JPH02503054A - 核酸配列の増幅および検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸配列の増幅および検出 発明の背景 最近の分子生物学の一般的な分野における発達により臨床および商業上重要な特 定の核酸配列を検出することが可能となった。例えば、様々なヒト遺伝子の核酸 配列の分析によって、特定の疾患と関連して特有の変化が存在することが明らか になった。同様に、各微生物を特異的に特徴づけ、それらを極く近縁種のものか らさえも区別し得る、種々の病原体ゲノムの配列が同定された。それらの配列に 関する情報を利用することで、遺伝子レベルでの疾患の診断が可能となった。

特定の核酸配列を検出する最も一般的な方法はハイブリダイゼーション（ハイブ リッド形成法）である。この方法は核酸が相補的な核酸配列と安定な非共有結合 性の複合体（コンプレックス）を形成し得るという点を利用したものである。被 検試料中に特定の核酸配列が存在するか否かを決定するには、相補的な核酸プロ ーブを調製し、検出可能な化学的修飾によって標識した後、被検試料に加える。

検出すべき配列が存在する場合、標識したプローブがそれとハイブリダイズし、 その標識が、ハイブリダイゼーションの生起の有無および程度を既知の方法で決 定する手段を与える。

現在のハイブリダイモーション法を被検試料中の核酸配列を決定するために用い ることは、それが充分に高感度でなく特定の核酸配列の存在を正確に証明するに はかなり多量の被検試料を要するという点で根本的に限界がある。このような限 界は、通常、分析用として得られる試料の量が限られている臨床面での実用化に とって重大な限界である。従って、被検試料中の特定の核酸配列を検出するため のハイブリダイモーション法の感度を高める方法を開発し、該方法の診断技術面 での利用を拡大することが注目されていた。

一般的なハイブリダイモーション法の感度の改善法の１つはハイブリダイゼーシ ョンプローブによって生成されるシグナルを増大することであった。例えば、ニ ックトランスレーション［リグビイら（Ｒｉｇｂｙ）、ジャーナル・オブ・モレ キュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂ　ｉｏｌ、　）、１１３：２３７（ １９７７）］またはＳＰ６転写［メルトンら（Ｍｅｌｔｏｎ）、ヌクレイツク・ アシッズ・リサーチ（Ｎ　ｕｃ、　Ａ　Ｃ１ｄｓＲ５ｓ、　）、１２ニア０３５ （１９８４）］により、高い比活性の放射能で標識された核酸プローブの調製法 が報告されている。

シナイブ−ら（Ｓ　ｅｈｎｅｉｄｅｒ）　［Ｐ　ＣＴ国際特許出願公開Ｎｏ、Ｗ Ｏ３７１０３６２２］は、ハイブリダイゼーションにより生成したシグナルを増 幅する手段として、目的のＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリダイズしている第 １プローブの各々と結合可能な複数のシグナル産生性第２プローブ群を使用する ことについて報告している。

チュら（Ｃｈｕ）［ＰＣＴ国際特許出願公開Ｎｏ、ＷＯ８７／　Ｏ６２７０］は 核酸ハイブリダイゼーションプローブとして“複製可能なＲＮＡ”を単独で、ま たは親和性分子と一緒に使用し、さらに、ＲＮＡを複製し、それによって産生さ れるシグナルを増加するためにＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼを使用するこ とについて報告している。

ロドランドら（Ｒｏｄｌａｎｄ）［米国特許出願Ｎｏ、第４．６４７．５２９号 ］はハイブリダイゼーションプローブに取り込まれた場合にプローブと検出すべ き核酸配列との結合量を増加させるチオヌクレオチドの使用について報告してい る。

プローブ検出法の感度の向上にかなりの努力が払われたのに対して被検試料中の 検出すべき核酸配列を増幅させて現在利用可能なハイブリダイゼーション法によ って検出するのに充分な量の配列を生産する方法に向けてなされた研究は殆どな かった。

ムリスら（Ｍｕｌｌｉｓ）［米国特許出願Ｎｏ、第４．６８３，１９５号］は２ つのオリゴヌクレオチドブライマーを用いて被検試料中の特定の核酸配列を増幅 する方法およびブライマー伸長産物の合成に関して教示している°。１つのブラ イマーの伸長産物は、もう１つのブライマーとハイブリダイズした場合に所望の 特定の核酸配列を生産するための鋳型となり、またその逆の関係が成り立ち、特 定の配列が所望の量、生産されるまでこの工程が繰り返される。

ムリスらは、非相補配列と結合したブライマーを用い、この増幅法によって大量 の組換え核酸を調製することも教示している。ムリスらはプロモーター、リンカ −または暗号配列のための核酸配列をブライマーの１方または両方に連結し、被 検試料の核酸配列と非相補性配列とを一緒に増幅させる方法を開示した。このよ うにして、選択された外因性の核酸配列と結合した既存の被検核酸配列からなる 組換え核酸が大量に生産される。

従って、ムリスらの方法の原理は、相捕的なブライマー伸長産物の形で所望の核 酸配列を増幅することにある。形成された各ブライマー伸長産物がさらに他のブ ライマー伸長生産における鋳型となるので、ムリスらのブライマー伸長法を複数 回繰り返すことにより、理論上、反応サイクルの回数に対して指数関数的な速度 で所望の配るので、直線的な速度で蓄積される。

このように、ムリスらの方法の特異性および精度は、厳密に、副産物の合成速度 に対する所望の核酸配列の相対的合成速度の実質的な増大にかかっている。しか しながら、実際には、副産物の蓄積は理論的な計算から予測される速度よりもは るかに早く進むことが観察されている。例えばムリスらはヒトゲノムＤＮＡを含 有する試料中に存在するヒトベーターヘモグロビン遺伝子部分を増幅させるため にこの方法を用い、ゲノム内の他の配列の増幅により、所望の配列に相当する増 幅配列の最終的な割合は１％にすぎないという結果を認めた。

ムリスらの方法で所望の核酸配列以外の核酸配列が増幅した程度から、この方法 は実際に被検試料中に存在する所望の核酸配列よりも多くを検出し、偽陽性の結 果を与えることになる。従って、本発明は被検試料中の核酸配列を特異的かつ定 量的に増幅させることにより、偽陽性および、さもなくば既存の方法に付随する 不正確な結果等の問題を回避し、所望の配列の検出感度を向上させる方法を提供 することを目的とするものである。

さらにムリスらの方法は複数回のブライマーハイブリダイゼーションおよびブラ イマー伸長合成のサイクルを想定したものであるために面倒な作業を要するかま たは自動化（オートメーション化）のための経費が必要である。ムリスらの方法 の自動化には、特殊な装置のみならず特殊な試薬、熱的に安定なりＮＡポリメラ ーゼを必要とし、さらにブライマーハイブリダイゼーションおよびブライマー伸 長合成工程を連続的に行うために、各分析試験系に合わせて反応条件を設定する 必要がある。従って、本発明は、費用および工程の繰り返し、特別の装置および 試薬、あるいは異なる被検試料ごとに反応条件を変更しなければならない繁雑さ を必要とせず、迅速かつ簡便に被検試料中の特定の核酸配列を検出する方法を提 供することを目的とするものである。

発明の要約 本発明の目的は、 （ａ）検出すべき配列とプロモーターとを含有する２本鎖核酸を合成し、 （ｂ）該プロモーターのコントロール下で該２本鎖核酸から複数個のＲＮＡ転写 物を合成し、 （ｃ）工程（ｂ）で得たＲＮＡ転写物の存在を測定し、さらに（ｄ）該ＲＮＡ転 写物の存在を、検出すべき核酸配列の存在に関係づけることからなる方法によっ て達成された。

