JPH0824710B2 - 移植用骨コラーゲンマトリックス - Google Patents

移植用骨コラーゲンマトリックス

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JPH0824710B2
JPH0824710B2 JP2504059A JP50405990A JPH0824710B2 JP H0824710 B2 JPH0824710 B2 JP H0824710B2 JP 2504059 A JP2504059 A JP 2504059A JP 50405990 A JP50405990 A JP 50405990A JP H0824710 B2 JPH0824710 B2 JP H0824710B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、インビボにおいて、免疫反応が極めて少な
く自然に吸収される生体適合可能な移植に適する素材お
よびその製造方法に関する。より詳しくは、本発明は同
種間あるいは異種間での移植物として有用であり、骨形
成装置として、移植に適する補綴用の骨粒子コーティン
グとして、インビボで蛋白質を継続的に放出するための
配給ベヒクルとして、および足場依存性細胞を成長させ
る土台として使用するための新しいコラーゲン性骨マト
リックスに関する。
インビボで再度吸収され得る、生体適合可能な、移植
しうる素材は、伝導性の骨成長を促進するために、骨誘
導蛋白質と一緒に用いて骨形成を誘導するために、イン
ビボもしくはインビトロにおいて足場依存性細胞を成長
させるための土台を提供するために、または、例えば治
療薬もしくは抗生物質を継続して放出するためのキャリ
ヤーとして供給するために使用されてきた。そのような
素材は生体に適合可能でなければならない；即ち、イン
ビボにおいて免疫原もしくは連続炎症応答を誘導しては
ならない。その物理学的構造は細胞が侵入できなければ
ならず、またインビボにおいてその機能に応じた吸収時
間を持たねばならない。
インビボにおいて軟骨内の骨形成を誘導しうる骨形成
装置の潜在的有用性は広く認識されている。そのような
装置の有効性は、整形外科医学、ある種の整形外科なら
びに歯周囲および脳顔面頭蓋のさまざまな再構築技術に
大変革をおこすであろうと期待される。
脱石灰化骨マトリックスの移植によって誘導される骨
分化の成長カスケードは、この技術分野で十分に証明さ
れている［レッディ（Reddi）,1981,Collagen Rel.Re
s.,１:209−226）］。表現型形質転換の基礎となる精密
な機構は明確ではないが、骨マトリックスの自然な軟骨
内骨分化活性は二つの主成分：骨形成活性を司る可溶性
蛋白質様成分および不溶性コラーゲン性マトリックス
（骨誘導のキャリヤーとして役立つ成分）に分けて考え
うることが明からにされている。その後、可溶性骨誘導
蛋白質成分は不活性な残余コラーゲン性マトリックスと
共に再構成されて、全骨誘導活性を回復する［サムパス
（Sampath）ら,Proc.Natl.Acad.sci.USA.,78:7599−760
3（1981）］。最近、骨形成の誘導に応答し、本明細書
で以後骨形成蛋白質（OP）と呼ばれる蛋白質因子が精製
され、組換え宿主細胞で発現され、同種間の脱石灰化骨
粉末に適切に吸収された時に真に骨誘導性を示すことが
証明された（米国特許第179,406号）。
研究によって、骨誘導蛋白質が種に関わらず有効であ
るのに対して軟骨内の骨形成の誘導に一般的に用いられ
るコラーゲン性骨マトリックスは種特異性であることが
証明された［サンパスおよびレッディ（1983）,PNAS,8
0;6591−6594］。インビボでの骨誘導システムにおける
キャリヤーとしての脱石灰化し脱脂化し抽出した異種の
骨マトリックスの移植は、おそらく骨マトリックス中の
阻害成分または免疫原成分のため、常に骨形成を誘導し
ない。しかしながら、骨形成装置内で同種の骨形成マト
リックスを使用しても多くの種では骨誘導性の骨形成が
十分でない場合がある。例えば、脱石灰化し、脱脂化し
たサルの骨マトリックスの同種間の皮下移植は、サルに
骨形成を誘導しないことが報告されている［アスペルベ
ルグ（Asperberg）ら,J.Bone Joint Surg.（Br），70
−B;625−627（1988）］。
1986年１月７日に発行された米国特許第4,563,350号
は、抽出し、部分精製した骨誘導蛋白質調製物を共に移
植した時に骨形成活性をもたらすために異種マトリック
スとしてトリプシン処理したウシ骨マトリックスを用い
ることを開示している。骨形成には開示されたマトリッ
クス中に少なくとも５％、好ましくは少なくとも10％の
非原繊維性コラーゲンの存在を必要とするといわれてい
る。該米国特許明細書の著者らは、コラーゲン調製物の
免疫原に部分的に関与するテロペプチドを除去すること
が異種間の移植のためにより好ましいと主張している。
EPO309,241（1989年３月29日公開、1988年９月22日出
願、1987年９月25日優先日）は骨形成蛋白質調製物、な
らびに60〜98％の無機質成分または骨コラーゲン粉末の
いずれか一方および２〜４％のアテロペプチド低免疫原
性コラーゲンを含むマトリックスキャリヤーからなる軟
骨内の骨形成を誘導する装置を開示している。
デアテラージ（Deatherage）ら（1987）,Collagen R
el.Res.,７:2225−2231は、一段階のイオン交換カラム
で最小限精製された、高精製度のヒトＩ型胎盤コラーゲ
ンを再構成したウシ骨マトリックス抽出物からなる、一
見、異種間でも移植可能な装置を開示することを試みて
いる。
整形外科の骨再構築術では、骨損傷を修復するため
に、コラーゲン、金属／セラミックス、ポリマーおよび
金属移植物を基本とした生体素材が移植物として用いら
れている。これらの生体素材は伝導作用によって治療を
補助するものとして知られているが、新しい骨を誘導す
るものではない。骨損傷の輪郭再現（recontouring）ま
たは充填物のように、骨修復の伝導を必要とする外科方
法において用いられる素材の技術の現状は、デアテラー
ジ（1988）,J.Oral Maxillofac.Surg.,17:359−359に
開示されている。記載されている既知の移植用素材（ヒ
ドロキシルアパタイト、凍結乾燥した骨または自己性骨
移植片）はすべて骨誘導特性をほとんどまたは全くもた
ない。骨形成を誘導する能力はほとんどすべての方法で
骨の伝導性以上に好まれる。
米国特許第4,795,469号はリン酸カルシウム無機物
（好ましくは粒子サイズ100〜2000μ）およびアテロペ
プチド、再構築し架橋した原繊維性コラーゲンからなる
骨修復用組成物について開示している。この組成物は骨
の損傷を充填し且つ異種での骨の成長を促進することの
できる非抗原性の生体適合可能な組成物であると主張し
ている。
米国特許第4,789,663号は損傷を新しい骨にさらすこ
とにより骨修復を伝導する効果のある骨および／または
皮膚からの異種コラーゲンであって、酵素処理を行っ
て、テロペプチドを除去し、人為的に架橋した上記コラ
