JPH01153960A - 赤血球凝集アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、赤血球凝集によりヒト又は動物の血液中の抗
原、抗体又は他の分析物を検出するための試薬及び方法
に関する。本発明はまた、試薬を含むキット及びその試
薬の調製法にも関する。

〔発明の背景〕

特定の抗原又は抗体のための血液サンプルをアッセイす
ることは、アッセイする前、遠心分離及び／又は凝固す
ることにより血液の血清成分から細胞成分を分離する段
階を従来含む。

これは、いくつかの潜在的な問題を提示する。

第１に、そのようなアッセイは、フィールド条件下で行
われる試験には適切でない。多くの獣医によれば、フィ
ールドでの敏速な試験が、分離及びアッセイのために実
験室にサンプルを輸送する手段よりも所望される。また
、遠心機を持たない獣医は、怒染性物質、たとえばイヌ
糸状虫の存在のために血液サンプルを時々アッセイする
必要がある。さらに、第■世界における病気の検出のた
めに使用されるアッセイは、単純性及び低費用性が不可
欠なものである状況を示す。

第２に、ある病理学的条件においては、血液サンプルの
分ｇＩが困Ｗｌになる。ヴアルデンストームマクログロ
プリン血病症の患者から採取される血液は、完全なｌｌ
ｌ１液に対して行われ得るアッセイをひじょうに所望す
るものにする細胞画分及び血清に分離することが困難で
ある。

第３に、血液サンプルは、しばしば高い惑染性且つ潜在
的に危険な疾病状態の存在についての試験のために使用
される。これらの場合、アッセイを行う人々への危険性
を最少にするために、できるだけ少ない操作及び加工で
サンプルを処理することが好ましい。さらに、ある条件
は、オバーザーカウンターフィンガープリックアッセイ
（ｏｖｅｒ−ｔｈｅ−ｃｏｕｎｔｅｒ　ｆｉｎｇｅｒ−
ｐｒｉｃｋ　ａｓｓａｙ）の手段をひじょうに所望する
ものにする。そのようなアッセイは、必然的に完全な血
液に対する実施を適切なものにするにちがいない。

たとえばラジオイムノアッセイ　（Ｙａｌｏｗ　ａｎｄ
Ｂｅｒｓｏｎ　（１９５９）　Ｎａｔｕｒｅ　１８４．
１６４８により初めに報告された）及び酵素イムノアッ
セイ又はＥＩＡ（Ｅｎｇｖａｌｌ　ａｎｄ　Ｐｅｒｌｍ
ａｎ　（１９７１）　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ　８　。

８７１及びＶａｎ　Ｗｅｅｎａｎ　ａｎｄ　５ｃｈｕｎ
ｒｓ　（１９７１）　ＦＥＲＳＬｅｔｔｅｒｓ　１５．
２３２により最初に報告された〕の技法の紹介以来、イ
ムノアッセイは、ヒトの診断及び獣医学に新風を引き起
こして来た。

そのようなアッセイは、抗体−抗原の相互作用に基づか
れているが、使用される検出システムは通常、複雑であ
る。使用される試薬は一般的に酵素又は放射性ラベルさ
れた抗原、抗体又はその複合体であり、それらは、試験
されるべき分析物の存在を検出するために、特定の基質
とのインキュベーション及び視覚的に又は比色分析によ
る色のエンドポイントの測定、又は放射線カウンターに
よる放射性壊変の測定のいずれかを必要とする。

これらのアッセイはまた、いくつかの洗浄段階も含む。

血液中の分析物の検出のためのほとんどのイムノアッセ
イは、−ｉ的に自然界の力によるものである。従って、
これらのアッセイは敏感であるけれども、それらは、試
験下での分析物の検出のために、長い時間を必要とし、
そして高価な装置を必要とする工程を含む。

これらのア・νセイに代わるものとして、ＧｕｐＬａ、
星＆＊　、（１９８５）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ　３０１７７〜
１８７により記載のタイプのイムノアッセイが提供され
る。これらは、赤血球及び抗−赤血球抗体が指示器シス
テムに使用されるイムノアッセイである。これらのアッ
セイにおいては、外因性赤血球、たとえば羊赤血球が使
用される。

最近、ラテックスビーズに抗体を接触し、従って急速な
凝集アッセイを提供することが可能になって来た。しか
しながら、これはまだ細胞用からの血清／血漿相の分離
を伴い、そして従って遠心機又は濾過システムの使用を
必要とする。ラテックス凝集アッセイは、Ｍｅｒｓｋｅ
ｙｓ　ｆｔＨ＋　、Ｐｒｏｃ。

Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、（１９６９）、　
１３１．８７１；　Ｃａ５ｔｅｌｏｎ　。

ｆＬ＆、　、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、（１９６Ｂ
）、　２１．６３８；及びＳｉｎｇｅｒ−＆　ＰＩｏＬ
ｚ　ＡＭ、Ｊ、Ｍｅｏｌ、　　（１９５６（１２月）〕
。

８８８に記載される。

直接的及び間接的凝集イムノアッセイは、当業界で良く
知られている。これらのアッセイにおいて、抗原又は抗
体が結合される粒子の凝集を用いて、その対応する抗体
又は抗原の存在又は不在を指摘する。種々の粒子、たと
えばラテ・７クス、木炭、カオリナイト又はベントナイ
トの粒子、及び微生物細胞及び赤血球細胞の両者が凝集
可能なキャリヤー止して使用された。アメリカ特許節４
．３０８，０２６号（モチダによる）を参照のこと。指
示粒子としての赤血球の使用は、Ｐａｔｅｌ（アメリカ
特許節３，８８２，２２５号）により強く批評されてい
て、そして彼は、指示赤血球を標準化することは難しい
ことを言及する。

Ｍｏ１ｉｎａｒｏ　（アメリカ特許節４．１３０．６３
４号）は、抗体被覆の赤血球細胞を使用する抗原につい
てのアッセイを記載する。彼は、赤血球に抗体を結合す
るために使用される方法は、抗体の反応性を破壊すべき
でないことを強張する。彼は、赤血球に対して特異的で
ある抗体がこのアッセイのために有用でないことを明確
にする。しかしながら、彼は、抗原に対して特異的な１
つの結合部位及び赤血球細胞に対して特異的の他の結合
部位を有するハイブリッド抗体を用いる可能性を言及す
る。

Ｃｈａｎｇ　（アメリカ特許節４，４３３．０５９号）
は、２種の抗体が“テイルーツウーテイル”、すなわち
それらの特異性を変えないように共有結合される凝集イ
ムノアッセイ試薬を開示する。１つの抗体は、指示物質
、たとえば赤血球により担持される抗体に対して特異的
である。この抗体は好ましくは、非特異的な凝集を避け
るために一価である。他の抗体は二価であり、そして分
析物に対して特異的である。アッセイのための用意にお
いては、新−ｔな赤血球が接合体により被覆される。次
に、二重の抗体接合体被覆のＲＢＣが試験血清と共にイ
ンキュベートされる。Ｃｈａｎｇは、非凝集性抗−ＲＢ
Ｃ抗体及び内因性赤血球を用いての完全な血液サンプル
のアッセイを考慮しない。

Ｃｈｕ（アメリカ特許節４．４９３．７９３号）は、レ
クチン−抗体又はレクチン−抗原共有結合性接合体の構
成を開示する。彼の第１表（引用により組込まれている
）は、いくつかのレクチンの炭水化物特異性を示す。彼
は、レクチン又は抗体受容体のいずれかを通しての赤血
球へのそのような接合体の結合を教授しない。

他の“テイルーツウーテイル”免疫学的接合体は知られ
ている。Ｓｅｇａ　ｌ　（アメリカ特許筒４，６７６；
９８０号）は、標的細胞表面特異的抗体及び細胞素性エ
フェクター細胞受容体特異的抗体の“テイルーツウーテ
イル”接合体の１１４成を示す。いくつかの架矯法（引
用により導入される）が記載される。この接合体は、免
疫療法の使用に向けられ、ここでそれは患者の細胞免疫
系による標的細胞の分解を引き起こすであろう。もちろ
ん、標的細胞は、宿主に対して内因性の赤血球ではない
であろう。

