KR20180055905A - 증폭 산물의 농축을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

일부 측면에서, 본 개시내용은 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머를 포함하는 앰플리콘 또는 증폭 산물을 농축하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘을 서열결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 융합 유전자를 비롯하여 점 돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형성, 삽입, 결실 및 전좌를 포함하고 이로 제한되지 않는 염색체 재배열에 의해 생성된 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 설명되는 방법에 유용한 조성물 및 반응 혼합물을 제공한다.

Description

증폭 산물의 농축을 위한 방법 및 조성물
상호 참조
본원은 2015년 10월 9일 출원된 미국 특허 가출원 제62/239,690호의 이익을 주장하며, 상기 출원은 본원에 참고로 포함된다.
대규모 병렬(parallel) 핵산 서열결정의 출현으로 인해, 복잡한 집단 내에서의 서열 변이의 확인이 가능하게 되었다. 가닥 변위(strand displacement) 능력을 갖는 폴리머라제를 이용하는 증폭 과정인 롤링 써클 증폭(RCA: rolling circle amplification)은 서열결정 분석을 위한 핵산 준비를 위한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 절차에 유용한 대체물 및 보완물로서 등장했다. RCA는 원형 DNA 주형과 같은 원형 폴리뉴클레오티드 주형에 어닐링된 프라이머에 뉴클레오티드를 연속적으로 부가함으로써 반복 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 성장시키는 것을 수반한다. 이 연장 과정은 원형 폴리뉴클레오티드 주형의 전체 길이를 여러 번 포함하고, 이에 의해 반복된 주형 서열 또는 콘카테머(concatemer)로 불릴 수 있는 것을 형성할 수 있다. 또한, 콘카테머는 추가의 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로 사용될 수 있다. 그러나, 이 연장은 선형 콘카테머의 말단에 도달할 때까지만 진행된다. 성장하는 폴리뉴클레오티드 가닥의 전면이 DNA의 이중 가닥 부분을 만날 때, 성장하는 가닥은 존재하는 가닥을 주형으로부터 대체한다. 그 결과는 종종 상이한 수의 주형 서열의 반복체로 이루어진 다양한 길이의 이중 가닥 DNA의 형성이다. RCA의 통상적인 방법에서, 짧은 콘카테머는 보다 많은 경우에, 표적 서열의 많은 반복체를 포함하는 보다 긴 콘카테머에 비해 불균형적으로 증폭된다. 따라서, 보다 긴 콘카테머의 후속 분석은 보다 어려울 수 있다.
대규모 병렬 서열결정은 일반적으로 사용되는 기술에서의 고유한 오류 빈도가 집단 내의 많은 실제 서열 변이의 빈도보다 더 크다는 점에서 중요한 제한을 갖는다. 예를 들어, 표준 고속(high throughput) 서열결정에서 0.1-1%의 오류율이 보고되었다. 희귀한 서열 변이체의 검출은 변이체 빈도가 낮을 때, 예컨대 상기 오류율 이하일 때 높은 위양성 비율을 보인다.
희귀한 서열 변이체를 검출하는 능력은 다양한 이유로 극히 중요하다. 예를 들어, 희귀한 독특한 서열을 검출하는 것은 박테리아 분류군과 같은 유해한 환경 오염 물질의 존재를 확인하고 구별하는 데 사용될 수 있다. 박테리아 분류군을 특성화하는 일반적인 방법은 rRNA 서열과 같이 고도로 보존된 서열에서의 차이를 확인하는 것이다. 그러나, 현재까지 전형적인 서열결정 기반 접근법은 주어진 샘플 내의 상이한 게놈의 수 및 구성원 간의 상동성 정도와 관련된 어려움에 직면해 있고, 이것은 이미 어려운 절차에 대해 복잡한 문제를 제기한다.
서열 변이를 검출하기 위한 현존하는 기술은 융합 유전자 변이 및 염색체 재배열을 검출하는데 특히 비효과적이다. 종종, 재배열된 유전자와 융합된 '파트너' 유전자는 알려지지 않은 상태이고, 따라서 검출이 어렵게 된다. 또한, 융합 유전자는 접합 부위가 관찰되지 않으면 검출하기 어려울 수도 있다.
상기 내용에 비추어, 희귀한 서열 변이, 특히 희귀한 서열 변화 및 유전자 융합 사건을 검출하는 대안적인 및/또는 강력한 방법 및 조성물이 필요하다. 본 개시 내용의 조성물 및 방법은 상기 필요성을 해결하고, 추가의 이점을 또한 제공한다. 특히, 본 개시 내용의 다양한 측면은 대규모 병렬 서열결정 방법에 사용될 수 있는 표적 폴리뉴클레오티드의 다중 카피를 함유하는 앰플리콘을 제공한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 다중 카피를 함유하는 앰플리콘을 사용하여, 표적 폴리뉴클레오티드는 1회 초과로 서열결정될 수 있고, 따라서 희귀한 서열 변이체 및 융합 유전자의 서열결정에서의 오류를 감소시킬 수 있다.
한 측면에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머를 포함하는 앰플리콘의 농축 방법이 개시된다. 상기 방법은 (a) 제1 프라이머의 연장에 의해 원형 표적 폴리뉴클레오티드로부터 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 콘카테머를 생성하는 단계로서, 상기 제1 프라이머는 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 것인 단계; (b) 제2 프라이머의 연장에 의해 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 함유하는 다수의 연장 산물을 생성하는 단계로서, 상기 제2 프라이머는 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하고, 여기서 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일한 것인 단계, 및 (c) 다수의 앰플리콘을 생성하는 조건 하에 단계 (b)의 다수의 연장 산물을 증폭하는 단계로서, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘이 농축되는 것인 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)는 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 동일하다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)의 증폭은 제3 프라이머의 프라이머 연장을 포함하고, 여기서 제3 프라이머는 서열 상보성을 통해 제1 공통 서열 또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (c)의 증폭 단계를 통해, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 미만의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율보다 더 높게 된다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 적어도 90%이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 적어도 80%이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 적어도 60%이다. 일부 실시양태에서, 연장 산물은 (i) 제1 공통 서열과 제2 공통 서열의 상보체 사이, 또는 (ii) 제2 공통 서열과 제1 공통 서열의 상보체 사이의 분자내 혼성화를 포함하는 스템 루프 구조를 형성한다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 생성물의 형성은 어닐링 단계를 제3 프라이머의 용융 온도의 ±5℃ 이내의 온도에서 유지하면서 단계 (c)의 증폭을 수행함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 생성물의 형성은 어닐링 단계를 70℃ 미만의 온도에서 유지하면서 단계 (c)의 증폭을 수행함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조는 적어도 9개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조는 적어도 15개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조는 적어도 20개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조는 적어도 25개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조는 적어도 30개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)는 제2 프라이머의 6 사이클 이하의 연장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)는 제2 프라이머의 8 사이클 이하의 연장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)는 제2 프라이머의 10 사이클 이하의 연장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±5℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 원형화된(circularized) 무세포(cell free) DNA이다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA의 원형화된 단편이다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 염색체 재배열에 의해 생성된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염색체 재배열은 결실(deletion), 중복(duplication), 역위(inversion), 및 전좌(translocation) 중 적어도 하나이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합 길이는 75개 이하의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 적어도 50%의 콘카테머는 길이가 적어도 75개 뉴클레오티드인 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 방법은 단계 (c)에서 생성된 다수의 앰플리콘의 서열결정을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열결정은 표적 폴리뉴클레오티드의 하나의 카피만을 포함하는 앰플리콘으로부터 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘을 선택적으로 정제하지 않고 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (c)에서 생성된 다수의 앰플리콘에서 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 정제된 앰플리콘의 서열결정을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 상이한 표적 폴리뉴클레오티드가 동일한 반응 혼합물 내에서 증폭된다.
또 다른 측면에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머를 포함하는 앰플리콘을 농축하기 위한 반응 혼합물이 개시된다. 한 실시양태에서, 반응 혼합물은 (a) 원형 표적 폴리뉴클레오티드, (b) 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 제1 프라이머, 및 (c) 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하는 제2 프라이머를 포함하고, 여기서 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일하고, 콘카테머는 제1 프라이머의 연장 산물이다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 동일하다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 용기에 함유된다. 일부 실시양태에서, 용기는 웰, 플레이트, 튜브, 챔버, 유동 셀(flow cell) 또는 칩이다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 서열 상보성을 통해 제1 공통 서열 또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 서열을 갖는 제3 프라이머를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±5℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 원형화된 무세포 DNA이다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA의 원형화된 단편이다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 염색체 재배열에 의해 생성된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염색체 재배열은 결실, 중복, 역위, 및 전좌 중 적어도 하나이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합 길이는 75개 이하의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥이다.
또 다른 측면에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머를 포함하는 앰플리콘을 농축하기 위한 키트가 개시된다. 한 실시양태에서, 키트는 (a) 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 제1 프라이머; (b) 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하는 제2 프라이머(여기서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일하고, 콘카테머는 제1 프라이머의 연장 산물임), 및 (c) 서열 상보성을 통해 제1 공통 서열 또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 서열을 갖는 제3 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±5℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합 길이는 75개 이하의 뉴클레오티드이다.
또 다른 측면에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머를 포함하는 앰플리콘의 농축에 사용하기 위한 프라이머를 설계하기 위한 시스템이 개시된다. 한 실시양태에서, 시스템은 (a) 지정된 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 설계해 달라는 고객의 요청을 수신하도록 구성된 컴퓨터; (b) 하나 이상의 프로세서에 의한 실행시 표적 서열의 증폭을 위한 적어도 3개의 프라이머를 설계하는 코드를 포함하는 컴퓨터 판독 가능 매체로서, 적어도 3개의 프라이머가 (i) 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 제1 프라이머; (ii) 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하는 제2 프라이머(여기서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일하고, 콘카테머는 제1 프라이머의 연장 산물임); 및 (iii) 서열 상보성을 통해 제1 공통 서열 또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 서열을 갖는 제3 프라이머를 포함하는 것인 컴퓨터 판독 가능 매체; 및 (c) 상기 적어도 3개의 프라이머의 서열을 포함하는 보고서를 수신자에게 전송하는 보고서 생성기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±5℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합 길이는 75개 이하의 뉴클레오티드이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 롤링 써클 증폭을 수행하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 원형 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; (b) 콘카테머를 포함하는 다수의 증폭 산물을 생성하기 위해 (i) 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제, (ii) 원형 폴리뉴클레오티드 및 (iii) 프라이머를 포함하는 증폭 반응 혼합물을 롤링 써클 증폭의 다중 사이클에 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 롤링 써클 증폭의 다중 사이클의 각각의 사이클은 다수의 증폭 산물을 생성하기 위해 변성(denaturation) 온도에서의 변성, 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링 및 주어진 신장 시간 동안 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함하고, 생성된 다수의 증폭 산물은 이 산물이 변성 및 프라이머 어닐링 조건은 대등하지만 다중 사이클의 신장 시간의 총합과 대등한 신장 시간을 사용하는 1회 증폭 사이클을 이용하여 생성된 다수의 증폭 산물에 비해, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 콘카테머를 더 높은 비율로 함유한다는 것을 특징으로 한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 롤링 써클 증폭에 의해 생성된 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 콘카테머의 비율을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 원형 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; (b) 콘카테머를 포함하는 다수의 증폭 산물을 생성하기 위해 (i) 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제, (ii) 원형 폴리뉴클레오티드 및 (iii) 프라이머를 포함하는 증폭 반응 혼합물을 롤링 써클 증폭의 다중 사이클에 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 롤링 써클 증폭의 다중 사이클의 각각의 사이클은 다수의 증폭 산물을 생성하기 위해 변성 온도에서의 변성, 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링 및 주어진 신장 시간 동안 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 콘카테머의 비율을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 다수의 증폭 산물에서의 콘카테머의 비율은 변성 및 프라이머 어닐링 조건은 대등하지만 다중 사이클의 신장 시간의 총합과 대등한 신장 시간을 사용하는 1회 증폭 사이클을 이용하여 생성된 다수의 증폭 산물에 비해 증가한다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제는 Bsu DNA 폴리머라제, Vent 폴리머라제, Bst DNA 폴리머라제, phi29 DNA 폴리머라제, PyroPhage 3173 폴리머라제, 이들의 임의의 변이체 및 이들의 임의의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 반응 혼합물에 이용되는 원형 폴리뉴클레오티드가 인간 무세포 DNA(cfDNA)를 포함할 때 약 180개 염기쌍의 평균 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 반응 혼합물에 이용되는 원형 폴리뉴클레오티드가 인간 무세포 DNA(cfDNA)를 포함할 때 약 170개 염기쌍의 중간 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 반응 혼합물에 이용되는 원형 폴리뉴클레오티드가 인간 무세포 DNA(cfDNA)를 포함할 때 약 40개 염기 내지 약 450개 염기의 단편 길이의 분포를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 반응 혼합물에 이용되는 원형 폴리뉴클레오티드가 인간 무세포 DNA(cfDNA)를 포함할 때 약 100개 염기 내지 약 200개 염기의 단편 길이의 분포를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 콘카테머의 비율은 적어도 약 1% 증가된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 롤링 써클 증폭의 다중 사이클의 적어도 한 사이클 후에 반응 혼합물에 폴리머라제를 보충하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 원형 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 40개 염기 내지 약 500개 염기이다. 일부 실시양태에서, 원형 폴리뉴클레오티드는 무세포 DNA(cfDNA)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 원형 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 원형 폴리뉴클레오티드는 염색체 재배열에 의해 생성된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염색체 재배열은 결실, 중복, 역위, 및 전좌 중 적어도 하나이다. 일부 실시양태에서, 원형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥이다. 일부 실시양태에서, 원형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥이다.
일부 실시양태에서, 다수의 상이한 원형 폴리뉴클레오티드가 증폭 반응 혼합물에서 증폭된다. 일부 실시양태에서, 다중 사이클은 적어도 2회의 사이클을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중 사이클의 각각의 사이클은 (i) 약 5초 내지 약 60초 동안 약 75℃ 내지 약 95℃의 변성 온도에서의 변성, (ii) 약 5초 내지 약 60초 동안 약 45℃ 내지 약 65℃의 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링, 및 (iii) 약 30초 내지 약 10분의 신장 시간 동안 약 65℃ 내지 약 75℃의 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중 사이클의 각각의 사이클은 (i) 약 15초 내지 약 30초 동안 약 80℃의 변성 온도에서의 변성, (ii) 약 15초 내지 약 45초 동안 약 50℃의 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링, 및 (iii) 약 3분 내지 약 10분의 신장 시간 동안 약 70℃의 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프라이머는 프라이머 연장을 위한 원형 폴리뉴클레오티드의 다양한 영역에 무작위적으로 혼성화하고 이 영역을 프라이밍할 수 있는 무작위 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 서열 특이적 방식으로 프라이머 연장을 위한 원형 폴리뉴클레오티드의 영역에 혼성화하고 이 영역을 프라이밍할 수 있는 유전자 특이적 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 (i) 서열 상보성을 통해 원형 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 (ii) 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 제1 프라이머를 포함하고, 여기서 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 콘카테머는 원형 폴리뉴클레오티드를 주형으로 사용하는 제1 프라이머의 연장에 의해 롤링 써클 증폭의 다중 사이클 동안 생성된다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 (i) 서열 상보성을 통해 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 (ii) 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하는 제2 프라이머를 포함하고, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 함유하는 다수의 연장 산물은 콘카테머를 주형으로 사용하는 제2 프라이머의 연장에 의해 롤링 써클 증폭의 다중 사이클 동안 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 동일하다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 다수의 앰플리콘을 생성하는 조건 하에 다수의 연장 산물을 증폭하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘이 농축된다. 일부 실시양태에서, 증폭은 서열 상보성을 통해 제1 공통 서열 또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 서열을 포함하는 제3 프라이머의 프라이머 연장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭을 통해, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 미만의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율보다 더 높게 된다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 적어도 5%이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 적어도 10%이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 적어도 20%이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 적어도 30%이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 적어도 40%이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 적어도 60%이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 적어도 80%이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 적어도 90%이다.
일부 실시양태에서, 다수의 연장 산물은 (i) 제1 공통 서열과 제2 공통 서열의 상보체 사이, 또는 (ii) 제2 공통 서열과 제1 공통 서열의 상보체 사이의 분자내 혼성화를 포함하는 스템 루프 구조를 형성한다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조의 형성은 어닐링 단계를 제3 프라이머의 용융 온도의 ±5℃ 이내의 온도에서 유지하면서 증폭을 수행함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조의 형성은 어닐링 단계를 약 70℃ 미만의 온도에서 유지하면서 증폭을 수행함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조는 적어도 9개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조는 적어도 15개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조는 적어도 20개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조는 적어도 25개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조는 적어도 30개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±5℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합 길이는 75개 이하의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 콘카테머를 포함하는 다수의 증폭 산물을 서열결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열결정은 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 미만의 카피를 포함하는 콘카테머로부터 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 콘카테머를 선택적으로 분리하지 않으면서 수행된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 미만의 카피를 포함하는 콘카테머로부터 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 포함하는 콘카테머를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 포함하는 콘카테머를 서열결정하는 단계를 추가로 포함한다.
참조에 의한 통합
본 명세서에서 언급되는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참고로 포함된다고 구체적으로 및 개별적으로 나타낸 것처럼 동일한 정도로 참고로 통합된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구 범위에서 상세하게 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점은 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시양태를 제시하는 다음의 상세한 설명 및 다음과 같은 첨부 도면(도 또는 도면)을 참조함으로써 보다 잘 이해될 것이다:
도 1은 한 실시양태에 따른 스템 루프 생성물의 형성을 보여준다.
도 2는 한 실시양태에 따라 전방향 및 역방향 프라이머가 RCA 증폭을 위해 인접한 5' 말단을 갖도록 설계되는 백-투-백(back-to-back: B2B) 프라이머 설계를 보여준다.
도 3은 한 실시양태에 따라 백-투-백 프라이머를 사용하여 서열결정 라이브러리를 구축하는 방법을 보여준다.
도 4는 한 실시양태에 따라 앰플리콘을 농축하는 방법을 보여준다.
도 5는 롤링 써클 증폭압의 1 사이클 및 아가로스 겔에 의한 롤링 써클 증폭의 다중 사이클에 의해 생성된 증폭 산물의 크기 분포를 보여준다.
도 6은 상이한 수의 반복체를 갖는 증폭 산물 사이의 비율을 나타내는 표를 제시한다.
도 7은 1 사이클 및 다중 사이클을 포함하는 예시적인 롤링 써클 증폭 반응에서 개별 반복체 요소의 크기 분포를 보여준다.
도 8은 롤링 써클 증폭의 1 사이클 및 롤링 써클 증폭의 다중 사이클에 의해 생성된 서열결정된 표적의 단편 크기 분포를 나타낸다.
도 9는 한 실시양태에 따라 ELM4/ALK 융합 DNA 샘플인 HD664를 야생형 참조 DNA 샘플과 상이한 비율로 혼합한 것을 보여주는 표이다.
도 10은 한 실시양태에 따른 융합 대립유전자 검출을 보여준다.
도 11은 한 실시양태에 따라 다중 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 다중 반응에서 검출 가능함을 보여준다.
본원에 개시된 일부 방법의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술 범위 내에 있는 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 유전체학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 사용한다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook and Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (2012)]; [the series Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds.)]; [the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.), PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))], [Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th Edition (R.I. Freshney, ed. (2010))]을 참고한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 그 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 관련 기술 분야의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 별법으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5% 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 별법으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 이 용어는 값의 10배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 보다 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구 범위에 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 그 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"이 가정되어야 한다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 교환 가능하게 사용된다. 이들 용어는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태, 또는 이의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지된 또는 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연관 분석으로 규정된 유전자좌(들), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 수송 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 방해될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후, 예를 들어 표지 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
용어 "표적 폴리뉴클레오티드"는 그의 존재, 양 및/또는 뉴클레오티드 서열, 또는 이들 중 하나 이상의 변화가 결정되는 것이 요구되는 표적 서열을 갖는, 핵산 분자의 출발 집단 내의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 표적 폴리뉴클레오티드는 보다 큰 폴리뉴클레오티드의 일부(예를 들어, 증폭되거나, 서열결정되거나, 또는 다른 방식으로 분석될 부분)일 수 있거나, 표적 서열을 포함하는 보다 큰 폴리뉴클레오티드를 지칭하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 용어 "표적 서열"은 핵산의 단일 가닥 상의 핵산 서열을 지칭한다. 표적 서열은 유전자의 일부, 조절 서열, 게놈 DNA, cDNA, 융합 유전자, mRNA, miRNA, rRNA 등을 포함하는 RNA 등일 수 있다. 표적 서열은 샘플로부터의 표적 서열 또는 2차 표적, 예컨대 증폭 반응의 산물일 수 있다.
