JP3689333B2 - Hiv−1の全てのサブタイプを増幅及び検出するためにプライマー及びプローブとして使用できる核酸配列 - Google Patents
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Description
本発明は、ウイルス診断の分野、より特定的には、エイズの原因となるヒト免疫不全ウイルス(HIV)の感染の診断に使用され得る核酸配列に関する。
【0002】
従来のウイルス診断は主としてウイルス抗原またはその特異的抗体の検出に基づいているが、近年の研究の主流はウイルスゲノムまたはそれに由来の核酸配列即ちRNA及びDNAの直接検出方法に移っている。これらの方法は概して核酸ハイブリダイゼーションに基づく。核酸ハイブリダイゼーションは、相補的配列を含む核酸の2つの鎖が適当な条件下で互いにアニーリングして二重鎖構造を形成する能力を有することに基づく。相補鎖がラベルで標識されているとき、このラベルを検出することができ、これがターゲット配列の存在の指標となる。これらの方法は、特に核酸配列の増幅方法と組合せることによって、ウイルス診断、特にヒト免疫不全ウイルス(HIV)を検出するための重要なツールとなる。
【0003】
血清学的方法が確実でない結果を与える場合または感染と抗ウイルス抗体の発生との間にかなりの時間的期間が存在する場合などには、核酸増幅技術が追加の技術として特に有用である。HIVの場合には通常、ウイルス接触後3−6カ月で血清変換が生じる。従って、慣用のイムノアッセイでは抗体は全く検出されないであろうが、プロウイルスDNAまたは環状ウイルスRNAは既に検出可能であろう。また、抗ウイルス治療をモニターする場合にも、核酸増幅に基づく方法は血清学的方法よりも優れたいくつかの利点を有している。特に、定量的増幅方法は、治療前及び治療中にウイルスの存在量の変化を評価する強力なツールとなる。
【0004】
核酸配列の増幅及び検出においてプライマー及びプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの選択は、アッセイの感度及び特異性にとって極めて重要である。増幅されるべき配列はサンプル(例えばウイルス感染が疑われる患者から採取した血液サンプル)中に通常は少量しか存在しない。プライマーは、サンプル中に存在するウイルス核酸を効率的に増幅させるようにターゲット配列に十分に相補的でなければならない。(双方の鎖中のヌクレオチドの塩基の不対合が原因で)プライマーがターゲット配列に適正にアニーリングしないならば、増幅は著しく妨害されるであろう。これはアッセイの感度に影響を与え、誤った陰性の試験結果が生じるかもしれない。プライマー及びプローブがウイルスの変種の一部にだけ存在する配列を認識できるならば、ウイルスゲノムの不均質性(heterogeneity)が原因で誤った陰性の試験結果が生じるかもしれない。HIVウイルスは高度な不均質性を示す。種々の大陸から得られた単離物の間でも、個体間でも、疾病の異なる種々の時期の間でも、遺伝的変異の存在が証明された。HIV−1では配列解析に基づいてグループM(“主系(major)”のM)及びグループO(“傍系(outlier)”のO)の2つのグループが同定された。各々がフィロジェネティックな個々の配列セットを構成しているサブタイプ(A−H)はグループMに所属すると考えられ、その他のサブタイプも同定されている。この配列変異はゲノム全体に均一に分布していない。HIV−1ゲノムはすべてのレトロウイルスゲノムと同様に、概して以下の領域から構成されている。HIV−1ゲノムのgag遺伝子は、ウイルスのコアタンパク質(例えばp24)をコードする領域である。env遺伝子は大きい前駆体タンパク質gp160をコードしており、このタンパク質はプロセシングされてエンベロープタンパク質gp120及びgp41を生じる。pol遺伝子はウイルスのポリメラーゼ(逆転写酵素)をコードしている。末端反復配列(LTR)領域は、ウイルスゲノムに存在し、宿主細胞によるウイルスの取り込み及びウイルス遺伝子の転写調節に関与する領域である。いくつかの領域はその他の領域よりも配列変異を生じ易い。特にenvドメインの配列変異は、種々のサブタイプで30%という高い値になり得る。理想的には、候補プライマー配列の菌株間の変異及びプライマー部位におけるミスマッチの結果に関する知識に基づいてプライマーを選択すべきである。McCutchanら,J.AIDS,4,1241−1250,1991は、種々のHIV−1単離物を遺伝的に比較するためにPCRを使用した。アンカードPCRを使用し(種々のセンスプライマーを一定のアンチセンスプライマーと共に使用した。プライマーはgag、env及びLTR中の比較的保存された領域から選択した)、得られたPCR産物の量に対するプライマー不対合の影響を検査した。プライマーの3′端の不対合はときには増幅産物の量を1/100に減少させた。
【0005】
特に患者の管理、血液及び血液産物の安全性、臨床的及び疫学的研究の見地から、現在知られたHIV−1の全てのサブタイプを検出することが極めて重要である。現行の増幅アッセイ及びその後のHIV−1由来核酸配列の検出は一般にウイルスゲノムのgag領域の配列の増幅に基づく。これらのアッセイは欧州諸国及び米国の主要なサブタイプであるサブタイプBに関して開発されたものである。しかしながらこれらの諸国でも、例えばアフリカ諸国への旅行機会の増加に伴って、これまではその存在が地域的に限定されていた他のサブタイプが増加しつつある。従って、HIV−1ウイルスのできるだけ多数(好ましくは全部)の変種を検出し得る高感度アッセイが要望されている。
【0006】
HIV−1由来の核酸配列の確実な増幅に好適なプライマーセットを同定する目的の研究は過去何年間も続けられている。Engelbrechtら,J.Virol.Meth.,55,391−400,1995は、南アメリカのウェスタンケープに存在するサブタイプを検出するためにenv,gag及びLTRプライマー対を使用する特異的高感度PCRの開発を目的とした研究を記載している。サブタイプB、C及びDに所属することが判っていた24の菌株を分析した。プライマー対の性能は種々のプライマー対に関する反応条件の最適化に大きく左右されることが知見された。低緊縮性条件を使用したときに限って(例えば、LTRプライマー対では長いサイクル時間及び低いアニーリング温度が必要であった)、試験した特定のHIVの菌株をすべてのプライマー対によって十分な感度及び再現性で検出することが可能であった。
【0007】