Ｌｉ　（アメリカ特許筒４．（ｉ６１，４４４号）は、
第１抗体のイディオタイプに対して特異的な抗体及び分
析物結合抗体のテイルーツウーテイル接合体の製造を示
唆する。この接合体は、イムノアッセイにおいて、不溶
化された分析物結合抗体と一緒に使用されるべきであっ
た。

Ｗａｒｄｌａｗ（アメリカ特許筒４，６９５，５５３号
）は、遠心骨■された完全な血液における赤血球細胞と
白血球細胞との間の界面を明確にするためにＲＢＣ凝集
剤として一般的な赤血球抗原に対するモノクローナル抗
体の使用を教授する。彼は、グリコホリンスはＨ抗原に
対する抗体の使用を提起するのみならず、またレクチン
の混合物の使用の可能性も記載する。Ｇｕｅｓｄｏｎ　
（アメリカ特許筒４，６６８，６３７号）は、赤血球吸
着の目的のために抗−赤血球細胞抗体又はレクチンの使
用を論議する。１３ｔｇｂｅｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　２０；　Ｌ３５３〜１３６２
（１９８３））は、グリコホリンＡに対する４種のモノ
クローナル抗体の産生及び試験を記載する。対象（微生
物）の分析物のクラスのすべてのメンバーの間に共有さ
れる抗原決定基と反応する抗体をイムノアッセイで使用
する一般的な概念が、ＭｃＬａｕｇｈ　１　ｉ　ｎ　ｓ
アメリカ特許第４．６８３．１９６号に示される。

多（の特許が、血液型判定に有用な抗体を取り扱う、、
Ｌｌｏｙｄ、アメリカ特許筒４．６１８．７４１号；Ｇ
ｒａｈａｍ、　Ｊｒ、　、アメリカ特許筒４，３５８，
４３６号；Ｌｉｕ　％アメリカ特許第４．５５０，０１
７号；　Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ。

アメリカ特許筒４，６０７，００９号；　Ｌｅｎｎｏｘ
、　ＷＯ３３１０３４７７を参照のこと。これらの抗体
は、それらがある血液細胞集団においてのみ見出される
抗原に結合するので、血液型判定のために有用であるが
、ところが本発明の目的のためには、本質的にすべての
赤血球に対して結合する抗体（又はその混合物）を使用
することが所望される。

Ｚｕｋ（アメリカ特許筒４，５９４，３２７号）は、完
全な血液サンプルに対する直接的イムノアッセイの実施
の望ましいことを認識する。この方法においては、サン
プルが不溶性分析物特異的免疫試薬及び赤血球細胞結合
剤、たとえばＲＢＣ−特異的抗体又はレクチンの両者と
接触せしめられる。分析物特異的免疫試薬及びＲＢＣ結
合剤は一緒に結合されず、そしてそのσｎ示されたアッ
セイは凝集アッセイではない。

血液サンプルに内因性の抗−赤血球抗体による赤血球の
非特異的凝集の凝集イムノアッセイにおける問題は、Ｃ
ｚｉｓｍａｓ（アメリカ特許筒３，６３９，５５８号）
により示された。彼は、タンパク質による粒子の被覆に
よりその粒子上のすべての天然に存在する抗原性部位の
除去を提案した。

Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ　（アメリカ特許筒４，
３４２，５６６号）；Ｄｕｅｒｍｅｙｅｒ　（アメリカ
特許筒４，２９２．４０３号）及びＧｏｌｄｅｎｂｅｒ
ｇ　（アメリカ特許筒４，３３１．６４７号）は、アッ
セイにおける損なわれていない抗体のだめの置換体とし
て抗体の特異的結合フラグメントの使用を示す。異種二
官能価抗体の構成は、Ａｕｄｉｔｏｒｅ−１１ａｒｇｒ
ｅａｖｅｓ　（アメリカ特許筒４．４４６．２３３号）
：Ｐａｕｌｕｓ　（アメリカ特許筒４．４４４．８７８
号）：及びＲｅａｄｉｎｇ（アメリカ特許筒４，４７４
，８９３号）により教授される。Ｍｏｃｈｉｄａ（アメ
リカ特許筒４，２００，４３６号）は、あるイムノアッ
セイにおいて一価抗体又はその結合フラグメントの使用
を開示する。Ｆｏｒｒｅｓ　ｔ（アメリカ特許筒４．６
５９．８７８号）は、−価抗体が抗原とのダイマー又は
それ以上の複合体を形成することができず；そのような
凝集体は、固相支持体への゛抗原−抗体複合体の結合を
妨げることができることを言及する。

〔本発明の記載〕

本発明者は、完全な血液中の種々のタイプの分析物の分
析のために、実験室において及び医学的試験設備を欠く
第三次世界において使用され得る方法が必要であること
を認識した。上記に指摘されたように、初期の方法は、
血清又は血漿から血液細胞の分離を必要とし、そして従
って、そのフィールドに実施の手段を与えるごとはＩＩ
］［であり且つ多くの場合、不可能である。

赤血球結合分子が特定の分析物結合分子に結合される場
合、その得られた接合体を使用して、血液ナンブル中に
存在する内因性赤血球及び分析物の両者を結合すること
ができる。本発明は、そのような複合体が唾液サンプル
に暴露される場合、そのサンプルに対して内因性の赤血
球の凝固が、分析物と赤血球との架橋により適切な分析
物（通常抗原又は抗体）の存在の指示薬として作用する
であろうことに起因する。

一サンプルを遠心分離する必要がない；適切な抗凝集体
の存在下で集められた完全な血液が血清又は血漿の代わ
りに使用される。

一感染性疾病、たとえばＡＩＤＳ又は肝炎を有する患者
からのサンプルに関して、最小のサンプル操作を要する
。

一設備が限定される第三次世界のｌ界健康組織（Ｗｏｒ
ｌｄ　１ｌｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）に
より行われるようなマススクリーニングプログラムのた
めに適切である。

一アッセイはひじょうに単純である；静菌剤、たとえば
０．０１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムの存在下で安
定できる１種の試薬のみが存在する。

−適切な動物の赤血球細胞が種特異的ＭＡｂを産生ずる
ために免疫化に使用される場合、獣医によるフィールド
試験として使用され得る。

−試験はひじょうに早い一凝集が３分以下で生じる。

−その方法は、治療薬及び患者のコンプリアンスを調節
するために使用され得る。

−それはまた、“オーバー−ザーカウンター”自己試験
アッセイとしても使用できる。

−必要とされる設備は、混合棒、ガラス又はプラスチッ
クスライド、ランセット及びたぶん微細管だけである。

ｉＩ）２大　２、■・に、−る１占は゛のものを４まな
いニ ー赤血球の前処理。特許第４，４３３．０５９号は回転
沈櫓陰性細胞を特徴する特許第４．６６８．６４７号は
、ＰＢＳにより洗浄され、そして再懸濁された羊赤血球
細胞を使用する。固体支持体上で起こる反応の後、細胞
は固定される。

一サンプルの前処理。特許第４，４３３，０５９号は、
サンプルが補体による介入を避けるために加熱不活性化
されるべきであることを示す。ウサギ血清及びウシアル
ブミンがまた、他の特異的反応を最少にするために添加
されるべきである。これは、患者からの希釈されていな
い完全な血液が試薬と直接的に反応せしめられ得る本発
明のシステムに関しては必要でない。この試薬は、存在
するかも知れないいずれかの抗−マウス反応を妨げるた
めに関係のないモノクローナル抗体を含む。

従って、凝集アッセイにおける血清から細胞のやっかい
な分離及び指示体粒子としての使用に向けられている外
因性赤血球の感作及び固定化を実施することは可能であ
る。内因性赤血球は試薬により感作される。

本発明の凝集試薬及びアッセイのもう１つの新規観点は
、内因性赤血球と共に接合体のインキュベーションが、
分析物がまた存在しない場合、赤血球の凝集を引き起こ
さないであろうような赤血球結合分子（該赤血球結合分
子は、本明細書で“非−自己凝９Ｌ″と称する）の選択
である。

