JP2009000044A - 核酸増幅法 - Google Patents
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Abstract
【課題】高感度かつ簡便に遺伝子の発現、もしくはその定量を可能にする核酸増幅法の提供。
【解決手段】標的遺伝子１に対して、標的遺伝子を認識する塩基配列部分と、標的遺伝子とは無関係な塩基配列１３，２３とを有する２種類のオリゴヌクレオチドプローブ２１を作用させ、ＤＮＡライゲースを用いて２種類のオリゴヌクレオチドプローブにライゲーションを行い、生じた一本鎖オリゴヌクレオチドに対してＬＡＭＰ増幅を行うことを特徴とする核酸増幅法。
【選択図】図１
【解決手段】標的遺伝子１に対して、標的遺伝子を認識する塩基配列部分と、標的遺伝子とは無関係な塩基配列１３，２３とを有する２種類のオリゴヌクレオチドプローブ２１を作用させ、ＤＮＡライゲースを用いて２種類のオリゴヌクレオチドプローブにライゲーションを行い、生じた一本鎖オリゴヌクレオチドに対してＬＡＭＰ増幅を行うことを特徴とする核酸増幅法。
【選択図】図１
Description
本発明は、核酸(DNAもしくはRNA)増幅方法に関する。より詳しくは、耐熱性ライゲースと鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを用いたLAMP法を組み合わせた恒温核酸増幅法に関する。
生命現象の研究において、DNAやRNAの増幅は様々な目的に用いられている。例えば、ある遺伝子の発現解析及び発現量を定量する方法として、コンペティティブPCR法(非特許文献１)やリアルタイムPCR法(非特許文献２)などが知られている。これらはいずれも一般的な核酸増幅法であるPCR(Polymerase chain reaction)法(非特許文献３)を応用して、増幅された遺伝子から発現量を判定する方法である。
上記解析に用いる核酸増幅法は、二本鎖鋳型DNAの一本鎖への変性、一本鎖鋳型DNAへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖の伸長の3つ、もしくは変性、伸長の2つの工程からなっていて、高温度から低温度へのサイクルを繰り返す工程が不可欠となる。この工程を行うために、PCR法は正確な温度制御を行うことが可能なサーマルサイクラーを使用して行う必要がある。また、装置及び反応液を設定温度にするために要する時間はサイクル数に応じて増大していくため、解析に時間がかかってしまう。
そこで、上記問題点を解決するために恒温状態で実施可能な核酸増幅法が開発された。例えば、NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)法 (非特許文献４)、SDA(strand displacement amplification)法 (非特許文献５)、3SR(self-sustained sequence replication)法 (非特許文献６)、TMA(transcription-mediated amplification)法 (特許文献１)、Qβ replicase amplification法 (特許文献２)、LAMP(loop-mediated isothermal amplification)法 (特許文献３及び非特許文献７)などが主な方法として知られている。これらの恒温核酸増幅法は一定温度で保温された反応混合物中で、プライマーの伸長や、一本鎖伸長産物へのプライマーのアニーリングや、それに続くプライマーの伸長が行われる。
これらの恒温核酸増幅法のうち鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを利用する方法（SDA法、LAMP法）では、増幅の起点となるプライミングサイトを設けるために基質としてdATPのかわりにdATPαSを使用したり（SDA法）や、プライマー伸長産物が自己ループを形成するように設計されている（LAMP法）。このため、SDA法では酵素による基質の取り込み効率が低く、その結果増幅効率が落ちるといった問題や、LAMP法ではプライマー設計が困難でさまざまな検査項目に対して最適のプライマーを設計することが困難であるなどの問題をかかえており、これらの問題を解決できる核酸の恒温核酸増幅方法が求められている。
本発明の主な目的は、従来の恒温増幅法の問題点を解決し、高感度かつ簡便に遺伝子の発現、もしくはその定量を可能にする方法を提供することである。
上記課題を解決するため、発明者らは、DNAライゲースを用いて鋳型核酸に共通配列を導入した後、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを用いて恒温増幅を行なう方法を見出した。
本発明では、標的遺伝子を認識する塩基配列部分と、標的遺伝子とは無関係な塩基配列とを有するオリゴヌクレオチドプローブ2種類を用いる。標的遺伝子を認識して2種類のオリゴヌクレオチドプローブがそれぞれ標的遺伝子に対してハイブリダイズし、DNAライゲースによって2種類のオリゴヌクレオチドプローブがライゲーションされる。ライゲーションされる2種のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つは、5'末端側に標的遺伝子を認識する塩基配列部分を有し、3'末端側に標的遺伝子とは無関係な塩基配列を有する。このオリゴヌクレオチドプローブは5'末端をリン酸化しておく。もう1つのオリゴヌクレオチドプローブは5'末端側に標的遺伝子とは無関係な塩基配列を有し、3'末端側に標的遺伝子を認識する塩基配列部分を有する。
標的遺伝子が存在する場合、2種類のオリゴヌクレオチドプローブはそれぞれの5'末端側と3'末端側で標的遺伝子とハイブリダイズし、DNAライゲースによってライゲーションされる。標的遺伝子が存在しない場合には2種類のオリゴヌクレオチドプローブはライゲーションされず、以降の反応は進行しない。
ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブは、その5'末端と3'末端に標的遺伝子と無関係な塩基配列を有する。これら標的遺伝子と無関係な塩基配列と同一あるいは相補的な配列に対して、LAMP用プライマーを設計し、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを用いて恒温増幅を行う。増幅の起点となる配列は標的遺伝子とは無関係に設計できるため、標的遺伝子が異なる場合でも変更する必要なくユニバーサルに使用できる。また、2種類のオリゴヌクレオチドプローブの標的遺伝子にハイブリダイズする部分だけを変更し、複数の標的遺伝子を同時に検出するマルチプレックス増幅も可能とすることができる。増幅に関係するプライマーは共通に使用可能であるため、オリゴヌクレオチドプローブを複数セット用意し、共通の増幅用プライマーを使用すればよい。
すなわち、本発明は、核酸の増幅方法であって、試料核酸に相補的な第1配列を3’末端に有し前記試料核酸に非相補的な第2配列を5’末端に有する第1プローブと、前記試料核酸に非相補的な第3配列を3’末端に有し前記試料核酸に相補的な第4配列を5’末端に有し、5’末端がリン酸化された第2プローブとを、前記試料核酸にハイブリダイズさせる工程と、前記試料核酸にハイブリダイズした前記第1プローブの3’末端と、前記試料核酸にハイブリダイズした前記第2プローブの5’末端とをライゲーション反応により結合させて鋳型を生成する工程と、以下の（１）〜（７）を繰り返すことによって鋳型を増幅する工程を含む、核酸の増幅方法に関する：
（１）前記鋳型に、前記第3配列に非相補な第5配列を5’末端に有し、前記第3配列の一部に相補な第6配列を3’末端に有する第1プライマーをハイブリダイズさせてから、前記第1プライマーを伸長させ、第1増幅鋳型を得る工程
（２）前記鋳型に、前記第3配列の前記第6配列に相補的な領域よりも3’末端側の領域に相補的な第7配列を有する第2プライマーをハイブリダイズさせてから、鎖置換型ポリメラーゼを用いて前記第2プライマーを伸長させ、前記鋳型から前記第1増幅鋳型を解離させる工程
（３）解離された前記第1増幅鋳型に、前記第2配列の相補配列に非相補な第8配列を5’末端に有し、前記第2配列の一部を含む第9配列を3’末端に有する第3プライマーをハイブリダイズさせてから、前記第3プライマーを伸長させ、第2増幅鋳型を得る工程