Zazziら,J.Med.Virol.,38,172−174,1992は、臨床サンプル中のHIV−1 DNAを検出するために(入れ子型プライマーを使用する)2段階PCR反応を開発した。増幅に使用したプライマーはgag遺伝子及びLTR領域に由来した。この研究で試験した患者はすべて近隣地域出身であり、従って、種々のウイルス菌株の中から少数の菌株だけを表すと考えられる。
【0008】
LTR由来の入れ子型プライマーを使用する定量的PCR方法は、Venerら,によってBioTechniques,21,248−255,1996に記載されていた。この手順で試験した細胞はHIV−1MN感染した末梢血単核細胞(PBMC)だけであった。従って、ウイルスの種々のサブタイプを検出するために使用されるプライマーの適性に関して判断することは全くできない。
【0009】
本発明によれば、HIV−1核酸を増幅及び検出するためにプライマー及びプローブとして使用され得るヌクレオチド配列が提供される。本発明によって提供されたオリゴヌクレオチド配列は、HIVウイルスゲノムのLTR部分に局在している。核酸の増幅及び検出方法に本発明の配列を使用することによって、HIV−1の高感度の特異的検出を達成し得る。本発明の配列の利点は主として、本発明の配列から成るプライマー及びプローブを使用してHIV−1の現在知られたすべてのサブタイプを高精度及び高感度で検出できることにある。このような広い範囲のHIV−1変種を検出できるプライマー対またはハイブリダイゼーションプローブはこれまで開発されていなかった。
【0010】
本発明のオリゴヌクレオチド配列は核酸の増幅方法に特に有用である。
【0011】
種々の核酸増幅技術が当業界で公知である。DNAターゲットセグメントを増幅する技術の一例はいわゆる“ポリメラーゼ連鎖反応”(PCR)である。PCR技術によれば、特定ターゲットセグメントのコピー数はサイクル数に伴って指数関数的に増加する。一対のプライマーを使用し、各サイクルで二重鎖DNA−ターゲット配列を構成する2つの鎖の各々の3′側に1つのDNAプライマーをアニーリングする。種々のモノヌクレオチドの存在下でDNAポリメラーゼによってプライマーを伸長させ二重鎖DNAを再形成する。熱変性によって二重鎖DNAの2つの鎖を互いから分離させ、鎖の各々を後続サイクル中にプライマーアニーリング及びその後の鎖伸長の鋳型とする。PCR法はSaikiら,Science 230,135,1985及び欧州特許EP200362及びEP201184に記載されている。
【0012】
別の核酸増幅技術はいわゆる転写に基づく増幅方式(TAS)である。TAS法は国際特許出願WO88/10315に記載されている。転写に基づく増幅技術は一般に、一方がプロモーター配列から成る2つのオリゴヌクレオチドによってターゲット核酸を処理して機能性プロモーターを含む鋳型を形成させる段階を含む。この鋳型からRNAの多数コピーが転写され、これをベースとして以後の増幅が行われる。
【0013】
等熱性連続転写に基づく増幅方法は欧州特許EP329822に記載されたいわゆるNASBA法(“NASBA”)である。NASBAは、T7プロモーターを含む鋳型からRNAの多数コピーを転写するためにT7 RNAポリメラーゼを使用する。転写に基づく増幅技術の別の方法が欧州特許EP408295に記載されている。欧州特許EP408295は主として、2酵素転写に基づく増幅方法を開示している。欧州特許EP329822に記載のNASBA法のような転写に基づく増幅方法では通常は1セットのオリゴヌクレオチドを使用し、一方のオリゴヌクレオチドがT7ポリメラーゼのようなDNA依存性RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列を備えている。転写に基づく技術の複数の修正方法が当業界で公知である。これらの修正方法では例えば、(プロモーター配列を備え得る)ブロックされたオリゴヌクレオチドを使用する。これらのオリゴは、該オリゴから伸長反応が進行することを阻止するためにブロックされている(米国特許US5554516)。1つまたは複数の“プロモーター−プライマー”(プロモーター配列を備えたオリゴヌクレオチド)は、プロモーター配列を備えていない1つまたは複数のオリゴヌクレオチドの使用を任意に組合せた転写に基づく増幅技術に使用され得る。RNA増幅の場合には転写に基づく増幅技術が好ましい方法である。PCRを使用する増幅もRNA鋳型をベースとして行うことができる。実際のPCRでは、PCRに先立ってRNAをDNAにコピーする逆転写段階が必要である(RT−PCR)。しかしながらRT−PCRをウイルス転写物の検出に使用する場合には、mRNA−及びDNA−由来のPCR産物の識別が必要である。RT−PCRに先立ってDNアーゼ処理を使用することはできるが(Bitsch,Aら,J Infect.Dis 167,740−743,1993;Meyer,T.ら,Mol.Cell Probes.8,261−271,1994)、夾雑DNAを十分に除去することはできない(Bitsch,A.ら,1993)。
【0014】
RT−PCRに対照的に、T7 RNAポリメラーゼによるRNA転写(Kievitsら,1991;Compton,1991)に基づくNASBAは、主要ターゲットとしてRNAを使用するのでRNA−及びDNA−由来の増幅産物の識別が不要である。NASBAは、DNAバックグラウンド中でもRNAターゲットを特異的に増幅させ得る。
【0015】
本発明によるオリゴヌクレオチドの使用はいかなる特定の増幅技術またはそのいかなる特定の修正方法にも限定されない。本発明によるオリゴヌクレオチドが異なる多くの核酸増幅技術及びHIVの(増幅された)核酸の存在を検出する種々の方法に使用できることは明らかである。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、定量的増幅方法にも使用され得る。このような定量的方法の一例が欧州特許EP525882に記載されている。
【0016】
本文中で使用された“オリゴヌクレオチド”なる用語は、2つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから成る分子を意味する。このようなオリゴヌクレオチドはプライマー及びプローブとして使用され得る。
【0017】
勿論、本発明のオリゴヌクレオチドの配列に基づいて、オリゴヌクレオチドの類似体も調製できる。このような類似体は“PNA”(正常な核酸のリン酸塩糖主鎖の代わりにペプチド様主鎖をもつ分子)のような代替的構造を形成し得る。本発明の配列を表すこれらの代替的構造も本発明の一部を構成することが明らかである。
【0018】
