JPH01153960A - 赤血球凝集アッセイ - Google Patents
赤血球凝集アッセイInfo
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、赤血球凝集によりヒト又は動物の血液中の抗
原、抗体又は他の分析物を検出するための試薬及び方法
に関する。本発明はまた、試薬を含むキット及びその試
薬の調製法にも関する。
原、抗体又は他の分析物を検出するための試薬及び方法
に関する。本発明はまた、試薬を含むキット及びその試
薬の調製法にも関する。
特定の抗原又は抗体のための血液サンプルをアッセイす
ることは、アッセイする前、遠心分離及び/又は凝固す
ることにより血液の血清成分から細胞成分を分離する段
階を従来含む。
ることは、アッセイする前、遠心分離及び/又は凝固す
ることにより血液の血清成分から細胞成分を分離する段
階を従来含む。
これは、いくつかの潜在的な問題を提示する。
第1に、そのようなアッセイは、フィールド条件下で行
われる試験には適切でない。多くの獣医によれば、フィ
ールドでの敏速な試験が、分離及びアッセイのために実
験室にサンプルを輸送する手段よりも所望される。また
、遠心機を持たない獣医は、怒染性物質、たとえばイヌ
糸状虫の存在のために血液サンプルを時々アッセイする
必要がある。さらに、第■世界における病気の検出のた
めに使用されるアッセイは、単純性及び低費用性が不可
欠なものである状況を示す。
われる試験には適切でない。多くの獣医によれば、フィ
ールドでの敏速な試験が、分離及びアッセイのために実
験室にサンプルを輸送する手段よりも所望される。また
、遠心機を持たない獣医は、怒染性物質、たとえばイヌ
糸状虫の存在のために血液サンプルを時々アッセイする
必要がある。さらに、第■世界における病気の検出のた
めに使用されるアッセイは、単純性及び低費用性が不可
欠なものである状況を示す。
第2に、ある病理学的条件においては、血液サンプルの
分gIが困Wlになる。ヴアルデンストームマクログロ
プリン血病症の患者から採取される血液は、完全なll
l1液に対して行われ得るアッセイをひじょうに所望す
るものにする細胞画分及び血清に分離することが困難で
ある。
分gIが困Wlになる。ヴアルデンストームマクログロ
プリン血病症の患者から採取される血液は、完全なll
l1液に対して行われ得るアッセイをひじょうに所望す
るものにする細胞画分及び血清に分離することが困難で
ある。
第3に、血液サンプルは、しばしば高い惑染性且つ潜在
的に危険な疾病状態の存在についての試験のために使用
される。これらの場合、アッセイを行う人々への危険性
を最少にするために、できるだけ少ない操作及び加工で
サンプルを処理することが好ましい。さらに、ある条件
は、オバーザーカウンターフィンガープリックアッセイ
(over−the−counter finger−
prick assay)の手段をひじょうに所望する
ものにする。そのようなアッセイは、必然的に完全な血
液に対する実施を適切なものにするにちがいない。
的に危険な疾病状態の存在についての試験のために使用
される。これらの場合、アッセイを行う人々への危険性
を最少にするために、できるだけ少ない操作及び加工で
サンプルを処理することが好ましい。さらに、ある条件
は、オバーザーカウンターフィンガープリックアッセイ
(over−the−counter finger−
prick assay)の手段をひじょうに所望する
ものにする。そのようなアッセイは、必然的に完全な血
液に対する実施を適切なものにするにちがいない。
たとえばラジオイムノアッセイ (Yalow and
Berson (1959) Nature 184.
1648により初めに報告された)及び酵素イムノアッ
セイ又はEIA(Engvall and Perlm
an (1971) Immunochem 8 。
Berson (1959) Nature 184.
1648により初めに報告された)及び酵素イムノアッ
セイ又はEIA(Engvall and Perlm
an (1971) Immunochem 8 。
871及びVan Weenan and 5chun
rs (1971) FERSLetters 15.
232により最初に報告された〕の技法の紹介以来、イ
ムノアッセイは、ヒトの診断及び獣医学に新風を引き起
こして来た。
rs (1971) FERSLetters 15.
232により最初に報告された〕の技法の紹介以来、イ
ムノアッセイは、ヒトの診断及び獣医学に新風を引き起
こして来た。
そのようなアッセイは、抗体−抗原の相互作用に基づか
れているが、使用される検出システムは通常、複雑であ
る。使用される試薬は一般的に酵素又は放射性ラベルさ
れた抗原、抗体又はその複合体であり、それらは、試験
されるべき分析物の存在を検出するために、特定の基質
とのインキュベーション及び視覚的に又は比色分析によ
る色のエンドポイントの測定、又は放射線カウンターに
よる放射性壊変の測定のいずれかを必要とする。
れているが、使用される検出システムは通常、複雑であ
る。使用される試薬は一般的に酵素又は放射性ラベルさ
れた抗原、抗体又はその複合体であり、それらは、試験
されるべき分析物の存在を検出するために、特定の基質
とのインキュベーション及び視覚的に又は比色分析によ
る色のエンドポイントの測定、又は放射線カウンターに
よる放射性壊変の測定のいずれかを必要とする。
これらのアッセイはまた、いくつかの洗浄段階も含む。
血液中の分析物の検出のためのほとんどのイムノアッセ
イは、−i的に自然界の力によるものである。従って、
これらのアッセイは敏感であるけれども、それらは、試
験下での分析物の検出のために、長い時間を必要とし、
そして高価な装置を必要とする工程を含む。
イは、−i的に自然界の力によるものである。従って、
これらのアッセイは敏感であるけれども、それらは、試
験下での分析物の検出のために、長い時間を必要とし、
そして高価な装置を必要とする工程を含む。
これらのア・νセイに代わるものとして、GupLa、
星&* 、(1985) Journal of Im
munologicalMethods 30177〜
187により記載のタイプのイムノアッセイが提供され
る。これらは、赤血球及び抗−赤血球抗体が指示器シス
テムに使用されるイムノアッセイである。これらのアッ
セイにおいては、外因性赤血球、たとえば羊赤血球が使
用される。
星&* 、(1985) Journal of Im
munologicalMethods 30177〜
187により記載のタイプのイムノアッセイが提供され
る。これらは、赤血球及び抗−赤血球抗体が指示器シス
テムに使用されるイムノアッセイである。これらのアッ
セイにおいては、外因性赤血球、たとえば羊赤血球が使
用される。
最近、ラテックスビーズに抗体を接触し、従って急速な
凝集アッセイを提供することが可能になって来た。しか
しながら、これはまだ細胞用からの血清/血漿相の分離
を伴い、そして従って遠心機又は濾過システムの使用を
必要とする。ラテックス凝集アッセイは、Merske
ys ftH+ 、Proc。
凝集アッセイを提供することが可能になって来た。しか
しながら、これはまだ細胞用からの血清/血漿相の分離
を伴い、そして従って遠心機又は濾過システムの使用を
必要とする。ラテックス凝集アッセイは、Merske
ys ftH+ 、Proc。
Soc、Exp、Biol、Med、(1969)、
131.871; Ca5telon 。
131.871; Ca5telon 。
fL&、 、J、Cl1n、Pathol、(196B
)、 21.638;及びSinger−& PIoL
z AM、J、Meol、 (1956(12月)〕
。
)、 21.638;及びSinger−& PIoL
z AM、J、Meol、 (1956(12月)〕
。
888に記載される。
直接的及び間接的凝集イムノアッセイは、当業界で良く
知られている。これらのアッセイにおいて、抗原又は抗
体が結合される粒子の凝集を用いて、その対応する抗体
又は抗原の存在又は不在を指摘する。種々の粒子、たと
えばラテ・7クス、木炭、カオリナイト又はベントナイ
トの粒子、及び微生物細胞及び赤血球細胞の両者が凝集
可能なキャリヤー止して使用された。アメリカ特許節4
.308,026号(モチダによる)を参照のこと。指
示粒子としての赤血球の使用は、Patel(アメリカ
特許節3,882,225号)により強く批評されてい
て、そして彼は、指示赤血球を標準化することは難しい
ことを言及する。
知られている。これらのアッセイにおいて、抗原又は抗
体が結合される粒子の凝集を用いて、その対応する抗体
又は抗原の存在又は不在を指摘する。種々の粒子、たと
えばラテ・7クス、木炭、カオリナイト又はベントナイ
トの粒子、及び微生物細胞及び赤血球細胞の両者が凝集
可能なキャリヤー止して使用された。アメリカ特許節4
.308,026号(モチダによる)を参照のこと。指
示粒子としての赤血球の使用は、Patel(アメリカ
特許節3,882,225号)により強く批評されてい
て、そして彼は、指示赤血球を標準化することは難しい
ことを言及する。
Mo1inaro (アメリカ特許節4.130.63
4号)は、抗体被覆の赤血球細胞を使用する抗原につい
てのアッセイを記載する。彼は、赤血球に抗体を結合す
るために使用される方法は、抗体の反応性を破壊すべき
でないことを強張する。彼は、赤血球に対して特異的で
ある抗体がこのアッセイのために有用でないことを明確
にする。しかしながら、彼は、抗原に対して特異的な1
つの結合部位及び赤血球細胞に対して特異的の他の結合
部位を有するハイブリッド抗体を用いる可能性を言及す
る。
4号)は、抗体被覆の赤血球細胞を使用する抗原につい
てのアッセイを記載する。彼は、赤血球に抗体を結合す
るために使用される方法は、抗体の反応性を破壊すべき
でないことを強張する。彼は、赤血球に対して特異的で
ある抗体がこのアッセイのために有用でないことを明確
にする。しかしながら、彼は、抗原に対して特異的な1
つの結合部位及び赤血球細胞に対して特異的の他の結合
部位を有するハイブリッド抗体を用いる可能性を言及す
る。
Chang (アメリカ特許節4,433.059号)
は、2種の抗体が“テイルーツウーテイル”、すなわち
それらの特異性を変えないように共有結合される凝集イ
ムノアッセイ試薬を開示する。1つの抗体は、指示物質
、たとえば赤血球により担持される抗体に対して特異的
である。この抗体は好ましくは、非特異的な凝集を避け
るために一価である。他の抗体は二価であり、そして分
析物に対して特異的である。アッセイのための用意にお
いては、新−tな赤血球が接合体により被覆される。次
に、二重の抗体接合体被覆のRBCが試験血清と共にイ
ンキュベートされる。Changは、非凝集性抗−RB
C抗体及び内因性赤血球を用いての完全な血液サンプル
のアッセイを考慮しない。
は、2種の抗体が“テイルーツウーテイル”、すなわち
それらの特異性を変えないように共有結合される凝集イ
ムノアッセイ試薬を開示する。1つの抗体は、指示物質
、たとえば赤血球により担持される抗体に対して特異的
である。この抗体は好ましくは、非特異的な凝集を避け
るために一価である。他の抗体は二価であり、そして分
析物に対して特異的である。アッセイのための用意にお
いては、新−tな赤血球が接合体により被覆される。次
に、二重の抗体接合体被覆のRBCが試験血清と共にイ
ンキュベートされる。Changは、非凝集性抗−RB
C抗体及び内因性赤血球を用いての完全な血液サンプル
のアッセイを考慮しない。
Chu(アメリカ特許節4.493.793号)は、レ
クチン−抗体又はレクチン−抗原共有結合性接合体の構
成を開示する。彼の第1表(引用により組込まれている
)は、いくつかのレクチンの炭水化物特異性を示す。彼
は、レクチン又は抗体受容体のいずれかを通しての赤血
球へのそのような接合体の結合を教授しない。
クチン−抗体又はレクチン−抗原共有結合性接合体の構
成を開示する。彼の第1表(引用により組込まれている
)は、いくつかのレクチンの炭水化物特異性を示す。彼
は、レクチン又は抗体受容体のいずれかを通しての赤血
球へのそのような接合体の結合を教授しない。
他の“テイルーツウーテイル”免疫学的接合体は知られ
ている。Sega l (アメリカ特許筒4,676;
980号)は、標的細胞表面特異的抗体及び細胞素性エ
フェクター細胞受容体特異的抗体の“テイルーツウーテ
イル”接合体の114成を示す。いくつかの架矯法(引
用により導入される)が記載される。この接合体は、免
疫療法の使用に向けられ、ここでそれは患者の細胞免疫
系による標的細胞の分解を引き起こすであろう。もちろ
ん、標的細胞は、宿主に対して内因性の赤血球ではない
であろう。
ている。Sega l (アメリカ特許筒4,676;
980号)は、標的細胞表面特異的抗体及び細胞素性エ
フェクター細胞受容体特異的抗体の“テイルーツウーテ
イル”接合体の114成を示す。いくつかの架矯法(引