赤血球結合分子は好ましくは、モノクローナル抗体であ
り、そして特にヒトシステムにおいては、抗−グリコホ
リン抗体である。この抗体は立体的理由のために自己凝
集しないように思われ；損なわれていない抗体の結合部
位のいづれかが、単に同じ赤血球上の隣°接するエピト
ープを結合することができ又は２個の結合部位の１つの
みが一度にグリコホリンに結合することができる。

本発明のアッセイは、２種の接合体（１つば分折物特異
的結合分子を阻持し、そして他は分析物への第１接合体
の結合により形成される新規エピトープに対して特異的
な結合分子を担持する）を用いて、反復抗原決定基を有
さない小さな抗原を検出することができる。これは、測
定されるべき抗原の存在下での架橋を可能にする。

〔発明の特定の記載〕

本発明の凝集アッセイにおいて、結合部分の結合特性を
実質的に変えないで、分析物結合分子により提供される
分析物結合部分（又は分析物類似体）に結合される赤血
球結合分子により提供される赤血球結合部分を含んで成
る試薬が提供される。

その試薬は、分析物の不在下で内因性赤血球と共にイン
キュベートされる場合、凝集しない。

克１球待金立ヱ 赤血球膜は、種々の抗原表面成分、たとえばタンパク質
、糖タンパク質、糖脂質及びリポタンパク質を含む。こ
れらの成分を認識する抗体は、免疫原としてその膜、又
はその精製された成分を用いて従来の技法によって調製
され得る。これらの抗体は、天然においてモノクローナ
ル又はポリクローナルである。損なわれていない抗体又
はその特異的結合フラグメントのいづれかが、赤血球結
合分子（ＥＢＭ）として使用され得る。抗体又は抗体フ
ラグメントは、多価、二価又は−価のものである。

さらに、赤血球の表面上の糖タンパク質、糖脂質及び他
の炭水化物構造体は、炭水化物に対する親和性を有する
、レクチンとして知られている化学物質により認識され
る。これらのレクチンはまた、ＥＢＭとしても使用され
得る。赤血球表面に対する特異的親和性を存する他の受
容体分子もまた、使用され得る。これらはまた、膜の脂
質二重層に対する親和性を有する分子も含むことができ
る。そのような分子の例として、プロタミン、ハチの毒
の膜結合部分及び他のひじょうに塩基性のペプチドを挙
げることができる。

本発明の好ましいＥＢＭは、すべて又はほとんどすべて
の赤血球上に見出される赤血球膜成分を認識し、その結
果、血液サンプルに内因性の赤血球が凝集粒子として使
用され得る。そのような成分は、いわゆる“公衆抗原（
ｐｕｂｌｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎｓ）”を含む。

赤血球膜は、タンパク質を膜内に固定し又はそれを通過
せしめることを可能にする疎水性部分又は表面上のいず
れか種々のタンパク質を有する脂質二重層であり、そし
て細胞内に分子の一部を有することもできる。

グリコホリンＡは、細胞膜を通り抜ける分子の例である
。血液型特異性は、膜タンパク質に結合される炭水化物
又は糖脂質成分により与えられる。

従って、ＥＢＭが、特定の種すべての赤血球に共通する
膜糖タンパク質、成分のタンパク質部分又は他の共通の
構造体のいづれかを認識すべきであることが重要である
。赤血球細胞を凝集する二価ＥＢＭの能力は、立体因子
、たとえば分子の移重度及び脂質二重層上の結合部位の
位置に依存するであろう。

赤血球膜のタンパク質は、グリコホリンＡ（ＭＮ。

Ｅｎ”、　Ｗｒｂ）　％グリコホリンＢ（Ｓｓ、　’Ｎ
’ｌ　Ｕ）及び少量の構成成分、すなわち膜内在地タン
パク質１（Ｒｈｅｓｕｓ）、膜結合糖タンパク質Ｃ４（
Ｃｈｉｄｏ　＆Ｒｏｄｇｅｒｓ）、膜内在性糖タンパク
質（アニオンチャネル）、糖脂質（Ｌｅｙｉｓ）、スフ
ィンゴ糖脂ｆ（ＡｌｌＩ？。

ｆｉｌ　ｐ、　ＴＫ）、アンキリン、スペクトリン、プ
ロティン４−１、Ｆ−アクチンを含む〔関連する血液型
因子は括弧内のものである。〕。

次の出版物は引用により本明細書に組込まれる＝１、赤
血球細胞膜。Ｓ、Ｂ、５ｈｏｈｅｔ　＆　Ｅ、Ｂｅｕｔ
ｌｅｒ。

１１ｅｍａｔｏｌｏｇｙ、第３版、出版者：　Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ、　Ｂｅｕｔ−１ｅｒ、　Ｅｒ５ｌｅｖ　＆　
Ｌｉｃｈｔｍａｎ、　１９８３　（すべての赤血球膜抗
原の総説）。

２、赤血球細胞膜の概略。

Ｖ、Ｔ、Ｍａｒｃｈｅｓｉ、Ｂｌｏｏｄ、　６１＋　　
１〜１１．１９８３　（タンパク質概略の総説）。

特に好ましいＥＭＢは、１つのグリコホリンである。赤
血球シアロ糖ペプチドが膜から抽出される場合、その主
な百分（合計の約７５％）は、グリコホリンである。こ
の分子は、１６個のすリゴ糖鎖と共に１３１個のアミノ
酸を含んで成る。従って、これは、赤血球細胞を凝集し
ないで抗体の結合を可能にする多くの成分である。それ
はまた、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎ
ｙから比較的高い純度で容易に入手できる（Ｆｒａｃｔ
ｉｏｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＭａｊｏｒＳｉａｌ
ｏｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｈｕｍ
ａｎ　Ｒｅｄ　ＢｌｏｏｄＣｅｌｌ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ
”　Ｈ，Ｆｕｒｔｈｍａｙｒ、　Ｍ、Ｔｏｍｉｔａ　＆
　Ｖ、Ｔ。

Ｍａｒｃｈｅｓｉ、ＢＢＲＣ６５，１９７５，１１３〜
１２２を参照のこと）。

赤血球結合分子が、通常の抗体の場合におけるように多
価のものである場合、その分子が、豊富であり、そして
十分に分布されている赤血球膜成分を認識し、そしてそ
の結合部位が、細胞間の架橋が立体障害物により阻害さ
れるような位置に存在すべきであり、それによって未熟
赤血球細胞の凝集を回避することが所望される。

すべての赤血球を実質的に認識する単一のＥＢＭが使用
されることが好ましいが、但し必要ではない。いくつか
のＥＢＭが同じ又は別の接合体のいづれかに使用され得
、それらのそれぞれは赤血球の特定のグループを認識す
るが、しかし凝集体においては、すべての赤血球を実質
的に認識するであろう。

ＥＢＭは、赤血球の天然の表面成分を認識することが好
ましいが、ＥＢＭにより認識されるリガンドにより赤血
球を被覆し、又は通常隠れたりガントを暴露するために
赤血球を処理することが可能である。

分扼皇 本発明は、特定の分析物の検出に限定されない。

分析物は、血液中に通常見出される物質、たとえば血液
タンパク質又はホルモンであり、又はそれは外来性物質
、たとえば薬物（治療用薬物及び悪用薬物の両者を含む
）、又は生物体、たとえばウィルス（ウィルス被覆タン
パク質を認識することにより）、細菌、原生動物、菌類
、又は多細胞寄生虫（たとえばイム糸状土類）である。

分析物は、１つの分析物結合分子により認識できる反復
エピトープ、又はユニークエピトープ（ここで分析物結
合分子の混合物が必要である）を有する。しかしながら
、単に一度に１種のＡＢＭにより結合され得る分析物も
また、検出され得る。

分」目１結ｊづ辷ｆ 分析物結合分子は、分析物に対して好ましい親和性を有
する物質、たとえばモノクローナル又はポリクローナル
抗体、レクチン、酵素又は他の結合タンパク質もしくは
物Ｘ＜又はその結合フラグメント）である。分析物が抗
原である場合、ＡＢＭは通常抗体である。分析物が抗体
である場合、ＡＢＭは通常、その抗体により認識される
抗原である。検出されるべき分析物が反復エピトープを
有さない場合、分析物に対する種々の特異性を有する複
数のＡＢＭが必要とされる。この場合、試薬は、ＡＢＭ
Ｉに結合されるＥＢＭ及びＡＢＭ２に結合されるＥＢＭ
の混合物、又は結合される両ＡＢＭを有するＥＢＭのい
ずれかであろう。

