JPS5855759A - 二重抗体接合体 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫学的検定の分野に関するものであ′り且つ
更に詳細にはへテロ−２官能性カツプリング剤の使用に
よる異なる特異性の免疫グロブリンの連結によって形成
せしめた免疫学的検定試薬に関するものである〇 細菌性物質による人体の侵襲及びそれによって生じる感
染は、多様なまたＦｉ最低限度の病的作用のために、診
断が困難なことが多い。免疫学、すなわち、人体への異
物の侵入に対する免疫応答の研究は、それ自体、２部類
の高分子に関係する。

これらの部類、抗原及び抗体、は特異的に反応する。侵
入する異物すなわち抗原蝶一般に付随する２性質、免疫
原性、すなわち、相当する抗体の生成を刺激する能力、
及びそれらの抗体と特異的に反応する能力を有している
。抗体自体拡、その特異的抗原との反応のために抗原の
存在に応答して生成する蛋白質である。抗体は免疫グロ
ブリンと呼ばれる特別なグループの血清蛋白質に輌する
。

抗体のグループは、抗原と特異的に反応することができ
る限られたグループの蛋白質から成っているけれども、
蛋白質、多くの多糖類、核蛋白質、リボ蛋白質、多くの
合成ポリペプチド並びに蛋白質または合成ポリペプチド
に適尚に結合している場合のその他多くの小さい分子を
包含する０抗原として働らくことができる多樵多様な高
分子が存在する。

抗体−抗原反応の％異性は、病的状態であるかまたは正
常状態であるかの診断において、且つ更に特定的には、
抗原性決定子、すなわち、抗体−抗原反応の特異性を決
定する抗原分子の限られた部分、の存在の確定において
、利用されている。

この分野の熟紳者の知識に従って、抗原−抗体反応は、
高感度ｔ−有する酵素免疫学的検定（ＥＩＡ）、放射線
免疫学的検定（ＰＩＡ）また蝶免疫螢光（ＩＦ）の各方
法によって明示することができるけれども、しかしなが
ら、これらの方法は複雑であり且つ一般に着るしい熟練
、時間及び複雑な電子装置を必要とする。

典型的には、溶液中に存在する可溶性抗原の検出は、特
異的抗原−抗体反応の実現を可能とするために十分な濃
度においてその抗原に対して特異的な抗体を添加するこ
とによって、達成することができる。抗原と抗体は結合
して大きな不溶性の凝集物を形成し、それは沈殿として
目に見えるようになる。残念なことに、抗原が低濃度水
準で存在するに過ぎない場合には、それによって生じる
弱い抗原−抗体反応は、直接の■視的検出をｉｉＪ能と
するに十分な大きさと質を有する沈殿を形成しない可能
性がある。沈殿の大きさを増大させ、それによってその
検出を助けるためには、抗原とたとえば不活性ラテック
ス粒子の工うな他の粒子に結合した抗体との凝集は、裸
眼によっていっそう明瞭に見ることができる著るしく大
きな沈殿を生成することが見出されている。

ラテックスまたはポリスチレン重合体から成る不活性粒
子を用いる凝集免疫学的検定は別の問題を提供する。ポ
リスチレンラテックス担体粒子は、水性の媒体中のポリ
スチレンラテックス担体粒子への疎水性物質による物理
的な付着性のために、被覆し且つ標準化することが難し
く、その上非特異的な反応によってｖ４＆−った結果を
与えることが多い。別の方法として、赤血球は便利な抗
原の受動的担体であるから、指標粒子として具合良く用
いられている。主として、赤血球は化学的な固定によっ
て保存することができ且つＲＨＣの表面上に存在する大
部分の抗原は特異的な抗体への結合活性を失なうことな
く化学的な処理に耐えることができることから、成功し
た多くの赤血球結合抗原沈降検査または受動的血液凝集
反応検定が存在する。その上、抗原は赤血球に化学的に
結合し、それによって指標粒子への架橋結合とそれに続
く特異的抗体との免疫学的反応を可能とすることが多い
。

これらの方法と原理は、たとえば、Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｅ
。

Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍ＠ｄ、、第９９巻、４５２〜
４５６頁（１９５８ン中に、ジョセフＳ、イングラハム
による１抗体の滴定のための抗原またはハプテンを結合
させたホルマリｙ処理赤血球の調製と使用”：Ｊｅｔ＋
ｒｎａＬ　　ｏｆ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｅ第９７巻
１第６号＼７９１〜７９６頁（１９６４）中のＨ，Ｍ、
ジョンソンによる１受動的血液凝固検査におけるカップ
リング試薬としての水溶性カルボジイミドの使用”のよ
うな文献中に記されている。

しかしながら、抗体の結合活性を害することなしに赤血
球のよう表較子に抗体を化学的に結合させることは、は
とんど成功していない。たとえは、Ｂ型肝炎の診断のた
めのアルデヒド固定赤血球上のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢ
ｓＡｇ）に対する抗体による逆受動的血液凝集検定（Ｒ
ＰＨＡ）ｔｉｔ米国における肝炎検査の”第三世代”感
度に合致する検査の例であるが、しかし、この検査は、
現行のＲＩＡ肝炎検査よりも感度が低いはかりでなく、
生じる血球沈降様式は、この技術に対する経験の浅いも
のには判断がきわめて難しい０その理由の一つは、表面
上の免疫グロブリン分子の場所または配置の何れかの制
御會伴なって化学的に活性化した粒子ま九は細胞上に抗
体を共有結合によって結合することが不可能なためと思
われる。すなわち、抗体分子線担体表面上でランダムな
配置及び多数の付着ｆｔ＊するものと思われる。かくし
て、抗体の結合活性及び凝集に際して格子構造を形成す
るその能力が着るしく損なわれる。

本発明の一目的は、主として単一の付着によって担体粒
子に結合し九抗体ｔＶし、それによって柔軟な定位と配
座及び別の免疫学的反応に対して解放されている異なる
特異性の他の抗体に対する最低限の影響を提供する、多
重または接合抗体を提供することにある。

従来における多重抗体の使用は、実質的に尾−局方式で
抗体を結合する本発明と異なって、本質的Ｋ１１ｉｉ−
尾結合に限られている。たとえば、ニスウエンダーに対
する米国特許第４．０４ａ２９８号は、抗原性物質また
は配位子を放射性誘導体に変化させ且つ抗体の生産を刺
激するために使用するという、固相二重抗体競合的放射
線免疫検定を目的とする方法金肥している０そののちに
、第一の抗体に対して特異的な第二の抗体を生産する。

第二の抗体は水に不溶性の有機重合体物質または重合体
性を有する物質上に固定することができる。

第二の抗体Ｆｉ第一の抗体−抗原複合体と反応してすべ
ての付着した物質を不溶性の形態に変換させることがで
きる。第二の抗体の活性は、共有結合または物理的な吸
着による付着は非特異性でおって多くの付着サイトで生
じ、その結果として抗体分子の立体配座と柔軟性のゆが
みを生じさせるために、恐らくは低下するものと考えら
れる。その上、放射性同位元素の使用は避けることが好
ましい問題を提供する。特に、これらの問題は、ａ）ｒ
＠を放射する同位元素（たとえば１”！）の比較的短か
い寿命、ｂ）同位元素のγ線による免疫学的反応性と特
異性の低下、Ｃ）連邦基準に準拠し且つ厳密な安全管理
が必要な手順の使用を必要とする危険な放射性同位元素
の使用にか、かわる衛生上の危険、及びｄ）たとえばシ
ンチレーション計数器のような高価で複雑な装置の使用
を包含する。

