BRPI0718644A2 - Anticorpo monoclonal isolado, anticorpos humanizado e quimérico do anticorpo monoclonal isolado, linha de célula hibridoma isolada, método para iniciar a citotoxidez induzida por anticorpo de células cancerosas em uma amostra de tecido selecionada de um tumor humano, cdmab do anticorpo monoclonal isolado ou seu cdmab e usos de um anticorpo monoclonal ou seu cdmab, sozinho ou em conjução com pelo menos um agente quimioterapêutico, e composição - Google Patents

Anticorpo monoclonal isolado, anticorpos humanizado e quimérico do anticorpo monoclonal isolado, linha de célula hibridoma isolada, método para iniciar a citotoxidez induzida por anticorpo de células cancerosas em uma amostra de tecido selecionada de um tumor humano, cdmab do anticorpo monoclonal isolado ou seu cdmab e usos de um anticorpo monoclonal ou seu cdmab, sozinho ou em conjução com pelo menos um agente quimioterapêutico, e composição Download PDF

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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO MONOCLONAL ISOLADO, ANTICORPOS HUMANIZADO E QUIMÉRICO DO ANTICORPO MONOCLONAL ISOLADO, LINHA DE CÉLULA HIBRIDOMA ISOLADA, MÉTODO PARA INICIAR A CITOTOXIDEZ INDUZIDA POR ANTI- 5 CORPO DE CÉLULAS CANCEROSAS EM UMA AMOSTRA DE TECIDO SE- LECIONADA DE UM TUMOR HUMANO, CDMAB DO ANTICORPO MONO- CLONAL ISOLADO, CDMAB DO ANTICORPO HUMANIZADO E QUIMÉRICO, ANTICORPO ISOLADO OU SEU CDMAB E USOS DE UM ANTICORPO MONOCLONAL OU SEU CDMAB, SOZINHO OU EM CONJUNÇÃO COM 10 PELO MENOS UM AGENTE QUIMIOTERAPÊUTICO, E COMPOSIÇÃO". DECLARAÇÃO DE ACORDO DE PESQUISA COOPERATIVA
A presente invenção, conforme definido pelas reivindicações aqui, neste requerimento de Patente, foi realizada pelas partes para um Acondo de Pesquisa Conjun- ta (Joint Reseamh Agreement, "Acordo") entre Arius Research Inc. and Takeda Pharma- ceutical Company Limited, em conseqüência de atividades empreendidas dentro do âm- bito daquele Acordo. O Acordo estava em efeito antes da data da invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presenet invenção refere-se ao isolamento e à produção de anti- corpos modificando doenças cancerosas (CDMAB) e ao uso destes CDMAB 20 em processos terapêuticos e diagnósticos, opcionalmente em combinação com um ou mais agentes quimioterápicos. A invenção adicionalmente refere-se a provas de ligação as quais utilizam o CDMAB da presente invenção. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Anticorpos Monodonais como Terapia do Câncer Cada indivíduo que se 25 apresenta com câncer é único e tem um câncer que é tão diferente de outros cânceres quanto a identidade destas pessoas. Apesar disso, a terapia corrente trata todos os paci- entes com o mesmo tipo de câncer, no mesmo estágio, do mesmo modo. No mínimo 30 por cento destes pacientes não terão sucesso com a primeira linha de terapia, deste mo- do levando a cursos de tratamento adicionais e à aumentada probabilidade de fracasso 30 do tratamento, metástases, e finalmente, morte. Uma abordagem superior ao tratamento seria a customização da terapia para o indivíduo em particular. A única terapia corren- te a qual se presta a customização é cirurgia. Quimioterapia e tratamento de radiação não podem ser talhados para o paciente, e a cirurgia por si só, na maioria dos casos é inadequada para produzir curas.
Com o advento de anticorpos monoclonais, a possibilidade de desen- volver métodos para terapia customizada se tornou mais realista uma vez que ca- 5 da anticorpo pode ser dirigido para um único epitopo. Além disso, é possível pro- duzir uma combinação de anticorpos que são dirigidos para a constelação de epi- topos que definem unicamente tumor de um indivíduo em particular.
Tendo reconhecido que uma significativa diferença entre células cancero- sas e normais é que as células cancerosas contêm antígenos que são específicos para células transformadas, a comunidade científica tem mantido há muito tempo que os anti- corpos monoclonais podem ser designados para ter por alvo especificamente células transformadas ligando especificamente a estes antígenos cancerígenos; deste modo dando origem à cresnça de que anticorpos monoclonais podem servir como "Balas Mági- cas" para eliminar células cancerígenas. No entanto, é agora amplamente reconhecido que nenhum anticorpo monoclonal pode servir em todos os casos de câncer, e que anti- corpos monoclonais podem ser dispostos, como uma classe, como tratamentos do cân- cer alvo. Foi mostrado que anticorpos monoclonais isolados de acordo com os ensina- mentos da invenção presentemente revelada modificam o processo de doenças cance- rosas em uma maneira a qual é benéfica para o paciente, por exemplo, reduzindo a carga tumoral, e serão referidos variadamente aqui, neste requerimento de Patente, como anti- corpos modificando doenças cancerosas (CDMAB) ou anticorpos "anti-câncer”
Atualmente, o paciente com câncer geralmente tem poucas opções de tratamento. A abordagem organizada para terapia do câncer tem produzido melhoras nas taxas globais de sobrevida e morbidez. No entanto, para o indivíduo em particular, estas estatísticas aprimoradas não se correlacionam necessariamente com uma melhora em sua situação pessoal.
Portanto, se fosse proposta uma metodologia a qual possibilitasse ao clínico tratar cada tumor independentemente de outros pacientes na mesma coorte, isto permiti- ria a abordagem única de adequar a terapia a somente aquela pessoa. Um curso de te- rapia similar, idealmente, aumentaria a taxa de curas, e produziria melhores resultados, deste modo satisfazendo uma necessidade há muito tempo reconhecida.
Historicamente, o uso de anticorpos policlonais tem sido usado com sucesso limitado no tratamento de cânceres humanos. Linfomas e Ieu- cemias têm sido tratadas com plasma humano, mas houve poucas respostas ou remissão prolongada. Além disso, houve uma falta de reprodutibilidade e não houve benefício adicional comparado à quimioterapia. Tumores sólidos 5 tais como cânceres de mama, melanomas e carcinomas de células renais também têm sido tratados com sangue humano, soro de chimpanzé, plasma humano e soro de cavalo com resultados correspondentemente imprevisí- veis e ineficazes.
Houve muitas provas clínicas de anticorpos monoclonais para tumores sólidos. Nos anos 1980s houve no mínimo quatro provas clínicas para câncer de mama humano as quais produziram somente um responde- dor entre no mínimo 47 pacientes usando anticorpos contra antígenos espe- cífic ou baseados em seletividade tecidual. Somente em 1998 que houve um experimento clínico bem sucessido usando um anticorpo anti-Her2/neu hu- manizado (Herceptin®) em combinação com CISPLATIN. Neste experimento 37 pacientes foram avaliados para respostas de quais em torno de um quar- to tiveram uma taxa de resposta parcial e um quarto adicional teve progres- são de doença menor ou estável. O tempo médio para progressão entre os respondedores foi de 8,4 meses com duração de resposta média de 5,3 me- ses.
Herceptin® foi aprovado em 1998 para uso de primeira linha em combinação com Taxol®. Resultados de estudos clínicos mostraram um aumento no tempo médio para progressão da doença para aqueles que re- ceberam terapia de anticorpos mais Taxol® (6,9 meses) em comparação 25 com o trupo que receveu Taxol® somente (3,0 meses). Houve também um ligeiro aumento na sobrevida média; 22 versus 18 meses para o ramo de tratamento com Herceptin® mais Taxol® versus o ramo de tratamento com Taxol® somente. Além disso, houve um aumento no número de tanto res- pondedores completos (8 versus 2 por cento) quanto parciais (34 versus 15 30 por cento) no grupo de combinação de anticorpo mais Taxol® em compara- ção com Taxol® somente. No entanto, tratamento com Herceptin® e Ta- xol® levou a uma maior incidência de cardiotoxicidade em comparação com tratamento com TaxoPsomente (13 versus 1 por cento respectivamente). Além disso, terapia com Herceptin® foi somente eficaz para pacientes que supexpressam (conforme determinado através de imunohistoquímica (IHC) análise) o receptor do fator do crescimento epidermal humano 2 (Her2/neu), 5 um receptor, o qual atualmente não tem função conhecida ou Iigante biologi- camente importante; aproximadamente 25 por cento de pacientes que têm câncer de mama metastático. Portanto, ainda há uma grande necessidade não satisfeita da parte de pacientes com câncer de mama. Mesmo aqueles que podem se beneficiar de tratamento com Herceptin® ainda necessitariam 10 de quimioterapia e consequentemente ainda teriam de lidar com, no mínimo em algum grau, os efeitos colaterais deste tipo de tratamento.
As provas clínicas investigando câncer colorretal envolvem anti- corpos contra tanto glicoproteína quanto alvos glicolipídicos. Anticorpos tais como 17- 1A, o qual tem alguma especificidade para adenocarcinomas, fo- 15 ram submetidos a provas clínicas Fase 2 em mais de 60 pacientes com so- mente 1 paciente tendo uma reação parcial. Em outras provas, o uso de 17- 1A produziu somente 1 reação completa e 2 reações menores entre 52 paci- entes em protocolos usando ciclofosfamida adicional. Até o momento, pro- vas clínicas fase Ill de 17-1A não demonstraram aprimorada eficácia como 20 terapia adjuvante para câncer de cólon estágio IN. O uso de um anticorpo monoclonal murino humanizado inicialmente aprovado para estudo por ima- gens também não produziu regressão tumoral. Somente recentemente hou- ve quaisquer resultados positivos de estudos clínicos de câncer colorretal com o uso de anticorpos monoclonais. Em 2004, ERBITUX® foi aprovado 25 para a segunda linha de tratamento de pacientes com câncer colorretal me- tastático expressando EGFR que são refratários a quimioterapia à base de irinotecan. Os resultados de tanto um estudo clínico Fase Il de dois ramos quanto de um estudo de único ramo mostraram que ERBITUX® em combi- nação com irinotecan teve uma taxa de resposta de 23 e 15 por cento res- 30 pectivamente um tempo médio para progressão da doença de 4,1 e 6,5 me- ses respectivamente. Os resultados do mesmo estudo clínico Fase Il de dois ramos e outro estudo de único ramo mostraram que tratamento com ERBI- TUX® somente resultou em uma taxa de resposta de 11 e 9 por cento res- pectivamente com um tempo médio para progressão da doença de 1,5 e 4,2 meses respectivamente.
Consequentemente tanto na Suíça quanto nos Estados Unidos, tratamento com ERBITUX® em combinação com irinotecan, e nos Estados Unidos, tratamento com ERBITUX® somente, foi aprovado como um trata- mento de segunda linha de pacientes com câncer de cólon que falharam na terapia com irinotecan de primeira linha. Portanto, como Herceptin®, trata- mento na Suíça somente é aprovado como uma combinação de anticorpo monoclonal e quimioterapia. Além disso, tanto na Suíça quanto nos Estados Unidos o tratamento somente é aprovado para pacientes como uma terapia de segunda linha. Além disso, em 2004, AVASTIN®foi aprovado para uso em combinação com quimioterapia à base de 5-fluorouracila intravenoso como um tratamento de primeira linha de câncer colorretal metastático. Os resultados de estudo clínicos Fase Ill demonstraram um prolongamento na sobrevida média de pacientes tratados com AVASTIN® mais 5-fluorouracila comparados com pacientes tratados com 5-fluourouracila somente (20 me- ses versus 16 meses respectivamente). No entanto, novamente como Her- ceptin® e ERBITUX®, o tratamento somente é aprovado como uma combina- ção de anticorpo monoclonal e quimioterapia.