さらに実施態様において、上記工程（ａ）の核酸を、（１）ブライマーと結合し たプロモーターを含むオリゴヌクレオチド、プロモーター−ブライマーを得、（ ２）検出すべき核酸配列にプロモーター−ブライマーがハイブリダイズする条件 下で被検試料とプロモーター−ブライマーとを接触させ、さらに （３）工程（２）においてプロモーター−ブライマーがハイブリダイズした被検 試料核酸配列を鋳型とし、検出すべき核酸配列と相補的な伸長産物をプロモータ ー−ブライマーから合成することからなる方法で調製することを含む方法によっ て本発明目的はより高く、達成される。

さらに他の実施態様として、工程（ａ）の核酸を、（１）ブライマーと結合した プロモーターからなるオリゴヌクレオチド、プロモーター−ブライマーおよびオ リゴヌクレオチド第２プライマーであって、これらブライマーは互いに相補的で な（、シかも１方のブライマーから合成された伸長産物をその相補体から分離し たときに、それがもう１方のブライマーの伸長産物の合成における鋳型となるよ う選択されているものを得、（２）プロモーター−プライマー伸長産物が合成さ れるハイブリダイゼーション条件下でプロモーター−ブライマーに被検試料を接 触させ、さらに （３）第２プライマーの伸長産物が合成されるハイブリダイゼーション条件下で 被検試料を接触させることからなる方法で得ることからなる方法によっても、本 発明の目的は達成される。

本発明は被検試料中の特定の核酸配列の存在を測定する方法の改良法および本発 明の実施に必要な試薬を含有するキットを提供するものである。総括すると、本 発明方法は、検出すべき核酸配列とプロモーターとを含有する２本鎖核酸の合成 、そのプロモーターのコントロール下での複数個の様々なＲＮＡ転写物の合成、 および産生物の形でなくＲＮＡ転写物の形で増幅させることの利点は、ポリメラ イゼーションのための酵素とりボヌクレオシド三りん酸の存在下においてＲＮＡ 転写物の合成は連続的に起こるので、極めて、また本質的に誤りを生じやすいブ ライマーハイブリダイゼーション反応を何度も繰り返さずに、検出すべき核酸配 列を任意の所望のレベルにまで増幅させることができるという点にある。

図面の簡単な説明 第１図は１本鎖核酸中の検出すべ特定の配列へのオリゴヌクレオチド、プロモー ター−ブライマーのハイブリダイゼーション、検出すべき配列とプロモーター− ブライマーのプロモーターを含有する２本鎖核酸の合成、およびプロモーターの 制御下における２本鎖核酸からの複数個のＲＮＡ転写物の合成を示す模式図であ る。

第２図は、本発明の１実施態様であって、オリゴヌクレオチド、プロモーター− ブライマーとオリゴヌクレオチド、第２プライマーとを一緒に用い、検出すべき 核酸配列とプロモーター−ブライマーのプロモーターとを含有する２本鎖核酸を 製造することを含む実施態様の模式図である。プロモーター−ブライマーと、１ 本鎖核酸中の検出すべき配列とがハイブリダイズし、プロモーター−ブライマー 伸長産物の中の検出すべき配列と相補的な配列に第２プライマーがハイブリダイ ズする。得られた生産物は２本鎖核酸であり、１本の鎖はオリゴヌクレオチド、 プロモーター−ブライマー伸長産物ヲ、もう１本の鎖はオリゴヌクレオチド、第 ２プライマー伸長産物を含有しており、それから、プロモーターのコントロール 下でＲＮＡ転写物が産生される。

第３図は本発明の他の実施態様であって、オリゴヌクレオチド、プロモーター− ブライマーと、オリゴヌクレオチド、第２プライマーとを一緒に用いることから なる実施態様の模式図である。オリゴヌクレオチド、第２プライマーと１本鎖核 酸内の検出すべき配列とがハイブリダイズし、オリゴヌクレオチド、プロモータ ー−ブライマーと第２ブライマー伸長産物内の検出すべき配列に相補的な配列と がハイブリダイズする。

本明細書中、“プロモーター”という語句ぼそれにＲＮＡポリメラーゼ酵素が結 合し、ＲＮＡ転写物の合成を開始する核酸配列を意味する。プロモーターは献呈 された（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）プロモーターであり、ＲＮＡポリメラーゼは献呈 されたＲＮＡポリメラーゼであることが好ましい。“献呈された”という語句は そのプロモーターが、実質上、分析すべき被検試料中に通常存在しているポリメ ラーゼ以外の、１つのＲＮＡポリメラーゼによってのみ認識されるものであるこ とを意味する。同様に、“献呈されたＲＮＡポリメラーゼ”は被検試料中に存在 する他のプロモーターと比較したとき、専ら、あるいは優先的に献呈されたプロ モーターと結合し、プロモーターの下流に位置する核酸のＲＮＡ転写物を合成す る。献呈されたプロモーターと献呈されたＲＮＡポリメラーゼとの組み合わせに より、通常でない、特異的なプロモーター−ＲＮＡポリメラーゼ相互反応が起き る。

一般に、献呈されたプロモーターと献呈されたＲＮＡポリメラーゼとは、例えば バクテリオファージＴ７またはバクテリオファージＳＰ６等、同じ供給源から得 られる。Ｔ７およびＳＦ３の両者の場合、ファージがコードしているＤＮＡポリ メラーゼは同族起源のファージプロモーターからのＲＮＡ転写物の合成を有効に 開始する。他の原核性または真核性プロモーターからＲＮＡ転写が開始されるこ とは殆ど認められない。しかも、単塩バッファー、２本鎖核酸鋳型、リボヌクレ オシド三りん酸およびファージＲＮＡポリメラーゼからなる転写反応によって大 量のＲＮＡが迅速に合成される。被検試料ＤＮＡに含まれる既知の任意の配列と の偶発的なハイブリダイゼーションを最小限に止めるよう、プロモーターを、固 有の配列から選択するか、そのヌクレオチド配列を修飾することが好ましい。

本明細書中“プライマー”という語句は、天然に存在するか、合成されたオリゴ ヌクレオチド配列であって、検出すべき核酸配列の全体または一部と実質上、ホ モローガスであるか、または相補的な配列を指す。プライマーは検出すべき配列 またはその相補配列を含有する鋳型核酸とハイブリダイズし、ポリメライゼーシ ョン用試薬の存在下で伸長産物の合成を開始（プライム）するのに充分な長さで なければならない。プライマーの正確な長さはハイブリダイゼーションおよびブ ライマー伸長合成反応の条件、並びに検出すべき特定の核酸配列の組成などの様 々な因子に左右される。通常、プライマーは１０−２５またはそれ以上のヌクレ オチドを含有するが、それより少ないこともある。しかしながら、プライマーは 、検出すべき核酸配列またはその相補体の配列を正確に反映したものである必要 はない。例えば、選択された条件下でプライマーが検出すべき核酸配列またはそ の相補配列と特異的にハイブリダイズする限り、ブライマー内に非相補的な塩基 が分散されていたり、プライマーから相補的な塩基が欠失されていてもよい。

本明細書中、“プロモーター−プライマー”という語句はプライマーの５′末端 にプロモーターが結合してなる、天然に存在するまたは合成されたオリゴヌクレ オチドを指す。適当な条件下、ポリメライゼーションのための試薬の存在下でプ ロモーター−プライマーは、検出すべき核酸配列またはその相補配列と、プロモ ーター−プライマーのプロモーターとを包含するプロモーター−プライマー伸長 物産生の開始点として作用することができる。ハイブリダイゼーション効果を最 大にするためには、プロモーター−プライマーは１本鎖であることが好ましいが 、２本鎖であってもよい。２本鎖の場合には、伸長産物の製造に用いる前に、ま ずプロモーター−プライマーを処理してそのストランドを解く。