本発明は、その−目的として、類似の感度を達成するた
めに、試薬、検査手順の複線性の低下及び放射性同位元
素の好ましい回避を達成する。

従来の方法は、前記のように、放射性同位元素、及び螢
光並びに酵素指標及び混成抗体を使用して、感度の向上
管試みていた。

多価混成抗体社従来から生産されているが、その典型的
な方法社ゲーテイー及びモータによって１多価混成抗体
”と趙する論文として、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｔＩ
ｍｏｌｏｇｙ＊　　第１７巻、５９５〜４０１頁（１９
８０）中に配されている。この文献は黄色葡萄状球１１
　（８ｔａｐｈｙｌｅｃｏｅｕｇ　ａｕｒ＠ｕｍ　）　
（５ｐＡ）の蛋白貴人を使用する２重特異性を有する多
価混成抗体の生成金肥している。混成は、Ｆｅ部分によ
ってＩｇＧ分子を結合することができるＳｐＡによる免
疫グロブリン（ＩｇＧ）反応によって行なわれる０たと
えば、抗−人及び抗−Ｂ抗体ｔｓｐＡと反応させて、（
ＩｇＧ抗−Ａ／ＳｐＡ／ＩｇＧ／抗−Ｂｈと記される分
子組成含有する多価混成抗体全形成させる。しかしなが
ら、この試薬は、巣−柚の抗原の存在において混成の多
価抗体によって生じる可能性のある非特異的な凝集のた
めに、凝集検査または指標粒子への付着には適当でない
。本発明は非特異的な凝集を避けるために、担体粒子へ
の付着に対する、たとえば、ＩｇＧのＦａｂ’　フラグ
メントのような１価の抗体の使用を教えている。

これは、８ｐＡとの反応は免疫グロブリンのＦｃ部分の
存在を必要とするが、その部分は１価のＦａｂ’フラグ
メント中には存在しないことに、工つて、ゲーテイー及
びモータの系によって不可能である。

グーチー及びモータが引用しているＡｒｅｈ１マ＠１ｏ
ｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｅｓ第９３巻、４６０〜４６２頁（１９６１）中
のニソノフとリバースの論文は、抗−Ａ　（Ｆａｂ’）
雪と抗−Ｂ（Ｆａｂ’）１の還元からの両Ｆａｂ’フラ
グメントの組変えによる２重特異性ｔ−Ｗする１価の混
成抗体分子の製造を記している。この方法に伴なう問題
は、ランダムな組合わせ並びに不必要な抗−Ａ／抗−Ａ
及び抗−Ｂ／抗−Ｂ組変えによる妨害を包含する。本発
明の目的は２種の異なる特異性の免疫グロブリンを接合
することができるヘテロ−２官能性カツプリング試薬の
使用によるこれらの問題の回避を包含する。ヘテロ−２
官能性カップリすグ剤社、以下の文献に記されている：
Ｊ６カールツソンらｓ　Ｂ１ｏ＊に＠ｍ１ｇｔｒｙ　Ｊ
ｏｕｒｎａｌ＊第１７３巻、７２３〜７３７頁（１９７
８）　；　Ｇ、インヵヮら、Ｅｎｚｙｍ＠　Ｌａｂ＠ｌ
ｅｄ　　Ｉｍｍｕｎｏａｍｓａｙ　　ｏｆＨ＠ｒｎ＠ｓ
＠ｓ　　ａｎｄ　　ｇｎｚｙｍｅｓｅ　　Ｓ、Ｂ、パル
編、４３′〜５７頁（１９７８）；Ｔ、キタガヮ及びＴ
、アイカワ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈ＠ｍ１
ｓｔｒｙ　　第７９巻翫２３３〜２３５頁（１９７６）
；Ｊ、Ｎ、メリットら％　Ｊ＊ｔｒｒｎａｌ　　ｏｆ　
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　　Ｍ＠ｔｋ・ｄｓ＊　　第２
８巻、２５〜３２頁（１９７９］；Ｉｅ、Ｓ、Ｌ／クタ
１ら、Ｊ＠ｔＩｒｍａｌ　　ｏｆ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ　　Ｍ＠ｔｈｏｄｓｓ第２４巻、３２１〜５３６頁
（１９７８）；及びＳ、Ｎシタケら、Ｅｕｒｏｐ＠ａｎ
　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ−ｅｈｓｍｉｓｔｒｙ
−第１０１巻、５９５〜５９９頁（１９７９）。

Ｊ＠ｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｉｍｍｍｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　　Ｍ＠ｔｈｏｄｓｓ第５９巻、１〜１３頁（１９８
０）におけるＪ、　Ｌ。

ゲストン及びＳ、アブ２ヌス′にょる“レクチン免疫検
査″は、標識として新鮮な赤血球ｔ−使用する抗原検出
のための更に他の可能な方法を記している。この文献は
、標識物質を結合するためにレクチン上に存在する結合
サイトを用いるコンカバリンム抗体接合体の使用を開示
している。この提案した方法及び試薬は、いくつかの不
利な点、なかでも連結のためのグルタルアルデヒドの使
用及びそれに基づくこのような非選択的な連結方法の共
Ｍ結合性による接合体の組成の複雑化、ｔ−提供する。

更に、レクチン抗体接合体は直接的な受動性赤血球凝集
検査には不適当であって、固相免疫吸着検査に対しての
み限定される。コンカナバリンＡが引き起す非特異的な
赤血球凝集反応は、Ｃの検査方法の適用性と感度を限定
する。

肝炎抗原の存在の決定のために考案された、免疫学的検
定標ｉ１ｍまたは指標として新鮮な赤血球を使用する別
の方式は、ＶＯ！　Ｓａｕｇ、　　第２０巻、１７８〜
１８１頁（１９７１）中におけるＭ、マユミらによる免
疫性付着赤血球凝集検査中に記されている。ここに提案
された方法は、抗原−抗体−補体複合体が赤血球に付着
し、かくして肝炎抗原に対する赤血球凝集検査を提供す
るという原理を利用している。この方式の欠点は、補体
固定検査線一般にきわめて安定とはいえず、可逆的であ
り且つその遂行に大きな技術的熟ＩＩＩｔ−要するとい
うことである。

前記のようなアルデヒド処理によって抗体が受ける損傷
に加えて、他の問題は、細胞間の接触を僅かな点に限定
し、それによって凝集マトリックスを保持すべき力を弱
いものとするこのような固定した細胞の硬さを包含する
。それに対して１本発明において使用する新鮮な細胞は
、柔軟な膜のために多くの区域における多くの細胞間接
触ｔ−有し、その結果としてマトリックスパターンのよ
り優れた保持を示す０かくして、指標物質としての新鮮
な赤血球と共に２重抗体接合体を使用する本発明におい
ては、より高い感度に到達することができる。アルデヒ
ド処理した細胞において遭遇する別の問題は、その細胞
が次第に疎水性となり、一方、それが自動的な凝集、す
なわち非特異的な凝集を生じさせるということである。

このような問題についての考察は、Ｐｒｏｅｓ　Ｓａｃ
、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ。

Ｍ＠ｄ、、　　第９９巻、４５２〜４５６頁（１９５８
）中にＴ、　Ｓ、イングラムによって論じられている。

赤血球は本発明において凝集剤として大きなＭ用件を有
しているけれども、本発明蝶赤血球の代りとして他の標
識物質を使用しうるという融通性と可能性′ｔ″有して
いる。そのような物質としては酵素、放射性同位元素、
螢光色素、電子不透過性物質及び螢光性または非螢光性
染料物質を混入させることができる重合体の微小球体を
包含する。