（４）解離された前記第1増幅鋳型に、前記第2配列の前記第9配列に相補的な配列よりも5’末端側の領域に相補的な第10配列を有する第4プライマーをハイブリダイズさせてから、鎖置換型ポリメラーゼを用いて前記第4プライマーを伸長させ、前記第1増幅鋳型から前記第2増幅鋳型を解離させる工程
（５）前記第2増幅鋳型の3’末端を起点として相補鎖合成を行う工程
（１）前記鋳型に、前記第3配列に非相補な第5配列を5’末端に有し、前記第3配列の一部に相補な第6配列を3’末端に有する第1プライマーをハイブリダイズさせてから、前記第1プライマーを伸長させ、第1増幅鋳型を得る工程
（２）前記鋳型に、前記第3配列の前記第6配列に相補的な領域よりも3’末端側の領域に相補的な第7配列を有する第2プライマーをハイブリダイズさせてから、鎖置換型ポリメラーゼを用いて前記第2プライマーを伸長させ、前記鋳型から前記第1増幅鋳型を解離させる工程
（３）解離された前記第1増幅鋳型に、前記第2配列の相補配列に非相補な第8配列を5’末端に有し、前記第2配列の一部を含む第9配列を3’末端に有する第3プライマーをハイブリダイズさせてから、前記第3プライマーを伸長させ、第2増幅鋳型を得る工程
（４）解離された前記第1増幅鋳型に、前記第2配列の前記第9配列に相補的な配列よりも5’末端側の領域に相補的な第10配列を有する第4プライマーをハイブリダイズさせてから、鎖置換型ポリメラーゼを用いて前記第4プライマーを伸長させ、前記第1増幅鋳型から前記第2増幅鋳型を解離させる工程
（５）前記第2増幅鋳型の3’末端を起点として相補鎖合成を行う工程
（６）前記第2増幅鋳型の3’末端側に形成されるループに、前記第5配列の少なくとも一部を5’末端に有し、かつ前記第6配列の少なくとも一部を3’末端に有する第5プライマーをハイブリダイズさせ、これを起点として鎖置換型ポリメラーゼを用いて前記第5プライマーを伸長させ、（５）の工程で合成された相補鎖を置換してその3’末端を塩基対結合が可能な状態とする工程、及び
（７）（６）の工程で3’末端を塩基対結合が可能な状態とした鎖を（５）における新たな鋳型とする工程。
前記方法は、さらに、以下の工程を含みうる：
（８）前記新たな鋳型の3’末端を起点として相補鎖合成を行う工程
（９）前記新たな鋳型の3’末端側に形成されるループに、前記第8配列の少なくとも一部を5’末端に有し、かつ前記第9配列の少なくとも一部を3’末端に有する第6プライマーをハイブリダイズさせ、これを起点として鎖置換型ポリメラーゼを用いて前記第6プライマーを伸長させ、（８）の工程で合成された相補鎖を置換してその3’末端を塩基対結合が可能な状態とする工程、及び
（１０）（９）の工程で3’末端を塩基対結合が可能な状態とした鎖を（５）における新たな鋳型とする工程。
（７）（６）の工程で3’末端を塩基対結合が可能な状態とした鎖を（５）における新たな鋳型とする工程。
前記方法は、さらに、以下の工程を含みうる：
（８）前記新たな鋳型の3’末端を起点として相補鎖合成を行う工程
（９）前記新たな鋳型の3’末端側に形成されるループに、前記第8配列の少なくとも一部を5’末端に有し、かつ前記第9配列の少なくとも一部を3’末端に有する第6プライマーをハイブリダイズさせ、これを起点として鎖置換型ポリメラーゼを用いて前記第6プライマーを伸長させ、（８）の工程で合成された相補鎖を置換してその3’末端を塩基対結合が可能な状態とする工程、及び
（１０）（９）の工程で3’末端を塩基対結合が可能な状態とした鎖を（５）における新たな鋳型とする工程。
前記第5プライマーは前記第1プライマーと同一であり、また前記第6プライマーは前記第3プライマーと同一であることが好ましいが、限定されるものではない。
LAMP法では、上記した第1〜第4プライマーに加えて、増幅鋳型の5’側ループにハイブリダイズするループプライマーを用いることができる。そのようなループプライマーとしては、前記第2増幅鋳型の5’末端側に形成されるループにハイブリダイズしうる、前記第8配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する第7プライマー、前記新たな鋳型の5’末端側に形成されるループにハイブリダイズしうる、前記第5配列の少なくとも一部に相補的な配列を有する第8プライマーを挙げることができる。これらのプライマーの利用により、鋳型上の全てのループが増幅に関与し、より高い増幅効率が達成される。
擬陽性反応を防止するため、前記第2プローブの第3配列の3’末端はリン酸化またはアミノ化により修飾されていることが望ましい。
本発明の方法は、複数の標的核酸に対し、2種類の前記オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ作用させ、ライゲーション反応により結合させた後に、前記第1プライマー、第2プライマー、第3プライマー、第4プライマーをそれぞれ作用させれば、同一反応チューブにおいて、複数種類の標的核酸を同時に増幅・検出することができる。
本発明はまた、本発明の核酸増幅法のためのキットを提供する。本発明のキットは、試料核酸に相補的な第1配列を3’末端に有し前記試料核酸に非相補的な第2配列を5’末端に有する第1プローブと、前記試料核酸に非相補的な第3配列を3’末端に有し前記試料核酸に相補的な第4配列を5’末端に有し、5’末端がリン酸化された第2プローブと、前記第3配列に非相補な第5配列を5’末端に有し、前記第3配列の一部に相補な第6配列を3’末端に有する第1プライマーと、前記第3配列の前記第6配列に相補的な領域よりも3’末端側の領域に相補的な第7配列を有する第2プライマーと、前記第2配列の相補配列に非相補な第8配列を5’末端に有し、前記第2配列の一部を含む第9配列を3’末端に有する第3プライマーと、前記第2配列の前記第9配列に相補的な配列よりも5’末端側の領域に相補的な第10配列を有する第4プライマーを必須の構成要素として含む。
前記キットは、さらに、前記第8配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する第7プライマーを含んでいてもよく、さらにまた、前記第5配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する第8プライマーを含んでいてもよい。
なお、キットには、上記したプライマーのほか、鎖置換型DNAポリメラーゼ、リガーゼ、各種反応液等、本発明の増幅方法の実施に必要な他の構成要素を含んでいてもよい。
なお、前述したように、擬陽性反応防止のため、前記第2プローブの第3配列の3’末端はリン酸化またはアミノ化により修飾されていることが望ましい。
本発明では、標的遺伝子に対して、2種類のオリゴヌクレオチドプローブを作用させ、DNAライゲースを用いてライゲーションを行い、生じた一本鎖オリゴヌクレオチドプローブに対してLAMP増幅を行う。これにより、従来、設計が困難であったLAMP増幅プライマーを標的遺伝子配列に関わらずに設計できることになり、プライマーや検出プローブをユニバーサルに利用可能となる。また、従来困難であったLAMP反応におけるマルチプレックス化も容易に実現可能となる。また、本発明では標的核酸の有無を2種類のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーションによって判断し、検出をLAMP法で行うことにより高感度な検出が可能となる。つまり、本発明により、高感度で簡便な核酸増幅法が実現できる。