일반적으로, 용어 "서열 변이체"는 하나 이상의 참조 서열에 대한 서열 내의 임의의 변이를 나타낸다. 전형적으로, 서열 변이체는 참조 서열이 알려져 있는 개체의 주어진 집단에 대한 참조 서열보다 더 낮은 빈도로 발생한다. 일부 경우에, 참조 서열은 단일 개체의 게놈 서열과 같은 하나의 공지된 참조 서열이다. 일부 경우에, 참조 서열은 다수의 공지된 서열, 예컨대 참조 집단으로 작용하는 다수의 개체의 게놈 서열 또는 동일한 개체로부터의 폴리뉴클레오티드의 다중 서열결정 판독을 정렬함으로써 형성된 컨센서스(consensus) 서열이다. 일부 경우에, 서열 변이체는 집단에서 낮은 빈도로 발생한다("희귀한" 서열 변이체로도 언급됨). 예를 들어, 서열 변이체는 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1%, 0.75%, 0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.075%, 0.05% 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.005%, 0.001% 이하 또는 약 상기 값 미만의 빈도로 발생할 수 있다. 일부 경우에, 서열 변이체는 약 0.1% 또는 약 0.1% 미만의 빈도로 발생한다. 서열 변이체는 참조 서열에 대한 임의의 변이체일 수 있다. 서열 변이는 단일 뉴클레오티드 또는 다수의 뉴클레오티드(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 뉴클레오티드)의 변화, 삽입 또는 결실로 이루어질 수 있다. 서열 변이체가 2개 이상의 뉴클레오티드 차이를 포함하는 경우, 상이한 뉴클레오티드는 서로 인접하거나 불연속적일 수 있다. 서열 변이체의 유형의 비제한적인 예는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 결실/삽입 다형성(DIP), 카피수 변이체(CNV), 짧은 직렬 반복체(STR), 간단한 서열 반복체(SSR), 상이한 수의 직렬 반복체(VNTR), 증폭된 단편 길이 다형성(AFLP), 레트로트랜스포존(retrotransposon) 기반 삽입 다형성, 서열 특이적 증폭 다형성 및 서열 변이체로서 검출될 수 있는 후성유전학적 표지(epigenetic mark)의 차이(예를 들어, 메틸화 차이)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 변이체는 전좌 또는 융합 유전자를 포함하고 이로 제한되지 않는 염색체 재배열을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "콘카테머"는 일반적으로 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 다중 카피(예를 들어, 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 카피, 일부 경우에 적어도 2개의 카피)를 함유하는 연속적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 라이게이션 산물 또는 증폭 산물을 지칭한다. 일부 경우에, 콘카테머는 직렬로 연결된 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 다중 카피를 함유한다. 일부 경우에, 추가의 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 다중 카피 사이에 산재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "혼성화하다", "혼성화", "혼성화하는", "어닐링하다" 및 "어닐링"은 일반적으로 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화된 복합체를 형성하는 반응을 의미한다. 수소 결합은 왓슨 크릭(Watson Crick) 염기쌍 형성, 훅스테인(Hoogstein) 결합 또는 임의의 다른 서열 특이적 방법에 의해 발생할 수 있다. 복합체는 이중체 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가 혼성화 가닥 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 PCR의 개시 또는 리보자임에 의한 폴리뉴클레오티드의 효소 절단과 같이 보다 광범위한 과정에서 한 단계를 구성할 수 있다. 제2 서열의 뉴클레오티드 잔기의 염기와의 수소 결합을 통해 안정화될 수 있는 제1 서열은 제2 서열에 "혼성화 가능"하다고 언급된다. 이러한 경우, 제2 서열은 또한 제1 서열에 혼성화 가능하다고 언급될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "상보체", "상보체들", "상보성인" 및 "상보성"은 일반적으로 주어진 서열에 대해 완전히 상보성이고 혼성화 가능한 서열을 지칭한다. 일부 경우에, 주어진 핵산과 혼성화되는 서열은 주어진 영역에 대한 그의 염기 서열이 그의 결합 파트너의 염기 서열에 상보성으로 결합하여 예를 들어 A-T, A-U, G-C 및 G-U 염기쌍이 형성될 수 있다면, 주어진 분자의 "상보체" 또는 "역상보체"로 언급된다. 일반적으로, 제2 서열에 혼성화 가능한 제1 서열은 제2 서열에 특이적으로 또는 선택적으로 혼성화 가능하여, 혼성화 반응 동안 비표적 서열과의 혼성화보다 제2 서열 또는 제2 서열의 세트에 대한 혼성화가 더 바람직하다(즉, 관련 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 엄격한 조건과 같은 주어진 조건의 세트 하에서 열역학적으로 더 안정하다). 일반적으로, 혼성화 가능 서열은 그 각각의 길이의 전부 또는 일부에 대해, 예를 들어 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 서열 상보성을 포함하는 25%-100%의 상보성과 같은 서열 상보성 정도를 공유한다. 예컨대 상보성 비율을 평가하기 위한 서열 동일성은 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘(예를 들어, 선택적으로 디폴트 설정을 갖는, www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html에서 이용가능한 EMBOSS Needle 정렬기 참조), 또는 BLAST 알고리즘 (예를 들어, 선택적으로 디폴트 설정을 갖는, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi에서 이용가능한 BLAST 정렬 도구 참조), 또는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘(예를 들어, 선택적으로 디폴트 설정을 갖는, www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html에서 이용가능한 EMBOSS 워터(Water) 정렬기 참조)을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 정렬 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 최적 정렬은 디폴트 파라미터를 비롯하여 선택된 알고리즘의 임의의 적합한 파라미터를 사용하여 평가될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "연장 산물"은 일반적으로 뉴클레오티드 프라이머가 뉴클레오티드의 공유 부가에 의해 연장하는 반응의 산물을 지칭한다. 일부 경우에, 뉴클레오티드 도입은 주형에 의해 안내될 수 있다. 일부 경우에, 뉴클레오티드 도입은 주형 없이 일어날 수 있다. 일부 경우에, 연장 산물은 예컨대 PCR 증폭, 롤링 써클 증폭(RCA) 또는 등온 증폭으로부터의 증폭 산물이다.
본원에서 사용되는 용어 "증폭하다", "증폭한다", "증폭된", "증폭"은 일반적으로 하나 이상의 카피가 표적 폴리뉴클레오티드 또는 그의 일부로 제조되는 임의의 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA 및/또는 RNA)를 증폭하는 다양한 방법이 이용 가능하며, 그의 일부 예가 본원에 기재되어 있다. 증폭은 선형기 또는 지수형기이거나, 또는 다상 증폭 과정에서 선형기 및 지수형기 둘 모두를 수반할 수 있다. 증폭 방법은 열 변성 단계와 같은 온도의 변화를 수반할 수 있거나, 열 변성을 필요로 하지 않는 등온 과정일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "스템 루프 생성물" 및 "스템 루프 구조체"는 일반적으로 분자내 혼성화가 폴리뉴클레오티드의 일부 사이에서 발생하는 폴리뉴클레오티드의 2차 구조를 지칭한다. 스템 루프는 단일 폴리뉴클레오티드 가닥의 두 영역이 혼성화하여 "스템"으로 언급될 수 있는 이중 가닥 부분, 및 쌍을 형성하지 않는, "루프"로 언급될 수 있는 단일 가닥 루프를 형성할 때 형성될 수 있다. 스템은 임의의 가변 길이의 염기쌍일 수 있고, 스템을 따른 염기쌍 형성은 스템에 참여하는 부분의 하나 또는 둘 모두 상에 하나 이상의 쌍을 형성하지 않은 염기의 갭에 의해 내부적으로 차단될 수 있다. 루프는 임의의 가변 길이의 쌍을 형성하지 않은 염기일 수 있다. 일부 경우에, 루프 길이는 적어도 3개의 염기이다. 일부 경우에, "스템"을 형성하는 두 영역이 완전히 상보성이다. 일부 경우에, "스템"을 형성하는 두 영역은 부분적으로 상보성이다. 일부 경우에, 단일 폴리뉴클레오티드는 하나의 스템 루프 구조를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단일 폴리뉴클레오티드는 하나 초과의 스템 루프 구조를 포함할 수 있다. 스템 루프 구조의 스템 부분은 돌출부(overhang)가 없이, 5' 돌출부를 포함하는 단일 가닥 섹션을 갖는 또는 3' 돌출부를 포함하는 단일 가닥 섹션을 갖는, 또는 5' 말단 및 3' 말단 둘 모두로부터 연장되는 단일 가닥 부분을 갖는 이중 가닥 섹션으로서 종결될 수 있다.
본 개시내용은 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘을 생성하기 위해 사용될 수 있는 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 희귀한 서열 변이체 및 융합 유전자를 검출하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 유전자 융합체는 파트너 유전자에 대한 사전 지식 없이 검출되고, 예컨대 무세포 DNA 또는 게놈 DNA 샘플에서 유전자 재배열 이벤트를 스크리닝하는데 적용될 수 있다. 본 개시내용의 다양한 측면은 대량 병렬 서열결정 방법과 함께 사용될 수 있는 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 함유하는 앰플리콘을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 롤링 써클 증폭에 의해 생성된 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 콘카테머의 비율을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 원형 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; (b) 증폭 반응 혼합물을 롤링 써클 증폭의 다중 사이클에 적용하여 콘카테머를 포함하는 다수의 증폭 산물을 생성하는 단계를 포함한다. 반응 혼합물은 (i) 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제, (ii) 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 원형 폴리뉴클레오티드, 및 (iii) 프라이머를 포함할 수 있다. 롤링 써클 증폭의 다중 사이클의 각각의 사이클은 변성 온도에서의 변성, 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링, 및 주어진 신장 시간 동안 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함할 수 있다. 롤링 써클 증폭의 다중 사이클은 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 콘카테머의 증가된 비율을 갖는 다수의 증폭 산물을 생성할 수 있다. 생성된 다수의 증폭 산물은 이 산물이 변성 및 프라이머 어닐링 조건은 대등하지만 다중 사이클의 신장 시간의 총합과 대등한 신장 시간을 사용하는 1회 증폭 사이클을 이용하여 생성된 다수의 증폭 산물에 비해, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 콘카테머를 더 높은 비율로 함유한다는 것을 특징으로 할 수 있다.
롤링 써클 증폭은 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제, 예를 들어 가닥 변위 활성을 갖는 DNA 폴리머라제에 의해 촉진될 수 있다. 본 방법에 유용한 다양한 폴리머라제가 이용 가능하며, 그의 비제한적인 예는 Bst DNA 폴리머라제, 큰 단편; Bsu DNA 폴리머라제, 큰 단편; Deep VentR™ DNA 폴리머라제; Deep VentR™(엑소-) DNA 폴리머라제; 클레노우(Klenow) 단편(3'-5' 엑소-); DNA 폴리머라제 I, 큰 단편; M-MuLV 역전사효소; phi29 DNA 폴리머라제; PyroPhage 3173 폴리머라제; VentR ® DNA 폴리머라제; 및 VentR ®(엑소-) DNA 폴리머라제를 포함한다.
롤링 써클 증폭을 수행하기 위한 증폭 반응 혼합물은 주형(예를 들어, 원형 폴리뉴클레오티드), 하나 이상의 프라이머, dNTP 및 완충제 성분을 포함하고 이로 제한되지 않는 프라이머 연장 반응에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 증폭의 한 사이클은 (i) 이중 가닥 주형이 단일 가닥 폴리뉴클레오티드로 전환되는 변성 온도에서의 변성, (ii) 프라이머가 단일 가닥 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링, 및 (iii) 단일 가닥 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 프라이머가 주형으로서 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 사용하여 연장되는 주어진 신장 시간 동안 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함할 수 있다. 가닥 변위 폴리머라제는 변위를 통해 폴리머라제가 원형 주형 주위에서 1회 초과로 지속되어 원형 주형에 상보성인 서열의 콘카테머성 직렬 카피를 생성할 수 있기 때문에 RCA에 특히 유용하다. 원형 폴리뉴클레오티드를 주형으로 사용하여, 프라이머 연장을 주형 상에서 계속할 수 있고, 이에 의해 원형 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 콘카테머)의 다중 카피를 포함하는 증폭 산물이 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 증폭 반응 혼합물을 롤링 써클 증폭의 다중 사이클에 적용함으로써 생성된다.
일부 실시양태에서, 다중 사이클은 적어도 2 사이클 (예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 사이클)을 포함한다. RCA의 다중 사이클은 원형 주형으로부터 다수의 선형 콘카테머의 형성을 유도할 수 있다. 변성 동안, 원형 주형으로부터 제1 콘카테머의 연장이 종결된다. 프라이머 결합 및 연장을 반복함으로써, 다수의 사이클에 걸쳐 원형 주형으로부터 다수의 콘카테머를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 3개의 온도기, 즉 변성을 위한 제1 온도기, 프라이머 결합을 위한 제2 온도기 및 프라이머 연장을 위한 제3 온도기가 사용된다. 일부 실시양태에서, 프라이머 결합을 위한 것보다 더 높은 프라이머 연장을 위한 온도는 프라이머 연장 동안 프라이머 결합을 최소화하도록 선택된다. 프라이머 연장 동안 프라이머 결합을 최소화하는 것은 보다 짧은 증폭 산물의 형성을 감소시킬 수 있고, 프라이머가 증폭 반응 혼합물에 포함된 역방향 프라이머의 경우와 같이 형성되고 있는 증폭 산물에 혼성화할 가능성이 작기 때문에 짧은 단편의 편향된 증폭을 감소시킬 수 있다. 형성되고 있는 증폭 산물에 혼성화된 프라이머는 또한 프라이머 연장에 참여할 수 있지만, 연장 동안 작은 원은 주어진 시간 내에 큰 단편보다 더 많은 반복 단위의 카피 및 더 많은 프라이머 결합 부위를 생성하는 경향이 있기 때문에 작은 단편의 우선적인 증폭을 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머 연장을 위해 선택된 온도는 프라이머 어닐링을 위해 선택된 온도보다 적어도 5℃(예를 들어, 적어도 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃ 이상) 더 높을 수 있다. 프라이머 연장을 위해 선택된 온도는 프라이머 어닐링을 위해 선택된 온도보다 약 1℃ 내지 20℃(예를 들어, 약 2℃ 내지 18℃, 약 4℃ 내지 15℃ 또는 약 5℃ 내지 10℃) 더 높을 수 있다. 비등온 RCA에 적합한 온도의 범위는 사용된 폴리머라제 효소의 특성에 따라 결정될 수 있다.
다중 사이클의 각각의 사이클은 적어도 약 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃ 또는 95℃의 변성 온도에서의 변성을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃ 또는 95℃의 변성 온도에서의 변성을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 최대 약 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃ 또는 95℃의 변성 온도에서의 변성을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 70℃ 내지 약 100℃, 약 70℃ 내지 약 95℃, 약 70℃ 내지 약 90℃, 약 70℃ 내지 약 85℃, 약 70℃ 내지 약 80℃, 또는 약 70℃ 내지 약 75℃의 변성 온도에서의 변성을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 70℃ 내지 약 100℃, 약 75℃ 내지 약 100℃, 약 80℃ 내지 약 100℃, 약 85℃ 내지 약 100℃, 약 90℃ 내지 약 100℃, 또는 약 95℃ 내지 약 100℃의 변성 온도에서의 변성을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 적어도 약 5초, 10초, 15초, 20초, 25초, 30초, 35초, 40초, 45초, 50초, 55초 또는 60초 동안 변성 온도에서의 변성을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 5초, 10초, 15초, 20초, 25초, 30초, 35초, 40초, 45초, 50초, 55초, 또는 60초 동안 변성 온도에서의 변성을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 최대 약 5초, 10초, 15초, 20초, 25초, 30초, 35초, 40초, 45초, 50초, 55초, 또는 60초 동안 변성 온도에서의 변성을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 5초 내지 60초, 5초 및 55초, 5초 내지 50초, 5초 내지 45초, 5초 내지 40초, 5초 내지 35초, 5초 내지 30초, 5초 내지 25초, 5초 내지 20초, 5초 내지 15초 또는 5초 내지 10초 동안 변성 온도에서의 변성을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 5초 내지 60초, 10초 내지 60초, 15초 내지 60초, 20초 내지 60초, 25초 내지 60초, 30초 내지 60초, 35초 내지 60초, 40초 내지 60초, 45초 내지 60초, 50초 내지 60초, 또는 55초 내지 60초 동안 변성 온도에서의 변성을 포함할 수 있다.
다중 사이클의 각각의 사이클은 적어도 약 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 또는 65℃의 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃ 또는 65℃의 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 최대 약 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃ 또는 65℃의 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 45℃ 내지 약 65℃, 약 45℃ 내지 약 60℃, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 50℃의 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 45℃ 내지 약 65℃, 약 50℃ 내지 약 65℃, 약 55℃ 내지 약 65℃, 또는 약 60℃ 내지 약 65℃의 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 적어도 약 5초, 10초, 15초, 20초, 25초, 30초, 35초, 40초, 45초, 50초, 55초, 또는 60초 동안 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 5초, 10초, 15초, 20초, 25초, 30초, 35초, 40초, 45초, 50초, 55초 또는 60초 동안 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 최대 약 5초, 10초, 15초, 20초, 25초, 30초, 35초, 40초, 45초, 50초, 55초, 또는 60초 동안 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 5초 내지 60초, 5초 내지 55초, 5초 내지 50초, 5초 내지 45초, 5초 내지 40초, 5초 내지 35초, 5초 내지 30초, 5초 내지 25초, 5초 내지 20초, 5초 내지 15초, 또는 5초 내지 10초의 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 5초 내지 60초, 10초 내지 60초, 15초 내지 60초, 20초 내지 60초, 25초 내지 60초, 30초 내지 60초, 35초 내지 60초, 40초 내지 60초, 45초 내지 60초, 50초 내지 60초, 또는 55초 내지 60초 동안 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링을 포함할 수 있다.
다중 사이클의 각각의 사이클은 적어도 약 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃ 또는 75℃의 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃ 또는 75℃의 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 최대 약 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃ 또는 75℃의 신장 온도에서 프라이머 신장을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 65℃ 내지 약 75℃ 또는 약 65℃ 내지 약 70℃의 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 65℃ 내지 약 75℃ 또는 약 70℃ 내지 약 75℃의 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 적어도 약 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분 또는 10분의 신장 시간 동안 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 또는 10분의 신장 시간 동안 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 최대 약 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 또는 10분의 신장 시간 동안 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 30초 내지 10분, 30초 내지 9분, 30초 내지 8분, 30초 내지 7분, 30초 내지 6분, 30초 내지 5분, 30초 내지 4분, 30초 내지 3분, 30초 내지 2분, 또는 30초 내지 1분의 신장 시간 동안 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함할 수 있다. 다중 사이클의 각각의 사이클은 약 30초 내지 10분, 1분 내지 10분, 2분 내지 10분, 3분 내지 10분, 4분 내지 10분, 5분 내지 10분, 6분 내지 10분, 7분 내지 10분, 8분 내지 10분, 또는 9분 내지 10분의 신장 시간 동안 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함할 수 있다. 신장 시간의 길이는 증폭 산물 수율을 최적화하도록 선택될 수 있다. 신장 시간을 선택할 때 고려해야 할 몇 가지 요인은 원형 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 원형 주형)의 크기, 원형 폴리뉴클레오티드 서열의 GC 함량 및 증폭 산물의 2차 구조의 형성을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 증폭 산물의 유사한 수율을 생산하기 위해, 보다 긴 원형 폴리뉴클레오티드는 보다 짧은 원형 폴리뉴클레오티드에 비해 더 긴 신장 시간을 사용할 수 있다. 추가의 예로서, 증폭 산물의 유사한 수율을 생산하기 위해, 보다 높은 GC 함량을 갖는 원형 폴리뉴클레오티드는 보다 낮은 GC 함량을 갖지만 대등한 길이를 갖는 원형 폴리뉴클레오티드에 비해 더 긴 신장 시간을 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 다중 사이클의 각각의 사이클은 (i) 약 5초 내지 약 60초 동안 약 75℃ 내지 약 95℃의 변성 온도에서의 변성, (ii) 약 5초 내지 약 60초 동안 약 45℃ 내지 약 65℃의 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링, 및 (iii) 약 30초 내지 약 10분의 신장 시간 동안 약 65℃ 내지 약 75℃의 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중 사이클의 각각의 사이클은 (i) 약 15초 내지 약 30초 동안 약 80℃의 변성 온도에서의 변성, (ii) 약 15초 내지 약 45초 동안 약 50℃의 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링, 및 (iii) 약 3분 내지 약 10분의 신장 시간 동안 약 70℃의 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중 사이클의 각각의 사이클은 (i) 약 20초 동안 약 80℃의 변성 온도에서의 변성, (ii) 약 30초 동안 약 50℃의 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링, 및 (iii) 약 6분의 신장 시간 동안 약 70℃의 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함한다.
일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 롤링 써클 증폭의 다중 사이클의 임의의 사이클에서 폴리머라제로 보충된다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 롤링 써클 증폭의 다중 사이클 중 적어도 2회 사이클에서 폴리머라제로 보충된다. 일부 경우에, 폴리머라제 활성의 열 불활성화로 인해 증폭 반응 혼합물을 보충하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 폴리머라제는 승온에서 열에 의해 불활성화된다. 열 불활성화 온도는 사용된 폴리머라제에 따라 결정될 수 있다. 증폭을 위해 선택된 폴리머라제 및 변성 온도, 프라이머 어닐링 온도 및 프라이머 연장 온도 중 임의의 하나에 대해 선택된 온도에 따라, 폴리머라제는 적어도 하나의 증폭 사이클 후에 선택적으로 보충될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 두 사이클마다 한 번씩 폴리머라제로 보충된다. 다양한 실시양태에서, 반응 혼합물은 필요에 따라, 예를 들어 증폭 산물의 수율에 의해 결정되는 바와 같이 폴리머라제로 보충된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 생성된 다수의 증폭 산물은 이 산물이 변성 및 프라이머 어닐링 조건은 대등하지만 다중 사이클의 신장 시간의 총합과 대등한 신장 시간을 사용하는 1회 증폭 사이클을 이용하여 생성된 다수의 증폭 산물에 비해, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피(예를 들어, 적어도 3, 4 또는 5개의 카피)를 갖는 콘카테머를 더 높은 비율로 함유한다는 것을 특징으로 한다.
표적 폴리뉴클레오티드의 더 적은 카피를 갖는 증폭 산물에 비해 표적 폴리뉴클레오티드의 더 많은 카피를 갖는 콘카테머 또는 증폭 산물은 더 큰 단편 크기를 가질 수 있다. 증폭 산물 또는 콘카테머에서 표적 폴리뉴클레오티드의 카피 수의 결정은 다양한 방법, 예를 들어 아가로스 겔, 크기 배제 크로마토그래피 또는 차세대 서열결정에 의한 분석을 사용하여 확인될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 롤링 써클 증폭의 다중 사이클을 포함하는 방법을 사용하여 생성된 콘카테머 또는 증폭 산물은 임의의 적합한 방법(예를 들어, 아가로스 겔, 크기 배제 크로마토그래피 또는 차세대 서열결정)을 사용하여 확인된 바와 같이, 하나의 사이클을 포함하는 롤링 써클 증폭에 비해 표적 폴리뉴클레오티드의 2개의 카피를 갖는 콘카테머의 증가된 비율을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 콘카테머의 비율은 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 10%, 25% 또는 50% 증가한다.