本文中で使用された“プライマー”なる用語は、(例えば制限フラグメントとして)天然に産生するかまたは合成的に産生され、ヌクレオチドとDNA依存性またはRNA依存性ポリメラーゼのような核酸重合剤との存在下で適当な条件(例えば、バッファ、塩、温度及びpH)下に配置されたときに核酸の1つの鎖(鋳型またはターゲット配列)に相補的なプライマー伸長産物の合成の開始点となり得るオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成を開始できる十分な長さを有していなければならない。典型的なプライマーは、ターゲット配列に実質的に相補的または相同な配列の少なくとも約10ヌクレオチドの長さを有するが、これよりも幾らか長い配列が好ましい。プライマーは通常は約15−26ヌクレオチドを含むが、特に、プライマーが特定ポリメラーゼ用プロモーター配列のような追加の配列を含む場合にはもっと長いプライマーも使用し得る。通常は1組のプライマーセットが少なくとも2つのプライマー、即ち、1つの“上流”プライマーと1つの“下流”プライマーとから成り、増幅配列(これらのプライマーを使用して増幅される配列)は双方のプライマーによって規定される。
【0019】
主として転写に基づく増幅技術に使用するためには本発明によるオリゴヌクレオチドをプロモーター配列に連結し得る。“プロモーター配列”なる用語は、RNAポリメラーゼによって特異的に認識される核酸配列の1つの領域を意味しており、RNAポリメラーゼは、認識した配列に結合しRNA転写物を産生する転写プロセスを開始させる。プロモーター配列に対する既知の入手可能なポリメラーゼが存在し開始配列が認識され得る限り、原則としていかなるプロモーター配列も使用し得る。公知の有用なプロモーターは、バクテリオファージT3、T7またはSP6のようないくつかのバクテリオファージRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターである。プロモーター配列に連結したオリゴヌクレオチドは“プロモータープライマー”という通称で呼ばれている。しかしながらそのプライマー機能、例えば伸長反応の開始点という機能は、転写に基づく増幅反応のいくつかの実施態様では前述したようにブロックされていてもよくまたは存在しなくてもよい。
【0020】
本発明によるオリゴヌクレオチドはHIVゲノムの核酸配列のLTR領域の配列に実質的に相補的であり、このオリゴヌクレオチドは10−50ヌクレオチドの長さを有しており、且つ、
配列1:G GGC GCC ACT GCT AGA GA
配列2:G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
配列3:CGGGCGCCACTGCTA
配列4:CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
配列5:CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
配列6:TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
配列7:TAG TGT GTG CCC GTC TGT
配列8:AGT GTG TGC CCG TCT GTT
配列12:GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT
から成るグループから選択された配列またはその相補的配列の10ヌクレオチドのフラグメントを少なくとも1つ含む。
【0021】
本発明の配列から成るオリゴヌクレオチドが、得られる収量または産生物に有意な程度のマイナスの影響を与えない範囲で核酸塩基の些少な欠失、付加及び/または置換のような変異を含み得ることは理解されよう。本発明によるオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、これらの変異が、プローブのハイブリダイゼーション効率を低下させてはならない。例えば、転写に基づく増幅技術で1つまたは複数のプライマーがプロモーター配列を備え得る場合、プロモーター配列の直後にプリン富化(=GまたはA)ハイブリダイズ配列を導入すると、転写にプラスの効果が与えられるであろう(C及びTが存在する場合には不稔的転写が生じるであろう)。ターゲット核酸中でこのような配列が全く利用できない場合には、プリン富化配列をプロモーター配列の最後の3つのG残基の直後でオリゴヌクレオチドに挿入できる。本発明の配列はDNA配列として考えられている。これらの配列のRNA等価物も本発明の一部を構成する。本発明による好ましいオリゴヌクレオチドは本質的に、配列:
配列1:G GGC GCC ACT GCT AGA GA
配列2:G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
配列3:CGGGCGCCACTGCTA
配列4:CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
配列5:CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
配列6:TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
配列7:TAG TGT GTG CCC GTC TGT
配列8:AGT GTG TGC CCG TCT GTT
配列9:aat tct aat acg act cac tat agg gAG AGG GGC GCC ACT GCT AGA GA
配列10:aat tct aat acg act cac tat agg gAG AGG TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
配列11:aat tct aat acg act cac tat agg gCGGGCGCCACTGCTA
配列12:GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT
から成るグループから選択された配列から成るオリゴヌクレオチドである。
【0022】
配列9−11は実際には、配列1−3によって表される配列を含む。配列9−11中で、配列1−3はプロモーター配列(T7プロモーター配列)に操作可能に連結されている。このため配列は、NASBAのような転写に基づく増幅技術において上流プライマーとして特に好適に使用される。
【0023】
本発明の好ましい実施態様は、核酸増幅でセットとして使用される本発明の2つのオリゴヌクレオチドの組合せである。
