JPS6015559A - アポリポ蛋白−ｂの酵素免疫測定試薬 - Google Patents
アポリポ蛋白−ｂの酵素免疫測定試薬Info
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- JPS6015559A JPS6015559A JP58123973A JP12397383A JPS6015559A JP S6015559 A JPS6015559 A JP S6015559A JP 58123973 A JP58123973 A JP 58123973A JP 12397383 A JP12397383 A JP 12397383A JP S6015559 A JPS6015559 A JP S6015559A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
素免疫測定法によシ定量するための試薬に関するもので
ある。
ある。
動脈硬化症の成因には高脂血症が大きな役割を果してい
る。特にＬＤＬ （低比重リポ蛋白）分画の増加或いは
ＨＤＬ （高比重リポ蛋白）の低下は、動脈硬化促進因
子として重要な指標とされている。後者についてはすて
にＨＤＬ−コレステロールの測定として一般化している
が、動脈硬化の指標として最も重要なＬＤＬ−コレステ
ロール或いはアポリボ蛋白−Ｂの測定には長時間の超遠
心分離が必要であシ、一般検査としては用いられていな
い。
る。特にＬＤＬ （低比重リポ蛋白）分画の増加或いは
ＨＤＬ （高比重リポ蛋白）の低下は、動脈硬化促進因
子として重要な指標とされている。後者についてはすて
にＨＤＬ−コレステロールの測定として一般化している
が、動脈硬化の指標として最も重要なＬＤＬ−コレステ
ロール或いはアポリボ蛋白−Ｂの測定には長時間の超遠
心分離が必要であシ、一般検査としては用いられていな
い。
ボ蛋白一Ｂを正確にかつ多検体処理可能な方法によシ測
定し、ＬＤＬの増減の指標とすることを目的とした。
定し、ＬＤＬの増減の指標とすることを目的とした。
アポリボ蛋白一ＢｌｄＬＤＬ以外に：ＶＬＤＬ （超低
比重リポ蛋白）にも一部含まれているが、ＬＤＬの約１
／２０以１下でアシ、主としてＬＤＬを反映する。又近
年ＶＬＤＬ特にβ−ＶＬＤＬにも動脈硬化促進作用の存
在が知られ，ＬＤＬ，ＶＬＤＬを含めたアポリボ蛋白−
Ｂの測定は臨床上有用である。
比重リポ蛋白）にも一部含まれているが、ＬＤＬの約１
／２０以１下でアシ、主としてＬＤＬを反映する。又近
年ＶＬＤＬ特にβ−ＶＬＤＬにも動脈硬化促進作用の存
在が知られ，ＬＤＬ，ＶＬＤＬを含めたアポリボ蛋白−
Ｂの測定は臨床上有用である。
一方すボ蛋白Ｂ欠損或いは低下症や肝疾患、腸脂肪の吸
収障害などの血中ＬＤＬ又はＶＬＤＬの低下を伴う疾患
の診断、経過観察にも高感度測定法は必要である。
収障害などの血中ＬＤＬ又はＶＬＤＬの低下を伴う疾患
の診断、経過観察にも高感度測定法は必要である。
ところで血清中のアポリボ蛋白−Ｂの測定法として、免
疫拡散法・（ＳＲＩＤ法゛）やロケット免疫電気泳動法
が一部の施設で用いられている。
疫拡散法・（ＳＲＩＤ法゛）やロケット免疫電気泳動法
が一部の施設で用いられている。
しかしながら免疫拡散法は、感度が低く（３０〜２００
１ｑＡｉｔ ） ％ 目視下で測定するため測定者によ
るバラつきが大きいので、多検体処理には不適当であり
、ロケット免疫電気泳動法は、電気泳動を必要とするの
で手技が煩維である。
１ｑＡｉｔ ） ％ 目視下で測定するため測定者によ
るバラつきが大きいので、多検体処理には不適当であり
、ロケット免疫電気泳動法は、電気泳動を必要とするの
で手技が煩維である。
他の方法としては放射性免疫測定法（ＲＩＡ法）が考え
られるが、現在実用化されておらず、しかも放射性同位
元素（１１２Ｂ）を用いるため、被曝・蓄積のおそれが
あること、取扱いに一定の資格を要すること、高価な施
設・設備を要すること、半減期が短かいので使用期限も
短かくなること、環境汚染のおそれがあること、廃棄が
制約されることなどの問題点があり、一般臨床検査部で
の測定は困難である。
られるが、現在実用化されておらず、しかも放射性同位
元素（１１２Ｂ）を用いるため、被曝・蓄積のおそれが
あること、取扱いに一定の資格を要すること、高価な施
設・設備を要すること、半減期が短かいので使用期限も
短かくなること、環境汚染のおそれがあること、廃棄が
制約されることなどの問題点があり、一般臨床検査部で
の測定は困難である。
このような放射性物質を使用しない方法としては酵素免
疫測定法があるが、精度、感度、操作の容易性、簡便さ
などの実用上の要求を満足する方法は未だ報告されてい
ない。
疫測定法があるが、精度、感度、操作の容易性、簡便さ
などの実用上の要求を満足する方法は未だ報告されてい
ない。
本発明は、ヒト の血清中
のアポリポ蛋白−Ｂの濃度を酵素免疫測定法によシ測定
する実用的に有利な試薬を提供すること抗体としてのペ
ルオキシダーゼ標識付加Ｆａゼ （２） 抗体ＩｇＧ結合ポリスチレンボール （３）発色又は螢
光試薬 （４） 反応基質としての過酸化水素 （５） 反応停止剤 （６） 緩衝液 （７） よシなるものである。
する実用的に有利な試薬を提供すること抗体としてのペ
