CN105861487B - 用于靶向核酸序列富集和高效文库产生的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于核酸样品中的靶向核酸序列富集和为新一代测序(NGS)进行高效核酸文库产生的方法、组合物和试剂盒。特别地，本文提供的方法、组合物和试剂盒可用于从含有复合DNA的核酸样品产生和捕获感兴趣的扩增就绪的、靶标特异性的和链特异性的区域。

Description

用于靶向核酸序列富集和高效文库产生的组合物和方法

本申请是2013年01月25日提交的发明名称为“用于靶向核酸序列富集和高效文库产生的组合物和方法”的第201380006942.4号(国际申请号PCT/US2013/023278)中国专利申请的分案申请。

交叉引用

本申请要求于2012年1月26日提交的美国临时申请第61/591,241号的权益，该临时申请通过引用并入本文。

发明背景

随着新一代测序(NGS)技术和平台的迅速发展，全基因组测序变得愈加可行。研究人员被迫产生越来越多的数据量以便获得对变异和生物学趋势的更深入的了解，并且被迫从较小的样本大小产生数据以避免组织内多个细胞间的平均化。

尽管全基因组测序成本正在下降且NGS平台的通量不断增加，但选择感兴趣的基因组区域进行测序和分析往往更加实际和符合成本效益。靶标富集是在基因组DNA测序中通常使用的策略，其中在测序前从DNA样品中选择性捕获目标基因组区域。所关注的靶标富集是一种重要的手段，特别是在必须对大量样品进行测序而使全基因组测序成本难以接受的研究(例如，对疾病标志物或者SNP的基于群体的研究)领域中。类似地，已经取得的改进使得由来自更少量细胞的核酸制备DNA文库成为可能，但是这些改进受限于连接反应效率的限制。

已经开发了许多靶标富集方法，这些方法在灵敏度、特异性、重现性、均一性、成本和易用性方面彼此不同。目前通常使用的靶标富集方法可分成3个主要类别，每个类别各有其独特的优势和劣势：1)基于PCR的方法；2)通过杂交的捕获，即阵列上或溶液中杂交捕获；以及3)通过环化的捕获，即基于分子倒置探针的方法。

基于PCR的方法使用高度平行的PCR扩增，其中样品中的每个靶序列具有相应的一对独特的序列特异性引物。大量引物对的同时使用因高水平的非特异性扩增和引物-引物相互作用而使得多重PCR不切实际。最近开发的、其中每个扩增反应在物理上被分离成单个小滴的微滴PCR技术(Tewhey等人,2009)能够消除多重PCR与非特异性扩增和引物-引物相互作用有关的限制。然而，微滴PCR和其他改进的基于PCR的方法需要专门的仪器或平台，其通量受到限制，并且在富集大量的目标区域时，同常规的多重PCR一样需要大量的单个引物对，因此使得靶标富集变得昂贵。

杂交捕获方法是基于靶基因组区域与用户设计的寡核苷酸的选择性杂交。该杂交可以是与固定在高密度或低密度微阵列中的寡核苷酸的杂交(阵列上捕获)，或者可以是与随后可被固定至固体表面如珠上的配体(例如生物素)修饰的寡核苷酸的溶液相杂交(溶液中捕获)。为了有效的捕获，杂交捕获法需要昂贵的长寡核苷酸的复合池(pool)和长杂交周期(通常是48小时)。对于阵列上杂交捕获，还需要昂贵的仪器和硬件。由于杂交反应的效率相对较低，所以需要大量的输入DNA。

基于分子倒置探针(MIP)的方法依赖于构建大量的单链线性寡核苷酸探针，该探针由侧翼为靶标特异性序列的共同连接体组成。在与靶序列退火后，通过聚合和连接补平探针缺口区域，从而产生环化探针。然后释放环化探针，并使用针对共同连接体区域的引物进行扩增。基于MIP的靶标富集的主要缺点之一是其相对较低的捕获均一性，意味着在整个靶区域的序列覆盖方面存在较大的变异性。与PCR和杂交捕获一样，基于MIP的方法需要大量可能昂贵的靶标特异性寡核苷酸。

对不需使用专门的仪器而允许低成本、高通量的目标基因组区域捕获的改进的选择性靶标富集方法存在需求。另外，对高效核酸文库产生也存在需求。本文所述的本发明的方法满足了这些需求。

发明内容

在一个方面，本文公开了用于在包含核酸的样品中富集目标靶核酸序列的方法，该方法包括：(a)片段化核酸，从而产生核酸片段；(b)将第一衔接子附加至每个核酸片段的5’末端；(c)使一个或多个寡核苷酸与核酸片段退火，从而使所述一个或多个寡核苷酸中的每一个包含与存在于一个或多个所述核酸片段中的目标靶核酸序列互补的3’部分和包含第二衔接子序列的5’部分；(d)用聚合酶延伸所述一个或多个寡核苷酸，从而产生一个或多个在第一末端具有第一衔接子并且在第二末端具有第二衔接子的寡核苷酸延伸产物；以及(e)使用与第一衔接子互补的第一引物和与第二衔接子序列互补的第二引物扩增所述一个或多个寡核苷酸延伸产物，以富集在各末端包含第一衔接子和第二衔接子序列的核酸片段。在一个实施方案中，该方法进一步包括在扩增后对所述一个或多个寡核苷酸延伸产物进行测序的附加步骤。在一个实施方案中，目标靶核酸序列包含基因组DNA、RNA或cDNA。在一个实施方案中，目标靶核酸序列包含基因组DNA。在一个实施方案中，目标靶核酸序列包含cDNA。在一个实施方案中，该方法进一步包括在步骤c之前使核酸片段变性，从而产生在5’末端具有第一衔接子序列的单链核酸片段。在一个实施方案中，第一衔接子对于每个核酸片段可以是共同的。在一个实施方案中，第二衔接子序列对于所述一个或多个寡核苷酸可以是共同的。在一个实施方案中，第一衔接子和第二衔接子序列可以彼此不同。在一个实施方案中，第一衔接子和/或第二衔接子序列进一步包含条形码序列。在一个实施方案中，步骤b可以通过连接进行。在一个实施方案中，该方法进一步包括在第一衔接子连接后进行缺口修复以产生具有互补末端的核酸片段的附加步骤。在一个实施方案中，可通过本文所公开的方法产生包含富集的目标靶核酸序列的组合物。在一个实施方案中，该聚合酶可以是DNA聚合酶。

在另一方面，本文公开了用于在包含核酸的样品中富集目标靶核酸序列的方法，该方法包括：(a)片段化核酸，从而产生核酸片段；(b)将第一衔接子附加至该核酸片段，其中第一衔接子包含具有短链和长链的部分双链体，其中该部分双链体衔接子的短链的3’末端包含封闭基团，并且该部分双链体衔接子的长链的5’末端包含针对核酸修饰酶的限制和/或切割位点；(c)使该核酸片段变性，从而产生单链核酸片段；(d)使一个或多个寡核苷酸与该单链核酸片段退火，从而使所述一个或多个寡核苷酸中的每一个包含与存在于一个或多个所述单链核酸片段中的目标靶核酸序列互补的序列，用聚合酶延伸所述一个或多个寡核苷酸以产生一个或多个双链核酸复合物，该复合物包含靶核酸序列及其互补序列、具有针对核酸修饰酶的双链限制和/或切割位点的第一末端和具有包含第一衔接子的短链的3’突出端的第二末端；(e)用核酸修饰酶切割该双链限制和/或切割位点，从而产生切割位点；(f)将第二衔接子连接至该切割位点，其中第二衔接子包含具有两条链的双链体；(g)使所述一个或多个双链核酸复合物变性，从而产生一个或多个单链核酸片段，该片段包含靶核酸序列、在第一末端处的来自第二衔接子的链和在第二末端处的第一衔接子的短链；以及(h)使用包含与来自第二衔接子的链互补的序列的第一引物和包含与第一衔接子的短链互补的序列的第二引物扩增包含所述一个或多个靶核酸序列的所述一个或多个单链核酸片段，从而富集所述一个或多个靶核酸序列。在一个实施方案中，该方法进一步包括在扩增后对来自步骤h的一个或多个单链核酸片段进行测序的附加步骤。在一个实施方案中，目标靶核酸序列包含基因组DNA、RNA或cDNA。在一个实施方案中，目标靶核酸序列包含基因组DNA。在一个实施方案中，目标靶核酸序列包含cDNA。在一个实施方案中，第一衔接子和第二衔接子对于每个核酸片段可以是共同的。在一个实施方案中，第一衔接子和第二衔接子可以彼此不同。在一个实施方案中，第一衔接子和/或第二衔接子进一步包含条形码序列。在一个实施方案中，来自步骤e的针对核酸修饰酶的双链限制和/或切割位点包含第一衔接子的部分双链体长链的5’末端以及由一个或多个寡核苷酸延伸产生的、与第一衔接子的部分双链体长链的5’末端互补的序列。在一个实施方案中，该核酸修饰酶包括限制酶。在一个实施方案中，步骤b可通过连接进行。在一个实施方案中，可通过本文公开的方法产生包含富集的目标靶核酸序列的组合物。在一个实施方案中，该聚合酶可以是DNA聚合酶。

在又一方面，本文公开了用于产生核酸序列文库的方法，该方法包括：(a)片段化包含核酸的样品，从而产生核酸片段；(b)将第一衔接子附加至每个核酸片段；(c)使核酸片段变性，从而产生单链核酸片段文库；(d)使一个或多个寡核苷酸与该单链核酸片段退火，其中所述一个或多个寡核苷酸中的每一个包含与一个或多个所述单链核酸片段中的序列互补的3’部分和包含第二衔接子序列的5’部分；(e)用聚合酶延伸所述一个或多个寡核苷酸，从而产生一个或多个寡核苷酸延伸产物，该寡核苷酸延伸产物在第一末端处包含第一衔接子并且在第二末端处包含第二衔接子序列；以及(f)使用一组对第一衔接子和第二衔接子序列具有特异性的引物扩增所述一个或多个寡核苷酸延伸产物，以产生在各末端处包含第一衔接子和第二衔接子序列的核酸片段的文库。在一个实施方案中，该方法进一步包括在正向衔接子连接后进行缺口修复反应以产生具有互补末端的核酸片段的附加步骤。在一个实施方案中，该方法进一步包括对来自步骤f的扩增的一个或多个核酸延伸产物进行测序的附加步骤。在一个实施方案中，该核酸序列包含基因组DNA。在一个实施方案中，该核酸序列包含cDNA。在一个实施方案中，步骤c可被省略，其中核酸片段是双链的。在一个实施方案中，步骤d的一个或多个寡核苷酸的3’部分包含随机序列。在一个实施方案中，步骤b可通过连接进行。在一个实施方案中，第一衔接子和第二衔接子序列对于每个核酸片段可以是共同的。在一个实施方案中，第一衔接子和第二衔接子序列可彼此不同。在一个实施方案中，第一衔接子和/或第二衔接子序列进一步包含条形码序列。在一个实施方案中，本文所公开的方法可产生包含核酸序列文库的组合物。在一个实施方案中，该聚合酶可以是DNA聚合酶。

在进一步的方面，本文公开了用于从包含在第一末端上具有第一衔接子并且在第二末端上具有第二衔接子的核酸***片段的文库富集目标靶核酸序列的方法，该方法包括：(a)使核酸***片段变性，从而产生单链核酸***片段的文库；(b)使一个或多个寡核苷酸与该单链核酸***片段退火，其中所述一个或多个寡核苷酸中的每一个包含与存在于一个或多个所述核酸***片段中的目标靶核酸序列互补的3’部分和包含第三衔接子序列的5’部分；(c)用聚合酶延伸所述一个或多个寡核苷酸，从而产生一个或多个在第一末端处具有第一衔接子并且在第二末端处具有第三衔接子序列的寡核苷酸延伸产物；以及(d)使用与第一衔接子互补的第一引物和与第三衔接子序列互补的第二引物扩增所述一个或多个寡核苷酸延伸产物，从而富集在各末端包含第一衔接子和第三衔接子序列的核酸片段。在一个实施方案中，该方法进一步包括对来自步骤d的扩增的一个或多个寡核苷酸延伸产物进行测序的附加步骤。在一个实施方案中，目标靶核苷酸序列包含基因组DNA。在一个实施方案中，目标靶核苷酸序列包含cDNA。在一个实施方案中，步骤a可省略，其中核酸片段可以是双链的。在一个实施方案中，第一衔接子和第二衔接子对于每个核酸片段可以是共同的。在一个实施方案中，第三衔接子序列对于所述一个或多个寡核苷酸可以是共同的。在一个实施方案中，第一衔接子和第二衔接子可以彼此不同。在一个实施方案中，第一衔接子和第二衔接子可以是相同的。在一个实施方案中，第一衔接子、第二衔接子和/或第三衔接子序列进一步包含条形码序列。在一个实施方案中，本文所公开的方法可产生包含富集的目标靶核酸序列的组合物。