【0024】
HIV−1のゲノムのLTR領域の内部に局在するターゲット配列を増幅するためにセットとして使用されるこのようなオリゴヌクレオチド対は、10−50ヌクレオチドの長さを有しており、且つ、配列:
配列1:G GGC GCC ACT GCT AGA GA
配列2:G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
配列3:CGGGCGCCACTGCTA
から成るグループから選択された配列の10ヌクレオチドのフラグメントを少なくとも1つ含む第一のオリゴヌクレオチドと、10−50ヌクレオチドの長さを有しており、且つ、配列:
配列4:CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
配列5:CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
配列12:GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT
から成るグループから選択された配列の10ヌクレオチドのフラグメントを少なくとも1つ含む第二のオリゴヌクレオチドとから成る。
【0025】
オリゴヌクレオチドの1つは“上流オリゴヌクレオチド”即ち増幅反応で上流プライマーとして作用し、第二のオリゴヌクレオチドは“下流オリゴヌクレオチド”即ち増幅反応で下流プライマーとして作用する。このような対を構成する本発明の2つのオリゴヌクレオチドがアニーリングし得るHIV−ゲノム(またはこれに相補的な配列)の位置も、増幅される核酸の配列を規定するであろう。増幅される配列は、HIV−ゲノムのLTR領域の内部の複数の“プライマー結合部位”の間に局在する。本発明によるオリゴヌクレオチド対を増幅反応に使用することによって、現在公知のHIVのサブタイプ全部について、それらに由来する核酸の正確で確実な増幅を達成し得ることが知見された。
【0026】
本発明による最も好ましいオリゴヌクレオチド対は配列1の配列を含む第一プライマーと配列5の配列をもつ第二プライマーとから構成されるであろう。転写に基づく増幅方法に使用するためには、配列9のオリゴヌクレオチドを配列5のオリゴヌクレオチドと併用するのが好ましい。
【0027】
本発明によるオリゴヌクレオチドの一部は、本発明によるオリゴヌクレオチド対によって増幅させた核酸を検出するためのプローブとして特に好適に使用される。プローブとして使用されるとき、このオリゴヌクレオチドは検出可能なラベルを備えていてもよい。プローブとして特に好適な本発明によるオリゴヌクレオチドは本質的に、配列:
配列6:TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
配列7:TAG TGT GTG CCC GTC TGTまたは
配列8:AGT GTG TGC CCG TCT GTT
から成り検出可能なラベルを備えたものである。この点で最も好ましいオリゴヌクレオチドは配列6に示した配列をもつオリゴヌクレオチドである。
【0028】
種々のラベル用成分が当業界で公知である。この成分は例えば、放射性化合物、検出可能な酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP))、ビオチンなどのハプテン、または、比色シグナル、蛍光シグナル、化学発光シグナルまたは電気化学発光シグナルなどの検出可能なシグナルを発生し得る他のいかなる成分でもよい。本発明によるオリゴヌクレオチドと(増幅された)ターゲット核酸とのハイブリッドはまた、当業者に公知の別の方法によって検出されてもよい。本発明によるオリゴヌクレオチドを使用する上記に引用した方法のような核酸増幅方法も本発明の一部であることは明らかであろう。
【0029】
本発明は更に、HIV核酸を増幅及び検出するための検査キットを提供する。この検査キットを使用すると、HIV由来の核酸を含有すると疑われるサンプルを高精度及び高感度でスクリーニングできる。このような検査キットは、本発明のオリゴヌクレオチド対を含み、更に、増幅された物質の検出用プローブとして使用できる本発明のオリゴヌクレオチドを任意に含む。検査キットは更に、適当な増幅試薬を含んでいてもよい。これらの試薬は例えば、増幅反応を実施するために好適な酵素である。NASBAで使用するように作製されたキットは例えば、適量の逆転写酵素、RNアーゼH及びT7 RNAポリメラーゼを含み得る。これらの酵素は緩衝溶液の形態でキット中に存在してもよいが、凍結乾燥組成物、例えば凍結乾燥球状粒子として提供されてもよい。このような凍結乾燥粒子はPCT出願No.EP95/01268に開示されている。キットは更に、増幅反応の実施に適したバッファ組成物を含み得る。これらのバッファは、キットが目的とする特定の増幅技術に最適であり且つキットによって提供される特定のオリゴヌクレオチドに最適であればよい。NASBAのような転写に基づく増幅技術においては、これらのバッファは例えば、(PCT出願No.US90/04733に記載されているような)増幅反応を促進するDMSOを含有し得る。
【0030】
キットは更に、増幅手順に関するチェックとしてまたは増幅手順の欠陥に起因する誤った陰性検査結果の出現を防止するための内部対照を有し得る。転写に基づく増幅技術における内部対照の使用に関しては、PCT出願No.EP93/02248に記載されている。最適な対照配列は、増幅反応においてターゲット核酸と競合しないように選択される。キットはまた、増幅に先立って生物標本から核酸を単離するための試薬を含み得る。核酸の適当な単離方法は欧州特許EP389063に記載されている。
【0031】
【実施例】
実施例1:HIV−1ゲノムRNAの増幅及び検出
以下の実施例に記載のようにサンプルからHIV−1ゲノムRNAを増幅及び検出するために以下の手順を使用した。
【0032】
サンプルの調製及び核酸の単離