本発明の第1のフローを図1に示す。本発明は核酸配列を増幅、検出するための方法であって、標的遺伝子1の塩基配列に対して特異的な配列を有する塩基配列12と、標的遺伝子の塩基配列に対して無関係な配列を有する塩基配列13とを有し、5'末端がリン酸化されたオリゴヌクレオチドプローブ11と、標的遺伝子1の塩基配列に対して特異的な配列を有する塩基配列22と、標的遺伝子の塩基配列に対して無関係な配列を有する塩基配列23とを有するオリゴヌクレオチドプローブ21と、標的遺伝子1の塩基配列に対して無関係な塩基配列13の一部である塩基配列31と相補的な塩基配列32を3'末端側に有し、塩基配列31よりも5'末端側に位置する塩基配列13の一部である塩基配列33と同一の配列を5'末端側に有するプライマー35と、塩基配列31よりも3'末端側に位置する塩基配列13の一部である塩基配列36と相補的な塩基配列を有するプライマー37と、標的遺伝子1の塩基配列に対して無関係な塩基配列23の一部である塩基配列41と同一の配列を3'末端側に有し、塩基配列41よりも3'末端側に位置する塩基配列23の一部である塩基配列43と相補的な配列44を5'末端側に有するプライマー45と、塩基配列41よりも5'末端側に位置する塩基配列23の一部である塩基配列46と同一の塩基配列を有するプライマー47とを用いる。本発明の方法は、前記標的遺伝子1に対してオリゴヌクレオチドプローブ11とオリゴヌクレオチドプローブ21をハイブリダイズさせ、ライゲーション反応によりオリゴヌクレオチドプローブ11とオリゴヌクレオチドプローブ21とを結合させる第1の工程と、第1の工程の結果得られるオリゴヌクレオチドプローブ結合体25に対して、プライマー35とプライマー37とプライマー45とプライマー47を作用させて、二本鎖DNAを増幅させる第2の工程とを有することを特徴とする。ライゲーションのためのリガーゼとしては、Pfu DNAリガーゼ、Taq DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ、E. coli DNAリガーゼ等を用いることができる。
第2の工程は、実質的にはオリゴヌクレオチドプローブ結合体25を鋳型としてLAMP反応を行い、増幅産物を得る工程である。従って本発明において使用するDNAポリメラーゼは鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼである。鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼとしては、Bst DNAポリメラーゼ、phi29 DNAポリメラーゼ、Klenow Fragment、Klenow Fragment(3'→5' exo) Vent DNAポリメラーゼ、Vent (exo-) DNAポリメラーゼ、Deep Vent DNAポリメラーゼ、Deep Vent (exo-) DNAポリメラーゼ, 9 Nm DNAポリメラーゼ、TherminatorDNAポリメラーゼ等を挙げることができる。第2の工程では、一本鎖DNAであるオリゴヌクレオチドプローブ結合体25に対してプライマー35とプライマー37とを作用させてループ構造を有するDNA53を得た後に、プライマー35とプライマー37とプライマー45とプライマー47とをループ構造を有するDNA53に作用させてLAMP反応における増幅の起点となるダンベル構造を有するDNA56を得て、最終的に増幅産物を得る。
このうち、増幅の起点となるダンベル構造を有するDNA56を得るまでの詳細を図2に示す。標的遺伝子1の塩基配列に対して特異的な配列を有する塩基配列12と、標的遺伝子の塩基配列に対して無関係な配列を有する塩基配列13とを有し、5'末端がリン酸化されたオリゴヌクレオチドプローブ11と、標的遺伝子1の塩基配列に対して特異的な配列を有する塩基配列22と、標的遺伝子の塩基配列に対して無関係な配列を有する塩基配列23とを有するオリゴヌクレオチドプローブ21とをハイブリダイズさせる。ライゲーション反応により、5'末端がリン酸化されたオリゴヌクレオチドプローブ11とオリゴヌクレオチドプローブ21を結合させて、オリゴヌクレオチドプローブ結合体25を得る。
標的遺伝子1の塩基配列に対して無関係な塩基配列13の一部である塩基配列31と相補的な塩基配列32を3'末端側に有し、塩基配列31よりも5'末端側に位置する塩基配列13の一部である塩基配列33と同一の配列を5'末端側に有するプライマー35と、塩基配列31よりも3'末端側に位置する塩基配列13の一部である塩基配列36と相補的な塩基配列を有するプライマー37とを、得られた一本鎖DNAであるオリゴヌクレオチドプローブ結合体25に対してハイブリダイズさせ、伸長させる。まずプライマー35が、鋳型となるオリゴヌクレオチドプローブ結合体25に対して伸長し、一本鎖DNA51となる。一本鎖DNA51とオリゴヌクレオチドプローブ結合体25はハイブリダイズしており、二本鎖DNA61の状態となる。次にプライマー37が二本鎖DNA61から一本鎖DNA51を剥がしながら伸長し、一本鎖DNA52となる。一本鎖DNA52とオリゴヌクレオチドプローブ結合体25はハイブリダイズしており、二本鎖DNA62の状態となる。オリゴヌクレオチドプローブ結合体25から剥がされた一本鎖DNA51は5'末端に塩基配列33を有し、鋳型であるオリゴヌクレオチドプローブ25に含まれる塩基配列33の相補鎖に相当する部分の配列も有するため、分子内でハイブリダイズし、3'末端にループ構造を有するDNA53となる。
ループ構造を有するDNA53は、鋳型であるオリゴヌクレオチドプローブ結合体25に含まれる塩基配列41、塩基配列43、塩基配列46それぞれの相補的な塩基配列を有する。つまり5'末端側に塩基配列46に相補な塩基配列66、塩基配列66より3'末端側には塩基配列41に相補的な塩基配列64、塩基配列64より3'末端側には塩基配列43に相補的な塩基配列44を有する。塩基配列64に対して、塩基配列41を3'末端側に有し、塩基配列44を5'末端側に有するプライマー45と、プライマー47とを、ループ構造を有するDNA53に対してハイブリダイズさせ、伸長させる。まずプライマー45が、ループ構造を有するDNA53を鋳型として伸長し、一本鎖DNA54となる。一本鎖DNA54はループ構造を有するDNA53のループ構造をほどきながら伸長してハイブリッドを形成するため、二本鎖DNA71が生成する。次にプライマー47が二本鎖DNA71から一本鎖DNA54を剥がしながら伸長し、一本鎖DNA55となる。一本鎖DNA55も、一本鎖DNA54を剥がしながらハイブリッドを形成するため、二本鎖DNA72が生成する。剥がされた一本鎖DNA54は、5'末端に塩基配列44を有し、鋳型である一本鎖DNA 53は塩基配列44に相補的な塩基配列43を有するため、分子内でハイブリダイズし、5'末端にループ構造を形成する。また、一本鎖DNA54はループ構造を有するDNA53を鋳型として合成されるため、3'末端に塩基配列33の相補的な配列を有し、内部に塩基配列33の配列を有するため、3'末端にもループ構造を有するDNAとなり、5'末端と3'末端の両方にループ構造を有するダンベル構造を有するDNA56となる。このダンベル構造を有するDNA56がLAMP反応の増幅の起点となる。
ダンベル構造を有するDNA56が増幅の起点となるLAMP反応を図3に示すが、詳細は、既報（T. Notomi, et al., Nucleic Acids Research, 28, e63 (2000)）を参照されたい。ダンベル構造を有するDNA56は、3'末端にループ構造を形成しているため、伸長し、ループ構造部分にプライマー35がハイブリダイズしてDNA構造81となる。DNA構造81にハイブリダイズしたプライマー35は、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼにより二本鎖部分を剥がしながら伸長し、DNA構造82となる。
このDNA構造82は、その3'末端にループ構造を形成するため、当該3’末端部分から伸長して、プライマー35からの伸長鎖を解離させ、DNA構造85となる解離されたプライマー35からの伸長鎖はDNA56に相補であるから、ダンベル構造を有するDNA84となる。
ダンベル構造を有するDNA84は、前記したプロセスと同様のプロセスで、ダンベル構造を有するDNA56を再生させる。すなわち、DNA84はループ構造を形成している3'末端から自己伸長するとともに、ループ構造部分にプライマー45がハイブリダイズしてDNA構造86となる。DNA構造86にハイブリダイズしたプライマー45は、鎖置換型活性を有するDNAポリメラーゼにより二本鎖部分を剥がしながら伸長し、DNA構造87となる。
このDNA構造87は、その3'末端にループ構造を形成するため、当該3’末端部分から自己伸長して、プライマー45からの伸長鎖を解離させ、DNA構造88となる。解離されたプライマー45からの伸長鎖はDNA84に相補、すなわちDNA56と同一であり、これが新たな鋳型となって、増幅反応が進む。
上記の増幅工程ではダンベル構造を有するDNAの3’末端側のループ部分しか増幅反応に関与していないが、さらに5’末端側のループ部分に相補なプライマー（LAMP法のループプライマー）を用いることにより、全てのループが増幅反応に利用され、より高効率の増幅が可能となる。本発明においても、このようなループプライマーを利用することができる。