用により導入される)が記載される。この接合体は、免
疫療法の使用に向けられ、ここでそれは患者の細胞免疫
系による標的細胞の分解を引き起こすであろう。もちろ
ん、標的細胞は、宿主に対して内因性の赤血球ではない
であろう。
Li (アメリカ特許筒4.(i61,444号)は、
第1抗体のイディオタイプに対して特異的な抗体及び分
析物結合抗体のテイルーツウーテイル接合体の製造を示
唆する。この接合体は、イムノアッセイにおいて、不溶
化された分析物結合抗体と一緒に使用されるべきであっ
た。
第1抗体のイディオタイプに対して特異的な抗体及び分
析物結合抗体のテイルーツウーテイル接合体の製造を示
唆する。この接合体は、イムノアッセイにおいて、不溶
化された分析物結合抗体と一緒に使用されるべきであっ
た。
Wardlaw(アメリカ特許筒4,695,553号
)は、遠心骨■された完全な血液における赤血球細胞と
白血球細胞との間の界面を明確にするためにRBC凝集
剤として一般的な赤血球抗原に対するモノクローナル抗
体の使用を教授する。彼は、グリコホリンスはH抗原に
対する抗体の使用を提起するのみならず、またレクチン
の混合物の使用の可能性も記載する。Guesdon
(アメリカ特許筒4,668,637号)は、赤血球吸
着の目的のために抗−赤血球細胞抗体又はレクチンの使
用を論議する。13tgbee(Molecular
Immunology、 20; L353〜1362
(1983))は、グリコホリンAに対する4種のモノ
クローナル抗体の産生及び試験を記載する。対象(微生
物)の分析物のクラスのすべてのメンバーの間に共有さ
れる抗原決定基と反応する抗体をイムノアッセイで使用
する一般的な概念が、McLaugh 1 i n s
アメリカ特許第4.683.196号に示される。
)は、遠心骨■された完全な血液における赤血球細胞と
白血球細胞との間の界面を明確にするためにRBC凝集
剤として一般的な赤血球抗原に対するモノクローナル抗
体の使用を教授する。彼は、グリコホリンスはH抗原に
対する抗体の使用を提起するのみならず、またレクチン
の混合物の使用の可能性も記載する。Guesdon
(アメリカ特許筒4,668,637号)は、赤血球吸
着の目的のために抗−赤血球細胞抗体又はレクチンの使
用を論議する。13tgbee(Molecular
Immunology、 20; L353〜1362
(1983))は、グリコホリンAに対する4種のモノ
クローナル抗体の産生及び試験を記載する。対象(微生
物)の分析物のクラスのすべてのメンバーの間に共有さ
れる抗原決定基と反応する抗体をイムノアッセイで使用
する一般的な概念が、McLaugh 1 i n s
アメリカ特許第4.683.196号に示される。
多(の特許が、血液型判定に有用な抗体を取り扱う、、
Lloyd、アメリカ特許筒4.618.741号;G
raham、 Jr、 、アメリカ特許筒4,358,
436号;Liu %アメリカ特許第4.550,01
7号; Steplewski。
Lloyd、アメリカ特許筒4.618.741号;G
raham、 Jr、 、アメリカ特許筒4,358,
436号;Liu %アメリカ特許第4.550,01
7号; Steplewski。
アメリカ特許筒4,607,009号; Lennox
、 WO33103477を参照のこと。これらの抗体
は、それらがある血液細胞集団においてのみ見出される
抗原に結合するので、血液型判定のために有用であるが
、ところが本発明の目的のためには、本質的にすべての
赤血球に対して結合する抗体(又はその混合物)を使用
することが所望される。
、 WO33103477を参照のこと。これらの抗体
は、それらがある血液細胞集団においてのみ見出される
抗原に結合するので、血液型判定のために有用であるが
、ところが本発明の目的のためには、本質的にすべての
赤血球に対して結合する抗体(又はその混合物)を使用
することが所望される。
Zuk(アメリカ特許筒4,594,327号)は、完
全な血液サンプルに対する直接的イムノアッセイの実施
の望ましいことを認識する。この方法においては、サン
プルが不溶性分析物特異的免疫試薬及び赤血球細胞結合
剤、たとえばRBC−特異的抗体又はレクチンの両者と
接触せしめられる。分析物特異的免疫試薬及びRBC結
合剤は一緒に結合されず、そしてそのσn示されたアッ
セイは凝集アッセイではない。
全な血液サンプルに対する直接的イムノアッセイの実施
の望ましいことを認識する。この方法においては、サン
プルが不溶性分析物特異的免疫試薬及び赤血球細胞結合
剤、たとえばRBC−特異的抗体又はレクチンの両者と
接触せしめられる。分析物特異的免疫試薬及びRBC結
合剤は一緒に結合されず、そしてそのσn示されたアッ
セイは凝集アッセイではない。
血液サンプルに内因性の抗−赤血球抗体による赤血球の
非特異的凝集の凝集イムノアッセイにおける問題は、C
zismas(アメリカ特許筒3,639,558号)
により示された。彼は、タンパク質による粒子の被覆に
よりその粒子上のすべての天然に存在する抗原性部位の
除去を提案した。
非特異的凝集の凝集イムノアッセイにおける問題は、C
zismas(アメリカ特許筒3,639,558号)
により示された。彼は、タンパク質による粒子の被覆に
よりその粒子上のすべての天然に存在する抗原性部位の
除去を提案した。
Theofilopoulos (アメリカ特許筒4,
342,566号);Duermeyer (アメリカ
特許筒4,292.403号)及びGoldenber
g (アメリカ特許筒4,331.647号)は、アッ
セイにおける損なわれていない抗体のだめの置換体とし
て抗体の特異的結合フラグメントの使用を示す。異種二
官能価抗体の構成は、Auditore−11argr
eaves (アメリカ特許筒4.446.233号)
:Paulus (アメリカ特許筒4.444.878
号):及びReading(アメリカ特許筒4,474
,893号)により教授される。Mochida(アメ
リカ特許筒4,200,436号)は、あるイムノアッ
セイにおいて一価抗体又はその結合フラグメントの使用
を開示する。Forres t(アメリカ特許筒4.6
59.878号)は、−価抗体が抗原とのダイマー又は
それ以上の複合体を形成することができず;そのような
凝集体は、固相支持体への゛抗原−抗体複合体の結合を
妨げることができることを言及する。
342,566号);Duermeyer (アメリカ
特許筒4,292.403号)及びGoldenber
g (アメリカ特許筒4,331.647号)は、アッ
セイにおける損なわれていない抗体のだめの置換体とし
て抗体の特異的結合フラグメントの使用を示す。異種二
官能価抗体の構成は、Auditore−11argr
eaves (アメリカ特許筒4.446.233号)
:Paulus (アメリカ特許筒4.444.878
号):及びReading(アメリカ特許筒4,474
,893号)により教授される。Mochida(アメ
リカ特許筒4,200,436号)は、あるイムノアッ
セイにおいて一価抗体又はその結合フラグメントの使用
を開示する。Forres t(アメリカ特許筒4.6
59.878号)は、−価抗体が抗原とのダイマー又は
それ以上の複合体を形成することができず;そのような
凝集体は、固相支持体への゛抗原−抗体複合体の結合を
妨げることができることを言及する。
本発明者は、完全な血液中の種々のタイプの分析物の分
析のために、実験室において及び医学的試験設備を欠く
第三次世界において使用され得る方法が必要であること
を認識した。上記に指摘されたように、初期の方法は、
血清又は血漿から血液細胞の分離を必要とし、そして従
って、そのフィールドに実施の手段を与えるごとはII
][であり且つ多くの場合、不可能である。
析のために、実験室において及び医学的試験設備を欠く
第三次世界において使用され得る方法が必要であること
を認識した。上記に指摘されたように、初期の方法は、
血清又は血漿から血液細胞の分離を必要とし、そして従
って、そのフィールドに実施の手段を与えるごとはII
][であり且つ多くの場合、不可能である。
赤血球結合分子が特定の分析物結合分子に結合される場
合、その得られた接合体を使用して、血液ナンブル中に
存在する内因性赤血球及び分析物の両者を結合すること
ができる。本発明は、そのような複合体が唾液サンプル
に暴露される場合、そのサンプルに対して内因性の赤血
球の凝固が、分析物と赤血球との架橋により適切な分析
物(通常抗原又は抗体)の存在の指示薬として作用する
であろうことに起因する。
合、その得られた接合体を使用して、血液ナンブル中に
存在する内因性赤血球及び分析物の両者を結合すること
ができる。本発明は、そのような複合体が唾液サンプル
に暴露される場合、そのサンプルに対して内因性の赤血
球の凝固が、分析物と赤血球との架橋により適切な分析
物(通常抗原又は抗体)の存在の指示薬として作用する
であろうことに起因する。
一サンプルを遠心分離する必要がない;適切な抗凝集体
の存在下で集められた完全な血液が血清又は血漿の代わ
りに使用される。
の存在下で集められた完全な血液が血清又は血漿の代わ
りに使用される。
一感染性疾病、たとえばAIDS又は肝炎を有する患者
からのサンプルに関して、最小のサンプル操作を要する
。
からのサンプルに関して、最小のサンプル操作を要する
。
一設備が限定される第三次世界のl界健康組織(Wor
ld 1lealth Organization)に
より行われるようなマススクリーニングプログラムのた
めに適切である。
ld 1lealth Organization)に
より行われるようなマススクリーニングプログラムのた
めに適切である。
一アッセイはひじょうに単純である;静菌剤、たとえば
0.01%(w/v)のアジ化ナトリウムの存在下で安
定できる1種の試薬のみが存在する。
0.01%(w/v)のアジ化ナトリウムの存在下で安
定できる1種の試薬のみが存在する。
−適切な動物の赤血球細胞が種特異的MAbを産生ずる
ために免疫化に使用される場合、獣医によるフィールド
試験として使用され得る。
ために免疫化に使用される場合、獣医によるフィールド
試験として使用され得る。
−試験はひじょうに早い一凝集が3分以下で生じる。
−その方法は、治療薬及び患者のコンプリアンスを調節
するために使用され得る。
するために使用され得る。
−それはまた、“オーバー−ザーカウンター”自己試験
アッセイとしても使用できる。
アッセイとしても使用できる。
−必要とされる設備は、混合棒、ガラス又はプラスチッ
クスライド、ランセット及びたぶん微細管だけである。
クスライド、ランセット及びたぶん微細管だけである。
iI)2大 2、■・に、−る1占は゛のものを4まな
いニ ー赤血球の前処理。特許第4,433.059号は回転
沈櫓陰性細胞を特徴する特許第4.668.647号は
、PBSにより洗浄され、そして再懸濁された羊赤血球
細胞を使用する。固体支持体上で起こる反応の後、細胞
は固定される。
いニ ー赤血球の前処理。特許第4,433.059号は回転
沈櫓陰性細胞を特徴する特許第4.668.647号は
、PBSにより洗浄され、そして再懸濁された羊赤血球
細胞を使用する。固体支持体上で起こる反応の後、細胞
は固定される。
一サンプルの前処理。特許第4,433,059号は、
サンプルが補体による介入を避けるために加熱不活性化
されるべきであることを示す。ウサギ血清及びウシアル
ブミンがまた、他の特異的反応を最少にするために添加
されるべきである。これは、患者からの希釈されていな
い完全な血液が試薬と直接的に反応せしめられ得る本発
明のシステムに関しては必要でない。この試薬は、存在
するかも知れないいずれかの抗−マウス反応を妨げるた
めに関係のないモノクローナル抗体を含む。
サンプルが補体による介入を避けるために加熱不活性化
されるべきであることを示す。ウサギ血清及びウシアル
ブミンがまた、他の特異的反応を最少にするために添加
されるべきである。これは、患者からの希釈されていな
い完全な血液が試薬と直接的に反応せしめられ得る本発
明のシステムに関しては必要でない。この試薬は、存在
するかも知れないいずれかの抗−マウス反応を妨げるた
めに関係のないモノクローナル抗体を含む。
従って、凝集アッセイにおける血清から細胞のやっかい
な分離及び指示体粒子としての使用に向けられている外
因性赤血球の感作及び固定化を実施することは可能であ
る。内因性赤血球は試薬により感作される。
な分離及び指示体粒子としての使用に向けられている外
因性赤血球の感作及び固定化を実施することは可能であ
る。内因性赤血球は試薬により感作される。
本発明の凝集試薬及びアッセイのもう1つの新規観点は
、内因性赤血球と共に接合体のインキュベーションが、
分析物がまた存在しない場合、赤血球の凝集を引き起こ
さないであろうような赤血球結合分子(該赤血球結合分
子は、本明細書で“非−自己凝9L″と称する)の選択
である。
、内因性赤血球と共に接合体のインキュベーションが、
分析物がまた存在しない場合、赤血球の凝集を引き起こ