第一の免疫グロブリンは、直接にこれらの標識物質への
親和性または標識物質に対して結合した他の物質への親
和性に関して選択することができる。酵素、放射性同位
元素また紘電子不透過性物質の使用は、赤血球によって
必要なものよりも複雑な手順と装置を必要とするが、そ
れにもかかわらず、特別な情況においては臨床医によっ
て望まれている。

上述の目的に加えて、可溶性抗原の検出のために有用な
直接的な凝集剤として二重抗体接合体を使用する診断的
に有用な試薬を提供すること窒もまた本発明の目的であ
る。本発明のもう一つの目的は、最高の感度をもって凝
集させることができる試薬の形成を可能とする最大の抗
体結合活性を有する試薬を提供することにある０高度に
熟練した取扱い技術または複雑且つ高価な装置を必要と
しない方法及び材料を提供することは、本発明の他の目
的である０肝炎検査のための第三世代感度に対する要望
に合致する材料と方法を提供することは本発明のさらに
他の目的である。螢光色素、酵素、赤血球、電子不透過
性物質、放射性同位元素、及び重合体微小球体と共に使
用することができる試薬を提供することは本発明の更に
別の目的である。使用者から取得されるかまたは凝集剤
と組合わせて供給される新鮮な赤血球を使用することが
できる凝集剤を提供することは別の目的である。水溶性
または水性の試料中の特別な抗原の存在を検出するため
の方法を提供すること鉱本発明のもう一つの目的である
。

本発明の目的に従って、凝集検査のための異なる血清学
的決定子に対して特異的な抗体の選択的接合から成る診
断上有用な試薬並びにその使用方法を提供する。更に詳
細には、本発明は規定した特異性ｔＷする第一の免疫グ
ロブリン、第一の免疫グロブリンとは異なる特異性をＭ
し且つ検出すぺき抗原に対して特異的な第二の免疫グロ
ブリン及び該第−の免疫グＵプリンを該第二の免疫グロ
ブリンに対して選択的に連結するヘテロ−２官能性カツ
プリング剤を含有して成る抗原を検出するための免疫学
的検定試薬に関するものでめる０第一の免疫グープリン
の規定した特異性拡、試薬と抗原の組合わせを固定また
は検出するために有用となるように選ぶことが好ましい
０そのために社、基質すなわち粒子の表面上に現われる
抗原に対して特異的であるか、また社標繊あるいは指標
物質に対して特異的であればよい〇 本明細書において用いる場合の１選択的連結２トハ、ヘ
テロ−２官能性カツプリング剤が抗体をカップリング剤
に結合させるための官能基の選択と有効性の順序に基づ
いて、異なる特異性の他の免疫グロブリンＬりも１免疫
グロブリンを識別してそれに結合することができること
を意味し；好適な結合の選択性は部分的に異なる結合系
数に工って支配される。

本発明は更に、指標物質を使用して抗原を検出するため
に用いる免疫学的検定試薬を提供するが、この試薬は、
該指標物質に対して自然にまたは人為的に結合した抗原
に対して特異的な第一の免疫グロブリン；検出すべき抗
原に対して特異的な第二の免疫グロブリン−及びスルフ
ヒドリル反応性官能基とアミン反応性官能基を提供し且
つ該第−の免疫グロブリンを該第二の免疫グロブリンに
対して選択的に連結することができるヘテロ−２官能性
カップリング剤ｔ−ｔＷしている。更に詳細には、この
免疫学的検定試薬はチオール結合の生成によって該第−
の免疫グロブリンに対して共有結合的に結合し且つアミ
ド結合の形成によって鈑第二の免疫グロブリンに対して
共有結合的ＶＣ，結合するヘテロ−２官能性カツプリン
グ剤ｔＮしている０好適実施形態においては、ヘテロ−
２官能性カツプリング剤は水と混和する溶剤中に可溶で
あり且つ該第−及び第二の免疫グロブリンの結合活性の
実質的な損失を生じることがない。

本発明の免疫学的検定試薬の追加的な実施形態紘、次の
ものを包含する：該第−の免疫グロブリンがペプシン消
化とジチオトレイトール還元に続（ＩｇＧのＦｍｂ’　
１価フラグメント（このようなフラグメントは、２価の
免疫グロブリンでは非特異的な凝集を生じさせるために
、凝集系において必要である）である場合のもの：指標
物質が赤血球であり且つ該第−の免疫グロブリンは該赤
血球の表面上に自然に存在する該連合する抗原に対して
特異的である場合のもの：指標物質が人為的に表面に植
付けた会合する抗原ｆ：有する固定した赤血球であり且
つ該第−の免疫グロブリンが該会合した抗原に対して特
異的である場合のもの；及びヘテロ−２官能性カツプリ
ング剤がＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−
ニトロフエ／　−ルエステル及び１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾールエステルより成る群から選択されるアミン
反応性官能基、とマレイミド、ヨードアシル及び２−ピ
リジルジチオより成る群から選択されるスルフヒドリル
反応性官能基ｔＮしている架橋結合試薬である場合のも
の０ 本発明における免疫学的検定試薬の好適実施形態におい
ては、第二の免疫グロブリンは、多クローン性または単
クローン性起源の何れかの人または動物の抗−Ｂ型肝炎
表面抗原免疫グロブリンであり：且つ指標物質は赤血球
、酵素、放射性同位元素、螢光色素、電子不透過性物質
及び重合体微小球体より成る群から選択される。

本発明は更に、会合した抗原を肩する指標物質、該会合
した抗原に対して特異的な第一の免疫グロブリン、検出
すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グロブリン、及
び該第−の免疫グロブリンを該第二の免疫グロブリンに
対して選択的に連結するヘテロ−２官能性カツプリング
剤管含有して成る抗原を検出する夷めの免疫学的検定試
薬を提供する。

更に本発明は：水性の試料１　　ｍ）　会合した抗原ｔ
Ｗする指標物質を使用して抗原を検出するための：該会
合し九抗原に対して特異的な第一の免疫グロブリン、検
出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グロブリン、
及び該第−の免疫グロブリンを＃第二の免疫グロブリン
に対して選択的に連結するヘテロ−２官能性カツプリン
グ剤管含有して成る免疫学的検定試薬、及びｂ）該指標
物質と一緒にして混合物を形成させ；該混合物管攪拌し
：該混合物を動揺させずに沈降させ：且っ該混合物を指
標物質について観察し、それによって検するための方法
を提供する。別法として、試薬を試料と混合する前に、
指標物質を試薬に対して添加しておいてもよい。好適実
施形態においては、指標物貴社赤血球と微小球体より成
る群から選択され且つ沈降させる段階は凝集反応の存在
についての該混合物の観察を包含しそれによって検出す
べき抗原の存在を指示する。水性の試料中の特定の抗原
の存在を検出するための別の好適実施形態においては、
該指標物質が赤血球であり、検出すべき該抗原か人の絨
毛性性腺刺激ホルモン及びＢ型肝炎表面抗原より成る群
から選択される場合；あるいは該第二の免疫グロブリン
を抗−人の絨毛性性腺刺激ホルモン免疫グロブリン及び
抗−Ｂ型肝炎表面抗原免疫グロブリン（何れの免疫グロ
ブリンも多クローン性または単クローン性起源のもので
ある）の群から選択される場合に、本発明の方法管使用
する。