分析物結合分子は、直接分析物に結合する必要はない。

たとえば、チロキシンのためのアッセイにおいては、１
つのＡＢＭがチロキシン結合タンパク質に対して向けら
れ（その結合タンパク質がサンプル中に存在することが
既知である場合）、又は別々に供給され得る。

ＥＢＭ　　びＡＢＭの　人 ＥＢＭ及びＡＢＭは、直接的又は間接的に、及び共有結
合又は非共有結合（又はその組合わせ）により一緒に結
合され得る。複数のＥＢＭ又はＡＢＭが使用される場合
、ＥＢＭ又はＡＢＭは、ＥＢＭに直接結合された１又は
複数のＡＢＭにより一緒に結合され得る。次の表は、当
業界に既知であるいくつかの共有結合法を要約する。

ｌ挾二１皿囁 １、　　５ＰＤＰ （Ｎ−スクシンイミジル−３，２−（ピリジルジチ”オ
）プロピオネート） Ｎｅｕｒａｔｈ、　’Ｌｈ−，１９８Ｌ　Ｊ、ｖ＋ｒｏ
１．＋　Ｍｅｔｈ、、　３　＋１５５〜１６５゜ ２、ＭＢＳ （ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル） Ｋｉｔａｇａｗ　、ｆＬ＆、　、１９７６、　Ｊ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、＋　７９＋　２２３−２３６　。

３．　５ＩＡＢ （Ｎ−スクシンイミジル−４−ヨードアセチルアミノベ
ンゾエート） Ｗｅｌｔｍａｎ、　ｆｌＥ、　、１９８３゜Ｂｉｏ、Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、土。

１４８〜１５２゜ ｊ妻ＪＴ；Ｗ能Ｊ＠ Ｐ−イソチオシアナトベンゾイル、クロリドアメリカ特
許第４，６８０，３３８号 二宜詣債 １、８ＳＯＣＯＥＳ ビス〔２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）
エチル〕スルホン Ｚａｒｌｉｎｇ、　ｆ、ＬＥ、　、１９８０＋　Ｊ、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、＋　１２４＋９１３〜９２０゜ ２、ＢＳ ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート５ｔａｒｏ
ｓ、　１９８２．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２１
．３９５０〜３９５５゜仇 １、　グルタルアルデヒド ＾ＶｒａｍｅａＳ＋　１９６９＋　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍ、、　６　、４３゜２、過ヨウ素酸酸化 Ｎａｋａｎｅ及びＫａｗａｉ＋　１９７４＋　Ｊ、ｌｌ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　４％、　１０
８４〜１０９１゜ ３、　カルボジイミド 共有結合の前記方法のうち、５ＰＤＰとの接合が好まし
い。

ＥＢＭ及びＡＢＭはまた、たとえば （ａ）ビチオンを一方に及びアビジン（又はストレパビ
シン）を他方に付着し、（ｂ）抗−抗体を一方に付着し
く次にこれは他方に結合する）、（ｃ）プロティンＡを
一方に付着しく次にこれは他方のＦＣ部分を結合する）
、そして（ｄ）糖を一方に及び対応するレクチンを他方
に付着することによって非共有結合され得る。

ＥＢＭ及びＡＢＭを結合することにおいて、その結合特
性は、可能なかぎりほとんど変化せしめられるべきでな
いことが理解されるべきである。

立体障害を減じるためにＥＢＭとＡＢＭとの間にスペー
サー成分を提供することが好都合である。

ＥＢＭ／ＡＢＭ接合体は、キメラ抗体であり得る。

そのような接合体を構成する１つの方法は、次の通りで
ある： （ａ）ペプシン消化により、選択された抗体のＦ　（ａ
ｂ）　ｔフラグメントを調製し；（ｂ）前記選択された
抗体のＰａｂ　’フラグメントを調製するためにエルマ
ン試薬によりそのフラグメントを還元し、そして処理し
； （ｃ）選択された特異的抗体又はｉ！訳された赤血球抗
体をチオール化し；そして （ｄ）キメラ性抗−赤血球抗体−抗原特異的抗体接合体
を産生ずるためにエルマン試薬により処理されたＦａｂ
　’フラグメントにチオール化されたＦａｂ　’フラグ
メントを結合せしめることを含んで成る。

もう１つの方法が下記に示される： （ａ）高分子生合成の異なった部位−特異性不可逆阻害
剤により、抗−赤血球モノクローナル抗体産生ハイプリ
ドーマ及び抗原特異性モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマを処理し；（ｂ）２種の異なったモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマとポリエチレングリコールとを
融合し； （ｃ）その融合された細胞を、軟アガロース中において
又は限界希釈法のいづれかによりクローン化し； （ｄ）キメラ性抗−赤血球抗体−抗原特異的抗体を分泌
するクローン化された異種ハイブリドーマを、抗体に対
して適切なスクリーニングアッセイにより選択すること
を含んで成る。

好ましくは、阻害剤は、エメチン、アクチノマンシンＤ
１ヒドロキシ尿素、ウヮバイン、シクロへキシミド、ニ
シン及びスパルソマイシンかう成る群から選択される。

キメラ抗体は、２つの半分子であり、１つは赤血球（Ｅ
　Ｂ　Ｍ）に対する特異性を有し、そして他方は分析物
（ＡＢＭ）に対する特異性を有する。

この場合、抗体のジスルフィド結合が、接合体を形成す
るためにＡＢＭをＥＢＭに結合せしめる。

他方、前記２つの半分子は、分析物の同じ又は異なった
エピトープに対して特異的であり得る。この２番目の場
合、キメラ抗体は実際に２つのＡＢＭであり、そして３
分節接合体を形成するためにＥＢＭに結合されるべきで
ある。３分節接合体は、他の手段、たとえばＥＢＭ及び
２つのＡＢＭを高分子スペーサーに付着することによっ
て形成され得る。

考えられる最も単純な凝集試薬は、１つのＡＢＭへの１
つのＥＢＭの単一接合体を含んで成るものである。この
試薬は、反復エピトープを存する抗原の検出のために適
切である。

２つの抗体分子の同時結合を可能にするのに十分に大き
な抗原分析物（反復エピトープを欠く）が知られている
。それらは、多くのペプチド及びタンパク質ホルモンを
含む。凝集が生じるためには、抗原は、抗原の少なくと
もいくつかの分子が隣接する赤血球の間に架橋として作
用するように試薬と相互反応すべきである。そのような
分析物をアッセイするためには、複数の種々の接合体、
すなわちＡＢＭＩ／ＥＢＭ　＋ＡＢＭ２／ＥＢＭ（ここ
で八ＢＭＩ及び八ＢＭ２は、分析物の種々の非オーバー
ラフピングエピトーブに結合する）を含む試薬を使用す
ることが好ましい。その代わりにより複雑な単一接合体
、すなわちＡＢＭＩ／ＡＢＭ２／ＥＢＭ（ここでその立
体化学は、同じ分析物分子への同じ接合体分子上の両Ａ
ＢＭの結合に関与しそうもない）を使用することができ
る。

ハ血Ｆ′　−ア・・セイ 直接的及び間接的再凝集アッセイは、当業界に既知であ
る。抗原に対する従来の直接的アッセイにおいては、赤
血球細胞は抗体により被覆され、そしてサンプルと反応
せしめられる。多官能価抗原は、被覆された赤血球細胞
の間で架橋として作用し、凝集体を創造する。従来の間
接的アッセイにおいては、赤血球細胞は、抗原により被
覆され、そして可溶性抗体及びサンプルの両者と接触さ
れる。サンプル抗原は、感作化された赤血球細胞の結合
を抗体により、及び従って凝集を競争的に阻害する。抗
体−感作されたＲＢＣをさらに使用することも可能であ
る。Ｍｏｃｈｉｄａ、アメリカ特許第４．３０８．０２
６号を参照のこと。