さないであろうような赤血球結合分子(該赤血球結合分
子は、本明細書で“非−自己凝9L″と称する)の選択
である。
赤血球結合分子は好ましくは、モノクローナル抗体であ
り、そして特にヒトシステムにおいては、抗−グリコホ
リン抗体である。この抗体は立体的理由のために自己凝
集しないように思われ;損なわれていない抗体の結合部
位のいづれかが、単に同じ赤血球上の隣°接するエピト
ープを結合することができ又は2個の結合部位の1つの
みが一度にグリコホリンに結合することができる。
り、そして特にヒトシステムにおいては、抗−グリコホ
リン抗体である。この抗体は立体的理由のために自己凝
集しないように思われ;損なわれていない抗体の結合部
位のいづれかが、単に同じ赤血球上の隣°接するエピト
ープを結合することができ又は2個の結合部位の1つの
みが一度にグリコホリンに結合することができる。
本発明のアッセイは、2種の接合体(1つば分折物特異
的結合分子を阻持し、そして他は分析物への第1接合体
の結合により形成される新規エピトープに対して特異的
な結合分子を担持する)を用いて、反復抗原決定基を有
さない小さな抗原を検出することができる。これは、測
定されるべき抗原の存在下での架橋を可能にする。
的結合分子を阻持し、そして他は分析物への第1接合体
の結合により形成される新規エピトープに対して特異的
な結合分子を担持する)を用いて、反復抗原決定基を有
さない小さな抗原を検出することができる。これは、測
定されるべき抗原の存在下での架橋を可能にする。
本発明の凝集アッセイにおいて、結合部分の結合特性を
実質的に変えないで、分析物結合分子により提供される
分析物結合部分(又は分析物類似体)に結合される赤血
球結合分子により提供される赤血球結合部分を含んで成
る試薬が提供される。
実質的に変えないで、分析物結合分子により提供される
分析物結合部分(又は分析物類似体)に結合される赤血
球結合分子により提供される赤血球結合部分を含んで成
る試薬が提供される。
その試薬は、分析物の不在下で内因性赤血球と共にイン
キュベートされる場合、凝集しない。
キュベートされる場合、凝集しない。
克1球待金立ヱ
赤血球膜は、種々の抗原表面成分、たとえばタンパク質
、糖タンパク質、糖脂質及びリポタンパク質を含む。こ
れらの成分を認識する抗体は、免疫原としてその膜、又
はその精製された成分を用いて従来の技法によって調製
され得る。これらの抗体は、天然においてモノクローナ
ル又はポリクローナルである。損なわれていない抗体又
はその特異的結合フラグメントのいづれかが、赤血球結
合分子(EBM)として使用され得る。抗体又は抗体フ
ラグメントは、多価、二価又は−価のものである。
、糖タンパク質、糖脂質及びリポタンパク質を含む。こ
れらの成分を認識する抗体は、免疫原としてその膜、又
はその精製された成分を用いて従来の技法によって調製
され得る。これらの抗体は、天然においてモノクローナ
ル又はポリクローナルである。損なわれていない抗体又
はその特異的結合フラグメントのいづれかが、赤血球結
合分子(EBM)として使用され得る。抗体又は抗体フ
ラグメントは、多価、二価又は−価のものである。
さらに、赤血球の表面上の糖タンパク質、糖脂質及び他
の炭水化物構造体は、炭水化物に対する親和性を有する
、レクチンとして知られている化学物質により認識され
る。これらのレクチンはまた、EBMとしても使用され
得る。赤血球表面に対する特異的親和性を存する他の受
容体分子もまた、使用され得る。これらはまた、膜の脂
質二重層に対する親和性を有する分子も含むことができ
る。そのような分子の例として、プロタミン、ハチの毒
の膜結合部分及び他のひじょうに塩基性のペプチドを挙
げることができる。
の炭水化物構造体は、炭水化物に対する親和性を有する
、レクチンとして知られている化学物質により認識され
る。これらのレクチンはまた、EBMとしても使用され
得る。赤血球表面に対する特異的親和性を存する他の受
容体分子もまた、使用され得る。これらはまた、膜の脂
質二重層に対する親和性を有する分子も含むことができ
る。そのような分子の例として、プロタミン、ハチの毒
の膜結合部分及び他のひじょうに塩基性のペプチドを挙
げることができる。
本発明の好ましいEBMは、すべて又はほとんどすべて
の赤血球上に見出される赤血球膜成分を認識し、その結
果、血液サンプルに内因性の赤血球が凝集粒子として使
用され得る。そのような成分は、いわゆる“公衆抗原(
public antigens)”を含む。
の赤血球上に見出される赤血球膜成分を認識し、その結
果、血液サンプルに内因性の赤血球が凝集粒子として使
用され得る。そのような成分は、いわゆる“公衆抗原(
public antigens)”を含む。
赤血球膜は、タンパク質を膜内に固定し又はそれを通過
せしめることを可能にする疎水性部分又は表面上のいず
れか種々のタンパク質を有する脂質二重層であり、そし
て細胞内に分子の一部を有することもできる。
せしめることを可能にする疎水性部分又は表面上のいず
れか種々のタンパク質を有する脂質二重層であり、そし
て細胞内に分子の一部を有することもできる。
グリコホリンAは、細胞膜を通り抜ける分子の例である
。血液型特異性は、膜タンパク質に結合される炭水化物
又は糖脂質成分により与えられる。
。血液型特異性は、膜タンパク質に結合される炭水化物
又は糖脂質成分により与えられる。
従って、EBMが、特定の種すべての赤血球に共通する
膜糖タンパク質、成分のタンパク質部分又は他の共通の
構造体のいづれかを認識すべきであることが重要である
。赤血球細胞を凝集する二価EBMの能力は、立体因子
、たとえば分子の移重度及び脂質二重層上の結合部位の
位置に依存するであろう。
膜糖タンパク質、成分のタンパク質部分又は他の共通の
構造体のいづれかを認識すべきであることが重要である
。赤血球細胞を凝集する二価EBMの能力は、立体因子
、たとえば分子の移重度及び脂質二重層上の結合部位の
位置に依存するであろう。
赤血球膜のタンパク質は、グリコホリンA(MN。
En”、 Wrb) %グリコホリンB(Ss、 ’N
’l U)及び少量の構成成分、すなわち膜内在地タン
パク質1(Rhesus)、膜結合糖タンパク質C4(
Chido &Rodgers)、膜内在性糖タンパク
質(アニオンチャネル)、糖脂質(Leyis)、スフ
ィンゴ糖脂f(AllI?。
’l U)及び少量の構成成分、すなわち膜内在地タン
パク質1(Rhesus)、膜結合糖タンパク質C4(
Chido &Rodgers)、膜内在性糖タンパク
質(アニオンチャネル)、糖脂質(Leyis)、スフ
ィンゴ糖脂f(AllI?。
fil p、 TK)、アンキリン、スペクトリン、プ
ロティン4−1、F−アクチンを含む〔関連する血液型
因子は括弧内のものである。〕。
ロティン4−1、F−アクチンを含む〔関連する血液型
因子は括弧内のものである。〕。
次の出版物は引用により本明細書に組込まれる=1、赤
血球細胞膜。S、B、5hohet & E、Beut
ler。
血球細胞膜。S、B、5hohet & E、Beut
ler。
11ematology、第3版、出版者: Will
iams、 Beut−1er、 Er5lev &
Lichtman、 1983 (すべての赤血球膜抗
原の総説)。
iams、 Beut−1er、 Er5lev &
Lichtman、 1983 (すべての赤血球膜抗
原の総説)。
2、赤血球細胞膜の概略。
V、T、Marchesi、Blood、 61+
1〜11.1983 (タンパク質概略の総説)。
1〜11.1983 (タンパク質概略の総説)。
特に好ましいEMBは、1つのグリコホリンである。赤
血球シアロ糖ペプチドが膜から抽出される場合、その主
な百分(合計の約75%)は、グリコホリンである。こ
の分子は、16個のすリゴ糖鎖と共に131個のアミノ
酸を含んで成る。従って、これは、赤血球細胞を凝集し
ないで抗体の結合を可能にする多くの成分である。それ
はまた、Sigma Chemical Compan
yから比較的高い純度で容易に入手できる(Fract
ionation of the MajorSial
oglycopeptides or the Hum
an Red BloodCell Membrane
” H,Furthmayr、 M、Tomita &
V、T。
血球シアロ糖ペプチドが膜から抽出される場合、その主
な百分(合計の約75%)は、グリコホリンである。こ
の分子は、16個のすリゴ糖鎖と共に131個のアミノ
酸を含んで成る。従って、これは、赤血球細胞を凝集し
ないで抗体の結合を可能にする多くの成分である。それ
はまた、Sigma Chemical Compan
yから比較的高い純度で容易に入手できる(Fract
ionation of the MajorSial
oglycopeptides or the Hum
an Red BloodCell Membrane
” H,Furthmayr、 M、Tomita &
V、T。
Marchesi、BBRC65,1975,113〜
122を参照のこと)。
122を参照のこと)。
赤血球結合分子が、通常の抗体の場合におけるように多
価のものである場合、その分子が、豊富であり、そして
十分に分布されている赤血球膜成分を認識し、そしてそ
の結合部位が、細胞間の架橋が立体障害物により阻害さ
れるような位置に存在すべきであり、それによって未熟
赤血球細胞の凝集を回避することが所望される。
価のものである場合、その分子が、豊富であり、そして
十分に分布されている赤血球膜成分を認識し、そしてそ
の結合部位が、細胞間の架橋が立体障害物により阻害さ
れるような位置に存在すべきであり、それによって未熟
赤血球細胞の凝集を回避することが所望される。
すべての赤血球を実質的に認識する単一のEBMが使用
されることが好ましいが、但し必要ではない。いくつか
のEBMが同じ又は別の接合体のいづれかに使用され得
、それらのそれぞれは赤血球の特定のグループを認識す
るが、しかし凝集体においては、すべての赤血球を実質
的に認識するであろう。
されることが好ましいが、但し必要ではない。いくつか
のEBMが同じ又は別の接合体のいづれかに使用され得
、それらのそれぞれは赤血球の特定のグループを認識す
るが、しかし凝集体においては、すべての赤血球を実質
的に認識するであろう。
EBMは、赤血球の天然の表面成分を認識することが好
ましいが、EBMにより認識されるリガンドにより赤血
球を被覆し、又は通常隠れたりガントを暴露するために
赤血球を処理することが可能である。
ましいが、EBMにより認識されるリガンドにより赤血
球を被覆し、又は通常隠れたりガントを暴露するために
赤血球を処理することが可能である。
分扼皇
本発明は、特定の分析物の検出に限定されない。
分析物は、血液中に通常見出される物質、たとえば血液
タンパク質又はホルモンであり、又はそれは外来性物質
、たとえば薬物(治療用薬物及び悪用薬物の両者を含む
)、又は生物体、たとえばウィルス(ウィルス被覆タン
パク質を認識することにより)、細菌、原生動物、菌類
、又は多細胞寄生虫(たとえばイム糸状土類)である。
タンパク質又はホルモンであり、又はそれは外来性物質
、たとえば薬物(治療用薬物及び悪用薬物の両者を含む
)、又は生物体、たとえばウィルス(ウィルス被覆タン
パク質を認識することにより)、細菌、原生動物、菌類
、又は多細胞寄生虫(たとえばイム糸状土類)である。
分析物は、1つの分析物結合分子により認識できる反復
エピトープ、又はユニークエピトープ(ここで分析物結
合分子の混合物が必要である)を有する。しかしながら
、単に一度に1種のABMにより結合され得る分析物も
また、検出され得る。
エピトープ、又はユニークエピトープ(ここで分析物結
合分子の混合物が必要である)を有する。しかしながら
、単に一度に1種のABMにより結合され得る分析物も
また、検出され得る。
分」目1結jづ辷f
分析物結合分子は、分析物に対して好ましい親和性を有
する物質、たとえばモノクローナル又はポリクローナル
抗体、レクチン、酵素又は他の結合タンパク質もしくは
物X<又はその結合フラグメント)である。分析物が抗
原である場合、ABMは通常抗体である。分析物が抗体
である場合、ABMは通常、その抗体により認識される
抗原である。検出されるべき分析物が反復エピトープを
有さない場合、分析物に対する種々の特異性を有する複
数のABMが必要とされる。この場合、試薬は、ABM
Iに結合されるEBM及びABM2に結合されるEBM
の混合物、又は結合される両ABMを有するEBMのい
ずれかであろう。
する物質、たとえばモノクローナル又はポリクローナル
抗体、レクチン、酵素又は他の結合タンパク質もしくは
物X<又はその結合フラグメント)である。分析物が抗
原である場合、ABMは通常抗体である。分析物が抗体
である場合、ABMは通常、その抗体により認識される
抗原である。検出されるべき分析物が反復エピトープを
有さない場合、分析物に対する種々の特異性を有する複
数のABMが必要とされる。この場合、試薬は、ABM