更に本発明Ｆｉ二　　　　　　　　　　　指標物質の使
用下に、指標物質に対して特異的な第一の１価の免疫グ
ロブリン、検出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫
グロブリン、及びスルフリル反応性官能基及びアミン反
応性官能基を提供し且つ該第−の免疫グロブリンな骸第
二の免疫グロブリンに選択的に連結させることができる
ヘテロ−２官能性カップリング剤ｔ−有して成る抗原を
検出するための免疫学的検定試薬を表面と接触させ；更
に核表面を赤血球、酵素、放射性同位元素、螢光色素、
電子不透明物質、及び重合体微小球体より成る鮮から選
択される指標物質と接触させ；骸試薬と該指標物質を反
応させ：未反応の試薬と指標物質を除去し；且つ該表面
を骸指標粒子の存在について調べ、それによって該特定
抗原を決定することができるという諸段階を含有して成
る、該表面上に存在する該特定抗原の存在を検出するた
めの方法を提供する０ 更に本発明は：表面を、会合した抗原ｔＶｔ−る指標粒
子（ここで指標物質は赤血球、酵素、放射性同位元素、
螢光色素及び重合体微小球体から成るグループから選択
する）：該会合した抗原に対して特異的な第一の免疫グ
ロブリン、検出すべき特定の抗原に対して特異的な第二
の免疫グロブリン、及び該第−の免疫グロブリンを該第
二の免役グロブリンに対して選択的に連結するヘテロ−
２官能性カツプリング剤を含有して成る抗原を検出する
ための免疫学的検定試薬と接触さぜ；該試薬を該表面と
反応させ；未反応の試薬と指標粒子を除去し；且つ該表
面を該指標粒子の存在について調べそれによって該抗原
の存在を決定することができるという諸段階から成る、
表面上に存在する特定の抗原の存在を検出するための方
法を提供するＯ 特定の抗原の存在を検出するための方法のその他の実施
形態は、第一の免疫グロブリンｔ１価の免疫グロブリン
として指定し：または検出すべき抗原を組織上の存在と
してまたは固相基質上に固定したものとして指定する〇 本発明のいっそうの理解ならびにそのはかの目的は、図
面の説明によって明白となるであろう０第１図は、指標
または担体粒子及び検出すべき抗原に付着した本発明の
二重−抗体接合体を模式的に示す図である０特に第１図
は、表面上に、人為的または自然に鋳発した、抗体２が
それに対して特異的である抗原を有している指標粒子ま
九は担体物質１を示している。抗体２絋、非特異的凝集
反応を低減するようにベグシン消化及びジチオトレイト
ール還元を行表うた、たとえばＦａｂ’フラグメントの
ように１価であることが好ましい。ヘテロ−２官能性カ
ツプリング試薬３を用いて、免疫グロブリン２′ｔ−１
検出すべき抗原５に対して特異的な免疫グロブリン４と
、共有結合によって結合する。従来は、たとえば免疫グ
ロブリンのような蛋白質を、たとえばグルタルアルデヒ
ド、ジイミデート、ジイソシアネート、ジフェニルアジ
ド及ヒジマレイミドびょうな同種２官能性試薬の使用に
よって、共有結合的に結合していたが、しかしながら、
これらの試薬は、蛋白質上の同一の２官能基、たとえば
アミノ、フェノール及びチオール基、の反応に限定され
る０その結果、これらの非選択的カップリング試薬は、
分子内架橋、自己縮合、重合及びその結果生じる抗体結
合活性の低下のために、免疫学的検定手順における限ら
れた成功を招くにすぎなかった。

本発明は、蛋白質上の真なる基と選択的に反応するヘテ
ロ−２官能性カツプリング剤３の使用によって、これら
のやっかいな局面を回避する。ヘテロ−２官能性カツプ
リング剤の選択的な連結の局面は、試薬の一端における
アミド結合と他の末端におけるチオール結合の生成によ
って、自己縮合生成物の形成を回避する０これらの異な
る各結合線、それぞれ異なる抗体の結合または接合のた
めに用いることができる。更に、免疫グロブリン蝶、大
または動物源と何れかから単離した、もとのまま、また
はフラグメントとした抗体とすることができる。これら
の抗体は多クローン性の起源のものまた蝶たとえば抗−
ＨＢｓムｇ単りｐ−ン性抗体を生じるマウスハイブリド
ーマ細胞系のようなモノクローン性起源のものとするこ
とができる。

いうまでもなく、純度と結合活性の点で抗体の品質が高
いほど、生じる試薬の特異性と感度が大きい０ さらに第１図を参照すると、理想的には、粒子すなわち
担体に対して特異的な免疫グロブリン２は、ヘゲＣ１−
２官能性カップリング架橋３によって、１価、２価また
はＩｇＭにおけるような５価の何れかとすることができ
る他の免疫グロブリン４と結合した、１価の免疫グロブ
リンまたはそのＦａｂ’　７ラグメント（Ｆａｂ’はＩ
ｇＧ　（Ｂｕｌｌｅｔｉｎｏｆ　Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌ
ｔｈ　　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ＋　　第５０巻、４
４７負、１９６４年中に定義された免疫グロブリン）の
ペプシン消化及びジチオトレイトール（ＤＴＴ）還元に
よる１価の７ラグメントである〕である。指標すなわち
担体物質に対して特異的な免疫グロブリン２は、早期の
粒子間格子の形成による非特異的凝集反応を回避し且つ
また粒子表面上における接合した高分子の最大量の回転
または振動を可能とするために二重抗体接合体による指
標物質上への単一の付着が存在するように、１価である
ことが好ましい。かくして、問題とする抗原４に対する
特異性によって選択する免疫グロブリン４＃′ｉ、結局
、実質的に免疫グロブリン２の尾の部分でチオール結合
により免疫グロブリン２に結合し、その結果、再配置し
且つ問題としでいる特定の抗原と反応するべきその能力
の点で、全く柔軟性である。

実質的に、尾−カツブリング剤−尾の配置は、粒子表面
１の密接な接触によって生じる立体障害のための免疫グ
ロブリン４の何らかの立体配座変化が最低限であると予
想される故に、いっそう有利でめる◎抗体４の結合サイ
トは、抗体２とカップリング剤５の広がりのために、化
学的に付着した抗体につ諭ての従来の技術の特徴である
ような、粒子表面上でのぐらつきや障害がなくて、いっ
そう露出していると思われるので、子側される２重抗体
接合体被覆した粒子は、それらの特異的抗原と容易に反
応して、直接的な凝集反応における格子の生成を保つ。

接合体結合凝集検査に対する４標として理想的に適した
粒子は天然産の表面抗原〔たとえば赤血球（ＲＢＣｓ）
）ｉ有する粒子並びに人為的に植え付けた抗原を肩する
粒子を包含する。血液型免疫反応によって生じる赤血球
凝集反応を回避するためには、Ｒｈ陰性０型赤血球を使
用することが好ましい。

ヘテロ−２官能性試薬の部類は、スルフリル反応性官能
基、たとえば、マレイミド、ヨードアセチルまたは２−
ピリジルジチオ基、且つ筐だ、たとえばＮ−ヒドロ中ジ
ースクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェノールエス
テル、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルなど
のような活性エステルのアミン反応性官能基ｔＷする薬
品を包含する。これらの両種の反応性基ｔＮＬ且つ好ま
しくは水と混和性の溶剤、たとえば、ジオキサン、アセ
トンまたはジメチルホルムアミド、中に可溶な化合物が
抗体の接合の丸めに適している。試薬または溶剤は顕著
な変性または結合活性の低下をも良らさないことが好ま
しい。これらの２官能的に反応性の基ｔ−有するカップ
リング試薬は、高温、塩基及び求核性物質の存在を包含
する種々の条件下に不安定であるから、これらの試薬拡
典型的には無水で低温（０℃以下）において頂蔵し且つ
使用直前に適尚な溶剤中に溶解することが望ましい。