Também continua a ter resultados pobres para câncer pulmonar, cerebral, de ovário, pancreático, de próstata, e de estômago. Os resultados recentes mais promissores para câncer pulmonar de células não pequenas vêm de uma prova clínica Fase Il onde o tratamento envolveu um anticorpo 25 monoclonal (SGN-15; dox-BR96, anti-Sialyl-LeX) conjugado ao fármaco de morte celular doxorubicina em combinação com o agente quimioterápico TAXOTERE®. TAXOTERE® é a única quimioterapia aprovada pela agência de regulamentação de fármacos e alimentos dos Estados Unidos (FDA) para o tratamento de segunda linha de câncer pulmonar. Dados iniciais indicam 30 uma sobrevida global aumentada comparada com TAXOTERE® somente. Dos 62 pacientes que foram recrutados para o estudo, dois terços recebe- ram SGN-15 e, combinação com TAXOTERE® ao passo que o um terço restante recebeu TAXOTERE® somente. Para os pacientes recebendo SGN-15 em combinação com TAXOTERE®, a sobrevida global média foi de 7,3 meses em comparação com 5,9 meses para os pacientes recebendo TAXOTERE® somente. A sobrevida global em 1 ano e 18 meses foi de 29 e 5 18 por cento respectivamente para os pacientes recebendo SNG- 15 mais TAXOTERE® comparada com 24 e 8 por cento respectivamente para os pacientes recebendo TAXOTERE® somente. Adicionalmente estão planeja- das provas clínicas.
Pré-clinicamente, tem havido algum sucesso limitado no uso de anticorpos monoclonais para melanoma. Muito poucos destes anticorpos têm atingido provas clínicas e até o momento nenhum foi aprovado ou de- monstrou resultados favoráveis em provas clínicas Fase III.
A descoberta de novos fármacos para tratar doença é dificultada pela falta de identificação de alvos relevantes entre os produtos de 30.000 genes conhecidos que contribuiriam para patogênese da doença. Em pes- quisa oncológica, alvos de fármacos potenciais são frequentemente selecio- nados simplesmente devido ao fato de que são superexpressados em célu- las tumorais. Alvos identificados deste modo são então triados para intera- ção com uma multitude de compostos. No caso de terapias de anticorpos potenciais, estes compostos candidatos são geralmente derivados de méto- dos tradicionais de geração de anticorpo monoclonal de acordo com os prin- cípios fundamentais estabelecidos por Kohler e Milstein (1975, Nature, 256, 495-497, Kohler and Milstein). Células de baço são coletadas de camundon- gos imunizados com antígeno (por exemplo, células inteiras, frações de célu- Ias, antígeno purificado) e fundidas com parceiros de hibridoma imortalizado. Os hibridomas resultantes são triados e selecionados para secreção de anti- corpos os quais ligam mais avidamente ao alvo. Muitos anticorpos terapêuti- cos e diagnósticos dirigidos contra células cancerígenas, incluindo Hercep- tin® e RITUXIMAB, têm sido produzidos usando estes métodos e seleciona- dos com base em sua afinidade. As falhas nesta estratégia são duplas. Em primeiro lugar, a escolha de alvos apropriados para ligação de anticorpos terapêuticos ou diagnósticos é limitada pela escassez do conhecimento de processos carcinogênicos específicos do tecido circunjacente e os métodos simplistas resultantes, tais como seleção por superexpressão, pelos quais estes alvos são identificados. Em segundo lugar, a hipótese de que a molé- cula de fármaco que liga ao receptor com a maior afinidade geralmente tem 5 a maior probabilidade para iniciar ou inibir um sinal pode não ser sempre o caso.
Apesar de algum progresso com o tratamento de câncer de ma- ma e de cólon, a identificação e o desenvolvimento de terapias de anticorpos eficazes, quer como agentes únicos ou como co-tratamentos, tem sido ina- dequada para todos os tipos de câncer.
Patentes Anteriores:
A Patente dos Estados Unidos N0 5.750.102 revela um processo em que células do tumor de um paciente são transfectadas com genes MHC os quais podem ser clonados a partir de células ou tecido do paciente. Estas células transfectadas são então usadas para vacinar o paciente.
A Patente dos Estados Unidos N0 4.861.581 revela um processo compreendendo as etapas de obter anticorpos monoclonais que são especí- ficos para um componente celular interno de células neoplásicas e normais do mamífero mas não a componentes externos, etiquetar o anticorpo mono- 20 clonal, contactar o anticorpo etiquetado com tecido de um mamífero que re- cebeu terapia para matar células neoplásicas, e determinar a eficácia da te- rapia medindo a ligação do anticorpo etiquetado ao componente celular in- terno das células neoplásicas degenerativas. Ao preparar anticorpos dirigi- dos para antígenos intracelulares humanos, o detentor da Patente reconhe- 25 ce que células malignas representam uma fonte conveniente de similares antígenos.
A Patente dos Estados Unidos N0 5.171.665 proporciona um no- vo anticorpo e um método para sua produção. Especificamente, a Patente ensina a formação de um anticorpo monoclonal o qual tem a propriedade de 30 ligar fortemente a um antígeno de proteína associado com tumores huma- nos, por exemplo, os do cólon e do pulmão, enquanto ligando a células nor- mais em um grau muito menor. A Patente dos Estados Unidos N0 5.484.596 proporciona um mé- todo de terapia contra câncer compreendendo remover cirurgicamente tecido tumoral de um paciente com câncer humano, tratar o tecido tumoral para obter células tumorais, irradiando as células tumorais para serem viáveis 5 mas não-tumorigênicas, e usando estas células para preparar uma vacina para o paciente capaz de inibir a recorrência do tumor primário ao mesmo tempo que simultaneamente inibindo metástases. A Patente ensina o desen- volvimento de anticorpos monoclonais os quais são reativos com antígenos da superfície de células tumorais. Conforme determinado na coluna 4, linhas 10 45 e seguintes, os detentores da Patente utilizam células tumorais autócto- nas no desenvolvimento de anticorpos monoclonais expressando imunotera- pia ativa específica em neoplasia humana.
A Patente dos Estados Unidos N0 5.693.763 ensina um antígeno de glicoproteína característico de carcinomas humanos e não dependente do tecido epitelial de origem.
A Patente dos Estados Unidos N0 5.783.186 é dirigida a anticor- pos Anti-Her2 os quais induzem apoptose em células expressando Her2, linhagens de células de hibridoma produzindo os anticorpos, métodos para tratar câncer usando os anticorpos e composições farmacêuticas incluindo os referidos anticorpos.
A Patente dos Estados Unidos N0 5.849.876 descreve novas linhagens de células de hibridoma para a produção de anticorpos monoclo- nais para antígenos de mucina purificados a partir de fontes de tecido tumo- ral e não-tumoral.
A Patente dos Estados Unidos N0 5.869.268 é dirigida a um mé-
todo para gerar um linfócito humano produzindo um anticorpo específico pa- ra um antígeni desejado, um método para produzir um anticorpo monoclonal, bem como anticorpos monoclonais produzidos pelo método. A Patente é par- ticularmente dirigida à produção de um anticorpo monoclonal anti-HD huma- no útil para o diagnóstico e tratamento de cânceres.
A Patente dos Estados Unidos N0 5.869.045 refere-se a anticor- pos, fragmentos de anticorpos, conjugados de anticorpos e imunotoxinas de cadeia única reativas com células de carcinoma humano.
O mecanismo pelo qual estes anticorpos funcionam é duplo, em que as moléculas são reativas com antígenos da membrana celular presen- tes sobre a superfície de carcinomas humanos, e adicionalmente em que os 5 anticorpos têm a capacidade de internalizar dentro das células de carcino- ma, subsequente a ligação, tornando-os especialmente úteis para formar conjugados de anticorpo-fármaco e de anticorpo-toxina. Em sua forma não modificada os anticorpos também manifestam propriedades citotóxicas em concentrações específicas.
A Patente dos Estados Unidos N0 5.780.033 revela o uso de au-
toanticorpos para terapia e profilaxia de tumores. No entanto, este anticorpo é um autoanticorpo antinuclear de um mamífero amadurecido. Neste caso, diz-se que o autoanticorpo é um tipo de anticorpo natural encontrado no sis- tema imune. Como o autoanticorpo se origina de "um mamífero amadureci- 15 do", não há necessidade de que o autoanticorpo realmente se origine do paciente sendo tratado. Além disso a Patente revela autoanticorpo antinu- clear natural e monoclonal de um mamífero amadurecido, e uma linhagem de células de hibridoma produzindo um autoanticorpo antinuclear monoclo- nal.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Este requerimento utiliza metodologia para produzir anticorpos anticancerígenos paciente-específicos ensinados na Patente dos Estados Unidos N0 6.180.357 para isolar linhagens de células de hibridoma as quais codificam para anticorpos monoclonais modificando doenças cancerosas. 25 Estes anticorpos podem ser produzidos especificamente para um tumor e portanto tornam possível a customização da terapia do câncer. Dentro do contexto deste requerimento, anticorpos anticancerígenos tendo quer propri- edades de destruição celular (citotóxicas) ou de inibição do crescimento ce- lular (citostáticsa) serão referidos nas partes que se seguem como citotóxi- 30 cos. Estes anticorpos podem ser usados no auxílio do estagiamento e diag- nóstico de um câncer, e podem ser usados para tratar metástases tumorais. Estes anticorpos também podem ser usados para a prevenção de câncer por meio de tratamento profilático. Diferentemente de anticorpos produzidos de acordo com paradigmas de descoberta de fármacos tradicionais, anticorpos produzidos deste modo podem ter por alvo moléculas e caminhos não mos- trados previamente como sendo integrais para o crescimento e/ou sobrevida 5 de tecido maligno. Além disso, as afinidades de ligação destes anticorpos são adequadas para os requisitos para iniciação dos eventos citotóxicos que podem não ser suscetíveis a interações de afinidade mais fortes. Além disso, está dentro do âmbito desta invenção conjugar modalidades quimioterápicas de rotina, por exemplo, radionuclídeos, com o CDMAB da presente inven- 10 ção, deste modo focalizando o uso dos referidos quimioterápicos. O CDMAB também pode ser conjugado a toxinas, porções citotóxicas, enzimas, por exemplo, enzimas conjugadas a biotina, ou células hematógenas, deste mo- do formando um conjugado de anticorpos.
A perspectiva de tratamento anti-câncer individualizado produzi- rá uma alteração no modo em que um paciente é tratado. Um cenário clínico provável é que uma amostra tumoral é obtida no momento da apresentação, e depositada. A partir desta amostra, o tumor pode ser classificado a partir de um painel de anticorpos modificando doenças cancerosas preexistentes. O paciente será convencionalmente estagiado mas os anticorpos disponíveis podem ser úteis em estagiamento adicional do paciente. O paciente pode ser tratado imediatamente com os anticorpos existentes, e um painel de an- ticorpos específicos para o tumor pode ser produzido quer usando os méto- dos resumidos aqui, neste requerimento de Patente, ou através do uso de bibliotecas de display de fago em combinação com os métodos de triagem revelados aqui, neste requerimento de Patente. Todos os anticorpos produ- zidos serão adicionados à biblioteca de anticorpos anticancerígenos uma vez que há uma possibilidade de que outros tumores possam portar alguns dos mesmos epitopos que aquele que está sendo tratado. Os anticorpos produzidos de acordo com este método podem ser úteis para tratar doença cancerosa em qualquer número de pacientes que tenham cânceres que li- gam a estes anticorpos.
Além de anticorpos anticancerígenos, o paciente pode escolher receber as terapias atualmente recomendadas como parte de um regime multi-modal de tratamento. O fato de que os anticorpos isolados através da presente metodologia são relativamente não-tóxicos para células não cance- rosas permite que sejam usadas combinações de anticorpos em altas doses, 5 quer somente, ou em combinação com terapia convencional. O alto índice terapêutico também permitirá retratamento em uma curta escala de tempo que reduziria a probabilidade de surgimento de células resistentes a trata- mento.
Se o paciente for refratário ao curso inicial de terapi ou desen- volver metástases, o processo de produção de anticorpos específicos para o tumor pode ser repetido para retratamento. Além disso, os anticorpos anti- cancerígenos podem ser conjugados a hemácias obtidas daquele paciente e reinfundidas para tratamento de metástases. Tem havido poucos tratamen- tos eficazes para câncer metastático e metástases geralmente prognosticam um resultado pobre resultando em morte. No entanto, cânceres metastáticos são geralmente bem vascularizados e a liberação de anticorpos anticancerí- genos por hemácias pode ter o efeito de concentrar os anticorpos no sítio do tumor. Mesmo antes das metástases, a maioria das células cancerígenas são dependentes do suprimento de sangue do hospedeiro para sua sobrevi- da e um anticorpo anticancerígeno conjugado a hemácias pode ser eficaz contra tumores in situ também. Alternativamente, os anticorpos podem ser conjugados a outras células hematógenas, por exemplo, linfócitos, macrófa- gos, monócitos, células assassinas naturais, e etc.