本発明の試薬は、直接的又は間接的凝集アッセイのいづ
れかに使用され得る。しかしながら、従来のアッセイと
は異なって、抗体又は抗原により赤血球を前もって被覆
することが必要でない。むしろ、本発明の試薬は、内因
性赤血球を含む血液サンプルに添加され得、この上それ
は細胞を感作し、それらをサンプル分析物に結合できる
ようにしく直接的アッセイ）又は可溶性分析物−結合分
子分析物−結合分子のためにサンプル分析物と競争でき
るようにする（間接的アッセイ）。

いくつかの小さな循環分子、たとえば合成又は天然のス
テロイド、すなわちジゴキシン、テオフィリン、等、又
は悪用薬物、すなわちフェノバルビクール、カンナピノ
イド、オピオイド、等に関しては、問題の分析物は、架
橋及び続く赤血球の凝集を可能にするために、抗体結合
のための２つの必要な抗原エピトープ（又は他の結合分
子による認識のための他の“エピトーチ）を提供するに
は小さ過ぎるかも知れない。

小さな分子のアッセイに関しては、いづれか他の抗原を
モニターする薬物におけるように、凝集阻害アッセイが
好ましい。この場合、二段階試験が予定される。第１段
階は、非凝集ＥＢＭに結合された分析物又は分析物類似
体から成る試薬の添加であり、そして第２段階は、非接
合性ＡＢＭの添加であろう（それらの二段階は可逆的で
あり得る）。分析物が血液サンプル中に存在する場合、
ＥＢＭ−分析物類似体接合体へのＡＢＭの特異的結合は
阻害され、凝集の損失を４かれる。さもなければ、凝集
が生じる。

用語“分析物類似体”とは、分析物、及びそのような結
合が分析物により競争的に阻害される場合、ＡＢＭによ
りまた特異的に結合される物質を含む。分析物類似体は
、分析物−結合抗体の抗原−結合部位に対して生じる抗
−イディオタイプ抗体である。

直接的凝集アッセイによるそのような小さな分子、の検
出に関しては、少なくとも２つの特異的モツクローナル
抗体が使用され得る。小さな循環性抗原に直接的に結合
できる１つのモノクローナル抗体が、赤血球結合分子に
結合され得る。２番目のモノクローナル抗体は、上記接
合体及び分析物と共にインキュベートされ、そして前記
第１モノクローナル抗体のオーバーラツプ領域から成る
新しい抗原決定基、及び第１モノクローナル抗体が抗原
を結合する場合にのみ存在する抗原に結合することがで
きるであろう。従って、第２モノクローナル抗体は、赤
血球“架橋”として作用し、最終的に凝集の存在を可能
にする種々の赤血球細胞の間に架橋を引き起こす。もち
ろん、この方法はモノエピトープ分析物に限定されない
。

立体化学的理由に関しては、単一の第二抗体分子が２種
の接合体二分析物複合体に同時に結合することは難しい
かも知れない。従って、第二抗体と赤血球結合分子とを
接合することが好ましい。

サンプルが多くの試薬と共にインキュベートされるべき
であることを言及する場合、接触は、接触の特別な順序
又は期間に限定されないで、同時又は連続的であり得る
ことが理解されるべきである。

マウスを、ヒト赤血球細胞により免疫化し、そしてモノ
クローナル抗体を、免疫化された動物の肺臓細胞とマウ
ス骨髄腫細胞とを融合することによって生成した。抗体
を回転凝集アッセイ及び酵素イムノアッセイの両者によ
りスクリーンし、ここでグリコホリンがマイクロタイタ
ープレートに結合された。回転凝集は、Ｗｙａｔｔ　＆
　５ｔｒｅｅｔ、　Ａｕ５ｔ。

Ｊ、Ｍｅｄ、Ｌａｂ、Ｓｃｉ＋　４　＋　４８〜５０の
変法により行われた。

細胞培養物の上清液５０１ｔｌを、マイクロタイタープ
レート中で１％赤血球細胞懸濁液５０μｌと混合した。

この例のためには、グリコホリンを結合するが、しかし
凝集しない抗体が選択された。モノクローナル抗体及び
グリコホリンの反応を、酵素イムノアッセイにより決定
した。マイクロプレートを、ｌＯ賄／ｍ１のヒトグリコ
ホリン（ＳｉｇｍａＣａｔ、Ｎｏ、Ｇ７３８９）により
被覆し、そして洗浄し、次にモノクローナル抗体の一連
の希釈溶液と共にインキュベートした。さらに洗浄した
後、結合された抗体の存在を、酵素ラベルされた抗−マ
ウス抗体の添加、続いて基質の添加により決定した。そ
の力価を、モノクローナル抗体の最も高い希釈溶液に対
して決定し、そしてそれはバックグラウンド上で１．０
００単位よりも高い＾４２０読みを与えた。

３８４個のウェルのうち、４０個ウェルの一次クローン
を選択した。これらは、陽性の回転凝集アッセイ、ＥＩ
Ａに基づいてのグリコホリンに対する応答又は両者のい
ずれかを与えた。

陰性　陽性　　　４ 陽性　陽性　　２０ 陽性　陰性　　１６ 続く吸収研究が、抗体が赤血球細胞表面上に暴露された
グリコホリンドメインを認識することを確かめるために
行われた。

腹水に対するスクリーニングアッセイの結果が下記に列
挙される： ＲＡＴ　１０３／１６７　５１２０００　　　＜１００
０　　　陽性ＲＡ？　３０６１５　　６４００　１０２
４０００　　　陽性ＲＡＴ　ｌｃ３／８６　　＜１００
０　１０２４０００　　　陽性１？ＡＴ　３８１／１７
２　２５６０００　　２０００　　　陽性ＲＡＴ　３０
３／２２　　４０００　１０２４０００　　　陽性ＲＡ
Ｔ　３Ｄ５／６１　１２８０００　１０２４０００　　
　陽性ＲＡＴ　ＩＡ２／１８７　　　＜１０００　　　
　２５６０００　　　　　ｇｊ　　性ＲＡＴ　２Ａ２／
１８７　　　＜１０００　　　　１２８０００　　　　
　陽　性ＲＡＴ　ＩＡ３／１２９　　＜１０００　　１
２８００　　　弱いＲＡＴ　ＩＣ４１５＜１０００　　
　　１２８０００　　　　１１ｊ％　性ＲＡＴ　４Ｃ３
／１３　　＜　１０００　　１２８０００　　　陽性Ｒ
ＡＴ　３Ｂ１／Ｔｏ　　＜１０００　　５１７０００　
　１１ｊｉ性ＲＡＴ　ＩＣ３／８６を、ブダペスト条約
に基づいて、ＡＴＣＣ（Ａｎ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ＋　１２３０
１１’ａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅｎ　Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ　ＭＤ＋　２０８５２＋　ＵＳＡ）に１９８８年９
月７日に寄託され、そして寄託番号Ｇ２６．４．ＩＣ３
／８６を得た。

ハＬ且１４匪Δ構盟 モノクローナル抗体を、ヒドロキシルアパタイトを充填
するクロマトグラフィーにより腹水から均質に精製した
（Ｓｔａｎｋｅｒ、　ｆｌＨ，、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　７６、１５７．１９８５）。

ｆｊＩ２−ＨＩＶペプチド−Ａｂ　Ａ　の３占暫ヒト免
疫欠損ウイルス（ＨＩＶ　−１）の流行は、主な全世界
の健康問題に成って来た。現在、この疾病のためｂ治療
又はワクチンはまた存在しない。感染された個人の診断
は、ウィルスの広がりを減じる試みにおける主要因子で
ある。さらに、血液生成物の汚染を防ぎ、そして個人の
健康を保護する必要性が、抗−ＨＩＶ抗体の存在のため
の単純で、迅速で、安価な特定の試験についての需要を
高めて来た。