接合は、使用する特定のカップリング剤に依存して、！
ＬＯ−ａｓのｐＨに緩衝した水性の媒体中で行なうこと
が好ましいｏｐＨｔｉマレイミド基を有するものに対し
てはｚΩ以下に保たねばならな＼ いが、ヨードアセチル（またはヨードアシル）基を含有
するものに対してはａ５まで上げてもよい〇九とえば、
リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＸ）、または免疫グロブリン
上のアミノ基あるいはスルフヒドリル基に対して競合す
る、たとえばアミンまたはメルカプタンのような、求核
性物質を含有しない類以の本位直系のような、常用され
る緩衝系が接合反応に対して理想的である。典型的には
、異なる２抗体、すなわち抗体２と抗体４、の接合は、
２段階プロセスで行なわれる。第一の段階は、少なくと
も１のアミノ基、恐らくはりシンのイプシロンアミノ基
を、アミド結合の生成によって、抗体４の免疫グロブリ
ン分子上の１以上のマレイミドまたはヨードアセチル基
に対して選択的に反応させるためには、ｐＨ７において
、モル的に１０〜２０倍過剰の異種２官能性カツプリン
グ剤を使用することが有利である。過剰のカップリング
剤の除去後に、マレイミドまたはヨードアセチル基結合
抗体４は、抗体２上のスルフヒドリル基による連結に対
する用意が完了している。理想的には、チオール基は、
連鎖内−のジスルフィドの還元に工つて、あるいは、−
一アセチルメルカプト無水コハク酸を用いて高分子上に
導入したチオール−アセチル基の除去によって、生成さ
せることができる。すべての過剰の試薬は、反応段階間
のゲルｆ過まえは透析によって除去することが好ましい
。

第１段階、すなわち、試薬の抗体４への連結は、０℃で
開始して、典型的には、室温で２時間以内に完了する０
第二の段階、すなわち、活性化した抗体４のチオール化
抗体２への連結は、一般に低温（４℃）において２０時
間を超える反応時間を要する。望ましい１：１の比率の
二重抗体接合体、すなわち、抗体２−抗体４の収率を最
高とする喪めには、連結条件の注意深い計算と最適な取
り扱いが存在しなければならない。たとえばＩｇＭのよ
うな多価抗体の還元は避けることが好ましく、且つこの
ような免疫グロブリンはアミド結合によって結合するこ
とが理想的である０゜ みツブリング剤に対するＦａｂ’フラグメント（抗体２
）筐たはＩｇＧ　（抗体４）の有利なモル比は１．１　
：　１乃至１．５：１の範囲である６　Ｆｍｂ’スルフ
ヒドリル基のジスルフィドへの酸化による自己縮合は、
ＩｇＧ上のマレイミドまたはヨードアセチル結合に対す
るアルキル化反応と競合するという理由で、更にまた、
典型的には、抗体は多クローン性の起源のものであるか
ら望ましい特異的抗体が存在する全免疫グロブリンの中
の一部の量として存在しているに過ぎないという理由に
よって、高い連結効率を保証するためには接合の開始に
おいて過剰のＦａｂ’成分を使用することが好ましい。

競合を回避して最高の感度を達成するためには未結合の
抗体を除去（ゲル１過による分別）することが好ましい
。

分別しまたは分別しない形態の接合体による指標粒子の
被接は、一般に１０９６充填細胞懸濁液ｔ接合抗体溶液
と共に３７℃または室温において１５〜３０分間保温し
たのち、リン蒙塩緩衝塩水（ｐＢｓ）ｔ−用いて３回洗
浄することによって達成される。赤血球上に負わせる接
合体の量は、大きな感度ｔＶするがしかし抗原標準によ
って検査するときに誤まった陽性の結果を示すことがな
い最適の密度を達成するためには、接合体の各バッチに
対して滴定することが理想的である。蛋白質またｄ　Ｉ
ｇＧによって高過ぎる密度で被覆された粒子は、過度の
付着性と最後的に非特異的な凝集ｔもたらす。かくして
、免疫学的検定試薬は、接合体の負荷の量によって調節
することができる、可変の感度ｔＶしている。

感度の調節は、たとえば、人の絨毛性性腺刺激ホルモン
（ＨＣＧ）及びさもなければ妨害する密接に関連するゴ
ナドトロピン黄体形成ホルモン（ＬＨ）の検出において
、交差反応性の場合に望ましいことがある。ＨＣＧに関
しては、試薬がα５　ＩＵ／−を超える感度を有してい
る場合に、誤まった陽性の反応を伴なうことが一般的で
ある。

感度を低下させることによって、ＨＣＧよりはむしろＬ
Ｈの検出において起りがちな、このような誤まった陽性
反応を具合良く排除することができる。

検査血清試料は、赤血球凝集検査を妨害するおそれのあ
る、存在する補体を破壊するために、熱不活性化（５６
℃で３０分）しなければならない。

艷に、良好な特異性と感度のためには、たとえば５μｔ
またはその荀希釈というような、少量の試験血清を用い
ることが好ましい。リューマチス性及び異極親和性反応
の排除または最小限度化のため並びに特異性凝集反応の
促進のためには、検定系中に正常なウサギの血清（約０
．５　％　）と牛のアルブミン（約１チ）を含有させる
ことが好ましいといりことも認められている０その上、
すべてのカップリング溶液または検査溶液中に、一般的
な防腐剤としてナトリウムアジド（ＣＬ０２〜［１１％
）を使用することもまた有利である。

免疫学的検定検査は、約（ＬＯ５−の二重抗体接合体被
覆ＲＢＣｓ（α５〜１ｇｂの細胞）の１滴を１滴の検査
血清及び数滴（α１〜ａ２−）の希釈剤と混合すること
によって行なうことが理想的である。スライドガラス上
で混合物を凝集させると抗原の存在の迅速（約１０〜１
５分）な決定が可能であるが、しかしこの方法り感度が
低いＯ試験管！えはミクロ滴定板中で溶液を沈降させる
方法は、約２時間という比較的長い時間ｔ−要するけれ
ども、このような条件下でより高い感度が達成されるの
で、このような方法が好適である０陽性の反応は典型的
にはスライド上の細胞凝集物あるいは試験管ま九はミク
ロ滴定板の底におけるマット及びリングによって示され
、一方、陰性の反応は、スライド試験において目に見え
る凝集物が全くないこと、または沈降管あるいはミクロ
滴定板中のボタン状物の存在によって、示される。

時によっては、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）陰性血
清を用いる免疫学的検定は、２時間の沈降の間に小さな
リングを与えるｏｌｆまった陽性を避けるために、沈降
時間を更に２時間処長しなければならず、それによって
陰性の試料からの小さなリングは一般にボタン状に収縮
し、一方、弱い陽性は取り巻いているマットの影と共に
リング状に保たれる。

きわめて重要且つ有利なこととして、Ｂ型肝炎表面抗原
の検出に関しては、本発明は米国生物学局の規定による
第三世代Ｂ型肝炎検査の要求を超える１　　ｎｆ　ＨＢ
ｍＡｇ／−血清よりも高い感度’ｉｗしている。この免
疫学的検定系において使用する二重抗体接合体の好適実
施形態は、人の赤血球細胞に対して特異的であり且つそ
れに付着させたウサギの抗−人界血球断片に対して異種
２官能的に連結させたチンパンジー抗Ｂｗ肝炎表面抗原
免疫グｐプリン、たとえば人のＲＢＣで被覆し友（Ｃｐ
Ｘ　ＨＢｓＡｇ）−ＩｇＧ（ＲｘｈＲＢＣ）Ｆａｂ’、
である。このような肝炎検査の有利な点は明らかに、簡
単で感度が高く、容易に判断することができ、僅かな試
料を必要とするのみで且つ誤まった陽性の結果を避ける
ことができる方法によって、可溶性の抗原を検出しうる
能力を包含する。