具体而言，本发明涉及：

1.一种用于在包含核酸的样品中富集目标靶核酸序列的方法，该方法包括：

a.片段化所述核酸，从而产生核酸片段；

b.将第一衔接子附加至每个核酸片段的5’末端；

c.使一个或多个寡核苷酸与所述核酸片段退火，从而使所述一个或多个寡核苷酸中的每一个包含与存在于一个或多个所述核酸片段中的目标靶核酸序列互补的3’部分，和包含第二衔接子序列的5’部分；

d.用聚合酶延伸所述一个或多个寡核苷酸，从而产生一个或多个在第一末端具有第一衔接子并且在第二末端具有第二衔接子序列的寡核苷酸延伸产物；以及

e.使用与第一衔接子互补的第一引物和与第二衔接子序列互补的第二引物扩增所述一个或多个寡核苷酸延伸产物，以富集在各末端包含第一衔接子和第二衔接子序列的核酸片段。

2.根据段1所述的方法，进一步包括在扩增后对所述一个或多个寡核苷酸延伸产物进行测序的附加步骤。

3.根据段1所述的方法，其中所述目标靶核苷酸序列包含基因组DNA、RNA或cDNA。

4.根据段1所述的方法，其中所述目标靶核苷酸序列包含基因组DNA。

5.根据段1所述的方法，其中所述目标靶核苷酸序列包含cDNA。

6.根据段1所述的方法，进一步包括在步骤c之前使所述核酸片段变性，从而产生在5’末端具有第一衔接子序列的单链核酸片段。

7.根据段1所述的方法，其中所述第一衔接子对于每个核酸片段是共同的。

8.根据段1所述的方法，其中所述第二衔接子序列对于所述一个或多个寡核苷酸是共同的。

9.根据段1所述的方法，其中所述第一衔接子和第二衔接子序列彼此不同。

10.根据段1所述的方法，其中所述第一衔接子和/或第二衔接子序列进一步包含条形码序列。

11.根据段1所述的方法，其中步骤b通过连接进行。

12.根据段1所述的方法，进一步包括在第一衔接子连接后进行缺口修复以产生具有互补末端的核酸片段的附加步骤。

13.一种组合物，其包含通过段1的方法富集的目标靶核酸序列。

14.根据段1所述的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。

15.一种用于在包含核酸的样品中富集目标靶核酸序列的方法，该方法包括：

a.片段化所述核酸，从而产生核酸片段；

b.将第一衔接子附加至所述核酸片段，其中该第一衔接子包含具有短链和长链的部分双链体，其中该部分双链体衔接子的短链的3’末端包含封闭基团，并且该部分双链体衔接子的长链的5’末端包含针对核酸修饰酶的限制和/或切割位点；

c.使所述核酸片段变性，从而产生单链核酸片段；

d.使一个或多个寡核苷酸与所述单链核酸片段退火，从而使所述一个或多个寡核苷酸中的每一个包含与存在于一个或多个所述单链核酸片段中的目标靶核酸序列互补的序列，用聚合酶延伸所述一个或多个寡核苷酸以产生一个或多个双链核酸复合物，该复合物包含靶核酸序列及其互补序列、具有针对核酸修饰酶的双链限制和/或切割位点的第一末端和具有包含所述第一衔接子的短链的3’突出端的第二末端；

e.用核酸修饰酶切割所述双链限制和/或切割位点，从而产生切割位点；

f.将第二衔接子连接至所述切割位点，其中所述第二衔接子包含具有两条链的双链体；

g.使所述一个或多个双链核酸复合物变性，从而产生一个或多个单链核酸片段，该片段包含靶核酸序列、在第一末端处的来自第二衔接子的链和在第二末端处的第一衔接子的短链；以及

h.使用包含与来自第二衔接子的链互补的序列的第一引物和包含与第一衔接子的短链互补的序列的第二引物扩增包含所述一个或多个靶核酸序列的所述一个或多个单链核酸片段，从而富集所述一个或多个靶核酸序列。

16.根据段15所述的方法，进一步包括在扩增后对来自步骤h的一个或多个单链核酸片段进行测序的附加步骤。

17.根据段15所述的方法，其中所述目标靶核苷酸序列包含基因组DNA、RNA或cDNA。

18.根据段15所述的方法，其中所述目标靶核苷酸序列包含基因组DNA。

19.根据段15所述的方法，其中所述目标靶核苷酸序列包含cDNA。

20.根据段15所述的方法，其中所述第一衔接子和第二衔接子对于每个核酸片段是共同的。

21.根据段15所述的方法，其中所述第一衔接子和第二衔接子彼此不同。

22.根据段15所述的方法，其中所述第一衔接子和/或第二衔接子进一步包含条形码序列。

23.根据段15所述的方法，其中来自步骤e的针对核酸修饰酶的双链限制和/或切割位点包含第一衔接子的部分双链体长链的5’末端以及由所述一个或多个寡核苷酸的延伸产生的、与第一衔接子的部分双链体长链的5’末端互补的序列。

24.根据段15所述的方法，其中所述核酸修饰酶包含限制酶。

25.根据段15所述的方法，其中步骤b通过连接进行。

26.一种组合物，其包含通过段15的方法富集的目标靶核酸序列。

27.根据段15所述的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。

28.一种用于产生核酸序列文库的方法，该方法包括：

a.片段化包含核酸的样品，从而产生核酸片段；

b.将第一衔接子附加至每个所述核酸片段；

c.使所述核酸片段变性，从而产生单链核酸片段的文库；

d.使一个或多个寡核酸与所述单链核酸片段退火，其中所述一个或多个寡核苷酸中的每一个包含与一个或多个所述单链核酸片段中的序列互补的3’部分和包含第二衔接子序列的5’部分；

e.用聚合酶延伸所述一个或多个寡核苷酸，从而产生一个或多个寡核苷酸延伸产物，该寡核苷酸延伸产物在第一末端处包含第一衔接子并且在第二末端处包含第二衔接子序列；以及

f.使用一组对第一衔接子和第二衔接子序列具有特异性的引物扩增所述一个或多个寡核苷酸延伸产物，以产生在各末端处包含第一衔接子和第二衔接子序列的核酸片段的文库。

29.根据段28所述的方法，进一步包括在正向衔接子连接后进行缺口修复反应以产生具有互补末端的核酸片段的附加步骤。

30.根据段28所述的方法，进一步包括对来自步骤f的扩增的一个或多个寡核苷酸延伸产物进行测序的附加步骤。

31.根据段28所述的方法，其中所述核酸序列包含基因组DNA。

32.根据段28所述的方法，其中所述核酸序列包含cDNA。

33.根据段28所述的方法，无步骤c，其中所述核酸片段是双链的。

34.根据段28所述的方法，其中步骤d的所述一个或多个寡核苷酸的3’部分包含随机序列。

35.根据段28所述的方法，其中步骤b通过连接进行。

36.根据段28所述的方法，其中所述第一衔接子和第二衔接子序列对于每个核酸片段是共同的。

37.根据段28所述的方法，其中所述第一衔接子和第二衔接子序列彼此不同。

38.根据段28所述的方法，其中所述第一衔接子和/或第二衔接子序列进一步包含条形码序列。

39.一种组合物，其包含通过段28的方法产生的核酸序列文库。

40.根据段28所述的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。

41.一种从包含在第一末端上具有第一衔接子并且在第二末端上具有第二衔接子的核酸***片段的文库富集目标靶核酸序列的方法，该方法包括：

a.使所述核酸***片段变性，从而产生单链核酸***片段的文库；

b.使一个或多个寡核苷酸与所述单链核酸***片段退火，其中所述一个或多个寡核苷酸中的每一个包含与存在于一个或多个所述核酸***片段中的目标靶核酸序列互补的3’部分和包含第三衔接子序列的5’部分；

c.用聚合酶延伸所述一个或多个寡核苷酸，从而产生一个或多个在第一末端处具有第一衔接子并且在第二末端处具有第三衔接子序列的寡核苷酸延伸产物；以及

d.使用与第一衔接子互补的第一引物和与第三衔接子序列互补的第二引物扩增所述一个或多个寡核苷酸延伸产物，从而富集在各末端处包含第一衔接子和第三衔接子序列的核酸片段。

42.根据段41所述的方法，进一步包括对来自步骤d的扩增的一个或多个寡核苷酸延伸产物进行测序的附加步骤。

43.根据段41所述的方法，其中所述目标靶核酸序列包含基因组DNA。

44.根据段41所述的方法，其中所述目标靶核苷酸序列包含cDNA。

45.根据段41所述的方法，无步骤a，其中所述核酸片段是双链的。

46.根据段41所述的方法，其中所述第一衔接子和第二衔接子对于每个核酸片段是共同的。

47.根据段41所述的方法，其中所述第三衔接子序列对于所述一个或多个寡核苷酸是共同的。

48.根据段41所述的方法，其中所述第一衔接子和第二衔接子彼此不同。

49.根据段41所述的方法，其中所述第一衔接子和第二衔接子是相同的。

50.根据段41所述的方法，其中所述第一衔接子、第二衔接子和/或第三衔接子序列进一步包含条形码序列。

51.一种组合物，其包含通过段41的方法富集的目标靶核酸序列。

援引并入

本说明书中所述的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以相同的程度并入本文，犹如特别地和单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。

附图说明

本发明的新颖特征在随附的权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：

图1示出了使用DNA文库中DNA片段末端处的单一正向衔接子的连接进行的选择性靶标富集。与目标靶区域退火的序列特异性寡核苷酸在其5’末端处包含共同的逆衔接子序列，并且在序列特异性寡核苷酸延伸后，使用对正向和反向衔接子具有特异性的一组引物进行PCR。

图2示出了一种备选的连接方案，其中在连接后，在不进行切口修复和衔接子补平的情况下使DNA-片段-衔接子复合物变性，从而产生连接产物，其中在每个***片段上存在非互补末端。

图3示出了使用部分双链体衔接子的连接进行的选择性靶标富集。利用对双链DNA具有特异性的核酸修饰酶切割部分双链体衔接子长链的5’末端(和延伸的序列特异性寡核苷酸的相应互补序列)允许新衔接子对的连接，并且随后用对应于新衔接子的引物进行扩增。

图4示出了使用随机引发的高效NGS文库产生。与DNA片段退火的寡核苷酸在其5’末端处包含共同的反向衔接子序列，并且在引物延伸后，使用对正向和反向衔接子具有特异性的一组引物进行PCR。

发明详述

概述

本发明的方法可用于使用一组共同引物和衔接子从复合DNA中选择性富集多个限定的靶序列，从而避免了对多重PCR和多个引物对的需要。设想了多个目标靶区域：例如，目标区域可代表所有已知的编码区，整个外显子组，代表选定途径的编码基因组区域的选定区域，已知包含与表型改变相关的基因组变异的选定基因组区域，特定染色体的整个或选定区域，等等。在另一方面，本发明的方法还可用于高效核酸文库产生。

总之，本发明的方法建立了一种用于靶标富集和文库制备的简单、低成本、高通量的***。

现将详细参考本发明的示例性实施方案。虽然将结合这些示例性实施方案来描述这些公开的方法和组合物，但应当理解，这些示例性实施方案并非意在限制本发明。相反，本发明意在涵盖可包括在本发明精神和范围内的备选方案、修改方案和等效方案。

在一个实施方案中，本发明提供了用于从包含核酸的样品中富集感兴趣的特定靶序列的方法和组合物。本文所述的方法通过使用常规双链体衔接子和/或部分双链体衔接子、序列特异性寡核苷酸、限制酶和连接来富集靶序列。该方法进一步允许从模板核酸的特定链中富集靶序列，该靶序列可使用多种扩增方法进一步扩增。在另一个实施方案中，本发明提供了用于高效产生包含感兴趣的特定核酸序列的文库的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了用于从包含核酸的样品中富集靶核酸序列的方法和组合物。在一个方面，该方法包括片段化输入样品中的核酸以产生核酸片段。该核酸可以是DNA或RNA。该核酸可以是单链的或双链的。该DNA可以是基因组DNA或cDNA或其任意组合。在一个实施方案中，输入样品中的核酸是双链DNA。在一个实施方案中，核酸的片段化可通过本领域中已知的方法来实现。片段化可通过物理片段化方法和/或酶催化片段化方法进行。物理片段化方法可包括雾化、超声处理和/或流体动力剪切。在一些实施方案中，片段化可以以机械的方式完成，包括对输入样品中的核酸进行超声处理。在一些实施方案中，片段化包括用一种或多种酶在适于该一种或多种酶产生双链核酸断裂的条件下处理输入样品中的核酸。可用于产生核酸或多核苷酸片段的酶的例子包括序列特异性和非序列特异性的核酸酶。核酸酶的非限制性实例包括DNase I、片段化酶(Fragmentase)、限制性内切核酸酶、其变体及其组合。用于进行酶促片段化反应的试剂可商购获得(例如，来自New EnglandBiolabs)。例如，在不存在Mg⁺⁺和存在Mn⁺⁺的情况下用DNase I消化可以诱导DNA中的随机双链断裂。在一些实施方案中，片段化包括用一种或多种限制性内切核酸酶处理输入样品中的核酸。片段化可以产生具有5’突出端、3’突出端、平端或其组合的片段。在一些实施方案中，例如当片段化包括使用一种或多种限制性内切核酸酶时，样品多核苷酸的切割会产生具有可预测序列的突出端。在一些实施方案中，该方法包括通过本领域中已知的标准方法例如柱纯化或从琼脂糖凝胶分离对片段进行大小选择的步骤。

在一些实施方案中，输入样品中的核酸可被片段化成具有一个或多个特定大小范围的片段化的核酸分子或多核苷酸的群体。在一些实施方案中，片段具有从约10个至约10,000个核苷酸的平均长度。在一些实施方案中，片段具有从约50个至约2,000个核苷酸的平均长度。在一些实施方案中，片段具有约100-2500个、10-1000个、10-800个、10-500个、50-500个、50-250个或50-150个核苷酸的平均长度。在一些实施方案中，片段具有少于10,000个核苷酸的平均长度，诸如少于5,000个核苷酸、少于2,500个核苷酸、少于2,500个核苷酸、少于1,000个核苷酸、少于500个核苷酸，诸如少于400个核苷酸、少于300个核苷酸、少于200个核苷酸或少于150个核苷酸。