Iに結合されるEBM及びABM2に結合されるEBM
の混合物、又は結合される両ABMを有するEBMのい
ずれかであろう。
分析物結合分子は、直接分析物に結合する必要はない。
たとえば、チロキシンのためのアッセイにおいては、1
つのABMがチロキシン結合タンパク質に対して向けら
れ(その結合タンパク質がサンプル中に存在することが
既知である場合)、又は別々に供給され得る。
つのABMがチロキシン結合タンパク質に対して向けら
れ(その結合タンパク質がサンプル中に存在することが
既知である場合)、又は別々に供給され得る。
EBM びABMの 人
EBM及びABMは、直接的又は間接的に、及び共有結
合又は非共有結合(又はその組合わせ)により一緒に結
合され得る。複数のEBM又はABMが使用される場合
、EBM又はABMは、EBMに直接結合された1又は
複数のABMにより一緒に結合され得る。次の表は、当
業界に既知であるいくつかの共有結合法を要約する。
合又は非共有結合(又はその組合わせ)により一緒に結
合され得る。複数のEBM又はABMが使用される場合
、EBM又はABMは、EBMに直接結合された1又は
複数のABMにより一緒に結合され得る。次の表は、当
業界に既知であるいくつかの共有結合法を要約する。
l挾二1皿囁
1、 5PDP
(N−スクシンイミジル−3,2−(ピリジルジチ”オ
)プロピオネート) Neurath、 ’Lh−,198L J、v+ro
1.+ Meth、、 3 +155〜165゜ 2、MBS (m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシン
イミドエステル) Kitagaw 、fL&、 、1976、 J、Bi
ochem、+ 79+ 223−236 。
)プロピオネート) Neurath、 ’Lh−,198L J、v+ro
1.+ Meth、、 3 +155〜165゜ 2、MBS (m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシン
イミドエステル) Kitagaw 、fL&、 、1976、 J、Bi
ochem、+ 79+ 223−236 。
3. 5IAB
(N−スクシンイミジル−4−ヨードアセチルアミノベ
ンゾエート) Weltman、 flE、 、1983゜Bio、T
echniques、土。
ンゾエート) Weltman、 flE、 、1983゜Bio、T
echniques、土。
148〜152゜
j妻JT;W能J@
P−イソチオシアナトベンゾイル、クロリドアメリカ特
許第4,680,338号 二宜詣債 1、8SOCOES ビス〔2−(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)
エチル〕スルホン Zarling、 f、LE、 、1980+ J、I
mmunol、+ 124+913〜920゜ 2、BS ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート5taro
s、 1982. Biochemistry、 21
.3950〜3955゜仇 1、 グルタルアルデヒド ^VrameaS+ 1969+ Immunoche
m、、 6 、43゜2、過ヨウ素酸酸化 Nakane及びKawai+ 1974+ J、ll
istochem、Cytochem、 4%、 10
84〜1091゜ 3、 カルボジイミド 共有結合の前記方法のうち、5PDPとの接合が好まし
い。
許第4,680,338号 二宜詣債 1、8SOCOES ビス〔2−(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)
エチル〕スルホン Zarling、 f、LE、 、1980+ J、I
mmunol、+ 124+913〜920゜ 2、BS ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート5taro
s、 1982. Biochemistry、 21
.3950〜3955゜仇 1、 グルタルアルデヒド ^VrameaS+ 1969+ Immunoche
m、、 6 、43゜2、過ヨウ素酸酸化 Nakane及びKawai+ 1974+ J、ll
istochem、Cytochem、 4%、 10
84〜1091゜ 3、 カルボジイミド 共有結合の前記方法のうち、5PDPとの接合が好まし
い。
EBM及びABMはまた、たとえば
(a)ビチオンを一方に及びアビジン(又はストレパビ
シン)を他方に付着し、(b)抗−抗体を一方に付着し
く次にこれは他方に結合する)、(c)プロティンAを
一方に付着しく次にこれは他方のFC部分を結合する)
、そして(d)糖を一方に及び対応するレクチンを他方
に付着することによって非共有結合され得る。
シン)を他方に付着し、(b)抗−抗体を一方に付着し
く次にこれは他方に結合する)、(c)プロティンAを
一方に付着しく次にこれは他方のFC部分を結合する)
、そして(d)糖を一方に及び対応するレクチンを他方
に付着することによって非共有結合され得る。
EBM及びABMを結合することにおいて、その結合特
性は、可能なかぎりほとんど変化せしめられるべきでな
いことが理解されるべきである。
性は、可能なかぎりほとんど変化せしめられるべきでな
いことが理解されるべきである。
立体障害を減じるためにEBMとABMとの間にスペー
サー成分を提供することが好都合である。
サー成分を提供することが好都合である。
EBM/ABM接合体は、キメラ抗体であり得る。
そのような接合体を構成する1つの方法は、次の通りで
ある: (a)ペプシン消化により、選択された抗体のF (a
b) tフラグメントを調製し;(b)前記選択された
抗体のPab ’フラグメントを調製するためにエルマ
ン試薬によりそのフラグメントを還元し、そして処理し
; (c)選択された特異的抗体又はi!訳された赤血球抗
体をチオール化し;そして (d)キメラ性抗−赤血球抗体−抗原特異的抗体接合体
を産生ずるためにエルマン試薬により処理されたFab
’フラグメントにチオール化されたFab ’フラグ
メントを結合せしめることを含んで成る。
ある: (a)ペプシン消化により、選択された抗体のF (a
b) tフラグメントを調製し;(b)前記選択された
抗体のPab ’フラグメントを調製するためにエルマ
ン試薬によりそのフラグメントを還元し、そして処理し
; (c)選択された特異的抗体又はi!訳された赤血球抗
体をチオール化し;そして (d)キメラ性抗−赤血球抗体−抗原特異的抗体接合体
を産生ずるためにエルマン試薬により処理されたFab
’フラグメントにチオール化されたFab ’フラグ
メントを結合せしめることを含んで成る。
もう1つの方法が下記に示される:
(a)高分子生合成の異なった部位−特異性不可逆阻害
剤により、抗−赤血球モノクローナル抗体産生ハイプリ
ドーマ及び抗原特異性モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマを処理し;(b)2種の異なったモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマとポリエチレングリコールとを
融合し; (c)その融合された細胞を、軟アガロース中において
又は限界希釈法のいづれかによりクローン化し; (d)キメラ性抗−赤血球抗体−抗原特異的抗体を分泌
するクローン化された異種ハイブリドーマを、抗体に対
して適切なスクリーニングアッセイにより選択すること
を含んで成る。
剤により、抗−赤血球モノクローナル抗体産生ハイプリ
ドーマ及び抗原特異性モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマを処理し;(b)2種の異なったモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマとポリエチレングリコールとを
融合し; (c)その融合された細胞を、軟アガロース中において
又は限界希釈法のいづれかによりクローン化し; (d)キメラ性抗−赤血球抗体−抗原特異的抗体を分泌
するクローン化された異種ハイブリドーマを、抗体に対
して適切なスクリーニングアッセイにより選択すること
を含んで成る。
好ましくは、阻害剤は、エメチン、アクチノマンシンD
1ヒドロキシ尿素、ウヮバイン、シクロへキシミド、ニ
シン及びスパルソマイシンかう成る群から選択される。
1ヒドロキシ尿素、ウヮバイン、シクロへキシミド、ニ
シン及びスパルソマイシンかう成る群から選択される。
キメラ抗体は、2つの半分子であり、1つは赤血球(E
B M)に対する特異性を有し、そして他方は分析物
(ABM)に対する特異性を有する。
B M)に対する特異性を有し、そして他方は分析物
(ABM)に対する特異性を有する。
この場合、抗体のジスルフィド結合が、接合体を形成す
るためにABMをEBMに結合せしめる。
るためにABMをEBMに結合せしめる。
他方、前記2つの半分子は、分析物の同じ又は異なった
エピトープに対して特異的であり得る。この2番目の場
合、キメラ抗体は実際に2つのABMであり、そして3
分節接合体を形成するためにEBMに結合されるべきで
ある。3分節接合体は、他の手段、たとえばEBM及び
2つのABMを高分子スペーサーに付着することによっ
て形成され得る。
エピトープに対して特異的であり得る。この2番目の場
合、キメラ抗体は実際に2つのABMであり、そして3
分節接合体を形成するためにEBMに結合されるべきで
ある。3分節接合体は、他の手段、たとえばEBM及び
2つのABMを高分子スペーサーに付着することによっ
て形成され得る。
考えられる最も単純な凝集試薬は、1つのABMへの1
つのEBMの単一接合体を含んで成るものである。この
試薬は、反復エピトープを存する抗原の検出のために適
切である。
つのEBMの単一接合体を含んで成るものである。この
試薬は、反復エピトープを存する抗原の検出のために適
切である。
2つの抗体分子の同時結合を可能にするのに十分に大き
な抗原分析物(反復エピトープを欠く)が知られている
。それらは、多くのペプチド及びタンパク質ホルモンを
含む。凝集が生じるためには、抗原は、抗原の少なくと
もいくつかの分子が隣接する赤血球の間に架橋として作
用するように試薬と相互反応すべきである。そのような
分析物をアッセイするためには、複数の種々の接合体、
すなわちABMI/EBM +ABM2/EBM(ここ
で八BMI及び八BM2は、分析物の種々の非オーバー
ラフピングエピトーブに結合する)を含む試薬を使用す
ることが好ましい。その代わりにより複雑な単一接合体
、すなわちABMI/ABM2/EBM(ここでその立
体化学は、同じ分析物分子への同じ接合体分子上の両A
BMの結合に関与しそうもない)を使用することができ
る。
な抗原分析物(反復エピトープを欠く)が知られている
。それらは、多くのペプチド及びタンパク質ホルモンを
含む。凝集が生じるためには、抗原は、抗原の少なくと
もいくつかの分子が隣接する赤血球の間に架橋として作
用するように試薬と相互反応すべきである。そのような
分析物をアッセイするためには、複数の種々の接合体、
すなわちABMI/EBM +ABM2/EBM(ここ
で八BMI及び八BM2は、分析物の種々の非オーバー
ラフピングエピトーブに結合する)を含む試薬を使用す
ることが好ましい。その代わりにより複雑な単一接合体
、すなわちABMI/ABM2/EBM(ここでその立
体化学は、同じ分析物分子への同じ接合体分子上の両A
BMの結合に関与しそうもない)を使用することができ
る。
ハ血F′ −ア・・セイ
直接的及び間接的再凝集アッセイは、当業界に既知であ
る。抗原に対する従来の直接的アッセイにおいては、赤
血球細胞は抗体により被覆され、そしてサンプルと反応
せしめられる。多官能価抗原は、被覆された赤血球細胞
の間で架橋として作用し、凝集体を創造する。従来の間
接的アッセイにおいては、赤血球細胞は、抗原により被
覆され、そして可溶性抗体及びサンプルの両者と接触さ
れる。サンプル抗原は、感作化された赤血球細胞の結合
を抗体により、及び従って凝集を競争的に阻害する。抗
体−感作されたRBCをさらに使用することも可能であ
る。Mochida、アメリカ特許第4.308.02
6号を参照のこと。
る。抗原に対する従来の直接的アッセイにおいては、赤
血球細胞は抗体により被覆され、そしてサンプルと反応
せしめられる。多官能価抗原は、被覆された赤血球細胞
の間で架橋として作用し、凝集体を創造する。従来の間
接的アッセイにおいては、赤血球細胞は、抗原により被
覆され、そして可溶性抗体及びサンプルの両者と接触さ
れる。サンプル抗原は、感作化された赤血球細胞の結合
を抗体により、及び従って凝集を競争的に阻害する。抗
体−感作されたRBCをさらに使用することも可能であ
る。Mochida、アメリカ特許第4.308.02
6号を参照のこと。
本発明の試薬は、直接的又は間接的凝集アッセイのいづ
れかに使用され得る。しかしながら、従来のアッセイと