“第２ブライマー”という語句は、天然に存在するか、または合成されたオリゴ ヌクレオチドであって、適当な条件下、ポリメライゼーションのための試薬の存 在下で検出すべき核酸配列またはその相補配列を含む第２プライマー伸長生産の 開始点として作用することができるものを指す。ハイブリダイゼーション効果を 最大にするためには、第２ブライマーは１本鎖であることが好ましいが、２本鎖 であってもよい。２本鎖の場合には、伸長産物の製造に用いる前に、まずプロモ ーター−プライマーを処理してそのストランドを解く。

第２ブライマーは、検出すべき核酸配列の全部または一部と実質上、相補的であ れば、いかなるヌクレオチド配列を含有していてもよいが、プロモーター−プラ イマーの相補配列でないように選択することが好ましい。

“プローブという語句は、検出すべき核酸配列の全部または一部とホモローガス または相補的な、天然に存在する、または合成されたオリゴヌクレオチドを指す 。プローブは、適当な条件下、検出すべき核酸配列のＲＮＡ転写物と特異的にハ イブリダイズすることができる。

本明細書中、プライマーおよびプローブに関して“オリゴヌクレオチド”という 語句は２またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはりボヌクレオチドか らなる分子を意味する。所望のオリゴヌクレオチドは、例えば、天然に存在する 核酸から精製する、あるいは新たに合成する等、適当な方法で調製される。様々 な有機化学の技術を用い、ヌクレオシド誘導体からオリゴヌクレオチドを合成す ることに関する幾つかの方法が文献に記載されている。有機合成の１つの型はホ スホトリエステル法であり、この方法では、ヌクレオシド三りん酸エステルが結 合して所望の配列を有するオリゴヌクレオチドを形成する［ナラングら（Ｎ　ａ ｒａｎｇ）、Ｍｅｔｈ、　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ、、６８：９０（１９７９）］。ヌ クレオシドニりん酸［ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）、Ｍｅｔｈ、　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ 、、６８　：　１０９（１９７９）］、またはヌクレオシド・ホスホラミデート ［カルーサー（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、Ｍｅｔｈ、　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ、、１５ ４　：２８７（１９８５）］の使用を含む他の有機合成法が報告されている。次 いで、これらの方法のいずれかで合成されたオリゴヌクレオチドを一緒にして、 必要な長さおよび配列を有する任意の１本鎖オリゴヌクレオチドを形成すること ができる。別法として、インビトロでの転写性増幅、宿主細胞へのクローニング 、あるいは適当な制限酵素を使用して天然の供給源から回収することによりオリ ゴヌクレオチドを生産する。

本明細書中、“ＲＮＡ転写物”という語句はプロモーター−ブライマーのプロモ ーターのコントロール下でＲＮＡポリメラーゼ酵素によって合成されたリボ核酸 分子を指す。検出すべき特定の核酸配列のＲＮＡ転写物は、プロモーター−ブラ イマーの性質により該配列とホモローガスであるか相補的である。

本明細書中、“伸長産物”という語句は、ブライマーがハイブリダイズしている 核酸分子を合成の鋳型として用い、プライマーの３“ＯＨ末端から合成が開始さ れる核酸分子を指す。

“ポリメライゼーション用試薬”という語句は、一般に、既存の核酸を鋳型とし てデオキシリボヌクレオチドまたはりポヌクレオチドからの核酸の合成を触媒す る酵素を意味する。

被検試料としては、精製形または非精製形の任意の起源の核酸を鋳型として用い 得る。例えば、被検試料は食物、農産物、あるいはヒトまたは動物の臨床標本で あってよい。通常、標本試料は、尿、血液、佃漿、血清、および峡などの生物学 的な液体である。被検試料中の検出すべき核酸は細菌、酵母、ウィルス、および 植物または動物などのより高等な生物に由来する細胞または組織など、任意の源 からのＤＮＡまたはメソセンジャーＲＮＡをも含むＲＮＡである。

そのような核酸の抽出および精製法は、例えば、マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉ ｓ）［モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　 ：実験手引書（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、ニューヨーク、コ ールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２）］によって報告され た。

被検試料中の検出すべき核酸配列は最初から分離した分子として存在し、検出す べき配列が全核酸を構成していてもよく、あるいは大きい分子の単なる一部分で あってもよい。検出すべき核酸配列が最初から、精製された形である必要はない 。被検試料は検出すべき核酸配列が少数部分である核酸複合体（コンプレックス ）混合物を含有するものであってもよい。例えば、検出すべき核酸配列は全ヒト ゲノムＤＮＡに含有された腫瘍遺伝子、または臨床標本の少数部分である微生物 、病原体の核酸配列の一部に該当するものであってもよい。

本発明方法によれば、いかなる核酸配列をも検出することができる。配列の内、 検出すべき核酸配列またはその相補体とハイブリダイズし得る最小限１個、また は好ましくは２個のプライマーを調製するのに充分な数の配列中のヌクレオチド が分かっているだけで十分である。検出すべき核酸配列は、例えば、任意の既知 の核酸配列決定法によって確かめるか、決定されたタンパク質配列に基づいて推 測することができる。検出すべき核酸配列についての知識が多いほど、選択され るブライマーの特異性がより大きくなり、本発明方法の精度が一層高くなる。

例えば、選択された条件下、被検試料中の検出すべき核酸配列またはその相補的 配列とは特異的にハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしないプロ モーター−ブライマーを選択し得るよう、充分な配列情報を入手することが好ま しい。プロモーター−ブライマーと第２プライマーの両方を用いるときは、検出 すべき核酸配列について、相互に相補的でないブライマーを選択し得るだけの知 識を得ることが望ましい。

第１−３図記載の方法はいずれも、中核となる第１段階として、検出すべき配列 とプロモーターとを含有する２本鎖核酸の製造工程を含む。一般に、この２本鎖 核酸の調製にはブライマーがハイブリダイズした１本鎖核酸を鋳型として用いる プロモーター−ブライマー伸長産物の合成、および、場合によらては、第２ブラ イマー伸長産物の合成が含まれる。プロモーター−ブライマーを単独で用いるか 、第２ブライマー゛と併用するかによって、鋳型は検出すべき配列を含有する被 検試料核酸か、または先に合成された検出すべき核酸配列の相補配列を含有する ブライマー伸長産物のいずれかで構成される。

もしも鋳型が元々２本鎖核酸に含有されていたものであればブライマー伸長産物 の合成の前、または同時に核酸ストランドを分離しなければならない。ストラン ドの分離は、被検試料を９０〜１００℃で約１〜１０分間加熱して熱変成する方 法によることが好ましいが、他の物理的、化学的または酵素的な方法を使用する こともできる。

ブライマーハイブリダイゼーションは、通常、ブライマーが、検出すべき核酸配 列またはその相補配列と特異的にハイブリダイズするが、他のいかなる配列とも ハイブリダイズしない、十分なストリンジエンシーとなるよう、温度、塩濃度お よびｐＨに関する条件を選択した緩衝化水溶液中で行う。一般に、ブライマーと 鋳型とのハイブリダイゼーション効果は、加えられたブライマーが鋳型に対して 過剰モル、好ましくは１０００〜１０６モル濃度過剰に存在するような条件下で 促進される。しかしながら、被検試料中の鋳型の量が不明の場合には鋳型に対す るブライマーの相対量も確実に決定されないということは理解されるであろう。

第１Ａ−Ｇ図は、本発明の実施態様を示しており、プロモーター−ブライマーを 用いた、検出すべき配列とプロモーターとを含有する２本鎖核酸の調製を示す図 である。

の既知の核酸配列のどれとも非相補的であるよう、好適に選択されているのでハ イブリダイズしないままである。

次いで、ヌクレオシド三りん酸の存在下、ポリヌクレオチドポリメラーゼ工を加 えると、最初にブライマーがハイブリダイズした配列■の５′側に境界を接して いる被検試料核酸配列ｌを含有する１本鎖鋳型に沿って、ブライマーの３”末端 から始まり、５”側に向けてプロモーター−ブライマー伸長産物が合成される（ 第１図ＩＢ−Ｃ）。このようにブライマー伸長産物は、検出すべき核酸配列およ びもしあるならば、５°側に隣接する被検試料核酸配列と相補的な２本鎖分子を 形成する。