일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 적어도 약 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250개 염기쌍의 평균 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 약 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 또는 250개 염기쌍의 평균 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 최대 약 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 또는 250개 염기쌍의 평균 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 약 150개 염기쌍의 평균 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 약 160개 염기쌍의 평균 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 약 170개 염기쌍의 평균 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 약 180개 염기쌍의 평균 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 약 190개 염기쌍의 평균 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 약 200개 염기쌍의 평균 단편 길이를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 적어도 약 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250개 염기쌍의 중간 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 약 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 또는 250개 염기쌍의 중간 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 최대 약 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 또는 250개 염기쌍의 중간 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 약 150개 염기쌍의 중간 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 약 160개 염기쌍의 중간 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 약 170개 염기쌍의 중간 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 약 180개 염기쌍의 중간 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 약 190개 염기쌍의 중간 단편 길이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 약 200개 염기쌍의 중간 단편 길이를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 무세포 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 무세포 DNA의 분석이 바람직하다. 본원의 다른 곳에서 추가로 설명되는 바와 같이, 무세포 DNA(cfDNA)는 순환하는 종양 DNA 또는 순환하는 태아 DNA일 수 있다. 무세포 폴리뉴클레오티드는 일부 경우에 무세포 RNA를 포함할 수 있다. 무세포 DNA는 예를 들어 리가제와 같은 효소를 사용하는 라이게이션에 의해 원형화되고, 본 방법을 통해 증폭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 반응 혼합물에 이용되는 원형 폴리뉴클레오티드가 cfDNA를 포함할 때 약 40개 염기 내지 약 450개 염기, 40개 염기 내지 약 400개 염기, 40개 염기 내지 약 350개 염기, 40개 염기 내지 약 300개 염기, 40개 염기 내지 약 250개 염기, 40개 염기 내지 약 200개 염기, 40개 염기 내지 약 150개 염기, 40개 염기 내지 약 100개 염기, 또는 40개 염기 내지 약 50개 염기의 단편 길이의 분포를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 반응 혼합물에 이용되는 원형 폴리뉴클레오티드가 cfDNA를 포함할 때 약 40개 염기 내지 약 450개 염기, 50개 염기 내지 약 450개 염기, 100개 염기 내지 약 450개 염기, 150개 염기 내지 약 450개 염기, 200개 염기 내지 약 450개 염기, 250개 염기 내지 약 450개 염기, 300개 염기 내지 약 450개 염기, 350개 염기 내지 약 450개 염기, 또는 400개 염기 내지 약 450개 염기의 단편 길이의 분포를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 반응 혼합물에 이용되는 원형 폴리뉴클레오티드가 cfDNA를 포함할 때 약 100개 염기 내지 약 200개 염기, 110개 염기 내지 약 200개 염기, 120개 염기 내지 약 200개 염기, 130개 염기 내지 약 200개 염기, 140개 염기 내지 약 200개 염기, 150개 염기 내지 약 200개 염기, 160개 염기 내지 약 200개 염기, 170개 염기 내지 약 200개 염기, 180개 염기 내지 약 200개 염기 또는 190개 염기 내지 약 200개 염기의 단편 길이의 분포를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 증폭 산물은 반응 혼합물에 이용되는 원형 폴리뉴클레오티드가 cfDNA를 포함할 때 약 100개 염기 내지 약 200개 염기, 100개 염기 내지 약 190개 염기, 100개 염기 내지 약 180개 염기, 100개 염기 내지 약 170개 염기, 100개 염기 내지 약 160개 염기, 100개 염기 내지 약 150개 염기, 100개 염기 내지 약 140개 염기, 100개 염기 내지 약 130개 염기, 100개 염기 내지 약 120개 염기 또는 100개 염기 내지 약 110개 염기의 단편 길이의 분포를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 증폭 반응 혼합물 중의 프라이머는 무작위 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 반응 혼합물 중의 프라이머는 유전자 특이적 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 다수의 유전자(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 유전자)에 대한 유전자 특이적 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 (i) 서열 상보성을 통해 원형 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 (ii) 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 제1 프라이머를 포함한다. 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 콘카테머는 주형으로서 원형 폴리뉴클레오티드를 사용하는 제1 프라이머의 연장에 의해 롤링 써클 증폭의 다중 사이클 동안 생성될 수 있다. 프라이머는 (i) 서열 상보성을 통해 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단, (ii) 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하는 제2 프라이머를 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 함유하는 다수의 연장 산물은 주형으로서 콘카테머를 사용하는 제2 프라이머의 연장에 의해 롤링 써클 증폭의 다중 사이클 동안 생성될 수 있다. 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이, 이러한 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 사용하여 증폭을 수행하는 방법은 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머를 포함하는 앰플리콘을 농축하는데 이용될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머를 포함하는 앰플리콘을 농축하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 제1 프라이머의 연장에 의해 원형 표적 폴리뉴클레오티드로부터 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 콘카테머를 생성하는 단계로서, 상기 제1 프라이머는 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 것인 단계; (b) 제2 프라이머의 연장에 의해 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 함유하는 다수의 연장 산물을 생성하는 단계로서, 상기 제2 프라이머는 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하고, 여기서 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일한 것인 단계, 및 (c) 다수의 앰플리콘을 생성하는 조건 하에 단계 (b)의 다수의 연장 산물을 증폭하는 단계로서, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘이 농축되는 것인 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드로부터 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 콘카테머를 생성하는 단계는 제1 프라이머의 연장을 포함한다. 프라이머 신장은 열순환 반응 및 등온 반응을 포함하고 이로 제한되지 않는 증폭 반응에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 열순환 반응은 예를 들어 변성, 프라이머 결합 및 프라이머 연장의 여러 사이클을 수반한다. 일부 실시양태에서, 본 방법의 콘카테머를 생성하는 단계는 폴리머라제에 의해 수행된다. 본 방법에 유용한 다양한 폴리머라제가 이용 가능하며, 이들의 비제한적인 예가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 콘카테머의 생성을 수행하기 위한 폴리머라제는 가닥 변위 활성을 갖는다. 일부 실시예에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드로부터 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 콘카테머를 생성하는 단계는 등온 롤링 써클 증폭(RCA)을 포함한다. 가닥 변위 폴리머라제는 변위를 통해 폴리머라제가 원형 주형 주위에서 1회 초과로 지속되어 원형 주형에 상보성인 서열의 콘카테머성 직렬 카피를 생성할 수 있기 때문에 RCA에 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 콘카테머를 생성하는 단계는 비등온 RCA를 포함한다. 비등온 RCA는 적어도 2개의 온도기(예를 들어, 적어도 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 온도기)의 적어도 2회 사이클(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 사이클)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 온도기는 프라이머 결합 및 연장에 적합할 수 있고, 제2 온도기는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 변성에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비등온 RCA는 적어도 2개의 온도기의 2 내지 35 사이클 (예를 들어, 3 내지 30, 4 내지 20, 5 내지 15, 또는 6 내지 10 사이클) 포함한다. 비등온 RCA 동안 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 변성에 적합한 제2 온도기를 포함하는 온도기를 통한 사이클링은 원형 주형으로부터 다수의 선형 콘카테머의 형성을 유도할 수 있다. 변성 동안, 원형 주형으로부터 제1 콘카테머의 연장이 종결된다. 프라이머 결합 및 연장을 반복함으로써, 다수의 콘카테머는 원형 주형으로부터 여러 사이클에 걸쳐 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 3개의 온도기, 즉 프라이머 어닐링을 위한 제1 온도기, 프라이머 연장을 위한 제2 온도기, 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 변성시키기 위한 제3 온도기를 사용한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 결합 동안보다 더 높은 프라이머 연장을 위한 온도는 프라이머 연장 동안 프라이머 결합을 최소화하도록 선택된다. 프라이머 연장 동안 프라이머 결합을 최소화하는 것은 보다 짧은 증폭 산물의 형성을 감소시킬 수 있고, 프라이머가 RCA 반응 혼합물에 포함된 역방향 프라이머의 경우와 같이 형성되고 있는 증폭 산물에 혼성화할 가능성이 작기 때문에 짧은 단편의 편향된 증폭을 감소시킬 수 있다. 형성되고 있는 증폭 산물에 혼성화된 프라이머는 또한 프라이머 연장에 참여할 수 있지만, 연장 동안 작은 원은 주어진 시간 내에 큰 단편보다 더 많은 반복 단위의 카피 및 더 많은 프라이머 결합 부위를 생성하는 경향이 있기 때문에 작은 단편의 우선적인 증폭을 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머 연장을 위해 선택된 온도는 프라이머 어닐링을 위해 선택된 온도보다 적어도 5℃(예를 들어, 적어도 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃ 이상) 더 높을 수 있다. 프라이머 연장을 위해 선택된 온도는 프라이머 어닐링을 위해 선택된 온도보다 약 1℃ 내지 20℃(예를 들어, 약 2℃ 내지 18℃, 약 4℃ 내지 15℃ 또는 약 5℃ 내지 10℃) 더 높을 수 있다. 일부 실시양태에서, 비등온 RCA는 제4 온도기를 포함할 수 있다. 제4 온도기는 예를 들어 연장 산물에 2차 구조를 형성하는 데, 예를 들어 스템 루프 구조를 형성하는 데 적합할 수 있다. 비등온 RCA에 적합한 온도의 범위는 사용된 폴리머라제 효소의 특성에 따라 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, RCA(등온 또는 비등온)는 원형 주형을 따라 프라이머 연장에 의해 생성된 선형 콘카테머를 따라 역방향 프라이머의 연장과 같은, 선형 주형을 따른 프라이머 연장 반응을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제2 프라이머는 제1 프라이머의 연장 산물로서 생성된 선형 콘카테머 주형을 포함하는 주형과 혼성화할 수 있고, 프라이머 연장 단계 동안 제2 프라이머의 프라이머 연장은 선형의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있고, 그의 가닥들은 제1 및 제2 프라이머의 추가의 카피에 의한 연장을 위한 주형으로서 추가로 작용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 함유하는 다수의 연장 산물을 생성하는 단계는 제1 프라이머의 연장 산물로서 생성된 선형 콘카테머 주형에 혼성화된 제2 프라이머의 연장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 연장 산물은 비등온 RCA 동안 원형 주형으로부터 선형 콘카테머의 생성과 동시에 생성될 수 있다. 프라이머 연장 및 증폭 방법은 종종 긴 단편에 비해 짧은 단편의 증폭을 선호한다. 일부 실시양태에 따르면, 연장 산물을 생성하기 위한 프라이머 연장 반응은 보다 짧은 산물에 유리한 편향을 감소시키고 따라서 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 포함하는 산물과 같은 보다 긴 산물의 비율을 증가시키도록 최적화될 수 있다. 본 개시내용은 이러한 목적을 달성하기 위한 다양한 방법을 고려하고, 이들 방법은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 이를 달성하는 한 방법은 짧은 단편이 우선적으로 증폭되지 않도록 또는 길이는 동일하지만 헤어핀 구조가 결여된 주형에 비해 감소된 빈도로 증폭되도록 프라이머 연장 사이클의 수를 제한함으로써 이루어진다. 일부 실시양태에서, 연장 산물을 생성하는 단계는 15회 이하(예를 들어, 10, 8, 6회 또는 그 미만)의 제2 프라이머의 연장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연장 산물을 생성하는 단계는 2 내지 15 사이클의 제2 프라이머의 연장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연장 산물을 생성하는 단계는 2 내지 10 사이클의 제2 프라이머의 연장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프라이머의 연장은 제1 프라이머의 연장과 동시에 발생한다.
일부 실시양태에서, 콘카테머의 생성을 위해 사용될 수 있는, 본원에서 원형 폴리뉴클레오티드와 교환 가능하게 사용되는 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 선형 표적 폴리뉴클레오티드로부터 형성된다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥이다. 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 임의의 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드의 길이는 25 내지 1000개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드의 길이는 50 내지 500개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드의 길이는 75 내지 250개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드의 길이는 100 내지 200개 뉴클레오티드이다. 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 염색체 또는 유전자 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 miRNA, rRNA, tRNA 및 mRNA를 포함하고 이로 제한되지 않는 유전자 산물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 점 돌연변이, SNP, 삽입 또는 결실에 의해 생성되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 염색체 재배열에 의해 생성되는 서열을 포함한다. 염색체 재배열은 하나 이상의 역위; 하나 이상의 결실; 하나 이상의 중복; 하나 이상의 전좌; 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 전좌를 포함하는 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 융합 유전자의 융합점 또는 융합 접합부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 역위, 결실, 중복, 및 전좌 중 적어도 하나를 포함한다.
콘카테머를 생성하기 위해 하나 이상의 본 발명의 방법에서 사용되는 제1 프라이머는 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함한다. 제1 프라이머는 임의의 적합한 길이, 예컨대 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 또는 100개 뉴클레오티드일 수 있고, 그의 임의의 부분(예를 들어, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 뉴클레오티드)은 프라이머가 혼성화하는 대응하는 표적 서열에 상보성일 수 있다. 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1 프라이머의 제1의 3' 말단은 임의의 적합한 길이, 예컨대 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 프라이머는 프라이머 연장을 위해 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드의 다양한 무작위 영역에 무작위로 혼성화하고 이를 프라이밍하는 무작위 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1의 3' 말단을 포함하고, 상기 각각의 무작위 서열은 서열 상보성을 통해 대응하는 상보성 서열에 특이적으로 혼성화한다. 프라이머가 무작위 3' 말단 서열을 포함할 때, 표적 서열은 프라이머 연장에 의해 증폭된 서열이다. 전형적으로, 3' 말단은 3' 말단 뉴클레오티드를 포함한다. 제1의 5' 말단(서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 프라이머의 제1 공통 서열을 갖는)은 임의의 적합한 길이, 예컨대 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 제1 공통 서열은 임의의 적절한 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 프라이머의 제1 공통 서열의 길이는 적어도 10개(예를 들어, 적어도 15, 20, 25, 30개 또는 그 초과의) 뉴클레오티드이다. 일반적으로, 5' 말단은 3' 말단에 대해 5'인 폴리뉴클레오티드의 부분을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 5' 말단은 5' 말단 뉴클레오티드를 포함한다.
서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하는 제2 프라이머는 프라이머 연장에 의해 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 함유하는 다수의 연장 산물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 다수의 연장 산물을 생성하기 위한 제2 프라이머는 임의의 적합한 길이, 예컨대 약 또는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 또는 100개 뉴클레오티드일 수 있고, 그의 임의의 부분(예를 들어, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 뉴클레오티드)은 프라이머가 혼성화하는 대응하는 표적 서열에 상보성일 수 있다. 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2 프라이머의 제2의 3' 말단은 임의의 적합한 길이, 예컨대 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 프라이머는 프라이머 연장을 위해 콘카테머의 다양한 무작위 영역에 무작위로 혼성화하고 이를 프라이밍하는 무작위 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2의 3' 말단을 포함한다. 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 프라이머의 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단은 임의의 적합한 길이, 예컨대 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 제2 공통 서열은 임의의 적절한 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 프라이머의 제2 공통 서열의 길이는 적어도 10개(예를 들어, 적어도 15, 20, 25, 30개 또는 그 초과의) 뉴클레오티드이다. 일반적으로, 5' 말단은 3' 말단에 대해 5'인 폴리뉴클레오티드의 부분을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 5' 말단은 5' 말단 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공통 서열은 제2 공통 서열이 적합한 반응 조건(예를 들어, 프라이머 혼성화 및/또는 프라이머 연장 단계와 같은 증폭 반응에서의 하나 이상의 단계) 하에서 제1 공통 서열의 상보체와 혼성화할 수 있도록 제1 공통 서열에 적어도 80% 동일하다(예를 들어, 적어도 90%, 95% 또는 100% 동일함). 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 공통 서열은 동일하다.
일반적으로, 표적에 특이적으로 혼성화하지 않는 공통 서열은 3' 말단이 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 조건(예를 들어, 증폭 반응의 하나 이상의 단계) 하에서 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하지 않도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 공통 서열은 3' 말단이 혼성화하는 위치에 대해 3'인 표적 폴리뉴클레오티드를 따른 서열, 표적 폴리뉴클레오티드 내의 임의의 위치의 서열, 또는 샘플 내의 폴리뉴클레오티드의 임의의 군(예를 들어, 인간 게놈 DNA 서열을 포함하는, 박테리아, 바이러스, 식물 또는 동물과 같은 유기체의 모든 게놈 서열)과 75%, 50%, 25%, 10% 미만, 또는 이보다 작은 상보성을 갖도록 설계된다. 특정 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개(예를 들어, 적어도 15, 20, 25, 30, 40, 50개 또는 그 초과)의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일하다. 특정 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 5' 말단에 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 70% 동일하다(예를 들어, 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일하다).
일부 실시양태에서, 본 방법의 연장 산물은 (i) 제1 공통 서열과 제2 공통 서열의 상보체 사이, 및/또는 (ii) 제2 공통 서열과 제1 공통 서열의 상보체 사이의 분자내 혼성화를 포함하는 스템 루프 구조를 형성한다. 연장 산물은 비등온 RCA 동안, 예를 들어 스템 루프 구조를 형성하기에 적합한 온도를 사용하는 제4 온도기 동안 스템 루프 구조를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조는 RCA 후의 후속 증폭 반응 동안 형성된다. 스템 루프 구조의 형성은 이중 가닥 스템 영역 및 단일 가닥 루프 영역의 안정성에 의존할 수 있다. 스템의 안정성은 그의 길이, 불일치 수 및 염기 조성에 따라 달라질 수 있다. 스템 루프 구조의 안정성은 또한 루프의 길이에 따라 달라진다. 2차 구조가 없는 큰 루프는 불안정할 수 있고, 길이가 3개 염기보다 짧은 루프는 입체적으로 가능하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 스템 부분이 보다 긴 스템 루프 구조는 동일한 루프 및 보다 짧은 스템을 갖는 스템 루프 구조보다 더 안정적일 수 있다. 일부 예에서, 보다 긴 루프를 갖는 스템 루프 구조는 동일한 스템 및 보다 짧은 루프를 갖는 스템 루프 구조보다 덜 안정할 수 있다.
콘카테머를 생성하는 방법의 예시적인 실시양태가 도 1에 도시된다. 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열 5'-TACGCA-3'을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 제1 프라이머는 롤링 써클 증폭(RCA)에 의해 연장된다. 다음으로, 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 함유하는 다수의 연장 산물을 생성하는 단계는 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열 5'-TACGCA-3'(제1 공통 서열과 동일)을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하는 제2 프라이머의 연장을 포함한다. 연장 산물은 제2 공통 서열과 제1 공통 서열의 상보체 사이의 분자내 혼성화의 결과로서 스템 루프 구조를 형성할 수 있다. 스템 루프 구조는 표적 폴리뉴클레오티드의 가변적인 수의 카피를 포함할 수 있다. 염기쌍의 스템 길이는 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스템의 길이는 적어도 6, 9, 15, 20, 25, 30개 또는 그 초과의 염기쌍이다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조는 5 내지 30개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 구조는 10 내지 20개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함한다. 제1 또는 제2 공통 서열로서 사용될 수 있는 서열의 비제한적인 예가 표 1에 제시된다.
<표 1> 후보 공통 서열의 비제한적인 예
Figure pct00001
Figure pct00002
분자내 혼성화에 관련되는 염기쌍의 수는 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열의 연속적인 뉴클레오티드의 수, 또는 제2 공통 서열 및 제1 공통 서열의 상보체의 연속적인 뉴클레오티드의 수에 의존할 수 있다. 분자내 혼성화에 관련되는 염기쌍의 수는 또한 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열의 동일성 백분율에 의존할 수 있고, 여기서 동일성 백분율은 제1 및 제2 공통 서열이 최적으로 정렬될 때 제1 공통 서열과 제2 공통 서열 사이의 동일한 염기의 백분율을 의미한다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 5 내지 25개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 최적으로 정렬될 때 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 최적으로 정렬될 때 60% 내지 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 공통 서열은 5' 말단에 5 내지 25개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 60% 내지 100% 동일하다.
제1 및 제2 프라이머의 다수의 신장 산물을 증폭하는 단계는 제3 프라이머의 프라이머 연장을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제3 프라이머는 서열 상보성을 통해 제1 공통 서열 및/또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 서열을 포함한다. 핵산 증폭을 위한 제3 프라이머는 임의의 적합한 길이, 예컨대 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 또는 100개 뉴클레오티드일 수 있고, 그의 임의의 부분 또는 전부는 대응하는 표적 서열(예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 초과의 뉴클레오티드)에 상보성일 수 있다. 제3 프라이머는 하나 이상의 증폭 프라이머 어닐링 서열 또는 이의 상보체; 하나 이상의 서열결정 프라이머 어닐링 서열 또는 그의 상보체; 하나 이상의 바코드(barcode) 서열; 다수의 상이한 프라이머 사이에서 공유된 하나 이상의 공통 서열; 하나 이상의 제한 효소 인식 부위; 하나 이상의 프로브 결합 부위 또는 서열결정 어댑터(예를 들어, 대규모 병렬 서열결정을 위한 유동 셀과 같은 서열결정 플랫폼에 부착하기 위한); 하나 이상의 무작위 또는 거의 무작위 서열(예를 들어, 하나 이상의 위치에서 2개 이상의 상이한 뉴클레오티드의 세트로부터 무작위로 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드); 및 이들의 조합물을 포함하는 분절을 포함할 수 있다. 증폭 프라이머 어닐링 서열은 또한 서열결정 프라이머 어닐링 서열로서 작용할 수 있다.
스템 루프 구조는 스템 루프 구조의 안정성에 따라 가변적인 효율로 증폭될 수 있다. 일반적으로, 동일한 길이의 스템 및 가변 길이의 루프를 포함하는 다수의 스템 루프 구조 중에서, 보다 긴 루프를 포함하는 스템 루프 구조는 열역학적으로 덜 안정하고, 주형으로서 보다 쉽게 접근 가능하며, 보다 효율적으로 증폭될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 혼성화 가능한 공통 서열이 측면에 위치하는 표적 서열의 증폭은 표적 서열의 적어도 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘을 농축한다. 제3 프라이머의 프라이머 연장으로부터 생성된 앰플리콘은 표적 폴리뉴클레오티드의 가변적인 카피수를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 적어도 50%(예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과)이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 10% 내지 100%(예를 들어, 20%-90%, 30%-80%, 또는 40%-60%)이다.
본 방법의 실행시에, 스템 루프 생성물의 형성 및 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘의 농축은 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머 서열의 혼성화 서열의 용융 온도를 특정하고 증폭이 수행되는 온도를 조정하는 단계를 1회 이상의 수행함으로써 최적화된다. 프라이머 연장 산물의 증폭이 제1 공통 서열 및/또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 제3 프라이머의 프라이머 연장을 포함하는 실시양태에서, 제3 프라이머의 프라이머 결합 효율은 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열의 용융 온도 중 하나 이상에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±15℃ 이내(예를 들어 ±10℃, ±5℃, 또는 ±1℃ 이내)의 용융 온도(Tm)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±5℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는다. 일반적으로, Tm은 일반적으로 참조 서열(실제로 더 큰 폴리뉴클레오티드 내의 하위 서열일 수 있는) 및 이의 상보성 서열로 이루어지는 올리고 뉴클레오티드의 50%가 혼성화(또는 분리)되는 온도를 나타낸다. Tm은 관련 기술 분야에서 이용 가능한 표준 계산, 알고리즘 또는 측정에 기초할 수 있다. Tm을 측정하기 위한 도구의 일례인 올리고어낼라이저(OligoAnalyzer)는 www.idtdna.com/calc/analyzer에서 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies)에 의해 이용가능하고, 이것은 디폴트 파라미터를 사용하도록 설정될 수 있다. 다른 유사한 도구가 이용가능하다.
증폭이 수행되는 온도는 또한 긴 스템 루프 생성물 및 짧은 스템 루프 생성물에 대한 프라이머 결합 및 연장의 효율에 영향을 줄 수 있다. 특정 실시양태에서, 스템 루프 구조의 형성은 어닐링 단계를 제3 프라이머의 용융 온도의 ±5℃ 이내(예를 들어 ±10℃, ±5℃, 또는 ±1℃ 이내)의 온도에서 유지하면서 단계 (c)의 증폭 단계를 수행함으로써 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스템 루프 생성물의 형성은 어닐링 단계를 70℃ 미만(예를 들어, 70℃, 65℃, 60℃ 또는 이보다 낮은 온도 미만)의 온도에서 유지하면서 단계 (c)의 증폭을 수행함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 스템 고리 생성물의 형성은 어닐링 단계를 55℃ 내지 75℃(예를 들어, 60℃ 내지 70℃)의 온도에서 유지하면서 단계 (c)의 증폭을 수행함으로써 수행된다.