は異なって、抗体又は抗原により赤血球を前もって被覆
することが必要でない。むしろ、本発明の試薬は、内因
性赤血球を含む血液サンプルに添加され得、この上それ
は細胞を感作し、それらをサンプル分析物に結合できる
ようにしく直接的アッセイ)又は可溶性分析物−結合分
子分析物−結合分子のためにサンプル分析物と競争でき
るようにする(間接的アッセイ)。
れかに使用され得る。しかしながら、従来のアッセイと
は異なって、抗体又は抗原により赤血球を前もって被覆
することが必要でない。むしろ、本発明の試薬は、内因
性赤血球を含む血液サンプルに添加され得、この上それ
は細胞を感作し、それらをサンプル分析物に結合できる
ようにしく直接的アッセイ)又は可溶性分析物−結合分
子分析物−結合分子のためにサンプル分析物と競争でき
るようにする(間接的アッセイ)。
いくつかの小さな循環分子、たとえば合成又は天然のス
テロイド、すなわちジゴキシン、テオフィリン、等、又
は悪用薬物、すなわちフェノバルビクール、カンナピノ
イド、オピオイド、等に関しては、問題の分析物は、架
橋及び続く赤血球の凝集を可能にするために、抗体結合
のための2つの必要な抗原エピトープ(又は他の結合分
子による認識のための他の“エピトーチ)を提供するに
は小さ過ぎるかも知れない。
テロイド、すなわちジゴキシン、テオフィリン、等、又
は悪用薬物、すなわちフェノバルビクール、カンナピノ
イド、オピオイド、等に関しては、問題の分析物は、架
橋及び続く赤血球の凝集を可能にするために、抗体結合
のための2つの必要な抗原エピトープ(又は他の結合分
子による認識のための他の“エピトーチ)を提供するに
は小さ過ぎるかも知れない。
小さな分子のアッセイに関しては、いづれか他の抗原を
モニターする薬物におけるように、凝集阻害アッセイが
好ましい。この場合、二段階試験が予定される。第1段
階は、非凝集EBMに結合された分析物又は分析物類似
体から成る試薬の添加であり、そして第2段階は、非接
合性ABMの添加であろう(それらの二段階は可逆的で
あり得る)。分析物が血液サンプル中に存在する場合、
EBM−分析物類似体接合体へのABMの特異的結合は
阻害され、凝集の損失を4かれる。さもなければ、凝集
が生じる。
モニターする薬物におけるように、凝集阻害アッセイが
好ましい。この場合、二段階試験が予定される。第1段
階は、非凝集EBMに結合された分析物又は分析物類似
体から成る試薬の添加であり、そして第2段階は、非接
合性ABMの添加であろう(それらの二段階は可逆的で
あり得る)。分析物が血液サンプル中に存在する場合、
EBM−分析物類似体接合体へのABMの特異的結合は
阻害され、凝集の損失を4かれる。さもなければ、凝集
が生じる。
用語“分析物類似体”とは、分析物、及びそのような結
合が分析物により競争的に阻害される場合、ABMによ
りまた特異的に結合される物質を含む。分析物類似体は
、分析物−結合抗体の抗原−結合部位に対して生じる抗
−イディオタイプ抗体である。
合が分析物により競争的に阻害される場合、ABMによ
りまた特異的に結合される物質を含む。分析物類似体は
、分析物−結合抗体の抗原−結合部位に対して生じる抗
−イディオタイプ抗体である。
直接的凝集アッセイによるそのような小さな分子、の検
出に関しては、少なくとも2つの特異的モツクローナル
抗体が使用され得る。小さな循環性抗原に直接的に結合
できる1つのモノクローナル抗体が、赤血球結合分子に
結合され得る。2番目のモノクローナル抗体は、上記接
合体及び分析物と共にインキュベートされ、そして前記
第1モノクローナル抗体のオーバーラツプ領域から成る
新しい抗原決定基、及び第1モノクローナル抗体が抗原
を結合する場合にのみ存在する抗原に結合することがで
きるであろう。従って、第2モノクローナル抗体は、赤
血球“架橋”として作用し、最終的に凝集の存在を可能
にする種々の赤血球細胞の間に架橋を引き起こす。もち
ろん、この方法はモノエピトープ分析物に限定されない
。
出に関しては、少なくとも2つの特異的モツクローナル
抗体が使用され得る。小さな循環性抗原に直接的に結合
できる1つのモノクローナル抗体が、赤血球結合分子に
結合され得る。2番目のモノクローナル抗体は、上記接
合体及び分析物と共にインキュベートされ、そして前記
第1モノクローナル抗体のオーバーラツプ領域から成る
新しい抗原決定基、及び第1モノクローナル抗体が抗原
を結合する場合にのみ存在する抗原に結合することがで
きるであろう。従って、第2モノクローナル抗体は、赤
血球“架橋”として作用し、最終的に凝集の存在を可能
にする種々の赤血球細胞の間に架橋を引き起こす。もち
ろん、この方法はモノエピトープ分析物に限定されない
。
立体化学的理由に関しては、単一の第二抗体分子が2種
の接合体二分析物複合体に同時に結合することは難しい
かも知れない。従って、第二抗体と赤血球結合分子とを
接合することが好ましい。
の接合体二分析物複合体に同時に結合することは難しい
かも知れない。従って、第二抗体と赤血球結合分子とを
接合することが好ましい。
サンプルが多くの試薬と共にインキュベートされるべき
であることを言及する場合、接触は、接触の特別な順序
又は期間に限定されないで、同時又は連続的であり得る
ことが理解されるべきである。
であることを言及する場合、接触は、接触の特別な順序
又は期間に限定されないで、同時又は連続的であり得る
ことが理解されるべきである。
マウスを、ヒト赤血球細胞により免疫化し、そしてモノ
クローナル抗体を、免疫化された動物の肺臓細胞とマウ
ス骨髄腫細胞とを融合することによって生成した。抗体
を回転凝集アッセイ及び酵素イムノアッセイの両者によ
りスクリーンし、ここでグリコホリンがマイクロタイタ
ープレートに結合された。回転凝集は、Wyatt &
5treet、 Au5t。
クローナル抗体を、免疫化された動物の肺臓細胞とマウ
ス骨髄腫細胞とを融合することによって生成した。抗体
を回転凝集アッセイ及び酵素イムノアッセイの両者によ
りスクリーンし、ここでグリコホリンがマイクロタイタ
ープレートに結合された。回転凝集は、Wyatt &
5treet、 Au5t。
J、Med、Lab、Sci+ 4 + 48〜50の
変法により行われた。
変法により行われた。
細胞培養物の上清液501tlを、マイクロタイタープ
レート中で1%赤血球細胞懸濁液50μlと混合した。
レート中で1%赤血球細胞懸濁液50μlと混合した。
この例のためには、グリコホリンを結合するが、しかし
凝集しない抗体が選択された。モノクローナル抗体及び
グリコホリンの反応を、酵素イムノアッセイにより決定
した。マイクロプレートを、lO賄/m1のヒトグリコ
ホリン(SigmaCat、No、G7389)により
被覆し、そして洗浄し、次にモノクローナル抗体の一連
の希釈溶液と共にインキュベートした。さらに洗浄した
後、結合された抗体の存在を、酵素ラベルされた抗−マ
ウス抗体の添加、続いて基質の添加により決定した。そ
の力価を、モノクローナル抗体の最も高い希釈溶液に対
して決定し、そしてそれはバックグラウンド上で1.0
00単位よりも高い^420読みを与えた。
凝集しない抗体が選択された。モノクローナル抗体及び
グリコホリンの反応を、酵素イムノアッセイにより決定
した。マイクロプレートを、lO賄/m1のヒトグリコ
ホリン(SigmaCat、No、G7389)により
被覆し、そして洗浄し、次にモノクローナル抗体の一連
の希釈溶液と共にインキュベートした。さらに洗浄した
後、結合された抗体の存在を、酵素ラベルされた抗−マ
ウス抗体の添加、続いて基質の添加により決定した。そ
の力価を、モノクローナル抗体の最も高い希釈溶液に対
して決定し、そしてそれはバックグラウンド上で1.0
00単位よりも高い^420読みを与えた。
384個のウェルのうち、40個ウェルの一次クローン
を選択した。これらは、陽性の回転凝集アッセイ、EI
Aに基づいてのグリコホリンに対する応答又は両者のい
ずれかを与えた。
を選択した。これらは、陽性の回転凝集アッセイ、EI
Aに基づいてのグリコホリンに対する応答又は両者のい
ずれかを与えた。
陰性 陽性 4
陽性 陽性 20
陽性 陰性 16
続く吸収研究が、抗体が赤血球細胞表面上に暴露された
グリコホリンドメインを認識することを確かめるために
行われた。
グリコホリンドメインを認識することを確かめるために
行われた。
腹水に対するスクリーニングアッセイの結果が下記に列
挙される: RAT 103/167 512000 <100
0 陽性RA? 30615 6400 102
4000 陽性RAT lc3/86 <100
0 1024000 陽性1?AT 381/17
2 256000 2000 陽性RAT 30
3/22 4000 1024000 陽性RA
T 3D5/61 128000 1024000
陽性RAT IA2/187 <1000
256000 gj 性RAT 2A2/
187 <1000 128000
陽 性RAT IA3/129 <1000 1
2800 弱いRAT IC415<1000
128000 11j% 性RAT 4C3
/13 < 1000 128000 陽性R
AT 3B1/To <1000 517000
11ji性RAT IC3/86を、ブダペスト条約
に基づいて、ATCC(An+erican Type
Cu1ture Co11ection+ 1230
11’arklawn Driven Rockvil
le MD+ 20852+ USA)に1988年9
月7日に寄託され、そして寄託番号G26.4.IC3
/86を得た。
挙される: RAT 103/167 512000 <100
0 陽性RA? 30615 6400 102
4000 陽性RAT lc3/86 <100
0 1024000 陽性1?AT 381/17
2 256000 2000 陽性RAT 30
3/22 4000 1024000 陽性RA
T 3D5/61 128000 1024000
陽性RAT IA2/187 <1000
256000 gj 性RAT 2A2/
187 <1000 128000
陽 性RAT IA3/129 <1000 1
2800 弱いRAT IC415<1000
128000 11j% 性RAT 4C3
/13 < 1000 128000 陽性R
AT 3B1/To <1000 517000
11ji性RAT IC3/86を、ブダペスト条約
に基づいて、ATCC(An+erican Type
Cu1ture Co11ection+ 1230
11’arklawn Driven Rockvil
le MD+ 20852+ USA)に1988年9
月7日に寄託され、そして寄託番号G26.4.IC3
/86を得た。
ハL且14匪Δ構盟
モノクローナル抗体を、ヒドロキシルアパタイトを充填
するクロマトグラフィーにより腹水から均質に精製した
(Stanker、 flH,、J、Immunol。
するクロマトグラフィーにより腹水から均質に精製した
(Stanker、 flH,、J、Immunol。
Methods 76、157.1985)。
fjI2−HIVペプチド−Ab A の3占暫ヒト免
疫欠損ウイルス(HIV −1)の流行は、主な全世界
の健康問題に成って来た。現在、この疾病のためb治療
又はワクチンはまた存在しない。感染された個人の診断
は、ウィルスの広がりを減じる試みにおける主要因子で
ある。さらに、血液生成物の汚染を防ぎ、そして個人の
健康を保護する必要性が、抗−HIV抗体の存在のため
の単純で、迅速で、安価な特定の試験についての需要を
高めて来た。
疫欠損ウイルス(HIV −1)の流行は、主な全世界
の健康問題に成って来た。現在、この疾病のためb治療
又はワクチンはまた存在しない。感染された個人の診断
は、ウィルスの広がりを減じる試みにおける主要因子で
ある。さらに、血液生成物の汚染を防ぎ、そして個人の
健康を保護する必要性が、抗−HIV抗体の存在のため
の単純で、迅速で、安価な特定の試験についての需要を
高めて来た。
抗−HIV抗体のための可能性ある検出システムを提供
するためには、患者自身の赤血球細胞の使用を行ってき
た。これは、ヒト赤血球細胞に対する非凝集性モノクロ
ーナル抗体を選択することによって達成されて来た。こ
の抗体と合成HIVペプチド抗原とを化学的に架橋する
ことは、この抗原に対する抗体の存在下で患者の赤血球
細胞の特異的凝集を可能にした。HIV−1のgp4t
(残基579〜602)に由来する合成ペプチド抗原
が、WellinHの方法(FEBS LETT、18
8:215 (1985))に基づいて選択され、そし
てAIDS患者のおよそ98%からの抗体により認識さ
れる主要エピトープどして同定される領域に一致する。
するためには、患者自身の赤血球細胞の使用を行ってき
た。これは、ヒト赤血球細胞に対する非凝集性モノクロ
ーナル抗体を選択することによって達成されて来た。こ
の抗体と合成HIVペプチド抗原とを化学的に架橋する
ことは、この抗原に対する抗体の存在下で患者の赤血球