３゛−５°エキソヌクレアーゼ活性を有する物質用の存在下、もしあるならば被 検試料核酸の３°末端側１本鎖配列を第１Ｄ図のように切断し、ポリヌクレオチ ドポリメラーゼｆにより、被検試料核酸配列の３°末端でプロモーター−ブライ マーのプロモーターを鋳型として開始され、合成された新しい核酸で置換する（ 第１図Ｅ−Ｇ）。

検出すべき配列とプロモーターを含有する２本鎖分子を生成する１１Ａ−１１の 方法はプロモーター−ブライマーと検出すべき核酸配列とのハイブリダイゼーシ ョン、およびその後の、プロモーター−ブライマー伸長合成、核酸の切除、およ び置換合成からなる工程によるものである。切除反応には、プロモーター−ブラ イマー伸長合成および置換合成に用いた試薬りと異なる試薬比が使用されるが、 ２本鎖産物の合成が、プロモーター−プライマーハイブリダイゼ−ジョンに続い て行われるよう、単一の試薬を使用することが望ましい。従って、ポリヌクレオ チドポリメラーゼは、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ１１大腸菌ＤＮＡポリメラー ゼＩのフレノウ断片、およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ等の５′−３°ポリメラー ゼ活性と３′−５″エキソヌクレアーゼ活性の両者を有するものであることが好 ましい。これらの酵素はいずれもブライマー伸長合成に鋳型を必要とするので、 それらを第１Ｂおよび第１Ｆ図記載の方法で使用するのに適切な場合は、検出す べき配列がＤＮＡである場合である事が分かる。

検出すべき配列とプロモーターとを含有する２本鎖核酸は、検出すべき配列の複 数個のＲＮＡ転写物の供給源として作用する。第１Ｈ−Ｉ図に示すように、被検 試料に適当なＲＮＡポリメラーゼ弦を加えると２本鎖産物のプロモーターにＲＮ Ａポリメラーゼが結合し、次いで、リボヌクレオシドトリホスファターゼの存在 下、検出すべき核酸配列をも含む、核酸配列のＲＮＡ転写物がプロモーターの下 流に位置して合成される。

必要な試薬の存在を含む、適当な条件下、ＲＮＡ転写物の合成は連続的に、しか も元々被検試料中に存在していた検出すべき核酸配列の量に比例して起こる。所 望の量のＲＮＡ転写物を調製するために必要ならば試薬を追加してもよい。ＲＮ Ａ転写物の合成は、本質的でないリボヌクレアーゼ不純物（混在物）によって有 り得る偶発的な転写物の分解を避けるために、バナジル−リボヌクレオシド複合 体またはヒト胎盤リボヌクレアーゼ・インヒビターなどのりボヌクレアーゼ・イ ンヒビターの存在下で行うことが好ましい［バーガーら（Ｂ　ｅｒｇｅｒ）、Ｍ ｅｔｈ、　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ、、１５２　：　２２７（１９８７）；ド・マルチ ノフら（ｄｅ　Ｍａｒｔｙｎｏｆｆ）、バイオケミカル・アンド・バイオフィジ カル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙ ｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　）、９３　：　６４５（１９８０）；およびシール ら（Ｓｈｅｅｌ）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンシイーズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、７６：４ ８９８（１９７９）］。

産生された特異的なＲＮＡ転写物の測定は、ＲＮＡ転写物をその合成の間、また は合成後に検出可能な部分で標識するか、検出すべき核酸配列のＲＮＡ転写物と 特異的にハイブリダイズすることができる標識したプローブを用いて標識するこ とにより行われる。

ＲＮＡ転写物は、例えば、それ自身、検出可能な部分で標識されており、Ｒ，Ｎ Ａポリメラーゼの基質として利用され、そのことによりＲＮＡ転写物に組み込ま れるリボヌクレオシド三りん酸を供給することによって標識される。検出可能な 部分は直接または間接的に検出可能なシグナルを産生じ得るものであればよい。

例えば、１つの態様として、検出可能な部分は３１ｐ、３Ｈ，＋４Ｃ，Ｉｔｓｌ および３５Ｓ等の放射性同位元素であってよい。また別の態様として、検出可能 な部分は１またはそれ以上の適当な試薬と相互反応したときに検出可能なシグナ ルを産生ずる非放射能性の化学修飾である。即ち、例えば、検出可能な部分はビ オチンであってよく、ビオチン部分と、アビジン、ストレプトアビジン、または 抗ビオチン抗体などビオチンと特異的に結合し得るタンパク質との複合体の形成 によって検出可能なシグナルが生成されるものであり、ここに、結合したタンパ ク質はフルオレスセイン、または適当な基質と反応して蛍光、ルミネセンス、ま たは着色生成物を形成する酵素と抱合体を形成する（コンジュゲートする）もの である［ランガーら（Ｌ　ａｎｇｅｒ）、プロシーディングズ・オブ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンシイーズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、）、７８：６６３３（１９８１）；ベイヤー（Ｂ　ａｙｅｒ）およびウィ ルチｘ　ツク（Ｗｉｌｃｈｅｋ）、Ｍｅｔｈ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ａ　ｎａ ｌ、、２６　：　１（１９８０）］。

他の実施態様においては、生産された特異的なＲＮＡ転写物を核酸ハイブリダイ ゼーションプローブを用いて測定する［ファルコウら（Ｆａｌｋｏｗ）、米国特 許出願Ｎｏ、４，３５８，５３５、グッドソンら（Ｇｏｄｓｏｎ）、欧州特許出 願Ｎｏ、０２３８３３２コ。検出すべき核酸配列と相捕的またはホモローガスな ＲＮＡ転写物の配列とハイブリダイズするように選択することが好ましい。ハイ ブリダイゼーション法は欧州特許公開Ｎｏ、７０，６８５および７０，６８７記 載の液相ハイブリダイゼーション法、および米国特許出願Ｎｏ、４．３５８．５ ３５（ファルコウ）および４，６４７．５２９（ロドランド（Ｒｏｄｌａｎｄ） ）、欧州特許出願Ｎｏ、０．２３８，３３２（グッドソン）、およびランキら（ Ｒａｎｋｉ）、Ｇｅｎｅ２１　ニア　７　（１９８３）に記載の液−固相ハイブ リダイゼーションなど、任意の適当な方法で行うことができる。液−固ハイブリ ダイゼーシヲンの場合には、プローブ分子またはＲＮＡ転写物のいずれかを固体 支持体に固定化すればよい。

例えば、定められた量の検出すべき配列または他の既知配列を含有する核酸標準 と、被検試料中の検出すべき配列の量を同時に測定する方法など、任意の適当な 方法を用いてＲＮＡ転写物の量と被検試料中の検出すべき核酸配列の量とを関係 づけることができる（ランキら、英国特許出願２１８７２８３Ａ）。

また、本発明の別の実施態様では、検出すべき配列とプロモーターとを含有する ２本鎖核酸の合成を、プロモーター−プライマーと第２プライマーとを一緒に用 いて互いにハイブリダイズし得る２個の異なるブライマー伸長産物の合成を開始 することにより行う。

第２Ａ−Ｆ図は、まずプロモーター−ブライマー伸長産物を合成し、次いで、第 ２ブライマー伸長産物を合成することからなる方法を示す図である。第２Ａ図は 、プロモーター−プライマーｃｄにおけるプライマ一旦が検出すべき核酸配列互 の３′末端に結合し、相補的なヌクレオチド配列の非共有結合的な塩基対形成色 を介してハイブリダイズしていることを示す図である。ヌクレオシド三りん酸の 存在下、ポリメライゼーション用の試薬ユを加えると、１本鎖鋳型に沿って、プ ロモーター−プライマーの３′末端から５゛方向に伸長産物差の合成が開始され る。このようにして得られる生成物は１本の鎖が被検試料核酸であり、他の鎖が プロモーター−プライマー伸長産物Ｉである２本鎖核酸である。