ルオキシダーゼ標識付加Ｆａゼ （２） 抗体ＩｇＧ結合ポリスチレンボール （３）発色又は螢
光試薬 （４） 反応基質としての過酸化水素 （５） 反応停止剤 （６） 緩衝液 （７） よシなるものである。
これらの試薬をキットとして準備しておけば、次のよう
な操作及び機構によシアポリボ蛋白−Ｂの濃度が測定で
きる。即ち、まず標準溶液又は検体希釈液と緩衝液との
混合液中にＩｇＧ結合ボ１） 、Ｘ ｆレンボールを投
入して、ポリスチレンボール上のＩｇＧに標準溶液又は
検体希釈液中に含まれるアポリポ蛋白−Ｂを抗原抗体・
反応により結合させる。次にこれをペルオキシダーゼ標
識付加ｐａ’Ｗを溶解した緩衝液中に投入すると、抗原
抗体反応によシ、すでにボールに結合したアポリポ蛋白
−Ｂにさらにペルオキシダーゼ標識付加ｐａｄＯＦａセ
側が結合する。即ちポリスチレンボール上のＩｇＧにア
ポリポ蛋白−Ｂが結合し、さらにそのアポリポ蛋白−Ｂ
にペルオキシダーゼ標識付加ｖａｔｆが結合したものが
得られる。この反応後のポリスチレンボールを発色又は
螢光試薬の溶液中に投入し、酵素反応基質としての過酸
化水素を加えれば、ペルオキシダーゼが発色又は螢光試
薬に作用して発色体又は螢光体が生ずるので、適当時間
後に反応停止剤を加えて、その生成物の濃度を吸光度又
は螢光度の測定によ請求め、予め標準物質を用いてめて
おいた検量線と対比すれば、直ちにアポリポ蛋白−Ｂの
濃度を正確に知ることができる。
な操作及び機構によシアポリボ蛋白−Ｂの濃度が測定で
きる。即ち、まず標準溶液又は検体希釈液と緩衝液との
混合液中にＩｇＧ結合ボ１） 、Ｘ ｆレンボールを投
入して、ポリスチレンボール上のＩｇＧに標準溶液又は
検体希釈液中に含まれるアポリポ蛋白−Ｂを抗原抗体・
反応により結合させる。次にこれをペルオキシダーゼ標
識付加ｐａ’Ｗを溶解した緩衝液中に投入すると、抗原
抗体反応によシ、すでにボールに結合したアポリポ蛋白
−Ｂにさらにペルオキシダーゼ標識付加ｐａｄＯＦａセ
側が結合する。即ちポリスチレンボール上のＩｇＧにア
ポリポ蛋白−Ｂが結合し、さらにそのアポリポ蛋白−Ｂ
にペルオキシダーゼ標識付加ｖａｔｆが結合したものが
得られる。この反応後のポリスチレンボールを発色又は
螢光試薬の溶液中に投入し、酵素反応基質としての過酸
化水素を加えれば、ペルオキシダーゼが発色又は螢光試
薬に作用して発色体又は螢光体が生ずるので、適当時間
後に反応停止剤を加えて、その生成物の濃度を吸光度又
は螢光度の測定によ請求め、予め標準物質を用いてめて
おいた検量線と対比すれば、直ちにアポリポ蛋白−Ｂの
濃度を正確に知ることができる。
以下本発明の試薬を構成する各成分及びその役割を詳述
する。
する。
本発明においてキットを構成する試薬の一つとして、ま
）ケボリボ蛋白−Ｂ（１）が用いられる。
）ケボリボ蛋白−Ｂ（１）が用いられる。
アポリポ蛋白−Ｂは、ヒト血清を遠心分離してＬＤＬ（
低比重リボ蛋白）層を分取し、透析、力２ムクロマト分
画等の手段によシ精製することによシ取得される。一般
にＬＤＬは約９８％ののようにして得られたアポリポ蛋
白−Ｂを奔修券、 標準抗原として使用する。
低比重リボ蛋白）層を分取し、透析、力２ムクロマト分
画等の手段によシ精製することによシ取得される。一般
にＬＤＬは約９８％ののようにして得られたアポリポ蛋
白−Ｂを奔修券、 標準抗原として使用する。
又後述の如く抗体ＩｇＧ、７ラグメンー） Ｆａ′Ｆｆ
の製造にも使用する。− 次にキットを構成するもう一つの試薬としてペルオキシ
ダーゼ標識付加ｐａ１ｆ（２）が必要である。
の製造にも使用する。− 次にキットを構成するもう一つの試薬としてペルオキシ
ダーゼ標識付加ｐａ１ｆ（２）が必要である。
ペルオキシダーゼ標識付加Ｆａυは次のようにして作成
される。
される。
まず上記で得た精製ＬＤＬ即ちアポリボ蛋白−Ｂを、補
助剤（特にフロイントの完全アジュノ；ンド）と共に抗
体生成能の大きな動物（特にニューシーラント・ホワイ
ト・２ビツト）に皮肉注射し、さらに適当日数の間にア
ポリボ蛋白−Ｂを数回静脈注射し、適当日数後に採血し
て抗血清を得る。
助剤（特にフロイントの完全アジュノ；ンド）と共に抗
体生成能の大きな動物（特にニューシーラント・ホワイ
ト・２ビツト）に皮肉注射し、さらに適当日数の間にア
ポリボ蛋白−Ｂを数回静脈注射し、適当日数後に採血し
て抗血清を得る。
この抗血清から塩析、遠沈、透析、カラムクロマト分画
等の分離、精製手段を加えて抗体である免疫グロブリン
ＩｇＧを得る。ＩｇＧは周知のように分子量約２３００
０のポリペプチド鎖（Ｌ鎖＝ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ
） ２本と分子量約５００００のポリペプチド鎖（Ｈ
鎖＝ ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ） ２本とから構成されて
いる。
等の分離、精製手段を加えて抗体である免疫グロブリン
ＩｇＧを得る。ＩｇＧは周知のように分子量約２３００
０のポリペプチド鎖（Ｌ鎖＝ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ
） ２本と分子量約５００００のポリペプチド鎖（Ｈ