Há cinco classes de anticorpos e cada uma é associada a uma 25 função que é conferida por sua cadeia pesada. Imagina-se que geralmente a destruição de células cancerígenas por anticorpos nus é mediada ou através de citotoxicidade celular dependente de anticorpos ou através de citotoxici- dade dependente do complemento. Por exemplo, anticorpos IgM e lgG2a murinos podem ativar o complemento humano ligando o componente C-I do 30 sistema do complemento deste modo ativando o caminho clássico de ativa- ção do complemento o qual pode levar a Iise tumoral. Para anticorpos hu- manos os anticorpos de ativação do complemento mais eficazes são geral- mente IgM e IgGI. Anticorpos murinos do isótipo lgG2a e lgG3 são eficazes no recrutamento de células citotóxicas que têm receptores de Fc os quais levaarão a morte celular por monócitos, macrófagos, granulócitos e alguns linfócitos. Anticorpos humanos tanto do isótipo IgGI quanto lgG3 mediam 5 ADCC.
Outro mecanismo possível de destruição de câncer mediada por anticorpos pode ser através do uso de anticorpos que funcionam catalisando a hidrólise de várias ligações químicas na membrana celular e suas glicopro- teínas ou seus glicolipídeos associados, denominados anticorpos catalíticos. Há três mecanismos adicionais de destruição de células cance-
rígenas mediadas por anticorpos. O primeiro é o uso de anticorpos como uma vacina para induzir o corpo a produzir uma reação imune contra o antí- geno putativo que reside sobre a célula cancerígena. O segundo é o uso de anticorpos para atingir receptores do crescimento e interferir com sua função 15 ou para regular para baixo o receptor de modo que sua função seja perdida de modo eficaz. O terceiro é o efeito de similares anticorpos sobre ligação direta de porções da superfície celular que pode levar a morte celular direta, tal como ligação de receptores de morte tais como TRAIL Rl ou TRAIL R2, ou moléculas de integrina tais como alfa V beta 3 e similares.
A utilidade clínica de um fármaco contra câncer se baseia no
benefício do fármaco sob um perfil de risco aceitável para o paciente. Na terapia do câncer a sobrevida geralmente tem sido o benefício posterior mais buscado, no entanto há uma série de outros benefícios reconhecidos de mo- do geral além de prolongar a vida. Estes outros benefícios, onde o tratamen- 25 to não afeta de modo adverso a sobrevida, incluem alívio de sintomas, pro- teção contra eventos adversos, prolongamento no tempo para recorrência ou sobrevida livre de doença, e prolongamento no tempo para progressão. Es- tes critérios são aceitos de modo geral e organismos reguladores tais como a agência F.D.A. dos Estados Unidos (U.S. Food and Drug Administration) 30 aprovam fármacos que produzem estes benefícios (Hirschfeld et al. Criticai Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143 2002). Além destes critérios é reconhecido de modo geral que há outros desfechos que podem anunciar estes tipos de benefícios. Em parte, o processo de aprovação acelerado concedido pela agência F.D.A. dos Estados Unidos admite que há substitu- tos que provevelmente prognosticarão benefício para o paciente. Por volta do final do ano de 2003, houve dezesseis fármacos aprovados sob este pro- 5 cesso, e destes, quatro foram submetidos a aprovação plena, isto é, estudos de seguimento demonstraram benefício direto para o paciente conforme pre- visto por desfechos substitutos. Um desfecho importante para determinar efeitos de fármacos em tumores sólidos é a avaliação da carga tumoral me- dindo a resposta ao tratamento (Therasse et at. Journal of the National Can- 10 cer Institute 92(3):205-216 2000). Os critérios clínicos (RECIST criteria) para similar avaliação foram promulgados pelo Response Evaluation Criteria in Soiid Tumors Working Group (N.T.: Grupo de Trabalho sobre Critérios de Avaliação da Resposta em Tumores Sólidos), um grupo de especialistas in- ternacionais em câncer. Fármacos com um efeito demonstrado sobre a car- 15 ga tumoral, conforme mostrado por respostas objetivas de acordo com os critérios RECIST, em comparação com o grupo controle apropriado tendem a, essencialmente, produzir benefício direto para o paciente. No cenário pré- clínico a carga tumoral é geralmente mais constante para avaliar e documen- tar. Nestes estudos pré-clínicos podem ser traduzidos para o cenário clínico, 20 fármacos que produzem prolongada sobrevida em modelos pré-clínicos têm a maior utilidade clínica prevista. De modo análogo à produção de respostas positivas ao tratamento clínico, fármacos que reduzem a carga tumoral no cenário pré-clínico também podem ter impacto direto significativo sobre a doença. Embora o prolongamento da sobrevida seja o resultado clínico pos- 25 terior mais buscado do tratamento de câncer com fármaco, há outros benefí- cios que têm utilidade clínica e é evidente que a redução da carga tumoral, a qual pode se correlacionar com um atraso na progressão da doença, prolon- gar a sobrevida ou ambos, também pode levar a benefícios diretos e ter im- pacto clínico (Eckhardt et a Developmental Therapeutics: Successes and 30 Failures of Clinicai Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003, pp. 209-219).
A presente invenção descreve o desenvolvimento e uso de AR51A165.2 identificado por seu efeito em uma prova citotóxica e em um modelo animal de câncer humano. Esta invenção descreve reagentes que ligam especificamente a um epitopo ou epitopos presentes sobre a molécula alvo, e que também têm propriedades citotóxicas in vitro, como um anticorpo 5 nu, contra células tumorais malignas mas não células normais, e as quais também mediam diretamente, como um anticorpo nu, a inibição de cresci- mento tumoral. Um avanço adicional é o uso de anticorpos anticancerígenos tais como este para atingir tumores expressando marcadores antigênicos cognatos para obter inibição do crescimento tumoral, e outros desfechos 10 positivos de tratamento do câncer.
Em todos, esta invenção ensina o uso do antígeno AR51A165.2 como um alvo para um agente terapêutico, que quando administrado pode reduzir a carga tumoral de um câncer expressando o antígeno em um mamí- fero. Esta invenção também ensina o uso de CDMAB (AR51A165.2), e seus 15 derivados, e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, e Iigantes in- dutores de citotoxicidade dos mesmos, para atingir seu antígeno para reduzir a carga tumoral de um câncer expressando o antígeno em um mamífero. Além disso, esta invenção também ensina o uso de detecção do antígeno AR51A165.2 em células cancerosas que podem ser úteis para o diagnóstico, 20 prognóstico da terapia, e prognóstico de mamíferos portando tumores que expressam este antígeno.
Por conseguinte, é um objetivo da invenção utilizar um método para produzir anticorpos modificando doenças cancerosas (CDMAB) cultiva- dos contra células cancerosas derivadas de um indivíduo particular, ou uma 25 ou mais linhagens de células cancerígenas particulares, cujos CDMAB são citotóxicos com respeito a células cancerígenas ao mesmo tempo que simul- taneamente sendo relativamente não-tóxicos para células não-cancerosas, de modo a isolar linhagens de células de hibridoma e os anticorpos mono- clonais isolados correspondentes e fragmentos de ligação de antígeno dos 30 mesmos para os quais as referidas linhagens de células de hibridoma são codificadas.
É um objetivo adicional da invenção ensinar anticorpos modifi- cando doenças cancerosas, Iigantes e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos.
É um objetivo adicional da presente invenção produzir anticorpos modificando doenças cancerosas cuja citotoxicidade é mediada através de toxicidade celular dependente de anticorpos.
É ainda um objetivo adicional da presente invenção produzir an- ticorpos modificando doenças cancerosas cuja citotoxicidade é mediada a- través de toxicidade celular dependente do complemento.
É ainda um objetivo adicional da presente invenção produzir an- ticorpos modificando doenças cancerosas cuja citotoxicidade é uma função de sua capacidade para catalisar hidrólise de ligações químicas celulares.
Um objetivo ainda adicional da presente invenção é produzir an- ticorpos modificando doenças cancerosas os quais são úteis para em uma prova de ligação para diagnóstico, prognóstico, e monitoramento do câncer.
Outros objetivos e vantagens desta invenção se tornarão eviden-
tes a partir da seguinte descrição em que são determinados, a título de ilus- tração e exemplo, algumas modalidades desta invenção.
BREVE DESCRIÇÃO OS DESENHOS
A figura 1 compara a percentagem de citotoxicidade e níveis de ligação do sobrenadantes do hibridoma contgra as linhagens celulares OCC- I, OVCAR-3 e CCD-27sk.
A figura 2 representa ligação de AR51A165.2 a linhagens de células de câncer e normais. Os dados são tabelados para apresentar a in- tensidade de fluorescência média como um aumento múltiplo acima do con- trole de isótipos.
A figura 3 inclui histogramas FACS representativos de AR51 A165.2 e anticorpos antiEGFR dirigidos contra várias linhagens de cé- lulas de câncer e não-cancerígenas.
A figura 4 demonstra o efeito de AR51A165.2 sobre o cresci- mento tumoral em um modelo de câncer pancreático BxPC-3 profilático. As linhas tracejadas verticais indicam o período durante o qual o anticorpo foi administrado. Os pontos de dados representam a média +/- SEM. A figura 5 demonstra o efeito de AR51A165.2 sobre o peso cor- poral em um modelo de câncer pancreático BxPC-3 profilático. Os pontos de dados representam a média +/- SEM.
A figura 6 demonstra o efeito de AR51A165.2 sobre o cresci- mento tumoral em um modelo de câncer de mama MDA-MB-231 profilático. As linhas tracejadas verticais indicam o período durante o qual o anticorpo foi administrado. Os pontos de dados representam a média +/- SEM.
A figura 7 demonstra o efeito de AR51A165.2 sobre o peso cor- poral em um modelo de câncer de mama MDA-MB-231 profilático. Pontos de dados representam a média +/- SEM.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Em geral, as seguinges palavras ou frases têm a definição indi- cada quando usadas no sumário, na descrição, nos exemplos, e nas reivin- dicações.
O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e cobre es-
pecificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais únicos (incluindo anti- corpos agonistas, antagonistas, e neutralizantes, anticorpos de-imunizados, murinos, quimerizados ou humanizados), composições de anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos de cadeia única, imunoconjugados e fragmentos de anticorpos (vide abaixo).
O termo "anticorpo monoclonal" conforme usado aqui, neste re- querimento de Patente, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individu- ais compreendendo a população são idênticos exceto por possíveis muta- 25 ções que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em menores quantidades. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dire- cionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos policlonais as quais incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo mo- 30 noclonal é direcionado contra um único determinante sobre o antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos em que podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modifi- cador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser considerado como requerendo produção do anticorpo por qualquer mé- todo em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados 5 de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método do hibridoma (murino ou humano) descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por meio de métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos N0 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados a par- 10 tir de bibliotecas de fagos de anticorpos usando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. MoL Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.
"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, preferencialmente compreendendo a região de ligação de 15 antígeno ou variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpos in- cluem fragmentos de anticorpos de extensão menos de total, Fab, Fab’, F(ab')2, e Fv; "diacorpos"; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia única; anticorpos de cadeia única, moléculas de anticorpos de único domínio, proteínas de fusão, proteínas recombinantes e anticorpos multies- 20 pecíficos formados de um ou mais fragmentos de anticorpos.
Um anticorpo "intacto" é um anticorpo o qual compreende uma região variável de ligação de antígeno bem como um domínio constante de cadeia leve (Cl) e os domínios constantes de cadeia pesada, CHI, CH2 e Ch3. Os domínios constantes podem ser de domínios constantes de se- 25 quência nativa (por exemplo, domínios constantes de seqüência nativa hu- mana) ou variante de seqüências de aminoácidos dos mesmos. Preferenci- almente, o anticorpo intacto tem uma ou mais funções efetoras.
Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constan- te de suas cadeias pesadas, anticorpos intactos podem ser atribuídos a dife- rentes "classes". Há cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE1 IgG, e IgM, e vários destes podem ser adicionalmente divididos em "subclasses" (isótipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são denominados α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As estruturas das subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são de conhecimento geral.
5 Anticorpo "funções efetoras" refere-sem às atividades biológicas
atribuíveis à região de Fc (uma região de Fc de seqüência nativa ou região de Fc variante de seqüência de aminoácidos) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem ligação de Clq; citotoxicidade de- pendente do complemento; ligação de receptor de Fe; citotoxicidade media- 10 da por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; down regula- ção de receptores da superfície celular (por exemplo, receptor de células B; BCR), e etc.
"Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos" e "ADCC” referem-se a uma reação mediada por células na qual células cito- tóxicas não específicas que expressam receptores de Fe (FcRs) (por exem- plo, células assassinas naturais (NK), neutrófilos, e macrófagos) reconhe- cem anticorpo ligado sobre uma célula alvo e subsequentemente causam Iise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, ex- pressam FcyRIII somente, ao passo que monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 à página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Im- munol 9: 457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizada uma prova de ADCC in vitro, tal como a descrita na Patente dos Estados Unidos N0 5.500.362 ou na Patente dos Estados Unidos N0 5.821.337. Células efetoras úteis para tais provas inclu- em células mononucleares do sangeu periférico (PBMC) e células assassi- nas naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o revelado em Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656(1998).
"Células efetoras" são leucócitos os quais expressam uma ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Preferencialmente, as células ex- pressam no mínimo FcyRIIl e realizam função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos os quais mediam ADCC incluem células mononucle- ares do sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK), monó- citos, células T citotóxicas e neutrófilos; com células PBMCs e células NK 5 sendo preferenciais. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa das mesmas, por exemplo, do sangue ou PBMCs conforme descrito aqui, neste requerimento de Patente.
Os termos "receptor de Fe" ou "FcR" são usados para descrever um receptor que liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferencial é uma 10 FcR humana de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferencial é um o qual liga um anticorpo de IgG (um gama receptor) e inclui receptores das subclasses FcyRI1 FcyRII, e Fcy Rlll1 incluindo variantes alélicas e alternati- vamente formas unidas destes receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), 15 os quais têm seqüências de aminoácidos similares que diferem essencial- mente nos domínios citoplasmáticos dos mesmos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação à base de tirosina imunorreceptor (ITAM) em seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB con- tém um motivo de inibição à base de tirosina imunorreceptor (ITIM) em seu 20 domínio citoplasmático, (vide a revisão de M. in Daeron, Annu. Rev. Immu- nol. 15:203-234 (1997)). FcRs são revisados por Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo "FcR" 25 aqui, neste requerimento de Patente. O termo também inclui o receptor neo- natal, FcRn, o qual é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., Eur. J. Immunol. 24:2429(1994)).
"Citotoxicidade dependente do complemento" ou "CDC" refere- se à capacidade de uma molécula para Iisar um alvo na presença de com- plemento. O caminho de ativação do complemento é iniciado por ligação do primeiro componente do sistema do complemento (CIq) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) formando complexo com um antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, pode ser realizada uma prova de CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Me- thods 202: 163(1996).
5 O termo "variável" refere-se ao fato de que algumas porções dos
domínios variáveis diferem extensivamente em seqüência entre anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniforme- mente por todos os domínios variáveis de anticorpos. É concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis tanto nos domínios variáveis de cadeia leve quanto nos de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são denominadas as regiões de frame- work (FRs). Os domínios variáveis de cadeias pesada e leve nativas cada compreendem quatro FRs, largamente adotando uma configuração de β- sheet, conectada por três regiões hipervariáveis, as quais formam Ioops co- nectando, e em alguns casos formando parte, da estrutura de β-sheet. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em íntima proxi- midade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contri- buem para a formação do sítio de ligação antigênica de anticorpos (vide Ka- bat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Os do- mínios constantes não estão envolvidos diretamente em ligar em anticorpo a um antígeno, mas apresentam várias funções efetoras, tais como participa- ção do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). O termo "região hipervariável" quando usado aqui, neste reque-
rimento de Patente, refere-se aos resíduos aminoácidos de um anticorpo os quais são responsáveis por ligação de antígeno. A região hipervariável ge- ralmente compreende resíduos aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (por exemplo, resíduos 24-34 (LI), 50-56 30 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., Sequen- ces of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, Na- tional Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou os resíduos de um "lo- op hipervariável" (por exemplo, resíduos 2632 (LI), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901 - 5 917 (1987)). Resíduos da "região de Framework" ou "FR" são os resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de regiões hipervariáveis conforme definido aqui, neste requerimento de Patente. A digestão por papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, deno- minados fragmentos "Fab", cada um com um único sítio de ligação de antí- 10 geno, e um fragmento "Fe" residual, cujo nime reflete sua capacidade para cristalizar prontametne. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de ligação de antígeno e ainda é capaz de reticu- Iar antígeno.
"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo o qual contém um sítio completo de reconhecimento de antígeno e de ligação de antígeno. Esta re- gião consiste de um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em firme associação não-covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem defi- nindo um sítio de ligação de antígeno sobre a superfície do dímero Vh-Vl. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio va- riável (ou metade de um Fv compreendendo somente três regiões hipervari- áveis específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora em uma menor afinidade do que o sítio de ligação inteiro. O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH I) da cadeia pesada. Fragmentos Fab1 dife- rem de fragmentos Fab pela adição de uns poucos resíduos no término car- bóxi do domínio CHI de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui, neste re- querimento de Patente, para Fab1 no qual o um ou mais resíduos cisteína dos domínios constantes portam no mínimo um grupamento tiol livre. Frag- mentos de anticorpos F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab1 os quais têm articulação de cisteinas entre os mesmos. Ou- tras ligações químicas de fragmentos de anticorpos também são conhecidas.
As "cadeias leves" de anticorpos de quaisquer espécies de ver- tebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, de- 5 nominados Kappa (K) e lâmbda (λ), com base nas seqüências de aminoáci- dos de seus domínios constantes.
Fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia única" ou "scFv" com- preendem os domínios Vh e Vl de anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferencialmente, o poli- 10 peptídeo Fv adicionalmente compreende um encadeador de polipeptídeo entre os domínios VH e Vl o qual permite que o scFv forme a estrutura dese- jada para ligação de antígeno. Para uma revisão de scFv vide Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moo- re eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anti-
corpos com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreen- dem um domínio pesado variável (Vh) conectado a um domínio leve variável (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (Vh-Vl). Usando um encadeador que é curto demais para permitir pareamento entre os dois domínios sobre a 20 mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios com- plementares de outra chain e criar dois sítios de ligação de antígeno. Diabo- dies são descritos mais completamente, por exemplo, na Patente européia N0 EP 404.097; na Patente internacional N0 WO 93/11161 ; e em Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 90: 6444-6448 (1993).
Um anticorpo "isolado" é um anticorpo o qual foi identificado e
separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente natu- ral. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais os quais interfeririam com usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não pro- 30 teináceos. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células re- combinantes desde que no mínimo um componente do ambiente natural do anticorpo não venha a estar presente. Ordinariamente, no entanto, o anticor- po isolado será preparado por no mínimo uma etapa de purificação.
Um anticorpo "o qual liga" um antígeno de interesse é um anti- corpo capaz de ligar aquele antígeno com suficiente afinidde de tal modo que o anticorpo seja útil como um agente terapêutico ou diagnóstico no dire- 5 cionamento de uma célula expressando o antígeno. Onde o anticorpo é um anticorpo o qual liga a porção antigênica geralmente e preferencialmente ele ligará aquela porção antigênica ao invés de outros receptores, e não inclui ligação incidental tal como contacto com Fc não-específico, ou ligação a modificações pós-translacionais comuns a outros antígenos e pode ser um 10 anticorpo o qual não tem reação cruzada significativa com outras proteínas. Métodos para a detecção de um anticorpo que liga um antígeno de interesse são de conhecimento geral na técnica e podem incluir mas não estão limita- dos a testes tais como FACS, ELISA celular e Western blot.
Conforme usado aqui, neste requerimento de Patente, as ex- 15 pressões "célula", "linhagem celular", e "cultura celular" são usados de modo intercambiável, e todas estas designações incluem progênis. Deve ser en- tendido que toda a progênie pode não ser precisamente idêntica no conteú- do de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Progênies mu- tantes que tenham a mesma função ou atividade biológica conforme triado 20 para na célula originalmente transformada cell são incluídas. Será evidente a partir do contexto onde se pretende designações distintas.
"Tratamento ou tratar" refere-se tanto a tratamento terapêutico quanto a medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou retardar (reduzir) a condição patológica ou distúrbio alvo. Aqueles que 25 necessitam de tratamento incluem aqueles já com o distúrbio bem como a- queles propensos a terem o distúrbio ou aqueles nos quais o distúrbio deve ser evitado. Deste modo, o mamífero a ser tratado aqui, neste requerimento de Patente, pode ter sido diagnosticado como tendo o distúrbio ou pode ser predisposto ou suscetível ao distúrbio.
Os termos "câncer" e "canceroso" refere-sem a ou descrevem a
condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por mor- te ou crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais particulares de similares cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células es- camosas epiteliais), câncer pulmonar incluindo câncer pulmonar de células 5 pequenas, câncer pulmonar de células não-pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepa- tocelular, câncer gástrico ou estomacal incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer hepático, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, 10 câncer retal, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, câncer de rim ou renal, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tiróide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, bem como câncer de cabeça e pescoço.
Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tra- tamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquila tais como bussulfan, improssulfan e pipossulfan; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilame- Iaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trieti- Ienotiofosforamida e trimetilolomelamina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, meclore- tamina, cloridreto de óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fe- nesterine, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosuréias tais como carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimusti- na; antibióticos tais como aclacinomysins, actinomicina, autramicina, azase- rina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carnomícina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6- diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estrepto- nigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti- metabólitos tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos do áci- do fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; aná- logos de purina tais como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina, tiogua- nina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5- 5 FU; androgênios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epi- tiostanol, mepitiostane, testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetimi- da, mitotano, trilostano; repositor do ácido fólico tal como ácido frolínico; a- ceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; ansacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defosfamina; demecolcina; diaziquona; 10 elfornitina; acetato de eliptínio; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiuréia; Ienti- nan; lonidamine; mitoguazone; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentos- tatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxana; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"- triclorotrietilamina; uretan; vindesina; dacarbazina; manomustina; 15 mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); ci- clofosfamida; tiotepa; taxanos, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.) e docetaxel (TAXOTERE®, Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil; gencitabina; 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cis- 20 platina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposídeo; daunomicina; aminopterin; xeloda; ibandronato; CPT-II; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; esperamicinas; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente 25 aceitáveis de quaisquer dos acima. Também são incluídos nesta definição agentes anti-hormonais que agem regulando ou inibindo a ação hormonal sobre tumores tais como anti-estrogênios incluindo por exemplo tamoxifen, raloxifeno, 4(5)-imidazóis inibidores da aromatase, 4-hidroxitamoxifen, trioxi- feno, queoxifeno, LYI 17018, onapristone, e toremifeno (Fareston); e anti- 30 androgênios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, e go- serelin; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quais- quer dos acima. "Mamífero" para fins de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, camundongos, SCID ou camundongos nude ou cepas de camundongos, animais domésticos e de criação, e animais selvagens, de competição, ou de estimação, tais como 5 carneiro, cães, cavalos, gatos, vacas, e etc. Preferencialmente, o mamífero aqui, neste requerimento de Patente, é humano.
"Oligonucleotídeos" são polidesoxinucleotídeos de extensão cur- ta, de filamento único ou de filamento duplo, que são sintetizados quimica- mente por meio de métodos conhecidos (tais como química de fosfotriéster, 10 fosfito, ou fosforamidita, usando técnicas de fase sólida tal como descrito na Patente européia N0 EP 266.032, publicada em 4 de maio de 1988, ou atra- vés de desoxinucleosídeo H-fosfonato intermediários conforme descrito por Froehler et al., NucL Acids Res., 14:5399-5407, 1986. São então purificados sobre géis de poliacrilamida.
De acordo com a presente invenção, formas "humanizadas" e/ou
"quiméricas" de imunoglobulinas não-humanas (por exemplo, murine) refere- sem a anticorpos os quais contêm imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, Fab, Fab1, F(ab')2 ou outras subsequências de anticorpos de ligação de antígeno) 20 as quais resultam na redução de uma resposta de anticorpo humano anti- camundongo (HAMA), anticorpo humano anti-quimérico (HACA) ou um anti- corpo humano anti-humano (HAHA), comparado à o anticorpo original, e contêm as porções requeridas (por exemplo, CDR(s), uma ou mais regiões de ligação de antígeno, um ou mais domínios variáveis e assim por diante) 25 derivadas da referida imunoglobulina não-humana, necessária para reprodu- zir o efeito desejado, ao mesmo tempo que conservando simultaneamente características de ligação as quais são comparáveis à referida imunoglobuli- na não-humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglo- bulinas humanas (anticorpo do receptor) nas quais resíduos das regiões de- 30 terminantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo receptor são substi- tuídas por resíduos das CDRs de uma espécie não-humana (anticorpo do doador) tais como camundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, a afinidade e a capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de framework Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resí- duos FR não-humanos correspondentes. Além disso, o anticorpo humaniza- do pode compreender resíduos os quais não são encontrados nem no anti- 5 corpo receptor nem nas seqüências CDR ou FR importadas. Estas modifica- ções são feitas para refinar e otimizar adicionalmente a performance do anti- corpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de no mínimo um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma 10 imunoglobulina não-humana e todos ou substancialmente todos os resíduos FR são os de uma seqüência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá no mínimo uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fe), tipicamente a de uma imunoglobulina humana.