以上のように、本発明によれば、標的遺伝子の有無に対応してオリゴヌクレオチドプローブのライゲーション反応を行い、得られたオリゴヌクレオチドプローブ結合体の標的遺伝子の配列とは無関係な部分に設定したプライマーを用いてオリゴヌクレオチドプローブ結合体を鋳型としてLAMP反応を行う。具体的には、標的遺伝子の配列とは無関係な配列の一部と相補的な配列を3'末端部分に有し、5'末端部分には3'末端部分の相補的な配列の伸長方向にある鋳型配列と同一の塩基配列を有するプライマーと、前記プライマー伸長産物を、鎖置換型活性を有するDNAポリメラーゼによって剥がせるように前記プライマーが鋳型にハイブリダイズする位置よりも5'末端側にハイブリダイズするように設計したプライマーを、フォワード側とリバース側にそれぞれ用いてLAMP反応を行う。従来のLAMP反応ではプライマー設計が困難で、擬陽性反応が起こらないプライマーセットを得るために試行錯誤が必要であったが、本発明によれば、標的遺伝子の配列とは無関係な領域に設計したプライマーを用いるため、標的遺伝子が変わってもオリゴヌクレオチドプローブの標的遺伝子の配列に相補的な配列の部分だけを変更すれば良く、プライマーセットはユニバーサルに使用できる。つまり、プライマー設計に苦労することなく簡単にLAMP反応の反応系を設定できるようになる。
本発明の第2の発明フローを図4に示す。標的RNA101に対して、特異的な配列を有するプライマー102を用いて逆転写反応を行う。逆転写反応と、それに続くRNaseH処理により、cDNA105を得る。5'末端側にcDNA105に対して特異的な配列を有し、3'末端側にcDNA105に無関係な配列を有し、5'末端がリン酸化されたオリゴヌクレオチドプローブ106と、5'末端側にcDNA105に無関係な配列を有し、3'末端側にcDNAに対して特異的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ107をcDNA105にハイブリダイズさせる。その後、ライゲーション反応により、オリゴヌクレオチドプローブ106とオリゴヌクレオチドプローブ107を結合させて、オリゴヌクレオチドプローブ結合体108を得る。
後は第1の発明フローと同様に、オリゴヌクレオチドプローブ結合体の標的遺伝子の配列とは無関係な配列部分に設計したプライマーを用いてオリゴヌクレオチドプローブ結合体を鋳型としてLAMP反応を行う。まず、オリゴヌクレオチドプローブ結合体108の標的遺伝子の配列とは無関係に設定したフォワード側のプライマー111とプライマー112をオリゴヌクレオチドプローブ結合体108にハイブリダイズさせ、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを用いて伸長させる。プライマー111はオリゴヌクレオチドプローブ106の標的遺伝子の配列とは無関係な配列部分にハイブリダイズする配列を3'末端に有し、5'末端側には、3'末端が伸長すると合成される配列に相補的な配列（つまり鋳型であるオリゴヌクレオチドプローブ106の標的遺伝子の配列とは無関係な配列部分の一部の配列で、プライマー111の3'末端がハイブリダイズして伸長した場合に鋳型となる配列と同一の配列）を有するように設計される。また、プライマー112は、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼの伸長反応によってプライマー111の伸長産物を剥がすことが出来るように、プライマー111がハイブリダイズする位置よりも上流側にハイブリダイズするように設計される。プライマー111の伸長産物115はプライマー112によって鋳型から剥がされるが、5'末端にループ構造を形成する。
プライマー111の伸長産物115に対して、プライマー121とプライマー122をハイブリダイズさせて、鎖置換型活性を有するDNAポリメラーゼを用いて伸長させる。プライマー121は、オリゴヌクレオチドプローブ107の標的遺伝子の配列とは無関係な配列部分の相補的配列に対して、ハイブリダイズする配列を3'末端に有し、5'末端側には、3'末端からの伸長によって合成される配列に相補的な配列（つまり鋳型となるオリゴヌクレオチドプローブ107の標的遺伝子の配列とは無関係な配列部分の一部の配列で、プライマー121の3'末端がハイブリダイズして伸長した場合に鋳型となる配列と同一の配列）を有するように設計される。また、プライマー122は、鎖置換型活性を有するDNAポリメラーゼの伸長反応によってプライマー121の伸長産物を剥がすことが出来るように、プライマー121がハイブリダイズする位置よりも上流側にハイブリダイズするように設計される。プライマー121の伸長産物116はプライマー122によって鋳型から剥がされるが、5'末端と3'末端の両方にループ構造を持ったダンベル型構造を有するDNA116となる。このダンベル構造を有するDNA116がLAMP反応の増幅の起点となる。つまり、標的RNAの有無に対応して、2種のオリゴヌクレオチドプローブがライゲーションしたライゲーション産物が生成し、ライゲーション産物に対して、標的RNAの塩基配列に無関係な配列に対して作用するプライマーセットを用いてLAMP反応を行い、増幅産物の有無から、標的RNAの有無を判定することができる。別のRNAを標的とする場合も、逆転写用のプライマーと、2種類のオリゴヌクレオチドプローブの標的RNAの塩基配列に特異的な配列部分だけを変更すれば、同様の反応様式でRNAの有無を判定できる。従ってLAMP反応用のプライマーを設計するために試行錯誤する必要がなく、ユニバーサルに使用できるプライマーセットを提供できる。
本発明の第3の発明フローを図5に示す。複数の標的遺伝子131、141、151それぞれに対して、5'末端側に標的遺伝子に特異的な配列を有し、3'末端側に標的遺伝子に無関係な配列を有し、5'末端がリン酸化されたオリゴヌクレオチドプローブ132、142、152と、5'末端側に標的遺伝子と無関係な配列を有し、3'末端側に標的遺伝子に特異的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ133、143、153をハイブリダイズさせる。その後、ライゲーション反応により、オリゴヌクレオチドプローブ結合体135、145、155を得る。
後は第1の発明フローと同様に、オリゴヌクレオチドプローブ結合体の標的遺伝子とは無関係な配列部分に設計したプライマー161、162、163、164を用いてLAMP反応を行い、増幅産物を得る。このようにして本発明により従来困難であったLAMP反応のマルチプレックス化が可能となる。LAMP反応用のプライマーを設計するには、プライマーダイマーに起因する擬陽性反応を防ぐことが重要であり、1つの反応系についてプライマーを4種類使用するLAMP反応は2種のプライマーで増幅反応が進行するPCR法、TMA法、NASBA法などと比較してプライマー設計が困難であった。このため、LAMP反応をマルチプレックス化することは現実的にはほぼ不可能であった。本発明によれば、標的遺伝子とは無関係な配列に、アダプターと同一の配列を5'末端に含むプライマーを設計することでどのような標的遺伝子に対しても共通に使用できるLAMP反応用プライマーを提供できる。つまり、オリゴヌクレオチドプローブの標的遺伝子に特異的な配列部分だけを変更するだけでどのような標的遺伝子に対しても同じLAMP反応用プライマーを使用できる。同じプライマーを使用するため、当然のことであるが反応温度などの条件を一定にすることができ、簡単に増幅反応のマルチプレックス化が可能となる。
以下に、本発明の実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
〔実施例1〕
1.実施例1で使用したプライマー
マウスGAPDHのmRNA逆転写用プライマー
5'- aactttattg atggtattca -3'（配列番号1）
フォワード側、内側プライマー
5'- tgctgggtcg gcacagcctg aagctgacct gaaatacctg gcctg -3'（配列番号2）
フォワード側、外側プライマー
5'- gggtgtgtaa agctgtg -3'（配列番号3）