Boomら,1990,Journal of Clinical Microbiology 28,495−503及び欧州特許No.EP0389063の記載に従って核酸の単離を実施した。簡単に説明すると、健康なドナーからプールした容量200μlの血漿(HBsAg、抗HIV及び抗HCV陰性)を900μlの溶解バッファ(47mMのトリス−HCl,pH7.2、20mMのEDTA、1.2%のトリトンX−100、4.7Mのグアニジンチオシアネート(GuSCN,Fluka,Buchs,Switzerland))に添加した。撹拌し遠心(30秒、13,000rpm)した後、Layneら,1992,Virology 189,695−714によってキャラクタライズされ記載されたHIV−1 RNAサブタイプB標準の系列希釈物またはHIV−1陽性標本を添加した。50μlの活性化シリコン(0.1NのHCl中に0.4g/mlの懸濁液)を添加し、懸濁液を定期的に撹拌しながら室温で10分間インキュベートした。遠心(30−60秒、13,000rpm)した後、シリコンペレットを1mlの洗浄バッファ(5.25MのGuSCN、50mMのトリス−HCl,pH6.4)で2回洗浄し、次いで70%のエタノールで2回、次いでアセトンで1回洗浄した。その後、シリコンペレットを56℃の加熱用ブロック中で10分間乾燥した。50μlの溶出バッファ(1.0mMのトリス−HCl,pH8.5)を添加し、56℃で10分間のインキュベーションによって核酸をシリコンから溶出させた。その後、5μlの溶出液をペレットから採取し、以後の増幅反応で使用した。残りの溶出液を−70℃で保存した。
【0033】
NASBA増幅
10μlのプライマー混合物と5μlの(単離した)核酸と5μlの酵素混合物とから成る20μlの反応容量で増幅を実施した。凍結乾燥したaccusphereを50μlのaccusphere希釈剤と51.6μlの水と8.4μlの2MのKClと5μlの各プライマー(10μM)で復元させることによってプライマー混合物を調製した。使用する前に混合物を十分に撹拌した。このプライマー混合物の10μlを5μlの(単離した)HIV−1 RNA(標準)に添加した。この混合物を65℃で5分間インキュベートし、次いで41℃で更に5分間インキュベートした。これらのインキュベーション後、5μlの酵素混合物を添加し、41℃で5分間インキュベートした。管を検出エリアに移し、41℃で90分間インキュベートした。増幅反応後、以後に使用するまで管を−20℃で保存した。
【0034】
各増幅反応は以下の試薬を含んでいた。
【0035】
40mMのトリス−HCl,pH8.5
12mMのMgCl2
70mMのKCl
15%v/vのジメチルスルホキシド
5mMのジチオトレイトール
1mMの各デオキシヌクレオシド三リン酸
2mMのヌクレオシドγATP、γCTP、γUTP
1.5mMのγGTP
0.5mMのITP
0.105μg/μlのBSA
0.08単位のRNアーゼH
32単位のT7 RNAポリメラーゼ
6.4単位のトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素(Seikagaku,USA)
0.2μMの各プライマー
375mMのソルビトール
45.6mMのショ糖
28.5mMのマンニトール
0.13mMのデキストランT40。
【0036】
増幅産物の検出
A.ゲル電気泳動
アガロースゲル(100mlの2%Pronarose及び0.5μg/mlの臭化エチジウム)及び1×TAE(40mMのトリス−アセテート、1mMのEDTA,pH8.0)処理バッファを使用して増幅産物の存在を分析した。電気泳動を100ボルトで約30分間実施した。増幅産物の臭化エチジウム染色バンドをUV照射によって可視化した。ブロットをハイブリダイゼーションミックス(750mMのNaCl、75mMのクエン酸ナトリウム、20mMのNa2HPO4/NaH2PO4(pH6.7)、10×Denhardts)中のビオチンプローブ(3μM)と共に50℃で4時間インキュベートすることによってハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ブロットを450mMのNaCl、45mMのクエン酸ナトリウム,pH6.4(2×SSPE)及び1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液によって50℃で5分間の洗浄を2回繰り返し、20mMのNa2HPO4,pH7.4、360mMのNaCl、2mMのEDTA及び0.1%SDSによって室温で10分間の洗浄を1回実施した。その後、ブロットを、10mlの50mMのNa2HPO4、900mMのNaCl、5mMのEDTA,pH7.4及び0.5%SDS中の2μlのストレプトアビジン/西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液(Amersham Life Scienceの増強化学発光検出キット500U/ml)と共に30分間インキュベートした。室温で2×SSPE、0.1%SDS中で5分間の洗浄を2回、2×SSPE中で10分間の洗浄を1回夫々実施した後、ブロットを組織間で乾燥し、Amershamキットプロトコルに従って現像し、フィルムに露光した。
【0037】
B.電気化学発光(ECL)プローブハイブリダイゼーション
増幅産物を検出用希釈液(1.0mMのトリス/HCl,pH8.5及び0.2g/リットルの2−メチルイソチアゾロンHCl)で2倍に希釈した。その後、希釈した5μlの増幅産物を、5μgのストレプトアビジン被覆磁気ビーズ(平均サイズ2.8μm±0.2μm、Dynal,Great Neck,NY、USA)に結合した0.084μMのHIV−1特異的ビオチンプローブ及び2×1011分子のECL(トリス〔2,2−ビピリジン〕ルテニウム〔II〕複合体)で標識したプローブと共に750mMのNaCl、75mMのクエン酸ナトリウム,pH6.4(5×SSC)の総量25μl中で41℃で30分間インキュベートした。陰性対照として、検出用希釈液をまた、ビーズ−プローブ混合物及びECL−プローブ混合物と共にインキュベートした。インキュベーション中、管を10分毎に振盪させてビーズを懸濁状態に維持した。その後、300μlのアッセイバッファ溶液(100mMのトリプロピルアミン,pH7.5)を添加し、管をECL検出器具(Organon Teknika BVのNASBA QR−システム)に配置し、発生したECLシグナルを読み取った。
【0038】
実施例2:HIV−1ゲノムRNAの増幅及び検出
104コピー(分光光度法で260nmの測定数)のHIV−1 RNA標準に以下のプライマー対を試験した。RNAを増幅に直接添加した。実施例1に記載のゲル電気泳動によって増幅産物を分析した。結果を図1に示す。
【0039】
本発明のプライマー対及びプローブはいずれも同程度にサブタイプBからHIV−1 RNAを増幅し検出することが可能であった。初期濃度5.5×109コピー/mlを有するHIV−1 RNA標準の系列希釈物を使用して2組のプライマー対(配列9/配列5及び配列11/配列5)の分析感度を測定する。配列7及び配列6に示す配列を有するプローブによって検出した。増幅及び検出は実施例1に記載の手順で実施した。表1は双方のプライマー対で得られた結果を示す。