Anticorpos "de-imunizados" são imunoglobulinas que são não-
imunogênicas, ou menos imunogênicas, a uma dada espécie. De- imunização pode ser obtida através de alterações estruturais para o anticor- po. Pode ser empregada qualquer técnica de de-imunização de conhecimen- to daqueles versados na arte. Uma técnica adequada para de-imunizar anti- 20 corpos é descrita, por exemplo, na publicação de Patente internacional N0 WO 00/34317 publicada em 15 de junho de 2000.
Um anticorpo o qual induz "apoptose" é um o qual induz morte celular programada por quaisquer meios, ilustrados por mas não limitados a ligação de anexina V, atividade de caspase, fragmentação de DNA, encolhi- 25 mento celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular, e/ou formação de vesículas de membranas (denominadas estruturas apoptó- ticas).
Conforme usado aqui, neste requerimento de Patente, "citotoxi- cidade induzida por anticorpos" é entendido como significando o efeito cito- tóxico derivado do sobrenadante do hibridoma ou anticorpo produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC como número de acesso 180706-02 cujo efeito não é necessariamente relacionado com o grau de ligação. Do início ao fim da presente especificação, linhagens de células de hibridoma, bem como os anticorpos monoclonais isolados os quais são produzidos a partir das mesmas, são alternativamente referidas por sua de- signação interna, AR51A165.2 ou Designação do Depositário, IDAC 180706- 5 02.
Conforme usado aqui, neste requerimento de Patente, "anticor- po-ligante" inclui uma porção a qual apresenta especificidade de ligação pa- ra no mínimo um epitopo do antígeno-alvo, e a qual pode ser uma molécula de anticorpo intacto, fragmentos de anticorpo, e qualquer molécula tendo no 10 mínimo uma região de ligação de antígeno ou porção da mesma (isto é, a porção variável de um anticorpo molécula), por exemplo, uma molécula Fv, molécula Fab, molécula Fab', molécula F(ab').sub.2, um anticorpo biespecífi- co, uma proteína de fusão, ou qualquer molécula produzida por engenharia genética a qual especificamente reconhece e liga no mínimo um epitopo do 15 antígeno ligado pelo anticorpo monoclonal isolado produzido pela linhagem celular do hibridoma designado como IDAC 180706-02 (o antígeno IDAC 180706-02).
Conforme usado aqui, neste requerimento de Patente, "anticor- pos modificando doença cancerosa" (CDMAB) refere-se a anticorpos mono- 20 clonais os quais modificam o processo de doença cancerosa em uma manei- ra a qual é benéfica para o paciente, por exemplo, reduzindo a carga tumoral ou prolongando a sobrevida de indivíduos portando tumor, e anticorpo- Iigantes dos mesmos.
Conforme usado aqui, neste requerimento de Patente, "região de ligação antigênica" significa uma porção da molécula a qual reconhece o antígeno-alvo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de Patente, "inibe competitivamente" significa ser capaz de reconhecer e ligar um sítio deter- minante ao qual o anticorpo monoclonal produzido pela linhagem celular do 30 hibridoma designatado como IDAC 180706-02, (o anticorpo IDAC 180706- 02) é direcionado usando provas de competição de anticorpos recíprocos convencionais. (Belanger L., Sylvestre C. and Dufour D. (1973), Enzyme Iin- ked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich proce- dures. Clinica Chimica Acta 48, 15).
Conforme usado aqui, neste requerimento de Patente, "antíge- no-alvo" é o antígeno IDAC 180706-02 ou porções do mesmo.
5 Conforme usado aqui, neste requerimento de Patente, um "imu-
noconjugado" significa qualquer molécula ou CDMAB tal como um anticorpo quimicamente ou biologicamente encadeado a uma citotoxina, um agente radioativo, enzima, toxina, um fármaco antitumoral ou um agente terapêuti- co. O anticorpo ou CDMAB pode ser encadeado à citotoxina, agente radioa- 10 tivo, fármaco antitumoral ou agente terapêutico em qualquer localização ao longo da molécula na medida que seja capaz de ligar seu alvo. Exemplos de imunoconjugados incluem conjugados químicos de anticorpo toxina e proteí- nas de fusão de anticorpo-toxina.
Conforme usado aqui, neste requerimento de Patente, uma "pro- teína de fusão" significa qualquer proteína quimérica em que uma região de ligação d eantígeno é conectada a uma molécula biologicamente ativa, por exemplo, toxina, enzima, ou fármaco de proteína.
De modo a que a invenção descrita aqui, neste requerimento de Patente, possa ser mais totalmente entendida, é estabelecida a seguinte descripção.
A presente invenção proporciona CDMABs (isto é, IDAC 180706-02 CDMAB) os quais especificamente reconhecem e ligam o antíge- no IDAC 180706-02.
O CDMAB do anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibri- 25 doma depositado junto ao IDAC como número de acesso 180706-02 pode estar em qualquer forma na medida que tenha uma região de ligação de an- tígeno a qual inibe competitivamente a ligação imunoespecífica do anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma IDAC 180706-02 para seu an- tígeno-alvo. Deste modo, quaisquer proteínas recombinantes (por exemplo, 30 proteínas de fusão em que o anticorpo é combinado com uma segunda pro- teína tal como uma Iinfocina ou um fator de crescimento inibitório tumoral) tendo a mesma especificidade de ligação que o anticorpo IDAC 180706-02 estão dentro do âmbito desta invenção.
Em uma modalidade da invenção, o CDMAB é o anticorpo IDAC
180706-02.
Em outras modalidades, o CDMAB é um fragmento de ligação 5 antigênica o qual pode ser uma molécula Fv (tal como uma molécula Fv de cadeia única), uma molécula Fab, uma molécula Fab', uma molécula F(ab')2, uma proteína de fusão, um anticorpo bi-específico, um heteroanticorpo ou qualquer molécula recombinante tendo a região de ligação de antígeno do anticorpo IDAC 180706-02. O CDMAB da invenção é direcionado para o epi- 10 topo ao qual o anticorpo monoclonal IDAC 180706-02 é direcionado.
O CDMAB da invenção pode ser modificado, isto é, por modifi- cações de aminoácidos dentro da molécula, de modo a produzir moléculas derivadas. Também pode ser possível modificação química.
Moléculas derivadas conservariam a propriedade funcional do polipeptídeo, isto é, a molécula tendo similares substituições ainda permitirá a ligação do polipeptídeo ao antígeno IDAC 180706-02 ou porções do mes- mo.
Estas substituições de aminoácidos incluem, mas não estão ne- cessariamente limitadas a, substituições de aminoácidos conhecidas na téc- nica como "conservativas".
Por exemplo, é um princípio esbalelecido de modo geral da quí- mica de proteínas que algumas substituições de aminoácidos, intituladas "substituições de aminoácidos conservativas", podem frequentemente ser feitas em uma proteína sem alterar quer a conformação ou a função da pro- teína.
As alterações referidas incluem substituir qualquer de isoleucina (I), valina (V), e Ieucina (L) por qualquer outro destes aminoácidos hidrofóbi- cos; ácido aspártico (D) por ácido glutâmico (E) e vice versa; glutamina (Q) por asparagina (N) e vice versa; e serina (S) por treonina (T) e vice versa. 30 Outras substituições também podem ser consideradas conservativas, de- pendendo do ambiente do aminoácido em particular e de seu papel na estru- tura tridimensional da proteína. Por exemplo, glicina (G) e alanina (A) podem frequentemente ser intercambiáveis, assim como alanina e valina (V). Metio- nina (M)1 a qual é relativamente hidrofóbica, pode frequentemente ser inter- cambiada com Ieucina e isoleucina, e algumas vezes com valina. Lisina (K) e arginina (R) são frequentemente intercambiáveis em localizações nas quais 5 a característica significativa do resíduo aminoácido é sua carga e os pK's diferentes destes dois resíduos aminoácidos não são significativos. Ainda outras alterações podem ser consideradas "conservativas" em ambientes particulares.
EXEMPLO 1
Produção de Hibridoma - Linhagem de Células de Hibridoma AR51A165.2
A linhagem de células de hibridoma AR51A165.2 foi depositada, de acordo com o Tratado de Budapeste, junto á Autoridade Depositária In- ternacional do Canadá (IDAC, International Depository Authority of Canada), Bureau of Microbiology, Health Canada, 1015 Arlington Street, Winnipeg, 15 Manitoba, Canada, R3E 3R2, em 18 de julho de 2006, sob o Número de A- cesso 180706-02. De acordo com 37 CFR 1.808, os depositantes assegu- ram que todas as restrições impostas sobre a disponibilidade para o público dos materiais depositados serão irrevogavelmente removidas na concessão de uma Patente. O depósito será substituído se o depositário não puder dis- 20 pensar amostras viáveis.
Para produzir o hibridoma que produz o anticorpo anticanceríge- no AR51A165.2, uma única suspensão celular de tecido tumoral de adeno- carcinoma endometrióide congelado (Genomics Collaborative, Cambridge, MA) foi preparada em PBS. Adjuvante IMMUNEAS Y™ (Qiagen, Venlo, Ne- 25 therlands) foi preparado para uso por suave mistura. Camundongos BALB/c de cinco a sete semanas de idade foram imunizados injetando por via subcu- tânea, 2 milhões de células em 50 microlitros do antígeno-adjuvante. Antíge- no-adjuvante recentemente preparado foi usado para reforçar os camundon- gos imunizados por via intraperitoneal, 2 e 5 semanas depois da imunização 30 inicial, com 2 milhões de células em 50 a 60 microlitros. Um baço foi usado para fusão três dias depois da última imunização. Os hibridomas foram pre- parados fundindo os esplenócitos isolados com parceiros de mieloma NSO-I. Os sobrenadantes das fusões foram testados a partir de subclones dos hi- bridomas.
Para determinar se os anticorpos secretados pelas células de hibridoma são do isótipo IgG ou IgM, foi empregado um ensaio ELISA. 100 5 microlitros/ cavidade de IgG + IgM de cabra anti- camundongo (H+L) em uma concentração de 2,4 microgramas/ mL em tampão de revestimento (0,1 M de tampão de carbonato/bicarbonato, pH 9,2 a 9,6) a 4°C foi adicionado às lâminas do ELISA de um dia para o outro. As lâminas foram lavadas três vezes em tampão de lavagem (PBS + 0,05 por cento de Tween). 100 microli- 10 tros/ cavidade de tampão de bloqueio (5 por cento de leite em tampão de lavagem) foi adicionado à lâmina por 1 hora em temperatura ambiente e em seguida foi lavado três vezes em tampão de lavagem. 100 microlitros/ cavi- dade de sobrenadante do hibridoma foi adicionado e a lâmina foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas três vezes 15 com tampão de lavagem e diluição a 1/100.000 de ou IgG ou IgM de cabra anticamundongo conjugado de peroxidase de raiz-forte (diluído em PBS con- tendo 1 por cento de leite), 100 microlitros/ cavidade, foi adicionada. Depois de incubar a lâmina por 1 hora em temperatura ambiente a lâmina foi lavada três vezes com tampão de lavagem. 100 microlitros/ cavidade de solução 20 TMB foi incubado por 1 a 3 minutos em temperatura ambiente. A reação de cor foi terminada adicionando 50 microlitros/ cavidade de H2SO4 a 2 M e a lâmina foi lida a 450 nm com uma leitora de lâminas Perkin-Elmer HTS7000. Conforme indicado na figura 1, o hibridoma AR51A165.2 secretou essenci- almente anticorpos do isótipo de IgG.
Para determinar a subclasse de anticorpo secretada pelas célu-
las de hibridoma, um experimento de isotipagem foi realizado usando um kit Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (HyCuIt Biotechnology, Frontstraat, Países Baixos). 500 microlitros de solução tampão foram adicionados à tira de teste contendo anticorpos específicos da subclasse de rato anticamun- 30 dongo. 500 microlitros de sobrenadante do hibridoma foram adicionados ao tubo de teste, e submergiram por suave agitação. Imunoglobulinas de ca- mundongo capturadas foram detectadas diretamente por um segundo anti- corpo monoclonal de rato o qual é ligado a partículas de colóide. A combina- ção destas duas proteínas cria um sinal visual usado para analisar o isótipo. O anticorpo anticancerígeno AR51A165.2 é do isótipo Kappa de IgGI.