細胞の特異的凝集を可能にした。HIV−1のgp4t
(残基579〜602)に由来する合成ペプチド抗原
が、WellinHの方法(FEBS LETT、18
8:215 (1985))に基づいて選択され、そし
てAIDS患者のおよそ98%からの抗体により認識さ
れる主要エピトープどして同定される領域に一致する。
(Wang?、C上、、Proc、Nat、Acad、
Sci、USA 83:6529 (1986))。
Sci、USA 83:6529 (1986))。
合成ペプチドを、製造工業により供給された二重結合循
環を用いるApplied BiosystemsのM
ode1430合成器の助けにより、Merrifie
ldの方法(17sHodges and Re Me
rrifield、 Anal、Biochem、65
゜241 (1975))を用いて合成した。N−t−
ブチルオキシカルボニルアミノ酸誘導体を、Prote
inResearch Foundation(大阪9
日本)から得た。側鎖の保護は、Applied Bi
osystemsにより供給されたものと同じであった
。但し、オメガ−NO□誘導体がアルギニンのために使
用されたことが異なる。
環を用いるApplied BiosystemsのM
ode1430合成器の助けにより、Merrifie
ldの方法(17sHodges and Re Me
rrifield、 Anal、Biochem、65
゜241 (1975))を用いて合成した。N−t−
ブチルオキシカルボニルアミノ酸誘導体を、Prote
inResearch Foundation(大阪9
日本)から得た。側鎖の保護は、Applied Bi
osystemsにより供給されたものと同じであった
。但し、オメガ−NO□誘導体がアルギニンのために使
用されたことが異なる。
鎖アセンブリイーを、ニンヒドリンを用いて調節した(
V 5arinなど、 、 Anal、Bioche
m、117+ 147(1981) )。アセンブリイ
ーされたペプチドを、同時に開裂し、そして10%(v
/v)アニソールを含む無水HFを用いて保護解除した
(JM Stewartand JD Young、
5olid Phase Peptide 5ynth
esis。
V 5arinなど、 、 Anal、Bioche
m、117+ 147(1981) )。アセンブリイ
ーされたペプチドを、同時に開裂し、そして10%(v
/v)アニソールを含む無水HFを用いて保護解除した
(JM Stewartand JD Young、
5olid Phase Peptide 5ynth
esis。
pp44及び66、 Wll Freeman+ Sa
n Francisco(1966)) aその粗ペプ
チドをジエチルエーテルにより沈殿せしめ、エチルアセ
テートにより洗浄し、そして0.1%(v/v)のトリ
フルオロ酢酸中、60%(v/v)アセトニトリルによ
り抽出した。合成ペプチドを、0.1%のトリフルオロ
酢酸中、0〜60%アセトニトリルのt 、 ooo−
グラジェントにより溶離する分離用逆相クロマトグラフ
ィー(Amicon Cr a樹脂、250A孔サイズ
、25X 400mm)により精製した。その合成ペプ
チドは、分析用逆相11PLCにより及び酸加水分解の
後、アミノ酸の定量分析により評価する場合、約95%
の純度であった。
n Francisco(1966)) aその粗ペプ
チドをジエチルエーテルにより沈殿せしめ、エチルアセ
テートにより洗浄し、そして0.1%(v/v)のトリ
フルオロ酢酸中、60%(v/v)アセトニトリルによ
り抽出した。合成ペプチドを、0.1%のトリフルオロ
酢酸中、0〜60%アセトニトリルのt 、 ooo−
グラジェントにより溶離する分離用逆相クロマトグラフ
ィー(Amicon Cr a樹脂、250A孔サイズ
、25X 400mm)により精製した。その合成ペプ
チドは、分析用逆相11PLCにより及び酸加水分解の
後、アミノ酸の定量分析により評価する場合、約95%
の純度であった。
10.、 ・”七人A b (RAT IC3/86)
の5PDPラベリ2久 13.8mg/mfのRAT IC3/86の0.25
−に、ジメチルホルムアミド中、2■/−の5PDP
I2.5mを添加し、そしてその反応を25℃で1時間
進行せしめた。反応されなかった5PDPを、5eph
adex G25を充填するゲル濾過により除去し、そ
して5popラベリングのレベル(1,4モル1モル)
を決定した。
の5PDPラベリ2久 13.8mg/mfのRAT IC3/86の0.25
−に、ジメチルホルムアミド中、2■/−の5PDP
I2.5mを添加し、そしてその反応を25℃で1時間
進行せしめた。反応されなかった5PDPを、5eph
adex G25を充填するゲル濾過により除去し、そ
して5popラベリングのレベル(1,4モル1モル)
を決定した。
2、 ペプチド3.2の5−
ペプチド3.2 (Hmの主なコートタンパク質の残
基579〜601に対応する配列RILAVERYLK
DQQLLG IWGCSGK)を、100mMのTr
is HCl、 1mMのEDT^(pH8,0)溶
液1rnl中に溶解し、そして40℃で45分間2−メ
ルカプトエタノール10I11と反応せしめた。その反
応を、三弗素酢酸(TFA)4滴及び水性0.1%TF
A1mZの添加により停止した。
基579〜601に対応する配列RILAVERYLK
DQQLLG IWGCSGK)を、100mMのTr
is HCl、 1mMのEDT^(pH8,0)溶
液1rnl中に溶解し、そして40℃で45分間2−メ
ルカプトエタノール10I11と反応せしめた。その反
応を、三弗素酢酸(TFA)4滴及び水性0.1%TF
A1mZの添加により停止した。
その混合物を、60%アセトニトリル、0.1%TFA
の溶液20m1により処理され、そして0.1%TFA
により平衡化されている5ep−pak(Waters
) C18カートリッジに適用した。その還元されたペ
プチドを、0.1%TFA20mlにより洗浄する前、
5ep−pakを通して2度循環せしめた。その還元さ
れたペプチドを、60%アセトニトリル、0.1%TF
Aの?容?a Z nJにより2度5ep−pakから
?8離した。そのサンプルを、結合する前、回転7発に
より乾燥せしめた。
の溶液20m1により処理され、そして0.1%TFA
により平衡化されている5ep−pak(Waters
) C18カートリッジに適用した。その還元されたペ
プチドを、0.1%TFA20mlにより洗浄する前、
5ep−pakを通して2度循環せしめた。その還元さ
れたペプチドを、60%アセトニトリル、0.1%TF
Aの?容?a Z nJにより2度5ep−pakから
?8離した。そのサンプルを、結合する前、回転7発に
より乾燥せしめた。
3、楳−企
ペプチドを、100mMのリン酸カリウム、100mM
の塩化ナトリウム及び4MのグアニジンH(Jを含む緩
衝液(pH7,4) 0.2mj中に溶解し、そして同
じ緩衝液(但しグアニジンHC&を含まない)中で、ラ
ベルされた抗体の5PDP 2.2■と共に混合した。
の塩化ナトリウム及び4MのグアニジンH(Jを含む緩
衝液(pH7,4) 0.2mj中に溶解し、そして同
じ緩衝液(但しグアニジンHC&を含まない)中で、ラ
ベルされた抗体の5PDP 2.2■と共に混合した。
そのフラスコを、25℃で一晩インキユベートした。
抗体の置換の程度は、接合体の溶解性に影響を与えた;
接合体1モル当たりペプチド20モルは不溶性に成った
。抗体1モル当たりペプチド5〜7モルの範囲が最適で
あった。赤血球細胞を結合する接合体の能力は、ウサギ
抗マウス抗体及びHI V陽性の完全な血液による凝集
試験を用いて調節された。
接合体1モル当たりペプチド20モルは不溶性に成った
。抗体1モル当たりペプチド5〜7モルの範囲が最適で
あった。赤血球細胞を結合する接合体の能力は、ウサギ
抗マウス抗体及びHI V陽性の完全な血液による凝集
試験を用いて調節された。
4、ゲ四r゛、・クロマトグーフィー
反応されなかったペプチド及び5pop副生成物をリン
酸緩衝溶液中、5uperose 6カラム(Phar
macia)を充填するゲル濾過クロマトグラフィーに
より除去し、そして抗体含有画分をプールし、そして保
存剤として0.01%のアジ化ナトリウムの添加の後、
4℃で保存した。
酸緩衝溶液中、5uperose 6カラム(Phar
macia)を充填するゲル濾過クロマトグラフィーに
より除去し、そして抗体含有画分をプールし、そして保
存剤として0.01%のアジ化ナトリウムの添加の後、
4℃で保存した。
5、7〜セイのための1弓のJl、I!−接合体2体積
と、Bundesen、 fih’、 、Vet。
と、Bundesen、 fih’、 、Vet。
Immun、、 Immunopath、 8,24
5〜260.1985に記載のようにして調製された非
関連モノクローナル抗体(Bruce 5 )の10n
v/if溶液1体積とを混合した。
5〜260.1985に記載のようにして調製された非
関連モノクローナル抗体(Bruce 5 )の10n
v/if溶液1体積とを混合した。
ヱ1」牝り1汰
アッセイのために、ヘパリン化された完全な血液10p
lを、ガラススライド上に置いた。試薬30Iを添加し
、そして混合した。そのスライド ”を3分までの
間、揺り動かし、そして凝集の存在又は不在が示された
。
lを、ガラススライド上に置いた。試薬30Iを添加し
、そして混合した。そのスライド ”を3分までの
間、揺り動かし、そして凝集の存在又は不在が示された
。
9種の独立したペプチド/抗体接合体が調製され、そし
て血漿陽性患者の赤血球細胞を凝集することにおいて活
性であることが見出された。活性接合体はまた、架橋剤
として、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシス
クシンイミドエステルを用いても調製された。
て血漿陽性患者の赤血球細胞を凝集することにおいて活
性であることが見出された。活性接合体はまた、架橋剤
として、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシス
クシンイミドエステルを用いても調製された。
結果は、類似する抗原を用いる酵素イムノアッセイによ
り観察される結果に少なくとも正確に匹敵した(第1表
)。
り観察される結果に少なくとも正確に匹敵した(第1表
)。
血液サンプルの比較試験が、赤血球アッセイにより得ら
れる陽性物及び陰性物を確認するためにELIS^によ
り行われた。
れる陽性物及び陰性物を確認するためにELIS^によ
り行われた。
対照の血液サンプルは、ELISA陰性血液サンプル及
び感染された患者からのELISA陽性サンプルを含ん
で成る。)IrV陽性患者は、VictorianSt
ate Reference Laboratoryに
よりウェスターンプロットが陽性であることが確かめら
れた。フェアーフィールド病院の患者は、ウェスターン
プロット又はE I A (Abbot Labora
torieS)のいずれも陰性であった。血液供与者を
E I A (GeneticSystems)により
試験した。誤った陽性又は陰性値は、かっこ内に示され
、そしてEIA又はウェスターンプロット分析により確
認された。
び感染された患者からのELISA陽性サンプルを含ん
で成る。)IrV陽性患者は、VictorianSt
ate Reference Laboratoryに
よりウェスターンプロットが陽性であることが確かめら
れた。フェアーフィールド病院の患者は、ウェスターン
プロット又はE I A (Abbot Labora
torieS)のいずれも陰性であった。血液供与者を
E I A (GeneticSystems)により
試験した。誤った陽性又は陰性値は、かっこ内に示され
、そしてEIA又はウェスターンプロット分析により確
認された。
凝集試験 EIA試験
+ve −ve +ve −νe旧
V +ve患者 42 (1)
43 0フエアーフイールド病院の患者 (3)
63 0 66健康な血液供与者
(1) 873 (2) 872試験の特異性
を評価するために、HIV−1エンベロープタンパク質
の他の領域に対応する一連の合成ペプチドを、WAN反
応を阻害するそれらの能力について試験した(第2表)
。非関連ペプチドは競争せず、そして必須カルボキシ末
端エビ+−−ブ領域を欠く合成gp41フラグメント、
すなわち残基572〜591は、凝集を阻害しなかった
。合成遊雛抗原による凝集の阻害は、時おりの弱い陽性
サンプルを(il i=することにおいて有用であった
。合成ペプチドの添加が凝集を阻害しそこなう場合、そ
れは抗−赤血球細胞抗体に関連する誤った陽性を示すで
あろう。
V +ve患者 42 (1)
43 0フエアーフイールド病院の患者 (3)
63 0 66健康な血液供与者
(1) 873 (2) 872試験の特異性
を評価するために、HIV−1エンベロープタンパク質
の他の領域に対応する一連の合成ペプチドを、WAN反