抗−ＨＩＶ抗体のための可能性ある検出システムを提供
するためには、患者自身の赤血球細胞の使用を行ってき
た。これは、ヒト赤血球細胞に対する非凝集性モノクロ
ーナル抗体を選択することによって達成されて来た。こ
の抗体と合成ＨＩＶペプチド抗原とを化学的に架橋する
ことは、この抗原に対する抗体の存在下で患者の赤血球
細胞の特異的凝集を可能にした。ＨＩＶ−１のｇｐ４ｔ
　（残基５７９〜６０２）に由来する合成ペプチド抗原
が、ＷｅｌｌｉｎＨの方法（ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴ、１８
８：２１５　（１９８５））に基づいて選択され、そし
てＡＩＤＳ患者のおよそ９８％からの抗体により認識さ
れる主要エピトープどして同定される領域に一致する。

（Ｗａｎｇ？、Ｃ上、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３：６５２９　（１９８６））。

合成ペプチドを、製造工業により供給された二重結合循
環を用いるＡｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＭ
ｏｄｅ１４３０合成器の助けにより、Ｍｅｒｒｉｆｉｅ
ｌｄの方法（１７ｓＨｏｄｇｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅ　Ｍｅ
ｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、６５
゜２４１　（１９７５））を用いて合成した。Ｎ−ｔ−
ブチルオキシカルボニルアミノ酸誘導体を、Ｐｒｏｔｅ
ｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（大阪９
日本）から得た。側鎖の保護は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓにより供給されたものと同じであった
。但し、オメガ−ＮＯ□誘導体がアルギニンのために使
用されたことが異なる。

鎖アセンブリイーを、ニンヒドリンを用いて調節した（
　Ｖ　５ａｒｉｎなど、　、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、１１７＋　１４７（１９８１）　）。アセンブリイ
ーされたペプチドを、同時に開裂し、そして１０％（ｖ
／ｖ）アニソールを含む無水ＨＦを用いて保護解除した
（ＪＭ　Ｓｔｅｗａｒｔａｎｄ　ＪＤ　Ｙｏｕｎｇ、　
５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ。

ｐｐ４４及び６６、　Ｗｌｌ　Ｆｒｅｅｍａｎ＋　Ｓａ
ｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９６６））　ａその粗ペプ
チドをジエチルエーテルにより沈殿せしめ、エチルアセ
テートにより洗浄し、そして０．１％（ｖ／ｖ）のトリ
フルオロ酢酸中、６０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルによ
り抽出した。合成ペプチドを、０．１％のトリフルオロ
酢酸中、０〜６０％アセトニトリルのｔ　、　ｏｏｏ−
グラジェントにより溶離する分離用逆相クロマトグラフ
ィー（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｒ　ａ樹脂、２５０Ａ孔サイズ
、２５Ｘ　４００ｍｍ）により精製した。その合成ペプ
チドは、分析用逆相１１ＰＬＣにより及び酸加水分解の
後、アミノ酸の定量分析により評価する場合、約９５％
の純度であった。

１０．、　・”七人Ａ　ｂ　（ＲＡＴ　ＩＣ３／８６）
の５ＰＤＰラベリ２久 １３．８ｍｇ／ｍｆのＲＡＴ　ＩＣ３／８６の０．２５
−に、ジメチルホルムアミド中、２■／−の５ＰＤＰ　
Ｉ２．５ｍを添加し、そしてその反応を２５℃で１時間
進行せしめた。反応されなかった５ＰＤＰを、５ｅｐｈ
ａｄｅｘ　Ｇ２５を充填するゲル濾過により除去し、そ
して５ｐｏｐラベリングのレベル（１，４モル１モル）
を決定した。

２、　ペプチド３．２の５− ペプチド３．２　　（Ｈｍの主なコートタンパク質の残
基５７９〜６０１に対応する配列ＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫ
ＤＱＱＬＬＧ　ＩＷＧＣＳＧＫ）を、１００ｍＭのＴｒ
ｉｓ　ＨＣｌ、　　１ｍＭのＥＤＴ＾（ｐＨ８，０）溶
液１ｒｎｌ中に溶解し、そして４０℃で４５分間２−メ
ルカプトエタノール１０Ｉ１１と反応せしめた。その反
応を、三弗素酢酸（ＴＦＡ）４滴及び水性０．１％ＴＦ
Ａ１ｍＺの添加により停止した。

その混合物を、６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ
の溶液２０ｍ１により処理され、そして０．１％ＴＦＡ
により平衡化されている５ｅｐ−ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ
）　Ｃ１８カートリッジに適用した。その還元されたペ
プチドを、０．１％ＴＦＡ２０ｍｌにより洗浄する前、
５ｅｐ−ｐａｋを通して２度循環せしめた。その還元さ
れたペプチドを、６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦ
Ａの？容？ａ　Ｚ　ｎＪにより２度５ｅｐ−ｐａｋから
？８離した。そのサンプルを、結合する前、回転７発に
より乾燥せしめた。

３、楳−企 ペプチドを、１００ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭ
の塩化ナトリウム及び４ＭのグアニジンＨ（Ｊを含む緩
衝液（ｐＨ７，４）　０．２ｍｊ中に溶解し、そして同
じ緩衝液（但しグアニジンＨＣ＆を含まない）中で、ラ
ベルされた抗体の５ＰＤＰ　２．２■と共に混合した。

そのフラスコを、２５℃で一晩インキユベートした。

抗体の置換の程度は、接合体の溶解性に影響を与えた；
接合体１モル当たりペプチド２０モルは不溶性に成った
。抗体１モル当たりペプチド５〜７モルの範囲が最適で
あった。赤血球細胞を結合する接合体の能力は、ウサギ
抗マウス抗体及びＨＩ　Ｖ陽性の完全な血液による凝集
試験を用いて調節された。

４、ゲ四ｒ゛、・クロマトグーフィー 反応されなかったペプチド及び５ｐｏｐ副生成物をリン
酸緩衝溶液中、５ｕｐｅｒｏｓｅ　６カラム（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）を充填するゲル濾過クロマトグラフィーに
より除去し、そして抗体含有画分をプールし、そして保
存剤として０．０１％のアジ化ナトリウムの添加の後、
４℃で保存した。

５、７〜セイのための１弓のＪｌ、Ｉ！−接合体２体積
と、Ｂｕｎｄｅｓｅｎ、　ｆｉｈ’、　、Ｖｅｔ。

Ｉｍｍｕｎ、、　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ、　　８，２４
５〜２６０．１９８５に記載のようにして調製された非
関連モノクローナル抗体（Ｂｒｕｃｅ　５　）の１０ｎ
ｖ／ｉｆ溶液１体積とを混合した。

ヱ１」牝り１汰 アッセイのために、ヘパリン化された完全な血液１０ｐ
ｌを、ガラススライド上に置いた。試薬３０Ｉを添加し
、そして混合した。そのスライド　　　”を３分までの
間、揺り動かし、そして凝集の存在又は不在が示された
。

９種の独立したペプチド／抗体接合体が調製され、そし
て血漿陽性患者の赤血球細胞を凝集することにおいて活
性であることが見出された。活性接合体はまた、架橋剤
として、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステルを用いても調製された。

結果は、類似する抗原を用いる酵素イムノアッセイによ
り観察される結果に少なくとも正確に匹敵した（第１表
）。

血液サンプルの比較試験が、赤血球アッセイにより得ら
れる陽性物及び陰性物を確認するためにＥＬＩＳ＾によ
り行われた。

対照の血液サンプルは、ＥＬＩＳＡ陰性血液サンプル及
び感染された患者からのＥＬＩＳＡ陽性サンプルを含ん
で成る。）ＩｒＶ陽性患者は、ＶｉｃｔｏｒｉａｎＳｔ
ａｔｅ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに
よりウェスターンプロットが陽性であることが確かめら
れた。フェアーフィールド病院の患者は、ウェスターン
プロット又はＥ　Ｉ　Ａ　（Ａｂｂｏｔ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅＳ）のいずれも陰性であった。血液供与者を
Ｅ　Ｉ　Ａ　（ＧｅｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）により
試験した。誤った陽性又は陰性値は、かっこ内に示され
、そしてＥＩＡ又はウェスターンプロット分析により確
認された。