本発明が有利な効果を実証するもう一つの重要な領域は
、妊娠ｔ１１Ｉ認するための診断試薬としての使用であ
る。人の絨毛性性腺刺激ホルモンの存在は、１滴のＰＢ
Ｓ中の人の、Ｏｒｒ細胞を、１滴の尿または血清試料及
び（ＲｘＨＣＧ）ＩｇＧ−（Ｒｘ　ｈＲＢＣ）　Ｆ　ａ
ｂ’接合体（ここでＲｘＨＣＧ。

はウサギの抗−人絨毛性性腺刺激ホルモンである）と混
合することによって、決定する。細胞に負荷させた接合
体の密度社、前記のように、黄体形成ホルモン（ＬＨ）
及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）による妨害を避けるた
めには尿１−当りα５１ＵＨＣＧの感度水準に調節しな
ければならない。２時間後の沈降試験管中のマットの生
成は、高水準のＨＣＧの存在、従って妊娠に対する陽性
反応の表示である。

別法として、第１図において、免疫グロブリン２Ｆｉ、
好ましくは基質上に固定した抗原５に対して特異的とす
ることができ、且つ免疫グロブリン４は２価でおり且つ
非特異的な凝集反応は避けることが好ましいから、赤血
球以外の指標物質に対して特異的とすることができる。

第２図は更に固相免疫吸着検査における本発明の使用を
例証するものであるが、この場合に、抗原１１を基質１
０上に固定し且つそれに対して問題とする抗原５に対し
てもまた特異的であるヘテロ−特異性接合抗体１２を向
ける。固定した抗原１１に対して向けた接合抗体１２の
部分は回転及び配置能力を最大とするためには１価であ
ることが好ましいが多価であってもよい０次いで、系を
洗浄したのち、第二の接合抗体１４の第二のグループで
処理し、それに指標物質１を付着させる０指標物質１の
存在の定量化は検査試料中に存在する抗原５の量の表示
となる。

第３図を参照すると、ヘテロ−２官能性カツプリング剤
によって尾−尾の関係で連結した異なる２抗体２１．２
２から成り且つ指標物質１５に対して特異的な抗体２１
部分を肩している接合した抗体試薬１４に一使用する本
発明の方法は、組繊細１１２０上に存在する異面抗原の
存在を確認するために用いることができる。腫瘍特異的
表面抗原を有する腫瘍細胞の位置付けと確認において、
本発明の使用を期待することができる。このような状況
において、腫瘍抗原に対して特異的な抗体２２は、単ク
ローン性起源のものと予想される。

第４図は、本発明の好適実施形態として、赤血球凝集検
査における様式化した格子の形成を示している。二重抗
体接合体１４は、赤血球指標１６に対して特異的なＦａ
ｂ’フラグメント及び検出すべき抗原５に対して特異的
な多価抗体部分ｅＮしている。抗原５の存在は、赤血球
１６に付着した接合体１４の多重的な付着金可能とする
０その結果、赤血球は肉眼で明瞭に認めることができる
マット状の堅固な格子の形成中に保六れる０本発明の原
理は以下の実施例によって更に例証することができるが
、本発明は以下の実施例に限定されることはない。

実施例　１ ｐＨ７のリン液塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）２ｗＡｔ中に溶
解した２、５１１Ｆのアフイニテイーク費マドグラフィ
ーで精製したチンパンジー抗−Ｂ型肝炎表面抗原免疫グ
ロブリン（ＣｐｚＨＢｓＡｇ　ＩｇＧ）を氷浴中で冷却
し、過酸化物を含まないジオキサン（α１−）中に溶解
した、Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキシメチル）マレ
イミドのＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（５
５μｆ１モル的に１０倍過剰）を、０℃で１５分間、次
いで室温で１時間攪拌しながら加えるｏＪ剰の試薬を、
溶離液として１ミリモル濃度のＥＤＴｊｌ含有する脱気
したｐａｔｏのＰＢＳ’ｉ使用するセファデックスＧ−
１５（Ｌ５Ｘ４５ｔｘ）カラム上のゲルｒ過によって、
除去する。りｐマトグ２フィーは紫外線によってモニタ
ーする。マレイミド−ＩｇＧｔｔＶする第一のピークの
幽分含集めて、ウサギの抗−人界血球（ＲｘｈＲＢＣ）
のＦａｂ’フラグメントとの接合のために４℃に保つ。

α７−のｐＨａＯの（ＬＯ１モル濃度のトリス緩衝食塩
水（ＴＢＳ）中の１岬のＲｘｈＲＢＣ（ＦＩＬｂ’）ｘ
ｉ”、窒素下にα１−のＨ，０中のｔｏｗＩＩのジチオ
トレイトール（ＤＴＴ）を加えながら、攪拌する。室温
における１時間の攪拌後に、過剰のＤＴＴＹ、脱気した
ｐＨ６，０ＰＢＳ−１ミリモル濃度ＥＤＴＡを用いるセ
ファデックスＧ−１５（１，ＯＸ２０ｏｎ）カラム上で
、除去する。Ｆｉｂ’−８Ｈｔ含Ｍするフラグメントラ
集めて、直ちに窒素下にマレイミドＣｐｚＨＢｇＡｇ　
　ＩｇＧと混合する。　接置ｍｙのｐＨを＾め容置の１
モル濃度のｐＨ７，０！Ｊン酸ナトＩＪウムで調節し且
つ反応を窒素下に４℃で約２０時間続ける０かくして得
た接合体＃液をミクロフィルター（α２２ミクロン）を
通じて１遇して透明浴液とする。防腐剤としてナトリウ
ムアジドをα１−の濃度まで加える。分別しない接合体
は、肝炎の存在のための検査に対する直接的な凝集試薬
として、人のＯｒｒ　　ＲＢＣｓの被覆のために適して
いる。接合体のＲＢＣｓ　　に対する比は、非特異的な
凝集音生じることなく最高の感度となるように滴定しな
ければならず、それは次第に変化させた陽性と陰性の対
照試料の使用によって達成される。

接合体は、２容器ｔ−；’ｗする診断試薬検査キット中
に詰めることが好ましく、それらの容器の中の一方は緩
衝した接合試薬を含有し且つ他の容器は＋１Ｌ１１Ｊ１
１のナトリウムアジドを含有するＰＢＳ中の（Ｌ５１Ｇ
の正常なウサギの血清と１％の牛のアルブミンの希釈液
を含有している。接合試薬はＰＢＳ（ｐＨ７，４、ａ１
％のナトリウムアジド）当りに約α０５ｑの二重抗体蛋
白質を肩していることが理想的である。１０検査に対し
て、この試薬の各１滴（約［１０５ｍ）＠滴下すること
によって１１ｉ１ｉ（約（１０ｓｄ）の１０　％　Ｏｒ
ｒ　ＲＢＣｇ（１−当り約５×１０１の細胞）を被傍す
る。市販の貯蔵血液試薬細胞またはＨＢｓ　Ａｇ　ｖｉ
ｌ−有していない人からの新鮮（１週以内）なＯｒｒ細
胞が、接合体に対する理想的な担体である０検査は次の
ようにして竹なうことが好普しい： １、細胞感作−０ｒｒ細胞金３（ロ）洗浄したのち、Ｐ
ＢＳで１０％に調節する。１滴の１０チ細胞全１滴の接
合体試薬と混合して、３７℃で少なくとも１５分間保温
する。細胞を６回洗浄したのち、ＰＢＳ（（１０２％の
ナトリウムアジドを含有）　’ｔ’で、Ｑ、５％の濃度
で懸濁させる。被覆した細胞は４℃の貯蔵においてＰＢ
Ｓ中で少なくとも６日間安定である。