応を阻害するそれらの能力について試験した(第2表)
。非関連ペプチドは競争せず、そして必須カルボキシ末
端エビ+−−ブ領域を欠く合成gp41フラグメント、
すなわち残基572〜591は、凝集を阻害しなかった
。合成遊雛抗原による凝集の阻害は、時おりの弱い陽性
サンプルを(il i=することにおいて有用であった
。合成ペプチドの添加が凝集を阻害しそこなう場合、そ
れは抗−赤血球細胞抗体に関連する誤った陽性を示すで
あろう。
合成ペプチド(0,125ow/m/)を、完全な血液
の添加の前、接合された抗体に添加した。その凝集試験
を、上記のようにして行った。共通配列は下線が引かれ
る。
の添加の前、接合された抗体に添加した。その凝集試験
を、上記のようにして行った。共通配列は下線が引かれ
る。
添加された合成 凝集の
ペプチド(配列) 阻 害
な し O%gp
41 (579−601) RILAVERYLKD
OOLLGIWGC5GK 100%gp41 (5
72−591) GIKQLARILAVERYLK
ADOOO%gρ120(193−200) AST
TTNYT O%gp120(105−11
7) HBD夏l5IJDQSI、K
O%gp120
(101−118) VEQMIIEDIISLWD
O5LKP O%gp120(105−129)Y
”” HEDIISI、H5QSI、KPAVKLTP
LCVSY 0%3−キメ−−グjコホjン −−ヒ モノクローナル抗体RAT tc3/86 (抗−ヒト
赤血球細胞)及びDD −IC3/ 108 (Ryl
att、 次煮、、1983、 Thrombosis
Res、+ 31.767〜778に記載のような抗
−ヒトD−ダイマー)を、■ackmans4な−E、
、1981. Immunology、 15,42
9〜436による記載のようにしてペプシンにより消化
し、そしてTSK−3000SWカラムによるクロマト
グラフィーにより精製した。2■のRAT IC3/8
6を、0.1 Mの酢酸、70mMの塩化ナトリウムを
含む緩マ97液(pH3,5>中において1%W/−ペ
プシンにより45分間消化した。その間に、21T1g
のDO−IC3/108を、同じ緩衝液中において2時
間1%W/−ペプシンにより消化した。それらの反応を
、1.5 MのTrisの添加により停止し、pl+を
8に高めた。F (ab) tフラグメントを、TSK
−3000SWカラムによるゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより精製した F (ab) tの還元及びFabフラグメントの続く
ブロッキングを、8rennan、 ft、、 −、1
985+ 5cience229、81〜83に記載の
ようにして行った。3■/−のF (ab) ttPJ
製物を、10n+Hの亜砒酸ナトリウムの存在下で、1
6時1u125℃で1mMのメルカプトエチルアミンに
より処理した。Fabフラグメントを、5.5′−ジチ
オビス(2−二トロ安息香酸) (El1man試薬)
により25℃で3時間反応せしめることにより安定化し
た。次に、Fabフラグメントを、TSK −3000
SI4カラムによるゲル濾過クロマトグラフィーにより
精製した 口D−IC3/10Bのチオール形を、25℃で30分
間の10mMのメルカプトエチルアミンによる反応によ
り再生した。過剰の試薬を、TSK −3000SWカ
ラムによるゲル濾過クロマトグラフィーにより除去した
。チオール00− IC3/10B及びEl1man試
薬により処理されたRATIC3/86の混合物を、B
rennan、などにより記載されているようにして2
5℃で16時間インキエベートした。最後に、キメラ抗
体を、↑Sに−30005−カラムによるゲル濾過クロ
マトグラフィーにより精製した。
41 (579−601) RILAVERYLKD
OOLLGIWGC5GK 100%gp41 (5
72−591) GIKQLARILAVERYLK
ADOOO%gρ120(193−200) AST
TTNYT O%gp120(105−11
7) HBD夏l5IJDQSI、K
O%gp120
(101−118) VEQMIIEDIISLWD
O5LKP O%gp120(105−129)Y
”” HEDIISI、H5QSI、KPAVKLTP
LCVSY 0%3−キメ−−グjコホjン −−ヒ モノクローナル抗体RAT tc3/86 (抗−ヒト
赤血球細胞)及びDD −IC3/ 108 (Ryl
att、 次煮、、1983、 Thrombosis
Res、+ 31.767〜778に記載のような抗
−ヒトD−ダイマー)を、■ackmans4な−E、
、1981. Immunology、 15,42
9〜436による記載のようにしてペプシンにより消化
し、そしてTSK−3000SWカラムによるクロマト
グラフィーにより精製した。2■のRAT IC3/8
6を、0.1 Mの酢酸、70mMの塩化ナトリウムを
含む緩マ97液(pH3,5>中において1%W/−ペ
プシンにより45分間消化した。その間に、21T1g
のDO−IC3/108を、同じ緩衝液中において2時
間1%W/−ペプシンにより消化した。それらの反応を
、1.5 MのTrisの添加により停止し、pl+を
8に高めた。F (ab) tフラグメントを、TSK
−3000SWカラムによるゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより精製した F (ab) tの還元及びFabフラグメントの続く
ブロッキングを、8rennan、 ft、、 −、1
985+ 5cience229、81〜83に記載の
ようにして行った。3■/−のF (ab) ttPJ
製物を、10n+Hの亜砒酸ナトリウムの存在下で、1
6時1u125℃で1mMのメルカプトエチルアミンに
より処理した。Fabフラグメントを、5.5′−ジチ
オビス(2−二トロ安息香酸) (El1man試薬)
により25℃で3時間反応せしめることにより安定化し
た。次に、Fabフラグメントを、TSK −3000
SI4カラムによるゲル濾過クロマトグラフィーにより
精製した 口D−IC3/10Bのチオール形を、25℃で30分
間の10mMのメルカプトエチルアミンによる反応によ
り再生した。過剰の試薬を、TSK −3000SWカ
ラムによるゲル濾過クロマトグラフィーにより除去した
。チオール00− IC3/10B及びEl1man試
薬により処理されたRATIC3/86の混合物を、B
rennan、などにより記載されているようにして2
5℃で16時間インキエベートした。最後に、キメラ抗
体を、↑Sに−30005−カラムによるゲル濾過クロ
マトグラフィーにより精製した。
基1紹U乱袈
0.1mg/mlのキメラ抗体2休積と、7.5mg/
mlの非関連モノクローナル抗体(Bruce 5 )
1体積とを混合した。
mlの非関連モノクローナル抗体(Bruce 5 )
1体積とを混合した。
ヱヱ皇土方失
アッセイのために、ヘパリン化された完全な血液10u
1をガラススライド上に置いた。試薬30Iを添加し、
そして混合せしめた。スライドを3分間振動せしめ、そ
してD−ダイマーの存在下で凝集を観察した。
1をガラススライド上に置いた。試薬30Iを添加し、
そして混合せしめた。スライドを3分間振動せしめ、そ
してD−ダイマーの存在下で凝集を観察した。
1)過ヨウ素Mill化されたジゴキシンの調製。
100mMの過ヨウ素酸ナトリウム2−を、ジゴキサン
(Sigma) 40 mgに滴下し、95%エタノ
ール2++tl中にg3し、そしてその反応を37℃で
30分間続けた。その反応を、エタンジオール60dの
添加により停止せしめた。最後に、シップ塩基中間体を
、40mFIのシスチンの添加(30分:37℃)及び
続く15■/miの水素化硼素ナトリウムl−による反
応(16時間:25℃)により安定化した。
(Sigma) 40 mgに滴下し、95%エタノ
ール2++tl中にg3し、そしてその反応を37℃で
30分間続けた。その反応を、エタンジオール60dの
添加により停止せしめた。最後に、シップ塩基中間体を
、40mFIのシスチンの添加(30分:37℃)及び
続く15■/miの水素化硼素ナトリウムl−による反
応(16時間:25℃)により安定化した。
2)シスチン/ジゴキシン接合体の還元。
シスチン/ジゴキシン接合体3mlを、メルカプトエタ
ノール40j11の添加により還元しく40分:37℃
)、そしてその生成物を、例1におけるペプチドの還元
について記載のようにしてWa tersSep−pa
k C113カートリツジによるクロマトグラフィーに
より精製した。回転蒸発の後、サンプルを、5PDPラ
ベルされたRAT IC3/86 (例1に記載のよう
にして510ピルジチオピリジン基/抗体によりラベル
されている(16時間:25℃)〕と反応せしめた。最
後に、ジゴキシン/抗体接合体を、5uperose1
2を充填するゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し
た。
ノール40j11の添加により還元しく40分:37℃
)、そしてその生成物を、例1におけるペプチドの還元
について記載のようにしてWa tersSep−pa
k C113カートリツジによるクロマトグラフィーに
より精製した。回転蒸発の後、サンプルを、5PDPラ
ベルされたRAT IC3/86 (例1に記載のよう
にして510ピルジチオピリジン基/抗体によりラベル
されている(16時間:25℃)〕と反応せしめた。最
後に、ジゴキシン/抗体接合体を、5uperose1
2を充填するゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し
た。
抗−HIV抗体のためのもう1つの試薬は、抗−グリコ
ホリン抗体のF (ab) z誘導体を使用する。
ホリン抗体のF (ab) z誘導体を使用する。
RAT IC3/86 (70mMの酢酸塩、100m
Mの塩化ナトリウム(pH3,5)中において2mg/
mりを、110l1/−のペプシン(Siga+a P
6887)により37℃で40分間消化し、そして反応
を、1.5MのTris塩基1塩基1体10体積により
停止せしめた。
Mの塩化ナトリウム(pH3,5)中において2mg/
mりを、110l1/−のペプシン(Siga+a P
6887)により37℃で40分間消化し、そして反応
を、1.5MのTris塩基1塩基1体10体積により
停止せしめた。
5mMのリン酸ナトリウムを含む緩衝液(pH8,0)
への−晩の透析の後、抗体フラグメントを、リン酸ナト
リ’y ム(pH8,0) (7) 5〜300mMグ
ラジェントに基づいて、DEARセルロースを充填する
イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
への−晩の透析の後、抗体フラグメントを、リン酸ナト
リ’y ム(pH8,0) (7) 5〜300mMグ
ラジェントに基づいて、DEARセルロースを充填する
イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
F (ab) tフラグメントの5PDPラベリング、
ペプチド3.2の還元、ペプチド3.2のF (ab)
z RAT IC3/86への接合、そのペプチド接
合体の精製、アッセイのための試薬の調製及び試験方法
を、完全な抗体接合体について記載のようにして行った
。
ペプチド3.2の還元、ペプチド3.2のF (ab)
z RAT IC3/86への接合、そのペプチド接
合体の精製、アッセイのための試薬の調製及び試験方法
を、完全な抗体接合体について記載のようにして行った
。
他の赤血球又は分析物結合抗体のF (ab) を接合
体を、同様にして調製し、そしてHI Vペプチド以外
の分子に結合することができる。
体を、同様にして調製し、そしてHI Vペプチド以外
の分子に結合することができる。
例6−HI■ペプチド/抗−グリコホリンFab’もう
1つの試薬は、EBMとして一価のFab ’フラグメ
ントを使用する。
1つの試薬は、EBMとして一価のFab ’フラグメ
ントを使用する。
リン酸緩衝溶液中、F (ab) 2 RAT IC3
/ 86を、室温で工時間、10mMのメルカプトエタ
ノールと共にインキュベートした。次に15mMのヨー
ドアセトアミドを添加し、そしてその反応を暗やみ中で
15分間進行せしめた。最後に、その反応を、リン酸緩
衝溶液100体積中への透析により停止せしめた。
/ 86を、室温で工時間、10mMのメルカプトエタ
ノールと共にインキュベートした。次に15mMのヨー
ドアセトアミドを添加し、そしてその反応を暗やみ中で
15分間進行せしめた。最後に、その反応を、リン酸緩
衝溶液100体積中への透析により停止せしめた。
S−カルボキシメチル化されたFab ’の5PDPラ
ベリング、ペプチド3.2の還元、ペプチド3.2のR
AT lc3/86のFab ’−TNB(チオニトロ
ベンゾイル”)RATフラグメントへの接合、そのペプ
チド接合体の精製、アッセイのための試薬の調製及び試