在一个实施方案中，可在核酸的片段化后进行核酸片段的末端修复。末端修复可包括平端、非平端(即黏性或粘性末端)或单碱基突出端的产生，诸如通过缺乏3’外切核酸酶活性的聚合酶向核酸片段的3'末端添加一个dA核苷酸。末端修复可使用众多本领域已知的酶和/或方法来进行，包括但不限于可商购获得的试剂盒，如Encore^TM Ultra Low InputNGS Library System I。在一个优选的实施方案中，可对双链DNA片段进行末端修复以产生平端，其中该双链DNA片段包含5’磷酸和3’羟基。在一些实施方案中，双链DNA片段在与衔接子连接之前可进行平端打磨(blunt-end polish)(或“末端修复”)以产生具有平端的DNA片段。在双链片段上产生平端可通过使用单链特异性DNA外切核酸酶例如外切核酸酶1、外切核酸酶7或其组合降解双链产物的突出单链末端来进行。或者，可通过使用单链特异性DNA内切核酸酶，例如但不限于绿豆内切核酸酶或S1内切核酸酶使双链DNA片段平端化(bluntended)。或者，可通过使用含有单链外切核酸酶活性的聚合酶例如T4DNA聚合酶或含有单链外切核酸酶活性的任何其他聚合酶或其组合降解双链产物的突出单链末端而使双链产物平端化。在一些情况下，含有单链外切核酸酶活性的聚合酶可在含有或不含一种或多种dNTP的反应混合物中进行孵育。在其他情况下，可使用单链核酸特异性外切核酸酶与一种或多种聚合酶的组合来对通过包含核酸的样品的片段化而产生的双链片段进行平端化。在另外其他的情况下，可通过补平双链片段的突出单链末端来使核酸片段平端化。例如，片段可与聚合酶如T4DNA聚合酶或Klenow聚合酶或其组合在一种或多种dNTP的存在下孵育以补平双链片段的单链部分。或者，可通过使用外切核酸酶和/或聚合酶的单链突出端降解反应与在一种或多种dNTP的存在下使用一种或多种聚合酶的补平反应相结合来对双链DNA片段进行平端化。

在一些实施方案中，片段化的核酸的5’和/或3’末端核苷酸序列在与本发明的衔接子寡核苷酸连接之前不进行修饰或末端修复。例如，由限制性内切酶进行的片段化可用于产生可预测的突出端，随后与包含与核酸片段上的可预测突出端互补的突出端的一个或多个衔接子寡核苷酸连接。在另一个实例中，通过酶切产生可预测的平端，随后可将平端化的核酸片段与包含平端的衔接子寡核苷酸连接。在一些实施方案中，末端修复之后可添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个核苷酸，诸如一个或多个腺嘌呤、一个或多个胸腺嘧啶、一个或多个鸟嘌呤、或一个或多个胞嘧啶，以产生突出端。具有突出端的核酸片段可与具有互补突出端的一个或多个衔接子寡核苷酸连接，例如在连接反应中。例如，可使用不依赖于模板的聚合酶将单个腺嘌呤添加至末端修复的DNA片段的3’末端，随后与一个或多个衔接子连接，每个衔接子都在3’末端具有胸腺嘧啶。在一些实施方案中，衔接子寡核苷酸可与平端双链核酸片段连接，该平端双链核酸片段已经通过用一个或多个寡核苷酸延伸3’末端、随后进行5’磷酸化而得到修饰。在一些情况下，可以在含有镁的合适的缓冲液中，在一种或多种dNTP的存在下，使用聚合酶，例如Klenow聚合酶或在此提供的任意合适的聚合酶，或使用末端脱氧核苷酸转移酶，来进行3’末端的延伸。在一些实施方案中，具有平端的核酸片段可以与含有平端的一个或多个衔接子连接。可以在含有ATP和镁的合适的缓冲液中例如使用T4多核苷酸激酶进行核酸片段的5’末端的磷酸化。可以任选地处理片段化的核酸分子以对5’末端或3’末端进行去磷酸，例如，通过使用本领域已知的酶，例如磷酸酶。

本文所述的用于富集靶核酸序列的方法进一步包括将第一衔接子附加至通过本文所述的方法产生的核酸片段上。在一个实施方案中，第一衔接子可以是正向衔接子。可通过使用连接反应或引发反应来完成第一衔接子向通过本文所述方法产生的核酸片段上的附加。在一个实施方案中，第一衔接子向核酸片段上的附加包含连接。在一个实施方案中，可以在核酸片段的末端修复后，将第一衔接子与核酸片段连接。在另一实施方案中，可以在核酸片段产生后，在不进行核酸片段的末端修复的情况下，将第一衔接子与核酸片段连接。第一衔接子可以是本领域中已知的任何类型的衔接子，包括但不限于常规双链体或双链衔接子，其中衔接子包含两条互补的链。在一个优选实施方案中，第一衔接子可以是双链DNA衔接子。在一个实施方案中，第一衔接子可以是具有已知序列的寡核苷酸，因此允许产生和/或使用序列特异性引物，以便对附加或连接有第一衔接子的任何多核苷酸进行扩增和/或测序。在一个实施方案中，第一衔接子可以是常规双链体衔接子，其中第一衔接子包含本领域中已知的序列。在一个优选实施方案中，第一衔接子可从多个方向附加至通过本文所述方法产生的核酸片段上。在一个优选实施方案中，本文所述的方法可涉及使用包含具有已知序列的双链DNA的第一双链体衔接子，该第一双连体衔接子是平端化的并且可从两个方向中的一个方向上与通过本文所述方法产生的双链核酸片段结合。在一个实施方案中，第一衔接子可与每个核酸片段连接，从而使每个核酸片段包含相同的第一衔接子。换言之，每个核酸片段包含共同的第一衔接子。在另一个实施方案中，第一衔接子可附加或连接至通过本文所述方法产生的核酸片段的文库上，从而使得该核酸片段文库中的每个核酸片段包含与一个或两个末端连接的第一衔接子。

在一个实施方案中，第一衔接子可连接或附加至通过本文所述方法产生的核酸片段的5’和/或3’末端。第一衔接子可包含两条链，其中每条链包含游离的3’羟基但是两条链都不包含游离的5’磷酸。在一个实施方案中，在第一衔接子每条链上的游离的3’羟基可与存在于本发明核酸片段的任一末端上的游离5’磷酸基连接。在该实施方案中，第一衔接子包含连接链和非连接链，从而连接链可与核酸片段任一末端上的5’磷酸连接，而在第一衔接子的非连接链与核酸片段任一末端上的3’羟基之间可能存在切口或缺口。在一个实施方案中，可通过进行缺口修复反应来补平该切口或缺口。在一个实施方案中，可使用具有链置换活性的DNA依赖性DNA聚合酶来进行缺口修复。在一个实施方案中，可使用具有弱或无链置换活性的DNA依赖性DNA聚合酶来进行缺口修复。在一个实施方案中，第一衔接子的连接链可作为缺口修复或补平反应的模板。在该实施方案中，缺口修复或补平反应包括以第一衔接子的连接链作为模板的延伸反应，并且导致产生具有互补端或末端的核酸片段，例如，如图1所示。在一个实施方案中，可使用Taq DNA聚合酶进行缺口修复。在一个实施方案中，第一衔接子与通过本文所述方法产生的核酸片段连接后可不进行缺口修复，例如，如图2所示。在该实施方案中，核酸片段包含仅在每条链的5’末端连接的第一衔接子序列。

第一衔接子与核酸片段的连接和任选的缺口修复产生第一衔接子-核酸片段复合物。在一个实施方案中，可使第一衔接子-核酸片段复合物变性。可使用本领域中已知的任何方法来实现变性，包括但不限于物理、热和/或化学变性。在一个实施方案中，可使用热变性或高温变性来实现变性。在一个实施方案中，第一衔接子-核酸片段复合物的变性产生了仅在核酸片段的5’末端处包含第一衔接子序列的单链核酸片段，例如，如图2所示。在另一个实施方案中，第一衔接子-核酸片段复合物的变性产生在核酸片段的5’末端和3’末端均包含第一衔接子序列的单链核酸片段，例如，如图1所示。

在一个实施方案中，可以使包含附加至5’末端或附加至5’末端和3’末端两端的第一衔接子序列的核酸片段变性，以产生包含附加至5’末端或附加至5’末端和3’末端两端的第一衔接子序列的单链核酸片段。在一个实施方案中，本文所述的本发明的方法可用于产生多个包含附加至5’末端或附加至5’末端和3’末端两端的第一衔接子序列的单链核酸片段。在一个实施方案中，如下的寡核苷酸可与单链核酸片段退火，该寡核苷酸在第一末端包含与存在于单链核酸片段中的目标靶序列互补的序列并且在第二末端包含来自第二衔接子的序列，其中该第二衔接子序列不与靶核酸互补。在一个实施方案中，第二衔接子序列可以是来自反向衔接子的序列。在一个实施方案中，目标靶核酸序列可存在于一个或多个单链核酸片段中。在一个实施方案中，不同的或独特的目标靶核酸序列可存在于一个或多个单链核酸片段中。在一个实施方案中，一个或多个寡核苷酸可包含与存在于一个或多个单链核酸片段中的相同目标序列互补的序列。在该实施方案中，所述一个或多个寡核苷酸可包含与相同目标序列的不同部分或区域互补的序列。在一个实施方案中，所述不同区域可彼此相邻。在一个实施方案中，所述不同区域可彼此不相邻。在优选实施方案中，包含与相同目标靶核酸序列互补的序列的一个或多个寡核苷酸进一步包含相同的第二衔接子序列。在另一实施方案中，一个或多个寡核苷酸可包含与可能存在于一个或多个单链核酸片段中的不同或独特的目标序列互补的序列。在一个优选实施方案中，包含与不同或独特的目标靶核酸序列互补的序列的一个或多个寡核苷酸进一步包含相同的第二衔接子序列。在一个实施方案中，与目标靶序列互补的序列可以在寡核苷酸的3’末端并且第二衔接子序列可以在寡核苷酸的5’末端。在一个优选的实施方案中，第二衔接子序列与目标靶核酸序列不互补。这样，第二衔接子序列作为尾部。第二衔接子序列可以是常规的衔接子序列。在一个优选的实施方案中，第二衔接子序列可以是不同于或有别于如上所述附加至单链核酸片段上的第一衔接子序列的常规衔接子序列。在一个实施方案中，第二衔接子序列可具有已知的序列，因此允许产生和/或使用序列特异性引物，以便对附加或连接有第二衔接子的任意多核苷酸进行扩增和/或测序。在一个单独的实施方案中，寡核苷酸可以与包含附加至5’末端或附加至5’末端和3’末端两端的第一衔接子序列的核酸片段退火，而不需要预先变性。在该实施方案中，寡核苷酸的退火可通过在该寡核苷酸和包含附加至双链核酸片段的5’末端或者5’末端和3’末端两端的第一衔接子序列的双链核酸片段之间形成三股螺旋或三链体来进行。在该实施方案中，该双链核酸序列包含目标序列，并且可存在于多个包含附加至5’末端或附加至5’和3’末端两端的第一衔接子序列的双链核酸片段之间。进一步对于该实施方案，该寡核苷酸包含与双链核酸片段中的目标序列互补的序列。总之，如下的寡核苷酸的使用允许利用本文所述的方法选择性结合并随后富集所述核酸片段，该寡核苷酸包含与存在于一个或多个或多种核酸片段之间的核酸片段中的目标靶序列互补的序列。

如上所述使寡核苷酸退火后，可利用聚合酶延伸寡核苷酸。在一个实施方案中，该聚合酶可以是DNA依赖性DNA聚合酶。在一个实施方案中，该DNA依赖性DNA聚合酶可以是本文所述的任意DNA依赖性DNA聚合酶，并且寡核苷酸的延伸可以通过本领域中已知的任何方法来进行。在一个实施方案中，包含第二衔接子序列(其中该第二衔接子序列不与靶核酸互补)和与包含附接至一个和/或两个末端上的第一衔接子的核酸片段中存在的目标靶序列互补的序列的寡核苷酸可与核酸片段退火并且用聚合酶延伸，以产生在第一末端处包含第一衔接子且在第二末端处包含第二衔接子序列的寡核苷酸延伸产物。在一个实施方案中，核酸片段可存在于多个包含附加至一个或/或两个末端的第一衔接子的核酸片段之中。在该实施方案中，仅能对含有目标靶序列的核酸片段产生寡核苷酸延伸产物。

在一个实施方案中，通过本文所述方法产生的寡核苷酸延伸产物可经历扩增反应。在一个实施方案中，该扩增反应可以是指数式的，并且可在各种温度循环或等温下进行。在一个实施方案中，该扩增可以是聚合酶链反应。在一个实施方案中，该扩增反应可以是等温的。在一个实施方案中，如通过本文所述方法产生的寡核苷酸延伸产物在一个末端上含有第一衔接子并且在另一末端上含有第二衔接子序列。在一个优选实施方案中，寡核苷酸延伸产物可与模板核酸片段分离，以便产生在5’末端上具有第一衔接子序列并且在3’末端上具有第二衔接子序列的单链寡核苷酸延伸产物。然后可使用包含与第一衔接子互补的序列的第一引物和包含与第二衔接子序列互补的序列的第二引物对单链寡核苷酸延伸产物进行扩增。这样，仅有同时包含第一和第二衔接子序列的寡核苷酸延伸产物将会得到扩增并因此被富集。在一个实施方案中，第一衔接子和/或第二衔接子序列可包含标识序列。在一个实施方案中，该标识序列可以是条形码序列。在一个实施方案中，条形码序列针对第一衔接子和第二衔接子序列可以是相同的或不同的。在一个实施方案中，第一衔接子和/或第二衔接子序列可包含能够用于例如但不限于测序的下游应用的序列。在一个实施方案中，第一衔接子和/或第二衔接子序列可包含流动池(flow cell)序列，该流动池序列可用于使用由Illumina开发的和本文所述的测序方法进行测序。