ーゲンを用いることを開示している。
整形外科補綴術の固定の中での骨の成長を強めるため
に、金属性移植物上を多孔質でコーティングしたものが
用いられている。多孔質コーティングの表面化学は骨伝
導の役割を演じるが、骨は骨界面の多孔質コーティング
によって、より高い伸長性およびずれ強度ならびにより
高い硬度を持つと考えられる。移植した補綴物、特に金
属移植物にとって“バイオロジカルアンカー（biologic
al anchor"）の提供が必要であることはこの技術分野
で十分証明されている。補綴移植技術の現状は、スペク
ター（Specter）,1987,J.Arthroplasty,２:163−177に
開示されているが、多孔質コーティングが細胞の成長を
明らかに促進することが示されているため、一般的に多
孔質コーティングした装置が用いられている。
また、最近、移植物の表面をコラーゲン調製物でコー
ティングすることによって移植した補綴物の細胞成長を
増加させる技術が要求されている。例えば、EPO169,001
（1986年１月22日公開）は、コーティングが骨または皮
から精製し殺菌した非免疫原性異種コラーゲン調製物か
らなる、コラーゲン−コーティング補綴物について特許
を請求している。コラーゲンにはアテロペプチドコラー
ゲンが好ましい。コーティングは、補綴物をコラーゲン
懸濁液中に浸すことにより、または補綴物を覆うコラー
ゲンシートを形成することにより作られる。
米国特許第4,812,120号は連続ポリマー層で覆われた
金属芯からなる補綴装置を開示している。外層はコラー
ゲン原繊維の突き出したバイオポリマーからなる。突出
した原繊維は装置移植時に損傷を与える。インビトロで
はマトリックスの表面積およびポアサイズが増加すると
細胞の付着および足場依存性細胞の成長が高まることが
示されている。
インビトロでは、哺乳類細胞の十分な成長が足場依存
性細胞の土台または足場（scaffold）として用いる物質
によって制限される場合がしばしばある。この目的に最
適なマトリックスは、足場依存性細胞に生理的に許容さ
れなければならず、また細胞が付着しうる大きな有効表
面積を提供せねばならない。GB2,178,447（1987年２月1
1日公開）は、10−100μｍの程度のポアサイズ（マトリ
ックスの高さ50〜500μ）をもつオープン型またはクロ
ーズド型の繊維からなる繊維状または多孔質形状のマト
リックスについて開示している。繊維ネットワークは違
った足場の形状を要求された場合、後からでも修飾出来
るようにシート状に成形される。ストランド（Strand）
ら，（Biotechnology and Bioengineering,26;503,19
84）は、マトリックス潅流細胞培養液中の足場依存性細
胞のマトリックスとして用いるためのミクロキャリヤー
ビーズを開示している。試験したビーズ状物質はDEAEま
たはポリアクリルアミドであった。得られる表面積は25
0〜300cm2/gであり、106細胞数/mlの細胞接種を必要と
した。米国特許第4,725,671号は、乾燥させ、かつ好ま
しくは架橋した可溶性アテロペプチドコラーゲン繊維か
らなる、細胞培養液に適したコラーゲン繊維膜を特許請
求している。
既知の確実な放出速度をもつ徐放性の放出ベヒクルの
技術が要求されている。有効なキャリヤーは生体適合で
き、水不溶性であり、必要時間の間重要な治療薬をトラ
ップまたは保持できねばならず，さらにインビボで薬の
所望の放出速度に似せるための吸収時間を持たねばなら
ない。コラーゲンは主にその生体適合可能でかつ生体分
解され得る性質のために、医療のための利用に魅力ある
キャリヤーである。一般にキャリヤーはコラーゲンを可
溶化または分散し、その後溶液を凝固することにより、
スポンジ様構造に形成されるので、単繊維は一般的にラ
ンダムなオープン構造の配列になる。次いで、溶媒を除
去し、分子を化学的に架橋してオープン構造を維持し、
キャリヤーを水不溶性にする。治療化合物は可溶化され
る前に溶液中にコラーゲンと混合されているほうが好ま
しい。
構造はいろいろな形にすることができる。例えば、EP
O230,647（1987年８月５日公開）は、ミクロペレット構
造を開示している。また、構造はシート型（米国特許第
4,703,108号,1987年10月27日発行）、もしくはチューブ
（例えばEPO069,260,1983年１月12日公開、EPO170,979,
1986年２月12日公開、および米国特許第4,657,548号,19
87年４月14日発行）、またはビーズにすることもでき
る。米国特許第4,837,285号（1989年６月６日発行）
は、薬を含む微小小滴を凍結乾燥することにより形作ら
れかつＩ型もしくはIII型コラーゲンを可溶化もしくは
分散させた多孔質ビーズから作られた負傷用外科医薬材
料または薬剤配給システムのための組成物を開示してい
る。微小小滴はその後ゆっくりと凍結乾燥または空気乾
燥されてビーズとされ、次いで架橋される。
残念なことに、コラーゲンの高繊維形成性は、均質か
つ均一な溶液を作り難いものとし、適切なキャリヤーマ
トリックスの効果的な合成を困難にしている。加えて、
架橋試薬（例えばグルタルアルデヒド）の使用は細胞毒
性［クック（Cooke）ら,British J.Exp.Pathl.,64;17
2,1983）のような好ましくない生物学的影響を与える場
合もある。
本発明の目的は、生体適応が可能で、インビボで生体
分解され、重大な阻害もしくは免疫原性応答がほとんど
または全くなく哺乳類宿主に移植可能な骨マトリックス
を提供することにある。他の目的は、ヒトを含む哺乳類
の中で軟骨内の骨形成を作り出す骨誘導蛋白質と組み合
わせうる、生体適合可能な、インビボで生体分解される
マトリックスを提供することにある。他の目的は生体内
に移植可能な保護装置をコーティングするための優れた
素材を提供すること；そのような装置内への細胞の成長
を増加させること；放出させる医薬組成物を維持するキ
ャリヤーとして使用するための生体適合可能な、インビ
ボで生体分解されうるマトリックスであって、その再吸
収速度を医薬品のそれと釣合うように調整しうるマトリ
ックスを提供すること；および足場依存性細胞の足場ま
たは土台として働きうる生体適合可能な、インビボで生
体分解されうるマトリックスであって、細胞の付着しう
る表面積を調整しうるマトリックスを提供することにあ
る。本発明の他の目的はそのようなマトリックスの製造
方法を提供することにある。
本発明のこれらのおよびその他の目的ならびに特徴は
以下の説明、図面および請求の範囲から明らかになるで
あろう。ここで用いる「骨コーティングマトリックス」
または「骨マトリックス」は、皮を剥ぎ、きれいにして
脱骨髄化し、粉砕し、脱脂した骨であって、これをさら
に脱石灰化し、グアニジン塩酸または当量の抽出剤で蛋
白質を抽出した上記の骨を意味する。ここで用いる「移
植しうる」とは、外科的導入ならびに局所適用および注
射による導入を含む。
発明の概要 本発明は宿主に対して同種であってもよくまた異種で
あってもよく、さらに宿主内への移植時に生体分解され
かつ間充織細胞（mesenchymal cell）の遊走および増