鎖＝ ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ） ２本とから構成されて
いる。
このＩｇＧにタンパク質分解酵素の一つであるペプシン
を作用させ、カラムクロマト分画等の処理を行うと７ラ
グメントｐ（ａ′ｄ）２が得られる。
を作用させ、カラムクロマト分画等の処理を行うと７ラ
グメントｐ（ａ′ｄ）２が得られる。
ついでとのｐ（ａＢ）２を安定剤（特にエチレンジアミ
ンテトラ酢酸塩）及び還元剤（特にメルカプトアルキル
アミン）を含むリン酸緩衝液中で還元反応させ、その後
カラムクロマト分画等の処理を行うと、抗原結合活性を
有するフラグメントＦａセが得られる。つまｊ５Ｆ（ａ
ｌ）’）２のヒンジにあるＳ−５結合を還元してＦａｔ
ｆとすることによル、酵素がつきやすくなるようにする
のである。この反応の際使用した還元剤は−ＳＳ−結合
を一８ＲＨ５−にし、安定剤は−ＳＨになったｐａｌｆ
を安定化する機能を果す。
ンテトラ酢酸塩）及び還元剤（特にメルカプトアルキル
アミン）を含むリン酸緩衝液中で還元反応させ、その後
カラムクロマト分画等の処理を行うと、抗原結合活性を
有するフラグメントＦａセが得られる。つまｊ５Ｆ（ａ
ｌ）’）２のヒンジにあるＳ−５結合を還元してＦａｔ
ｆとすることによル、酵素がつきやすくなるようにする
のである。この反応の際使用した還元剤は−ＳＳ−結合
を一８ＲＨ５−にし、安定剤は−ＳＨになったｐａｌｆ
を安定化する機能を果す。
とのＦａセをペルオキシダーゼで標識する方法として、
最も適当と考えられるものにマレイミド法がある。マレ
イミド法では、たとえばＮ −（４−カルボキシシクロ
ヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシサクシニ
ミドエステルを用いてペルオキシダーゼにマレイミド基
を導入し、これにＦａυのチオール基を反応させる。
最も適当と考えられるものにマレイミド法がある。マレ
イミド法では、たとえばＮ −（４−カルボキシシクロ
ヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシサクシニ
ミドエステルを用いてペルオキシダーゼにマレイミド基
を導入し、これにＦａυのチオール基を反応させる。
他の方法としては過ヨウ素酸法があシ、ペルオキシダー
ゼを過ヨウ素酸々化して作シ出したアルデヒド基とＦａ
セのアミン基とを反応させ、形成されたシッフ塩基を還
元する。そのほかグルタルアルデヒド法も採用できる。
ゼを過ヨウ素酸々化して作シ出したアルデヒド基とＦａ
セのアミン基とを反応させ、形成されたシッフ塩基を還
元する。そのほかグルタルアルデヒド法も採用できる。
本発明においては標識とする酵素としてペルオキシダー
ゼを使用する。ペルオキシダーゼ以外の酵素、たとえば
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等
を用いることについても検討したが、ペルオキシダーゼ
が最も好ましかった。
ゼを使用する。ペルオキシダーゼ以外の酵素、たとえば
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等
を用いることについても検討したが、ペルオキシダーゼ
が最も好ましかった。
キットを構成するさらにもう一つの試薬として、ＩｇＧ
結合ポリスチレンボール（３）が用いられる。このＩｇ
Ｇ結合ポリスチレンポールは、抗体ＩｇＧ’ｉポリスチ
レンボール上に支持し、検体中の抗原であるアポリボ蛋
白−Ｂとの反応を同相で行うためのものである。ＩｇＧ
結合ポリスチレンポールは、前に述べた方法によシ取得
したＩｇＧを緩衝液に溶かし、この中に適当な径を有す
るポリスチレンボールを投入して放置後、取シ出せはよ
い。
結合ポリスチレンボール（３）が用いられる。このＩｇ
Ｇ結合ポリスチレンポールは、抗体ＩｇＧ’ｉポリスチ
レンボール上に支持し、検体中の抗原であるアポリボ蛋
白−Ｂとの反応を同相で行うためのものである。ＩｇＧ
結合ポリスチレンポールは、前に述べた方法によシ取得
したＩｇＧを緩衝液に溶かし、この中に適当な径を有す
るポリスチレンボールを投入して放置後、取シ出せはよ
い。
本発明においては、ＩｇＧを結合する支持体としてポリ
スチレンボールを用いることが大切である。支持体とし
てポリスチレンチューブ内壁、シリコンゴム片・ディス
ク・ロンド、アミノアルキルシリルガラスロンド等を用
いることについても検討したが、ポリスチレンボールが
最も好ましかった。
スチレンボールを用いることが大切である。支持体とし
てポリスチレンチューブ内壁、シリコンゴム片・ディス
ク・ロンド、アミノアルキルシリルガラスロンド等を用
いることについても検討したが、ポリスチレンボールが
最も好ましかった。
キットを構成するさらにもう一つの試薬として、発色又
は螢光試薬（４）が用いられる。この試薬は前述の標識
ペルオキシダーゼの作用を受けて発色又は螢光を発する
ようにするためのものである。発色試薬としては、テト
ラメチルベンジジン、オルソフェニレンジアミン、５−
アミンサリチル酸、オルソフェニルジアミンジヒドロク
ロライド、２．Ｚ’−アミン・ジ（３−エチルベンズチ
アゾリン）−タースルホン酸、０−ジアニシジンなどが
あげられ、これらの中ではテトラメチルベンジジンが精