在一个备选实施方案中，本发明的方法可用于产生核酸片段或***片段的文库，其中每个核酸片段在一个或两个末端处包含衔接子。在一个实施方案中，衔接子可存在于两个末端处并且可能彼此不同。在一个实施方案中，衔接子可存在于两个末端处并且可包含相同的衔接子序列。包含在两个末端处具有不同衔接子的核酸***片段的文库的产生可涉及如上所述的用于产生在第一末端上包含第一衔接子序列并且在另一末端上包含第二衔接子序列的寡核苷酸延伸产物的方法，不同之处在于与核酸片段结合并可延伸的寡核苷酸包含随机序列。在该实施方案中，寡核苷酸在3’部分包含可与一个或多个核酸片段杂交的随机序列，并且在5’部分进一步包含第二衔接子序列。如图4所示，寡核苷酸沿核酸片段和相应的第一衔接子的延伸产生在一个末端包含第二衔接子并且在另一末端包含与第一衔接子互补的序列的一个或多个产物。在一个实施方案中，存在于寡核苷酸中的随机序列可以与一个或多个核酸***片段结合并在其上延伸。在一个实施方案中，包含含有随机序列的3’部分和含有第二衔接子序列的5’部分的一个或多个寡核苷酸可与包含在每个核酸***片段的一个或两个末端上含有第一衔接子序列的核酸***片段的文库退火。在一个实施方案中，第一衔接子序列对于每个核酸***片段可以是相同的或共同的。在一个实施方案中，第二衔接子序列对于一个或多个寡核苷酸中的每一个可以是相同的或共同的。在一个实施方案中，上述方法可用于产生核酸***片段的文库，其中每个核酸***片段在一个末端上含有共同的第一衔接子并且在第二末端上含有共同的第二衔接子序列。在一个实施方案中，第一衔接子和第二衔接子序列可彼此不同。在一个实施方案中，第一衔接子和第二衔接子序列可包含相同的衔接子序列。总之，如上所述的本发明方法可用于核酸序列文库的高效产生。

在如上所述的本发明方法的又一备选实施方案中，第一衔接子可以是包含部分双链体的双链DNA衔接子，其中该衔接子的两条链可具有不同的长度，在5’末端具有互补区域和突出区域。在该实施方案中，部分双链体衔接子的长链的5’末端可包含针对核酸修饰酶如限制酶的独特位点，该位点在双链体衔接子的短链中是不存在的。在进一步的实施方案中，可通过用封闭基团例如双脱氧核苷酸(ddCMP、ddAMP、ddTMP或ddGMP)替换3’OH基来修饰短链衔接子的3’末端，以阻止聚合酶延伸。在该实施方案中，包含部分双链体的第一衔接子可与通过本文所述方法产生的核酸片段连接。在一个实施方案中，部分双链体第一衔接子连接后，可进行如上所述的缺口修复反应。在该实施方案中，部分双链体第一衔接子连接后，不进行缺口修复反应。在一个优选的实施方案中，部分双链体第一衔接子在短链上含有游离5’磷酸并且在长链上含有游离3’羟基。在该实施方案中，部分双链体衔接子的连接产生双链核酸片段，其中该双链核酸片段的两个末端包含部分双链体第一衔接子的长链和短链。双链部分双链体第一衔接子-核酸片段复合物可通过连接产生。在一个实施方案中，可使双链部分双链体第一衔接子-核酸片段复合物变性，以产生在第一末端上含有第一衔接子的长链并且在第二末端上含有第一衔接子的短链的单链核酸片段。在该实施方案中，第一末端是5’末端且第二末端是3’末端。在一个实施方案中，第一衔接子可附加至通过本文所述方法产生的一个或多个核酸片段上，以使得每个核酸片段包含相同的第一衔接子，或者，换言之，第一衔接子对于每个核酸***片段可以是共同的。包含与单链核酸片段中的目标序列互补的序列的寡核苷酸或引物可以与该单链核酸片段退火，并使用聚合酶进行延伸。在一个实施方案中，该聚合酶可以是DNA依赖性DNA聚合酶。在一个实施方案中，该DNA依赖性DNA聚合酶可以是如本文所述的任意DNA依赖性DNA聚合酶，并且寡核苷酸的延伸可通过本领域中已知的任何方法进行。与单链核酸片段退火的引物的延伸产生在一个末端上包含与第一衔接子的长链互补的序列的寡核苷酸延伸产物。在一个实施方案中，寡核苷酸延伸产物保持与单链核酸片段杂交，使得针对核酸修饰酶特异性的限制和/或切割位点成为双链的。随后可以用对双链限制位点特异性的核酸修饰酶切割双链位点。在一个实施方案中，该核酸修饰酶可以是限制酶。在一个实施方案中，该限制酶可对双链限制位点具有特异性。在一个实施方案中，限制位点的切割可产生平端或非平端。在一个实施方案中，切割后，可以通过本文所述的任何方法在核酸片段的末端上进行末端修复。限制和/或切割位点的切割产生可与第二衔接子连接的位点。第二衔接子的连接可通过如本文所述的任何连接方法来进行。在一个实施方案中，连接产生在第一末端上含有第二衔接子且在第二末端上含有部分双链体的双链核酸片段，其中该部分双链体包含含有第一衔接子短链的序列的3’突出端。随后可使用本文所述的任何变性方法使双链核酸片段变性，以产生在第一末端上包含第二衔接子序列并且在第二末端上包含第一衔接子短链的序列的单链核酸片段。在一个实施方案中，第一末端和第二末端分别包含5’末端和3’末端。在一个实施方案中，双链限制位点切割后，第二衔接子可附加至一个或多个核酸片段上，从而使每个核酸片段包含相同的第二衔接子，或者，换言之，第二衔接子对于每个核酸***片段可以是共同的。随后可使用对第二引物具有特异性的第一引物和对存在于第一衔接子短链中的序列具有特异性的第二引物来对单链核酸片段进行扩增。在一个实施方案中，该扩增反应可以是指数式的，并且可在各种温度循环或等温下进行。在一个实施方案中，该扩增可以是聚合酶链反应。在一个实施方案中，该扩增反应可以是等温的。总之，仅有含有第二衔接子和第一衔接子短链的片段将会得到扩增或富集。在该方法提供文库的靶向片段的富集，而不富集通过延伸包含与目标靶序列互补的序列的寡核苷酸而产生的寡核苷酸延伸产物的情况下，不存在原始DNA文库的失真(distortion)，并且该富集与***长度无关。因为部分双链体衔接子短链的3’末端是3’封闭的，所以该方法允许定向或非对称连接。在一个实施方案中，包含与核酸片段中的目标序列互补的序列的寡核苷酸进一步包含反向衔接子序列。在该实施方案中，与核酸片段中的目标序列互补的序列可存在于寡核苷酸的3’部分，并且反向衔接子序列可存在于5’部分。进一步对于该实施方案，反向衔接子序列可以是共同的或常规的衔接子序列，并且可以不同于或有别于第一和/或第二衔接子。更进一步对于该实施方案，上述方法可导致产生在一个末端上包含第二衔接子并且在另一末端上包含反向衔接子序列的单链核酸片段。该实施方案后，可以通过使用对第二衔接子具有特异性的第一引物和对第三衔接子序列具有特异性的第二引物进行扩增来富集单链核酸片段。

本发明的方法可进一步适用于从文库对目标靶核酸序列的任意富集，该文库包含在一个或两个末端处附加有衔接子序列的样品的核酸片段，其中该文库如下产生：使用如本文所述的衔接子或衔接子序列与一个或两个末端的连接，或通过不依赖于连接的方法，例如Nextra，即一种转座组(transposome)驱动的方法。在一个实施方案中，该核酸可以是DNA，诸如基因组DNA或cDNA。在一个实施方案中，该核酸可以是双链的。目标核酸序列的富集可使用本文所述的用于靶标富集的方法来实现。在一个实施方案中，从含有在一个或两个末端上附加有衔接子的核酸***片段的文库富集目标靶核酸序列的方法包括使核酸***片段变性以产生单链核酸***片段的文库。在一个实施方案中，每个核酸***片段可在一个末端上包含第一衔接子序列并且在相反末端上包含第二衔接子序列。在一个实施方案中，第一衔接子和第二衔接子可彼此不同。在一个实施方案中，第一衔接子和第二衔接子可包含相同的衔接子序列。在一个实施方案中，每个核酸***片段可在一个末端上包含第一衔接子序列并且在相反末端上包含第二衔接子序列，以使得变性产生在一个末端上包含第一衔接子序列并且在相反末端上包含第二衔接子序列的单链核酸***片段的文库。可使用本文所述的任何方法实现变性。进一步对于上述实施方案，一个或多个寡核苷酸可与单链核酸***片段退火。在一个实施方案中，一个或多个寡核苷酸中的每一个包含与存在于一个或多个核酸***片段中的目标靶核酸序列互补的3’部分和包含第三衔接子序列的5’部分。在一个实施方案中，第三衔接子序列与第一衔接子和第二衔接子中的任一个或两个不同。一个或多个寡核苷酸可用聚合酶(即DNA聚合酶)进行延伸，从而产生在第一末端处具有第一或第二衔接子并且在第二末端具有第三衔接子序列的一个或多个寡核苷酸延伸产物。在一个实施方案中，第一末端包含5’末端且第二末端包含3’末端。可使用可能与第一或第二衔接子互补的第一引物和可能与第三衔接子序列互补的第二引物来扩增一个或多个寡核苷酸延伸产物，以富集在各末端处包含第一或第二衔接子和第三衔接子序列的核酸片段。在一个实施方案中，第一和第二衔接子对于文库中的每个核酸***片段可以是共同的。在一个实施方案中，第三衔接子序列对于一个或多个寡核苷酸中的每一个可以是共同的。总之，如上所述的靶标富集方法可用于产生组合物，该组合物包含针对任何目标靶序列从由衔接子已连接至一个或两个末端的核酸***片段组成的非富集文库中富集的核酸***片段文库。

图1图示了用于富集目标靶序列的本文所述方法的优选实施方案的示意图。总之，图1描述了从核酸片段文库或多个核酸片段中分离或富集包含靶核酸序列的核酸片段或***片段的方法。图1的方法包括产生核酸片段或***片段的连接文库，其中该连接文库的每个片段或***片段包含共同的正向衔接子和与正向衔接子不同的片段或***片段特异性反向衔接子，以使得使用针对共同正向衔接子的引物和针对反向衔接子的引物进行的消减PCR能富集包含靶核酸序列的核酸片段或***片段。图1所示方法的输入是片段化的DNA。片段化的DNA是双链的且包含DNA片段文库或多个DNA片段。在一个实施方案中，DNA片段可来自复合DNA，如双链DNA、基因组DNA或来自超过一个有机体的混合的DNA。在一个实施方案中，DNA片段可来自已通过第一链合成反应转化成cDNA的RNA，该转化使用本领域公知的、用于从RNA模板产生cDNA的任何方法，可包括但不限于将RNA与引物(即随机引物)相组合，以及使用RNA依赖性DNA聚合酶逆转录RNA模板。在一个实施方案中，DNA片段可来自已使用本领域公知的任何方法通过第一和第二链合成反应转化成双链cDNA的RNA。可通过本文描述的任何用于核酸片段化的方法来实现DNA的片段化以产生DNA片段，该方法可包括但不限于物理的(即超声处理)和/或化学的(即限制酶处理)片段化反应。

如图1所示，单一正向衔接子与DNA片段连接。在一个实施方案中，单一正向衔接子可包含已知的序列。在一个实施方案中，单一正向衔接子可以是共同的衔接子。在一个实施方案中，DNA片段可以经历如本文所述的末端修复反应以产生平端。在该实施方案中，单一正向衔接子还可包含平端，并且在单一正向衔接子和DNA片段之间的连接可通过如本文所述的平端连接来进行。可通过使用酶(即T4DNA连接酶)和本领域中已知的方法来促进连接，包括但不限于可商购获得的试剂盒，如Encore^TM Ultra Low Input NGS Library System。在图1中，正向衔接子可包含与DNA片段5’末端上的游离5’磷酸连接的链(连接链)和不与DNA片段3’末端连接的链(非连接链)。在一个实施方案中，连接反应可导致在单一正向衔接子的非连接链和DNA片段的3’末端之间产生切口或缺口。在该实施方案中，可通过缺口修复或补平反应来修复或补平切口或缺口，其中可使用聚合酶(优选DNA依赖性DNA聚合酶，诸如Taq DNA聚合酶)延伸DNA片段的3’末端，其中正向衔接子的连接链可作为模板。在该实施方案中，缺口修复产生具有互补末端的DNA片段。如图1所述，使具有互补末端的DNA片段变性，以产生包含具有互补末端的单链DNA片段的变性文库。可使用本领域中已知的任何方法来实现变性，该方法可包括但不限于热变性和/或化学变性。