次の工程（第２Ｄ図）では上記の方法の内、任意の方法で２本鎖を分離して１本 鎖分子を得る。この鎖分離工程の後、第２プライマーとプロモーター−プライマ ー伸長産物中の検出すべき配列と相補的な配列とのハイブリダイゼーションに適 した条件下、被検試料と第２ブライマー江とを接触させる。しかしながら、分析 の正確さを増すためには第２プライマーとプロモーター−プライマーとは相補的 でないことが望ましいので、相補配列の３′末端とハイブリダイズするように第 ２プライマーを選択することが好ましい（第２Ｅ図）。

プロモーター−プライマー伸長合成に用いたポリメライゼーション用試薬」の継 続的な存在下、またはポリメライゼーション用試薬ｉの添加により、第２プライ マーの３゛末端から、プロモーター−プライマー伸長産物鋳型に沿って５”側に 向かう第２プライマーの伸長産物の合成が開始される（第２Ｆ図）。このように 、第２ブライマー伸長産物はプロモーター−ブライマー伸長産物と相補的であり 、それとハイブリダイズして検出すべき配列とプロモーター−プライマーのプロ モーターとを含有する２本鎖核酸を形成する。

プロモーター−ブライマー伸長産物の合成に用いられるポリメライゼーション用 試薬はエキソヌクレアーゼ欠損Ｔ７ＤＮＡ［ターバー（Ｔ　ａｂｏｒ）およびリ チャードソン（Ｒ１ｃｈａｒｄｓｏｎ）、プロシーディングズ・オブ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンシイーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎ　ａｔｌ、　Ａ　ｃ ａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　）、８４　：　４７６７（１９８７）コであることが好ま しいが逆転写酵素やその他の３°−５′エキソヌクレアーゼ活性を欠損したポリ ヌクレオチド・ポリメラーゼ等の他の試薬を用いることもできる。市販の３°− ５°エキソヌクレアーゼ活性を欠損したポリメラーゼ［シークエナーゼＴＭ（Ｓ 　ｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ）、ユナイテット・スティソ・バイオケミカル・コーホ レイテッド（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓＢ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ 、　）、クリーブランド（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ）、オハイオ（Ｏｈｉｏ）］は残 存量の３°−５”エキソヌクレアーゼ活性を有しており、例えば、プロモーター −プライマーが結合している、被検試料デオキシリボ核酸のハイブリダイズされ ていない３′末端は第２Ｄ図記載の鎖分離工程にかける前に切除されるような場 合には望ましくない。このような現象は、被検試料の核酸が機械的に剪断される 場合や制限酵素消化によってプロモーター−プライマーが結合する配列の３°側 に位置する被検試料の核酸配列の長さが短縮されるような場合に起こり得ると予 測される。

第２ブライマー伸長産物の合成は第２プライマーの３°末端から合成を開始し、 プロモーター−プライマー伸長産物鋳型に沿って５゛方向に進行し得る任意のポ リメライゼーション用試薬を用いて行うことができる。この目的に適した酵素に は、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸［ｄＤＮＡポリメラーゼ■のフ レノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ欠損Ｔ７ＤＮＡポリ メラーゼ、および逆転写酵素が含まれる。

第３Ａ−Ｉ図は、まず第２ブライマー伸長産物を合成し、次いで、プロモーター −プライマー伸長産物を合成することからなる方法をを加えると、１本鎖鋳型に 沿って、第２ブライマーの３′末端から開始され５゛方向に向けて伸長産物工が 合成される。このようにして得られる生成物は１本の鎖が被検試料の核酸であり 、他の鎖が第２ブライマー伸長産物である２本鎖核酸である（第３Ｃ図）。

（以下余白） 次の工程（第３Ｄ図）では上記の方法の内、任意の方法で２本鎖を分離して１本 鎖分子を得る。この鎖分離工程の後、プロモーター−ブライマーと第２ブライマ ー伸長産物の中の検出すべき配列と相補的な配列とのハイブリダイゼーションに 適した条件下、被検試料とプロモーター−ブライマー劾とを接触させる。しかし ながら、発明の精度の向上のためにはプロモーター−ブライマーと第２ブライマ ーとが相補的でないことが望ましいので、相補配列の３゛末端とハイブリダイズ するようにプロモーター−ブライマーのブライマーを選択することが好ましい。

れ、第２プライマー伸長産物鋳型に沿って５°側に向かい、プロモーター−ブラ イマーの伸長産物ｊが合成される。プロモーター−プライマー伸長産物は検出す べき核酸配列であって、第２ブライマー伸長産物中の該配列に相補的な配列とハ イブリダイズする配列およびプロモーターを含有している。このように、得られ た生産物は検出すべき核酸配列とプロモーター−ブライマーのプロモーターとを 含有する２本鎖核酸である。

３、−５．エキソヌクレアーゼ活性を有する試薬にの存在下、もしあれば、プロ モーター−ブライマー伸長産物の３′末端の１本鎖配列を切除し、プロモーター −ブライマーのプロモーターを鋳型としてプロモーター−プライマー伸長産物の ３′末端からポリメライゼーション試薬上により合成が開始されるプロモーター 相補配列によって置換する（第３Ｇ−１図）。

第２ブライマー伸長産物の合成は第２ブライマーの３′末端から合成を開始し、 被検試料の核酸配列の鋳型に沿って５′方向に進行する任意のポリメライゼーシ ョン用試薬を用いて行うことができる。

この目的に適した酵素には、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１１大腸菌ＤＮ ＡポリメラーゼＩのフレノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアー ゼ欠損Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素が含まれる。プロモーター− プライマー伸長産物の合成およびプロモーター相補配列の合成は第２ブライマー 伸長産物の合成に用いたポリメライゼーション用試薬をも含めて、同一の試薬ま たは異なる試薬を用いて行うことができる。しかしながら、第３図記載の工程を 効率的に行うためには、プロモーター−プライマー伸長産物の合成に使用する試 薬が第３Ｇ図記載の切除反応をも行って第２ブライマー伸長産物のハイブリダイ ズしていない３′末端側の配列を除去し得るものであることが好ましい。合成と 切除反応の両方を行うのに適した酵素には大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ断片およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼなどの３′ −５°エキソヌクレアーゼ活性を有するポリヌクレオチド・ポリメラーゼが含ま れる。

この、または前記の方法により２本鎖核酸生成物が形成されると、それは検出す べき配列の複数個のＲＮＡ転写物の源として作用し、その合成および測定は上記 方法のいずれかを用いて行うことができる。

検出すべき配列とプロモーターを含有する２本鎖核酸の生産にプロモーターーブ ライマーと第２ブライマーとを一緒に用いることの利点は、分析の精度がより大 きいという点にある。プロモーター−プライマーまたは第２プライマーが、検出 すべき配列またはその相補配列以外の配列と間違ってハイブリダイズした場合、 得られたプライマー伸長副産物は被検試料核酸または他のブライマー伸長産物と ハイブリダイズして、ＲＮＡ転写物が合成されるような２本鎖生成物を与えると は考えられない。

また、２個のプライマーを一緒に用いることの他の利点は、検出すべき配列のＲ ＮＡ転写物が様々な大きさで得られることである。

第２図および第３図に記載のごとく、プロモーター−プライマーと第２ブライマ ーとを、１本のプライマーが検出すべき配列の３°末端にハイブリダイズし、他 のプライマーが相補配列の３″末端にハイブリダイズするようにプロモーター− プライマーと第２プライマーとを選択することにより、ＲＮＡ転写物が合成され る核酸生成物の２本鎖領域は、検出すべき配列とプロモーター−プライマーのプ ロモーターのみに限定される。得られたＲＮＡ転写物が様々なサイズであるとい うことは、ゲルろ過クロマトグラフィー等によって被検試料から所望のＲＮＡ転 写物を分離するなど、以後の転写物の検出または単離に好都合である。さらに、 生成された転写物が第１図記載の方法で生成されたものよりも短いと、その合成 はより迅速に進み、かつ必要な試薬の量も少い。