験方法を、完全な抗体接合体について記載したようにし
て行った。
ベリング、ペプチド3.2の還元、ペプチド3.2のR
AT lc3/86のFab ’−TNB(チオニトロ
ベンゾイル”)RATフラグメントへの接合、そのペプ
チド接合体の精製、アッセイのための試薬の調製及び試
験方法を、完全な抗体接合体について記載したようにし
て行った。
7−゛ のEB、Mとしてのメツチンの与・11、ハ
チの毒からのペプチド、すなわちメリチン(CVLTT
GLPALISWIKRKRQQ)を、赤血球結合性モ
ノクローナル抗体に代わるものとして使用した。このペ
プチドは、細胞を溶解しないで赤血球表面に結合する(
Degrado WF+ Kezdy 、FJ+ Ka
iser ET、J、Am。
チの毒からのペプチド、すなわちメリチン(CVLTT
GLPALISWIKRKRQQ)を、赤血球結合性モ
ノクローナル抗体に代わるものとして使用した。このペ
プチドは、細胞を溶解しないで赤血球表面に結合する(
Degrado WF+ Kezdy 、FJ+ Ka
iser ET、J、Am。
Chem、Soc、1981; 103 ; 679〜
81) 、そのペプチドを、Merrifieldの方
法(lodges、 Merrifield、Anal
。
81) 、そのペプチドを、Merrifieldの方
法(lodges、 Merrifield、Anal
。
Biochem、1975; 65; 241)により
合成した。
合成した。
EBMとしてメリチンを使用することの1つの利点は、
それが及びペプチドタイプABMが単一の単位として合
成され得ることである。
それが及びペプチドタイプABMが単一の単位として合
成され得ることである。
ABM及びEBMは、共有結合される必要はない。1つ
の代用手段は、アビジン−ビオチン結合である。
の代用手段は、アビジン−ビオチン結合である。
ビオチンによ −ベル たメツチンの8.制メリチン
ペプチド(10g)を、例1における3、2ペプチドに
ついて記載しているようにしてメルカプトエタノールに
より還元した。回転蒸発した後、サンプルを0.1 M
のTris−11C1,5mMのIEDT八(pl!3
.0)の溶液2−中に再!課濁し、そしてN−ヨードア
セチル−N−ビチオニルへキシレンジアミン(Pier
ce) 4.3■を含むジメチルスルホキシド(DMS
O) 1 mZと反応せしめた。これを室温で15分間
反応せしめ、そしてビチオニル化された誘4体を、5e
phadex GIOカラムにより副生成物から分離し
た。
ペプチド(10g)を、例1における3、2ペプチドに
ついて記載しているようにしてメルカプトエタノールに
より還元した。回転蒸発した後、サンプルを0.1 M
のTris−11C1,5mMのIEDT八(pl!3
.0)の溶液2−中に再!課濁し、そしてN−ヨードア
セチル−N−ビチオニルへキシレンジアミン(Pier
ce) 4.3■を含むジメチルスルホキシド(DMS
O) 1 mZと反応せしめた。これを室温で15分間
反応せしめ、そしてビチオニル化された誘4体を、5e
phadex GIOカラムにより副生成物から分離し
た。
アビジンによ −ベル れたペプチド3.2の討製3.
2ペプチドを、それが例1において抗体に結合されたの
と同じ態様でアビジンに結合する。
2ペプチドを、それが例1において抗体に結合されたの
と同じ態様でアビジンに結合する。
アッセイ
アビジンによりラベルされたペプチドの半凝集投与量を
赤血球細胞に添加する。
赤血球細胞に添加する。
庄−玉
アビシン化され且つビチオニル化された分子は、交換さ
れ得ることが理解されるであろう。
れ得ることが理解されるであろう。
第1図は、それぞれ抗原の存在及び不在下で抗体複合体
による陽性及び陰性の凝集結果を示す赤血球の図的な表
示である。 第2図は、それぞれ抗−抗原抗体の存在及び不在下で抗
体及び抗原の複合体による陽性及び陰性の凝集結果を示
す赤血球の図的な表示である。 第3図は、分析物又は抗原の存在により(a)赤血球凝
集及び(b)赤血球凝集の阻害を示す図的な表示である
。 第4図は、オーバーランピング抗原アッセイと共に凝集
/非凝集の機構を示す図的な表示である。
による陽性及び陰性の凝集結果を示す赤血球の図的な表
示である。 第2図は、それぞれ抗−抗原抗体の存在及び不在下で抗
体及び抗原の複合体による陽性及び陰性の凝集結果を示
す赤血球の図的な表示である。 第3図は、分析物又は抗原の存在により(a)赤血球凝
集及び(b)赤血球凝集の阻害を示す図的な表示である
。 第4図は、オーバーランピング抗原アッセイと共に凝集
/非凝集の機構を示す図的な表示である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、分析物であるかもしくは該分析物と交差反応可能な
化合物である別の作用物質の不存在において、予め定め
られた条件の下で赤血球との凝集物を生成することがで
きない赤血球結合分子の接合体と、前記分析物に関して
アッセイ中で使用するための分析物結合分子とを含む凝
集試薬であって、前記予め定められた条件が前記アッセ
イの条件であり、前記アッセイが、前記分析物及び赤血
球に対する結合をひきおこして凝集を惹起するかもしく
は分析物に関して、前記分析物と交差反応可能な試薬へ
の結合を防止して凝集を阻止するのに十分な時間にわた
って血液サンプルを前記試薬とともにインキュベーショ
ンすることを含む、凝集試薬。 2、前記赤血球結合分子が、抗−赤血球抗体、又はその
F(ab)_2又はFab′フラグメントあるいはメリ
チン又はその特異的結合フラグメントである、請求項1
に記載の試薬。 3、前記抗体又はそのF(ab)_2又はFab′フラ
グメントがグリコホリンA、グリコホリンB、膜内在性
タンパク質1、膜結合糖タンパク質C4、膜内在性糖タ
ンパク質、アンキリン、スペクトリン、糖脂質、スフィ
ンゴ糖脂質、プロテイン4−1又はF−アクチンに対し
て生ぜしめられる、請求項2に記載の試薬。 4、前記抗体がRAT IC3/86又はそのF(ab
)_2又はFab′フラグメントである、請求項3に記
載の試薬。 5、抗−赤血球抗体に由来する一価のフラグメント及び
抗−分析物抗体に由来する一価の分析物結合分子の異種
二官能価ハイブリッド抗体接合体を含む、請求項1〜4
のいずれか1項に記載の試薬。 6、前記結合が共有結合の手段によるものである、請求
項1〜5のいずれか1項に記載の試薬。 7、前記分析物への前記分析物結合部分の結合により形
成されるオーバーラップ性エピトープを特異的に認識す
る第2抗体又はその特異的な結合フラグメントをさらに
含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の試薬。 8、前記分析物結合分子がHIV−1ペプチド又は肝炎
ウィルスペプチド、ジゴキシン、又はヒトD−ダイマー
、成長ホルモン又は肝炎ウィルスに対して生ぜしめられ
た抗体又はそのF(ab)_2又はFab′フラグメン
ト又は抗−イディオタイプ抗体である、請求項1〜7の
いずれか1項に記載の試薬。 9、前記分析物結合分子が本文に規定せるペプチド3.
2である、請求項8に記載の試薬。 10、請求項1〜9のいずれか1項に記載の凝集試薬と
既知性質の分析物を含有する対照溶液とを含んでなる凝
集アッセイ試験キット。 11、分析物であるかもしくは該分析物と交差反応可能
な化合物である別の作用物質の不存在においてアッセイ
の条件の下で赤血球との凝集物を生成することができな
い赤血球結合分子の接合体と、分析物結合分子とを試薬
として用いた分析物測定のためのアッセイであって、前
記接合体及び任意の追加の試薬を血液とともに、前記分
析物及び赤血球に対する結合をひきおこして凝集を惹起
するかもしくは分析物に関して、前記分析物と交差反応
可能な試薬への結合を防止して凝集を阻止するのに十分
な時間にわたってインキュベートすることを含んでなる
アッセイ。 12、分析物結合部分の分析物に対する結合によって生
成せしめられた新しいエピトープに結合する第2抗体を
添加することをさらに含む、請求項11に記載のアッセ
イ。
Applications Claiming Priority (10)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AUPI440087 | 1987-09-17 | ||
US11131387A | 1987-10-22 | 1987-10-22 | |
US111313 | 1987-10-22 | ||
AUPI501887 | 1987-10-22 | ||
AU5018 | 1987-10-22 | ||
US07/143,343 US4894347A (en) | 1987-09-17 | 1988-01-13 | Erythrocyte agglutination assay |
US4400 | 1988-01-13 | ||
AU4400 | 1994-03-11 | ||
US5018 | 2001-12-04 | ||
US143343 | 2002-05-10 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01153960A true JPH01153960A (ja) | 1989-06-16 |
JP2553159B2 JP2553159B2 (ja) | 1996-11-13 |
Family
ID=27424223
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63231517A Expired - Fee Related JP2553159B2 (ja) | 1987-09-17 | 1988-09-17 | 赤血球凝集アッセイ |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0308242B1 (ja) |
JP (1) | JP2553159B2 (ja) |
AT (1) | ATE116740T1 (ja) |
DE (1) | DE3852683T2 (ja) |
DK (1) | DK519388A (ja) |
ES (1) | ES2070129T3 (ja) |
IL (1) | IL87768A (ja) |
NO (1) | NO175024C (ja) |
NZ (1) | NZ226202A (ja) |
OA (1) | OA08953A (ja) |
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JP2017008046A (ja) * | 2010-08-10 | 2017-01-12 | エコール・ポリテクニーク・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ(ウペエフエル)Ecole Polytechnique Federale de Lausanne (EPFL) | 赤血球結合療法 |
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-
1988
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- 1988-09-15 IL IL8776888A patent/IL87768A/en active Protection Beyond IP Right Term
- 1988-09-15 OA OA59432A patent/OA08953A/xx unknown
- 1988-09-16 EP EP88308590A patent/EP0308242B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-16 NO NO884131A patent/NO175024C/no unknown
- 1988-09-16 DE DE3852683T patent/DE3852683T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-16 AT AT88308590T patent/ATE116740T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-09-16 ES ES88308590T patent/ES2070129T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-16 DK DK519388A patent/DK519388A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-09-17 JP JP63231517A patent/JP2553159B2/ja not_active Expired - Fee Related
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