リバース側、内側プライマー
5'-ttgttcctga tgcagtgggc agtctgcggc ggtgttctg -3'（配列番号4）
リバース側、外側プライマー
5'- tgcttgtggc ctctcgtg -3'（配列番号5）
〔実施例1〕
1.実施例1で使用したプライマー
マウスGAPDHのmRNA逆転写用プライマー
5'- aactttattg atggtattca -3'（配列番号1）
フォワード側、内側プライマー
5'- tgctgggtcg gcacagcctg aagctgacct gaaatacctg gcctg -3'（配列番号2）
フォワード側、外側プライマー
5'- gggtgtgtaa agctgtg -3'（配列番号3）
リバース側、内側プライマー
5'-ttgttcctga tgcagtgggc agtctgcggc ggtgttctg -3'（配列番号4）
リバース側、外側プライマー
5'- tgcttgtggc ctctcgtg -3'（配列番号5）
2.実施例1で使用したオリゴヌクレオチドプローブ
マウスGAPDH遺伝子検出用リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ（5'末端側は標的遺伝子に特異的な配列(下線部)、3'末端側は標的遺伝子に無関係な配列）
5'-(P) gaggggccta gggagccctc tgctgggtcg gcacagcctg aatgaagaca caggccaggt atttcaggtc agccacagct ttacacaccc-3'（配列番号6）
マウスGAPDH遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ（5'末端側は標的遺伝子に無関係な配列、3'末端側は標的遺伝子に特異的な配列(下線部)）
5'- tgcttgtggc ctctcgtgag tctgcggcgg tgttctggtg cacctgccca ctgcatcagg aacaaccaga cccccataat aacag
-3'（配列番号7）
マウスGAPDH遺伝子検出用リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ（5'末端側は標的遺伝子に特異的な配列(下線部)、3'末端側は標的遺伝子に無関係な配列）
5'-(P) gaggggccta gggagccctc tgctgggtcg gcacagcctg aatgaagaca caggccaggt atttcaggtc agccacagct ttacacaccc-3'（配列番号6）
マウスGAPDH遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ（5'末端側は標的遺伝子に無関係な配列、3'末端側は標的遺伝子に特異的な配列(下線部)）
5'- tgcttgtggc ctctcgtgag tctgcggcgg tgttctggtg cacctgccca ctgcatcagg aacaaccaga cccccataat aacag
-3'（配列番号7）
3.実施例１で使用した反応液の組成。括弧内は終濃度の値を示す。
Tris-HCl pH8.2 (20 mM), KCl (10 mM), (NH4)2SO4 (10 mM), MgSO4 (4 mM),DTT (0.5 mM), dATP (1.4 mM), dCTP (1.4 mM), dGTP (1.4 mM), dTTP (1.4 mM), TritonX-100 (0.1%), BSA(0.1 mg/mL)
Tris-HCl pH8.2 (20 mM), KCl (10 mM), (NH4)2SO4 (10 mM), MgSO4 (4 mM),DTT (0.5 mM), dATP (1.4 mM), dCTP (1.4 mM), dGTP (1.4 mM), dTTP (1.4 mM), TritonX-100 (0.1%), BSA(0.1 mg/mL)
4.実施例１で使用した酵素の組成。
Bst DNAポリメラーゼ 8U、Pfu由来耐熱性ライゲース 2.0U
Bst DNAポリメラーゼ 8U、Pfu由来耐熱性ライゲース 2.0U
本発明の第2の発明フローを用いて標的遺伝子の増幅が可能かを確認するために、増幅産物を電気泳動で検出した。鋳型はマウスのグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(略称GAPDH遺伝子、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)を用い、GAPDH遺伝子のmRNAを逆転写するために上記1.に記載の逆転写用プライマーをプライマー102として使用した。逆転写反応は従来法に従って行った。次にRNaseHを作用させてmRNAを分解し、得られたcDNAに上記1.に記載のオリゴヌクレオチドプローブ2種類をハイブリダイズさせて、耐熱性ライゲースでライゲーションさせると同時に、上記1.に記載のフォワード側内側プライマー、フォワード側外側プライマー、リバース側内側プライマー、リバース側外側プライマーを作用させてBst DNAポリメラーゼ増幅反応を行った。
オリゴヌクレオチドプローブ106は5'末端がリン酸化され、5'末端には標的遺伝子であるcDNAに特異的な配列（配列中の下線部）を有し、3'末端側には標的遺伝子に無関係な配列を有する。また、オリゴヌクレオチドプローブ107は5'末端側には標的遺伝子に無関係な配列、3'末端側には標的遺伝子であるcDNAに特異的な配列(配列中の下線部)を有する。
プライマー111はフォワード側内側プライマーであり、3'末端側にオリゴヌクレオチドプローブ106の標的遺伝子に無関係な配列部分にハイブリダイズする配列を有し、5'末端側にオリゴヌクレオチドプローブ106の標的遺伝子に無関係な配列部分と同一配列を有する。プライマー112はフォワード側外側プライマーであり、オリゴヌクレオチドプローブ106にハイブリダイズする配列を有する。
プライマー111とプライマー112を、鎖置換型活性を有するDNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼで伸長させ、プライマー111の伸長産物115を得る。伸長産物に対してプライマー121とプライマー122をハイブリダイズさせ、鎖置換型活性を有するDNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼで伸長させる。実質的には、プライマー111、プライマー112、プライマー121、プライマー122は逆転写プライマーと同時に反応チューブに入れ、耐熱性DNAライゲース、RNaseH、Bst DNAポリメラーゼの酵素や反応の基質、緩衝液を同時に反応チューブに投入した。
本発明に関わる増幅反応液の組成及び酵素の組成の具体例は上記2.及び3.に示す。鋳型となるマウスmRNA、プライマーを含む反応液を65℃に設定したヒートブロックに設置して90分間インキュベートした。その後、得られた反応生成物をアガロースゲルを用いて電気泳動分析した。電気泳動結果を図6の電気泳動イメージ171に示す。左右2つのMを記すレーンMにはマーカーをローディングし、レーン1〜6にはそれぞれ反応産物をローディングした。マウスRNAから逆転者反応とライゲーション、増幅反応からなる本発明の反応を実施したサンプルをローディングしたレーン1〜3では、ラダー状の増幅産物が確認された。一方、陰性対照をローディングしたレーン4と5では増幅産物は検出されなかった。この結果は本発明の第2の方法により目的の増幅産物が得られることを示しており、本発明を用いて遺伝子を増幅し、検出できることが確認できた。
〔実施例2〕
1.実施例2で使用したプライマー（配列番号2〜5は実施例1で使用したプライマーと同じ）
mRNA逆転写用オリゴdTプライマー
5'- tttttttttt tttttttt -3'（配列番号8）
フォワード側、内側プライマー
5'- tgctgggtcg gcacagcctg aagctgacct gaaatacctg gcctg -3'（配列番号2）
フォワード側、外側プライマー
5'- gggtgtgtaa agctgtg -3'（配列番号3）
リバース側、内側プライマー
5'-ttgttcctga tgcagtgggc agtctgcggc ggtgttctg -3'（配列番号4）