일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 원형화된 무세포 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 무세포 DNA, cDNA 또는 RNA)이다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA의 원형화된 단편이다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 염색체 재배열에 의해 생성된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염색체 재배열은 결실, 중복, 역위, 및 전좌 중 적어도 하나이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법의 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법의 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥이다. 특정 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합 길이는 75개 이하의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 서열 부분의 조합된 길이는 60개 이하의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 서열 부분의 조합된 길이는 50개 이하의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 서열 부분의 조합된 길이는 40개 이하의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 서열 부분의 조합된 길이는 30개 이하의 뉴클레오티드이다.
예시적인 한 실시양태에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 도 2에 도시된 바와 같이 배열된다. 간략화를 위해, 제1 및 제2 프라이머의 상대적인 혼성화 위치는 표적 폴리뉴클레오티드의 단일 가닥에 대해 제시된다. 그러나, 아래에서 언급되는 바와 같이, 하나의 프라이머는 표적 서열을 포함하는 가닥에 혼성화하고, 다른 프라이머는 표적 서열의 상보체를 포함하는 가닥에 혼성화한다. 제1 프라이머인 전방향 프라이머(F 프라이머)의 제1의 3' 말단은 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하고, 제1의 5' 말단은 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는다. 제2 프라이머인 역방향 프라이머(R 프라이머)의 제2의 3' 말단은 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드의 상보체에 특이적으로 혼성화하고, 제2의 5' 말단은 표적 폴리뉴클레오티드의 상보체에 특이적으로 혼성화하지 않는다. 표적 서열의 단량체에 대한 전방향 프라이머(F 프라이머) 및 역방향 프라이머(R 프라이머)의 배향을 고려하여, 이 배열은 "백-투-백"(B2B) 또는 "반전된(inverted)" 프라이머로 언급될 수 있다. 이러한 프라이머 설계는 전통적인 헤드-투-헤드(head-to-head) 설계에 비해 감소된 프라이머 풋 프린트(foot print)(한 쌍의 프라이머에 의해 걸쳐지는 총 거리)를 갖는다. 도 2에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합 길이는 약 30-100개 뉴클레오티드(예를 들어, 40-80개 또는 50-70개 뉴클레오티드)이다. 이 조합된 길이는 "프라이머 풋프린트"로도 언급된다. 일부 실시양태에서, 프라이머 풋프린트의 길이는 100개 미만의 뉴클레오티드(예를 들어, 90, 80, 70, 60, 50개 또는 그보다 적은 수 미만의 뉴클레오티드)이다. 일부 실시양태에서, 점 돌연변이, indel(삽입/결실) 또는 유전자 융합을 포함하는 원형화된 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 백-투-백 배열을 갖는 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 이러한 프라이머 쌍의 감소된 프라이머 풋 프린트는 표적 서열 주위에서의 보다 다양한 단편화 이벤트의 증폭을 허용하고, 이것은 접합부, 예를 들어 융합 접합부가 B2B 프라이머 사이에서 발생할 가능성이, 전형적인 증폭 반응에서 발견되는 프라이머의 배열(서로 대면하고, 표적 서열에 걸치는)에서보다 더 낮기 때문이다.
하나의 예시적인 실시양태에서, 서열결정 라이브러리는 도 3에 도시된 바와 같이 구축된다. 선형 DNA 분자는 먼저 RCA를 위한 주형을 형성하기 위해 원형화된다. 5' 말단에 공통 서열결정 어댑터를 갖는 백-투-백 프라이머는 표적 분자에 결합하고, 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제가 RCA 동안 표적을 증폭한다. 라이브러리는 서열 변이체, 예를 들어 점 돌연변이, SNP 및 융합 유전자의 검출을 위한 서열결정 전에 PCR 증폭에 의해 서열결정되거나 추가로 증폭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플 중의 다수의 표적 폴리뉴클레오티드로부터 다수의 콘카테머가 생성될 수 있다. 샘플은 하나 이상의 표적 서열을 함유할 수 있다. 각각의 표적 서열은 하나 이상의 대응하는 콘카테머를 가질 수 있다. 독특한 표적 폴리뉴클레오티드에 대응하는 각각의 콘카테머는 가변 카피 수의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 가변 길이의 콘카테머를 생성하도록 최적화될 수 있다. 콘카테머 길이의 가변성은 표적 폴리뉴클레오티드 길이 및/또는 콘카테머당 표적 폴리뉴클레오티드의 카피 수의 변화에 기인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 50%(예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과)의 콘카테머는 길이가 적어도 75개 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 100, 150, 200개 또는 그 초과)인 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 80%의 콘카테머는 길이가 적어도 75개 뉴클레오티드인 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 60%의 콘카테머는 길이가 적어도 100개 뉴클레오티드인 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 50%의 콘카테머는 길이가 적어도 150개 뉴클레오티드인 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 단계 (c)에서 생성된 다수의 앰플리콘을 서열결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열결정은 표적 폴리뉴클레오티드의 단 하나의 카피만을 포함하는 앰플리콘으로부터 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘을 선택적으로 정제하지 않으면서 수행된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 포함하는 단계 (c)에서 생산된 다수의 앰플리콘에서 앰플리콘을 정제하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법의 정제된 앰플리콘은 서열결정된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 동일한 반응 혼합물에서 다수의 상이한 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 것을 포함한다. 다수의 표적 폴리뉴클레오티드의 성분은 가변 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 길이는 30개 뉴클레오티드 내지 1000개 뉴클레오티드(예를 들어, 50-600, 75-500, 100-400 또는 200-300개 뉴클레오티드)이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 반응 혼합물 내에서 라이게이션에 의해 원형화된다.
예시적인 실시양태에서, 무세포 폴리뉴클레오티드의 혼합물을 함유하는 핵산 샘플은 도 4에 도시된 바와 같이 증폭된다. 혼합물 내의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 단일 가닥 DNA, 즉 "ssDNA")는 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드를 형성하기 위해 원형화될 수 있다. 55℃와 같은 비등온 RCA의 제1 온도기에서의 프라이머 결합, 및 70℃와 같은 비등온 RCA의 제2 온도기에서의 하나 이상의 제1 프라이머의 프라이머 연장은 콘카테머의 혼합물을 생성한다. 프라이머 결합을 위해 선택되는 온도보다 더 높은 프라이머 연장을 위해 선택된 온도는 프라이머 연장 동안 추가의 프라이머 결합을 최소화할 수 있다. 각각의 표적 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 대응하는 콘카테머를 가질 수 있다. 독특한 표적 폴리뉴클레오티드에 대응하는 각각의 콘카테머는 가변 카피 수의 표적 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예시에 따르면, 하나 이상의 제1 프라이머는 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함한다. 후속 비등온 증폭 사이클에서, 다수의 제2 연장 산물은 콘카테머의 생성과 동시에 생성되고, 여기서 연장 산물은 제2 온도기에 하나 이상의 제2 프라이머의 프라이머 연장으로부터 생성되고, 하나 이상의 제2 프라이머는 제1 온도기에 제1 프라이머의 연장 산물로서 생성된 선형 콘카테머 주형에 혼성화하고 이전 사이클에서 94℃와 같은 제3 온도기 동안 변성에 의해 원형 주형에 혼성화하지 않는다. 제2 프라이머에 대한 새로운 혼성화 부위는 또한 원형 주형 주위에서 진행하는 폴리머라제에 의한 변위시에 노출된다. 하나 이상의 제2 프라이머는 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함한다. 연장 산물은 다양한 카피 수의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 혼합된 샘플에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 다양한 길이일 수 있고, 생성되는 연장 산물은 또한 다양한 길이일 수 있다. 다양한 크기의 스템 루프 구조는 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열의 상보체의 분자내 혼성화의 결과로서, 또는 제1 공통 서열의 상보체 및 서열 공통 서열의 분자내 혼성화에 의해 형성될 수 있다. 스템 루프 구조는 어닐링, 연장 또는 스템 루프 형성을 위한 제4 온도기(예를 들어, 58℃)와 같은 하나 이상의 증폭기 동안 형성될 수 있다. 스템 루프 구조는 또한 RCA 후의 후속 증폭 반응 동안 형성될 수 있다. 연장 산물은 앰플리콘을 생성하기 위한 증폭 반응을 위한 주형으로서 기능할 수 있고, 스템 루프 구조의 안정성은 프라이머의 결합 및 연장에 영향을 미칠 수 있다. 후속 증폭 반응 동안, 보다 긴 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 보다 많은 카피를 함유하는 연장 산물은 스템 루프 구조가 더 작은 루프를 갖는 연장 산물에 비해 우선적으로 농축될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 카피의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 앰플리콘이 농축된다. 일부 실시예에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 적어도 50%(예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과)이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율은 10% 내지 100%(예를 들어, 20%-90%, 30%-80% 또는 40%-60%)이다. 일부 실시양태에서, 보다 긴 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 앰플리콘이 농축된다. 일부 실시양태에서, 적어도 50%(예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과)의 콘카테머는 길이가 적어도 75개 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 100, 150, 200개 또는 그 초과의 뉴클레오티드)인 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 80%의 콘카테머는 길이가 적어도 75개의 뉴클레오티드인 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 60%의 콘카테머는 길이가 적어도 100개의 뉴클레오티드인 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 50%의 콘카테머는 길이가 적어도 150개의 뉴클레오티드인 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 따라 방법을 수행하기 위한 반응 혼합물을 제공한다. 반응 혼합물은 임의의 다양한 측면 및 방법에 관하여 본원에서 설명되는 하나 이상의 다양한 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머를 포함하는 앰플리콘을 농축하기 위한 반응 혼합물을 제공한다. 한 실시양태에서, 반응 혼합물은 (a) 원형 표적 폴리뉴클레오티드, (b) 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 제1 프라이머, 및 (c) 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하는 제2 프라이머를 포함하고, 여기서 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 반응 혼합물은 용기에 함유된다. 각각의 성분은 상이한 용기에 포장되거나, 교차 반응성 및 유효 기간이 허용되는 경우 성분의 조합물을 용기에 제공할 수 있다. 용기는 웰, 플레이트, 튜브, 챔버, 유동 셀 또는 칩일 수 있다.
일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 서열 상보성을 통해 제1 공통 서열 또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 서열을 갖는 제3 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 프라이머는 다수의 연장 산물을 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 핵산 증폭을 위한 제3 프라이머는 임의의 적합한 길이, 예컨대 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 또는 100개 뉴클레오티드일 수 있고, 그의 임의의 부분 또는 전부는 대응하는 표적 서열(예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 초과의 뉴클레오티드)에 상보성일 수 있다. 제3 프라이머는 하나 이상의 증폭 프라이머 어닐링 서열 또는 이의 상보체; 하나 이상의 서열결정 프라이머 어닐링 서열 또는 그의 상보체; 하나 이상의 바코드 서열; 다수의 상이한 프라이머 사이에서 공유된 하나 이상의 공통 서열; 하나 이상의 제한 효소 인식 부위; 하나 이상의 프로브 결합 부위 또는 서열결정 어댑터(예를 들어, 대규모 병렬 서열결정을 위한 유동 셀과 같은 서열결정 플랫폼에 부착하기 위한); 하나 이상의 무작위 또는 거의 무작위 서열(예를 들어, 하나 이상의 위치에서 2개 이상의 상이한 뉴클레오티드의 세트로부터 무작위로 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드); 및 이들의 조합물을 포함하는 분절을 포함할 수 있다. 증폭 프라이머 어닐링 서열은 또한 서열결정 프라이머 어닐링 서열로 작용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 연장 산물은 스템 루프 생성물을 형성할 수 있고, 제3 프라이머의 프라이머 연장으로부터의 앰플리콘 수율은 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 제3 혼성화 서열의 특성을 최적화, 예를 들어 그들의 용융 온도를 최적화함으로써 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±15℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±10℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±5℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±1℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 반응 혼합물은 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드로서 원형화된 무세포 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 반응 혼합물은 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드로서 게놈 DNA의 원형화된 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 염색체 재배열에 의해 생성된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 염색체 재배열은 결실, 중복, 역위 및 전좌 중 적어도 하나이다. 일부 실시양태에서, 본 방법의 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 본 방법의 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 반응 혼합물에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합된 길이는 75개 이하의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합된 길이는 60개 이하의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합된 길이는 50개 이하의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합된 길이는 40개 이하의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합된 길이는 30개 이하의 뉴클레오티드이다.
본 개시내용의 방법 및 반응 혼합물을 포함하여 본원에서 설명되는 다양한 측면의 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 선형 표적 폴리뉴클레오티드를 라이게이션함으로써 형성된다. 선형 표적 폴리뉴클레오티드로부터 형성된 원형화된 표적 폴리뉴클레오티드는 특성화되는 서열, 예를 들면 희귀한 서열 변이체 또는 융합 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선형 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 다른 실시양태에서, 선형 표적 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥이다. 표적 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예는 DNA, RNA, cDNA, dsDNA, ssDNA, 플라스미드 DNA, 코스미드 DNA, 염색체 DNA, 게놈 DNA, 바이러스 DNA, 박테리아 DNA, mtDNA(미토콘드리아 DNA), mRNA, rRNA, tRNA, nRNA, siRNA, snRNA, snoRNA, scaRNA, 마이크로RNA, dsRNA, 리보자임, 리보스위치(riboswitch) 및 바이러스 RNA(예를 들어, 레트로바이러스 RNA)를 포함한다.
임의의 다양한 측면의 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 무세포 DNA 또는 RNA(cfDNA 또는 cfRNA)를 포함하고 이로 제한되지 않는 무세포 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무세포 폴리뉴클레오티드는 순환 종양 DNA 또는 RNA(ctDNA 또는 ctRNA)이다. 일부 실시양태에서, 무세포 폴리뉴클레오티드는 태아 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무세포 폴리뉴클레오티드는 세포로부터 유래되지만 조직 샘플과 같은 세포 공급원으로부터 직접 수득되지 않은 폴리뉴클레오티드이다. 그로부터 무세포 폴리뉴클레오티드가 유래될 수 있는 공급원의 비제한적인 예는 정상 세포 및 조직, 비정상 세포 및 조직(예를 들어, 암세포 또는 조직), 태아 세포 및 조직, 및 병원체이다. 비세포 공급원에 존재하는 무세포 폴리뉴클레오티드는 세포 사멸(예를 들어, 아폽토시스 또는 괴사) 또는 세포 쉐딩(shedding)으로부터 유래할 수 있다. 무세포 폴리뉴클레오티드의 서열 분석은 종양 세포(예를 들어, 암 검출), 태아 세포(예를 들어, 출생 전 진단), 이식 조직의 세포(예를 들어, 이식 실패의 조기 검출) 또는 병원체(예를 들어, 박테리아 또는 바이러스)와 같은 무세포 DNA가 그로부터 유래되는 세포 또는 세포 집단을 특성화하기 위해 사용될 수 있다.
임의의 무세포 폴리뉴클레오티드는 본 개시내용의 실시양태에 의해 사용될 수 있다. 무세포 폴리뉴클레오티드는 임의의 동물 또는 살아있는 유기체와 같은 대상체로부터 수득될 수 있다. 대상체의 비제한적 예는 포유동물, 예컨대 인간, 비인간 영장류, 설치류, 예컨대 마우스 및 래트, 개, 고양이, 돼지, 양, 토끼 등이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 건강하고, 대상체로부터 수득한 무세포 폴리뉴클레오티드는 질환 또는 장애와 관련된 서열 변이체를 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되며, 대상체로부터 수득된 무세포 폴리뉴클레오티드는 질환 또는 장애와 관련된 서열 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 임신한 상태이고, 대상체로부터 수득된 무세포 폴리뉴클레오티드는 태아 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
무세포 폴리뉴클레오티드는 다양한 비세포 공급원으로부터 수득될 수 있다. 그로부터 무세포 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있는 비세포 공급원의 비제한적 예는 혈청, 혈장, 혈액, 땀, 타액, 소변, 대변, 정액, 점막 분비물, 척수액, 양수 및 림프액이다. 그로부터 무세포 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있는 비세포 공급원의 샘플을 수집하는 다양한 방법이 이용 가능하다. 일부 실시양태에서, 그로부터 무세포 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있는 비세포 공급원의 샘플은 대상체로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 정맥 천자에 의해 수득된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 흡인에 의해 수득된다.
샘플로부터 무세포 DNA와 같은 무세포 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해 다양한 방법 및 상업적 키트가 이용 가능하다. 무세포 DNA를 포함하여 무세포 폴리뉴클레오티드를 추출하고 단리하는 방법 및 키트의 예는 페놀/클로로포름 추출, 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(PCI)-글리코겐 추출, NaI(요오드화나트륨) 추출, 구아니딘-수지 추출, 캐리어 RNA가 포함된 QIAmp DNA 블러드 미디(Blood Midi) 키트, 차지스위치(ChargeSwitch) 혈청 키트, ZR 혈청 DNA 키트, 퀴아겐(Qiagen) 큐비트(Qubit)™ dsDNA HS 검정 키트, 애질런트(Agilent)™ DNA 1000 키트, TruSeq™ 서열결정 라이브러리 제제(Sequencing Library Preparation) 및 퓨어진(Puregene) DNA 정제 시스템 혈액 키트(Blood Kit)이다.
무세포 DNA를 포함하는 무세포 폴리뉴클레오티드는 무세포 폴리뉴클레오티드가 체액의 세포 및 다른 비가용성 성분으로부터 분리되는 분할 단계를 통해 체액으로부터 추출되고 단리될 수 있다. 분할 기술의 예는 원심분리 및 여과이다. 일부 실시양태에서, 세포는 먼저 무세포 폴리뉴클레오티드로부터 분할되지 않고 용해된다. 일부 실시양태에서, 무손상 세포의 게놈 DNA는 선택적 침전을 통해 분할된다. DNA를 비롯한 무세포 폴리뉴클레오티드는 가용성을 유지할 수 있고, 불용성 게놈 DNA로부터 분리되어 추출될 수 있다. 일부 절차에 따르면, 완충제 첨가 및 상이한 키트에 특이적인 다른 세척 단계 후에, 이소프로판올 침전을 사용하여 DNA를 침전시킬 수 있다. 오염물 또는 염을 제거하기 위해 실리카계 컬럼과 같은 추가의 세정 단계가 사용될 수 있다. 전체적인 단계는 특정 용도에 맞게 최적화될 수 있다. 비특이적 벌크 캐리어 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 수율과 같은 절차의 특정 측면을 최적화하기 위해 반응 전체에 걸쳐 첨가될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 다양한 측면의 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA로부터 유래된다. 게놈 DNA는 다양한 방법 및 상업적으로 이용 가능한 키트, 예컨대 퀴아겐 DNeasy 조직 키트를 사용하여 세포 샘플에서 얻을 수 있다. 게놈 DNA는 본원의 다른 곳에서 이전에 설명된 임의의 추출, 단리 및 정제 방법을 사용하여 샘플로부터 수득 및 정제될 수 있다. 추출 기술의 다른 비제한적인 예는 다음을 포함한다: (1) 예를 들어, 자동화된 핵산 추출기, 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)에서 입수할 수 있는 모델 341 DNA 추출기를 사용하거나 사용하지 않으면서 페놀/클로로포름 유기 시약(Ausubel et al., 1993)을 사용한 유기 추출 후 에탄올 침전; (2) 정지상 흡착 방법(미국 특허 제5,234,809호; [Walsh et al., 1991]); (3) 염-유도 핵산 침전 방법(Miller et al., (1988)] - 이러한 침전 방법은 전형적으로 "염석(salting-out)" 방법으로 지칭된다). 핵산 단리 및/또는 정제의 또 다른 예는 핵산이 특이적으로 또는 비특이적으로 자성 비드에 결합된 후, 자석을 사용하여 비드를 단리하고, 비드로부터 핵산을 세정 및 용리시키는 자성 입자의 사용(예를 들어, 미국 특허 제5,705,628호 참조)을 포함한다. 예를 들어, 핵산은 고상 가역적 고정화(SPRI) 비드(Agencourt AMPure XP)를 사용하여 단리 및 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 단리 방법은 샘플로부터 원하지 않는 단백질을 제거하는 것을 돕기 위한 효소 분해 단계, 예를 들어 프로테이나제 K 또는 다른 유사한 프로테아제에 의한 소화가 선행될 수 있다. 원하는 경우, RNase 억제제를 용해 완충제에 첨가할 수 있다. 특정 세포 또는 샘플 유형의 경우, 단백질 변성/소화 단계를 프로토콜에 추가하는 것이 바람직할 수 있다. 정제 방법은 DNA, RNA 또는 둘 모두를 단리하도록 진행될 수 있다. DNA 및 RNA 둘 모두가 추출 절차 동안 또는 추출 절차 후에 함께 단리될 때, 서로로부터 하나 또는 둘 모두를 개별적으로 정제하기 위해 추가의 단계를 이용할 수 있다. 또한, 추출된 핵산의 하위 분획은 예를 들어 크기, 서열, 또는 다른 물리적 또는 화학적 특성에 의한 정제에 의해 생성될 수 있다. 초기 핵산 단리 단계에 추가로, 핵산의 정제는 예컨대 과량의 또는 원하지 않는 시약, 반응물 또는 생성물을 제거하기 위해 개시된 방법의 임의의 단계 후에 수행될 수 있다. 샘플 내의 핵산의 양 및/또는 순도를 결정하기 위한 다양한 방법, 예컨대 흡광도(예를 들어, 260 nm, 280 nm에서의 흡광도 및 이들의 비율) 및 표지(예를 들어, 형광 염료 및 삽입제, 예컨대 SYBR 그린, SYBR 블루, DAPI, 요오드화프로피듐, 획스트(Hoechst) 염색, SYBR 골드, 브롬화에티듐)의 검출이 이용 가능하다.
일부 실시양태에서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 단편화된 무세포 DNA 또는 단편화된 게놈 DNA를 포함한다. 화학적, 효소적 및 기계적 방법, 예컨대 초음파 처리, 전단 및 제한 효소와의 접촉을 비롯한 다양한 방법이 폴리뉴클레오티드를 단편화하기 위해 이용 가능하다. 일부 실시양태에서, 무세포 DNA 단편은 길이가 거의 균일하다. 일부 실시양태에서, 무세포 DNA 단편은 길이가 거의 균일하지 않다. 일부 실시양태에서, 무세포 DNA 단편의 평균 길이는 약 50 내지 약 1000개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 무세포 DNA 단편의 평균 길이는 약 50 내지 약 500개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 무세포 DNA 단편의 평균 길이는 약 50 내지 약 250개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 무세포 DNA 단편의 평균 길이는 약 50 내지 약 200개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 무세포 DNA 단편의 평균 길이는 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 무세포 DNA 단편의 평균 길이는 약 40 내지 약 1000개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 무세포 DNA 단편의 평균 길이는 약 40 내지 약 500개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 무세포 DNA 단편의 평균 길이는 약 40 내지 약 250개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 무세포 DNA 단편의 평균 길이는 약 40 내지 약 200개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 무세포 DNA 단편의 평균 길이는 약 40 내지 약 100개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 게놈 DNA는 보다 짧은 길이의 폴리뉴클레오티드로 단편화된다. 일부 실시양태에서, 게놈 DNA 단편의 길이는 거의 균일하다. 일부 실시양태에서, 게놈 DNA 단편의 길이는 거의 균일하지 않다. 일부 실시양태에서, 게놈 DNA 단편의 평균 길이는 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 게놈 DNA 단편의 평균 길이는 약 50 내지 약 250개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 게놈 DNA 단편의 평균 길이는 약 50 내지 약 500개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 게놈 DNA 단편의 평균 길이는 약 50 내지 약 750개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 게놈 DNA 단편의 평균 길이는 약 100 내지 약 1000개 뉴클레오티드이다.