度が良いので特に好ましい。螢光試薬としては、チラミ
ン、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などがあげら
れる。
は螢光試薬（４）が用いられる。この試薬は前述の標識
ペルオキシダーゼの作用を受けて発色又は螢光を発する
ようにするためのものである。発色試薬としては、テト
ラメチルベンジジン、オルソフェニレンジアミン、５−
アミンサリチル酸、オルソフェニルジアミンジヒドロク
ロライド、２．Ｚ’−アミン・ジ（３−エチルベンズチ
アゾリン）−タースルホン酸、０−ジアニシジンなどが
あげられ、これらの中ではテトラメチルベンジジンが精
度が良いので特に好ましい。螢光試薬としては、チラミ
ン、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などがあげら
れる。
これらの発色又は螢光試薬がペルオキシダーゼの作用に
よシ発光体又は螢光体に変化するわけであるが、この酵
素反応の一方の基質とじて過酸化水素が必要となる。即
ち 色原体＋Ｈ２Ｏ２′：色素（酸化型）＋２Ｈ乏Ｏの反応
を利用するのである。又酵素反応を適当なところで停止
する反応停止剤が必要となる。
よシ発光体又は螢光体に変化するわけであるが、この酵
素反応の一方の基質とじて過酸化水素が必要となる。即
ち 色原体＋Ｈ２Ｏ２′：色素（酸化型）＋２Ｈ乏Ｏの反応
を利用するのである。又酵素反応を適当なところで停止
する反応停止剤が必要となる。
そこで本発明においては、キットを構成する試薬として
、反応基質としての過酸化水素（５）及び反応停止剤（
６）を用いる。反応停止剤としては、硫酸、塩酸などの
酸やアルカリなどが適している。なお過酸化水素（５）
は上記発色又は螢光試薬（４）に予め混合しておくこと
もできる。
、反応基質としての過酸化水素（５）及び反応停止剤（
６）を用いる。反応停止剤としては、硫酸、塩酸などの
酸やアルカリなどが適している。なお過酸化水素（５）
は上記発色又は螢光試薬（４）に予め混合しておくこと
もできる。
各操作にあたっては緩衝液の使用が必須であるので、キ
ットを構成する試薬として緩衝液（７）が必要となる。
ットを構成する試薬として緩衝液（７）が必要となる。
緩衝液としては、たとえばリン酸緩衝液に塩化ナトリウ
ム、牛血清アルブミン及び必要に応じてアジ化ナトリウ
ムなどを配合したものが用いられる。
ム、牛血清アルブミン及び必要に応じてアジ化ナトリウ
ムなどを配合したものが用いられる。
次に実施例をあけて本発明の酵素免疫測定試薬をさらに
説明する。
説明する。
実施例１
ヒト血清を株式会社日立製作所製７０１’−７２超遠心
分離機（垂直回転体（ＲＰＶ５０Ｔ））を用いてｓ ｏ
ｏ ｏ ｏ ｒｐｍで１５時間遠沈し、ＬＤＬ層を分
取した。このＬＤＬ層を５ｍＭリン酸緩衝液（Ｉ）Ｈ４
）で透析後、コロジオンバッグで濃縮し、バイオラッド
社製のバイオゲルＡ −ｓｍ（径１α、高さ１２０３）
を用いて分画することによシ、精製ＬＤＬを得た。この
精製ＬＤＬは１１は純粋のアポリポ蛋白−Ｂであ、９，
５ＤＳ（ンジウムドデシルサルフェート）−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法で分子量５０万付近にアポリポ
蛋白−Ｂのバンドが認められる。
分離機（垂直回転体（ＲＰＶ５０Ｔ））を用いてｓ ｏ
ｏ ｏ ｏ ｒｐｍで１５時間遠沈し、ＬＤＬ層を分
取した。このＬＤＬ層を５ｍＭリン酸緩衝液（Ｉ）Ｈ４
）で透析後、コロジオンバッグで濃縮し、バイオラッド
社製のバイオゲルＡ −ｓｍ（径１α、高さ１２０３）
を用いて分画することによシ、精製ＬＤＬを得た。この
精製ＬＤＬは１１は純粋のアポリポ蛋白−Ｂであ、９，
５ＤＳ（ンジウムドデシルサルフェート）−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法で分子量５０万付近にアポリポ
蛋白−Ｂのバンドが認められる。
見
上記で得た精製ＬＤＬ即ちアポリボ蛋白−Ｂを５ ｍｌ
の緩衝液４０１１Ｉｙ溶解した溶液と７０インドの完全
アジュバント５Ｍ７？とを混合してニューシーラント・
ホワイト・ラビットに１匹あたシ計１０ ？２．０ ｔ
ｘｔを１０〜２０個所に皮肉注射し、２週間後に上記ア
ポリボ蛋白−Ｂを緩衝液に溶解した２ ｗＯ，２ｙｔの
溶液を静脈注射しく第１回静注）、以下２週間毎に同様
の静脈注射を２回行った（ウサギ１匹あたシアボリボ蛋
白−Ｂを２ｑづつ３回靜注）。３回目の静脈注射を行っ
てから１０日０にｚｏｔｘｌを採血して抗血清を得た。
の緩衝液４０１１Ｉｙ溶解した溶液と７０インドの完全
アジュバント５Ｍ７？とを混合してニューシーラント・
ホワイト・ラビットに１匹あたシ計１０ ？２．０ ｔ
ｘｔを１０〜２０個所に皮肉注射し、２週間後に上記ア
ポリボ蛋白−Ｂを緩衝液に溶解した２ ｗＯ，２ｙｔの
溶液を静脈注射しく第１回静注）、以下２週間毎に同様
の静脈注射を２回行った（ウサギ１匹あたシアボリボ蛋
白−Ｂを２ｑづつ３回靜注）。３回目の静脈注射を行っ
てから１０日０にｚｏｔｘｌを採血して抗血清を得た。
この抗血清１ ｍｌｌクシ硫酸ナトリウム０．１８１を
少量づつ加えて塩析を行い′、ついで１ｏｏｏ。
少量づつ加えて塩析を行い′、ついで１ｏｏｏ。