２　細胞沈降−１滴の感作した細胞（約２．５×１０＠
）細胞）’ｆｒ５Ｐｔｆ）！ＬＡ、者の血清と２滴の希
釈剤ｔＷするガラス試験管（１，ＯＸ　７．５５１　）
に入れる。完全な混合は１分間の振とうによって達成さ
れる。試験管中の細胞を２時間にわたり観察鏡上で静か
に保って沈降させる。・マット（陽性）またはリング（
弱い陽性）の形態の凝集は、Ｂ型肝炎にかかつている人
からの血清の表示であり、一方、管の底におけるボタン
状の細胞によって示される非凝集は、Ｂ型肝炎に陰性な
血清の表示である。

実施例　２ 水浴中で冷却した１０−のｐＨ２ＯＯＰＢｓ中の１０ｑ
のＱＡＥ−セファデックス精製ウサギ抗−人絨毛性性腺
刺激ホルモン（ＲｘｂＣＧ）ＩｇＧを、０℃で攪拌しな
がら１５分間にわたり、過酸化物を含有しないジオキサ
ン（α１−）中に溶解した、Ｎ−（４−カルボキシシク
ロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ヒトルキシスクシ
ンイミドエステル（ｕ４ｑｓモル的に２０倍過剰）に加
える。次いでこの混合物を１時間かけて室温にもどした
のち、脱気したｐＨａＯのｐＢｓ−１ミリモル濃度ＩＤ
ＴＡｔ−用いてセファデックスＧ−１５（ｔ　５　Ｘ　
４５　ｃｍ　）カラム上でゲルｆ遇する。マレイミドＩ
ｇＧ’に含有する両分を集め、４℃に保つと、接合のた
めの用意が児了する。α８−のｐＨａＯのＴＢＳ中に懸
濁させた４■のＲｘｈＲＢＣ（Ｆａｂつ。

を、室温において攪拌しながら、その甲に０４２−のＨ
ｚ　Ｏ中のＤＴＴ（２ｉｌｖ）ｉ加える０１時間の攪拌
後に、脱気したｐＨａＯのＰ　Ｈ８−１ミＩＪモル濃度
ＥＤＴＡ’を用いるセファデックスＧ−１５（Ｉ　Ｘ　
３０　ｃｍ　）カラム上のゲル１過によって、過剰のＤ
ＴＴ’ｉ除去する０還元したＦａｂ’を集め、直ちに４
℃における窒素下の攪拌によって、約２０時間かけて、
マレイミド−（ＲｘｈＣＧ）ＩｇＧ及び弱の容重のｐＨ
７，０の１モル嬢度のリン酸ナトリウム緩衝液と混合す
る。

このようにして得た接合体混合物をα４５ミクロンのＰ
Ｍを用いてｒ過し且つ溶離剤としてｐＨａＯのＴＢ８を
用いてセファクリル８−２００（２，６Ｘ７５ｍ）力２
ム上で分別するＯ（ＲｘｈＣＧ）ＩｇＧ　−（ＲｘｈＲ
ＢＣ）　Ｆａｂ’接合体を含有する主ピークの自分を集
める。ＨＣＧ標準に対する滴定後に、接合体の濃度を１
ｄ当り約α０１岬に調節する０ この試薬はα１チのナトリウムアジドｔｔ有するＰＨ３
中の［Ｌ５％の牛のアルブミンとα１チの正常なウサギ
の血清を含有する診断試薬キットとして詰めることが有
利である。１０ＷＩｔの試薬は１００回の検査に対して
十分である。