원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 다양한 방법에 의해 선형 표적 폴리뉴클레오티드로부터 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 선형 표적 폴리뉴클레오티드는 말단 연결에 의해 원형화된다. 일부 실시양태에서, 제1 선형 표적 폴리뉴클레오티드는 제2 선형 표적 폴리뉴클레오티드에 연결되고, 이어서 제1 표적 폴리뉴클레오티드의 연결되지 않은 말단은 제2 선형 표적 폴리뉴클레오티드의 연결되지 않은 말단에 연결되어 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 제1 및 제2 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 원형 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 원형화되는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥 원이 요구되는 경우, 폴리뉴클레오티드는 본래 단리된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드일 수 있거나, 또는 폴리뉴클레오티드가 단일 가닥이 되도록 처리될 수 있다(예를 들어 변성에 의해). 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드를 원형화하는 방법은 효소, 예컨대 리가제(예를 들어, RNA 리가제 또는 DNA 리가제)의 사용을 수반한다. 선형 표적 폴리뉴클레오티드를 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드로 라이게이션하기 위해 사용될 수 있는 효소의 비제한적인 예는 ATP 의존성 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 리가제, NAD+ 의존성 DNA 또는 RNA 리가제, 및 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 리가제이다. 리가제의 비제한적인 예는 CircLigase I 및 CircLigase II(Epicentre, 미국 위스콘신주 매디슨 소재), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) DNA 리가제, 테르무스 필리포르미스(Thermus filiformis) DNA 리가제, Tth DNA 리가제, 테르무스 스코토둑투스(Thermus scotoductus) DNA 리가제 (I 및 II), T3 DNA 리가제, T4 DNA 리가제, T4 RNA 리가제, T7 DNA 리가제, Taq 리가제, 앰플리가제(Ampligase)(Epicentre® Technologies Corp.), VanC-형 리가제, 9°N DNA 리가제, Tsp DNA 리가제, DNA 리가제 I, DNA 리가제 III, DNA 리가제 Ⅳ, Sso7-T3 DNA 리가제, Sso7-T4 DNA 리가제, Sso7-T7 DNA 리가제, Sso7-Taq DNA 리가제, Sso7-이. 콜라이 DNA 리가제, Sso7-앰플리가제 DNA 리가제 및 열안정성 리가제이다. 리가제 효소는 야생형, 돌연변이체 이소형 및 유전적으로 조작된 변이체일 수 있다. 라이게이션 반응에는 완충제 성분, 소분자 라이게이션 인해서 및 다른 반응 성분이 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및 효소의 농도는 분자내 라이게이션보다는 분자간 라이게이션을 촉진하도록 조정된다. 일부 실시양태에서, 반응 온도 및 반응 시간, 또는 반응 길이가 조정된다. 반응 온도 및 시간도 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 60℃는 분자내 원을 촉진하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 반응 시간은 12-16시간이다. 반응 조건은 선택된 효소의 제조자가 지정한 조건일 수 있다. 일부 실시양태에서, 원형 폴리뉴클레오티드를 형성하기 위한 폴리뉴클레오티드의 말단 연결(그 자체에 직접 또는 하나 이상의 다른 폴리뉴클레오티드에 대한(예를 들어 원형 표적 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드는 2개의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함함))은 접합 서열을 갖는 접합부를 생성한다. 일부 실시양태에서, 원형화 반응 후에 임의의 비라이게이션된 핵산을 소화하기 위해 엑소뉴클레아제 단계가 포함될 수 있다. 즉, 닫힌 원에는 자유 5' 또는 3' 말단이 없고, 따라서 5' 또는 3' 엑소뉴클레아제의 도입은 닫힌 원을 소화하지 않고 라이게이션되지 않은 성분을 소화할 것이다. 이것은 다중 시스템에서 특별한 용도로 사용될 수 있다.
원형화 후에, 반응 산물은 후속 단계에 참여하기 위해 이용 가능한 원형화된 폴리뉴클레오티드의 상대적인 농도 또는 순도를 증가시키기 위해 증폭 또는 서열결정 전에 정제될 수 있다(예를 들어, 원형 폴리뉴클레오티드의 단리 또는 반응 중의 하나 이상의 다른 분자의 제거에 의해)). 예를 들어, 원형화 반응 또는 그의 성분은 단일 가닥(비원형화된) 폴리뉴클레오티드를 제거하기 위해, 예컨대 엑소뉴클레아제로 처리함으로써 처리될 수 있다. 또 다른 예로서, 원형화 반응 또는 그의 일부를 크기 배제 크로마토그래피에 적용하여, 작은 시약을 보유 및 폐기하거나, 원형화 생성물을 별개의 부피로 보유 및 방출할 수 있다. 라이게이션 반응을 세정하기 위한 다양한 키트, 예컨대 자이모 리써치(Zymo Research)가 제조한 자이모 올리고 정제 키트에 의해 제공되는 키트가 이용 가능하다. 일부 실시양태에서, 정제는 원형화 반응에 사용된 리가제를 제거 또는 분해하고/하거나 상기 리가제로부터 원형화된 폴리뉴클레오티드를 정제하기 위한 처리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리가제를 분해시키는 처리는 프로테아제, 예컨대 프로테이나제 K로 처리하는 것을 포함할 수 있다. 프로테이나제 K 처리는 제조자 프로토콜 또는 표준 프로토콜(예를 들어, 문헌 [Sambrook and Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (2012)]에 제공된 바와 같은)을 따를 수 있다. 또한, 프로테아제 처리 후에, 추출 및 침전을 수행할 수 있다. 한 예에서, 원형화된 폴리뉴클레오티드는 0.1% SDS 및 20 mM EDTA의 존재 하에 프로테이나제 K(퀴아겐) 처리에 의해 정제되고, 1:1 페놀/클로로포름 및 클로로포름으로 추출되고, 에탄올 또는 이소프로판올로 침전된다. 일부 실시양태에서, 침전은 에탄올 내에서 이루어진다.
본 개시내용의 일부 실시양태는 콘카테머를 생성하고, 다수의 연장 산물을 생성하고, 다수의 연장 산물을 증폭하는 단계 중 하나 이상과 같은 프라이머 연장 및 증폭 반응을 포함한다. 프라이머 연장 반응은 온도 변화(열순환) 또는 일정한 온도(등온)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머 신장 반응은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 포함한다. PCR은 표적 서열의 카피 수를 지수적으로 증가시키기 위해 변성, 반대 가닥에 대한 프라이머 쌍의 어닐링, 및 프라이머 연장의 다수의 단계를 통한 사이클을 수반하고, 이들 단계 중 적어도 일부는 일반적으로 상이한 반응 온도에서 발생한다. PCR 증폭 기술의 비제한적인 예는 정량적 PCR(qPCR 또는 실시간 PCR), 역전사 PCR(RT-PCR), 디지털 PCR(dPCR 또는 dePCR), 표적 특이적 PCR 및 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)이다. PCR에 사용될 수 있는 폴리머라제 효소의 예는 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus) HB8; 돌연변이체 테르무스 오시마이(Thermus oshimai); 테르무스 스코토둑투스; 테르무스 테르모필루스 1B21; 테르수스 테르모필 루스 GK24; 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 폴리머라제(AmpliTaq® FS 또는 Taq(G46D; F667Y), Taq(G46D; F667Y; E6811) 및 Taq(G46D; F667Y; T664N; R660G); 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 폴리머라제; 테르모코쿠스 고르고나리우스(Thermococcus gorgonarius) 폴리머라제; 피로코쿠스 종 GB-D 폴리머라제; 테르모코쿠스 종(균주 9°N-7) 폴리머라제; 바실루스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus) 폴리머라제; Tsp 폴리머라제; ThermalAce™ 폴리머라제(Invitrogen), 테르무스 플라부스(Thermus flavus) 폴리머라제; 테르무스 리토랄리스(Thermus litoralis) 폴리머라제, 테르무스 Z05 폴리머라제; 델타 Z05 폴리머라제(예를 들어, 델타 Z05 골드 DNA 폴리머라제); 및 이들의 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 포함하고 이로 제한되지 않는 열안정성 폴리머라제이다. PCR을 위해 사용될 수 있는 폴리머라제 효소의 추가적인 예는 DNA 폴리머라제 I; 클레노우 단편 및 클레노우 단편(3'에서 5' 엑소뉴클레아제 미함유)를 포함하고 이로 제한되지 않는 돌연변이체 DNA 폴리머라제 I; T4 DNA 폴리머라제; 돌연변이체 T4 DNA 폴리머라제; T7 DNA 폴리머라제; 돌연변이체 T7 DNA 폴리머라제; phi29 DNA 폴리머라제; 및 돌연변이체 phi29 DNA 폴리머라제를 포함하고 이로 제한되지 않는 비열안정성 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 핫 스타트(hot start) 폴리머라제가 사용된다. 핫 스타트 폴리머라제는 열 활성화를 필요로 하는 DNA 폴리머라제의 변형된 형태이다. 이러한 폴리머라제는 예를 들어 감수성, 특이성 및 수율을 추가로 증가시키기 위해; 및/또는 저 카피 표적 증폭을 추가로 개선하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 핫 스타트 효소는 불활성 상태로 제공된다. 열 활성화시에, 변형 또는 변형제가 방출되어 활성 효소를 생성한다. 많은 핫 스타트 폴리머라제는 다양한 상업적 공급원, 예컨대 어플라이드 바이오시스템즈; 바이오-라드(Bio-Rad); 이엔자임 엘엘씨(eEnzyme LLC); 에펜도르프 노쓰 아메리카(Eppendorf North America); 핀자임스 오이(Finnzymes Oy); 진초이스, 인크.(GeneChoice, Inc.); 인비트로겐(Invitrogen); 제나 바이오사이언스 게엠베하(Jena Bioscience GmbH); MTDSCI; 메네르바 바이오랩스 게엠베하(Minerva Biolabs GmbH); 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs); 노바겐(Novagen); 프로메가(Promega); 퀴아겐; 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science); 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich); 스트라타젠(Stratagene); 타카라 미루스 바이오(Takara Minis Bio); 유에스비 코프.(USB Corp.); 요크셔 바이오사이언스 엘티디(Yorkshire Bioscience Ltd) 등으로부터 이용 가능하다.
일부 실시양태에서, 프라이머 연장 및 증폭 반응은 등온 반응을 포함한다. 등온 증폭 기술의 비제한적인 예는 리가제 연쇄 반응(LCR)(예를 들어, 미국 특허 제5,494,810호 및 제5,830,711호); 전사 매개 증폭(TMA)(예를 들어, 미국 특허 제5,399,491호, 제5,888,779호, 제5,705,365호, 제5,710,029호); 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)(예를 들어, Malek et al., 미국 특허 제5,130,238호); RNA의 신호 매개 증폭 기술(SMART)(예를 들어, [Wharam et al., Nucleic Acids Res. 2001, 29, e54]); 가닥 변위 증폭(SDA) (예를 들어, 미국 특허 제5,455,166호); 고온성 SDA([Spargo et al., Mol Cell Probes 1996, 10:247-256]; 유럽 특허 제0684315호); 롤링 써클 증폭(RCA)(예를 들어, Lizardi, "Rolling Circle Replication Reporter Systems", 미국 특허 제5,854,033호); DNA의 루프 매개 등온 증폭 (LAMP)(예를 들어, Notomi et al., "Process for Synthesizing Nucleic Acid", 미국 특허 제6,410,278호); 헬리카제 의존성 증폭(HDA)(예를 들어, 미국 특허 출원 US 20040058378); 단일 프라이머 등온 증폭(SPIA)(예를 들어, WO2001020035 및 미국 특허 제6,251,639호); 및 원형 헬리카제 의존성 증폭(cHDA)(예를 들어, 미국 특허 출원 제10/594,095호)이다.
일부 실시양태에서, 프라이머 연장 반응은 RCA와 같은 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 등온 증폭은 롤링 써클 증폭(RCA)을 포함한다. RCA 반응 혼합물은 하나 이상의 프라이머, 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제, 및 dNTP를 포함할 수 있다. 가닥 변위는 합성 동안 하류 DNA를 변위시키는 능력을 지칭한다. 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제는 다양한 정도의 가닥 변위 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 약한 가닥 변위 활성을 갖거나, 또는 전혀 갖지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 강한 가닥 변위 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제는 상이한 반응 온도에서 상이한 수준의 가닥 변위 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 중간 정도의 온도, 예를 들어, 20℃ 내지 37℃에서 가닥 변위 활성을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 승온, 예를 들어 65℃에서 가닥 변위 활성을 나타낼 수 있다. 반응 온도는 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제의 활성 수준에 유리하게 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응 온도는 적어도 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃ 또는 90℃이다. 일부 실시양태에서, 반응 온도는 20℃ 내지 80℃이다. 일부 실시양태에서, 반응 온도는 20℃ 내지 70℃이다. 일부 실시양태에서, 반응 온도는 20℃ 내지 60℃이다. 일부 실시양태에서, 반응 온도는 20℃ 내지 50℃이다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제의 가닥 변위 활성을 증가 또는 감소시키기 위해 다양한 반응 온도가 상이한 단계를 통해 순환될 수 있다. 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제의 비제한적인 예는 Bst DNA 폴리머라제, 큰 단편; Bsu DNA 폴리머라제, 큰 단편; Deep VentR™ DNA 폴리머라제; Deep VentR™(엑소-) DNA 폴리머라제; 클레노우 단편(3'-5' 엑소-); DNA 폴리머라제 I, 큰 단편; M-MuLV 역전사효소; phi29 DNA 폴리머라제; PyroPhage 3173 폴리머라제; VentR ® DNA 폴리머라제; 및 VentR ®(엑소-) DNA 폴리머라제를 포함한다.
열순환 방법, 등온 방법 및 이들의 조합을 포함하는 증폭 반응의 생성물로서 생성된 콘카테머는 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 포함할 수 있다. 콘카테머는 표적 폴리뉴클레오티드의 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 카피를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 표적 폴리뉴클레오티드로부터 프라이머 연장 반응의 생성물로서 콘카테머가 생성되고, 이 다수의 구성성분은 길이가 불균일하고, 다수의 서열을 포함한다.
본 개시내용의 임의의 다양한 측면의 일부 실시양태에서, 프라이머는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 하나 이상의 증폭 프라이머 어닐링 서열 또는 그의 상보체; 하나 이상의 서열결정 프라이머 어닐링 서열 또는 그의 상보체; 하나 이상의 바코드 서열; 다수의 상이한 프라이머 사이에서 공유되는 하나 이상의 공통 서열; 하나 이상의 제한 효소 인식 부위; 하나 이상의 프로브 결합 부위 또는 서열결정 어댑터(예를 들어, 대규모 병렬 서열결정을 위한 유동 셀과 같은 서열결정 플랫폼에 부착하기 위한); 하나 이상의 무작위 또는 거의 무작위 서열(예를 들어, 하나 이상의 위치에서 2개 이상의 상이한 뉴클레오티드의 세트로부터 무작위로 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드, 여기서 각각의 상이한 뉴클레오티드는 무작위 서열을 포함하는 프라이머의 풀(pool)에서 나타나는 하나 이상의 위치에서 선택됨); 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제3 프라이머와 같은 프라이머는 서열결정 어댑터 요소(본원에서 어댑터로도 언급됨)를 포함하고, 이는 일반적으로 폴리뉴클레오티드 서열결정 반응의 하나 이상의 단계를 촉진하기 위해 폴리뉴클레오티드의 5' 및/또는 3' 말단에 도입된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 일부 실시양태에서, 서열결정 어댑터는 서열결정 어댑터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 차세대 서열결정을 위한 유동 셀에 결합시키기 위해 사용된다. 차세대 서열결정 방법의 비제한적인 예는 단일 분자 실시간 서열결정, 이온 반도체 서열결정, 파이로 서열결정(pyrosequencing), 합성에 의한 서열결정, 라이게이션에 의한 서열결정 및 사슬 종료법(chain termination)이다. 유동 셀 부착을 위한 서열결정 어댑터는 차세대 서열결정 시스템, 예를 들어, 454 서열결정, 이온 토렌트 프로톤(Ion Torrent Proton) 또는 PGM, 및 일루미나(Illumina) X10에 상용성인 임의의 적합한 서열을 포함할 수 있다. 차세대 서열결정 방법을 위한 서열결정 어댑터의 비제한적인 예는 일루미나 서열결정 시스템에 사용하기에 적합한 P5 및 P7 어댑터; TruSeq 유니버셜(Universal) 어댑터; 및 TruSeq 인덱스드(Indexed) 어댑터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열결정 어댑터를 사용하여, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 증폭을 통해, 어댑터 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 농축할 수 있다. 서열결정 어댑터는 바코드 서열 및/또는 샘플 인덱스 서열을 추가로 포함할 수 있다.
다른 특정 실시양태에서, 제3 프라이머와 같은 프라이머는 바코드 서열을 포함한다. 바코드 서열은 바코드가 연관되는 폴리뉴클레오티드의 일부 특징을 확인할 수 있게 하는 알려진 핵산 서열을 말한다. 바코드는 5 내지 35개 뉴클레오티드, 6 내지 30개 뉴클레오티드 또는 8 내지 20개 뉴클레오티드의 범위 내의 길이를 각각 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 바코드의 길이는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 바코드의 길이는 6 뉴클레오티드 미만이다. 일부 실시양태에서, 일부 표적 폴리뉴클레오티드와 연관된 바코드는 다른 표적 폴리뉴클레오티드와 연관된 바코드와 길이가 상이할 수 있다. 세트 내의 바코드의 용융 온도는 서로 ±10℃ 이내, 서로 ±5℃ 이내, 또는 서로 ±2℃ 이내일 수 있다. 바코드는 최소 교차 혼성화 세트의 구성원이 될 수 있다. 예를 들어, 상기 세트의 각각의 구성원의 뉴클레오티드 서열은 중등도 또는 엄격한 혼성화 조건 하에 임의의 다른 구성원의 상보체와 함께 안정한 이중체를 형성할 수 없도록 상기 세트의 모든 다른 구성원의 뉴클레오티드 서열과 충분히 상이할 수 있다. 최소 교차 혼성화 세트의 각각의 구성원의 뉴클레오티드 서열은 적어도 2개의 뉴클레오티드가 다른 모든 구성원의 뉴클레오티드 서열과 상이할 수 있다. 일부 바코드 기술은 문헌 [Winzeler et al. (1999) Science 285:901]; [Brenner (2000) Genome Biol. 1 :1]; [Kumar et al. (2001) Nature Rev. 2:302]; [Giaever et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 :793]; [Eason et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 :11046]; 및 [Brenner (2004) Genome Biol. 5:240]에 기재되어 있고, 이들 각각의 문헌은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 다수의 앰플리콘을 서열결정하는 것을 포함한다. 다양한 서열결정 방법이 다수의 앰플리콘을 서열결정하기 위해 이용 가능하다. 일부 실시양태에서, 고속 서열결정 방법이 사용된다. 사용될 수 있는 서열결정 방법의 비제한적인 예는 일루미나(HiSeq® 및 MiSeq®과 같은 서열결정 시스템), 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)(이온 토렌트®, SOLiD® 등), 로슈의 454 라이프 사이언시스(Life Sciences) 시스템 등에 의해 제조될 서열결정 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열결정은 길이가 약 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300개 뉴클레오티드 또는 그 초과인 판독치(read)를 생산하는 HiSeq® 및 MiSeq® 시스템의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열결정은 개별 뉴클레오티드가 성장하는 프라이머 연장 산물에 부가됨에 따라 반복적으로 확인되는 합성에 의한 서열결정(sequencing-by-synthesis) 과정을 포함한다. 파이로 서열결정은 서열결정 반응의 부산물, 즉 파이로포스페이트의 존재에 대해 생성되는 합성 혼합물을 검정함으로써 뉴클레오티드의 도입을 확인하는, 합성에 의한 서열결정의 예이다. 특히, 프라이머/주형/폴리머라제 복합체는 단일 유형의 뉴클레오티드와 접촉한다. 이 뉴클레오티드가 도입되면, 중합 반응은 트리포스페이트 사슬의 α와 β 포스페이트 사이의 뉴클레오시드 트리포스페이트를 절단하고, 파이로포스페이트를 방출한다. 이어서, 방출된 파이로포스페이트의 존재는 파이로포스페이트를 AMP와 함께 ATP로 전환한 후, 측정 가능한 광 신호를 생산하는 루시퍼라제 효소를 사용하여 ATP를 측정하는 화학발광 효소 리포터 시스템을 사용하여 확인된다. 광이 검출되면 염기가 도입된 것이고, 광이 검출되지 않으면 염기는 도입되지 않은 것이다. 적절한 세척 단계 후에, 다양한 염기를 주기적으로 복합체와 접촉시켜 주형 서열 내의 후속 염기를 순차적으로 확인한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,210,891호를 참고한다.
일부 실시양태에서, 앰플리콘은 참조 서열에 대해 또는 돌연변이가 없는 배경에서 서열 변이체, 예를 들어 역위, 결실, 중복, 전좌 및 희귀한 체세포 돌연변이를 검출하기 위해 서열결정된다. 일부 실시양태에서, 서열 변이체는 질환과 상호 관련된다. 일부 실시양태에서, 서열 변이체는 질환과 상호 관련되지 않는다. 일반적으로, 질병 또는 형질과의 연관성에 대한 통계적, 생물학적 및/또는 기능적 증거가 있는 서열 변이체를 "원인 유전자 변이체"라고 언급한다. 단일 원인 유전자 변이체는 하나 초과의 질환 또는 형질과 관련될 수 있다. 일부 경우에, 원인 유전자 변이체는 멘델 형질, 비멘델 형질 또는 둘 모두와 관련될 수 있다. 원인 유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 변이, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 또는 그 초과의 서열 차이(예컨대, 원인 유전자 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 동일한 상대적 게놈 위치에 원인 유전자 변이체가 결여된 폴리뉴클레오티드 사이의)로서 나타날 수 있다. 원인 유전자 변이체의 유형의 비제한적인 예는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 결실/삽입 다형성(DIP), 카피 수 변이체(CNV), 짧은 직렬 반복체(STR), 제한 단편 길이 다형성(RFLP), 간단한 서열 반복체(SSR), 상이한 수의 직렬 반복체(VNTR), 무작위로 증폭된 다형성 DNA(RAPD), 증폭된 단편 길이 다형성(AFLP), 레트로트랜스포존간 증폭된 다형성(IRAP), 길고 짧은 산재된 요소(LINE/SINE), 긴 직렬 반복체(LTR), 이동성 요소(mobile element), 레트로트랜스포존 미소부수체(microsatellite) 증폭 다형성, 레트로트랜스포존 기반 삽입 다형성, 서열 특이적 증폭 다형성, 및 유전성 후성유전학적 변형(예를 들어, DNA 메틸화)을 포함한다. 원인 유전자 변이체는 또한 밀접하게 관련된 원인 유전자 변이체의 세트일 수 있다. 일부 원인 유전자 변이체는 RNA 폴리뉴클레오티드에서 서열 변이로서 영향을 미칠 수 있다. 이 수준에서, 일부 원인 유전자 변이체는 또한 RNA 폴리뉴클레오티드 종의 존재 또는 부재로 표시된다. 또한, 일부 원인 유전자 변이체는 단백질 폴리펩티드의 서열 변이를 초래한다. 많은 원인 유전자 변이체가 보고되었다. SNP인 원인 유전자 변이체의 예는 겸상 적혈구성 빈혈을 유발하는 헤모글로빈의 Hb S 변이체이다. DIP인 원인 유전자 변이체의 예는 낭포성 섬유증을 유발하는 CFTR 유전자의 델타508 돌연변이이다. CNV인 원인 유전자 변이체의 예는 다운(Down) 증후군을 유발하는 21번 삼염색체(trisomy 21)이다. STR인 원인 유전자 변이체의 예는 헌팅톤(Huntington) 병을 유발하는 직렬 반복체이다. 원인 유전자 변이체의 추가의 비제한적 예는 WO2014015084에 기재되어 있다. 희귀한 서열 변이체를 확인하기 위한 방법의 추가의 비제한적인 예가 WO2015089333에 기재되어 있다.