ｒｐｍで１０分間遠心分離して得た沈澱に０．０１７５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，３） Ｉ Ｍｌを加えて溶解
し、この溶解した液を同一緩衝液を用いて透析した。透
析後ジエチルアミノエチルセルロースカラムを用いて分
画を行い、ＩｇＧを得た。
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，３） Ｉ Ｍｌを加えて溶解
し、この溶解した液を同一緩衝液を用いて透析した。透
析後ジエチルアミノエチルセルロースカラムを用いて分
画を行い、ＩｇＧを得た。
Ｆ（ａゼ）２
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，５）を用いて
上記で得た■塵を透析しく ＩｇＧ １０〜２０”Ｖｍ
ｌ緩衝液）、２Ｍ塩化ナトリウム水溶液０，０５ ｒｘ
ｌを加え、さらにペプシンを０．４１Ｒｆ／１０ Ｍｇ
ＩｇＧの割合で加え、３７℃で２０時間反応後、ｐＨを
８に調整し、ファルマシア社製のセフ１デックスＧ−１
５０カラムを用いて０、ＩＭホウ酸ナナトリウム緩衝液
ｐＨ８，０）で溶出し、Ｆ（ａゼ）２を得た。
上記で得た■塵を透析しく ＩｇＧ １０〜２０”Ｖｍ
ｌ緩衝液）、２Ｍ塩化ナトリウム水溶液０，０５ ｒｘ
ｌを加え、さらにペプシンを０．４１Ｒｆ／１０ Ｍｇ
ＩｇＧの割合で加え、３７℃で２０時間反応後、ｐＨを
８に調整し、ファルマシア社製のセフ１デックスＧ−１
５０カラムを用いて０、ＩＭホウ酸ナナトリウム緩衝液
ｐＨ８，０）で溶出し、Ｆ（ａゼ）２を得た。
ａ１ｆ
上記ｐ（ａｌ（）、 ｏ、 ａ Ｅｌｆを０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６゜０ ） ０．４５ ｙｔに溶かし、
これにその１／９容（即ちｏ、 ｏ ｓ ｇｌ＞の０．
１Ｍリン酸緩衝液（５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸
ナトリウムと０． 、Ｉ Ｈ２−メルカプトエチルアミ
ンを配合したもの）（ｐＨ６，０）を加えて３７℃で１
．５時間反応させ、ついでセフ１デックスＧ−２５カラ
ム（径１ｍ、高さ３０ａ１ｔ）を用いて０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐａ６．０）で溶出し、Ｆａゼを得た。
酸緩衝液（ｐＨ６゜０ ） ０．４５ ｙｔに溶かし、
これにその１／９容（即ちｏ、 ｏ ｓ ｇｌ＞の０．
１Ｍリン酸緩衝液（５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸
ナトリウムと０． 、Ｉ Ｈ２−メルカプトエチルアミ
ンを配合したもの）（ｐＨ６，０）を加えて３７℃で１
．５時間反応させ、ついでセフ１デックスＧ−２５カラ
ム（径１ｍ、高さ３０ａ１ｔ）を用いて０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐａ６．０）で溶出し、Ｆａゼを得た。
マレイミド・ペルオキシダーゼ
ペルオキシダーゼ６−岬を０．１ Ｍ リン酸緩衝液１
ｍｌに溶解し、これにペルオキシダーゼに対し５０倍
モル量のＮ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）
゛マレイミドのＮ−ヒドロキシサクシニミドエステルの
Ｚ ５ ｑ７ｘ ｏ ｏμｌジメチルホルムアミド溶液
を加えて３０℃で３０分間反応を行い、反応物をセファ
デックスＧ−２５カラム（径１０Ｉ、高さ４５α）を用
いて０．１Ｍすン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で溶出し、マ
レイミド・ペルオキシダーゼを得た。
ｍｌに溶解し、これにペルオキシダーゼに対し５０倍
モル量のＮ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）
゛マレイミドのＮ−ヒドロキシサクシニミドエステルの
Ｚ ５ ｑ７ｘ ｏ ｏμｌジメチルホルムアミド溶液
を加えて３０℃で３０分間反応を行い、反応物をセファ
デックスＧ−２５カラム（径１０Ｉ、高さ４５α）を用
いて０．１Ｍすン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で溶出し、マ
レイミド・ペルオキシダーゼを得た。
ペルオキシダーゼ標識付加ｐａ’ｔｆ
上記で得たｐａゼ５０μＭと上記で得たマレイミド・ペ
ルオキシダーゼ５０μＭとを等量混合し、３０℃で１時
間反応後、ＬＫＢ’社製ウルトつゲルＡＱＡ −４４（
径Ｌ５ｃ！Ｉｔ、高さ４５３）を用いて０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出し、ペルオキシダーゼ標識
付加ｙａ１ｆを得た。なおフラクシヨンの確認は、吸光
光度計の２８０ｎｍで蛋白量を、４０３ｎｍでペルオキ
シダーゼ量を測定し、各７ラクシヨンについてペルオキ
シダーゼ活性を測定することによル行った。
ルオキシダーゼ５０μＭとを等量混合し、３０℃で１時
間反応後、ＬＫＢ’社製ウルトつゲルＡＱＡ −４４（