Depois de uma rodada de diluição limitante, sobrenadantes do hibridoma foram testados para anticorpos que ligam a células alvo em um ensaio ELISA celular. Foram testadas duas linhagens de células canceríge- nas ovarianas humanas e 1 linhagem de células de pele normal humana: OCC-I1 OVCAR-3 e CCD-27sk respectivamente. Todas as linhagens de célu- las foram obtidas da American Type Tissue Collection (ATCC; Manassas1 VA). As células laminadas foram fixadas antes de usar. As lâminas foram lavadas três vezes com PBS contendo MgCI2 e CaCI2 em temperatura ambi- ente. 100 microlitros de 2 por cento de paraformaldeído diluído em PBS foi adicionado a cada cavidade por 10 minutos em temperatura ambiente e em seguida descartados. As lâminas foram novamente lavadas com PBS con- tendo MgCI2 e CaCI2 três vezes em temperatura ambiente. Foi veito bloqueio com 100 microlitros/ cavidade de 5 por cento de leite em tampão de lavagem (PBS + 0,05 por cento de Tween) por 1 hora em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem e o sobrenadante do hibridoma foi adicionado a 100 microlitros/ cavidade por 1 hora em tem- peratura ambiente. As lâminas foram lavadas três vezes com tampão de la- vagem e 100 microlitros/ cavidade de 1/25.000 diluição de anticorpo IgG an- ticamundongo de cabra conjugado a peroxidase de raiz-forte (diluído em PBS contendo 1 por cento de leite) foi adicionado. Depois de 1 hora de incu- bação em temperatura ambiente as lâminas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem e 100 microlitro/ cavidade de substrato TMB foi incuba- do por 1 a 3 minutos em temperatura ambiente. A reação foi terminada com 50 microlitros/ cavidade de H2SO4 a 2 M e a lâmina foi lida a 450 nm com uma leitora de lâminas Perkin-Elmer HTS7000. Os resultados conforme ta- belados na figura 1 foram expressados como o número de vezes acima do pano de fundo comparado à um controle de isótipo de IgG in-house que foi mostrado previamente que liga às linhagens celulares testadas. Os anticor- pos do hibridoma AR5 IA 165.2 apresentaram ligação detectável às linha- gens celulares testadas.
Em combinação com experimentação para ligação de anticor- pos, o efeito citotóxico dos sobrenadantes do hibridoma (citotoxicidade indu- zida por anticorpos) foi testado nas linhagens celulares: OCC-1, OVCAR-3 e 5 CCD-27sk. Calcein AM foi obtida da Molecular Probes (Eugene, OR) e o tes- te foi realizado conforme resumido abaixo. As células foram laminadas antes do teste na densidade predeterminada apropriada. Depois de 2 dias, 100 microlitros de sobrenadante das lâminas de microtítulo do hibridoma foram transferidos para as lâminas celulares e incubadas em uma incubadora a 5 10 por cento de CO2 por 5 dias. As cavidades que serviram como os controles positivos foram aspiradas até vazias e 100 microlitros de azida de sódio (NaN3, 0,01 por cento, Sigma, Oakville, ON), ciclo-heximida (CHX, 0,5 mi- cromolar, Sigma, Oakville, ON) ou anticorpo antiEGFR (c225, IgGI, Kappa, 5 microgramas/ mL, Cedarlane, Hornby, ON) dissolvido em meio de cultura, foi 15 adicionado. Depois de 5 dias de tratamento, as lâminas foram em seguida esvaziadas por inversão e "blotted" à seco. DPBS em temperatura ambiente (salina tamponada com fosfato de Dulbecco) contendo MgCI2 e CaCI2 foi dispensada dentro de cada cavidade a partir de um frasco de compressão multicanal, batidas 3 vezes, esvaziadas por inversão e em seguida secas 20 com mata-borrão. 50 microlitros do corante de calceína fluorescente diluído em DPBS contendo MgCI2 e CaCI2 foi adicionado a cada cavidade e incuba- do a 37°C em uma incubadora a 5 por cento de CO2 por 30 minutos. As lâ- minas foram lidas em uma leitora de lâminas de fluorescência Perkin-Elmer HTS7000 e os dados foram analisados no Microsoft Excel. Os resultados 25 são tabelados na figura 1. O sobrenadante do hibridoma AR51 A 165.2 pro- duziu citotoxicidade específica de 23 por cento sobre as células OCC-1. Isto foi 27 e 24 por cento da citotoxicidade obtida com os controles positivos azi- da de sódio e ciclo-heximida, respectivamente.
Os resultados da figura 1 demonstram que os efeitos citotóxicos de AR51A165.2 não foram proporcionais aos níveis de ligação sobre os tipos de células cancerígenas. Houve ligação detectável sobre as três linhagens celulares testadas e citotoxicidade associada a somente OCC-I. Conforme tabelado na figura 1, AR51A165.2 não produziu citotoxicidade na linhagem de células de pele humana normal CCD-27sk. Os agentes citotóxicos não- específicos conhecidos ciclo-heximida e NaN3 produziram de modo geral citotoxicidade conforme esperado. O anticorpo c225 antiEGFR produziu cito- 5 toxicidade conforme esperado sobre SW1116.
EXEMPLO 2 Ligação In vitro
Anticorpo monoclonal AR51A165.2 foi produzido cultivando o hibridoma em frascos CL-1000 (BD Biosciences, Oakville, ON) com coleções 10 e ocorrendo ressemeadura duas vezes por semana. Foram seguidos proce- dimentos de purificação de anticorpos de rotina com Protein G Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC). Está dentro do âmbito desta invenção utilizar anticorpos monoclonais que são de-imunizados, hu- manizado, quimerizados ou murinos.
A ligação de AR51A165.2 a linhagens celulares de câncer de
próstata (PC-3 e DU-145), de cólon (DLD-I, Lovo e SWI 116), pancreático (BxPC-3, PL-45 e AsPC-I), pulmonar (A549), ovariano (OVCAR-3, ES-2, A2780-cp, A2780-S, C-13, Hey, OV2008 e OVCA-429) e mama (MDA-MB- 231 e MCF-7), e não-cancerígenas de pele (CCD-27sk) e pulmão 20 (Hs888.Lu) foi avaliada por citometria de fluxo (FACS). Toda as linhagens celulares, exceto pela maioria das linhagens de células cancerígenas ovari- anas, foram obtidas da American Type Tissue Collection (ATCC; Manassas, VA). A2780-cp, A2780-S, C-13, OV2008, ES-2, Hey, OVCA-429 foram obti- das do Ottawa Regional CancerCenter (Ottawa, ON).
As células foram preparadas para FACS lavando inicialmente a
monocamada celular com DPBS (sem Ca++ e Mg+*). Tampão de dissociação celular (Invitrogen, Burlington, ON) foi então usado para expulsar as células de suas lâminas de cultura celular a 37°C. Depois de centrifugação e coleta, as células foram ressuspendidas em DPBS contendo MgCI2, CaCI2 e 2 por 30 cento de soro fetal bovino a 4°C (meio de coloração) e contadas, divididas em alíquotas para a densidade celular apropriada, centrifugadas para peleti- zar as células e ressuspendidas em meio de coloração a 4°C na presença do anticorpo de teste (AR51 A165.2) ou anticorpos controle (isótipo controle, antiEGFR). O isótipo controle e o anticorpo de teste foram avaliados a 20 microgramas/ ml_ ao passo que o antiEGFR foi avaliado a 5 microgramas/ mL sobre gelo por 30 minutos. Antes da adição de anticorpo secundário con- 5 jugado a Alexa Fluor 546 as células foram lavadas uma vez com meio de coloração. O anticorpo conjugado a Alexa Fluor 546 em meio de coloração foi em seguida adicionado por 30 minutos a 4°C. As células foram em segui- da lavadas pelo tempo final e ressuspendidas em meio de fixação (meio de coloração contendo 1,5 por cento de paraformaldeído). A aquisição citomé- 10 trica de fluxo das células foi avaliada passando as amostras sobre um FAC- Sarray™ usando o programa FACSarray™ System Software (BD Bioscien- ces, Oakville, ON). A dispersão para diante (FSC) e lateral (SSC) das células foram ajustadas ajustando a voltagem e os ganhos de amplitude nos detec- tores de FSC e SSC. Os detectores para o canal de fluorescência (Alexa- 15 546) foram ajustados passando células não coradas de tal modo que as cé- lulas tinham um pico uniforme com uma intensidade fluorescente média de aproximadamente 1 a 5 unidades. Para cada amostra, aproximadamente 10.000 eventos gated (células fixas coradas) foram adquiridos para análise e os resultados são apresentados na figura 2.
A figura 2 apresenta o aumento múltiplo da intensidade de fluo-
rescência média acima do isótipo controle. Histogramas representativos de anticorpos AR51 A165.2 foram compilados para a figura 3. AR5 IA 165.2 demonstrou ligação a muitas das linhagens celulares testadas. Houve liga- ção muito forte à linhagem de células de câncer de cólon DLD-I (168,6 ve- 25 zes) e ligação forte à linhagem de células de câncer de ovário ES-2 (30,9 vezes), C-13 (18,0 vezes) e OV2008 (22,6 vezes). Não houve qualquer liga- ção detectável à linhagem de células de câncer de mama MDA-MB-231. Houve ligação moderada ao resto das linhagens celulares. Estes dados de- monstram que AR51A165.2 ligou a várias linhagens celulares diferentes com 30 maior expressão antigênoica sobre determinadas linhagens de células de câncer de cólon e de ovário.
EXEMPLO 3 Experimentos Tumorais In vivo com Células BxPC-3
Os Exemplos 1 e 2 demonstraram que AR51A165.2 teve propri- edades anticancerígenas contra uma linhagem de células cancerígenas hu- manas com ligação detectável através de várias indicações de câncer dife- rentes. Com referência às figuras 4 e 5, camundongos SCID fêmeas de 4 a 6 semanas de idade foram implantados com 5 milhões de células de câncer pancreático humano (BxPC-3) em 100 microlitros de salina injetada por via subcutânea na nuca do pescoço. Os camundongos foram divididos aleatori- amente em 2 grupos de tratamento de 5. No dia seguinte à implantação, 20 mg/kg de anticorpo de teste AR51A165.2 ou tampão controle foi administra- do por via intraperitoneal a cada coorte em um volume de 300 microlitros depois de diluição da concentração de estoque com um diluente que conti- nha 2,7 mM de KCI1 1 mM de KH2PO4, 137 mM de NaCI e 20 mM de Na2HPO4. As amostras de anticorpo e controle foram em seguida adminis- tradas uma vez por semana pela duração do estudo do mesmo modo. O crescimento do tumor foi medido em torno de a cada sétimo dia com calibra- dores. O estudo foi completado depois de 8 injeções de anticorpo. Os pesos corporais dos animais foram registrados uma vez por semana pela duração do estudo. Ao final do estudo todos os animais foram eutanizados de acordo com as diretrizes do CCAC.
AR51A165.2 reduziu o crescimento do tumor no modelo profiláti- co in vivo BxPC-3 de câncer pancreático humano. O tratamento com anti- corpo ARIUS AR51 A 165.2 reduziu o crescimento de tumores BxPC-3 por 65 por cento (p = 0,035), comparado à o grupo tratado com tampão, confor- 25 me determinado no dia 52, 2 dias depois da última dose de anticorpo (figura 1). Ao final do estudo (Dia 61), o tratamento com AR51A165.2 resultou em uma inibição do crescimento tumoral de 66 por cento (p = 0,0375; figura 4). Estes resultados in vivo, em combinação com os resultados apresentados no Exemplo 2, demonstram que AR51A165.2 é capaz de ligar à linhagem celu- 30 Iar BxPC- 3, bem como induzir citotoxicidade em um modelo xenoenxerto de câncer pancreático.
Não houve sinais clínicos de toxicidade do início ao fim do estu- do. O peso corporal medido em intervalos semanais foi um substituto para o bem-estar e deficiência de crescimento. O peso corporal médio aumentou em todos os grupos durante a duração do estudo (figura 5). O ganho de pe- so médio entre o dia 1 e o dia 61 foi de 3,6 g no grupo controle e de 3,2 g no 5 grupo tratado com AR51A165.2. Não houve diferenças significativas entre os grupos ao final do período de tratamento.