リバース側、外側プライマー
5'- tgcttgtggc ctctcgtg -3'（配列番号5）
1.実施例2で使用したプライマー（配列番号2〜5は実施例1で使用したプライマーと同じ）
mRNA逆転写用オリゴdTプライマー
5'- tttttttttt tttttttt -3'（配列番号8）
フォワード側、内側プライマー
5'- tgctgggtcg gcacagcctg aagctgacct gaaatacctg gcctg -3'（配列番号2）
フォワード側、外側プライマー
5'- gggtgtgtaa agctgtg -3'（配列番号3）
リバース側、内側プライマー
5'-ttgttcctga tgcagtgggc agtctgcggc ggtgttctg -3'（配列番号4）
リバース側、外側プライマー
5'- tgcttgtggc ctctcgtg -3'（配列番号5）
2.実施例1で使用したオリゴヌクレオチドプローブ
ヒトβアクチン遺伝子検出用リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ（5'末端側は標的遺伝子に特異的な配列(下線部)、3'末端側は標的遺伝子に無関係な配列）
5'-(P) tcctcctgag cgcaagtatg ctgggtcggc acagcctgaa tgaagacaca ggccaggtat ttcaggtcag ccacagcttt acacaccc-3'（配列番号9）
ヒトβアクチン遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ（5'末端側は標的遺伝子に無関係な配列、3'末端側は標的遺伝子に特異的な配列(下線部)）
5'- tgcttgtggc ctctcgtgag tctgcggcgg tgttctggtg cacctgccca ctgcatcagg aacaacaatg aagatcaaga tcattgc -3'（配列番号10）
ヒトβアクチン遺伝子検出用モレキュラービーコン
5'‐cgacgtcaag atcattgctc ctcctgacgt cg‐3'（配列番号11）
ヒトHPRT遺伝子検出用リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ（5'末端側は標的遺伝子に特異的な配列(下線部)、3'末端側は標的遺伝子に無関係な配列）
5'-(P) gcccttgact ataatgaata ctttgctggg tcggcacagc ctgaatgaag acacaggcca ggtatttcag gtcagccaca gctttacaca ccc-3'（配列番号12）
ヒトHPRT遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ（5'末端側は標的遺伝子に無関係な配列、3'末端側は標的遺伝子に特異的な配列(下線部)）
5'- tgcttgtggc ctctcgtgag tctgcggcgg tgttctggtg cacctgccca ctgcatcagg aacaacagac aagtttgttg taggatat -3'（配列番号13）
ヒトHPRT遺伝子検出用モレキュラービーコン
5'‐cgacgttgta ggatatgccc ttgactatac gtcg‐3'（配列番号14）
ヒトβアクチン遺伝子検出用リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ（5'末端側は標的遺伝子に特異的な配列(下線部)、3'末端側は標的遺伝子に無関係な配列）
5'-(P) tcctcctgag cgcaagtatg ctgggtcggc acagcctgaa tgaagacaca ggccaggtat ttcaggtcag ccacagcttt acacaccc-3'（配列番号9）
ヒトβアクチン遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ（5'末端側は標的遺伝子に無関係な配列、3'末端側は標的遺伝子に特異的な配列(下線部)）
5'- tgcttgtggc ctctcgtgag tctgcggcgg tgttctggtg cacctgccca ctgcatcagg aacaacaatg aagatcaaga tcattgc -3'（配列番号10）
ヒトβアクチン遺伝子検出用モレキュラービーコン
5'‐cgacgtcaag atcattgctc ctcctgacgt cg‐3'（配列番号11）
ヒトHPRT遺伝子検出用リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ（5'末端側は標的遺伝子に特異的な配列(下線部)、3'末端側は標的遺伝子に無関係な配列）
5'-(P) gcccttgact ataatgaata ctttgctggg tcggcacagc ctgaatgaag acacaggcca ggtatttcag gtcagccaca gctttacaca ccc-3'（配列番号12）
ヒトHPRT遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ（5'末端側は標的遺伝子に無関係な配列、3'末端側は標的遺伝子に特異的な配列(下線部)）
5'- tgcttgtggc ctctcgtgag tctgcggcgg tgttctggtg cacctgccca ctgcatcagg aacaacagac aagtttgttg taggatat -3'（配列番号13）
ヒトHPRT遺伝子検出用モレキュラービーコン
5'‐cgacgttgta ggatatgccc ttgactatac gtcg‐3'（配列番号14）
3.実施例2で使用した反応液の組成。括弧内は終濃度の値を示す。
Tris-HCl pH8.2 (20 mM), KCl (10 mM), (NH4)2SO4 (10 mM), MgSO4 (4 mM),DTT (0.5 mM), dATP (1.4 mM), dCTP (1.4 mM), dGTP (1.4 mM), dTTP (1.4 mM), TritonX-100 (0.1%), BSA(0.1 mg/mL)
Tris-HCl pH8.2 (20 mM), KCl (10 mM), (NH4)2SO4 (10 mM), MgSO4 (4 mM),DTT (0.5 mM), dATP (1.4 mM), dCTP (1.4 mM), dGTP (1.4 mM), dTTP (1.4 mM), TritonX-100 (0.1%), BSA(0.1 mg/mL)
4.実施例１で使用した酵素の組成。
Bst DNAポリメラーゼ 8U、Pfu由来耐熱性ライゲース 2.0U
Bst DNAポリメラーゼ 8U、Pfu由来耐熱性ライゲース 2.0U
本発明の第3の発明フローを用いて標的遺伝子の増幅が可能かを確認するために、増幅産物をリアルタイム検出装置を用いて検出した。鋳型はヒトの結腸由来培養細胞HT29から抽出したRNAを用い、抽出したRNAを逆転写するために上記1.に記載の逆転写用オリゴdTプライマーを使用した。次にRNaseHを作用させて、mRNAを分解し、cDNAを作製した。具体的には鋳型となる検体RNA、逆転写用プライマーを含む反応液を42℃に設定したヒートブロックに設置して30分間インキュベートした。
得られたcDNAに上記1.に記載のオリゴヌクレオチドプローブ（合計4種類）を、標的であるβアクチン(beta-actin) cDNAやヒポキサンチンリボシル転移酵素(hypoxanthine phosphoribosyltransferase)cDNAにハイブリダイズさせて、耐熱性ライゲースでライゲーションさせた。ライゲーションと同時に上記1.に記載のフォワード側内側プライマー、フォワード側外側プライマー、リバース側内側プライマー、リバース側外側プライマーを作用させてBst DNAポリメラーゼ増幅反応を行った。検出プローブとして上記2.に記載のモレキュラービーコンプローブを使用した。ヒトβアクチン遺伝子検出用モレキュラービーコンプローブは5'末端がFAM、3'末端がBHQ1で標識されており、5'末端から1〜6塩基と、27〜32塩基はステム配列、7〜26塩基は増幅産物とハイブリダイズする配列である。また、ヒトHPRT遺伝子検出用モレキュラービーコンプローブは5'末端がVIC、3'末端がBHQ1で標識されており、5'末端から1〜6塩基と、28〜34塩基はステム配列、7〜27塩基は増幅産物とハイブリダイズする配列である。