以下の実施例は単なる例示であって、いかなる意味においても本発明を限定する ものではない。本明細書で引用した文献は、すべて明確に記載されている。

実施例１ 本実施例では式： ％式％ で示される配列を有するデオキシリボヌクレオチドプロモーター−プライマーを 用いたＨＴＶ（ヒト免疫不全症ウィルス、以前はＨＴＬＶ−Ｉ［１／ＬＡＶと呼 称されていた）のｅｎｖ遺伝子の検出に関して示す。このプロモーター−プライ マーの配列は、プロモーター−プライマーの５゛末端側がバクテリオファージＴ ７クラス■プロモーター［ダン（Ｄｕｎｎ）およびスタブイア（Ｓ　ｔｕｄｉｅ ｒ）、ジャーナル・オブ・モレキユラー・バイオロジー（Ｊ　９Ｍｏ１．　Ｂ　 ｉｏｌ、　）、１６６：４７７１−６０００の間の配列［ミニシングら（Ｍ　ｕ ｅｓ　ｉｎｇ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１３　：４５０（１９８５） ］と相補的であるように選択されている。

分析用の核酸はクエン酸処理したヒト血液またはウィルス感染Ｈ９細胞［ポボビ ックら（Ｐ　ｏｐｏｖｉｃ）、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２２４：４９ ７（１９８４）］から、［バーマン（Ｈｅｒｍａｎｎ）およびフィシャウフ（Ｆ 　１ｓｃｈａｕｆ）、Ｍｅｔｈ、　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ、、１５２：１８０（１９ ８７）］の方法に従って抽出された。

４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ８，０）、２０　ｍＭ　ＭｇＣＱ−１ＩＩＩ ＩＭジチオスレイトール、５　ｘｇ／　ｍρゼラチン、１０＋ｎＭバナジルーリ ボヌクレオシド複合体、および各１０ｍＭの４種のデオキシリボヌクレオシド三 りん酸（ｄＡＴＰＳｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）および４種のりボヌク レオシド三りん酸（ＡＴＰ、ＵＴＰＳＧＴＰおよびＣＴＰ）を含有する反応バッ ファー１００μρ中のプロモーター−プライマー１００１００ｐに被検試料核酸 合計１０μｇを加える。混合物を１００°Ｃで１分間加熱し、３７°Ｃまで放冷 する。次いで、この混合物に大腸菌り、ＮＡポリメラーゼ■のフレノウ断片５単 位とＴ７ＲＮＡポリメラーゼ５単位とを加え、３７°Ｃで１時間反応を続ける。

生成したＲＮＡ転写物を、式： ％式％ で示される配列を有する３ｆｉｐ末端標識デオキシオリゴヌクレオチドをハイブ リダイゼーションのプローブとして用いるドツト−プロットハイブリッド形成法 によって検出する。上記プローブの配列はＨＩＶゲノム配列のヌクレオチド５８ ７５から５８９５の間に位置すＲＮＡ合成反応の一部をとり１５ＸＳＳＣバツフ アー（１ｘｓｓＣ＝０．１５Ｍ塩化ヂトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウ ム、ｐＨ７，０）１００μＱに加え、５ｘＳＳＣ中で予め湿らせておいたニトロ セルロースフィルターによってろ過する。次いで、フィルターを８０’Ｃで１時 間、真空オーブン中で乾燥する。

乾燥後、各フィルターを５ｘＳＳＣ，５０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ６，５） 、５Ｘデンハート溶液（ＩＸ＝０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％フ ィコール、０．０２％ウシ血清アルブミン、０．２ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ、０ ．２ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、およ び０．２％変性サケ***ＤＮＡからなるハイブリダイゼーション溶液と４２°Ｃ で１時間接触させる。次いで、標識したプローブを終濃度１０　’ｃｐｍ／　Ｊ ｌ（！となるように）＼イブリダイゼーション溶液に加え、４２°Ｃで２時間、 フィルターのインキュベーションを続ける。

最後に、フィルターを５ｘＳＳＣ中、バッファーを２回交換して３７℃で１時間 洗浄する。乾燥後、フィルターをオートラジオグラフィーにかけるかチェレンコ フの放射能測定に付す。

本実施例または以後の実施例はプロモーター−プライマーと第２プライマーとを 一緒に用いてＨＩ　Ｖｅｎｖ遺伝子を検出する方法に関するものである。

実施例１と同様にしてヒト血液またはウィルス感染Ｈ９細胞から調製した被検試 料１０μｇを反応バッファー１００μρ中でプロモーター−プライマー１００１ ００ｐおよび第２プライマー（５’　ＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴ Ａ　３’　）　１００　ｐｍｏｌと混合する。この第２プライマーはＨＩＶのｅ ｎｖ遺伝子のアミ／末端暗号配列（ヌクレオチド５８０３−５８２２）とホモロ ーガスである。このプロモーター−プライマーと第２プライマーとの特殊な組み 合わせは、隣接するＴ７プロモーターの調節（コントロール）下に、それから２ ０６ヌクレオチドのＲＮＡ転写物が合成される、ＨＩＶの肝ｐ責伝子配列中の１ ９８塩基対を含有する２２５塩基対の２本鎖核酸が生産されるよう、選択されて いる。

２個のプライマーと被検試料核酸を含有する混合物を１００’Ｃで１分間加熱し た後、１００°Ｃで１分間加熱し、３７℃まで放冷する。

この時点でエキソヌクレアーゼ不含Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ［シークエナーゼＴ ′″（Ｓ　ｅｑｕｅｎａｓｅ”）、ユナイテノド・スティソ・バイオケミカル− ）−ポレイテッド（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏｒｐ、）］５単位を加える。３７℃で５分間インキュベートした後、再度、反 応混合物を１００°Ｃで１分間加熱し、次いで、３７°Ｃで３０分間〜１時間反 応を続ける。最後に、反応混合物を１００℃で５分間加熱し、４２℃まで冷却す る。

生成したＲＮＡ転写物を第２プライマーと発生期のＲＮＡ転写物とのハイブリダ イゼーションによって特異的に開始される逆転写によって測定する。被検試料反 応混合物に逆転写酵素５単位と一緒に、終濃度１μＭとなるようにα−”Ｐ−ｄ ＴＴＰ（比活性的３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を加えた後、反応混合物を４２°Ｃ で１５分間インキュベートする。

ｓｔｐ標識逆転写産物を、反応混合物中の全酸不溶性放射能を測定することによ り、定量する。反応混合物の１部をポリスチレンチューブに入れた１０％トリク ロロ酢酸（ＴＣＡ）５００μＱに加え、氷上で１０分間インキュベートする。次 いで、各チューブの内容物をワットマンのグラスファイバーフィルターを用いて 吸引ろ過し氷冷ＴＣＡでフィルターを洗浄する。乾燥後、フィルターのチェレン コフの放射能を計数する。

実施例３ ヒト血液またはウィルス感染Ｈ９細胞から単離した核酸を音波処理して剪断し、 平均の長さが５００ヌクレオチドの断片を調製する。

次いで、剪断した被検試料核酸１０μｇを４０　ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ　−ＨＣ１２ （ｐＨ８，０’）、２０ｍＭ　ＭｇＣ（２−１１ｍＭジチオスレイトール、５　 ｘｇ／　ｙｒＱゼラチン、１０ｍＭバナジル−リポヌクレオシド複合体、および 各１０ｍＭの４種のデオキシリボヌクレオシド三りん酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、 ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）および５００℃１Ｍ　ＡＴＰ、５００μＭ　ＵＴＰ、 ５００μＭ　　ＧＴＰおよび５００μＭ　ＣＴＰ、および１　μＭ　ａ−”Ｐ− ＵＴＰ（比活性的３０００　Ｃｉ／　ｍｍｏ＋）を含有する反応バッファー１０ ０μＱ中でプロモーター−プライマー１１００ｐ。