凝集試験　　ＥＩＡ試験 ＋ｖｅ　　　　−ｖｅ　　　　＋ｖｅ　　　　−νｅ旧
Ｖ　＋ｖｅ患者　　　　　　　　　４２　　　（１）　
　４３　　０フエアーフイールド病院の患者　（３）　
　６３　　０　　６６健康な血液供与者　　　　　　　
（１）　　８７３　　　（２）　　８７２試験の特異性
を評価するために、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質
の他の領域に対応する一連の合成ペプチドを、ＷＡＮ反
応を阻害するそれらの能力について試験した（第２表）
。非関連ペプチドは競争せず、そして必須カルボキシ末
端エビ＋−−ブ領域を欠く合成ｇｐ４１フラグメント、
すなわち残基５７２〜５９１は、凝集を阻害しなかった
。合成遊雛抗原による凝集の阻害は、時おりの弱い陽性
サンプルを（ｉｌ　ｉ＝することにおいて有用であった
。合成ペプチドの添加が凝集を阻害しそこなう場合、そ
れは抗−赤血球細胞抗体に関連する誤った陽性を示すで
あろう。

合成ペプチド（０，１２５ｏｗ／ｍ／）を、完全な血液
の添加の前、接合された抗体に添加した。その凝集試験
を、上記のようにして行った。共通配列は下線が引かれ
る。

添加された合成　　　　凝集の ペプチド（配列）　　　阻　害 な　　し　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ％ｇｐ
４１　（５７９−６０１）　　ＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤ
ＯＯＬＬＧＩＷＧＣ５ＧＫ　　１００％ｇｐ４１　（５
７２−５９１）　　ＧＩＫＱＬＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫ
ＡＤＯＯＯ％ｇρ１２０（１９３−２００）　　ＡＳＴ
ＴＴＮＹＴ　　　　　　Ｏ％ｇｐ１２０（１０５−１１
７）　　　　　　　　ＨＢＤ夏ｌ５ＩＪＤＱＳＩ、Ｋ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ％ｇｐ１２０
（１０１−１１８）　　ＶＥＱＭＩＩＥＤＩＩＳＬＷＤ
Ｏ５ＬＫＰ　　　Ｏ％ｇｐ１２０（１０５−１２９）Ｙ
””　ＨＥＤＩＩＳＩ、Ｈ５ＱＳＩ、ＫＰＡＶＫＬＴＰ
ＬＣＶＳＹ　　０％３−キメ−−グｊコホｊン　−−ヒ モノクローナル抗体ＲＡＴ　ｔｃ３／８６　（抗−ヒト
赤血球細胞）及びＤＤ　−ＩＣ３／　１０８　（Ｒｙｌ
ａｔｔ、　次煮、、１９８３、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ
　Ｒｅｓ、＋　３１．７６７〜７７８に記載のような抗
−ヒトＤ−ダイマー）を、■ａｃｋｍａｎｓ４な−Ｅ、
　、１９８１．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　１５，４２
９〜４３６による記載のようにしてペプシンにより消化
し、そしてＴＳＫ−３０００ＳＷカラムによるクロマト
グラフィーにより精製した。２■のＲＡＴ　ＩＣ３／８
６を、０．１　Ｍの酢酸、７０ｍＭの塩化ナトリウムを
含む緩マ９７液（ｐＨ３，５＞中において１％Ｗ／−ペ
プシンにより４５分間消化した。その間に、２１Ｔ１ｇ
のＤＯ−ＩＣ３／１０８を、同じ緩衝液中において２時
間１％Ｗ／−ペプシンにより消化した。それらの反応を
、１．５　ＭのＴｒｉｓの添加により停止し、ｐｌ＋を
８に高めた。Ｆ　（ａｂ）　ｔフラグメントを、ＴＳＫ
　−３０００ＳＷカラムによるゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより精製した Ｆ　（ａｂ）　ｔの還元及びＦａｂフラグメントの続く
ブロッキングを、８ｒｅｎｎａｎ、　ｆｔ、、　−、１
９８５＋　５ｃｉｅｎｃｅ２２９、８１〜８３に記載の
ようにして行った。３■／−のＦ　（ａｂ）　ｔｔＰＪ
製物を、１０ｎ＋Ｈの亜砒酸ナトリウムの存在下で、１
６時１ｕ１２５℃で１ｍＭのメルカプトエチルアミンに
より処理した。Ｆａｂフラグメントを、５．５′−ジチ
オビス（２−二トロ安息香酸）　（Ｅｌ１ｍａｎ試薬）
により２５℃で３時間反応せしめることにより安定化し
た。次に、Ｆａｂフラグメントを、ＴＳＫ　−３０００
ＳＩ４カラムによるゲル濾過クロマトグラフィーにより
精製した 口Ｄ−ＩＣ３／１０Ｂのチオール形を、２５℃で３０分
間の１０ｍＭのメルカプトエチルアミンによる反応によ
り再生した。過剰の試薬を、ＴＳＫ　−３０００ＳＷカ
ラムによるゲル濾過クロマトグラフィーにより除去した
。チオール００−　ＩＣ３／１０Ｂ及びＥｌ１ｍａｎ試
薬により処理されたＲＡＴＩＣ３／８６の混合物を、Ｂ
ｒｅｎｎａｎ、などにより記載されているようにして２
５℃で１６時間インキエベートした。最後に、キメラ抗
体を、↑Ｓに−３０００５−カラムによるゲル濾過クロ
マトグラフィーにより精製した。

基１紹Ｕ乱袈 ０．１ｍｇ／ｍｌのキメラ抗体２休積と、７．５ｍｇ／
ｍｌの非関連モノクローナル抗体（Ｂｒｕｃｅ　５　）
　　１体積とを混合した。

ヱヱ皇土方失 アッセイのために、ヘパリン化された完全な血液１０ｕ
１をガラススライド上に置いた。試薬３０Ｉを添加し、
そして混合せしめた。スライドを３分間振動せしめ、そ
してＤ−ダイマーの存在下で凝集を観察した。

１）過ヨウ素Ｍｉｌｌ化されたジゴキシンの調製。

１００ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム２−を、ジゴキサン
（Ｓｉｇｍａ）　　４０　ｍｇに滴下し、９５％エタノ
ール２＋＋ｔｌ中にｇ３し、そしてその反応を３７℃で
３０分間続けた。その反応を、エタンジオール６０ｄの
添加により停止せしめた。最後に、シップ塩基中間体を
、４０ｍＦＩのシスチンの添加（３０分：３７℃）及び
続く１５■／ｍｉの水素化硼素ナトリウムｌ−による反
応（１６時間：２５℃）により安定化した。

２）シスチン／ジゴキシン接合体の還元。

シスチン／ジゴキシン接合体３ｍｌを、メルカプトエタ
ノール４０ｊ１１の添加により還元しく４０分：３７℃
）、そしてその生成物を、例１におけるペプチドの還元
について記載のようにしてＷａ　ｔｅｒｓＳｅｐ−ｐａ
ｋ　Ｃ１１３カートリツジによるクロマトグラフィーに
より精製した。回転蒸発の後、サンプルを、５ＰＤＰラ
ベルされたＲＡＴ　ＩＣ３／８６　（例１に記載のよう
にして５１０ピルジチオピリジン基／抗体によりラベル
されている（１６時間：２５℃）〕と反応せしめた。最
後に、ジゴキシン／抗体接合体を、５ｕｐｅｒｏｓｅ１
２を充填するゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し
た。

抗−ＨＩＶ抗体のためのもう１つの試薬は、抗−グリコ
ホリン抗体のＦ　（ａｂ）　ｚ誘導体を使用する。

ＲＡＴ　ＩＣ３／８６　（７０ｍＭの酢酸塩、１００ｍ
Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ３，５）中において２ｍｇ／
ｍりを、１１０ｌ１／−のペプシン（Ｓｉｇａ＋ａ　Ｐ
６８８７）により３７℃で４０分間消化し、そして反応
を、１．５ＭのＴｒｉｓ塩基１塩基１体１０体積により
停止せしめた。

５ｍＭのリン酸ナトリウムを含む緩衝液（ｐＨ８，０）
への−晩の透析の後、抗体フラグメントを、リン酸ナト
リ’ｙ　ム（ｐＨ８，０）　（７）　５〜３００ｍＭグ
ラジェントに基づいて、ＤＥＡＲセルロースを充填する
イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。