増幅反応液の組成及び酵素の組成の具体例は上記3.及び4.に示す。得られた逆転写産物に4種のオリゴヌクレオチドプローブと4種の増幅用プライマーと2種の検出用モレキュラービーコンを含む反応液を63℃に設定したリアルタイムPCR検出装置(ストラタジーン)に設置して、反応液の蛍光強度の時間変化を90分間測定した。測定結果を図7のグラフ181に示す。横軸は時間、縦軸はFAMおよびVICの蛍光強度を示し、プロットは増幅産物に由来する蛍光強度を示す。グラフ中黒四角のプロットで示すFAMの蛍光強度と黒丸のプロットで示すVICの蛍光強度は反応開始約10分から30分までに上昇した。FAMの蛍光強度はヒトβアクチン遺伝子の増幅を示し、VICの蛍光強度はヒトHPRT遺伝子の増幅を示している。このことから、この2つの遺伝子を一度に増幅・検出できることが確認できた。一方、グラフ中白四角で示すFAMの蛍光強度と、白丸で示すVICの蛍光強度は陰性コントロールからの反応結果を示している。逆転写産物を含まない陰性コントロールのグラフは蛍光強度は反応時間90分間の間、ほぼ一定値であり時間とともに変化していなかった。このことから陰性対照からは増幅反応が起こらないことが確認できた。これらの結果から、本発明の第3のフローにより標的RNAをマルチプレックス増幅し、検出できることが確認できた。
本発明によれば、標的核酸の有無を2種類のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーションによって判断し、検出をLAMP法で行うことにより高感度な検出が可能となる。また、標的核酸の配列によらず共通のプライマーでLAMP増幅が可能となり、高感度で簡便な核酸増幅法が実現できる。さらに、共通プライマーの利用によりLAMP法のマルチプレックス化が可能となる。したがって、本発明は、微量核酸の増幅を必要とする、遺伝子診断等の医療分野、ライフサイエンス分野などにおいて有用である。
1、131、141、151…標的遺伝子
11、106、132、142、152…リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ
12、22…標的遺伝子に対して特異的な塩基配列
13、23…標的遺伝子に対して無関係な塩基配列
21、107、133、143、153…オリゴヌクレオチドプローブ
25、108、135、145、155…オリゴヌクレオチドプローブ結合体
31、32、33、36、41、43、44、46、64、66…塩基配列
35、37、45、47、102、111、112、121、122、161、162、163、164…プライマー
51、52、54、55…一本鎖DNA
53…ループ構造を有するDNA
56…ダンベル構造を有するDNA
61、62、71、72…二本鎖DNA
81、82、83、85、86、87、88…DNA構造
84、116…ダンベル構造を有するDNA
101…標的RNA
105…cDNA
115…伸長産物
171…電気泳動イメージ
181…増幅産物のリアルタイム検出結果のグラフ
11、106、132、142、152…リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ
12、22…標的遺伝子に対して特異的な塩基配列
13、23…標的遺伝子に対して無関係な塩基配列
21、107、133、143、153…オリゴヌクレオチドプローブ
25、108、135、145、155…オリゴヌクレオチドプローブ結合体
31、32、33、36、41、43、44、46、64、66…塩基配列
35、37、45、47、102、111、112、121、122、161、162、163、164…プライマー
51、52、54、55…一本鎖DNA
53…ループ構造を有するDNA
56…ダンベル構造を有するDNA
61、62、71、72…二本鎖DNA
81、82、83、85、86、87、88…DNA構造
84、116…ダンベル構造を有するDNA
101…標的RNA
105…cDNA
115…伸長産物
171…電気泳動イメージ
181…増幅産物のリアルタイム検出結果のグラフ
配列番号1 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、マウスGAPDH遺伝子の逆転写用プライマー
配列番号2 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、フォワード側、内側のプライマー
配列番号3 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、フォワード側、外側のプライマー
配列番号4 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、リバース側、内側のプライマー
配列番号5 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、リバース側、外側のプライマー
配列番号6 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、マウスGAPDH遺伝子検出用リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号7 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、マウスGAPDH遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号8 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、オリゴdTプライマー
配列番号9 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、ヒトβアクチン遺伝子検出用リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号10 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、ヒトβアクチン遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号11 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、ヒトβアクチン遺伝子検出用モレキュラービーコン
配列番号12 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、ヒトHPRT遺伝子検出用リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号13 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、ヒトHPRT遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号14 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、ヒトHPRT遺伝子検出用モレキュラービーコン
配列番号2 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、フォワード側、内側のプライマー
配列番号3 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、フォワード側、外側のプライマー
配列番号4 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、リバース側、内側のプライマー
配列番号5 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、リバース側、外側のプライマー