Em resumo, AR51A165.2 foi bem tolerado e reduziu a carga tu- moral neste modelo de xenoenxerto de câncer pancreático humano. EXEMPLO 4
Experimentos Tumorais In vivo com Células MDA-MB-231
Os resultados do Exemplo 3 foram estendidos a um modelo dife- rente de câncer humano. Com referência às figuras 6 e 7, camundongos SCID fêmeas de 4 a 6 semanas de idade foram implantados com 5 milhões de células de câncer de mama humano (MDA-MB-231) em 100 microlitros 15 de salina injetada por via subcutânea na nuca do pescoço. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em 2 grupos de tratamento de 5. No dia se- guinte à implantação, 20 mg/kg de anticorpo de teste AR51A165.2 ou tam- pão controle foi administrado por via intraperitoneal a cada coorte em um volume de 300 microlitros depois de diluição da concentração do estoque 20 com um diluente que continha 2,17 mM de KCI, 1 mM de KH2PO4, 137 mM de NaCI e 20 mM de Na2HPO4. As amostras de anticorpo e controle foram em seguida administradas uma vez por semana pela duração do estudo do mesmo modo. O crescimento do tumor foi medido em torno de a cada séti- mo dia com calibradores. O estudo foi completado depois de 8 injeções de 25 anticorpo. Os pesos corporais dos animais foram registrados uma vez por semana pela duração do estudo. Ao final do estudo todos os animais foram eutanizados de acordo com as diretrizes do CCAC.
AR51A165.2 reduziu o crescimento do tumor no modelo profilático in vivo MDA-MB-231 de câncer de mama humano. Os resultados para o estudo de inibição do crescimento do tumor são mostrados na figura 6. No dia 56, a primeira medição depois do último tratamento no dia 50, AR51A165.2 redu- ziu o crescimento do tumor por 67 por cento (p = 0,18) neste modelo de cân- cer de mama humano. Este resultado não obteve significância, provavelmen- te devido ao número limitado de animais em cada grupo neste estudo. A par- tir do Exemplo 2, é evidente que a ligação de AR51A165.2 à linhagem celu- lar MDA-MB-231 não é detectável usando FACS. Não obstante, o anticorpo 5 foi capaz de reduzir o crescimento do tumor em um modelo de xenoenxerto MDA-MB-231. A eficácia pode ser devido a qualquer um de 2 fatores. É pos- sível que a linhagem celular MDA-MB-231 expresse o alvo antigênico em um niível abaixo do limiar de detecção por FACS sob estas condições, mas que o baixo nível de expressão seja suficiente para disparar um evento levando a 10 crescimento tumoral retardado. Também é possível que a expressão do an- tígeno seja induzida quando as células MDA-MB-231 são colocadas no am- biente in vivo mais fisiológico. Em qualquer caso, a eficácia deste anticorpo em um modelo de câncer de cólon MDA-MB-231 é um achado não-óbvio que pode não ter sido previsto com base na ligação.
Não houve sinais clínicos de toxicidade do início ao fim do estu-
do. O peso corporal medido em intervalos semanais foi um substituto para o bem-estar e deficiência de crescimento. Houve um aumento significativo no peso corporal para ambos os grupos durante o curso do estudo (figura 7). Ao fim do período de tratamento, não houve diferenças significativas nos pesos corporais entre os gurpos controle e tratado com anticorpo.
Em resumo, AR51A165.2 foi bem tolerado e reduziu a carga tu- moral neste modelo de xenoenxerto de câncer de mama humano.
EXEMPLO 5
Isolamento de Ligantes Competitivos Dado um anticorpo, um indivíduo ordinariamente versado na
técnica pode gerar um CDMAB inibidor competitivamente, por exemplo, um anticorpo de competição, o qual é um anticorpo que reconhece o mesmo epitopo (Belanger L et al. Clinica Chimica Acta 48:15-18 (1973)). Um método acarreta imunização com um imunogênio que expressa o antígeno reconhe- 30 cido pelo anticorpo. A amostra pode incluir mas não está limitada a tecidos, uma ou mais proteínas isoladas ou uma ou mais linhagens celulares. Hibri- domas resultantes podem ser triados usando uma prova de competição, a qual é uma prova que identifica anticorpos que inibem a ligação do anticorpo de teste, tal como ELISA, FACS ou Western blotting. Outro método pode fazer uso de bibliotecas de anticorpos de display de fago e varredura para anticorpos que reconhecem no mínimo um epitopo do referido antígeno (Ru- 5 binstein JL et al. Anal Biochem 314: 294-300 (2003)). Em qualquer caso, anticorpos são selecionados com base em sua capacidade para deslocar a ligação do anticorpo etiquetado original para no mínimo um epitopo de seu antígeno-alvo. Os anticorpos referidos portanto possuiriam a característica de reconhecedr no mínimo um epitopo do antígeno como o anticorpo origi- 10 nal.
EXEMPLO 6
Clonagem das Regiões Variáveis do Anticorpo Monoclonal AR51A165.2
Podem ser determinadas as seqüências das regiões variáveis das cadeias pesadas (V.H) e leve (V.L) de anticorpo monoclonal produzido pela linhagem de células de hibridoma AR51A165.2. RNA codificando as cadeias pesada e leve de imunoglobulina pode ser extraído do hibridoma em questão usando métodos de rotina envolvendo solubilização celular com iso- tiocianato de guanidínio (Chirgwin et al Biochem. 18:5294-5299 (1979)). O mRNA pode ser usado para preparar cDNA para subsequente isolamento dos genes V.H e V.L por metodologia de PCR conhecida na técnica (Sam- brook et al., eds., Molecular Cloning, Chapter 14, Cold Spring Harbor Iabora- tories Press, N. Y. (1989)). A seqüência de aminoácido de N-terminal das cadeias pesada e leve pode ser determinada de modo independente por se- quenciamento de Edman automatizado. Trechos adicionais das CDRs e FRs flanqueantes também podem ser determinados por sequenciamento de ami- noácidos dos fragmentos V.H e V.L. Primers sintéticos podem ser então de- signados para isolamento dos genes V.H e V.L de anticorpo monoclonal AR51A165.2, e o gene isolado pode ser ligado em um vetor apropriado para sequenciamento. Para produzir IgG quimérica e humanizada, os domínios variáveis leves e domínios variáveis pesados podem ser subclonados em um vetor apropriado para expressão.
(i) Anticorpo Monoclonal DNA codificando o anticorpo monoclonal (conforme reivindicado no Exemplo 1) é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesada e 5 leve dos anticorpos monoclonais). A célula de hibridoma serve como uma fonte preferencial de similar DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser coloca- do em vetores de expressão, os quais são então transfectados em células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster Chinês (CHO), ou células de mieloma que não produzem 10 de modo diverso proteína imunoglobulin, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a seqüência codificante por domí- nios constantes de cadeias pesada e leve humanas ao invés das seqüências murinas homólogas. Anticorpos quiméricos ou híbridos também podem ser 15 preparados in vitro usando métodos conhecidos em química de proteína sin- tética, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação de permuta de dis- sulfeto ou formando uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.
(ii) Anticorpo Humanizado
Um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos aminoáci- dos introduzidos neste de uma fonte não-humana. Estes resíduos aminoáci- dos não-humanos são frequentemente referidos como resíduos de "importa- ção", os quais são tipicamente selecionados entre um domínio variável de 25 "importação". Humanização pode ser realizada pelo método de Winter e co- laboradores substituindo seqüências CDR ou CDRs de roedor pelas se- qüências correspondentes de um anticorpo humano (Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-327 (1988); Verhoe- yen et al, Science 239:1534-1536 (1988); revisado em Clark, lmmunol. To- 30 day 21:397-402 (2000)).
Um anticorpo humanizado pode ser preparado por um processo de análise das seqüências parentais e vários produtos humanizados concei- tuais usando modelos tridimensionais das seqüências parentais e humani- zadas. Modelos de imunoglobulinas tridimensionais estão disponíveis co- mumente e são familiares para os versados na técnica. Estão disponíveis programas de computação os quais ilustram e apresentam estruturas con- 5 formacionais tridimensionais prováveis de seqüências de imunoglobulina candidatas selecionadas. Inspeção destes displays permite análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para ligar seu antígeno. Deste modo, resíduos FR 10 podem ser selecionados e combinados entre a seqüência de consenso e de importação de modo que é obtida a característica do anticorpo desejada, tal como aumentada afinidade para o um ou mais antígenos alvo. Em geral, os resíduos CDR são diretamente e o mais substancialmente envolvidos em influenciar a ligação de antígeno.
(iii) Fragmentos de Anticorpos
Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de frag- mentos de anticorpos. Estes fragmentos podem ser produzidos por células hospedeiras recombinantes (revisado em Hudson, Curr. Opin. Immunol 11:548-557 (1999); Little et al, Immunol. Today 21:364- 370 (2000)). Por e- 20 xemplo, fragmentos Fab1-SH podem ser diretamente recuperados a partir de E. coli e ligados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Biotechnology 10:163-167 (1992)). Em outra modalidade, o F(ab')2 é forma- do usando o zíper de Ieucina GCN4 para promover montagem da molécula F(ab’)2. De acordo com outra abordagem, fragmentos Fv, Fab ou 25 F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir de cultura de células hospe- deiras recombinantes.
EXEMPLO 7
Uma Composição Compreendendo o Anticorpo da Presente Invenção
O anticorpo da presente invenção pode ser usado como uma composição para prevenir/tratar câncer. A composição para prevenir/tratar câncer, a qual compreende o anticorpo da presente invenção, é não tóxica e pode ser administrada como estão sob a forma de preparações líquidas, ou como composições farmacêuticas de preparações adequadas a humanos ou mamíferos (por exemplo, ratos, coelhos, carneiro, suíno, bovino, felino, cani- no, símio, e etc.) por via oral ou por via parenteral (por exemplo, por via in- travascular, por via intraperitoneal, por via subcutânea, e etc.). O anticorpo 5 da presente invenção pode ser administrado sozinho, ou pode ser adminis- trado como uma composição apropriada. A composição usada para a admi- nistração pode conter um veículo farmacologicamente aceitável com o anti- corpo da presente invenção ou seu sal, um diluente ou excipiente. Uma composição similar é proporcionada sob a forma de preparações farmacêuti- 10 cas adequadas para administração oral ou parenteral.
Exemplos da composição para administração parenteral são preparações injetáveis, supositórios, e etc. As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagens tais como injeções intravenosas, subcutâneas, intracutâneas e intramusculares, infusões para gotejamento, injeções intra- 15 articulares, e etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas por meio de métodos conhecidos publicamente. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas dissolvendo, suspendendo ou emulsifican- do o anticorpo da presente invenção ou seu sal em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso usado convencionalmente para injeções. Como o meio 20 aquoso para injeções, há, por exemplo, salina fisiológica, uma solução isotô- nica contendo glucose e outros agentes auxiliares, e etc., as quais podem ser usadas em combinação com um agente solubilizante apropriado tal co- mo um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propileno glicol, polietileno glicol), um tensoativo não iônico [por exemplo, polissorbato 25 80, HCO- 50 (aduto de polioxietileno (50 mois) de óleo de rícino hidrogena- do)], e etc. Como o meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de gergelim, óleo de soja, e etc., os quais podem ser usados em combinação com um agente solubilizante tal como benzoato de benzila, álcool benzílico, e etc. A injeção preparada deste modo é geralmente preenchida em uma 30 ampola apropriada. O supositório usado para administração retal pode ser preparado combinando o anticorpo da presente invenção ou seu sal com bases convencionais para supositórios. A composição para administração oral inclui preparações sólidas ou líquidas, especificamente, comprimidos (incluindo drágeas e comprimidos revestidos com película), pílulas, grânulos, preparações em pó, cápsulas (incluindo cápsulas mois), xarope, emulsões, suspensões, e etc. Uma composição similar é fabricado por meio de méto- 5 dos publicamente conhecidos e pode conter um veículo, um diluente ou ex- cipiente convencionalmente usado no campo de preparações farmacêuticas. Exemplos do veículo ou excipiente para comprimidos são lactose, amido, sacarose, estearato de magnésio, e etc.
Vantajosamente, as composições para uso oral ou parenteral 10 descritas acima são preparadas em preparações farmacêuticas com uma unidade de dose conveniente para se adequar a uma dose dos ingredientes ativos. As preparações de unidade de dose referidas incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, e etc. A quantidade do composto supracitado contido é geralmente de 5 a 500 mg 15 por forma de unidade de dosagem; é preferencial que o anticorpo descrito acima seja contido em cerca de 5 a cerca de 100 mg especialmente sob a forma de injeção, e em 10 a 250 mg para as outras formas.