Ｆ　（ａｂ）　ｔフラグメントの５ＰＤＰラベリング、
ペプチド３．２の還元、ペプチド３．２のＦ　（ａｂ）
　ｚ　ＲＡＴ　ＩＣ３／８６への接合、そのペプチド接
合体の精製、アッセイのための試薬の調製及び試験方法
を、完全な抗体接合体について記載のようにして行った
。

他の赤血球又は分析物結合抗体のＦ　（ａｂ）　を接合
体を、同様にして調製し、そしてＨＩ　Ｖペプチド以外
の分子に結合することができる。

例６−ＨＩ■ペプチド／抗−グリコホリンＦａｂ’もう
１つの試薬は、ＥＢＭとして一価のＦａｂ　’フラグメ
ントを使用する。

リン酸緩衝溶液中、Ｆ　（ａｂ）　２　ＲＡＴ　ＩＣ３
／　８６を、室温で工時間、１０ｍＭのメルカプトエタ
ノールと共にインキュベートした。次に１５ｍＭのヨー
ドアセトアミドを添加し、そしてその反応を暗やみ中で
１５分間進行せしめた。最後に、その反応を、リン酸緩
衝溶液１００体積中への透析により停止せしめた。

Ｓ−カルボキシメチル化されたＦａｂ　’の５ＰＤＰラ
ベリング、ペプチド３．２の還元、ペプチド３．２のＲ
ＡＴ　ｌｃ３／８６のＦａｂ　’−ＴＮＢ（チオニトロ
ベンゾイル”）ＲＡＴフラグメントへの接合、そのペプ
チド接合体の精製、アッセイのための試薬の調製及び試
験方法を、完全な抗体接合体について記載したようにし
て行った。

７−゛　　のＥＢ、Ｍとしてのメツチンの与・１１、ハ
チの毒からのペプチド、すなわちメリチン（ＣＶＬＴＴ
ＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ）を、赤血球結合性モ
ノクローナル抗体に代わるものとして使用した。このペ
プチドは、細胞を溶解しないで赤血球表面に結合する（
Ｄｅｇｒａｄｏ　ＷＦ＋　Ｋｅｚｄｙ　、ＦＪ＋　Ｋａ
ｉｓｅｒ　ＥＴ、Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１９８１；　１０３　；　６７９〜
８１）　、そのペプチドを、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの方
法（ｌｏｄｇｅｓ、　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ａｎａｌ
。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９７５；　６５；　２４１）により
合成した。

ＥＢＭとしてメリチンを使用することの１つの利点は、
それが及びペプチドタイプＡＢＭが単一の単位として合
成され得ることである。

ＡＢＭ及びＥＢＭは、共有結合される必要はない。１つ
の代用手段は、アビジン−ビオチン結合である。

ビオチンによ　−ベル　　たメツチンの８．制メリチン
ペプチド（１０ｇ）を、例１における３、２ペプチドに
ついて記載しているようにしてメルカプトエタノールに
より還元した。回転蒸発した後、サンプルを０．１　Ｍ
のＴｒｉｓ−１１Ｃ１，５ｍＭのＩＥＤＴ八（ｐｌ！３
．０）の溶液２−中に再！課濁し、そしてＮ−ヨードア
セチル−Ｎ−ビチオニルへキシレンジアミン（Ｐｉｅｒ
ｃｅ）　４．３■を含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）　１　ｍＺと反応せしめた。これを室温で１５分間
反応せしめ、そしてビチオニル化された誘４体を、５ｅ
ｐｈａｄｅｘ　ＧＩＯカラムにより副生成物から分離し
た。

アビジンによ　−ベル　れたペプチド３．２の討製３．
２ペプチドを、それが例１において抗体に結合されたの
と同じ態様でアビジンに結合する。

アッセイ アビジンによりラベルされたペプチドの半凝集投与量を
赤血球細胞に添加する。

庄−玉 アビシン化され且つビチオニル化された分子は、交換さ
れ得ることが理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、それぞれ抗原の存在及び不在下で抗体複合体
による陽性及び陰性の凝集結果を示す赤血球の図的な表
示である。 第２図は、それぞれ抗−抗原抗体の存在及び不在下で抗
体及び抗原の複合体による陽性及び陰性の凝集結果を示
す赤血球の図的な表示である。 第３図は、分析物又は抗原の存在により（ａ）赤血球凝
集及び（ｂ）赤血球凝集の阻害を示す図的な表示である
。 第４図は、オーバーランピング抗原アッセイと共に凝集
／非凝集の機構を示す図的な表示である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分析物であるかもしくは該分析物と交差反応可能な
   化合物である別の作用物質の不存在において、予め定め
   られた条件の下で赤血球との凝集物を生成することがで
   きない赤血球結合分子の接合体と、前記分析物に関して
   アッセイ中で使用するための分析物結合分子とを含む凝
   集試薬であって、前記予め定められた条件が前記アッセ
   イの条件であり、前記アッセイが、前記分析物及び赤血
   球に対する結合をひきおこして凝集を惹起するかもしく
   は分析物に関して、前記分析物と交差反応可能な試薬へ
   の結合を防止して凝集を阻止するのに十分な時間にわた
   って血液サンプルを前記試薬とともにインキュベーショ
   ンすることを含む、凝集試薬。 ２、前記赤血球結合分子が、抗−赤血球抗体、又はその
   Ｆ（ａｂ）＿２又はＦａｂ′フラグメントあるいはメリ
   チン又はその特異的結合フラグメントである、請求項１
   に記載の試薬。 ３、前記抗体又はそのＦ（ａｂ）＿２又はＦａｂ′フラ
   グメントがグリコホリンＡ、グリコホリンＢ、膜内在性
   タンパク質１、膜結合糖タンパク質Ｃ４、膜内在性糖タ
   ンパク質、アンキリン、スペクトリン、糖脂質、スフィ
   ンゴ糖脂質、プロテイン４−１又はＦ−アクチンに対し
   て生ぜしめられる、請求項２に記載の試薬。 ４、前記抗体がＲＡＴ　ＩＣ３／８６又はそのＦ（ａｂ
   ）＿２又はＦａｂ′フラグメントである、請求項３に記
   載の試薬。 ５、抗−赤血球抗体に由来する一価のフラグメント及び
   抗−分析物抗体に由来する一価の分析物結合分子の異種
   二官能価ハイブリッド抗体接合体を含む、請求項１〜４
   のいずれか１項に記載の試薬。 ６、前記結合が共有結合の手段によるものである、請求
   項１〜５のいずれか１項に記載の試薬。 ７、前記分析物への前記分析物結合部分の結合により形
   成されるオーバーラップ性エピトープを特異的に認識す
   る第２抗体又はその特異的な結合フラグメントをさらに
   含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の試薬。 ８、前記分析物結合分子がＨＩＶ−１ペプチド又は肝炎
   ウィルスペプチド、ジゴキシン、又はヒトＤ−ダイマー
   、成長ホルモン又は肝炎ウィルスに対して生ぜしめられ
   た抗体又はそのＦ（ａｂ）＿２又はＦａｂ′フラグメン
   ト又は抗−イディオタイプ抗体である、請求項１〜７の
   いずれか１項に記載の試薬。 ９、前記分析物結合分子が本文に規定せるペプチド３．
   ２である、請求項８に記載の試薬。 １０、請求項１〜９のいずれか１項に記載の凝集試薬と
   既知性質の分析物を含有する対照溶液とを含んでなる凝
   集アッセイ試験キット。 １１、分析物であるかもしくは該分析物と交差反応可能
   な化合物である別の作用物質の不存在においてアッセイ
   の条件の下で赤血球との凝集物を生成することができな
   い赤血球結合分子の接合体と、分析物結合分子とを試薬
   として用いた分析物測定のためのアッセイであって、前
   記接合体及び任意の追加の試薬を血液とともに、前記分
   析物及び赤血球に対する結合をひきおこして凝集を惹起
   するかもしくは分析物に関して、前記分析物と交差反応
   可能な試薬への結合を防止して凝集を阻止するのに十分
   な時間にわたってインキュベートすることを含んでなる
   アッセイ。 １２、分析物結合部分の分析物に対する結合によって生
   成せしめられた新しいエピトープに結合する第２抗体を
   添加することをさらに含む、請求項１１に記載のアッセ
   イ。