殖を助ける土台として役立ちうる、生体適合可能な、ミ
ネラルを含まない、脱脂した、不溶性のＩ型骨コラーゲ
ンからなる、哺乳類宿主に移植するためのマトリックス
からなる。ここに開示するように、マトリックスは哺乳
類の体内に確実にかつ再生的に軟骨内の骨形成を誘導す
るために骨形成蛋白質と結合していてもよい。また、マ
トリックスは移植可能な補綴用装置のまわりの表面被覆
として、細胞の成長を促進するために用いてもよい。マ
トリックスは哺乳類の体内に種々の組成物を継続的に放
出するためのキャリヤーとして働き、かつ足場依存性細
胞のための生体適応可能な基質を提供しうる。
このマトリックス素材の開発は、異種の骨マトリック
スおよび骨形成蛋白質の移植を成功させるために必要と
される基本的特徴の発見の結果成し得たものである。研
究によって、実質上純粋な骨形成蛋白質および同種の脱
石灰化し、脱脂したグアニジン抽出の骨マトリックスか
らなる骨形成装置は、遊走細胞の流入、増殖および分化
を可能にするために必要な大きさの間質（隙間）を有す
るべきであることが示唆された。また、異種の骨マトリ
ックスからなる骨形成装置はインビボでほとんどまたは
全く軟骨内の骨形成を誘導しないことがわかった。一般
的に、異種マトリックスによって骨が形成されないの
は、マトリックス内に残存する蛋白質成分（コラーゲン
テロペプチドまたは関連する非コラーゲン生体分解糖蛋
白質のいずれか）に対する免疫原性または阻害性応答に
よるものと考えられている。
本発明によれば、全比表面積（表面積／単位量）、多
孔性およびミクロピットの程度、ならびにマトリックス
のミクロピットおよびポアのサイズが異種間移植を成功
させるために、さらにはある種の同種間移植のためにも
重要であることが明らかにされた。
第１図および第２図のパネルＡおよびＢは、それぞれ
ラットおよびウシの脱石灰化した、グアニジン抽出の骨
マトリックスの粒子構造を示す走査型電子顕微鏡写真
（SEMs）である。SEMsからわかるように、ラットの骨マ
トリックスはそれ自体ウシの骨マトリックスより大きい
多孔質または表面積を持つ。骨マトリックスの多孔性お
よび粒子内表面積を増加させると、ラットのコラーゲン
性骨マトリックスの移植によって証明されたように骨形
成の誘導性が促進され得ることが明らかになっている。
このことはコラーゲン性骨マトリックスをその形態を変
化させるように、ある種の溶媒または熱で処理すること
により成し遂げられる。この目的に適当な試薬をここに
開示し、コラーゲン原繊維修飾試薬と呼ぶ。
一つの態様において、本発明は宿主と同種または異種
であって、非コラーゲン性蛋白質を枯渇させた、好まし
くは70μｍ〜850μｍの範囲の平均直径を持ち、かつ未
処理の素材と比較して表面積が増加した粒子の形状を有
し、生体分解されることが出来、生体適応可能な、無機
質を含まない、脱脂した、不溶性のＩ型骨コラーゲンか
らなる、哺乳類宿主内に移植するためのマトリックスで
ある。
処理したマトリックス素材は、未処理の素材より好ま
しくは25％以上、またときには50％またはそれ以上、侵
入容積（intrusion volume）が増加し、ポアまたはミ
クロピットの数が増加し、BET法で測定したところによ
れば少なくとも２倍の表面積を持つ。好ましい粒子素材
は、相互接着し形を成した粒子の塊として、または粒子
を閉鎖的にパッキングした単一の塊として使用してもよ
く、その粒子サイズは150〜420μｍの範囲である。
本発明の他の態様は、コラーゲンマトリックスの多孔
性を増加させて、表面積の所望の増加が達成されるよう
に脱石灰化し脱脂しグアニジン抽出したコラーゲン性骨
マトリックスをコラーゲン原繊維修飾剤で処理する方法
を含む。ここに記載するマトリックス処理は、マトリッ
クス粒子の多孔性およびミクロピットを増加させ、それ
に伴って粒子の形態を変化させる。好ましい実施態様に
おいて、表面は高倍率に拡大すると1.0〜100ミクロン程
度の範囲の平均ポアサイズで重層構造をとり、カキの殻
に似た外観をとる。このことは、酸処理［例えばトリフ
ルオロ酢酸（TFA）またはフッ化水素（HF）］のみ、ま
たは好ましくは酸性化有機溶媒、例えばジクロロメタン
（DCM）、アセトニトリル（ACN）、イソプロパノール
（IP）および／またはクロロホルムの使用によって達成
されうる。これらの試薬は全て蛋白質変性特性を有する
こと、およびコラーゲン原繊維を修飾することにより不
溶性コラーゲン性蛋白質を膨張させることが知られてい
る。これらの試薬は全ての蛋白質を変性させる性質をも
つこと、およびコラーゲン原繊維を修飾することにより
不溶性コラーゲン性蛋白質を膨張させることが知られて
いる。これらの試薬の中で好ましいものはDCMおよびACN
である。現状における最も好ましい試薬は、少量例えば
0.1％のTFAで酸性にしたDCMまたはACNである。このよう
な変化はインビボでのマトリックスの吸収時間を増加ま
たは減少させる潜在的な効果を持つ。これらのうちの１
つは、インビボでのマトリックス吸収速度を短くするた
めに処理時間を延ばすことである（処理時間をより長く
すると再吸収速度はより速くなる）。
また、表面の形態は、脱石灰化し、脱脂し、グアニジ
ン抽出した骨コラーゲンを水中で高めた温度（37〜65
℃、好ましくは45〜60℃）に、１時間または所望の表面
形態が得られるために充分な時間、加温することにより
えられる。そのメカニズムはまだ明らかでないが、コラ
ーゲンを加温することによりコラーゲン原繊維が変化
し、その結果表面積が増加するためと予測される。コラ
ーゲンのような骨マトリックスは、温度と種々に上昇さ
せて水中（1g/30ml）で撹拌しながら処理し、次いで濾
過してもよい。水中で温度を上昇させて行う不溶性コラ
ーゲンの処理は、最初は、融解温度（Tm）、即ちラセン
構造から非ラセン構造へ全体の1/4〜3/4を転移させるの
に必要とされる温度に達する。次いで原繊維は突然、収
縮温度（Ts）とよばれる、あるより高い温度で何分の１
かの長さに収縮するであろう。Tsは通常はTmより高く、
分子のパッキングによって付加される更なる安定性を示
す。コラーゲンをおよそ５以下のpHで加熱すると、Tmお
よびTs両温度は下がるであろう。
溶媒処理した骨コラーゲンマトリックスを試験するこ
とにより、脱石灰化し、グアニジン抽出した異種のウシ
の骨はそれに関連する付加成分の混合物を有すること、
さらにこれらの成分の抽出はマトリックスの生物学的性
質を改良する役割を果たすことが分かった。マトリック
スのコラーゲンはまた脱グリコシル化されてもよい。
原繊維修飾試薬でのマトリックスの処理に続いて適切
な洗浄がなされねばならない。一般的に、処理は行った
が未洗浄のままの骨マトリックスは骨形成蛋白質と共に
哺乳類宿主に移植した場合に骨誘導性が小さい。第３図
のパネルＡおよびＢは洗浄処理が粒子内表面積に及ぼす
劇的な効果を示している。一般に好適な洗浄とは尿素含
有バッファーおよび水あるいは生理食塩水バッファーに
よる。
哺乳類の骨組織の成長には、遊走性始原細胞の流入、
増殖および分化が必要である。したがって、一つの態様
において、本発明は遊走性細胞の流入、増殖および分化
を可能ならしめるに必要な大きさの間質を有するパッキ