配列番号6 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、マウスGAPDH遺伝子検出用リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号7 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、マウスGAPDH遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号8 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、オリゴdTプライマー
配列番号9 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、ヒトβアクチン遺伝子検出用リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号10 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、ヒトβアクチン遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号11 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、ヒトβアクチン遺伝子検出用モレキュラービーコン
配列番号12 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、ヒトHPRT遺伝子検出用リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号13 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、ヒトHPRT遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号14 ‐人工配列の説明：本発明の増幅方法で使用する、ヒトHPRT遺伝子検出用モレキュラービーコン
Claims (12)
- 核酸の増幅方法であって、
試料核酸に相補的な第1配列を3’末端に有し前記試料核酸に非相補的な第2配列を5’末端に有する第1プローブと、前記試料核酸に非相補的な第3配列を3’末端に有し前記試料核酸に相補的な第4配列を5’末端に有し、5’末端がリン酸化された第2プローブとを、前記試料核酸にハイブリダイズさせる工程と、
前記試料核酸にハイブリダイズした前記第1プローブの3’末端と、前記試料核酸にハイブリダイズした前記第2プローブの5’末端とをライゲーション反応により結合させて鋳型を生成する工程と、
以下の（１）〜（７）を繰り返すことによって前記試料核酸由来の鋳型を増幅する工程を含む、核酸増幅方法。
（１）前記鋳型に、前記第3配列に非相補な第5配列を5’末端に有し、前記第3配列の一部に相補な第6配列を3’末端に有する第1プライマーをハイブリダイズさせてから、前記第1プライマーを伸長させ、第1増幅鋳型を得る工程
（２）前記鋳型に、前記第3配列の前記第6配列に相補的な領域よりも3’末端側の領域に相補的な第7配列を有する第2プライマーをハイブリダイズさせてから、鎖置換型ポリメラーゼを用いて前記第2プライマーを伸長させ、前記鋳型から前記第1増幅鋳型を解離させる工程
（３）解離された前記第1増幅鋳型に、前記第2配列の相補配列に非相補な第8配列を5’末端に有し、前記第2配列の一部を含む第9配列を3’末端に有する第3プライマーをハイブリダイズさせてから、前記第3プライマーを伸長させ、第2増幅鋳型を得る工程
（４）解離された前記第1増幅鋳型に、前記第2配列の前記第9配列に相補的な配列よりも5’末端側の領域に相補的な第10配列を有する第4プライマーをハイブリダイズさせてから、鎖置換型ポリメラーゼを用いて前記第4プライマーを伸長させ、前記第1増幅鋳型から前記第2増幅鋳型を解離させる工程
（５）前記第2増幅鋳型の3’末端を起点として相補鎖合成を行う工程
（６）前記第2増幅鋳型の3’末端側に形成されるループに、前記第5配列の少なくとも一部を5’末端に有し、かつ前記第6配列の少なくとも一部を3’末端に有する第5プライマーをハイブリダイズさせ、これを起点として鎖置換型ポリメラーゼを用いて前記第5プライマーを伸長させ、（５）の工程で合成された相補鎖を置換してその3’末端を塩基対結合が可能な状態とする工程、及び
（７）（６）の工程で3’末端を塩基対結合が可能な状態とした鎖を（５）における新たな鋳型とする工程。 - さらに、以下の工程を含む、請求項１に記載の核酸増幅法：
（８）前記新たな鋳型の3’末端を起点として相補鎖合成を行う工程
（９）前記新たな鋳型の3’末端側に形成されるループに、前記第8配列の少なくとも一部を5’末端に有し、かつ前記第9配列の少なくとも一部を3’末端に有する第6プライマーをハイブリダイズさせ、これを起点として鎖置換型ポリメラーゼを用いて前記第6プライマーを伸長させ、（８）の工程で合成された相補鎖を置換してその3’末端を塩基対結合が可能な状態とする工程、及び
（１０）（９）の工程で3’末端を塩基対結合が可能な状態とした鎖を（５）における新たな鋳型とする工程。 - 前記第5プライマーが前記第1プライマーと同一である、請求項1又は２に記載の核酸増幅方法。
- 前記第6プライマーが前記第3プライマーと同一である、請求項２又は３に記載の核酸増幅方法。
- 前記（６）の工程において、さらに第2増幅鋳型の5’末端側に形成されるループに、前記第8配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する第7プライマーをハイブリダイズさせ、これを起点として鎖置換型ポリメラーゼを用いて前記第7プライマーを伸長させることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
- 前記（９）の工程において、さらに新たな鋳型の5’末端側に形成されるループに、前記第5配列の少なくとも一部に相補的な配列を有する第8プライマーをハイブリダイズさせ、これを起点として鎖置換型ポリメラーゼを用いて前記第8プライマーを伸長させることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
- 前記第2プローブの第3配列の3’末端はリン酸化またはアミノ化により修飾されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
- 複数の標的核酸に対し、2種類の前記オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ作用させ、ライゲーション反応により結合させた後に、前記第1プライマー、第2プライマー、第3プライマー、第4プライマーをそれぞれ作用させて同一反応チューブにおいて、複数種類の標的核酸を同時に増幅・検出することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
- 試料核酸に相補的な第1配列を3’末端に有し前記試料核酸に非相補的な第2配列を5’末端に有する第1プローブと、
前記試料核酸に非相補的な第3配列を3’末端に有し前記試料核酸に相補的な第4配列を5’末端に有し、5’末端がリン酸化された第2プローブと、
前記第3配列に非相補な第5配列を5’末端に有し、前記第3配列の一部に相補な第6配列を3’末端に有する第1プライマーと、
前記第3配列の前記第6配列に相補的な領域よりも3’末端側の領域に相補的な第7配列を有する第2プライマーと、
前記第2配列の相補配列に非相補な第8配列を5’末端に有し、前記第2配列の一部を含む第9配列を3’末端に有する第3プライマーと、
前記第2配列の前記第9配列に相補的な配列よりも5’末端側の領域に相補的な第10配列を有する第4プライマーを含む、核酸増幅用キット。 - さらに、前記第8配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する第7プライマーを含む、請求項９記載のキット。
- さらに、前記第5配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する第8プライマーを含む、請求項１０記載のキット。
- 前記第2プローブの第3配列の3’末端はリン酸化またはアミノ化により修飾されていることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載のキット。
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