径Ｌ５ｃ！Ｉｔ、高さ４５３）を用いて０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出し、ペルオキシダーゼ標識
付加ｙａ１ｆを得た。なおフラクシヨンの確認は、吸光
光度計の２８０ｎｍで蛋白量を、４０３ｎｍでペルオキ
シダーゼ量を測定し、各７ラクシヨンについてペルオキ
シダーゼ活性を測定することによル行った。
ＩｇＧ結合ポリスチレンボール
前述で取得したＩｇＧを１００μｆｌＡｌ緩衝液となる
ように調製した後、この中に直径６．５ｊ！Ｉのポリス
チレンポールを１００〜８０個／ ２０ ｍｌの割合で
投入し、−４℃にて一晩放置してポール表面にＩｇＧを
吸着させた。
ように調製した後、この中に直径６．５ｊ！Ｉのポリス
チレンポールを１００〜８０個／ ２０ ｍｌの割合で
投入し、−４℃にて一晩放置してポール表面にＩｇＧを
吸着させた。
発色試薬
発色試薬としてテトラメチルベンジジンの１３４μｆ／
ｉｔ水溶液を調製した。
ｉｔ水溶液を調製した。
反応基質として過酸化水素の０．０１％水溶液を調製し
た。
た。
反応停止剤として２Ｍ硫酸水溶液を調製した。
緩衝液として
０、０１ Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０
０、１Ｍ Ｎａｃｌ
０．１％牛血清アルブミン
よりなる組成の緩衝液（以下緩衝液Ａと称する）を調製
した。なお標準抗原や検体の希釈の際には緩衝液Ａに０
．１％のチツ化ソーダを添加する場合がある。
した。なお標準抗原や検体の希釈の際には緩衝液Ａに０
．１％のチツ化ソーダを添加する場合がある。
操作法は次の如くである。
１、 標準溶液又は検体希釈液２００μｌと上述の緩衝
液Ａ１００μｌを試験管に入れ、これに上述のＩｇＧ結
合ポリスチレンボール１個を加え、４℃で１昼夜放置す
る。
液Ａ１００μｌを試験管に入れ、これに上述のＩｇＧ結
合ポリスチレンボール１個を加え、４℃で１昼夜放置す
る。
２ 溶液を吸引除去後上述の緩衝液Ａ ２ ｘｉで２回
洗浄し、上述のペルオキシダーゼ標識付加Ｆａ’Ｗ ２
００ｎｆ／３００ｆｉｌを入れた別の試験管にこの洗浄
したポールを入れ、２０℃で３時間インキュベートする
。
洗浄し、上述のペルオキシダーゼ標識付加Ｆａ’Ｗ ２
００ｎｆ／３００ｆｉｌを入れた別の試験管にこの洗浄
したポールを入れ、２０℃で３時間インキュベートする
。
３、 溶液を吸引除去後上述の緩衝液Ａ２ゴで２回洗浄
し、上述のテトラメチルベンジジン溶液（濃度１３４μ
ｆＡｌ ） ６００μＥの入った試験、管にこの洗浄し
たポールを入れ、３０℃で５分間ブレインキュベートす
る。
し、上述のテトラメチルベンジジン溶液（濃度１３４μ
ｆＡｌ ） ６００μＥの入った試験、管にこの洗浄し
たポールを入れ、３０℃で５分間ブレインキュベートす
る。
４、 ついで上述の０．０１％過酸化水素水溶液２００
μｌを加えて３０℃で１０分間反応させ、上述の１Ｍ硫
酸水溶液４００μｌを加えて反応を停止させる。
μｌを加えて３０℃で１０分間反応させ、上述の１Ｍ硫
酸水溶液４００μｌを加えて反応を停止させる。
５．４５０ｎｍで吸光度を測定し、標準曲線よ）検体濃
度をめる。又螢光強度の測定は、励起波長３２０ｎｍ、
螢光測定波長４０４ｎｍにて行う。
度をめる。又螢光強度の測定は、励起波長３２０ｎｍ、
螢光測定波長４０４ｎｍにて行う。
標準抗原としてのヒトアポリボ蛋白−Ｂの溶液（標準溶
液）及び滋賀医大附属病院で患者らから各２ ｍｌ採血
し、遠心分離し、４℃で保存した血清（検体）について
、上述の方法によシ一度に測定を行った。
液）及び滋賀医大附属病院で患者らから各２ ｍｌ採血
し、遠心分離し、４℃で保存した血清（検体）について
、上述の方法によシ一度に測定を行った。
標準溶液を用いたときの吸光度とアポリボ蛋白−Ｂの濃
度との関係を第１図に示した。第１図中縦軸は吸光度、
横軸はアポリボ蛋白−Ｂの濃度であり、曲線が検量線と
なる。なおｆ ＴＨＥ）４ｅとは１ｙｌｓモル／１００
μｌのことである。
度との関係を第１図に示した。第１図中縦軸は吸光度、
横軸はアポリボ蛋白−Ｂの濃度であり、曲線が検量線と
なる。なおｆ ＴＨＥ）４ｅとは１ｙｌｓモル／１００
μｌのことである。
又この検量線を用いて上記検体のアポリボ蛋白−Ｂの濃
度をめた。結果を次表に示す。
度をめた。結果を次表に示す。
※ 糖尿病（ｌ型）の患者のうち６〜７割の人は、動脈
硬化症患者でもある。
硬化症患者でもある。
実施例２
発色試薬に代えて螢光試薬を用いた？丘かは実施例１に
準じて測定を行った。即ち、螢光試薬としてのｐ−ヒド
ロキシフェニルグロビオネートの０．１％溶液２５０μ
ｌにスチレンボールを入れてプレインキユベートシ、つ
′いて０．０３％過酸化水素水溶液５０μｌを加えて３
０°Ｃで３０分間反応させ、その後０．１Ｍグリシン・
ＮａＯＨ液（ｐＨ１０）を加えて反応を停止させた。
準じて測定を行った。即ち、螢光試薬としてのｐ−ヒド
ロキシフェニルグロビオネートの０．１％溶液２５０μ
ｌにスチレンボールを入れてプレインキユベートシ、つ
′いて０．０３％過酸化水素水溶液５０μｌを加えて３
０°Ｃで３０分間反応させ、その後０．１Ｍグリシン・
ＮａＯＨ液（ｐＨ１０）を加えて反応を停止させた。
標準溶液を用いたときの螢光強度とアポリポ蛋白−Ｂの
濃度との関係を第２図に示した。第２図中縦軸は螢光強