ングされたマトリックス粒子であって、好適には150〜4
20μｍの範囲の粒子直径を有するマトリックス粒子から
なる。また、マトリックス粒子は脱グルコシル化されて
いてもよい。マトリックスは分散した蛋白質、例えば骨
形成蛋白質を含み、かつ哺乳類内への移植時に軟骨内の
骨形成を誘導する能力がある。本質的に純粋な骨形成蛋
白質をマトリックス粒子上に吸着させる好適な手段に
は、グアニジン塩酸溶液から冷エタノール沈澱を行うこ
と、またはアセトニトリル／トリフルオロ酢酸またはPB
S中でインキュベーションを行うこと、次いで凍結乾燥
を行うことが含まれる。マトリックスは複雑骨折をつな
ぐ形であっても、または哺乳類宿主の骨の損傷を埋める
形であってもよい。
また、生体適合可能でインビボで生体分解されうるマ
トリックスの性質によって、このマトリックスはインビ
ボで治療用医薬品を継続的に放出するための配給ベヒク
ルとしての使用に適したものになる。多孔性を増加させ
ることにより治療薬をトラップし吸収するマトリックス
の能力を増加させうる。さらに、処理時間、溶媒濃度お
よび関連する処理パラメーターを変化させることによっ
てインビボでのマトリックスの吸収速度を変化させ得る
ことが明らかになった。このように、本発明は非常に融
通性のある、簡単に得られるキャリヤー素材を提供す
る。この開示から、当業者は特定の所望する確実な吸収
時間を有するキャリヤーマトリックスを簡単に製造でき
る。その後、当業者はここに開示した方法のうちの一
つ、またはこの分野で知られている任意の技術を用いて
重要な薬品をマトリックス上に吸着させて、治療化合物
の放出が確実に行われるように改良した継続的放出ベヒ
クルを得ることができる。
本発明の素材の性質が粒子状でかつ多孔性であるとい
うことは、骨マトリックスに宿主内での生体適合性に加
えて、移植した補綴装置の界面および哺乳類組織の周囲
での使用を可能にし、細胞の成長を促進する。さらにマ
トリックス構造は、これらの組成物中に一般に用いられ
ているコラーゲン原繊維と比較した場合、移植時中の耐
久性を増加させるために役に立つ。この開示によって、
当業者は特定のあらかじめ決めておいた多孔性またはミ
クロピットおよび増加された耐久性を有する補綴装置の
ための表面コーティングを簡単に作り出すことができ
る。次いで、この技術分野で既知の任意の技術を用い
て、補綴用芯に皮膜を付着させることができる。例えば
クック（Cook）ら,Clin.Ortho.Rel.Res.,232;225（198
8）を参照されたい。さらに、軟骨内の骨誘導を所望す
るばあいには、マトリックスは骨形成蛋白質を包含する
ことが出来る。
また、本発明のマトリックスの性質によって、このマ
トリックスはインビトロにおいて足場依存性細胞の成長
のための優れた土台となる。マトリックス自体は細胞の
付着を生理学的に受容しうる表面を提供し、粒子の間質
ならびに粒子内の多孔性およびミクロピットは他の既知
マトリックス上の細胞付着可能表面積に比べて明らかな
増加を提供する。3000cm2/gまたはそれ以上の程度の表
面積が簡単に達成され得る。さらに本発明のマトリック
ス構造によってマトリックスを所望どうりの粒子多孔性
に変化させることができる。このマトリックス内に存在
するポアのカスケードは、細胞への効果的な栄養の接近
を提供し、細胞付着可能表面積を増加させ、それゆえ細
胞潅流システム内に必要とされる細胞接種濃度を低下さ
せる（GB2,178,447を参照されたい）。この開示によっ
て、当業者は特定の、既知の、所望の多孔性または表面
微細構造を有する卓越した生体適合可能なマトリックス
を効率良く作成できる。
図面の簡単な説明 本発明の前述の目的およびその他の目的、それらの種
々の特徴ならびに本発明自体は、以下の説明および図面
を参照することにより、より完全に理解されよう。
第1Aないし1F図はそれぞれ、 （1A）脱石灰化し、グアニジン抽出したラットの骨マ
トリックス（498×）；（1B）脱石灰化しグアニジン抽
出したウシの骨マトリックス（480×）；（1C）脱石灰
化しグアニジン抽出したウシの骨マトリックスをさらに
フッ化水素（HF）で処理し、洗浄したもの（350×）；
（1D）脱石灰化しグアニジン抽出したウシの骨マトリッ
クスをさらに99.9％ジクロロメタンおよび0.1％トリフ
ルオロ酢酸（DCM/TFA）で処理し洗浄したもの（441
×）；（1E）脱石灰化しグアニジン抽出したウシの骨マ
トリックスをさらに99.9％アセトニトリルおよび0.1％
トリフルオロ酢酸（ACN/TFA）で処理し洗浄したもの（4
29×）；ならびに（1F）脱石灰化しグアニジン抽出した
サルの骨マトリックスをさらにフッ化水素（HF）で処理
し、洗浄したもの（350×）：の走査型電子顕微鏡写真
（＜500×）である。
第2A〜2E図はそれぞれ、 （2A）脱石灰化し、グアニジン抽出したラットの骨マ
トリックス（9800×）；（2B）脱石灰化しグアニジン抽
出したウシの骨マトリックス（8700×）；（2C）脱石灰
化しグアニジン抽出したウシの骨マトリックスをさらに
フッ化水素で処理し、洗浄したもの（5000×）；（2D）
脱石灰化しグアニジン抽出したウシの骨マトリックスを
さらにDCM/TFAで処理し洗浄したもの（8000×）；なら
びに（2E）脱石灰化しグアニジン抽出したウシの骨マト
リックスをさらにACN/TFAで処理し洗浄したもの（11000
×）：のの走査型電子顕微鏡写真（＞5000×）である。
第3Aおよび3B図はそれぞれ、 （3A）脱石灰化しグアニジン抽出したウシの骨マトリ
ックスを、さらにジクロロメタンで処理し未洗浄のも
の；および（3B）脱石灰化しグアニジン抽出したウシの
骨マトリックスを、ジクロロメタンで処理し洗浄したも
の：の走査型電子顕微鏡写真（5000×）である。
第4A図はDCMおよびDCM/TFAを用いてさまざまに処理し
たウシの骨マトリックス素材、ならびに異なる量の骨形
成蛋白質の存在下における骨形成の指標として測定し
た、アルカリホスファターゼ活性の棒グラフである。
第4B図は温度処理したウシの骨マトリックス素材の存
在下における骨形成の指標として測定したアルカリホス
ファターゼ活性の棒グラフである。
第5A〜5D図はそれぞれ、 （5A）37℃、（5B）45℃、（5C）55℃、および（5D）
65℃で水中で１時間熱処理したウシの骨マトリックスの
走査型電子顕微鏡写真（およそ1000×）である。第1B図
の未処理のウシの骨マトリックス（480×）と比較され
たい。
発明の詳細な説明 本発明を実施するにあたっては、骨、好ましくは哺乳
類の骨、例えばウシの骨の入手性が必要とされる。骨は
種々の医療的処置に有用な移植しうる素材を製造するた
めに、汚れを除き、脱骨髄化し、脱脂し、脱石灰化（脱
ミネラル化）し、適切な大きさの粒子まで小さくし、可
溶性蛋白質を除去するために抽出し、殺菌し、その他に
ここに開示する方法にしたがって処理する。
本発明の素材から作った種々の形のマトリックスは、
種々の目的のために外科的に移植されてよい。こられの
うちの主なものは継続的放出キャリヤーとして、または
移植用コラーゲン性コーティングとして、種々の整形外