본 개시내용의 임의의 다양한 측면의 특정 실시양태에서, 앰플리콘은 서열결정 전에 정제된다. 앰플리콘은 다양한 방법으로 정제할 수 있다. 앰플리콘은 과량의 또는 원하지 않는 시약, 반응물 또는 생성물을 제거하기 위해 정제될 수 있다. 앰플리콘은 크기, 서열 또는 다른 물리적 또는 화학적 특성에 의해 추가로 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 앰플리콘은 크기 배제 크로마토그래피를 거칠 수 있고, 이에 의해 단지 하나의 카피의 표적 폴리뉴클레오티드 및/또는 작은 시약(예를 들어, 프라이머)을 포함하는 앰플리콘이 보유되고 폐기되거나, 또는 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘이 보유되고 별개의 부피로 방출된다. 일부 실시양태에서, 앰플리콘은 겔로부터의 단편 절제 및 겔 여과(예를 들어, 길이가 약 300, 400, 500개 또는 그 초과의 뉴클레오티드보다 큰 단편을 농축하기 위해); 및 결합 완충제 농도를 미세 조정하여 크기 선택을 위한 SPRI 비드(Agencourt AMPure XP)에 적용될 수 있다. 예를 들어, DNA 단편과 혼합하는 동안 0.6x 결합 완충제의 사용은 약 500개 염기쌍(bp)보다 큰 DNA 단편에 우선적으로 결합하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특히 B2B 프라이머를 사용한 증폭이 수행된 경우, 콘카테머를 포함하는 혼합물에서 단량체의 수를 감소시키고/시키거나 제거하기 위해 증폭 산물은 크기에 기초하여 생성되는 앰플리콘을 여과하기 위해 처리된다. 이것은 본원의 다른 곳에서 설명된 임의의 정제 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
본원에서 제공된 개시내용의 실시양태는 하나 이상의 종류의 암과 관련된 다양한 서열 변이체를 포함하는 앰플리콘을 농축하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시내용의 방법에 사용되는 종양학적 의미가 있는 적합한 표적 서열은 TP53 유전자, ALK 유전자, KRAS 유전자, PIK3CA 유전자, BRAF 유전자, EGFR 유전자 및 KIT 유전자 내의 변경을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특이적으로 증폭될 수 있고/있거나 서열 변이체에 대해 특이적으로 분석될 수 있는 표적 서열은 암 연관 유전자의 전부 또는 일부일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이체가 TP53 유전자에서 확인된다. TP53은 인간 암에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 유전자 중 하나이고, 예를 들어 TP53 돌연변이는 난소암의 45%, 대장암의 43%, 및 상부 호흡 소화기계 암의 42%에서 발견된다(예를 들어, 문헌 [M. Olivier, et, al. TP53Mutations in Human Cancers: Origins, Consequences, and Clinical Use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010 January; 2(1)] 참조). TP53의 돌연변이 상태를 특성화하면, 임상 진단을 돕고, 예후 값을 제공하며, 암 환자 치료에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, TP53 돌연변이는 아교 세포로부터 유래된 CNS 종양 환자에 대한 불량한 예후의 예측 인자 및 만성 림프구성 백혈병 환자의 급속한 질환 진행의 예측 인자로서 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌 [McLendon RE, et al. Cancer. 2005 Oct 15; 1 04(8): 1693-9]; [Dicker F, et al., Leukemia, 2009 Jan; 23(1): 117-24] 참조). 서열 변이는 유전자 내 어디에서나 발생할 수 있다. 따라서, TP53 유전자의 전부 또는 일부가 본원에서 평가될 수 있다. 즉, 본원의 다른 곳에서 설명되는 바와 같이, 표적 특이적 성분(예를 들어, 표적 특이적 프라이머)이 사용될 때, 유전자에 걸친 단편을 증폭 및 검출하기 위해, 예를 들어 선택된 표적에 대해 사용될 수 있는 단지 하나 이상의 선택된 하위 서열(예컨대, 돌연변이 "핫 스팟(hot spot)")보다는 다수의 TP53 특이적 서열이 사용될 수 있다. 별법으로, 표적 특이적 프라이머는 하나 이상의 선택된 하위 서열(예를 들어, 용어 "핫 스팟"에 또한 포함되는, 대상 클래스 중에서 돌연변이 비율 증가와 연관된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 영역)의 상류 또는 하류에서 혼성화하도록 설계될 수 있다. 그러한 하위 서열에 걸친 표준 프라이머가 설계될 수 있고/있거나, 그러한 하위 서열의 상류 또는 하류에서 혼성화하는 B2B 프라이머가 설계될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이체가 ALK 유전자의 전부 또는 일부에서 확인된다. ALK 융합체는 폐 종양의 7%에서 보고되었으며, 그 중 일부는 EGFR 티로신 키나제 억제제(TKI) 내성과 연관된다(문헌 [Shaw et al., J Clin Oncol. Sep 10, 2009; 27(26): 4247-4253] 참조). 2013년까지, 전체 ALK 티로신 키나제 도메인에 걸쳐 존재하는 몇 가지의 상이한 점 돌연변이가 ALK 티로신 키나제 억제제(TKI)에 대한 2차 내성이 있는 환자에서 발견되었다(Katayama R 2012 Sci Transl Med. 2012 Feb 8; 4(120)). 따라서, ALK 유전자에서 돌연변이 검출은 암 요법 결정을 돕기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이체가 KRAS 유전자의 전부 또는 일부에서 확인된다. 폐 선암종 환자의 약 15-25% 및 결직장암 환자의 40%가 종양 연관 KRAS 돌연변이를 가지고 있는 것으로 보고되었다(예를 들어, 문헌 [Neuman 2009, Pathol Res Pract. 2009; 205(12):858-62] 참조). 대부분의 돌연변이는 KRAS 유전자의 코돈 12, 13 및 61에 위치한다. 이들 돌연변이는 KRAS 신호전달 경로를 활성화하여, 종양 세포의 성장 및 증식을 촉발한다. 일부 연구에 따르면, KRAS에 돌연변이가 있는 종양 환자는 항-EGFR 항체 요법 단독으로부터 또는 화학 요법과 조합할 때 효과를 보지 못할 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌 [Amado et al. 2008 J Clin Oncol. 2008 Apr 1; 26(10): 1626-34], [Bokemeyer et al. 2009 J Clin Oncol. 2009 Feb 10;27(5):663-71] 참조). 서열 변이를 확인하기 위해 표적화될 수 있는 서열 변이에 대한 하나의 특정 "핫 스팟"은 유전자의 35번 위치에 있다. KRAS 서열 변이체의 확인은 결직장암이 있는 대상체의 치료 선택과 같은 치료 선택에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이체가 PIK3CA 유전자의 전부 또는 일부에서 확인된다. PIK3CA의 체세포 돌연변이는 다양한 유형의 암에서, 예를 들어 결직장암의 10-30%에서 빈번하게 발견된다(예를 들어, 문헌 [Samuels et al. 2004 Science. 2004 Apr 23;304 (5670):554] 참조). 이러한 돌연변이는 가장 일반적으로 엑손 9(나선 도메인) 및 엑손 20(키나제 도메인) 내의 2개의 "핫 스팟" 영역 내에 위치하며, 이들 엑손은 검출 서열 변이체에 대한 증폭 및/또는 분석을 위해 특이적으로 표적화될 수 있다. 위치 3140이 또한 특이적으로 표적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이체가 BRAF 유전자의 전부 또는 일부에서 확인된다. 모든 악성 흑색종의 거의 50%가 BRAF에서 체세포 돌연변이를 가지고 있는 것으로 보고되었다(예를 들어, 문헌 [Maldonado et al., J Natl Cancer Inst. 2003 Dec 17;95(24): 1878-90] 참조). BRAF 돌연변이는 모든 흑색종 하위 유형에서 발견되지만, 만성적인 일광 유발 손상이 없는 피부로부터 유래된 흑색종에서 가장 빈번하게 발생한다. 흑색종에서 가장 흔한 BRAF 돌연변이는 600번 위치의 발린을 글루타민으로 대체하는 미스센스 돌연변이 V600E이다. BRAF V600E 돌연변이는 BRAF 억제제 요법의 임상적 이점과 관련된다. BRAF 돌연변이의 검출은 흑색종 치료 선택 및 표적 요법에 대한 저항성 연구에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이체가 EGFR 유전자의 전부 또는 일부에서 확인된다. EGFR 돌연변이는 종종 비소세포 폐암과 관련된다(미국에서 약 10%, 동아시아에서는 35%; 예를 들어 문헌 [Pao et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Sep 7;101(36): 13306-11] 참조). 이러한 돌연변이는 일반적으로 EGFR 엑손 18-21 내에서 발생하고, 대체로 이종접합성이다. 이러한 돌연변이의 약 90%는 엑손 19 결실 또는 엑손 21 L858R 점 돌연변이이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이체가 KIT 유전자의 전부 또는 일부에서 확인된다. 위장관 기질 종양(GIST: Gastrointestinal Stromal Tumor)의 거의 85%가 KIT 돌연변이를 가지고 있는 것으로 보고되었다(예를 들어, 문헌 [Heinrich et al., 2003 J Clin Oncol. 2003 Dec I; 21 (23):4342-9] 참조). 대부분의 KIT 돌연변이는 막 근접(juxtamembrane) 도메인(엑손 11, 70%), 세포외 이량체화 모티브(엑손 9, 10-15%), 티로신 키나제 I(TKI) 도메인(엑손 13, 1-3%) 및 티로신 키나제 2(TK2) 도메인 및 활성화 루프(엑손 17, 1-3%)에서 발견된다. 2차 KIT 돌연변이는 표적 요법 이마티닙 치료 후에 및 환자가 요법에 저항을 보인 후에 통상적으로 확인된다.
암과 연관된 유전자로서, 그의 전부 또는 일부가 본원에서 설명되는 방법에 따라 서열 변이체에 대해 분석될 수 있는 암과 연관된 유전자의 추가의 비제한적인 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: PTEN; ATM; ATR; EGFR; ERBB2; ERBB3; ERBB4; Notch1; Notch2; Notch3; Notch4; AKT; AKT2; AKT3; HIF; HIF1a; HIF3a; Met; HRG; Bcl2; PPAR 알파; PPAR 감마; WT1(윌름즈(Wilms) 종양); FGF 수용체 패밀리 구성원(5개의 구성원: 1, 2, 3, 4, 5); CDKN2a; APC; RB(망막모세포종); MEN1; VHL; BRCA1; BRCA2; AR; (안드로겐 수용체); TSG101; IGF; IGF 수용체; Igf1(4개의 변이체); Igf2(3개의 변이체); Igf 1 수용체; Igf 2 수용체; Bax; Bcl2; 카스파제 패밀리(9개의 구성원: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12); Kras; 및 Apc. 추가의 예가 본원의 다른 곳에서 제공된다. 본원에서 개시되는 방법에 따라 하나 이상의 서열 변이체를 판정하는 것에 기초하여 진단될 수 있는 암의 예는 비제한적으로 다음을 포함한다: 극세포종, 선방세포 암종, 청신경종, 선단 흑자성 흑색종, 선단한선종, 급성 호산구 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 거핵모구성 백혈병, 급성 단구성 백혈병, 성숙을 수반한 급성 골수모세포성 백혈병, 급성 골수 수지상 세포 백혈병, 급성 골수 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 법랑질종, 선암종, 선양 낭성 암종, 선종, 선모양 치원성 종양, 부신피질 암종, 성인 T-세포 백혈병, 침습성 NK-세포 백혈병, AIDS 관련 암, AIDS 관련 림프종, 폐포 연질부 육종, 법랑모세포성 섬유종, 항문암, 역형성 대세포 림프종, 역형성 갑상선 암, 혈관면역모세포성 T-세포 림프종, 혈관근육지방종, 맥관육종, 맹장암, 별아교세포종, 비정형 기형 횡문근양 종양, 기저세포 암종, 기저 유사 암종, B-세포 백혈병, B-세포 림프종, 벨리니(Bellini) 관상 암종, 담관암, 방광암, 모세포종, 골암, 골 종양, 뇌간 신경아교종, 뇌 종양, 유방암, 브레너(Brenner) 종양, 기관지 종양, 세기관지폐포 암종, 브라운(Brown) 종양, 버킷(Burkitt) 림프종, 미지의 원발 부위의 암, 유암 종양, 암종, 상피내암종, 음경의 암종, 미지의 원발 부위의 암종, 암육종, 캐슬만(Castleman) 병, 중추신경계 배아 종양, 소뇌 별아교세포종, 뇌 별아교세포종, 자궁경부암, 담관암종, 척삭종, 연골육종, 척색종, 융모막암종, 맥락막총 유두종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 단구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 만성 호중구성 백혈병, 투명세포 종양, 결장암, 결직장암, 두개인두종, 피부 T-세포 림프종, 데고스(Degos) 질환, 돌출성 피부섬유육종, 유피낭종, 결합조직형성 소원형 세포 종양, 미만성 큰 B 세포 림프종, 배엽부전성 신경상피 종양, 배아 암종, 내배엽동 종양, 자궁내막암, 자궁내막 자궁암, 자궁내막모양 종양, 장 병증 관련 T-세포 림프종, 상의모세포종, 뇌실막세포종, 상피모양 육종, 적백혈병, 식도암, 비강신경교세포종, 유잉(Ewing) 종양 패밀리, 유잉 패밀리 육종, 유잉 육종, 두개외 생식세포 종양, 고환외 생식세포 종양, 간외 담도암, 유선외 파제트(Paget) 병, 나팔관암, 태아내 태아, 섬유종, 섬유육종, 여포성 림프종, 여포성 갑상선암, 담낭암, 담낭암, 신경절교종, 신경절신경종, 위암, 위 림프종, 위장암, 위장 유암 종양, 위장 기질 종양, 위장 기질 종양, 생식세포 종양, 종자세포종, 임신성 융모막암종, 임신성 융모성 종양, 골의 거대세포 종양, 다형성 교모세포종, 신경아교종, 대뇌 교종증, 사구 종양, 글루카곤종, 생식선모세포종, 과립막 세포 종양, 모발세포 백혈병, 모발세포 백혈병, 두경부암, 두경부 암, 심장 암, 혈관모세포종, 혈관주위세포종, 혈관육종, 혈액 악성종양, 간세포 암종, 간비장 T-세포 림프종, 유전성 유방-난소암 증후군, 호지킨(Hodgkin) 림프종, 호지킨의 림프종, 하인두암, 시상하부 신경아교종, 염증성 유방암, 안구내 흑색종, 소도세포 암종, 소도세포 종양, 유년성 골수단구성 백혈병, 카포시(Kaposi) 육종, 카포시의 육종, 신장암, 클라스킨(Klatskin) 종양, 크루켄베르크(Krukenberg) 종양, 후두암, 후두 암, 악성 흑자 흑색종, 백혈병, 백혈병, 입술 및 구강암, 지방육종, 폐암, 황체종, 림프관종, 림프관육종, 림프상피종, 림프성 백혈병, 림프종, 거대글로불린혈증, 악성 섬유성 조직구종, 악성 섬유성 조직구종, 골의 악성 섬유질 조직구종, 악성 신경아교종, 악성 중피종, 악성 말초 신경초 종양, 악성 횡문근양 종양, 악성 트리톤 종양, MALT 림프종, 외투세포 림프종, 비만세포 백혈병, 종격 생식세포 종양, 종격 종양, 수질 갑상선암, 수모세포종, 수모세포종, 수질상피종, 흑색종, 흑색종, 수막종, 머켈(Merkel) 세포 암종, 중피종, 중피종, 잠복 원발 전이성 편평상피 목암, 전이성 요상피 암종, 혼합된 뮬레리안(Mullerian) 종양, 단구성 백혈병, 입암, 점액성 종양, 다발성 내분비 신생물 증후군, 다발성 골수종, 다발성 골수종, 균상식육종, 균상식육종, 골수이형성 질환, 골수이형성 증후군, 골수성 백혈병, 골수성 육종, 골수증식성 질환, 점액종, 비강암, 비인두암, 비인두 암종, 신생물, 신경초종, 신경모세포종, 신경모세포종, 신경섬유종, 신경종, 결절성 흑색종, 비호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 비흑색종 피부암, 비소세포 폐암, 안구 종양, 희소돌기별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 종양세포종, 시신경초 수막종, 구강암, 구강 암, 구강인두암, 골육종, 골 육종, 난소암, 난소 암, 난소 상피암, 난소 생식세포 종양, 난소 낮은 악성 잠재적 종양, 유방의 파제트병, 판코스트(Pancoast) 종양, 췌장암, 췌장암, 유두상 갑상선암, 유두종증, 부신경절종, 부비동암, 부갑상선암, 음경암, 말초혈관 상피모양 세포 종양, 인두암, 크롬친화 세포종, 중간체 분화의 송과체 실질 종양, 송과체모세포종, 과립세포종, 뇌하수체 선종, 뇌하수체 종양, 형질세포 신생물, 흉막폐 모세포종, 다배아종, 전구체 T-림프모구성 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 원발성 삼출 림프종, 원발성 간세포암, 원발성 간암, 원발성 복막암, 원시 신경외배엽성 종양, 전립선암, 복막 가점액종, 직장암, 신장 세포 암종, 15번 염색체 상의 NUT 유전자와 관련된 기도 암종, 망막모세포종, 횡문근종, 횡문근육종, 리히터(Richter) 형질전환, 천골미골 기형종, 타액선암, 육종, 신경초종증, 피지선 암종, 2차 신생물, 정상피종, 장액 종양, 세르톨리-라이디히(Sertoli-Leydig) 세포 종양, 성삭-기질 종양, 세자리(Sezary) 증후군, 인환 세포 암종, 피부암, 청색 소원형 세포 종양, 소세포 암종, 소세포 폐암, 소세포 림프종, 소장암, 연부 조직 육종, 소마토스타틴종, 검댕 사마귀, 척수 종양, 척추 종양, 비장 변연부 림프종, 편평상피 세포 암종, 위암, 표재 확장성 흑색종, 천막상 원시 신경외배엽성 종양, 표면 상피-기질 종양, 활막 육종, T-세포 급성 림프모구성 백혈병, T-세포 거대 과립 림프구 백혈병, T-세포 백혈병, T-세포 림프종, T-세포 전림프구성 백혈병, 기형종, 말단 림프암, 고환암, 난포막종, 인후두암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행세포암, 이행세포 암종, 요막관암, 요도암, 비뇨생식기 신생물, 자궁 육종, 포도막 흑색종, 질암, 버너 모리슨(Verner Morrison) 증후군, 사마귀모양 암종, 시각경로 신경아교종, 외음부암, 발덴스트롬(Waldenstrom) 거대글로불린혈증, 와르틴(Warthin) 종양, 윌름즈 종양, 및 이들의 조합.
그의 전부 또는 일부(예를 들어, 프로모터 영역, 인트론, 엑손 등)가 본원에서 설명되는 방법에 따라 서열 변이체에 대해 분석될 수 있는, 암과 연관된 유전자의 추가의 비제한적인 예가 표 2에 제시된다.