如图1所示，具有反向衔接子尾部的定制(custom)寡核苷酸与具有互补末端的单链DNA片段退火。在一个实施方案中，具有反向衔接子尾部的定制寡核苷酸可包含3’部分和5’部分，该3’部分包含与在单链DNA片段之一中的目标靶序列互补的序列，该5’部分包含不与变性文库中的单链DNA片段互补的反向衔接子序列。在一个实施方案中，反向衔接子序列可以是已知的序列。在一个优选实施方案中，如本文所述，反向衔接子序列可与单一正向衔接子不同。在一个实施方案中，可将多个具有反向衔接子尾部的定制寡核苷酸加至变性文库中，其中所述多个具有反向衔接子尾部的定制寡核苷酸包含3’部分和5’部分，该3’部分包含与变性文库的一个或多个单链DNA片段中的目标靶序列互补的序列，该5’部分包含不与变性文库中的单链DNA片段互补的反向衔接子序列。在一个实施方案中，在多个具有反向衔接子尾部的定制寡核苷酸中的每一个中，反向衔接子尾部包含相同的反向衔接子序列，并且其中反向衔接子序列不同于正向衔接子序列。在另外一个实施方案中，对于多个具有反向衔接子尾部的定制寡核苷酸中的每一个，反向衔接子尾部包含不同的反向衔接子序列，并且其中每个不同的反向衔接子序列不同于正向衔接子序列。在一个实施方案中，具有反向衔接子尾部的定制寡核苷酸的3’部分可以是特异性序列，其中定制寡核苷酸包含与目标靶序列互补的序列，并且提供了一种使用本发明的方法靶向富集一个或多个目标序列的手段。在另一实施方案中，具有反向衔接子尾部的定制寡核苷酸的3’部分可以是随机产生的序列，该序列可与在一个或两个末端上具有衔接子序列的片段文库的随机序列杂交，从而提供了利用本发明的方法进行有效的、非富集的文库产生的手段。

在具有反向衔接子尾部的定制寡核苷酸与变性文库的单链DNA片段中的目标序列退火后，使用本领域中已知的任何方法延伸具有反向衔接子尾部的定制寡核苷酸，该方法可包括但不限于使用变性文库的单链DNA片段作为模板，利用DNA依赖性DNA聚合酶进行的延伸。具有反向衔接子尾部的定制寡核苷酸的延伸产生在一个末端具有正向衔接子序列并且在另一末端具有反向衔接子序列的寡核苷酸延伸产物。在该实施方案中，具有反向衔接子尾部的定制寡核苷酸仅可与变性文库中的DNA片段退火并在其上延伸，该DNA片段包含具有反向衔接子尾部的定制寡核苷酸所针对的目标靶序列。如图1所示，随后使用针对正向衔接子序列的第一引物和针对反向衔接子序列的第二引物来进行消减聚合酶链反应(PCR)程序，使得仅有在一个末端具有正向衔接子序列并且在另一个末端具有反向衔接子序列的寡核苷酸延伸产物可以得到扩增，并因此富集。

图2图示了针对图1所述的消减PCR富集方法的另一个实施方案，其中双链体正向衔接子(P1)与双链核酸片段的连接不经历缺口修复。双链体正向衔接子(P1)包含与核酸片段5’末端上的游离5’磷酸连接的链(连接链；P1)和不与核酸片段3’末端连接的链(非连接链；P1rc)。在该实施方案中，连接链与双链核酸片段的两条链的5’末端连接，而在非连接链和双链核酸片段两条链的3’末端之间产生缺口或切口。如图2所示，P1衔接子与核酸片段连接后，在不进行缺口修复或补平反应的情况下进行变性，从而产生具有非互补末端的单链核酸片段。在该实施方案中，具有非互补末端的单链核酸片段在5’末端包含P1正向衔接子序列并且在3’末端包含片段特异性序列。在进一步的实施方案中，如上所述并且如图1所示，可以进一步处理具有非互补末端的单链核酸片段，从而产生在5’末端具有P1正向衔接子序列并且在3’末端具有不同的反向衔接子序列的单链核酸片段。

图4图示了本发明的另一实施方案，其用于高效产生包含在各末端上具有不同衔接子的核酸片段的文库。在该实施方案中，用于产生如下变性文库的方法类似于针对图1所述的方法，该变性文库包含在5’末端上具有单一正向衔接子序列并且在3’末端上具有反向衔接子序列的单链DNA片段。然而，在图4中，使用具有反向衔接子尾部的寡核苷酸，从而该寡核苷酸包含含有随机序列的3’部分和反向衔接子尾部，其中该反向衔接子尾部包含与单一正向衔接子序列不同的反向衔接子序列。如图4所示，可使用针对单一正向衔接子序列的第一引物和针对反向衔接子序列的第二引物来进行PCR，其中第一和第二引物均进一步包含流动池序列。这样，在5’末端上具有单一正向衔接子序列并且在3’末端上具有反向衔接子序列的单链DNA片段包含流动池序列，该流动池序列可用于将扩增的单链DNA片段附着至流动池，以便如美国专利5,750,341、6,306,597和5,969,119所述，通过由Illumina商业化的方法进行后续测序。

图3图示了用于从复合文库中富集包含在双链核酸***片段中的靶核酸序列或目标序列的方法。在一个实施方案中，该复合文库包含来自基因组DNA样品的核酸***片段。在图3中，单一正向衔接子包含含有长链A的部分双链体正向衔接子，该长链A与短链B形成部分双链体。部分双链体衔接子的链A进一步包含限制酶位点，而链B不含限制酶位点。链B进一步包含封闭基团，其中链B的3’末端通过用可阻止聚合酶延伸的封闭基团置换3’OH基而修饰。在一个实施方案中，部分双链体正向衔接子与双链核酸片段连接，从而产生了具有附加至两个末端的部分双链体正向衔接子的双链***片段。在该实施方案中，部分双链体衔接子的链B的5’末端可包含游离的5’磷酸，该游离的5’磷酸可与存在于双链***片段的一条或两条链上的游离的3’OH连接。随后的变性产生在5’末端上包含序列A并且在3’末端上包含链B的单链***片段。针对单链***片段内的目标特异性序列的引物C可与特异性序列退火，并且使用单链***片段作为模板，用DNA聚合酶进行延伸。在一个实施方案中，引物C可以是序列特异性引物，并且用于根据本发明的方法富集一个或多个感兴趣的靶标。在一个实施方案中，引物C可以是随机引物。使用DNA聚合酶延伸引物C产生延伸的引物C产物，该产物在与模板***链的双链复合物中在其3’末端处包含与序列A互补的序列，从而在序列A和其互补序列之间已经产生了双链限制位点。在一个实施方案中，该双链限制酶识别位点可被双链限制位点特异性的限制酶切割，从而在一个末端处产生截短的或切割的衔接子序列。然后，使用本文所述的任何连接方法，将包含共同的或常规的双链体衔接子D的第二正向衔接子与切割位点连接，从而产生在一个末端处包含第二正向衔接子序列D并且在相反末端上包含含有链B的3’突出端的双链复合物。使在一个末端处包含第二正向衔接子序列D并且在相反末端上包含含有链B的3’突出端的双链复合物变性，并且使用针对第二正向衔接子D的第一引物和针对链B的第二引物进行扩增。以这种方式，图3所示的方法可用于从复合文库中富集感兴趣的特定序列，因为该方法被设计成使得第二正向引物D只能结合通过在引物C延伸后对序列A和其互补序列之间产生的双链限制位点进行限制酶消化而产生的双链切割位点。如所述的，引物C可针对存在于多个***片段之中的单一或多重的一个或多个***片段中的目标靶序列。此外，通过将引物C设计成与存在于多个***片段之中的***片段的一条链或另一条链上的目标靶序列结合，该方法可使链具有特异性。

除非另有说明，否则本文所用的遗传学、分子生物学、生物化学和核酸术语和符号采用该领域中的标准论著和教科书的术语和符号，例如Kornberg和Baker,DNAReplication,第二版(W.H.Freeman,New York,1992)；Lehninger,Biochemistry,第二版(Worth Publishers,New York,1975)；Strachan和Read,Human Molecular Genetics,第二版(Wiley-Liss,New York,1999)；Eckstein,编者,Oligonucleotides and Analogs:APractical Approach(Oxford University Press,New York,1991)；Gait,编者,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984)；等等。

输入核酸

输入可以是核酸。在一个实施方案中，输入可以是DNA。在一个实施方案中，输入核酸可以是复合DNA，诸如双链DNA、基因组DNA或来自超过一个有机体的混合DNA。在一个实施方案中，输入可以是RNA。在一个实施方案中，RNA可使用本领域中的标准技术来获得及纯化，并且包括纯化或未纯化形式的RNA，其包括但不限于mRNA、tRNA、snRNA、rRNA、逆转录病毒、小的非编码RNA、微小RNA、多核糖体RNA、前mRNA、内含子RNA、病毒RNA、无细胞RNA及其片段。非编码RNA或ncRNA可包括snoRNA、微小RNA、siRNA、piRNA和长ncRNA。在一个实施方案中，输入核酸可以是cDNA。cDNA可由RNA例如mRNA产生。cDNA可以是单链或双链的。输入DNA可以是诸如人、大鼠、小鼠、其他动物、特定植物、细菌、藻类、病毒等特定物种的DNA。输入复合物也可来自诸如宿主-病原体、细菌群体等不同物种的基因组的混合物。输入DNA可以是由不同物种的基因组混合物制备的cDNA。或者，输入核酸可来自合成来源。输入DNA可以是线粒体DNA。输入DNA可以是无细胞DNA。无细胞DNA可从例如血清或血浆样品获得。输入DNA可包含一个或多个染色体。例如，如果输入DNA来自人类，则DNA可包含染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X或Y中的一个或多个。DNA可来自线性或环状基因组。DNA可以是质粒DNA、粘粒DNA、细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)。输入DNA可以来自超过一个个体或有机体。输入DNA可以是双链的或单链的。输入DNA可以是染色质的一部分。输入DNA可与组蛋白相关。

在一些实施方案中，靶向选定的目标序列区域的寡核苷酸被设计成与单链核酸靶标杂交。在一个实施方案中，靶向选定的目标序列区域的寡核苷酸被设计成与单链DNA靶标杂交。在输入核酸样品包含基因组DNA或其他双链DNA的情况下，首先可使输入核酸样品变性，以使靶标成为单链的，并且允许寡核苷酸与期望的目标序列区域杂交。在这些实施方案中，本文描述的方法和组合物可允许区域特异性富集和扩增目标序列区域。在一些实施方案中，其他双链DNA可以是通过一个或多个靶RNA的第一和第二链合成产生的双链cDNA。

在其他实施方案中，靶向选定的目标序列区域的寡核苷酸被设计成在双链核酸不变性的情况下与该双链核酸靶标杂交。在其他实施方案中，靶向选定的目标序列区域的寡核苷酸被设计成在dsDNA不变性的情况下与该双链DNA靶标杂交。在这些实施方案中，靶向选定的目标序列区域的寡核苷酸被设计成在选定的目标序列区域形成三股螺旋(三链体)。可以在双链核酸样品没有预先变性的情况下，进行寡核苷酸与目标双链DNA序列区域的杂交。在此类实施方案中，本文描述的方法和组合物可允许目标序列区域的区域特异性富集以及链特异性富集和扩增。此方法可用于从复合核酸产生目标链特异性序列区域的拷贝，而无需使输入DNA的dsDNA变性，因此能够富集和分析在原始复合核酸样品中的多个目标序列区域。该方法可用于原位进行的研究和分析，能够研究和分析单细胞或极小的、明确定义的细胞群体集合中的复合基因组DNA，并且允许在不破坏染色质结构的情况下分析复合基因组DNA。

如本文所用的“靶核酸序列”或“靶序列”是期望对其进行富集的目标多核苷酸序列。在其实际序列方面，靶序列可以是已知的或未知的。通常，如本文所用的“模板”是包含靶核酸序列的多核苷酸。术语“靶序列”、“靶核酸序列”、“靶核苷酸序列”、“目标区域”或“目标序列”及其变体可交换使用。

本发明的寡核苷酸

如本发明所用的，术语“寡核苷酸”是指多核苷酸链，通常是少于200个残基的长度，最常见的是15-100个核苷酸的长度，而且意在包括更长的多核苷酸链。寡核苷酸可以是单链或双链的。如本发明所用的，术语“寡核苷酸”可与术语“引物”和“衔接子”交换使用。

如本文所用的，术语“杂交(hybridization)”/“杂交(hybridizing)”和“退火”可交换使用并且是指互补核酸的配对。

如本文所用的术语“引物”可指通常具有游离的3’羟基的核苷酸序列，其能够与模板(如一种或多种靶多核苷酸、一种或多种靶DNA、一种或多种靶RNA或引物延伸产物)杂交，并且也能够促进与模板互补的多核苷酸的聚合。引物可以是例如寡核苷酸。还可以是，例如，模板的序列(如引物延伸产物，或RNase[即RNase H]切割模板-DNA复合物后产生的模板片段)，该序列能够与模板本身中的序列杂交(例如，作为发夹环)，并且能够促进核苷酸的聚合。因此，引物可以是外源性(例如，加入的)引物或内源性(例如，模板片段)引物。引物可含有构成引物尾部的非杂交序列。即使引物的序列不与靶标完全互补，其仍可以与靶标杂交。

本发明的引物通常是在沿着多核苷酸模板由聚合酶进行的延伸反应中，例如在PCR、SPIA或cDNA合成中采用的寡核苷酸。寡核苷酸引物可以是单链的合成多核苷酸，在其3′末端含有能够与靶多核苷酸序列杂交的序列。通常，能与靶核酸杂交的引物的3′区域与序列或引物结合位点具有至少80％、优选90％、更优选95％、最优选100％的互补性。