科、歯周囲、および再建処理における骨形成用マトリッ
クスとして役立つものである。マトリックスは手術前に
予定した形に成形されてもよく、または手術中に医者も
しくは技師によって成形されてもよい。このように、素
材は局所、皮下、腹腔内、または筋肉内への移植用に用
いてもよい；また、癒着不能骨折をつなぐように、また
は骨損傷を埋めるように成形されてもよい。骨の形成ま
たは誘導処理中に、素材はゆっくりと体内に吸収され且
つ移植した形もしくはそれに非常に近い形で骨におき代
わる。
種々の成長因子、ホルモン、酵素、治療用組成物、抗
生物質、および他の体内処理試薬をキャリヤー素材上に
吸着させてもよく、これらは移植時にマトリックス素材
がゆっくりと吸収される間に時間をかけて放出されるで
あろう。
したがって、EGF,PDGF,IGF,FGF,TGF−αおよびTGF−
βのような種々の既知の成長因子がインビボで放出され
てもよい。素材は抗生物質、化学療法剤、インシュリ
ン、酵素または酵素阻害剤を放出するためにも使用され
得る。
本発明の素材の製造方法および使用方法の詳細を以下
に説明する。
A.脱石灰化骨の調製 脱石灰化したウシの骨マトリックスは先に記載された
方法［サムパス（Sampath）およびレッディ（Reddi）,1
983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80;6591−6595］によって
調製した。ウシの骨幹の骨（年齢１〜10日）は、近くの
屠殺場から入手し、新しいうちに使用した。骨は筋肉お
よび脂肪を除き、骨膜を取り除き、冷水の圧力で脱骨髄
化し、冷エタノールに浸し、−20℃で保存した。次いで
乾燥して圧搾破砕し、大型のミルで粉砕した。液体窒素
を用いて加熱されぬように注意した。粉砕した骨は70〜
850μｍ、好ましくは150〜420μｍの範囲の粒子サイズ
に製粉し、さらに３倍量のクロロホルムおよびメタノー
ル（3:1）でおよそ２時間づづ２回洗浄することにより
脱脂した。次いで粒子状の骨を１倍量の無水エタノール
で洗浄し、１倍量の無水エーテルで乾燥させて脱脂した
骨の粉末を得た。次いで脱脂した骨粉末を10倍量の0.5N
HCl,4℃で40分間、４回連続して処理することにより
脱石灰化した。最後に脱石灰化した骨粉末を大量の水で
中和洗浄した。
B.グアニジン抽出 次いで、脱石灰化した骨マトリックスは５倍量の4Mグ
アニジン塩酸、50mMトリス塩酸、pH7.0,16時間,4℃で抽
出した。懸濁液を濾過した。不溶性素材を収集し、マト
リックスの製造に用いた。素材は事実上主にコラーゲン
である。素材は骨形成または軟骨形成活性を全く含まな
い。
C.マトリックス処理 全骨マトリックス主成分はＩ型コラーゲンである。コ
ラーゲンの他、前述の方法で抽出した脱石灰化した骨は
５％容量の非コラーゲン性蛋白質を含む。異種マトリッ
クスにおいてこのような非コラーゲン性成分はそれ自身
潜在的抗原として存在する場合もあり、また免疫原およ
び／または阻害成分の構成成分になる場合もある。ま
た、このような成分は骨分化の成長カスケードを妨げる
ことによって同種間移植における骨形成をも阻害する。
下記の処理では溶媒を用いてマトリックスから潜在的な
非所望成分を抽出し、溶媒または熱処理を用いてマトリ
ックス素材の表面構造を変化させた。
溶媒と接触させた後、抽出成分を除去するため、処理
マトリックスを次に示す方法で洗浄した： 1.TBS（トリス−バッファー塩類溶液）に1g/200mlに懸
濁し、４℃で２時間撹拌する；または6M尿素、50mMトリ
ス塩酸,500mM NaCl,pH7.0（UTBS）もしくは水に懸濁
し、室温（RT）で30分間（pHを中性にするのに充分な時
間）撹拌する； 2.遠心分離し、洗浄段階を繰り返す；および 3.遠心分離し、上澄みを捨て；残渣を水で洗浄し、次い
で凍結乾燥する。
C1.酸処理 1.トリフルオロ酢酸 トリフルオロ酢酸はコラーゲン原繊維を修飾する蛋白
質にとって既知の膨潤剤である非酸化性強酸である。
上述の方法にしたがって調製したウシの骨の残渣をふ
るいにかけ、適切なサイズの粒子を収集する。こうして
調製した粒子を種々の百分率（1.0％〜100％）のトリフ
ルオロ酢酸および水（V/V）,0℃または室温で１〜２時
間、常に撹拌しながら抽出した。処理したマトリックス
を濾過し、凍結乾燥した；または水／食塩で洗浄し、次
いで凍結乾燥した。
2.フッ化水素 トリフルオロ酢酸と同様にフッ化水素は強酸であり且
つ膨潤剤であり、且つまた粒子内の表面構造を変化させ
る能力を持つ。また、フッ化水素は既知の脱グリコシル
化試薬である。このように、HFはグアニジン抽出後もマ
トリックスと結合している抗原性炭水化物を含む任意の
糖蛋白質を除去して、このようなマトリックスの骨形成
活性を増加させるように働く場合がある。
上述の方法にしたがって、調製されたウシの骨の残渣
をふるいにかけ、適当なサイズの粒子を収集する。サン
プルをP2O5上、真空下で乾燥させ、反応溶液に移し、サ
ンプルを−70℃で留出させた無水フッ化水素にさらす
（マトリックス1g当たり10〜20ml）。容器を０℃に暖
め、反応混合物をこの温度で120分間撹拌する。真空下
でフッ化水素を蒸発させた後、残渣を真空下、KOHペレ
ット上で徹底的に乾燥していかなる残存微量酸も除去す
る。脱グリコシル化の程度は、フッ化水素処理以前およ
び以後のマトリックスサンプルを適当に洗浄して非共有
結合の炭水化物を除去した後、炭水化物を分析して定量
できる。HF処理した素材からSDS抽出した蛋白質は、CON
Ａブロッティングによって定量したところ炭水化物
（−）であった。
次に、脱グリコシル化した骨マトリックスは、TBS
（トリスバッファー塩類溶液）またはUTBS中で２回洗浄
し、水洗浄し、次いで凍結乾燥した。
他の酸による処理が、HFおよびTFAに加えて試みられ
ている。現在のところTFAはその揮発性故にこれらの処
理の中で好適な酸性化試薬である。しかしながら、酢酸
または蟻酸のような他の潜在的な腐食性の少ない酸を使
ってもよいことが分かっている。
C2.溶媒処理 1.ジクロロメタン ジクロロメタン（DCM）は蛋白質の一次構造に影響を
与えずに蛋白質を変性させ得る有機溶媒である。この膨
潤試薬は自動ペプチド合成装置の共通試薬であり、成分
除去のための洗浄段階に用いられる。
上述の方法にしたがって調製したウシの骨の残渣およ
び適切なサイズの粒子は、100％DCM、好適には99.9％DC
M/0.1％TFA中でインキュベーションした。マトリックス
は１または２時間,0℃または室温で膨潤試薬とともにイ
ンキュベーションした。別に，マトリックスをインキュ
ベーションせずに試薬で多数回（×３）短時間洗浄（そ
れぞれ20分間）する処理も行った。
第4A図はラット内での骨形成マトリックスとして有用
な素材へウシのマトリックスを変えるにあたって、有機
溶媒膨潤試薬処理中に少量の酸が存在すると効果的であ
ることを示している。
2.アセトニトリル アセトニトリル（ACN）は、蛋白質の一次構造に影響
を与えずに蛋白質を変性させ得る有機溶媒である。ACN
は高速液体クロマトグラフィーに用いられる一般の試薬
であり、疎水的相互作用を乱すことにより蛋白質をシリ