<표 2>
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
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한 측면에서, 본 개시내용은 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머를 포함하는 앰플리콘을 농축하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 임의의 다양한 측면에 관하여 본원에서 개시되는 하나 이상의 요소를 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 (a) 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 제1 프라이머; (b) 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하는 제2 프라이머(여기서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일하고, 콘카테머는 제1 프라이머의 연장 산물임), 및 (c) 서열 상보성을 통해 제1 공통 서열 또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 서열을 갖는 제3 프라이머를 포함한다. 키트 내의 시약 및 다른 물질은 적절한 용기에 담을 수 있고, 즉시 사용할 수 있는 형태이거나 또는 키트 내의 다른 시약 또는 사용자가 제공한 시약(예를 들어, 농축된 조성물의 희석 또는 동결건조된 조성물의 재구성)과 조합할 것을 필요로 할 수 있다. 키트는 완충제를 제공할 수 있고, 그의 비제한적인 예는 탄산나트륨 완충제, 중탄산나트륨 완충제, 붕산염 완충제, 트리스(Tris) 완충제, MOPS 완충제, HEPES 완충제 및 이들의 조합물을 포함한다. 키트는 대조군 샘플, 예를 들어 양성 대조군 또는 정량 표준물로서 사용하기 위한 정제된 DNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 역전사효소 및 폴리머라제 중 하나 이상과 같은 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 하나 이상의 효소를 포함한다. 원하는 경우, 대상 키트는 증폭 산물의 축적을, 예컨대 실시간으로 모니터링할 수 있도록 하나 이상의 검출 가능한 마커를 추가로 포함할 수 있다. 검출 가능한 마커의 비제한적 예는 상기 설명되어 있고, 증폭 단계 동안 이중 가닥 DNA에 우선적으로 또는 배타적으로 결합하는 염료, 예컨대 SYBR 그린 염료 또는 BEBO 염료를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 증폭 반응의 진행 또는 산물을 검출하기 위한 형광단 및 소광제(quencher)를 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에서 개시되는 하나 이상의 방법에 따라 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±5℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합 길이는 75개 이하의 뉴클레오티드이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머를 포함하는 앰플리콘의 농축에 사용하기 위한 프라이머를 설계하기 위한 시스템을 제공한다. 프라이머는 본 개시내용의 임의의 다양한 측면에 관하여 본원에서 설명되는 임의의 특징을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스템은 (a) 지정된 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 설계해 달라는 고객의 요청을 수신하도록 구성된 컴퓨터; (b) 하나 이상의 프로세서에 의한 실행시 표적 서열의 증폭을 위한 적어도 3개의 프라이머를 설계하는 코드를 포함하는 컴퓨터 판독 가능 매체로서, 적어도 3개의 프라이머가 (i) 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 제1 프라이머; (ii) 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하는 제2 프라이머(여기서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일하고, 콘카테머는 제1 프라이머의 연장 산물임); 및 (iii) 서열 상보성을 통해 제1 공통 서열 또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 서열을 갖는 제3 프라이머를 포함하는 것인 컴퓨터 판독 가능 매체; 및 (c) 상기 적어도 3개의 프라이머의 서열을 포함하는 보고서를 수신자에게 전송하는 보고서 생성기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±5℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합 길이는 75개 이하의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 컴퓨터는 하나 이상의 프로세서를 포함한다. 프로세서는 하나 이상의 제어기, 계산 유닛, 및/또는 컴퓨터 시스템의 다른 유닛과 결합될 수 있거나, 또는 원하는 펌웨어(firmware)에서 실행될 수 있다. 소프트웨어에서 실행되는 경우, 루틴(routine)이 임의의 컴퓨터 판독 가능 메모리에, 예컨대 RAM, ROM, 플래쉬 메모리, 자기 디스크, 레이저 디스크, 또는 다른 저장 매체에 저장될 수 있다. 마찬가지로, 이러한 소프트웨어는 예를 들어 통신 채널, 예컨대 전화선, 인터넷, 무선 연결 등으로, 또는 전송 가능 매체, 예컨대 컴퓨터 판독 가능 디스크, 플래쉬 드라이브 등을 통하는 것을 포함하는 임의의 공지된 전달 방법을 통해 컴퓨팅 장치로 전달될 수 있다. 다양한 단계들이 다양한 블록, 작업, 도구, 모듈 및 기술로서 실행될 수 있고, 이는 하드웨어, 펌웨어, 소프트웨어, 또는 이들의 임의의 조합으로 실행될 수 있다. 하드웨어에서 실행되는 경우, 상기 블록, 작업, 기술 등의 일부 또는 전부가, 예를 들어 사용자 집적 회로(IC), 주문형 집적 회로(ASIC: application specific integrated circuit), 필드 프로그램 가능 로직 어레이(FPGA: field programmable logic array), 프로그램 가능 로직 어레이(PLA: programmable logic array) 등에서 실행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 컴퓨터는 (고객에 의해서도 제공될 수 있는) 특정 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 설계해 달라는 고객의 요청을 수신하도록 구성된다. 컴퓨터는 고객 요청을 직접(예를 들어, 고객이 입력한 키보드, 마우스 또는 터치 스크린과 같은 입력 장치 또는 고객 요청을 입력한 사용자에 의해) 또는 간접적으로(예를 들어, 인터넷을 비롯한 유선 또는 무선 연결을 통해) 수신할 수 있다.
일부 실시양태에서, 시스템은 수신자에게 보고서를 보내는 보고서 생성기를 포함하고, 상기 보고서는 적어도 3개의 프라이머의 서열을 포함한다. 보고서 생성기는 고객 요청에 대한 응답으로 자동으로 보고서를 보낼 수 있다. 별법으로, 보고서 생성기는 오퍼레이터로부터의 지시에 응답하여 보고서를 보낼 수 있다. 보고서는 임의의 적절한 통신 매체를 사용하여 로컬 또는 원격 위치의 수신자에게 전송될 수 있다. 예를 들어, 통신 매체는 네트워크 연결, 무선 연결 또는 인터넷 연결일 수 있다. 보고서는 접수 및/또는 수신자의 검토를 위해 네트워크 또는 연결망 (또는 인쇄물과 같은 물리적인 보고서를 우편으로 보내는 것을 포함하고 이로 제한되지 않는, 정보를 전송하기 위한 임의의 다른 적합한 수단)을 통해 전송될 수 있다. 수신자는 고객 또는 전자 시스템(예를 들어, 하나 이상의 컴퓨터 및/또는 하나 이상의 서버)일 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 보고서 생성기는 개인용 컴퓨터, 전화, 태블릿 또는 다른 장치와 같은 수신자 장치에 보고서를 전송한다. 보고서를 온라인으로 보거나, 수신자의 장치에 저장되거나, 인쇄될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 프로세서에 의한 실행시 본원에서 개시되는 임의의 방법에 따른 방법을 실행하는 코드를 포함하는 컴퓨터 판독 가능 매체를 제공한다. 컴퓨터 판독 가능 매체는 유형의 저장 매체, 반송파(carrier wave) 매체 또는 물리적 전송 매체를 포함하고 이로 제한되지 않는 많은 형태를 취할 수 있다. 비휘발성 저장 매체는 예를 들어 광학 또는 자기 디스크, 예컨대 임의의 컴퓨터(들) 내의 임의의 저장 장치 등을 포함하고, 예컨대 계산 단계, 처리 단계 등을 실행하는데 사용될 수 있다. 휘발성 저장 매체는 동적 메모리, 예컨대 컴퓨터의 주 메모리를 포함한다. 유형의 전송 매체는 동축 케이블; 컴퓨터 시스템 내의 버스(bus)를 포함하는 전선을 포함하는 구리선 및 광섬유를 포함한다. 반송파 전송 매체는 전기 또는 전자기 신호, 또는 음파 또는 광파, 예컨대 무선 주파수(RF) 및 적외선(IR) 데이터 통신 동안 생성되는 것의 형태를 취할 수 있다. 따라서, 컴퓨터 판독 가능 매체의 일반적인 형태는 예를 들어 플로피 디스크, 유연한(flexible) 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 임의의 다른 자기 매체, CD-ROM, DVD 또는 DVD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드 종이 테이프, 구멍 패턴을 갖는 임의의 다른 물리적 저장 매체, RAM, ROM, PROM 및 EPROM, FLASH-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 데이터 또는 명령어를 전송하는 반송파, 상기 반송파를 전송하는 케이블 또는 링크, 또는 컴퓨터가 그로부터 프로그래밍 코드 및/또는 데이터를 판독할 수 있는 임의의 다른 매체를 포함한다. 이러한 형태의 많은 컴퓨터 판독 가능 매체는 하나 이상의 명령어의 하나 이상의 시퀀스를 실행을 위해 프로세서에 전달하는데 관여할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시양태를 예시하기 위한 목적으로 제공되며, 어떤 식으로든 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 실시예는 본원에서 설명되는 방법과 함께 바람직한 실시양태를 나타내고, 예시적이며, 본 발명의 범위로 제한하고자 하는 것이 아니다. 이들에서의 변화 및 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 사상 내에 포함되는 다른 용도가 관련 기술 분야의의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
실시예 1: RCA 증폭의 1 사이클 및 RCA 증폭의 다중 사이클로부터의 산물의 비교
게놈 DNA를 약 180 bp의 평균 단편 크기로 초음파 처리하였다. 단편화된 DNA를 0.9x 앰퓨어(Ampure) 비드로 정제하여 100 bp보다 작은 단편을 제거하였다. 이어서, 초음파 처리된 게놈 DNA를 라이게이션하여 원형 표적 폴리뉴클레오티드를 형성시켰다. 라이게이션을 위해, 정제된 DNA 단편(>10 ng) 12 ㎕를 95℃에서 30초 동안 가열하고 빙상에서 2분 동안 냉각함으로써 변성시켰다. 이어서, 2 ㎕의 10x CircLigase 완충제, 4 ㎕의 5M 베타인, 1 ㎕의 50 mM MnCl2, 및 1 ㎕의 CircLigase II를 함유하는 8 ㎕의 라이게이션 혼합물을 변성된 DNA 샘플에 첨가하고, 반응물을 60℃에서 적어도 12시간 동안 인큐베이션하였다. 라이게이션 과정 종료시에, 남아있는 선형 단일 가닥 DNA 분자는 엑소뉴클레아제 처리 단계에 의해 제거하였다. 엑소뉴클레아제 처리를 위해, 라이게이션 산물을 80℃에서 45초 동안 가열한 후, 1 ㎕의 엑소뉴클레아제 혼합물(ExoI 20 U/㎕: ExoIII 100 U/㎕, 1:2 비율)을 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 30분 동안, 이어서 80℃에서 20분 동안 열 순환기에서 인큐베이션하였다. 엑소뉴클레아제 처리 후, 1 ㎕의 50 mM EDTA를 각각의 튜브에 첨가하였다.
원형 표적 폴리뉴클레오티드를 RCA 증폭의 1 사이클 또는 다중 RCA 증폭에 적용하였다. RCA 증폭의 1 사이클 및 RCA 증폭의 다중 사이클 둘 모두에 대해, 10 ng의 원형화된 DNA 샘플을 출발 물질로서 사용하였다. 각각의 반응에 대해, 0.34 ㎕의 1M 트리스-HCl(pH9.2), 1 ㎕의 100 mM MgS04, 2.78 ㎕의 180 mM (NH4)2SO4, 0.75 ㎕의 dNTP 혼합물(각각 25 mM), 0.5 ㎕의 10% 트윈(Tween) 20, 1.20 ㎕의 1M KCl, 2 ㎕의 10 μM 백-투-백 전방향 및 역방향 프라이머, 18.28 ㎕의 물을 각각 10 ng의 DNA 샘플에 첨가하였다. 반응물을 80℃에서 1분 동안 가열하고, 63℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 4℃로 냉각하였다. 다음으로, 15 단위의 Bst 2.0 웜 스타트(warm start) DNA 폴리머라제를 각각의 반응물에 첨가하였다. RCA 증폭의 1 사이클 동안, 반응물을 2시간 동안 63℃에서 인큐베이션하였다. RCA 증폭의 다중 사이클을 위해, 반응물을 다음 프로그램을 사용하는 열 순환기에서 인큐베이션하였다: 60℃에서 30초; 70℃에서 4.5분; 94℃에서 20초; 및 58℃에서 10초의 8 사이클. 2 사이클 종료시마다, 15 단위의 Bst 2.0 웜 스타트 DNA 폴리머라제를 첨가하였다.
나머지 세척 단계에 대한 제조자의 지시에 따라, 모든 증폭 산물을 50 ㎕ 앰퓨어 비드의 첨가에 의해 정제하였다. 용리를 위해, 55 ㎕의 용리 완충제를 각각의 튜브에 첨가하고, 비드를 65℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 잠시 회전시킨 후에, 튜브를 자석에 갖다대었다. 각각의 반응물로부터 약 50 ㎕의 용리된 생성물이 회수되었다.
RCA의 1 사이클로부터의 증폭 산물의 어댑터 부착을 위해, 각각 50 ㎕의 용리액을 5.7 ㎕의 10x AccuPrime 완충제, 이전의 증폭 반응에 사용된 프라이머의 각각의 3' 말단에서 공통 서열에 상보성인 1 ㎕의 25 μM 어댑터 프라이머, 및 2 단위의 AccuPrime HiFi Taq 폴리머라제와 혼합하였다. 어댑터는 다음 PCR 프로그램을 사용하여 증폭에 의해 부착되었다: 95℃에서 2분; 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 2.5분의 30 사이클; 72℃에서 7분의 최종 연장. RCA의 다중 사이클로부터의 증폭 산물에 대하여, 서열결정 어댑터는 일루미나를 위한 KAPA 하이퍼 프렙(hyper prep) 키트를 사용하여 부착되었다. PCR 증폭된 라이브러리 생성물을 아가로스 겔 또는 차세대 서열결정으로 분석하였다. 서열결정 데이터에 대한 생물정보 처리(bioinformatics)를 수행하기 위해, FASTQ 파일은 HiSeq 실행으로부터 수득하였다. FASTQ 파일은 표적 서열이 포함된 참조 파일에 정렬되었다. 삽입 크기는 서열결정 데이터를 기초로 하여 계산되었다.
B2B 프라이머 및 온도 사이클링을 이용한 증폭은 보다 많은 폴리뉴클레오티드 카피를 함유하는 앰플리콘뿐만 아니라, 도 5의 아가로스 겔에서 정성적으로 나타낸 바와 같이 RCA의 1 사이클에 비해 더 긴 표적 폴리뉴클레오티드를 갖는 앰플리콘을 생성하였다. 도 6에서, 표는 아가로스 겔의 강도 분석에 의해 하나의 반복체(~150 bp 크기), 2개의 반복체(~300 bp) 또는 3개의 반복체(~450 bp)을 함유하는 생성물의 비율의 반-정량적 비교를 제공한다. RCA의 1 사이클에 비해, RCA의 다중 사이클은 단지 1개의 반복체만을 갖는 산물의 상대적인 양을 감소시켰다.
증폭 산물의 서열결정 분석은 또한 RCA의 1 사이클에 비해 RCA의 다중 사이클을 사용할 때 보다 큰 DNA 단편의 증가된 비율을 제시한다. 도 7은 판독치 수에 의해 단편 크기의 분포를 보여주고, 도 8은 분자의 백분율에 의해 관찰된 분자 크기의 분포를 보여준다.
실시예 2: 스템 구조를 갖는 프라이머 또는 스템 구조가 없는 프라이머를 사용한 RCA의 다중 사이클로부터의 산물의 비교
게놈 DNA를 약 150 bp의 평균 단편 크기로 초음파 처리하였다. 100 bp보다 작은 단편을 제거하기 위해 단편화된 DNA를 0.9x 앰퓨어 비드로 정제하였다. 이어서, 초음파 처리된 게놈 DNA를 라이게이션하여 원형 표적 폴리뉴클레오티드를 형성시켰다. 라이게이션을 위해, 12 ㎕의 정제된 DNA 단편(>10 ng)을 95℃에서 30초 동안 가열하고 빙상에서 2분 동안 냉각함으로써 변성시켰다. 그 다음, 2 ㎕의 10x CircLigase 완충제, 4 ㎕의 5M 베타인, 1 ㎕의 50 mM MnC12, 및 1 ㎕의 CircLigase II를 함유하는 8 ㎕의 라이게이션 혼합물을 변성된 DNA 샘플에 첨가하고, 반응물을 60℃에서 적어도 12시간 동안 인큐베이션하였다. 라이게이션 과정의 종료시에, 남아있는 선형 단일 가닥 DNA 분자는 엑소뉴클레아제 처리 단계에 의해 제거하였다. 엑소뉴클레아제 처리를 위해, 라이게이션 산물을 80℃에서 45초 동안 가열한 후, 1 ㎕의 엑소뉴클레아제 혼합물(ExoI 20 U/㎕: ExoIII 100 U/㎕, 1:2 비율)을 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 30분 동안, 이어서 80℃에서 20분 동안 열 순환기에서 인큐베이션하였다. 엑소뉴클레아제 처리 후, 1 ㎕의 50 mM EDTA를 각각의 튜브에 첨가하였다.
원형 표적 폴리뉴클레오티드는 19mer 스템 구조를 형성할 수 있는 프라이머 또는 스템 구조 없이 설계된 프라이머를 사용하는 RCA 증폭의 다중 사이클에 적용하였다. 스템 구조를 형성할 수 있는 예시적인 공통 서열은 표 1에 제공된 서열 및 그의 임의의 단편을 포함한다.
각각의 반응에 대해, 0.34 ㎕의 1M 트리스-HCl(pH9.2), 1 ㎕의 100 mM MgS04, 2.78 ㎕의 180 mM (NH4)2SO4, 0.75 ㎕의 dNTP 혼합물(각각 25 mM), 0.5 ㎕의 10% 트윈 20, 1.20 ㎕의 1M KCl, 2 ㎕의 10 μM 백-투-백 전방향 및 역방향 프라이머, 18.28 ㎕의 물을 각각 10 ng의 DNA 샘플에 첨가하였다. 반응물을 80℃에서 1분 동안 가열하고, 63℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 4℃로 냉각하였다. 다음으로, 15 단위의 Bst 2.0 웜 스타트 DNA 폴리머라제를 각각의 반응물에 첨가하였다. 반응물을 다음 프로그램을 사용하는 열 순환기에서 인큐베이션하였다: 60℃에서 30초; 70℃에서 4.5분; 94℃에서 20초; 및 58℃에서 10초의 8 사이클. 2 사이클 종료시마다, 15 단위의 Bst 2.0 웜 스타트 DNA 폴리머라제를 첨가하였다.
나머지 세척 단계에 대한 제조자의 지시에 따라, 모든 증폭 산물을 50 ㎕ 앰퓨어 비드의 첨가에 의해 정제하였다. 용리를 위해, 55 ㎕의 용리 완충제를 각각의 튜브에 첨가하고, 비드를 65℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 잠시 회전시킨 후에, 튜브를 자석에 갖다대었다. 각각의 반응물로부터 약 50 ㎕의 용리된 생성물이 회수되었다.
서열결정 어댑터는 일루미나를 위한 KAPA 하이퍼 프렙 키트를 사용하여 부착되었다. PCR 증폭된 라이브러리 생성물을 아가로스 겔에 의해 분석하였고, 크기가 550 bp-1000 bp인 생성물을 서열결정을 위해 추가로 수집하였다. 생성된 증폭 산물을 서열결정으로 분석하였다. 서열결정 데이터에 대한 생물정보 처리를 수행하기 위해, FASTQ 파일은 HiSeq 실행으로부터 수득하였다. FASTQ 파일은 표적 서열이 포함된 참조 파일에 정렬되었다. 삽입 크기는 서열결정 데이터를 기초로 하여 계산되었다.
스템 구조를 포함하는 B2B 프라이머 및 온도 사이클링을 사용하여 증폭하면, 표 3에 나타낸 바와 같이 더 많은 폴리뉴클레오티드 카피를 함유하는 앰플리콘이 생성되었다. 표 3은 하나 초과의 반복체를 함유하는 서열결정 판독치의 백분율을 제시한다. 스템이 없는 프라이머에 비해, 19개 염기 스템을 갖는 프라이머를 사용한 증폭은 하나 초과의 반복체를 갖는 판독치의 백분율을 유의하게 증가시켰다.
<표 3>
Figure pct00017
실시예 3: 혼합된 게놈 DNA 샘플로부터 저빈도 융합 대립유전자의 검출
염색체 재배열은 많은 암 유형에서 관찰된다. 본 실시예는 원형화된 DNA 분자 및 백투백(B2B) 프라이머 설계를 사용하여 융합 대립유전자를 검출하는 방법을 설명한다. 이 방법은 '파트너' 유전자에 대한 사전 지식이 없는 상태에서 DNA 샘플로부터 융합 검출을 가능하게 하고, 무세포 DNA 또는 게놈 DNA 샘플에서 유전자 재배열 이벤트를 스크리닝하는데 적용될 수 있다.
50% EML4/ALK 융합 대립유전자를 함유하는 EML4/ALK DNA 표준 참조물(HD664 Horizon Diagnostics)로부터의 게놈 DNA 및 참조 게놈 DNA를 약 150 bp의 평균 단편 크기로 초음파 처리하였다. 100 bp보다 작은 단편을 제거하기 위해 단편화된 DNA를 0.9x 앰퓨어 비드로 정제하였다. 라이게이션을 위해, 12 ㎕의 정제된 DNA 단편(>10 ng)을 95℃에서 30초 동안 가열하고 빙상에서 2분 동안 냉각함으로써 변성시켰다. 그 다음, 2 ㎕의 10x CircLigase 완충제, 4 ㎕의 5M 베타인, 1 ㎕의 50 mM MnC12, 및 1 ㎕의 CircLigase II를 함유하는 8 ㎕의 라이게이션 혼합물을 변성된 DNA 샘플에 첨가하고, 반응물을 60℃에서 적어도 12시간 동안 인큐베이션하였다. 라이게이션 과정의 종료시에, 남아있는 선형 단일 가닥 DNA 분자는 엑소뉴클레아제 처리 단계에 의해 제거하였다. 엑소뉴클레아제 처리를 위해, 라이게이션 산물을 80℃에서 45초 동안 가열한 후, 1 ㎕의 엑소뉴클레아제 혼합물(ExoI 20 U/㎕: ExoIII 100 U/㎕, 1:2 비율)을 첨가하고, 37℃에서 30분 동안, 이어서 80℃에서 20분 동안 열 순환기에서 인큐베이션하였다. 엑소뉴클레아제 처리 후, 1 ㎕의 50 mM EDTA를 각각의 튜브에 첨가하였다.
이어서, 초음파 처리된 게놈 DNA를 라이게이션하여 원형 표적 폴리뉴클레오티드를 형성시켰다. 2개의 원형화된 DNA 샘플, HD664 및 참조 게놈 DNA를 qPCR에 의해 정량한 후, 농도에 기초하여 2.5%, 0.5%, 0.05% 및 0%의 융합 대립유전자를 달성하기 위해 함께 혼합하였다(도 9). 롤링 써클 증폭을 위해, 10 ng의 각각의 혼합된 DNA 샘플을 출발 물질로서 사용하였다. 각각의 반응에 대해, 0.34 ㎕의 1M 트리스-HCl(pH9.2), 1 ㎕의 100 mM MgS04, 2.78 ㎕의 180 mM (NH4)2SO4, 0.75 ㎕의 dNTP 혼합물(각각 25 mM), 0.5 ㎕의 10% 트윈 20, 1.20 ㎕의 1M KCl, ALK/EML4 융합 영역을 표적화하도록 특이적으로 설계된 2 ㎕의 10 μM 백-투-백 전방향 및 역방향 프라이머(표 4에 제공된 프라이머 서열), 18.28 ㎕의 물을 각각 10 ng의 DNA 샘플에 첨가하였다. 반응물을 80℃에서 1분 동안 가열하고, 63℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 4℃로 냉각하였다. 15 단위의 Bst 2.0 웜 스타트 DNA 폴리머라제를 각각의 반응물에 첨가한 후, 각 반응물을 63℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
<표 4> ALK 융합 검출을 위한 전방향 및 역방향 프라이머 서열
Figure pct00018
나머지 세척 단계에 대한 제조자의 지시에 따라, 증폭 산물을 50 ㎕ 앰퓨어 비드의 첨가에 의해 정제하였다. 용리를 위해, 55 ㎕의 용리 완충제를 각각의 튜브에 첨가하고, 비드를 65℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 잠시 회전시킨 후에, 튜브를 자석에 갖다대었다. 각각의 반응물로부터 약 50 ㎕의 용리된 생성물이 회수되었다. 각각의 50 ㎕의 용리액을 5.7 ㎕의 10X AccuPrime 완충제, 1 ㎕의 25 μM의 각각의 일루미나 서열결정 라이브러리 어댑터 프라이머 및 2단위의 AccuPrime HiFi Taq 폴리머라제와 혼합하였다. 증폭에 의한 어댑터 부착은 다음 PCR 프로그램을 사용하였다: 95℃에서 2분; 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 2.5분의 25 사이클; 및 72℃에서 7분의 최종 연장. PCR 산물을 아가로스 겔에 의해 분석하였고, 크기가 550 bp-1000 bp인 산물을 서열결정을 위해 추가로 수집하였다.