如本文所用的“互补的”可指与序列的全部或仅与序列的一部分的互补性。特定寡核苷酸引物的可杂交序列中的核苷酸数应该使得用于杂交该寡核苷酸引物的严格性条件将会阻止过多的随机非特异性杂交。通常，寡核苷酸引物的杂交部分中的核苷酸数将至少与该寡核苷酸引物所杂交的靶多核苷酸上的限定序列一样大，即，至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少约20个，并且通常约6个至约10个或6个至约12个或12个至约200个核苷酸，通常约20个至约50个核苷酸。一般来说，靶多核苷酸大于寡核苷酸引物或先前所述的引物。

在一些情况下，所研究的靶多核苷酸序列的身份是已知的，并且可根据前述靶多核苷酸序列的反义序列来精确地合成可杂交序列特异性的寡核苷酸或引物。在一些实施方案中，使用多种序列特异性寡核苷酸或引物来与大量的目标基因组区域杂交，从而允许目标区域的选择性富集。在基因组区域可能非常长的情况下，可将多种寡核苷酸设计成与目标基因组区域内的不同序列区域杂交。在其他实施方案中，当靶多核苷酸序列未知时，寡核苷酸或引物的可杂交序列为随机序列。如本文所述，包含随机序列的寡核苷酸或引物可被称为“随机引物”或“随机寡核苷酸”。在一个实施方案中，可与靶序列杂交的本发明的寡核苷酸或引物可包含设计为与多种(例如2、3、4、约6、8、10、20、40、80、100、125、150、200、250、300、400、500、600、800、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、10,000、20,000、25,000种或更多种)靶序列杂交的引物或寡核苷酸的混合物。在一些情况下，所述多种靶序列可包含一组相关序列、随机序列、整个转录组或其一部分(例如，大部分)，或任何成组的序列如mRNA。在一些实施方案中，引物可针对于在本文所述的本发明中使用的衔接子中存在的已知序列。在该实施方案中，引物可包含在每组中含有一个或多个引物的成组引物，其中每组引物可针对不同的衔接子。

在本发明的某些实施方案中可以采用有尾引物或寡核苷酸。通常，有尾引物包含可与一种或多种靶多核苷酸杂交的3’部分和不可与一种或多种靶多核苷酸杂交的5’部分。通常，在有尾引物的可杂交的3’部分与一种或多种靶多核苷酸杂交的条件下，不可杂交的5’部分不与该一种或多种靶多核苷酸杂交。在一些实施方案中，不可杂交的5’部分包含衔接子序列。在一些实施方案中，不可杂交的5’部分包含共同的或常规的衔接子序列。在一些实施方案中，不可杂交的5’部分包含共同的或常规的衔接子序列，该衔接子序列有别于或不同于本发明中使用的其他衔接子的序列。在一些实施方案中，不可杂交的5’部分包含启动子特异性序列。通常，启动子特异性序列包含单链DNA序列区域，该区域在双链形式下能够介导RNA转录。启动子特异性序列的实例是本领域已知的，并且包括但不限于T7、T3或SP6RNA聚合酶启动子序列。当利用DNA聚合酶延伸有尾引物时，可以产生具有包含限定序列的5'部分的引物延伸产物。该引物延伸产物然后可有第二引物与之退火，该第二引物可利用DNA聚合酶延伸以产生在一端包含限定序列的双链产物。在其中一种或多种有尾引物的不可杂交的5’部分包含启动子特异性序列的一些实施方案中，在一端包含限定序列的双链产物的构建产生能够介导RNA转录的双链启动子序列。在一些实施方案中，可通过使包含与启动子特异性序列互补的序列的寡核苷酸与启动子特异性序列杂交来产生双链启动子序列。在一些实施方案中，双链启动子的形成之后可接着通过对双链启动子的下游序列进行RNA转录来产生单链RNA，通常在包含包括但不限于核糖核苷三磷酸(rNTP)和DNA依赖性RNA聚合酶的所有必需组分的反应混合物中进行。有尾引物可包含DNA、RNA或DNA和RNA两者。在一些实施方案中，有尾引物由DNA组成。

在本发明的某些实施方案中可以采用复合引物。复合引物是由RNA和DNA部分组成的引物。在一些方面，复合引物可以是包含例如3'-DNA部分和5'-RNA部分的有尾复合引物。在该有尾复合引物中，其全部或一部分包含DNA的3'部分与多核苷酸互补；而其全部或一部分包含RNA的5'部分不与该多核苷酸互补，并且在该有尾复合引物的3'部分与多核苷酸靶标杂交的条件下不与该多核苷酸杂交。当用DNA聚合酶延伸有尾复合引物时，可以产生具有包含限定序列的5'-RNA部分的引物延伸产物。这种引物延伸产物然后可有第二引物与之退火，该第二引物可利用DNA聚合酶延伸以产生在一端具有包含限定序列的RNA/DNA异源双链体的双链产物。可从部分异源双链体上选择性切割RNA部分以产生具有3'单链突出端的双链DNA，该双链DNA可用于本发明的各个方面，包括允许使用复合扩增引物进行等温扩增。

如本文所用的“随机引物”可以是通常包含这样一种序列的引物：该序列不一定基于样品中的特定或特异性序列而设计，而是基于随机引物的序列可与样品中的一种或多种序列(在给定的一组条件下)杂交的统计期望(或经验观测值)进行设计。随机引物通常是包含随机序列的寡核苷酸或寡核苷酸群体，其中在寡核苷酸上的给定位置处的核苷酸可以是四种核苷酸中的任意核苷酸或四种核苷酸的任意选定组(例如四种核苷酸中的仅三种，或四种核苷酸中的仅两种)。在一些情况下，寡核苷酸或寡核苷酸群体的所有位置可以是任意两种或更多种核苷酸。在其他情况下，仅寡核苷酸的一部分，例如特定区域，包含可以是任意两种或更多种碱基的位置。在一些情况下，包含可以是任意两种或更多种碱基的位置的寡核苷酸部分具有约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或约15-20个核苷酸的长度。在一些情况下，随机引物可以包含有尾引物，该有尾引物具有包含随机序列的3'区和作为包含特异性非随机序列的非杂交序列的5'区。3'区还可包含与包含poly-T序列的区域组合的随机序列。随机引物(或其互补体)的序列可以是或可以不是天然存在的，或者可以存在于或可以不存在于感兴趣的样品中的序列池中。如本领域中所熟知的，“随机引物”还可指这样的引物：其为共同设计为与期望的和/或大量的靶序列杂交的引物群体(多种随机引物)的成员。随机引物可在核酸序列上的多个位点处杂交。随机引物的使用提供了一种用于产生与靶多核苷酸或靶核酸序列互补的引物延伸产物的方法，该方法不需要预先了解靶标的确切序列。在一些实施方案中，引物的一部分是随机的，而引物的另一部分包含限定的序列。例如，在一些实施方案中，引物的3'部分将包含随机序列，而引物的5'部分包含限定的序列。在一些实施方案中，引物的3'随机部分将包含DNA，而引物的5'限定部分将包含RNA，在其他实施方案中，3'和5'部分都将包含DNA。在一些实施方案中，5'部分将包含限定的序列，而3'部分将包含可与样品中的大量RNA(如所有mRNA)杂交的poly-dT序列。在一些实施方案中，“随机引物”或包含随机产生的序列的引物包含引物的集合，该引物集合包含随机选自两种或更多种不同核苷酸的一种或多种核苷酸，使得随机选择的核苷酸的所有可能的序列组合可在该集合中呈现。在一些实施方案中，一种或多种随机引物的产生不包括从一种或多种随机引物的随机部分的可能的序列组合中排除或选择某些序列或核苷酸组合的步骤。

在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可以是有尾寡核苷酸。在一个实施方案中，5’-尾可包含RNA，并且不可与样品中的RNA杂交。在一个实施方案中，5’-尾可包含DNA，并且不可与样品中的DNA杂交。在一个实施方案中，5’-尾可包含衔接子，该衔接子不可与来自含有核酸的样品中的DNA和/或核酸片段杂交。在一个实施方案中，5’-尾可包含衔接子序列，该衔接子序列不可与来自含有核酸的样品中的DNA和/或核酸片段杂交。在一些实施方案中，5’-尾可包含共同的衔接子序列，该共同的衔接子序列不可与DNA杂交并且不同于本文所述的本发明方法中使用的任何其他衔接子或衔接子序列。在一些实施方案中，5’-尾可包含标识序列。在一些实施方案中，该标识序列可包含条形码序列。在一些实施方案中，5’-尾可包含共同的衔接子序列，该共同的衔接子序列不可与DNA和条形码序列杂交。

如本文所用的术语“衔接子”是指已知序列的寡核苷酸，其与靶多核苷酸或目标靶多核苷酸链的连接使得能够产生该靶多核苷酸或目标靶多核苷酸链的扩增就绪的(amplification-ready)产物。在衔接子加入之前，靶多核苷酸分子可以片段化或不进行片段化。

可以设想适于产生目标靶序列区域/链的扩增就绪产物的各种衔接子设计。例如，衔接子的两条链可以是自身互补的、非互补的或部分互补的。在本发明的图3中所描述的衔接子的共同特征是部分双链体设计，其中衔接子的两条链具有不同的长度，在5’末端具有互补区域和突出区域。部分双链体衔接子的长链的5’末端包含针对核酸修饰酶如限制酶的独特位点，该位点不存在于该双链体衔接子的短链中。短链衔接子的3’末端通过封闭基团例如双脱氧核苷酸(ddCMP、ddAMP、ddTMP或ddGMP)替换3’OH基团来进行修饰，以阻止聚合酶延伸。

在本发明的一些实施方案中，衔接子包含额外的标识序列，即条形码序列。如本文所用的，术语“条形码”是指允许识别与条形码相关联的多核苷酸的一些特征的已知核酸序列。在一些实施方案中，将要识别的多核苷酸的特征是衍生出该多核苷酸的样品。在一些实施方案中，条形码至少是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸的长度。在一些实施方案中，条形码的长度短于10、9、8、7、6、5或4个核苷酸。在一些实施方案中，多个条形码中的每个条形码至少在3个核苷酸位置上，例如至少在3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个位置上不同于所述多个条形码中的每个其他条形码。在一些实施方案中，与一些多核苷酸相关联的条形码和与其他多核苷酸相关联的条形码相比具有不同的长度。通常，条形码具有足够的长度且包含足够不同的序列以允许基于与样品相关联的条形码对样品进行鉴别。在一些实施方案中，正向和反向衔接子都包含多个条形码序列中的至少一个。在一些实施方案中，第一、第二和/或第三衔接子包含多个条形码序列中的至少一个。在一些实施方案中，每个反向衔接子包含多个条形码序列中的至少一个，其中所述多个条形码序列中的每个条形码序列不同于所述多个条形码序列中的每个其他条形码序列。在一些实施方案中，第一衔接子和第二衔接子都包含多个条形码序列中的至少一个。在一些实施方案中，用于第二衔接子寡核苷酸的条形码独立地选自用于第一衔接子寡核苷酸的条形码。在一些实施方案中，具有条形码的第一衔接子寡核苷酸和第二衔接子寡核苷酸进行配对，从而使这对衔接子包含相同或不同的一个或多个条形码。在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括基于靶多核苷酸所连接的条形码序列鉴别衍生出该靶多核苷酸的样品。通常，条形码包含这样的核酸序列，当连接至靶多寡核苷酸时，其可作为衍生出靶多核酸的样品的标识物。

最近，在衔接子设计方面作出了许多减少衔接子二聚体发生的改进。这些改进包括使用核苷酸类似物和结构化的寡核苷酸，并且允许在连接反应中使用较高浓度的寡核苷酸。在连接反应中的较高浓度的衔接子使研究人员能够从少至150个基因组拷贝产生高质量的文库。衔接子与DNA片段的末端的连接，特别是与含有目标区域的那些片段的末端的连接适合实施本发明的方法。基于核酸修饰酶的选择和产生的双链DNA切割设想了多种连接方式。例如，当产生含有目标靶区域/序列的平端产物时，平端连接可能是合适的。或者，在使用已知序列特异性的限制酶进行切割，从而导致产生具有已知序列突出端的切割位点的情况下，衔接子的适宜的末端可设计成能够使衔接子与目标序列区域的切割位点杂交，且随后进行连接。用于衔接子的有效和迅速连接的试剂和方法是可商购获得的并且是本领域中已知的。

核酸修饰酶

核酸(NA)修饰酶可以是DNA特异性修饰酶。NA修饰酶可以根据针对双链DNA的特异性进行选择。该酶可以是双链体特异性内切核酸酶、平端频切限制酶(blunt-end frequentcutter restriction enzyme)或其他限制酶。平端切割酶的实例包括DraI或SmaI。NA修饰酶可以是由New England Biolabs提供的酶。NA修饰酶可以是寻靶内切核酸酶(寻靶内切核酸酶可以是不具有严格定义的识别序列的内切核酸酶)。NA修饰酶可以是切口内切核酸酶(切口内切核酸酶可以是只能切割双链DNA底物中的一条DNA链的内切核酸酶)。NA修饰酶可以是高保真内切核酸酶(高保真内切核酸酶可以是工程化的内切核酸酶，其具有比该内切核酸酶的野生型形式更低的“星活性”)。