検査は以下のようにして行なう： 市販の貯蔵血液試薬または新しく採取（１週間以内）し
た人のＯｒｒ　ＪＩＢ胞を５回洗浄し、ＰＨ３中で１Ｌ
ｓに希釈する０１滴の希釈した細胞をガラス試験管（１
，ＯＸ　７．５　ｃｍ　）中に入れ、次いで２滴の接合
体試薬と１滴の血清または尿の試料を加えて１〜２分間
の振とうにより完全に混合する。試験管中の細胞を観察
鏡上で静かに２時間沈降させる。次いで結果を観察する
。マットまたは拡散したリング状の凝集は、妊娠の表示
としての尿中の高濃度の人の性腺刺激ホルモンの存在を
示す。ボタンまたは小さなリング状の非凝集は、試料中
の低濃度筐たは正常濃度の性腺刺激ホルモンを表示する
０ 上記の説明及び実施例は本発明の好適実施形態を例肚す
るものであるけれども、この技術分野における通常の熟
練者には、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく
稽々の変更全行なうことができるということは明白であ
ろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗原の存在において担体粒子に付着させたヘ
テロ−２官能性連結した抗体免疫学的検定試薬の簡単化
した図である。 第２図は、固相免疫吸着検査における本発明の使用を示
す。 第３図は、細胞表面抗原の確認のための本発明の使用を
示す。 第４図は、赤血球凝集検査における本発明の使用による
格子構造の生成を様式的に示す。 特許出願人　　オーツ・ダイアグノスティック・システ
ムズ・インコーボレーテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｔａ）　　第一の免疫グロブリン； ｂ）該第−の免疫グロブリンとは異なる特異性を有し且
   つ検出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グロブリ
   ン；及び Ｃ）該第−の免疫グロブリンを該第二の免疫グロブリン
   に対して選択的に連結する、ヘテロ−２官能性カツプリ
   ング剤 を含有して成る、抗原を検出するための免疫学的検定試
   薬。 ２．１）指標物質に対して特異的な第一の免疫グロブリ
   ン； ｂ）検出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グロブ
   リン：及び Ｃ）スルフヒドリル反応性官能基とアミン反応性官能基
   ｔＷしそして該第−の免疫グロブリンを該第二の免疫グ
   ロブリンに対して選択的に連結する、ヘテロ−２官能性
   カツプリング剤 を含有して成る、指標物質を使用して抗原を検出するた
   めの免疫学的検定試薬〇 五　該第−の免疫グロブリンはＩｇＧのＦａｂ’　１価
   フラグメントである、特許請求の範囲第２項記載の免疫
   学的検定試薬。 亀　ヘテＯ−２官能性カップリング剤は、ａ）該第−の
   免疫グロブリンに対してチオール結合の形成により共有
   結合的に結合されており；且つ ｂ）皺第二の免疫グロブリンに対してアミド結合の形成
   により共有結合的に結合されている、特許請求の範囲第
   ２項記載の免疫学的検定試薬０５　へテロ−２官能性カ
   ツプリング剤は、水と混和性の溶剤中に可溶であり且つ
   該第−及び第二の免液グロブリンの結合活性の実質的な
   低下を生じさせない、特許請求の範囲第４項記載の免疫
   学的検定試薬。 ＆ａ）　　会合した抗原含有する指標物質；ｂ）骸会合
   した抗原に対して特異的な第一〇′免疫グロブリン： Ｃ）検出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グロブ
   リン；及び ｄ）該第−の免疫グロブリンを該第二の免疫グロブリン
   に対して選択的に連結する、ヘテロ−２官能性カツプリ
   ング剤 を含有して成る、抗原の検出の九めの免疫学的検定試薬
   。 ｌ　ヘテロ−２官能性試薬は、それぞれチオール結合及
   びアミド結合によって該第−の免疫グロブリンｔ−該第
   二の免疫グロブリンに連結する、特許請求の範囲第６項
   記載の免疫学的検定試薬Ｏａ　該第−の免疫グロブリン
   はＩｇＧ　ｑ）Ｆａｂ’　１価フ２グメントである、特
   許請求の範囲第６項記載の免疫学的検定試薬。 ９　指標物質は赤血球でありそして該第−の免疫グロブ
   リンは、該赤血球の表面上に天然に存在する該会合した
   抗原に対して特異的である、特許請求の範囲第７または
   ８項記載の免疫学的検定試薬。 １１指標物質は固定した赤血球でありそして該第−の免
   疫グロブリンは骸赤血球の表面上に人為的に植付けられ
   た該会合した抗原に対して特異的である、特許請求の範
   囲第７または８項記載の免疫学的検定試薬。 １ｔヘテロ−２官能性カツプリング剤は、Ｎ−ヒドロキ
   シスクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェノールエス
   テル及び１−ヒドロキシベンツトリアゾールエステルよ
   り成る群から選択されるアミン反応性官能基、並びにマ
   レイミド、ヨードアシル及び２−ピリジルジチオより成
   る群から選択されるスルフヒドリル反応性官能基ヲ有す
   る架橋試薬である、特許請求の範囲第７または８項記載
   の免疫学的検定試薬。 １２、第二の免疫グロブリンは、チンパンジーＫＢ型肝
   炎表面抗原免疫グロブリン、マウス単クローン性抗Ｂ型
   肝炎表面抗原免疫グロブリン、及びウサギ抗−人絨毛性
   性腺刺激ホルモン免疫グロブリンより成る群から選択さ
   れる免疫グロブリンである、特許請求の範囲第２または
   ６項記載の免疫学的検定試薬。 仏指標物質は赤血球、酵素、放射性同位元素、螢光色素
   、電子不透過性物質、及び重合体微小球体より成る群か
   ら選択される、特許請求の範囲第２または６項記載の免
   疫学的検定試薬〇１４［１）ａ）会合した抗原を有する
   指標物質：ｂ）該会合した抗原に対して特異的な第一の
   免疫グロブリン： Ｃ）検出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グ四プ
   リン：及び ｄ）該第−の免疫グロブリンを骸第二の免疫グロブリン
   に対して選択的に連結するヘテロ−２官能性カツプリン
   グ剤 ｔｔＶして成る、抗原を検出するための免疫学的検定試
   薬を水性の試料と一緒にし： （ｉ）　　該混合物を攪拌し； （２））　該攪拌した混合物を静かに沈降させ；そして 該混合物を指標物質について観測し、それによって該抗
   原の存在を指示せしめる、 という複数の段階金含有して成る、該試料中の特定の抗
   原の存在を検出する丸めの方法。 ｌＦｋ、（ｌ　ａ）会合した抗原に対して特異的な第一
   の免疫グロブリン、検出すべき抗原に対して特異的な第
   二の免疫グロブリン、及び該第−の免疫グロブリン上肢
   第二の免疫グロブリンに対して選択的に連結するヘテロ
   −２官能性カツプリング剤を含有して成る、該会合した
   抗原を有する指標物質を使用して抗原上検出するための
   免疫学的検定試薬；及び ｂ）該指標物質； を、水性の試料と一緒にし； （ｉ）　　該混合物を攪拌し； （―）　　該攪拌した混合物會静かに沈降させ；且つ該
   混合物を指標物質について観測し、それによって検出す
   べき抗原の存在を指示せしめるという複数の段階を含有
   して成る、該試料中の特定の抗原の存在を検出するため
   の方法。 １＆指標物質社赤血球及び重合体微小球体より成を群か
   ら選択され；そして沈降させる段階社該混合物を凝集反
   応の存在について観察することを含み、それによって該
   機態の存在を指示せしめる、特許請求の範囲第１４また
   は１５項記載の特定の抗原の存在上検出するための方法
   。 １７、該指標物質は赤血球であり； 核検出すべき抗原社人の絨毛性性腺刺激ホルモン及びＢ
   ＩＩ肝炎表面抗原より成る群から選択され；そして 沈降させる段階は該混合物を凝集反応の存在について観
   察すること管含み、それによって該抗原の存在を指示せ
   しめる、 特許請求の範囲第１４またけ１５項記載の方法。 １ａ＃検出すべき抗ＮはｎｆＩ！肝炎表面抗原でありそ
   して該二の免疫グロブリン社マウス檗りローン性抗−Ｂ
   、［肝炎表面抗原免疫グロブリン及びチンパンジー抗Ｂ
   型肝炎表面抗原免疫グロブリンより成る群から選択され
   る、特許請求の範囲第１７′ｇ４記載の方法。 １９、（ｉ）ａ）指標物質に対して特異的修築−の免疫
   グロブリン； ｂ）検出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グロブ
   リン；及び Ｃ）該第−の免疫グロブリンヲ骸第二の免疫グロブリン
   に対して選択的に連結する、スルフヒドリル反応性官能
   基とアミン反応性官能基を有する、ヘテロ−２官能性カ
   ップリング剤；を含有して成る、指標物質を使用する免
   疫学的検定試薬をその上に特定の抗原が存在する表面と
   接触させ； （−）　　更に該表面を、赤血球、酵素、放射性同位元
   素、螢光色素、電子不透過性物質及び重合体微小球体よ
   り成る群から選択される指標物質と接触させ； （ｉｉＯ＃試薬と該指標物質を反応させ：（−未反応の
   指標物質を除去し：且つ （ψ　該表面ｔ−該指標物質の存在について調べ、それ
   によって該特定の抗原の存在を決定せしめ得る、 という複数の段階を含有して成る、骸表面上に存在する
   特定の抗原の存在を検出するための方法。 ２（Ｌ（ｉ）ａ）会合した抗原を有し、そして赤血球、
   酵素、放射性同位元素、螢光色素、電子不透過性物質及
   び重合体微小球体より成る群から選択される、指標物質
   ； ｂ）該会合した抗原に対して特異的な第一の免疫グロブ
   リン； Ｃ）検出すべ１特定の抗原に対して特異的な第二の免疫
   グロブリン：及び ｄ）該第−の免疫グロブリンを該第二の免疫グロブリン
   に対して選択的に連結することができるヘテロ−２官能
   性カツプリング試薬 を含有して成る、該特定の抗原を検出するための免疫学
   的検定試薬を、その上に特定の抗原ｔ−有する表面と接
   触させ； （ｉｉ）　　該試薬を該表面と反応させ；（−）　　未
   反応の試薬を除去し；そして（１リ　　該表面を該指標
   物質の存在について調べ、それによって＃特定の抗原の
   存在を決定することができる という複数の段階を含有して成る、該異面上に存在する
   特定の抗原の存在を検出するための方法０２１、該第−
   の免疫グロブリンが１価の免疫グロブリンである、特許
   請求の範囲第１９または２０項記載の方法。 ２ｚ検出すべき該特定の抗原が組織上に存在する、特許
   請求の範囲第１９また１−ｊ２０項記載の方法。 ２＆検出すべき＃特定の抗原が同相基質上に固定されて
   いる、特許請求の範囲第１９ま九は２０項記載の方法。