ｌおよび第２プライマー１００１００ｐと混合する。混合物を１００℃で１分間 加熱し、２８°Ｃまで放冷した時点で、逆転写酵素５単位を加える。２８°Ｃで １５分間インキュベートした後、反応混合物を１００℃で１分間再度加熱し、２ ８℃まで放冷する。逆転写酵素５単位およびＴ７ＤＮＡポリメラーゼ５単位を加 え、２８℃で１時間反応を進行させる。

ｓａｐ標識逆転写産物を、上記のごとく、反応混合物中の全酸不溶性放射能を測 定することにより、定量する。２０６ヌクレオチドの標識ＲＮＡ転写物も、ＲＮ Ａ合成反応物の一部を種々の量の放射性１ｉＲＮＡ標準と一緒に尿素−ポリアク リルアミドゲルのオートラジオグラフィーにかけて測定することができる。次い で、現像したオートラジオグラムをデンシトメーター（濃度計）にかけて解析す ることによりｅｎｖｉｌｉ伝子配列の２０６ヌクレオチド転写物を定量する。

国際調査報告 Ｉ吻−−ｍｌ＾−−−鵬ＰロバＪＳ　８９１００１２０国際調査報告　　　ＰＣ Ｔ／ＵＳ　８９１００１２０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．核酸を含有する被検試料中の特定の核酸配列を検出する方法であって、 （ａ）検出すべき配列とプロモーターとを含有する２本鎖核酸を合成し、 （ｂ）該プロモーターのコントロール下で該２本鎖核酸から複数個のＲＮＡ転写 物を合成し、 （ｃ）工程（ｂ）で生産されたＲＮＡ転写物の存在を測定し、そして（ｄ）該Ｒ ＮＡ転写物の存在を、検出すべき核酸配列の存在に関係づけることからなる方法 。 ２．被検試料中の検出すべき特定の核酸配列が２本鎖ＤＮＡに含有されており、 工程（ａ）より前に、またはその間に変成によって鎖が分離されるものである請 求項１記載の方法。 ３．被検試料中の検出すべき特定の核酸配列がＲＮＡまたは１本鎖ＤＮＡに含有 されているものである請求項１記載の方法。 ４．検出すべき特定の核酸配列が遺伝的疾患を特徴づけるものであるか、あるい は病原微生物または腫瘍遺伝子中に含有されている配列とホモローガスなもので ある請求項１記載の方法。 ５．病原微生物がレトロウイルスまたは細菌である請求項４記載の方法。 ６．病原微生物がヒト免疫不全症ウイルスである請求項４記載の方法。 ７．プロモーターがバクテリオファージＴ７プロモーターであり、複数個のＲＮ Ａ転写物がＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成されるものである請求項１記載 の方法。 ８．プロモーターがバクテリオファージＳＰ６プロモーターであり、複数個のＲ ＮＡ転写物がＳＰ６ポリメラーゼを用いて合成されるものである請求項１記載の 方法。 ９．被検試料核酸配列が工程（ａ）より前に、またはその間に制限酵素によって 消化される請求項１記載の方法。 １０．工程（ａ）の２本鎖核酸が、 （１）プライマーと結合したプロモーターを含有するオリゴヌクレオチド、プロ モーター−プライマーを得、（２）プロモーター−プライマーと検出すべき核酸 配列とをハイブリダイズさせる条件下で被検試料とプロモーター−プライマーと を接触させ、そして （３）工程（２）においてプロモーター−プライマーがハイブリダイズした被検 試料核酸配列を鋳型とし、検出すべき核酸配列と相補的な伸長産物をプロモータ ー−プライマーから合成することからなる工程で調製されるものである請求項１ 記載の方法。 １１．プロモーター−プライマー伸長産物の合成が、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ Ｉ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、およびＴ４ＤＮＡポリメラー ゼからなる群から選択される酵素を用いて行われるものである請求項１０記載の 方法。 １２．工程（ａ）の２本鎖核酸が、 （１）プライマーと結合したプロモーターからなるオリゴヌクレオチド、プロモ ーター−プライマーおよびオリゴヌクレオチド第２プライマーであって、該プラ イマーは互いに相補的でなく、しかも１方のプライマーから合成された伸長産物 をその相補体から分離したときに、それがもう１方のプライマーの伸長産物の合 成のための鋳型となるよう選択されているものを得、（２）プロモーター−プラ イマー伸長産物が合成されるハイブリダイゼーション条件下で被検試料とプロモ ーター−プライマーとを接触させ、そして （３）第２プライマー伸長産物が合成されるハイブリダイゼーション条件下で被 検試料と第２プライマーとを接触させることからなる方法で得られるものである 請求項１記載の方法。 １３．プライマー伸長産物の合成がエキソヌクレアーゼ欠損Ｔ７ＤＮＡポリメラ ーゼまたは逆転写酵素を用いて行われる請求項１２記載の方法。 １４．プライマー伸長産物の合成がエキソヌクレアーゼ欠損Ｔ７ＤＮＡポリメラ ーゼ、および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノ ウ断片およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択きれる１またはそれ以 上の酵素を用いて行われる請求項１２記載の方法。 １５．プライマー伸長産物の合成が逆転写酵素、および大腸菌ＤＮＡポリメラー ゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ からなる群から選択される１またはそれ以上の酵素を用いて行われる請求項１２ 記載の方法。 １６．プロモーター−プライマー伸長産物の合成が第２プライマー伸長産物の合 成の前に実施され、かつ該プロモーター−プライマー伸長産物の合成がエキソヌ クレアーゼ欠損Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素を用いて行われる請求 項１２記載の方法。 １７．第２プライマー伸長産物の合成がプロモーター−プライマー伸長産物の合 成の前に実施され、かつ第２プライマー伸長産物の合成が大腸菌ＤＮＡポリメラ ーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片およびＴ４ＤＮＡポリメラー ゼからなる群から選択される酵素を用いて行われる請求項１２記載の方法。 １８．工程（ｂ）で合成されたＲＮＡ転写物が標識されているものである請求項 １記載の方法。 １９．ＲＮＡ転写物が１またはそれ以上の放射性同位元素で標識されており、取 り込まれた放射能の量を測定することにより工程（ｃ）が達成される請求項１８ 記載の方法。 ２０．ＲＮＡ転写物が検出可能な非放射能性の化学修飾により標識されているも のである請求項１８記載の方法。 ２１．工程（ｂ）の後、工程（ｃ）の前にＲＮＡ転写物をハイブリダイゼーショ ン条件下、ＲＮＡ転写物中の予め選択された配列とハイブリダイズするように選 択されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させる請求項１記載の方法。 ２２．ＲＮＡ転写物が固体支持体に固定化されている請求項２１記載の方法。 ２３．標識された伸長産物が、プローブがハイブリダイズしているＲＮＡ転写物 を鋳型としてオリゴヌクレオチドプローブから合成されたものであり、工程（ｃ ）がプローブ伸長産物の量を測定することにより達成される請求項２１記載の方 法。 ２４．プローブ伸長産物が１またはそれ以上の放射性同位元素で標識されており 、工程（ｃ）が放射能を測定することにより達成される請求項２３記載の方法。 ２５．プローブ伸長産物が検出可能な非放射能性の化学修飾により標識されてい るものである請求項２３記載の方法。 ２６．プローブが標識されており、工程（ｃ）がＲＮＡ転写物とハイブリダイズ したプローブの量を測定することにより実施される請求項２１記載の方法。 ２７．プローブが１またはそれ以上の放射性同位元素で標識されており、工程（ ｃ）が放射能を測定することにより実施される請求項２６記載の方法。 ２８．プローブが検出可能な非放射能性の化学修飾により標識されているもので ある請求項２６記載の方法。 ２９．標識が光学的分析によって検出されるものである請求項２０、２５または ２８記載の方法。 ３０．標識がビオチンである請求項２０、２５または２８記載の方法。 ３１．１本領ＤＮＡを含有する被検試料中の特定の核酸配列を検出する方法であ って、 （ａ）被検試料と、プライマーと結合している、献呈されたＲＮＡポリメラーゼ のためのプロモーターを含有するオリゴヌクレオチド、プロモーター−プライマ ーとを、プロモーター−プライマーを検出すべき核酸配列にハイブリダイズさせ る条件下で接触させ、（ｂ）被検試料をＤＮＡポリメラーゼと接触させて検出す べき核酸配列とプロモーター−プライマーのプロモーターとを含有する２本鎖核 酸を合成し、 （ｃ）工程（ｂ）の生産物をオリゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーの プロモーターを認識し得る献呈されたＲＮＡポリメラーゼと接触させ、それによ って該プロモーターのコントロール下だＲＮＡポリメラーゼにより、検出すべき 核酸配列の様々なＲＮＡ転写物を合成し、 （ｄ）工程（ｃ）で合成されたＲＮＡ転写物の存在を測定し、そして（ｅ）ＲＮ Ａ転写物の存在と検出すべき核酸配列の存在とを関係づけることからなる方法。 ３２．ＲＮＡまたは１本鎖ＤＮＡを含有する被検試料中の特定の核酸配列を検出 する方法であって、 （ａ）被検試料と、プライマーと結合している献呈されたＲＮＡポリメラーゼの ためのプロモーターを含有するオリゴヌクレオチド、プロモーター−プライマー とを、プロモーター−プライマーを検出すべき特定の核酸配列にハイブリダイズ させる条件下で接触させ、（ｂ）被検試料を逆転写酵素と接触させ、工程（ａ） でプロモーター−プライマーがハイブリダイズした被検試料ＲＮＡまたは１本鎖 ＤＮＡをプロモーター−プライマーＤ再Ａ伸長産物合成の鋳型として、プロモー ター−プライマーＤＮＡ伸長産物を合成し、（ｃ）工程（ｂ）の生産物を変成条 件下で処理してプロモーター−プライマーＤＮＡ伸長産物をその鋳型から分離し 、（ｄ）工程（ｃ）で生産された１本鎖核酸と、オリゴヌクレオチド第２プライ マーであって、検出すべき核酸配列の全体または一部とホモローガスであり、工 程（ａ）で用いたプロモーター−プライマーと相補的でないよう選択された第２ プライマーとを、該第２プライマーをプロモーター−プライマーＤＮＡ伸長産物 にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、 （ｅ）工程（ｄ）の生産物をＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素と接触させ、 プロモーター−プライマーＤＮＡ伸長産物を第２プライマー伸長産物合成の鋳型 として第２プライマーＤＮＡ伸長産物を合成し、 （ｆ）工程（ｅ）の生産物をオリゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーの プロモーターを認識し得る献呈されたＲＮＡポリメラーゼと接触させ、そのこと によって該プロモーターのコントロール下に検出すべき核酸配列の複数のＲＮＡ 転写物を合成し、そして（ｇ）ＲＮＡ転写物の存在を検出すべき核酸配列の存在 に関係づけることからなる方法。 ３３．ＲＮＡまたは１本鎖ＤＮＡを含有する被検試料中の特定の核酸配列を検出 する方法であって、 （ａ）被検試料とオリゴヌクレオチド第２プライマーとを、第２プライマーを検 出すべき特定の核酸配列にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、 （ｂ）被検試料を逆転写酵素と接触させ、工程（ａ）で第２プライマーがハイブ リダイズした被検試料ＲＮＡまたは１本領ＤＮＡを第２プライマー伸長産物合成 の鋳型として第２プライマー伸長産物を合成し、 （ｃ）工程（ｂ）の生産物を変成条件下で処理して第２プライマーＤＮＡ伸長産 物をその薄型から分離し、 （ｄ）工程（ｃ）で生産された１本鎖核酸を、献呈されたＲＮＡポリメラーゼの ためのプロモーターがプライマーに結合してなるプロモーター−プライマーであ って、検出すべき核酸配列の全体または一部とホモローガスであるが、工程（ａ ）で用いた第２プライマーとば相補的でないように選択されているオリゴヌクレ オチド、プロモーター−プライマーと、該プロモーター−プライマーを第２プラ イマー伸長産物にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、（ｅ）工程（ｄ）の 生産物をＤＮＡポリメラーゼと接触させて第２プライマーＤＮＡ伸長産物をプロ モーター−プライマーＤＮＡ伸長産物の合成における鋳型としてプロモーター− プライマーＤＮＡ伸長産物を合成し、 （ｆ）工程（ｅ）の生産物をオリゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーの プロモーターを認識し得る献呈されたＲＮＡポリメラーゼと接触させ、それによ って該プロモーターのコントロール下に検出すべき核酸配列の複数のＲＮＡ転写 物を合成し、そして（ｇ）該ＲＮＡ転写物の存在を検出すべき核酸配列の存在に 関係づけることからなる方法。 ３４．１本鎖ＤＮＡを含有する被検試料中の特定の核酸配列を検出する方法であ って、 （ａ）被検試料とオリゴヌクレオチド第２プライマーとを、第２プライマーを特 定の核酸配列にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、 （ｂ）被検試料をＤＮＡポリメラーゼと接触させて、工程（ａ）で第２プライマ ーがハイブリダイズした被検試料ＲＮＡまたは１本鎖ＤＮＡを第２プライマー伸 長産物合成の鋳型として第２プライマー伸長産物を合成し、 （ｃ）工程（ｂ）の生産物を変成条件下で処理して第２プライマーＤＮＡ伸長産 物をその鋳型から分離し、 （ｄ）工程（ｏ）で生産された１本鎖核酸と、献呈されたＲＮＡポリメラーゼの ためのプロモーターがプライマーに結合してなるプロモーター−プライマーであ って、検出すべき核酸配列の全体または一部とホモローガスであるが、工程（ａ ）で用いた第２プライマーとは相補的でないように選択されているオリゴヌクレ オチド、プロモーター−プライマーとを、プロモーター−プライマーを第２プラ イマー伸長産物にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、（ｅ）工程（ｄ）の 生産物をＤＮＡポリメラーゼと接触させて第２プライマーＤＮＡ伸長産物をプロ モーター−プライマーＤＮＡ伸長産物の合成における鋳型としてプロモーターー プライマーＤＮＡ伸長産物を合成し、 （ｆ）工程（ｅ）の生産物をオリゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーの プロモーターを認識し得る献呈されたＲＮＡポリメラーゼと接触させ、該プロモ ーターのコントロール下に検出すべき核酸配列の複数のＲＮＡ転写物を合成し、 そして（ｇ）該ＲＮＡ転写物の存在を検出すべき核酸配列の存在に関係づけるこ とからなる方法。 ３５．オリゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーとオリゴヌクレオチド、 プローブとを含有する被検試料中の核酸配列を検出するために用いられるキット であって、プロモーター−プライマーは被検試料核酸配列とハイブリダイズする ことができ、オリゴヌクレオチド、プローブは検出すべき核酸配列の全体または 一部とホモローガスであるキット。 ３６．オリゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーとオリゴヌクレオチド、 第２プライマーとを含有する被検試料中の核酸配列を検出するためのキットであ って、プライマーは相互に相補的でなく、１個のプライマーは被検試料核酸とハ イブリダイズすることができ、他のプライマーは検出すべき核酸配列の相補体と ハイブリダイズすることができるように選択されているものであるキット。