在一个优选实施方案中，NA修饰酶是序列和双链体特异性的DNA修饰酶。

DNA依赖性DNA聚合酶

用于本发明的方法和组合物中的DNA依赖性DNA聚合酶能够根据本发明的方法实现引物或寡核苷酸的延伸。在一个实施方案中，优选的DNA依赖性DNA聚合酶可以是在RNA或cDNA模板的存在下能够延伸核酸引物的聚合酶。适用于本发明的方法的示例性DNA依赖性DNA聚合酶包括但不限于具有或没有3'-外切核酸酶活性的Klenow聚合酶、Bst DNA聚合酶、Bca聚合酶、φ29DNA聚合酶、Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、Taq聚合酶、T4聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶1、其衍生物，或聚合酶的混合物。在一些情况下，聚合酶不包含5'-外切核酸酶活性。在其他情况下，聚合酶包含5'外切核酸酶活性。在一些情况下，本发明的引物或寡核苷酸延伸可使用包含强链置换活性的聚合酶例如Bst聚合酶进行。在其他情况下，本发明的引物延伸可使用包含弱或无链置换活性的聚合酶进行。本领域技术人员可以认识到在引物延伸步骤中使用链置换活性的优点和缺点，以及预计哪些聚合酶可提供链置换活性(参见，例如，New England Biolabs聚合酶)。

扩增方法

本文所述的方法、组合物和试剂盒可用于产生扩增就绪的产物，以用于下游应用，如大规模平行测序(即新一代测序方法)、具有富集的目标序列区域群体的文库的产生或杂交平台。扩增方法是本领域公知的。合适的扩增反应可以是指数式的或等温的并且可包括任何DNA扩增反应，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、线性扩增、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、单引物等温扩增(SPIA，参见，例如美国专利号6,251,639)、Ribo-SPIA，或其组合。在一些情况下，用于提供模板核酸的扩增方法可在限制条件下进行，以使得仅进行少数几轮扩增(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30轮等)，例如通常对于cDNA产生所进行的。扩增的轮数可以是约1-30、1-20、1-15、1-10、5-30、10-30、15-30、20-30、10-30、15-30、20-30或25-30轮。

PCR是一种体外扩增程序，其基于变性、寡核苷酸引物退火和通过嗜热模板依赖性多核苷酸聚合酶进行的引物延伸的重复循环，从而导致侧翼为引物的多核苷酸分析物的期望序列拷贝的指数增长。定位可与DNA的相反链退火的两条不同的PCR引物，以使得一条引物的聚合酶催化的延伸产物可作为另一条引物的模板链，从而导致离散的双链片段的累积，该片段的长度由寡核苷酸引物的5'末端之间的距离所限定。

LCR使用连接酶来连接成对的预形成的核酸探针。这些探针与核酸分析物的每条互补链(如果存在的话)杂交，并且采用连接酶将每对探针结合在一起，从而产生在下一个循环中可用来重复(reiterate)特定核酸序列的两个模板。

SDA(Westin等人,2000,Nature Biotechnology,18,199-202；Walker等人,1992,Nucleic Acids Research,20,7,1691-1696)是一种等温扩增技术，其基于限制性内切核酸酶如HincII或BsoBI使其识别位点的半硫代磷酸形式的未修饰链产生切口的能力，以及外切核酸酶缺陷型DNA聚合酶如Klenow exo minus聚合酶或Bst聚合酶在切口处延伸3'末端并使下游DNA链位移的能力。指数式扩增是由结合有义和反义反应导致的，其中从有义反应位移的链作为反义反应的靶标，反之亦然。

本发明的一些方面利用核酸或多核苷酸的线性扩增。线性扩增通常是指这样一种方法，其包括形成核酸或多核苷酸分子(通常为核酸或多核苷酸分析物)的仅一条链的互补体的一个或多个拷贝。因此，线性扩增与指数式扩增之间的主要差别是：在后一方法中，产物作为用于形成更多产物的底物，而在前一方法中，起始序列是用于形成产物的底物，但是反应产物即起始模板的复制不是用于产生产物的底物。在线性扩增中，形成的产物量作为时间的线性函数而增加，不同于其中形成的产物量为时间的指数函数的指数式扩增。

在一些实施方案中，扩增是指数式的，例如在通过聚合酶链反应(PCR)对DNA的特异性双链序列进行的酶促扩增中。在其他实施方案中，扩增方法是线性的。在其他实施方案中，扩增方法是等温的。

下游应用

本发明的一个重要方面是，本文公开的方法和组合物可高效并成本有效地用于下游分析，如新一代测序或杂交平台，具有最少的目标生物材料的损失。本发明的方法还可用于对目标选择性基因组区域(例如，SNP或其他疾病标志物的分析)以及可与目标选择性区域相互作用的基因组区域的遗传信息的分析。

测序

例如，本发明的方法对于通过如美国专利号5,750,341、6,306,597和5,969,119所述的、由Illumina商业化的方法进行测序是有用的。通常，双链片段多核苷酸可通过本发明的方法制备以产生在一个(例如(A)/(A′))或两个末端(例如(A)/(A′)和(C)/(C′))处标记的扩增的核酸序列。在一些情况下，在一个或两个末端处标记的单链核酸通过本发明的方法(例如，通过SPIA或线性PCR)进行扩增。然后将得到的核酸变性，并将单链扩增的多核苷酸随机地连接至流动池通道的内表面。加入未标记的核苷酸来启动固相桥式扩增以产生双链DNA的密集簇。为了启动第一碱基测序循环，加入四种标记的可逆终止子、引物和DNA聚合酶。在激光激发之后，对来自流动池上的每个簇的荧光进行成像。然后记录每个簇的第一碱基的身份。进行测序循环以便每次一个碱基地确定该片段序列。

在一些实施方案中，本发明的方法可用于制备靶多核苷酸，以用于通过由AppliedBiosystems商业化的连接测序方法(例如，SOLiD测序)进行测序。在其他实施方案中，这些方法可用于制备靶多核苷酸，以便使用由454/Roche Life Sciences商业化的方法进行合成测序，这些方法包括但不限于在Margulies等人,Nature(2005)437:376-380(2005)和美国专利号7,244,559、7,335,762、7,211,390、7,244,567、7,264,929及7,323,305中所述的方法和装置。在其他实施方案中，这些方法可用于制备靶多核苷酸，以便如美国申请序列号11/167,046和美国专利号7,501,245、7,491,498、7,276,720以及美国专利申请公开号US20090061439、US20080087826、US20060286566、US20060024711、US20060024678、US20080213770及US20080103058所述，通过由Helicos BioSciences Corporation(Cambridge,Mass.)商业化的方法进行测序。在其他实施方案中，这些方法可用于制备靶多核苷酸，以便如美国专利号7,462,452、7,476,504、7,405,281、7,170,050、7,462,468、7,476,503、7,315,019、7,302,146、7,313,308以及美国申请公开号US20090029385、US20090068655、US20090024331和US20080206764所述，通过由Pacific Biosciences商业化的方法进行测序。

可在提供的本发明的方法中使用的测序技术的另一个实例是纳米孔测序(参见，例如Soni G V和Meller A.(2007)Clin Chem 53:1996-2001)。纳米孔可以是直径为大约1纳米的小孔。纳米孔在传导流体中的浸没以及跨纳米孔的电势的施加由于离子通过纳米孔的传导而可导致轻微的电流。流动的电流量对纳米孔的大小是敏感的。随着DNA分子通过纳米孔，DNA分子上的每个核苷酸以不同的程度阻塞纳米孔。因此，当DNA分子通过纳米孔时通过纳米孔的电流的变化可代表对DNA序列的读取。

可在提供的本发明的方法中使用的测序技术的另一个实例是由Ion Torrent提供的半导体测序(例如，使用Ion Personal Genome Machine(PGM))。Ion Torrent的技术可使用具有多个层(例如，具有微机械加工的孔的层、离子敏感性层和离子传感器层)的半导体芯片。可将核酸加入孔中，例如，可将单个核酸的克隆群体附着至单个珠上，并且可将该珠引入孔中。为了启动在珠上的核酸的测序，可将一种类型的脱氧核糖核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP或dTTP)引入孔中。当通过DNA聚合酶掺入一种或多种核苷酸时，在孔中释放出质子(氢离子)，这可以通过离子传感器检测。然后可以洗涤半导体芯片，并且可利用不同的脱氧核糖核苷酸重复该过程。可在半导体芯片的孔中对多种核酸进行测序。半导体芯片可包含化学敏感性场效应晶体管(chemFET)阵列以对DNA进行测序(例如，如美国专利申请公开号20090026082所述)。一种或多种三磷酸在测序引物的3′末端处向新核酸链的掺入可通过用chemFET测量的电流的变化来检测。阵列可具有多个chemFET传感器。

遗传分析

本发明的方法可用于对目标选择性基因组区域以及可与目标选择性区域相互作用的基因组区域的遗传信息的分析。本文公开的扩增方法可用于本领域已知的用于遗传分析的装置、试剂盒以及方法，例如但不限于在美国专利号6,449,562、6,287,766、7,361,468、7,414,117、6,225,109和6,110,709中发现的那些。在一些情况下，本发明的扩增方法可用于扩增供DNA杂交研究使用的目标靶核酸，以确定多态性的存在或不存在。多态性或等位基因可与疾病或状况如遗传病相关。在其他情况下，多态性可与疾病或状况的易感性相关，例如，与成瘾、退行性和年龄相关性状况、癌症等相关的多态性。在其他情况下，多态性可与有益性状相关，该有益性状例如是冠状动脉健康增强，或对诸如HIV或疟疾之类的疾病的抵抗力，或对诸如骨质疏松症、阿尔茨海默症或痴呆之类的退行性疾病的抵抗力。

试剂盒

本文所述的任何组合物均可包含在试剂盒内。在非限制性实例中，处于合适的容器中的试剂盒包含：一种或数种衔接子，用于连接、引物延伸和扩增的一种或多种寡核苷酸引物和试剂。试剂盒还可包含用于纯化的装置，诸如珠悬浮液。

试剂盒的容器通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或可将组分放置在和优选地适当等分于其内的其他容器。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，该试剂盒通常还将含有第二、第三容器或可将额外的组分分开放置在其中的其他额外的容器。然而，在容器中可包含组分的各种组合。

当在一种或多种液体溶液中提供试剂盒的组分时，该液体溶液可以是水溶液。然而，试剂盒的组分可作为干燥粉末提供。当试剂和/或组分作为干粉末提供时，可通过加入合适的溶剂重建该粉末。

试剂盒将优选地包括关于使用试剂盒组分以及使用未包括在该试剂盒中的任何其他试剂的说明。说明可包括可以实施的变化形式。

在一个方面，本发明提供了包含在上述方法和组合物中公开的任何一个或多个元素的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒在一个或多个容器中包含本发明的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含本文所述的衔接子、引物和/或其他寡核苷酸的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含以下中的一个或多个：(a)DNA连接酶；(b)DNA依赖性DNA聚合酶；(c)RNA依赖性DNA聚合酶；(d)正向衔接子；(e)一种或多种含有反向衔接子序列的寡核苷酸；以及(f)适用于包含在所述试剂盒中的一个或多个元素的一种或多种缓冲溶液。衔接子、引物、其他寡核苷酸以及试剂可以是，但不限于，上文所述的任何衔接子、引物、其他寡核苷酸以及试剂。试剂盒的元素可以进一步以(但不限于)上文所述的任何量和/或组合(例如在相同的试剂盒或相同的容器中)提供。试剂盒可进一步包含根据本发明方法使用的额外试剂，诸如上文所述的试剂。例如，试剂盒可包含第一正向衔接子(其为如本文所述的部分双链体衔接子)、第二正向衔接子和对于第一正向衔接子中存在的限制和/或切割位点具有特异性的核酸修饰酶。试剂盒元素可在包括但不限于试管、小瓶、烧瓶、瓶子、安瓿、注射器等的任何适宜的容器中提供。试剂可以以可在本发明方法中直接使用的形式提供，或以在使用前需要制备诸如冻干制剂重建的形式提供。试剂可以以供一次性使用的等份形式提供，或者以可获得多次使用(例如在若干反应中)的贮存液的形式提供。

在一个实施方案中，试剂盒包含多个正向衔接子寡核苷酸和关于其使用的说明，其中每个所述的正向衔接子寡核苷酸包含多个条形码序列中的至少一个，其中所述多个条形码序列中的每个条形码序列在至少三个核苷酸位置上不同于在所述多个条形码序列中的每个其他条形码序列。包含不同条形码序列的正向衔接子可单独提供或与具有不同条形码序列的一个或多个额外的正向衔接子组合提供。在一些实施方案中，试剂盒可包含多个第一和第二正向衔接子寡核苷酸。第二正向衔接子寡核苷酸可与一个或多个第一正向衔接子和/或一个或多个不同的第二衔接子分开或组合提供。可根据上述组合提供第一和第二正向衔接子的组合。在一些实施方案中，试剂盒可包含多个含有反向衔接子序列的寡核苷酸。在一个实施方案中，试剂盒可包含多个含有反向衔接子序列的寡核苷酸，其中多个含有反向衔接子序列的寡核苷酸中的每一个进一步包含与核酸中存在的目标特异性靶序列互补的序列。在一个实施方案中，试剂盒可包含多个含有反向衔接子序列的寡核苷酸，其中多个含有反向衔接子序列的寡核苷酸中的每一个进一步包含随机序列。在一个实施方案中，试剂盒包含多个具有反向衔接子序列的寡核苷酸和关于其使用的说明，其中所述具有反向衔接子序列的寡核苷酸中的每一个包含多个条形码序列中的至少一个，其中所述多个条形码序列中的每一个条形码序列在至少三个核苷酸位置处不同于所述多个条形码序列中的每个其他条形码序列。包含不同条形码序列的具有反向衔接子序列的寡核苷酸可单独提供或与一个或多个具有不同条形码序列的具有反向衔接子序列的额外寡核苷酸组合提供。