カカラムから溶出させるために用いられる。
上述の方法にしたがって調製した適切なサイズのウシ
の骨残渣からなる粒子は、100％ACN（1.0g/30ml）、ま
たは好適には99.9％ACN/0.1％TFA、室温で１〜２時間、
一定速度で撹拌しながら処理した。次いで処理したマト
リックスを水で洗浄し、尿素バッファーまたは4M NaCl
で洗浄し、凍結乾燥した。別にACNまたはACN/TFA処理し
たマトリックスを洗浄せずに凍結乾燥した。
3.イソプロパノール イソプロパノールもまた、蛋白質の一次構造に影響を
与えずに蛋白質を変性させ得る有機溶媒である。イソプ
ロパノールもシリカHPLCカラムから蛋白質を溶出させる
ために用いられる。
上述の方法にしたがって調製した適切なサイズのウシ
の骨残渣から成る粒子を100％イソプロパノール（1.0g/
30ml）、または好適には0.1％TFAを含むイソプロパノー
ル、室温で１〜２時間、一定速度で撹拌しながら処理し
た。次いでマトリックスを凍結乾燥する前に水で洗浄、
または尿素バッファーもしくは4M NaClで洗浄した。
4.クロロホルム クロロホルムもまた、クロロホルムのみあるいは酸性
化試薬共存下のいずれかで、上述の試薬と同様に骨マト
リックスの表面積を増加させるために用いられる。
上述の処理は移植する前に素材が病原体を含んでいな
いことを保証するためにも有効である。
C3.熱処理 さまざまな量の脱脂し、脱石灰化し、グアニジン抽出
した骨コラーゲンを水中（1g/30ml）で一定速度で撹拌
しながら、水浴を取り付けたガラスフラスコ中で加熱
し、所望の温度に１時間維持した。ある場合には、加熱
前のコラーゲンの膨張を助けるために、水を0.1M酢酸で
置き換えた。用いた温度（室温および約37、45、55、6
5、75℃）は一定に保った。熱処理後マトリックスは濾
過し、凍結乾燥して移植用に使用した。結果を第4B図に
示す。第８図に、37、45、55および65℃で処理して首尾
良く変化したコラーゲン表面の形態を例示する。
コラーゲンマトリックス素材は、非接着性粒子からな
る水不溶性の微細粉末の形をとることが好ましい。コラ
ーゲンマトリックス素材は新しい骨の成長または継続的
放出が所望される容量にパッキングすることにより簡便
に用いられ、周囲組織によって適所に保たれてもよい。
別法として、粉末を例えば体内に容易に吸収されるゼラ
チンまたはポリ乳酸コーティング内にカプセル化しても
よい。粉末は所望の寸法の容量に形成されてもよく、さ
らに例えば可溶性の特定の生体適合可能なコラーゲンを
用いて、粒子を相互に付着させることにより所望の形に
保ってもよい。また素材をシート、ロッド、ビーズまた
はその他の肉眼で見える大きさの形に作ってもよい。
種々のマトリックスの機能性はインビボにおけるラッ
トのバイオアッセイで上昇させることができた。ラット
での研究によって、マトリックス内に分散させた骨形成
蛋白質量に依存する適切なマトリックス内での骨形成効
果が示された。マトリックスのみを移植した場合活性は
認められなかった。文献に記載されているような脱石灰
化し、グアニジン抽出した異種骨素材は、上述の方法に
したがった処理を行わずに移植した場合には、キャリヤ
ーとして効果的でなく、骨誘導性を欠き、炎症および免
疫応答をひきおこす。数多くの同種のマトリックス素材
もまた、キャリヤーとして効果的でない。以下に、上述
の方法したがって調製した対照標準およびマトリックス
素材から骨形成装置を製造するための種々の方法および
骨形成性を上昇させるための種々の方法について述べ
る。
A.骨形成装置の製作 骨形成蛋白質は米国特許出願第179,406号（1988年４
月８日出願）;PCT出願US89/01469（発明の名称：生合成
骨形成蛋白質およびそれを含有する骨形成装置）、およ
びPCT出願US89/01453（発明の名称：骨形成デバイス）
に開示された方法を用いて取得してもよい。両PCT出願
は1989年４月７日に出願されている。別の方法として、
装置作成に有用な骨形成蛋白質に富む抽出物を米国特許
第4,294,753号に開示された方法にしたがって取得して
もよい。これらの文献の開示は参照により本明細書に含
まれる。
A1.エタノール沈澱 マトリックスをグアニジン塩酸中に溶解した骨形成蛋
白質に加えた。サンプルは渦巻撹拌し低温でインキュベ
ーションした。次いでサンプルをさらに渦巻撹拌した。
冷無水エタノールを混合物に加え、次いで撹拌しインキ
ュベーションした。遠心分離（微量遠心分離，高速）
後、上澄みを捨てた。マトリックスを低温の濃厚エタノ
ール／水で洗浄し、次いで凍結乾燥した。
A2.アセトニトリル／トリフルオロ酢酸−凍結乾燥 この方法では、アセトニトリル／トリフルオロ酢酸
（ACN/TFA）溶液中の骨形成蛋白質をキャリヤーマトリ
ックスに加えた。サンプルは激しく何回も渦巻撹拌し、
次いで凍結乾燥した。骨形成蛋白質は濃度を変化させ
て、さまざまな程度の純度のものを加えた。現在のとこ
ろ、この方法が好ましい。
A3.尿素−凍結乾燥 尿素バッファー中で調製した骨形成蛋白質の場合に
は、蛋白質をマトリックス素材と混合し、何回も渦巻撹
拌し、凍結乾燥した。凍結乾燥した素材はそのまま移植
用に用いてもよい。
A4.バッファー化生理食塩水−凍結乾燥 生理食塩水中の骨形成蛋白質調製物もまたマトリック
スと渦巻撹拌し、凍結乾燥して骨形成活性素材を製造し
てよい。
また、これらの方法は、継続的放出を目的として、他
の活性のある治療薬、ホルモン、およびさまざまな生理
活性物質を吸着するためにも用いうる。
B.移植 サムパス（Sampath）およびレッディ（Reddi）によ
り、1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80;6591−6595に記
載された方法（参照により本明細書に含まれる）による
骨誘導についてのバイオアッセイは、軟骨内の骨の分化
活性の検査に用い得る。このアッセイは、ウシの試験サ
ンプルをエーテル麻酔下で異種動物宿主のラットの皮下
部位に移植することからなる。雄のロング−エバンス
（Long−Evans）ラット（28−32日令）を用いた。無菌
条件下で胸部領域上の皮膚に垂直切開（1cm）を加え、
鈍く切開することによりポケットを作成した。およそ25
mgの試験サンプルをポケット内に深く移植し、切開部を
金属皮膚クリップで閉鎖した。移植日を実験開始日とし
た。12日後に移植物を除去した。この従属栄養の実験部
位（heterotropic site）は、正常部位（orthotropic
site）を用いることによる不正確さを伴うことなく、
骨誘導の研究を可能にした。
C.細胞内での現象 移植成功例では：（１）多形核白血球の一過性の浸潤
（１日後）；（２）間充織細胞の遊走および増加（２お
よび３日後）；（３）軟骨細胞の出現（５および６日
後）；（４）軟骨のマトリックス形成（７日後）；
（５）軟骨の石灰化（８日後）；（６）血管の侵入、骨
芽細胞の出現、および新しい骨の形成（９および10日
後）；（７）骨芽細胞および骨の再形成ならびに移植マ
トリックスの分解（12〜18日後）；および（８）小骨内