【0040】
【表1】
【0041】
双方のプライマー対はHIV−1 RNA標準に対してほぼ同じ感度を有しており、配列9/配列5のプライマー対に対する検出率70%及び配列3/配列5のプライマー対に対する検出率63%である。
【0042】
実施例3:内部対照の存在下でのHIV−1 RNAの増幅及び検出
この実施例では、配列9/配列5のプライマー対及び配列7のプローブを内部対照(ic−)RNAの存在下でのHIV−1 RNA標準の系列希釈物について試験した。ic−RNAは、HIV−1 HXB−2のLTR配列の一部を含むin vitro転写物であり、核酸単離の前に104コピー(分光光度法で260nmの測定数)を添加する。単離、増幅及びECL検出は実施例1に記載の手順で実施した。比較として、Van Gemenら,1993,Journal of Virological Methods 43,177−188によって以前に記載されたHIV−1 gag領域(P1/P2)に局在するプライマー対を使用して別の増幅及び検出を実施した。gagに基づくプライマー対によって産生した増幅産物を検出するために使用したプローブは、
ビオチンプローブ:5′−TGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGA
ECLプローブ:5′−GAATGGGATAGAGTGCATCCAGTG
であった。
【0043】
結果を表2に示す。
【0044】
【表2】
【0045】
この実施例のLTRプライマー対及びgagプライマー対はいずれも、核酸単離の前にin vitro産生RNAの添加によって調節したアッセイで同様の量のHIV−1 RNAを検出することができた。
【0046】
実施例4:HIV−1陽性サンプル中のHIV−1 RNAの検出
この実施例では、種々の地域で採取した40のHIV−1陽性サンプル中のHIV−1 RNAの存在を分析した。全部のサンプルを実施例1に記載の核酸単離方法によって単離した。増幅及び検出は配列9/配列5のプライマー対及び配列7のプローブまたは配列8のプローブを使用して実施例1に記載の手順で実施した。
【0047】
比較のために、gagプライマー対と実施例3に記載のプローブとを使用して別の増幅及び検出を実施した。実施例1の方法に従って増幅産物の存在をECLプローブハイブリダイゼーションによって検出した。結果を表3に示す。
【0048】
【表3】
【0049】
この実施例に記載のHIV−1のLTR領域に由来のプライマー/プローブの組合せはいずれも、全ての試験サンプルでHIV−1を検出することができた。対照的に、gagアッセイのプライマー/プローブの組合せは多数のサンプルでHIV−1ゲノムRNAを検出することができなかった。
【0050】
実施例5:規定サブタイプによるHIV−1 RNAの増幅及び検出
この実施例では、既知のエンベロープに基づくサブタイプのHIV−1 RNAを保有する33のサンプルを試験した。サンプルは細胞培養物中で増殖させたサブタイプ化ウイルスから採取した。グループMのサブタイプA−Hの変種及びグループOの変種の双方から得られた細胞培養上清サンプルをHIV−1陰性ヒト血漿にスパイクし、実施例1の方法に従って処理した。増幅及び検出は実施例4とほぼ同様に実施した。試験の結果を、各タイプの試験サンプル総数に対するHIV−1 RNAが検出されたサンプル数として表4に示す。
【0051】
【表4】
【0052】
配列9/配列5のLTRプライマー対及び配列7のプローブを使用したときは33のHIV−1サンプルの全部からHIV−1 RNAが検出された。対照的に、実施例3に記載のようなgagプライマーとプローブとの組合せを使用したアッセイでは、サブタイプA及びサブタイプEに検出されなかったサンプルが1つずつ存在し、また、HIV−1 RNAを含有するグループOの全部のサンプルを検出することができなかった。
【0053】
実施例6:HIV−1臨床サンプルの増幅及び検出
この実施例では、アフリカ、南アメリカ及びアジア出身の血清陽性患者から得られた7つのサンプルをHIV−1ゲノムRNAの存在について検定した。これらの患者の血液サンプルは抗−p24抗体(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)及びウェスタンブロット(Genelabs)の双方に陽性であるにも関わらず、実施例3のgagプライマー対とプローブとの組合せを使用したNASBA HIV−1 RNA QLアッセイ(Organon Teknika BV)では全部のサンプルが陰性と判定され、50μlのサンプル容量を使用したQuantiplex HIV−1 RNA 2.0(Chiron)アッセイでは唯1つのサンプル(R9612222)だけが検出され定量(RNAコピー数29,500/ml)された。対照的に、配列9/配列5のプライマー対及び配列7のプローブは同じサンプル容量で7つのサンプルから4つのサンプルを検出した(表5)。
【0054】
【表5】
【0055】
LTRプライマーとプローブとの組合せが正しく判定できなかったサンプルに関しては、これらのサンプルが検出されなかった理由は、Quantiplex HIV−1 RNA 2.0(Chiron)アッセイでサンプル50μlあたりのHIV−1 RNAのコピー数が30以下であると定量されたHIV−1 RNAレベルのサンプルを容量1mlで使用したので、ウイルス負荷が検出レベルよりも低かったことにある。
【図面の簡単な説明】
【図1】
以下のプライマー対を使用してHIV−1 RNAの存在下(パネルA)または非存在下(パネルB)で増幅後に得られたブロッティング後及び増強化学発光による検出後の増幅産物を示す図である。
レーン1 配列9−配列10
レーン2 配列9−配列5
レーン3 配列10−配列4
レーン4 配列10−配列5
レーン5 配列3−配列12
【配列表】
Claims (7)
- DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列を更に備え、10〜26ヌクレオチドの長さを有し、少なくとも以下の配列 :
配列9:aat tct aat acg act cac tat agg gAG
AGG GGC GCC ACT GCT AGA GA
の10ヌクレオチドから成るフラグメントを含む第一のオリゴヌクレオチドと、10〜26ヌクレオチドの長さを有し、少なくとも以下の配列:
配列5:CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