基于本发明方法的产品

基于本发明方法的产品可由本申请人以商品名

进行商业化。

是NuGEN Technologies,Inc.的商标。

实施例

实施例1-通过细菌16S核糖体DNA序列的选择性富集对人类口腔微生物组的表征。

样品核酸

根据制造商的说明书所述，使用OMNIgene-DISCOVER样品采集试剂盒(DNAGenotek)从人唾液中分离微生物基因组DNA。然后通过超声处理将提取的DNA片段化成400bp的平均长度，并使用Agencourt AMPure XP珠(Beckman Coulter Genomics)进行纯化。

对照和连接有正向衔接子的测试文库的产生

利用NuGEN Ovation Ultralow文库***(NuGEN Technologies)由100ng纯化的样品产生两个新一代测序文库。根据制造商的推荐制备第一文库，即非富集的对照。使用如下改进的相同文库构建试剂盒产生第二“测试”文库，即用于下游富集步骤的输入。简言之，使DNA平端化，并准备在试剂盒中所述的标准末端修复反应条件下进行连接。随后片段仅连接至正向衔接子。如图2所示，连接将正向衔接子与每个DNA片段的各末端连接在一起，从而在相反链上产生单链切口。进行衔接子补平，因此在每个***片段上存在互补末端时产生连接产物。

至少100bp长度的连接产物通过与Agencourt AMPure XP珠的选择性结合进行纯化，并随后进行富集过程。

扩增

来自测试文库的核糖体DNA片段用两个不同的步骤进行选择性扩增：1)基因特异性引物延伸；以及2)使用通用衔接子序列的PCR。使用包含3’基因特异性区域和5’共同区域的寡核苷酸实施引物延伸步骤，其中该5’共同区域含有Illumina反向衔接子序列的一部分。通过使用ClustalW多重序列比对程序(欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformatics Institute))比较来自40种不同细菌种的核糖体操纵子，来选择构成基因特异性区段的共有16S序列。合成如下的寡核苷酸并以等摩尔比例混合，该寡核苷酸代表在16S基因组基因座中鉴定的18个高度保守的序列模块中的每一个。

将引物延伸探针池与含有正向衔接子的测试DNA文库(如上)和含有缓冲液、dNTP和热激活的Taq DNA聚合酶的HotStarTaq PCR主混合物(QIAGEN,USA)混合。将该溶液置于热循环仪中，加热至95℃保持15分钟以激活聚合酶，并冷却至70℃保持5分钟以使16S引物与DNA***片段退火并延伸至正向衔接子位点。加入可与正向和反向衔接子位点结合的扩增引物。通过使用3步温度路线(94℃保持30秒，60℃保持30秒，72℃保持1分钟)进行25次循环的PCR来完成对含有正向(测试文库)和反向(在16S引物上的5’共同区域)衔接子两者以及各自的通用引发位点的片段的选择。使用AMPure XP珠纯化PCR产物并用2100生物分析仪(Agilent Technologies)进行分析。

测序和数据分析

使用MiSeq***(Illumina)，针对对照和富集的测试文库两者获得长度为100nt的单末端测序读数(reads)。使用Illumina碱基判定软件对原始测序数据进行处理并映射到(mapped to)核糖体RNA数据库。将与细菌rRNA不对齐的序列映射到人类和细菌全基因组参考序列。通过将rRNA读数的数字计算为在对照和测试样品中的总映射读数的百分比来确定富集倍数。

实施例2-通过细菌16S核糖体DNA序列的选择性富集对人类口腔微生物组随时间的变化的表征。

样品核酸

在漱牙后的16小时内，以1小时的间隔，根据制造商的说明书所述，使用OMNIgene-DISCOVER样品采集试剂盒(DNA Genotek)从人唾液中分离微生物基因组DNA。然后通过超声处理将提取的DNA片段化成400bp的平均长度并使用Agencourt AMPure XP珠(BeckmanCoulter Genomics)进行纯化。

连接有正向衔接子的DNA片段的产生

利用来自NuGEN Ovation Ultralow文库***(NuGEN Technologies)的组分从100ng纯化的样品产生16个独立的新一代测序文库。简言之，使DNA平端化，并准备在试剂盒所述的标准末端修复反应条件下进行连接。随后片段仅连接至正向衔接子。如图2所示，连接将正向衔接子与每个DNA片段的各末端连接在一起，从而在相反链上产生单链切口。进行衔接子补平，因此在每个***片段上存在互补末端时产生连接产物。

至少100bp长度的连接产物通过与Agencourt AMPure XP珠的选择性结合进行纯化，并随后进行富集过程。

引物延伸

通过引入反向衔接子产生含有核糖体基因的文库，该反向衔接子连接至对于这些基因内的保守区域具有特异性的寡核苷酸的5’末端。存在两个不同的步骤：1)基因特异性引物的退火；及2)通过DNA聚合酶的作用对该引物的延伸。得到的产物是在一个末端上包含正向衔接子并且在另一个末端上包含反向衔接子的功能性文库。使用包含3’基因特异性区域和含有一部分Illumina反向衔接子序列的5’区域的寡核苷酸来完成基因特异性引物延伸步骤。具有8个碱基的可变区包埋在反向衔接子序列中，该可变区将该衔接子与用于其他样品的16种其他衔接子区分开来。因此，已经产生了16个基因特异性文库；每个样品产生一个文库。每个文库具有共同的正向衔接子。每个文库还在相反末端上含有共同序列，但在该共同序列内具有独特的8核苷酸区域。通过使用ClustalW多重序列比对程序(欧洲生物信息学研究所)比较来自40种不同细菌种的核糖体操纵子，来选择构成基因特异性区段的共有16S序列。合成如下的寡核苷酸并以等摩尔比例混合，该寡核苷酸代表在16S基因组基因座中鉴定的18个高度保守的序列模块中的每一个。

在16个独立的反应中，将具有连接至每条链上的正向衔接子的单个样品与引物延伸探针(如上所述)组合。它们与含有缓冲液、dNTP和热激活的Taq DNA聚合酶的HotStarTaqPCR主混合物(QIAGEN,USA)混合。将该溶液置于热循环仪中，加热至95℃保持15分钟以激活聚合酶，并冷却至70℃保持5分钟以使16S引物与DNA***片段退火并延伸至正向衔接子位点。

扩增

将16个单独的引物延伸产物(如上)合并，加入扩增引物，该扩增引物不仅互补于正向和反向衔接子位点的5’末端而且包含与流动池寡核苷酸序列互补的部分。通过使用3步温度路线(94℃保持30秒，60℃保持30秒，72℃保持1分钟)进行25次循环的PCR来完成对含有正向和反向(在16S引物上的5’共同区域)衔接子两者以及各自的通用引发位点的片段的选择。使用AMPure XP珠纯化PCR产物并用2100生物分析仪(Agilent Technologies)进行分析。

测序和数据分析

使用MiSeq***(Illumina)，针对对照和富集的测试文库两者获得长度为100nt的单末端测序读数。使用Illumina碱基判定软件对原始测序数据进行处理。基于它们独特的8碱基代码将来自不同时间点的样品入库(bin)并映射至核糖体RNA数据库。将与细菌rRNA不对齐的序列映射至人类和细菌全基因组参考序列。通过随时间比较样品中来自不同生物体的16S读数计数来评估微生物群体的变化。

实施例3-群体内的个体细胞的转录活性的表征。

样品核酸

使用FACS细胞分选仪从全血中分离个体细胞。将细胞悬浮于10μl的Prelude裂解溶液(NuGEN Technologies，One Direct***的一个组分)中，导致细胞膜裂解而核膜保持完整。选择16个单细胞悬浮液用于表达谱分析。简言之，如制造商所述使用试剂盒试剂，由裂解物中存在的总RNA产生第一和第二链cDNA。使用Agencourt AMPure XP珠(BeckmanCoulter Genomics)纯化双链cDNA产物。

连接有正向衔接子的片段的产生

使用来自NuGEN Ovation Ultralow文库***(NuGEN Technologies)的组分，由每个纯化的样品产生新一代测序文库。简言之，使DNA平端化，并准备在试剂盒所述的标准末端修复反应条件下进行连接。随后片段仅连接至正向衔接子。如图2所示，连接将正向衔接子与每个DNA片段的各末端连接在一起，从而在相反链上产生单链切口。进行衔接子补平，因此在每个***片段上存在互补末端时产生连接产物。

至少100bp长度的连接产物通过与Agencourt AMPure XP珠的选择性结合进行纯化，并随后进行富集过程。

引物延伸

通过引入连接至随机六聚体的5’末端的反向衔接子产生文库。存在两个不同的步骤：1)引物的退火；及2)通过DNA聚合酶的作用对该引物的延伸。得到的产物是在一个末端上包含正向衔接子并且在另一个末端上包含反向衔接子的功能性文库。使用包含3’随机区域和含有一部分Illumina反向衔接子序列的5’区域的寡核苷酸完成引物延伸步骤。具有8个碱基的可变区包埋在反向衔接子序列中，该可变区将该衔接子与用于其他样品的16种其他衔接子区分开来。因此，已经产生了16个文库；每个样品产生一个文库。每个文库具有共同的正向衔接子。每个文库还在相反末端上含有共同序列，但在该共同序列内具有独特的8核苷酸区域。

在16个独立反应中，将具有连接至每条链上的正向衔接子的单独的样品与引物延伸探针(如上所述)组合。它们与含有缓冲液、dNTP和热激活的Taq DNA聚合酶的HotStarTaqPCR主混合物(QIAGEN,USA)混合。将该溶液置于热循环仪中，加热至95℃保持15分钟以激活聚合酶，并冷却至70℃保持5分钟以使引物与DNA***片段退火并延伸至正向衔接子位点。

扩增

将扩增引物添加至16个单独的引物延伸产物(如上所述)，该扩增引物不仅互补于正向和反向衔接子位点的5’末端而且包含与流动池寡核苷酸序列互补的部分。通过使用3步温度路线(94℃保持30秒，60℃保持30秒，72℃保持1分钟)进行25次循环的PCR来完成对含有正向和反向衔接子两者以及各自的通用引发位点的片段的选择。使用AMPure XP珠纯化PCR产物并用2100生物分析仪(Agilent Technologies)进行分析。

测序和数据分析

将相同质量的各扩增文库(如上所述)合并，并根据制造商的建议稀释至工作浓度。使用MiSeq***(Illumina)，针对文库得到长度为100nt的单末端测序读数。使用Illumina碱基判定软件对原始测序数据进行处理。基于它们独特的8碱基代码将来自不同时间点的样品入库并映射至参考数据库。基于映射特性，单独的样品或新的样品池可在测序仪上重新运行以获得更大的读取深度。基因覆盖较差的样品将会从该池中去除。

Claims (20)

1.一种用于富集目标核酸序列并对其测序的方法，该方法包括：

a.使溶液中的一个或多个寡核苷酸在反应混合物中与核酸片段中的目标核酸序列退火，其中所述反应混合物包含多个核酸片段，其中所述核酸片段在所述核酸片段的5’末端包含第一衔接子序列，其中所述一个或多个寡核苷酸包含设计为与所述目标核酸序列互补的具有至少10个碱基的3’部分，和包含第二衔接子序列的5’尾部分，所述第二衔接子序列不与所述目标核酸序列互补；

b.在反应混合物中用聚合酶延伸所述一个或多个寡核苷酸，从而产生一个或多个包含在第一末端的与第一衔接子序列互补的序列、与所述目标核酸序列互补的序列、和在第二末端的第二衔接子序列的寡核苷酸延伸产物，所述一个或多个寡核苷酸与所述核酸片段中的目标核酸序列退火，所述核酸片段在所述核酸片段的5’末端包含所述第一衔接子序列；以及

c.在反应混合物中使用与第一衔接子的互补链退火的第一引物和与第二衔接子序列的互补链在其3’末端退火的第二引物扩增所述一个或多个寡核苷酸延伸产物，从而富集所述目标核酸序列，其中所述扩增产物包含具有与表面上的序列互补的序列的3’末端；

d.使用所述具有与表面上的序列互补的序列的3’末端，将所述扩增产物的链与所述表面上的序列退火；以及

e.在大规模平行测序平台上对所述富集的目标核酸序列进行测序。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标核酸序列包含基因组DNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标核酸序列包含cDNA。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标核酸序列包含RNA。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一衔接子和第二衔接子序列彼此不同。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个核酸片段包含所述第一衔接子序列，且其中所述第一衔接子序列对于所述多个核酸片段中的每一个是共同的。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二衔接子序列对于所述一个或多个寡核苷酸是共同的。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一衔接子序列和/或第二衔接子序列包含条形码序列。

9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在步骤a之前使双链核酸片段变性，从而产生在所述核酸片段的5’末端包含所述第一衔接子序列的所述核酸片段。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一衔接子序列在部分双链体衔接子的第一链中。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述部分双链体衔接子包含第二链，且其中所述部分双链体衔接子的第一链比所述第二链长。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二链附加至所述核酸片段的3’末端。

14.根据权利要求1所述的方法，其中测序包括桥式扩增。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述测序包括使用四种标记的可逆终止子。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述测序包括半导体测序。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面是流动池的表面。

18.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤a之前片段化核酸，从而生成所述多个核酸片段。

19.根据权利要求18所述的方法，其进一步包括在步骤a之前将所述第一衔接子序列附加至所述多个核酸片段中核酸片段的5’末端，从而生成在所述核酸片段的5’末端包含所述第一衔接子序列的所述核酸片段。

20.权利要求19所述的方法，其中所述附加通过连接进行。

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