での造血性骨髄の分化（21日後）；からなるマトリック
スが誘導する軟骨内の骨形成段階を経る統制された発達
経過が示された。得られた結果から、新しい骨の形は移
植したマトリックスの形に従うことが示された。
D.組織学的評価 組織切片および染色は、移植における骨形成範囲を決
定するのに好適である。移植物は、ブアン氏液で固定
し、パラフィンで包埋し、６〜８μｍの切片に切断し
た。トルイジンブルーまたはヘマトキシリン／エオジン
での染色によって、軟骨内の骨の最終形成が明確に証明
された。通常、移植物が新しく誘導された骨を含んでい
るか否かを決定するには12日後の移植物で充分である。
E.生物学的マーカー アルカリホスファターゼ活性を、骨形成マーカーとし
て用いてもよい。酵素活性は移植物をホモジナイズした
後、分光光度計で定量してもよい。活性はインビボでは
９〜10日後にピークに達し、その後ゆっくりと減退す
る。組織学的に骨の形成を示さなかった移植物はこのよ
うなアッセイ条件下でアルカリホスファターゼ活性をほ
とんどまたは全く持たなかった。このアッセイは定量を
行うために、および移植物をラットから除去した後に迅
速に骨の形成を評価するために有用である。これと別
に、移植物のカルシウム含有量を測定することにより骨
の形成量を定量することができる。
F.結果 HF−,DCM−,DCM/TFA−，およびACN/TFAで処理した骨
マトリックスを用いて作成した移植物の組織学的評価を
第１表および第4A図に示す。これらの実験に用いた骨形
成蛋白質は、米国特許出願第179,406号に開示された方
法にしたがって単離した。実験は高純度（Ｃ−18）蛋白
質を用いて行った。結果は、ここに開示した方法にした
がって処理したコラーゲン性のウシの骨マトリックスの
異種への移植が軟骨内の骨形成に好結果をもたらすこと
を明確に証明している。
第4A図は、DCMのみ、99.9％DCM＋0.1％TFA、および90
％DCM＋10％TFAで処理済、および未処理の同種のラット
のマトリックスならびに異種のマトリックスについて、
ng量の精製したOPで処理した水洗浄マトリックスの骨誘
導効果を、アルカリホスファターゼの比活性によって示
している。第4A図に示すように、低酸性化濃度の酸を含
有するDCMが骨形成を促進した。
骨形成移植物として使用するに当たっての本発明の素
材の有用性は、サイズ範囲１〜100μｍのミクロピット
およびポアの形成を含む、粒子内表面積の増加に一部依
存すると考えられる。この結論の根拠は第1A〜2E図の観
察および比較から明らかである。第1A図および第2A図に
示すように、未処理のラットマトリックスはラット内で
活性であり、明白なオープンポアの高表面積構造を持
つ。第1Bおよび第2B図の未処理のウシマトリックスはラ
ットより表面積が小さく、ラット内で不活性である。し
かしながら、ウシコラーゲンをHF（第1C図および第2C
図）、DCM/TFA（第1Dおよび第2D図）またはACN/TFA（第
1Eおよび第2E図）で処理すると、異種にも活性を示すオ
ープンポア、高表面積構造が形成される。貫入容積によ
って測定したことろ、ポア数、平均ポア直径および全表
面積、すべては種々の処理によって増加する。表面への
「カニ外皮構造」の出現に帰着するポア内へのポアおよ
びミクロピット内へのミクロピットの典型的な出現に注
目されたい。第３図はDCMで処理し、次いで洗浄した時
および洗浄しなかったとき（それぞれ第3Aおよび第3B
図）のウシの骨マトリックス粒子の出現について示して
いる。図に示すように、洗浄を省略すると未処理のウシ
コラーゲンと同様の低表面積構造を形成し、結局不活性
なマトリックス素材になる。第1F図は上述の方法に従っ
てHFで処理した後のサルの骨コラーゲン構造を示してい
る。骨粒子は骨を誘導するために異種間で使用してもよ
い。脱石灰化しグアニジン抽出したサルの骨は、報告に
よれば、骨形成マトリックスとしても同種への移植物と
しても有効ではない。
顕微鏡的および形態学的観察を確証する方法として、
処理マトリックスについて数多くの物理的分析を行っ
た。水銀ポロシメトリーを種々のマトリックスの多孔性
およびミクロピットの深さを比較するために使用した。
この標準的方法は、適用圧力が増加すると、水銀の素材
内への侵入が増加する能力に依存する。処理した骨マト
リックスのような有機体素材の場合、この圧力は素材の
破裂点以下で行わねばならず、さもなければオングスト
ロームのレベルでポアの直系の情報が狂う誤りが生じる
であろう。これらの結果を第２表に示す。これらの結果
は、コラーゲン原繊維修飾剤でウシの脱石灰化した骨を
処理すると、水銀侵入量、処理素材内のポアおよび深い
ミクロピットの量ならびに面積の増加に直接関係するパ
ラメーターが、明らかに増加することを示しており、こ
のように処理したウシのマトリックスは侵入容積におい
て活性のあるラットマトリックス素材と同様になり、走
査型電子顕微鏡写真による肉眼観察での結果を強く確証
する。
それぞれのマトリックスの比表面積は、素材を１週間
環境温度で脱ガスした後、吸収ガスとしてクリプトンを
用いたBET法によって測定した。第２表は、処理したウ
シマトリックスは未処理の素材と比較した場合に、表面
積が明らかに増加し、活性を有するラットマトリックス
素材と同様であることを示しており、このことはさらに
SEMデータで確証される。
骨格密度は、それぞれの素材についてヘリウムピクノ
メーターで測定された。骨格密度はそれぞれについてほ
ぼ同様であることが予測されたため、水銀ポロシメトリ
ーデータによる容積密度の違いは、もっぱら処理したウ
シマトリックスの表面積および表面積の増加に起因する
と推論して良いことが分かった。
また、アミノ酸組成分析を異なるマトリックスについ
て行った。この分析は、コラーゲン原繊維修飾試薬がマ
トリックスに関連した非コラーゲン性単に影響を及ぼす
ことがあるにせよ、それぞれのマトリックスにどのよう
な影響を及ぼすかを決定することを試みるために行っ
た。マトリックス中のチロシン含有量は、一般的にコラ
ーゲンの螺旋領域が1000残基当たり２〜３個のチロシン
残基を有するだけであることから、非コラーゲン性蛋白
質の指標として用いた。第３表に示すように、処理はマ
トリックスのチロシン（Ｙ）含有量に明らかな影響を与
えず、グアニジン抽出した骨コラーゲンは、低濃度の非
コラーゲン性蛋白質しか含まず、さらに処理によっても
キャリヤーマトリックスから非コラーゲン性蛋白質が抽
出されなかったことを示唆している。

Claims (48)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生体分解性および生体適合性の、無機質を
    含まない、脱脂された、多孔性粒子形状の不溶性Ｉ型骨
    コラーゲンであって、非コラーゲン性蛋白質が枯渇し、
    該粒子の多孔性および表面積が処理されて増加した不溶
    性Ｉ型骨コラーゲンを含む、哺乳類宿主への移植用マト
    リックス。
  2. 【請求項２】前記コラーゲンが前記宿主に対して異種で
    ある、請求項１に記載のマトリックス。
  3. 【請求項３】前記コラーゲンがコラーゲン原繊維修飾試