度、横軸はアポリポ蛋白−Ｂの濃度であり、曲線が検量
線となる。
濃度との関係を第２図に示した。第２図中縦軸は螢光強
度、横軸はアポリポ蛋白−Ｂの濃度であり、曲線が検量
線となる。
第１図は吸光度とアポリポ蛋白−Ｂの濃度との関係を示
したグラフ、第２図は螢光強度とアポリポ蛋白−Ｂの濃
度との関係を示したグラフでちる。
したグラフ、第２図は螢光強度とアポリポ蛋白−Ｂの濃
度との関係を示したグラフでちる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、標準抗原ととしてのヒトアポリポ蛋白−Ｂ（１）、
抗体としてのペルオキシダーゼ標識付加ｐａ′Ｆｆ（２
）、抗体ＩｇＧ結合ポリスチレンボール（３）、発色又
は螢光試薬（４）、反応基質としての過酸化水素（５）
、反応停止剤（６）及び緩衝液（７）よシなるアポリポ
蛋白−Ｂの酵素免疫測定試薬。 ２、 ペルオキシダーゼ標識付加Ｆａｎ （２）が、マ
レイミド法によジベルオキシダーゼをＦａυに結合した
ものである特許請求の範囲第１項記載の試薬。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58123973A JPS6015559A (ja) | 1983-07-06 | 1983-07-06 | アポリポ蛋白−ｂの酵素免疫測定試薬 |
| US06/627,714 US4722893A (en) | 1983-07-06 | 1984-07-05 | Reagents for enzyme immunoassay for apolipoprotein B |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58123973A JPS6015559A (ja) | 1983-07-06 | 1983-07-06 | アポリポ蛋白−ｂの酵素免疫測定試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6015559A true JPS6015559A (ja) | 1985-01-26 |
Family
ID=14873887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58123973A Pending JPS6015559A (ja) | 1983-07-06 | 1983-07-06 | アポリポ蛋白−ｂの酵素免疫測定試薬 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4722893A (ja) |
| JP (1) | JPS6015559A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6264956A (ja) * | 1985-09-18 | 1987-03-24 | Teijin Ltd | 肺表面活性物質の検出方法及びそれに用いる試薬キツト |
| JPS63501037A (ja) * | 1985-09-27 | 1988-04-14 | フア−マシア・ア−・ベ− | リポタンパク質及びアポリポタンパク質の測定方法 |
| JPH01129163A (ja) * | 1987-10-08 | 1989-05-22 | Behringwerke Ag | アポリポタンパク質ｂの診断試薬および測定法 |
| JPH02183164A (ja) * | 1989-01-09 | 1990-07-17 | Teijin Ltd | 多標識抗体 |
| JPH063349U (ja) * | 1991-01-30 | 1994-01-18 | 阪神化成工業株式会社 | 浣腸容器 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0257778B1 (en) * | 1986-08-06 | 1995-03-22 | Scripps Clinic And Research Foundation | Apolipoprotein b-specific monoclonal antibodies produced by two novel hybridomas |
| GB8728310D0 (en) * | 1987-12-03 | 1988-01-06 | St Georges Hosp Medical School | Method of estimation of systemic cholesterol concentrations from capillary blood samples |
| DE3842657A1 (de) * | 1988-12-19 | 1990-06-21 | Merck Patent Gmbh | Verfahren und mittel zur bestimmung von maleimidgruppen |
| US4983529A (en) * | 1988-06-10 | 1991-01-08 | Abbott Laboratories | Immunoassay for HIV-I antigens using F(AB')2 fragments as probe |