서열결정 데이터에 대한 생물정보 처리를 수행하기 위해, FASTQ 파일은 HiSeq 실행으로부터 수득하였다. FASTQ 파일은 표적 서열이 포함된 참조 파일에 정렬되었다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 융합 대립유전자는 2.5%, 0.5% 또는 0.05% 융합 대립유전자 스파이크-인(spike-in) 샘플에서 발견되었지만, 0% 융합 대립유전자 스파이크-인 샘플에서는 발견되지 않았다.
실시예 4: B2B 프라이머를 사용하는 다중 RCA에서 표적의 검출
샘플에서 다수의 표적 폴리뉴클레오티드의 구성 표적 폴리뉴클레오티드를 다중 RCA 및 B2B 프라이머를 사용한 증폭에서 검출하였다. 인간 혈청 샘플(H6914, Sigma)에서 추출한 20 ng의 대조군 cfDNA를 총 12 ㎕의 트리스(pH 8) 완충제에 재현탁하고, 95℃에서 30초 동안 가열하여 변성시키고, 빙상에서 2분 동안 냉각하였다. 그 다음, 2 ㎕의 10x CircLigase 완충제, 4 ㎕의 5M 베타인, 1 ㎕의 50 mM MnC12, 및 1 ㎕의 CircLigase II를 함유하는 8 ㎕의 라이게이션 혼합물을 변성된 DNA 샘플에 첨가하고, 반응물을 60℃에서 적어도 12시간 동안 인큐베이션하였다. 라이게이션 과정의 종료시에, 남아있는 선형 단일 가닥 DNA 분자는 엑소뉴클레아제 처리 단계에 의해 제거하였다. 엑소뉴클레아제 처리를 위해, 라이게이션 산물을 80℃에서 45초 동안 가열한 후, 1 ㎕의 엑소뉴클레아제 혼합물(ExoI 20 U/㎕: ExoIII 100 U/㎕, 1:2 비율)을 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 30분 동안, 이어서 80℃에서 20분 동안 열 순환기에서 인큐베이션하였다. 엑소뉴클레아제 처리 후, 1 ㎕의 50 mM EDTA를 각각의 튜브에 첨가하였다.
원형 표적 폴리뉴클레오티드는 롤링 써클 증폭, 이어서 B2B 프라이머를 사용한 증폭에 적용하였다. B2B 프라이머의 예가 표 5에 제시된다.
<표 5> 백-투-백 B2B 프라이머의 예
Figure pct00019
Figure pct00020
이 반응에 대해, 0.34 ㎕의 1M 트리스-HCl(pH9.2), 1 ㎕의 100 mM MgS04, 2.78 ㎕의 180 mM (NH4)2SO4, 0.75 ㎕의 dNTP 혼합물(각각 25 mM), 0.5 ㎕의 10% 트윈 20, 1.20 ㎕의 1M KCl, 2 ㎕의 10 μM 백-투-백 전방향 및 역방향 프라이머(도 11의 표적 목록 표에 제시된 특이적 표적을 표적으로 하는 8쌍의 프라이머의 혼합물), 18.28 ㎕의 물을 각각 10 ng의 DNA 샘플에 첨가하였다. 반응물을 80℃에서 1분 동안 가열하고, 63℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 4℃로 냉각하였다. 다음으로, 15 단위의 Bst 2.0 웜 스타트 DNA 폴리머라제를 각각의 반응물에 첨가하였다. B2B 프라이머를 사용한 등온 증폭을 위해, 반응물을 63℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
나머지 세척 단계에 대한 제조자의 지시에 따라, 모든 증폭 산물을 50 ㎕ 앰퓨어 비드의 첨가에 의해 정제하였다. 용리를 위해, 55 ㎕의 용리 완충제를 각각의 튜브에 첨가하고, 비드를 65℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 잠시 회전시킨 후에, 튜브를 자석에 갖다대었다. 각각의 반응물로부터 약 50 ㎕의 용리된 생성물이 회수되었다.
어댑터 부착을 위해, 각각의 50 ㎕의 용리액을 5.7 ㎕의 10X AccuPrime 완충제, 등온 및 B2B 증폭에 사용된 프라이머의 3' 말단에서 공통 서열에 상보성인 1 ㎕의 25 μM 어댑터 프라이머 및 2단위의 AccuPrime HiFi Taq 폴리머라제와 혼합하였다. 어댑터는 다음 PCR 프로그램을 사용하여 증폭에 의해 부착하였다: 95℃에서 2분; 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 2.5분의 30 사이클; 및 72℃에서 7분의 최종 연장. PCR 산물을 아가로스 겔에 의해 분석하였고, 크기가 550 bp-1000 bp인 산물을 서열결정을 위해 추가로 수집하였다. 생성된 증폭 산물을 서열결정으로 분석하였다. 도 11에 도시된 바와 같은 서열 분석 결과는 다수의 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 다중 반응에서 검출 가능함을 보여준다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에서 제시되고 설명되었지만, 그러한 실시양태는 단지 예로서 제공되는 것임이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 많은 변형, 변경, 및 대체가 본 발명을 벗어나지 않으면서 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 일어날 것이다. 본원에서 설명되는 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안들이 본 발명을 실행하는데 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 규정하며, 이들 청구범위 및 이들의 등가물에 속하는 방법 및 구조가 이에 의해 보호되는 것으로 의도된다.

Claims (105)

  1. 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머(concatemer)를 포함하는 앰플리콘의 농축 방법으로서,
    (a) 제1 프라이머의 연장에 의해 원형 표적 폴리뉴클레오티드로부터 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 콘카테머를 생성하는 단계로서, 상기 제1 프라이머는 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 것인 단계;
    (b) 제2 프라이머의 연장에 의해 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 함유하는 다수의 연장 산물을 생성하는 단계로서, 상기 제2 프라이머는 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하고, 여기서 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일한 것인 단계, 및
    (c) 다수의 앰플리콘을 생성하는 조건 하에 단계 (b)의 다수의 연장 산물을 증폭하는 단계로서, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘이 농축되는 것인 단계
    를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머를 포함하는 앰플리콘의 농축 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)가 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제에 의해 수행되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제1 공통 서열 및 상기 제2 공통 서열이 동일한 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 (c)의 증폭은 제3 프라이머의 프라이머 연장을 포함하고, 여기서 제3 프라이머는 서열 상보성을 통해 제1 공통 서열 또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, (c)의 증폭 단계는, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율을 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 미만의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율보다 더 높게 만드는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율이 적어도 90%인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율이 적어도 80%인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율이 적어도 60%인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 연장 산물은 (i) 제1 공통 서열과 제2 공통 서열의 상보체 사이, 또는 (ii) 제2 공통 서열과 제1 공통 서열의 상보체 사이의 분자내 혼성화를 포함하는 스템 루프 구조를 형성하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 스템 루프 구조의 형성은 어닐링 단계를 제3 프라이머의 용융 온도의 ±5℃ 이내의 온도에서 유지하면서 단계 (c)의 증폭을 수행함으로써 수행되는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 스템 루프 구조의 형성은 어닐링 단계를 70℃ 미만의 온도에서 유지하면서 단계 (c)의 증폭을 수행함으로써 수행되는 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 스템 루프 구조는 적어도 9개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함하는 것인 방법.
  13. 제9항에 있어서, 스템 루프 구조는 적어도 15개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함하는 것인 방법.
  14. 제9항에 있어서, 스템 루프 구조는 적어도 20개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함하는 것인 방법.
  15. 제9항에 있어서, 스템 루프 구조는 적어도 25개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함하는 것인 방법.
  16. 제9항에 있어서, 스템 루프 구조는 적어도 30개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 제2 프라이머의 6 사이클 이하의 연장을 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 제2 프라이머의 8 사이클 이하의 연장을 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 제2 프라이머의 10 사이클 이하의 연장을 포함하는 것인 방법.
  20. 제4항에 있어서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±5℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 원형화된 무세포 DNA인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA의 원형화된 단편인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 염색체 재배열에 의해 생성된 서열을 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 염색체 재배열은 결실, 중복, 역위 및 전좌 중 적어도 하나인 방법.
  25. 제1항 또는 제23항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합 길이가 75개 이하의 뉴클레오티드인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 적어도 50%의 콘카테머가, 길이가 적어도 75개 뉴클레오티드인 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항에 있어서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥인 방법.
  28. 제1항에 있어서, 단계 (c)에서 생성된 다수의 앰플리콘을 서열결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 서열결정은 표적 폴리뉴클레오티드의 하나의 카피만을 포함하는 앰플리콘으로부터 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘을 선택적으로 정제하지 않고 수행되는 것인 방법.
  30. 제1항에 있어서, 단계 (c)에서 생성된 다수의 앰플리콘에서 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 정제된 앰플리콘을 서열결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제1항에 있어서, 다수의 상이한 표적 폴리뉴클레오티드는 동일한 반응 혼합물 내에서 증폭되는 것인 방법.
  33. 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머를 포함하는 앰플리콘을 농축하기 위한 반응 혼합물로서, 상기 반응 혼합물은
    (a) 원형 표적 폴리뉴클레오티드,
    (b) 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 제1 프라이머, 및
    (c) 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하는 제2 프라이머
    를 포함하고, 여기서 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일한 것인 반응 혼합물.
  34. 제33항에 있어서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 동일한 것인 반응 혼합물.
  35. 제33항에 있어서, 반응 혼합물은 용기에 함유되는 것인 반응 혼합물.
  36. 제35항에 있어서, 용기는 웰, 플레이트, 튜브, 챔버, 유동 셀 또는 칩인 반응 혼합물.
  37. 제33항에 있어서, 서열 상보성을 통해 제1 공통 서열 또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 서열을 갖는 제3 프라이머를 추가로 포함하는 반응 혼합물.
  38. 제37항에 있어서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±5℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는 것인 반응 혼합물.
  39. 제33항에 있어서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 반응 혼합물.
  40. 제33항에 있어서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 원형화된 무세포 DNA인 반응 혼합물.
  41. 제33항에 있어서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA의 원형화된 단편인 반응 혼합물.
  42. 제33항에 있어서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 염색체 재배열에 의해 생성된 서열을 포함하는 것인 반응 혼합물.
  43. 제42항에 있어서, 염색체 재배열은 결실, 중복, 역위 및 전좌 중 적어도 하나인 반응 혼합물.
  44. 제33항 또는 제42항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합 길이가 75개 이하의 뉴클레오티드인 반응 혼합물.
  45. 제33항에 있어서, 원형 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥인 반응 혼합물.
  46. 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머를 포함하는 앰플리콘을 농축하기 위한 키트로서, 상기 키트는
    (a) 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 제1 프라이머;
    (b) 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하는 제2 프라이머로서, 상기 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일하고, 콘카테머는 제1 프라이머의 연장 산물인 제2 프라이머, 및
    (c) 서열 상보성을 통해 제1 공통 서열 또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 서열을 갖는 제3 프라이머
    를 포함하는 키트.
  47. 제46항에 있어서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 동일한 것인 키트.
  48. 제46항에 있어서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±5℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는 것인 키트.
  49. 제46항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합 길이가 75개 이하의 뉴클레오티드인 키트.
  50. 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피의 콘카테머를 포함하는 앰플리콘의 농축에 사용하기 위한 프라이머를 설계하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템은
    (a) 지정된 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 설계해 달라는 고객의 요청을 수신하도록 구성된 컴퓨터;
    (b) 하나 이상의 프로세서에 의한 실행시 표적 서열의 증폭을 위한 적어도 3개의 프라이머를 설계하는 코드를 포함하는 컴퓨터 판독 가능 매체로서, 상기 적어도 3개의 프라이머는
    (i) 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 제1 프라이머;
    (ii) 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하는 제2 프라이머로서, 상기 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일하고, 콘카테머는 제1 프라이머의 연장 산물인 제2 프라이머; 및
    (iii) 서열 상보성을 통해 제1 공통 서열 또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 서열을 갖는 제3 프라이머
    를 포함하는 것인 컴퓨터 판독 가능 매체; 및
    (c) 상기 적어도 3개의 프라이머의 서열을 포함하는 보고서를 수신자에게 전송하는 보고서 생성기
    를 포함하는 시스템.
  51. 제50항에 있어서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 동일한 것인 시스템.
  52. 제50항에 있어서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±5℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는 것인 시스템.
  53. 제50항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합 길이가 75개 이하의 뉴클레오티드인 시스템.
  54. 롤링 써클 증폭을 수행하는 방법으로서,
    (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 원형 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    (b) 콘카테머를 포함하는 다수의 증폭 산물을 생성하기 위해 (i) 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제, (ii) 원형 폴리뉴클레오티드 및 (iii) 프라이머를 포함하는 증폭 반응 혼합물을 롤링 써클 증폭의 다중 사이클에 적용하는 단계
    를 포함하고, 여기서 롤링 써클 증폭의 다중 사이클의 각각의 사이클은 다수의 증폭 산물을 생성하기 위해 변성 온도에서의 변성, 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링 및 주어진 신장 시간 동안 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함하고,
    생성된 다수의 증폭 산물은 이 산물이 변성 및 프라이머 어닐링 조건은 대등하지만 다중 사이클의 신장 시간의 총합과 대등한 신장 시간을 사용하는 1회 증폭 사이클을 이용하여 생성된 다수의 증폭 산물에 비해, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 콘카테머를 더 높은 비율로 함유한다는 것을 특징으로 하는, 롤링 써클 증폭을 수행하는 방법.
  55. 롤링 써클 증폭에 의해 생성된 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 콘카테머의 비율을 증가시키는 방법으로서,
    (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 원형 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    (b) 콘카테머를 포함하는 다수의 증폭 산물을 생성하기 위해 (i) 가닥 변위 활성을 갖는 폴리머라제, (ii) 원형 폴리뉴클레오티드 및 (iii) 프라이머를 포함하는 증폭 반응 혼합물을 롤링 써클 증폭의 다중 사이클에 적용하는 단계
    를 포함하고, 여기서 롤링 써클 증폭의 다중 사이클의 각각의 사이클은 다수의 증폭 산물을 생성하기 위해 변성 온도에서의 변성, 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링 및 주어진 신장 시간 동안 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함하며,
    그에 따라 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 콘카테머의 비율을 증가시키는 것인, 롤링 써클 증폭에 의해 생성된 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 콘카테머의 비율을 증가시키는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 다수의 증폭 산물에서의 콘카테머의 비율이 변성 및 프라이머 어닐링 조건은 대등하지만 다중 사이클의 신장 시간의 총합과 대등한 신장 시간을 사용하는 1회 증폭 사이클을 이용하여 생성된 다수의 증폭 산물에 비해 증가되는 것인 방법.
  57. 제54항 또는 제55항에 있어서, 폴리머라제가 Bsu DNA 폴리머라제, Vent 폴리머라제, Bst DNA 폴리머라제, phi29 DNA 폴리머라제, PyroPhage 3173 폴리머라제, 이들의 임의의 변이체 및 이들의 임의의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  58. 제54항 또는 제55항에 있어서, 반응 혼합물에 이용되는 원형 폴리뉴클레오티드가 인간 무세포 DNA(cfDNA)를 포함할 때, 다수의 증폭 산물은 약 180개 염기쌍의 평균 단편 길이를 나타내는 것인 방법.
  59. 제54항 또는 제55항에 있어서, 반응 혼합물에 이용되는 원형 폴리뉴클레오티드가 인간 무세포 DNA(cfDNA)를 포함할 때, 다수의 증폭 산물은 약 170개 염기쌍의 중간 단편 길이를 나타내는 것인 방법.
  60. 제54항 또는 제55항에 있어서, 반응 혼합물에 이용되는 원형 폴리뉴클레오티드가 인간 무세포 DNA(cfDNA)를 포함할 때, 다수의 증폭 산물은 약 40개 염기 내지 약 450개 염기의 단편 길이의 분포를 나타내는 것인 방법.
  61. 제54항 또는 제55항에 있어서, 반응 혼합물에 이용되는 원형 폴리뉴클레오티드가 인간 무세포 DNA(cfDNA)를 포함할 때, 다수의 증폭 산물은 약 100개 염기 내지 약 200개 염기의 단편 길이의 분포를 나타내는 것인 방법.
  62. 제56항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 콘카테머의 비율이 적어도 약 1% 증가되는 것인 방법.
  63. 제54항 또는 제55항에 있어서, 롤링 써클 증폭의 다중 사이클 중 적어도 하나의 사이클 후에 반응 혼합물에 폴리머라제를 보충하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  64. 제54항 또는 제55항에 있어서, 원형 폴리뉴클레오티드는 약 40개 염기 내지 약 500개 염기의 길이를 갖는 것인 방법.
  65. 제54항 또는 제55항에 있어서, 원형 폴리뉴클레오티드는 무세포 DNA(cfDNA)를 포함하는 것인 방법.
  66. 제54항 또는 제55항에 있어서, 원형 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA의 단편을 포함하는 것인 방법.
  67. 제54항 또는 제55항에 있어서, 원형 폴리뉴클레오티드는 염색체 재배열에 의해 생성된 서열을 포함하는 것인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 염색체 재배열은 결실, 중복, 역위 및 전좌 중 적어도 하나인 방법.
  69. 제54항 또는 제55항에 있어서, 원형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥인 방법.
  70. 제54항 또는 제55항에 있어서, 원형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥인 방법.
  71. 제54항 또는 제55항에 있어서, 다수의 상이한 원형 폴리뉴클레오티드는 증폭 반응 혼합물 중에서 증폭되는 것인 방법.
  72. 제54항 또는 제55항에 있어서, 다중 사이클이 적어도 2회 사이클을 포함하는 것인 방법.
  73. 제54항 또는 제55항에 있어서, 다중 사이클의 각각의 사이클은 (i) 약 5초 내지 약 60초 동안 약 75℃ 내지 약 95℃의 변성 온도에서의 변성, (ii) 약 5초 내지 약 60초 동안 약 45℃ 내지 약 65℃의 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링, 및 (iii) 약 30초 내지 약 10분의 신장 시간 동안 약 65℃ 내지 약 75℃의 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함하는 것인 방법.
  74. 제54항 또는 제55항에 있어서, 다중 사이클의 각각의 사이클은 (i) 약 15초 내지 약 30초 동안 약 80℃의 변성 온도에서의 변성, (ii) 약 15초 내지 약 45초 동안 약 50℃의 어닐링 온도에서의 프라이머 어닐링, 및 (iii) 약 3분 내지 약 10분의 신장 시간 동안 약 70℃의 신장 온도에서의 프라이머 신장을 포함하는 것인 방법.
  75. 제54항 또는 제55항에 있어서, 프라이머는 무작위 서열을 포함하는 것인 방법.
  76. 제54항 또는 제55항에 있어서, 프라이머는 유전자 특이적 서열을 포함하는 것인 방법.
  77. 제54항 또는 제55항에 있어서, 프라이머는 (i) 서열 상보성을 통해 원형 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 제1의 3' 말단 및 (ii) 서열 상보성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지 않는 제1 공통 서열을 포함하는 제1의 5' 말단을 포함하는 제1 프라이머를 포함하고, 여기서 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 콘카테머는 주형으로서 원형 폴리뉴클레오티드를 사용하는 제1 프라이머의 연장에 의해 롤링 써클 증폭의 다중 사이클 동안 생성되는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 프라이머는 (i) 서열 상보성을 통해 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 콘카테머에 특이적으로 혼성화하는 제2의 3' 말단 및 (ii) 서열 상보성을 통해 콘카테머에 특이적으로 혼성화하지 않는 제2 공통 서열을 포함하는 제2의 5' 말단을 포함하는 제2 프라이머를 포함하고, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 함유하는 다수의 연장 산물은 주형으로서 콘카테머를 사용하는 제2 프라이머의 연장에 의해 롤링 써클 증폭의 다중 사이클 동안 생성되는 것인 방법.
  79. 제78항에 있어서, 제1 공통 서열 및 상기 제2 공통 서열은 각각 5' 말단에 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최적으로 정렬될 때 적어도 90% 동일한 것인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 제1 공통 서열 및 제2 공통 서열은 동일한 것인 방법.
  81. 제78항에 있어서, 다수의 앰플리콘을 생성하는 조건 하에 다수의 연장 산물을 증폭하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개 이상의 카피를 포함하는 앰플리콘이 농축되는 것인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 증폭하는 단계는 서열 상보성을 통해 제1 공통 서열 또는 제2 공통 서열에 특이적으로 혼성화하는 서열을 포함하는 제3 프라이머의 프라이머 연장을 포함하는 것인 방법.
  83. 제81항에 있어서, 증폭하는 단계는 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율을 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 미만의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율보다 더 높게 만드는 것인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율이 적어도 5%인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율이 적어도 10%인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율이 적어도 20%인 방법.
  87. 제86항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율이 적어도 30%인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율이 적어도 40%인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율이 적어도 60%인 방법.
  90. 제89항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율이 적어도 80%인 방법.
  91. 제90항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 갖는 앰플리콘의 백분율이 적어도 90%인 방법.
  92. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 연장 산물은 (i) 제1 공통 서열과 제2 공통 서열의 상보체 사이, 또는 (ii) 제2 공통 서열과 제1 공통 서열의 상보체 사이의 분자내 혼성화를 포함하는 스템 루프 구조를 형성하는 것인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 스템 루프 구조의 형성은 어닐링 단계를 제3 프라이머의 용융 온도의 ±5℃ 이내의 온도에서 유지하면서 증폭을 수행함으로써 수행되는 것인 방법.
  94. 제92항에 있어서, 스템 루프 구조의 형성은 어닐링 단계를 약 70℃ 미만의 온도에서 유지하면서 증폭을 수행함으로써 수행되는 것인 방법.
  95. 제92항에 있어서, 스템 루프 구조는 적어도 9개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함하는 것인 방법.
  96. 제95항에 있어서, 스템 루프 구조는 적어도 15개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함하는 것인 방법.
  97. 제96항에 있어서, 스템 루프 구조는 적어도 20개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함하는 것인 방법.
  98. 제97항에 있어서, 스템 루프 구조는 적어도 25개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함하는 것인 방법.
  99. 제98항에 있어서, 스템 루프 구조는 적어도 30개 염기쌍의 분자내 혼성화를 포함하는 것인 방법.
  100. 제82항에 있어서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제3 프라이머의 혼성화 서열은 모두 서로 ±5℃ 이내의 용융 온도(Tm)를 갖는 것인 방법.
  101. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 5'에서 3'으로 (i) 제1의 3' 말단에 상보성인 서열, (ii) 제2의 3' 말단과 동일한 서열, 및 (iii) (i)과 (ii) 사이의 개재 서열에 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 부분의 조합 길이가 75개 이하의 뉴클레오티드인 방법.
  102. 제54항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 콘카테머를 포함하는 다수의 증폭 산물을 서열결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  103. 제102항에 있어서, 서열결정은 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 미만의 카피를 포함하는 콘카테머로부터 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 갖는 콘카테머를 선택적으로 분리하지 않으면서 수행되는 것인 방법.
  104. 제54항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 2개 미만의 카피를 포함하는 콘카테머로부터 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 포함하는 콘카테머를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피를 포함하는 콘카테머를 서열결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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