    薬で処理されたものである、請求項１に記載のマトリッ
    クス。
  4. 【請求項４】前記コラーゲンが増加した侵入容積を有す
    る、請求項１に記載のマトリックス。
  5. 【請求項５】前記侵入容積が少なくとも25％増加され
    た、請求項４に記載のマトリックス。
  6. 【請求項６】前記侵入容積が少なくとも約50％増加され
    た、請求項４に記載のマトリックス。
  7. 【請求項７】前記コラーゲンが増加した数のポアおよび
    ミクロピットを有する、請求項１に記載のマトリック
    ス。
  8. 【請求項８】前記コラーゲンの表面積がBET法による測
    定において少なくとも２倍に増加された、請求項１に記
    載のマトリックス。
  9. 【請求項９】前記コラーゲンが１μｍ〜100μｍの範囲
    の平均直径のポアまたはミクロピットを有する、請求項
    １に記載のマトリックス。
  10. 【請求項１０】前記ポアおよびミクロピットの数が少な
    くとも約３倍に増加された、請求項７に記載のマトリッ
    クス。
  11. 【請求項１１】前記ポアおよびミクロピットの数が少な
    くとも約10倍に増加された、請求項７に記載のマトリッ
    クス。
  12. 【請求項１２】70μｍ〜850μｍの範囲の平均直径を持
    つ充填粒子である、請求項１に記載のマトリックス。
  13. 【請求項１３】150μｍ〜420μｍの範囲の平均直径を持
    つ充填粒子である、請求項１に記載のマトリックス。
  14. 【請求項１４】合成した骨代替移植物の表面に配置され
    た、請求項１に記載のマトリックス。
  15. 【請求項１５】前記哺乳類宿主体内からの遊走細胞の流
    入、増殖および分化を可能にする大きさの隙間を持つ相
    互接着した粒子である、請求項１に記載のマトリック
    ス。
  16. 【請求項１６】さらに骨形成蛋白質を分散して含み、前
    記哺乳類宿主内への移植時に軟骨内の骨形成を誘導する
    能力を有する、請求項15に記載のマトリックス。
  17. 【請求項１７】前記哺乳類宿主の癒着不能骨折をつなぐ
    ように成形された、請求項16に記載のマトリックス。
  18. 【請求項１８】前記哺乳類宿主内に徐放的に放出させる
    ために治療剤をマトリックス表面に吸着させて含む、請
    求項１に記載のマトリックス。
  19. 【請求項１９】前記修飾試薬がジクロロメタンである、
    請求項３に記載のマトリックス。
  20. 【請求項２０】前記修飾試薬がフッ化水素である、請求
    項３に記載のマトリックス。
  21. 【請求項２１】前記修飾試薬が、トリフルオロ酢酸であ
    る、請求項３に記載のマトリックス。
  22. 【請求項２２】前記修飾試薬が、0.1〜10％のトリフル
    オロ酢酸を混合した、ジクロロメタン、アセトニトリル
    またはイソプロパノールである、請求項３に記載のマト
    リックス。
  23. 【請求項２３】前記修飾試薬がイソプロパノールであ
    る、請求項３に記載のマトリックス。
  24. 【請求項２４】前記修飾試薬がアセトニトリルである、
    請求項３に記載のマトリックス。
  25. 【請求項２５】前記修飾試薬がクロロホルムである、請
    求項３に記載のマトリックス。
  26. 【請求項２６】前記修飾試薬が高めた温度の水性媒質で
    ある、請求項３に記載のマトリックス。
  27. 【請求項２７】前記水性媒質が37〜65℃の範囲内の温度
    を有する、請求項26に記載のマトリックス。
  28. 【請求項２８】前記コラーゲンが、脱グリコシル化され
    ている、請求項１に記載のマトリックス。
  29. 【請求項２９】哺乳類宿主内への移植に適する、生体適
    合性の、インビボで生体分解されうるマトリックスの製
    造方法であって、以下の工程： （ａ）脱石灰化および脱脂された、不溶性のＩ型骨コラ
    ーゲンを多孔性を有する粒子形状で提供する工程； （ｂ）該コラーゲン粒子をグアニジン抽出する工程；お
    よび （ｃ）該グアニジン抽出されたコラーゲン粒子をコラー
    ゲン原繊維修飾試薬で処理する工程； を包含する方法。
  30. 【請求項３０】前記修飾試薬がコラーゲン原繊維修飾溶
    媒である、請求項29に記載の方法。
  31. 【請求項３１】前記溶媒がフッ化水素溶液である、請求
    項30に記載の方法。
  32. 【請求項３２】前記溶媒がトリフルオロ酢酸溶液であ
    る、請求項30に記載の方法。
  33. 【請求項３３】前記溶媒がアセトニトリルである、請求
    項30に記載の方法。
  34. 【請求項３４】前記溶媒がイソプロパノールである、請
    求項30に記載の方法。
  35. 【請求項３５】前記溶媒がジクロロメタンである、請求
    項30に記載の方法。
  36. 【請求項３６】前記溶媒がクロロホルムである、請求項
    30に記載の方法。
  37. 【請求項３７】前記溶媒が酸性化したアセトニトリル、
    イソプロパノールまたはジクロロメタンである、請求項
    30に記載の方法。
  38. 【請求項３８】生理食塩水バッファーで前記コラーゲン
    粒子を洗浄する付加工程を包含する、請求項30に記載の
    方法。
  39. 【請求項３９】前記コラーゲン粒子を尿素含有バッファ
    ーおよび水で洗浄する、請求項30に記載の方法。
  40. 【請求項４０】前記修飾試薬が、加熱されるかまたは高
    めた温度の水性媒質である、請求項29に記載の方法。
  41. 【請求項４１】前記水性媒質が37〜65℃の範囲の温度を
    有する、請求項40に記載の方法。
  42. 【請求項４２】前記処理したコラーゲン粒子の表面上に
    骨形成蛋白質を吸着させる付加工程を包含する、請求項
    29に記載の方法。
  43. 【請求項４３】骨形成蛋白質を冷エタノール中での沈澱
    によって、表面上に吸着させる、請求項42に記載の方
    法。
  44. 【請求項４４】骨形成蛋白質をアセトニトリルおよびト
    リフルオロ酢酸を含有する溶液中でインキュベーション
    して表面上に吸着させ、次いで凍結乾燥する、請求項42
    に記載の方法。
  45. 【請求項４５】前記水性媒質中に存在する骨形成蛋白質
    をインキュベーションして表面上に吸着させ、次いで凍
    結乾燥する、請求項42に記載の方法。
  46. 【請求項４６】前記処理したコラーゲン粒子を70μｍ〜
    850μｍの範囲の平均直径を有する粒子に成形する付加
    工程を包含する、請求項29に記載の方法。
  47. 【請求項４７】前記粒子が、150μｍ〜420μｍの範囲の
    平均直径を有する、請求項46に記載の方法。
  48. 【請求項４８】請求項29に記載の方法により調製され
    る、生体適合性の、インビボで生体分解されうるマトリ
    ックス。
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