の10ヌクレオチドから成るフラグメントを含む第二のオリゴヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドプライマー対。 - 請求の範囲第1項に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対と適当な増幅試薬とを使用してサンプルを核酸増幅反応で処理し、増幅された核酸の存在を検出することを特徴とするサンプル中のHIV−1核酸の検出方法。
- 増幅された核酸の検出が、適当なハイブリダイゼーション条件下でサンプルを配列:
配列6:TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
配列7:TAG TGT GTG CCC GTC TGT または
配列8:AGT GTG TGC CCG TCT GTT
から成るグループから選択された(1つまたは複数の)配列を有しており前記配列の1つまたは複数が検出可能なラベルを備えている1つまたは複数のオリゴヌクレオチドと反応させ、増幅された配列とプロープとによって形成されたハイブリッド中のラベルの存在を検出する処理から成る請求の範囲第2項記載の方法。 - 使用される増幅技術が転写に基づく増幅技術であることを特徴とする請求の範囲第2項記載の方法。
- −請求の範囲第1項記載のオリゴヌクレオチドプライマー対と、
−検出可能なラベルを備えており、増幅された核酸配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含む1つまたは複数のオリゴヌクレオチドと、
−適当な増幅試薬と、
から成るサンプル中のHIV−1検出用検査キット。 - 請求の範囲第1項記載のオリゴヌクレオチドプライマー対を、適当な増幅試薬と増幅された核酸の検出手段と共に含むサンプル中のHIV−1検出用検査キット。
- HIV−1のゲノムのLTR領域内部に局在するターゲット配列を増幅するためにプライマーセットとして使用される請求の範囲第1項記載のオリゴヌクレオチドプライマー対の使用。
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US20090050492A1 (en) * | 2005-08-02 | 2009-02-26 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Nanoporous silicon-based electrochemical nucleic acid biosensor |
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Family Cites Families (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK171161B1 (da) | 1985-03-28 | 1996-07-08 | Hoffmann La Roche | Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve |
US5333675C1 (en) * | 1986-02-25 | 2001-05-01 | Perkin Elmer Corp | Apparatus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4772547A (en) * | 1986-02-03 | 1988-09-20 | Hoffmann-La Roche Inc. | HTLV-III envelope peptides |
IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
US5306631A (en) * | 1987-08-21 | 1994-04-26 | University Of Colorado Foundation, Inc. | Compositions and method for inhibition of HIV production |
US4963532A (en) * | 1987-11-25 | 1990-10-16 | Hem Research, Inc. | dsRNA-based prevention of viral escape |
EP0331939B1 (en) * | 1988-02-16 | 2001-11-14 | Greatbatch Gen-Aid, Ltd | Modified cells having resistance to retroviral infection |
CA1340807C (en) | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
US5622820A (en) * | 1988-03-10 | 1997-04-22 | City Of Hope | Method for amplification and detection of RNA and DNA sequences |
US5221610A (en) * | 1988-05-26 | 1993-06-22 | Institut Pasteur | Diagnostic method and composition for early detection of HIV infection |
JP3276955B2 (ja) * | 1988-09-30 | 2002-04-22 | ジーン−トラック・システムス | Rnaの鋳型の末端に結合したプローブ構造およびその使用方法 |
NL8900725A (nl) | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
IE64040B1 (en) * | 1989-06-15 | 1995-06-28 | Akzo Nv | Method for determining nucleic acid |
WO1991001384A1 (en) | 1989-07-11 | 1991-02-07 | Gen-Probe, Incorporated | Nucleic acid sequence amplification methods utilizing a transcription complex |
US5856088A (en) * | 1989-07-11 | 1999-01-05 | Gen-Probe Incorporated | Detection of human immunodeficiency virus type 1 |