| US5187068A (en) * | 1989-06-09 | 1993-02-16 | Nicolae Luca | Method for determination of lipid moiety and apolipoprotein expressed epitope immunoreactivity on intact lipoprotein |
| DK0559795T3 (da) * | 1990-11-30 | 1996-01-29 | Monoclonetics Int | Fremgangsmåder til diagnosticering af kroniske smerter i lænderegionen og halshvrivelsøjlen |
| US5844097A (en) * | 1990-11-30 | 1998-12-01 | Monoclonetics International, Inc. | Methods for the diagnosis of peripheral nerve damage |
| GB9512994D0 (en) * | 1995-06-26 | 1995-08-30 | Brf International | Method for quantitative measurement of an enzyme linked immunosorbent assay |
| GR1004477B (el) * | 2002-04-23 | 2004-03-08 | Ευσταθιος Γκονος | Μεθοδος και κιτ ποσοτικης μετρησης της απολιποπρωτεινης j/clusterin στον ορο του αιματος |
| CN110940639B (zh) * | 2018-12-24 | 2023-03-07 | 河北省动物疫病预防控制中心 | 一种死宰羊肉的鉴定方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4342739A (en) * | 1979-01-09 | 1982-08-03 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Novel material for immunological assay of biochemical components and a process for the determination of said components |
| FR2455743A1 (fr) * | 1979-05-02 | 1980-11-28 | Goella Laboratoires | Procede et dispositif pour le dosage des lipoproteines seriques |
| EP0072902B1 (de) * | 1981-08-21 | 1985-04-24 | F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft | Verfahren zur Bestimmung von carcinoembryonalem Antigen (CEA) und zur Bestimmung geeignete Antikörperlösung |
| US4433059A (en) * | 1981-09-08 | 1984-02-21 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Double antibody conjugate |
-
1983
- 1983-07-06 JP JP58123973A patent/JPS6015559A/ja active Pending
-
1984
- 1984-07-05 US US06/627,714 patent/US4722893A/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6264956A (ja) * | 1985-09-18 | 1987-03-24 | Teijin Ltd | 肺表面活性物質の検出方法及びそれに用いる試薬キツト |
| JPS63501037A (ja) * | 1985-09-27 | 1988-04-14 | フア−マシア・ア−・ベ− | リポタンパク質及びアポリポタンパク質の測定方法 |
| JPH01129163A (ja) * | 1987-10-08 | 1989-05-22 | Behringwerke Ag | アポリポタンパク質ｂの診断試薬および測定法 |
| JPH02183164A (ja) * | 1989-01-09 | 1990-07-17 | Teijin Ltd | 多標識抗体 |
| JPH063349U (ja) * | 1991-01-30 | 1994-01-18 | 阪神化成工業株式会社 | 浣腸容器 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4722893A (en) | 1988-02-02 |
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