A dose do agente profilático/terapêutico ou regulador supracita- do compreendendo o anticorpo da presente invenção pode variar dependen- do do sujeito a ser administrado, da doença alvo, condições, via de adminis- tração, e etc. Por exemplo, quando usada para os fins de tratar/prevenir, por exemplo, câncer de mama em um adulto, é vantajoso administrar o anticorpo da presente invenção por via intravenosa em uma dose de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg de peso corporal, preferencialmente cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg de peso corporal e mais preferencialmente cerca de 0,1 a cerca de 5 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 a 5 vezes/ dia, preferencialmente cerca de 1 a 3 vezes/ dia. Em outra administração parenteral e oral, o agente pode ser administrado em uma dose correspondente à dose administrada acima. Quando a condição é especialmente grave, a dose pode ser aumen- tada de acordo com a condição.
O anticorpo da presente invenção pode ser administrado no es- tado em que se encontra ou sob a forma de uma composição apropriada. A composição usada para a administração pode conter um veiculo farmacolo- gicamente aceitável com o anticorpo supracitado ou seus sais, um diIuente ou excipiente. Uma composição similar é proporcionada sob a forma de pre- parações farmacêuticas adequadas para administração oral ou parenteral (por exemplo, injeção intravascular, injeção subcutânea, e etc.). Cada com- posição descrita acima pode conter adicionalmente outros ingredientes ati- vos. Além disso, o anticorpo da presente invenção pode ser usado em com- binação com outros fármacos, por exemplo, agentes alquilantes (por exem- plo, ciclofosfamida, ifosfamida, e etc.), antagonistas metabólicos (por exem- pio, metotrexato, 5-fluorouracila, e etc.), antibióticos antitumorais (por exem- plo, mitomicina, adriamicina, e etc.), agentes antitumorais derivados de plan- tas (por exemplo, vincristina, vindesina, Taxol, e etc.), cisplatina, carboplati- na, etoposídeo, irinotecan, e etc. O anticorpo da presente invenção e os fár- macos descritos acima podem ser administrados ao paciente simultanea- mente ou em momentos alternados.
A preponderância de evidência mostra que AR51A165.2 media efeitos anticancerígenos através de ligação de um epitopo presente sobre linhagens de células cancerígenas. Adicionalmente pode ser mostrado que o anticorpo AR5IA165.2 pode ser usado na detecção de células as quais ex- 20 pressam o epitopo o qual especificamente liga às mesmas; utilizando técni- cas ilustradas por, mas não limitadas a FACS, ELISA celular ou IHC.
Todas as patentes e publicações mencionadas nesta especifica- ção são indicativas dos níveis daqueles versados na técnica, à qual diz res- peito a invenção. Todas as patentes e publicações são aqui, a este requeri- 25 mento de Patente, incorporadas por meio de referência na mesma extensão como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por meio de referência.
Deve ser entendido que apesar de ser ilustrada uma forma de- terminada da invenção, não deve ser limitada à forma específica ou disposí- ção de partes descrita e mostrada aqui, neste requerimento de Patente. Será evidente para os versados na técnica que podem ser feitas várias alterações sem se afastar do âmbito da invenção e a invenção não deve ser considera- da limitada ao que é mostrado e descrito na especificação.
Uma pessoa versada na técnica reconhecerá prontamente que a presente invenção é bem adaptada para realizar os objetivos e obter as fina- lidades e vantagens mencionadas, bem como as inerentes na mesma.
5 Quaisquer oligonucleotídeos, peptídeos, polipeptídeos, compostos biologi- camente relacionados, métodos, procedimentos e técnicas descritos aqui, neste requerimento de Patente, são presentemente típicos das modalidades preferenciais, são pretendidos para serem exemplares e não são pretendi- dos como limitações do âmbito. Alterações nas mesmas e outros usos ocor- 10 rerão aos versados na técnica os quais são englobados dentro do espírito da invenção e são definidos pelo âmbito das reivindicações anexadas. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades preferenciais específicas, deve ser entendido que a invenção conforme reivindicado não deve ser indevidamente limitada a similares modalidades específicas. Na 15 verdade, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção as quais são óbvias para os versados na técnica são pretendidas para esta- rem dentro do âmbito das seguintes reivindicações.

Claims (47)

1. Anticorpo monoclonal isolado, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com o número de a- cesso 180706-02.
2. Anticorpo humanizado contendo o anticorpo monoclonal iso- lado, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com o número de acesso 180706-02, ou um fragmento de ligação de antígeno produzido a partir do referido anticorpo humanizado.
3. Anticorpo quimérico do anticorpo monoclonal isolado, caracte- rizado pelo fato de que é produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com o número de acesso 180706-02. ou um fragmento de ligação de antíge- no produzido a partir do referido anticorpo quimérico.
4. Linhagem de células de hibridoma isolada, caracterizada pelo fato de que é depositada junto ao IDAC com o número de acesso 180706- 02.
5. Método para iniciar citotoxicidade induzida por anticorpos de células cancerosas em uma amostra de tecido selecionada entre um tumor humano, caracterizado pelo fato de que compreende: proporcionar uma amostra de tecido do referido tumor humano; proporcionar o anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hi- bridoma depositado junto ao IDAC com o número de acesso 180706-02, o anticorpo humanizado do anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibri- doma depositado junto ao IDAC com o número de acesso 180706-02, o anti- corpo quimérico do anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com o número de acesso 180706-02 ou um CD- MAB do mesmo, cujo CDMAB é definido por uma capacidade de inibir com- petitivamente ligação do referido anticorpo monoclonal isolado a seu antíge- no-alvo; e contactar o referido anticorpo monoclonal isolado, o referido an- ticorpo humanizado, o referido anticorpo quimérico ou CDMAB do mesmo com a referida amostra de tecido; em que ligação do referido anticorpo monoclonal isolado, o refe- rido anticorpo humanizado, o referido anticorpo quimérico ou CDMAB do mesmo com a referida amostra de tecido induz citotoxicidade.
6. CDMAB do anticorpo monoclonal isolado, caracterizado pelo fato de que é como definido na reivindicação 1.
7. CDMAB do anticorpo humanizado, caracterizado pelo fato de que é como definido na reivindicação 2.
8. CDMAB do anticorpo quimérico, caracterizado pelo fato de que é como definido na reivindicação 3.
9. Anticorpo isolado ou CDMAB do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 6, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que é conjugado com um membro selecionado entre o grupo consistindo em porções citotóxicas, enzimas, compostos radioativos, e células hematóge- nas.
10. Uso de um anticorpo monoclonal ou do CDMAB do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma compopsição para tratar um tumor humano suscetível a citotoxicidade induzida por anti- corpos em um mamífero, em que o referido tumor humano expressa no mí- nimo um epitopo de um antígeno, o qual especificamente liga ao anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com o número de acesso 180706-02, ou um CDMAB do mesmo, cujo CDMAB é definido por uma capacidade de inibir competitivamente ligação do referido anticorpo monoclonal isolado a seu antígeno-alvo, resultando em uma redu- ção da carga tumoral do referido mamífero.
11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é conjugado a uma por- ção citotóxica.
12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a referida porção citotóxica é um isótopo radioativo.
13. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado ou CDMAB do mesmo ativa o complemento.
14. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado ou CDMAB do mesmo media citotoxicidade celular dependente de anticorpo.
15. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é humanizado.
16. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é quimerizado.
17. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que é ca- paz de ligação específica ao mesmo epitopo ou epitopos que o anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com o número de acesso 180706-02.
18. Uso de um anticorpo monoclonal ou do CDMAB do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para tratar um tumor humano em um mamífero, em que o referido tumor humano expressa no mínimo um epitopo de um antígeno o qual especificamente liga ao anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com o número de acesso 180706-02, ou um CDMAB do mesmo, cujo CDMAB é definido por uma capacidade de inibir competitivamente liga- ção do referido anticorpo monoclonal isolado a seu antígeno-alvo, resultando em uma redução da carga tumoral do referido mamífero.
19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é conjugado a uma por- ção citotóxica.
20. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a referida porção citotóxica é um isótopo radioativo.
21. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado ou CDMAB do mesmo ativa o complemento.
22. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado ou CDMAB do mesmo media citotoxicidade celular dependente de anticorpo.
23. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é humanizado.
24. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é quimerizado.
25. Uso de um anticorpo monoclonal ou CDMAB do mesmo em combinação com no mínimo um agente quimioterápico, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para tratar um tumor humano em um mamífero, em que o referido tumor humano expressa no mínimo um epitopo de um antígeno o qual especificamente liga ao anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com o número de acesso 180706-02, ou um CDMAB do mesmo, cujo CDMAB é definido por uma capacidade de inibir competitivamente ligação do referido anticorpo monoclonal isolado a seu antígeno-alvo, resultando em uma redu- ção da carga tumoral do referido mamífero.
26. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é conjugado a uma por- ção citotóxica.
27. Uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a referida porção citotóxica é um isótopo radioativo.
28. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado ou CDMAB do mesmo ativa o complemento.
29. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado ou CDMAB do mesmo media citotoxicidade celular dependente de anticorpo.
30. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é humanizado.
31. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é quimerizado.
32. Ensaio de ligação para determinar a presença de células cancerosas em uma amostra de tecido selecionada entre um tumor humano, a qual é especificamente ligada pelo anticorpo monoclonal isolado produzido pela linhagem de células de hibridoma AR51A165.2 tendo N0 de Acesso I- DAC 180706-02, o anticorpo humanizado do anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com o número de aces- so 180706-02, ou o anticorpo quimérico do anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com o número de aces- so 180706-02, caracterizado pelo fato de que compreende: proporcionar uma amostra de tecido do referido tumor humano; proporcionar no mínimo um do referido anticorpo monoclonal isolado, o referido anticorpo humanizado, o referido anticorpo quimérico ou CDMAB do mesmo que reconhece o mesmo epitopo ou epitopos como a- queles reconhecidos pelo anticorpo monoclonal isolado produzido por uma linhagem de células de hibridoma AR51A165.2 tendo N0 de Acesso IDAC 180706-02; contactar no mínimo um dos anticorpos proporcionados referidos ou CDMAB do mesmo com a referida amostra de tecido; e determinar ligação do referido no mínimo um anticorpo propor- cionado ou CDMAB do mesmo com a referida amostra de tecido; pela qual é indicada a presença das referidas células cancero- sas na referida amostra de tecido.
33. Uso de anticorpos monoclonais ou de CDMAB dos mesmos, caracterizado pelo fato de que é para a redução da carga tumoral humana, em que o referido tumor humano expressa no mínimo um epitopo de um an- tígeno o qual especificamente liga ao anticorpo monoclonal isolado produzi- do pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com o número de acesso 180706-02, ou um CDMAB do mesmo, cujo CDMAB é definido por uma ca- pacidade de inibir competitivamente ligação do referido anticorpo monoclonal isolado a seu antígeno-alvo, resultando em uma redução da carga tumoral humana do referido mamífero.
34. Uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é conjugado a uma por- ção citotóxica.
35. Uso de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a referida porção citotóxica é um isótopo radioativo.
36. Uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado ou CDMAB do mesmo ativa o complemento.
37. Uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado ou CDMAB do mesmo media citotoxicidade celular dependente de anticorpo.
38. Uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é humanizado.
39. Uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é quimerizado.
40. Uso de anticorpos monoclonais ou de CDMAB dos mesmos em combinação com no mínimo um agente quimioterápico, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para a redução da carga tumoral humana, em que o referido tumor humano expressa no míni- mo um epitopo de um antígeno o qual especificamente liga ao anticorpo mo- noclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com o número de acesso 180706-02, ou um CDMAB do mesmo, cujo CDMAB é definido por uma capacidade de inibir competitivamente ligação do referido anticorpo monoclonal isolado a seu antígeno-alvo, resultando em uma redu- ção da carga tumoral humana do referido mamífero.
41. Uso de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é conjugado a uma por- ção citotóxica.
42. Uso de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a referida porção citotóxica é um isótopo radioativo.
43. Uso de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado ou CDMAB do mesmo ativa o complemento.
44. Uso de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado ou CDMAB do mesmo media citotoxicidade celular dependente de anticorpo.
45. Uso de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é humanizado.
46. Uso de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado é quimerizado.
47. Composição eficaz para tratar um tumor canceroso humano, caracterizada pelo fato de que compreende, em combinação: um anticorpo ou CDMAB de qualquer uma das reivindicações 1,2,3,6,7,8, ou 17; um conjugado do referido anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo com um membro selecionado entre o grupo consis- tindo em porções citotóxicas, enzimas, compostos radioativos, e células he- matógenas; e uma quantidade requerida de um veículo farmaceuticamente aceitável; em que a referida composição é eficaz para tratar o referido tu- mor canceroso humano.
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