US5122457A (en) * | 1989-10-19 | 1992-06-16 | Schering Corporation | Expression systems utilizing bacteriophage t7 promoters, gene sequences, and t7 rna polymerase |
EP0504278B1 (en) | 1989-11-30 | 1997-01-15 | Pharmacia Biotech AB | A new method for detecting a specific nucleic acid sequence in a sample of cells |
ATE184321T1 (de) | 1990-01-10 | 1999-09-15 | Chiron Diagnostics Corp | Dns-abhängige rns-polymerase-transkripte als reportermoleküle zur signalverstärkung in nukleinsäure-hybridisierungsuntersuchungen |
DE4027616A1 (de) * | 1990-08-31 | 1992-03-05 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von polymerase-aktivitaet |
US5474796A (en) * | 1991-09-04 | 1995-12-12 | Protogene Laboratories, Inc. | Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface |
DK173091D0 (da) | 1991-10-11 | 1991-10-11 | Schleroseforeningen The Danish | Biologisk materiale |
WO1993022461A1 (en) | 1992-05-06 | 1993-11-11 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit |
US5770428A (en) * | 1993-02-17 | 1998-06-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site |
WO1994023069A1 (en) | 1993-03-26 | 1994-10-13 | Gen-Probe Incorporated | Detection of human immunodeficiency virus type 1 |
US5403707A (en) * | 1993-05-14 | 1995-04-04 | Eastman Kodak Company | Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of retroviral DNA using primers having matched melting temperatures |
EP0714436B1 (en) * | 1993-07-19 | 2003-05-07 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotides with activity against human immunodeficiency virus |
US5576176A (en) | 1994-03-03 | 1996-11-19 | The Regents Of The University Of California | Marker and an assay for detection and monitoring of human immunodeficiency virus latency and activation |
US6025124A (en) * | 1994-03-03 | 2000-02-15 | The Regents Of The University Of California | Marker, method and an assay for detection and monitoring of latency and activation of human immunodeficiency virus |
US5622827A (en) * | 1995-02-07 | 1997-04-22 | Gen-Probe Incorporated | Amplification primers and nucleic acid probes targeted to coccidioides immitis nucleic acid |
US5599662A (en) | 1995-02-17 | 1997-02-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1 |
US5798542A (en) * | 1996-10-08 | 1998-08-25 | Eastman Kodak Company | Image sensor having ITO electrodes with overlapping color filters for increased sensitivity |
US6001558A (en) | 1997-06-25 | 1999-12-14 | Ortho Clinical Diagnostics, Inc. | Amplification and detection of HIV-1 and/or HIV 2 |
US6881537B1 (en) * | 1997-08-08 | 2005-04-19 | Biomerieux, B.V. | Nucleic acid sequences that can be used as primers and probes in the amplification and detection of all subtypes of HIV-1 |
US9004733B2 (en) | 2012-04-05 | 2015-04-14 | Corning Cable Systems Llc | Optical fiber installation tool having a passive illumination feature |
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