JP2003260123A - 骨の再構成用の再吸収性細胞外マトリックス - Google Patents

骨の再構成用の再吸収性細胞外マトリックス

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JP2003260123A JP2003044287A JP2003044287A JP2003260123A JP 2003260123 A JP2003260123 A JP 2003260123A JP 2003044287 A JP2003044287 A JP 2003044287A JP 2003044287 A JP2003044287 A JP 2003044287A JP 2003260123 A JP2003260123 A JP 2003260123A
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natural
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Ed Geistlich Soehne AG fuer Chemische Industrie
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明の目的は、骨組織の再生及び再構成を
促進するための改善された材料及び方法を提供すること
にある。 【解決手段】 骨治癒組み合わせ材料は、骨細胞、骨芽
細胞、間質幹細胞又は骨形成骨芽細胞への分化が決定付
けられた幹細胞であり得る培養骨形成細胞を担持するマ
トリックスを含み、前記マトリックスが、天然コラーゲ
ン含有動物組織から得られる精製コラーゲンマトリック
ス材料と、実質的に天然骨の結晶構造を有し、内在性有
機物質を実質的に含まない天然骨から得られる多孔性骨
ミネラルマトリックス材料と、前記精製コラーゲンマト
リックス材料及び多孔性骨ミネラルマトリックス材料の
組合せとである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】（関連出願のクロス−リファレンス）本出
願は、２００２年２月２１日に出願された米国仮特許出
願第６０／３５７,８３９号の利益を主張するものであ
る。
【０００２】（発明の分野）本発明は、骨組織の再構成
の分野に関するものである。
【０００３】（背景技術の説明）上顎骨及びその他の骨
格の骨欠損部における骨組織の再生及び再構成を促進す
るための材料及び方法に対して当業界での要請が残って
いる。
【０００４】（発明の概要）本発明によれば、骨治癒組
合せ材料は、骨細胞、骨芽細胞、間質幹細胞（例えば骨
髄に存在する）、及び骨形成骨芽細胞への分化が決定付
けられた幹細胞からなる群より選択される骨形成細胞を
担持するマトリックスを含む。本発明に使用される前記
マトリックスは、天然コラーゲン含有動物組織から得ら
れる精製コラーゲンマトリックス材料と、実質的に天然
骨の結晶構造を有し、内在性有機物質又は材料を実質的
に含まない天然骨から得られる多孔性骨ミネラルマトリ
ックス材料と、前記精製コラーゲンマトリックス材料及
び多孔性骨ミネラルマトリックス材料の組合せとからな
る群より選択される。
【０００５】（発明の詳細な説明）上述のように、本発
明により使用するためのマトリックス材料は、コラーゲ
ンマトリックス材料、多孔性骨ミネラルマトリックス材
料又はこれらの組合せであることができる。
【０００６】図１は、本発明の一実施形態により、骨形
成細胞１２を担持する多孔性骨ミネラルマトリックス材
料１０を示す。多孔性骨ミネラルマトリックス材料１０
は以下により詳細に記載され、一実施形態により、コラ
ーゲン材料１４と共に任意に充填又は注入される。
【０００７】図２は、上顎骨又はその他の骨格にあり得
る骨１８における骨欠損部１６を示す。図２に示される
実施形態では、本発明による骨形成細胞を担持する多孔
性骨ミネラルマトリックス材料１０を骨欠損部１６に詰
める。骨ミネラルマトリックスの詰め物１０は、いずれ
かの適当な手段、例えばファスナー２２により膜２０を
その場所に保持させることができる。ある実施形態で
は、膜２０は本発明による骨形成細胞を担持するコラー
ゲンマトリックスである。他の実施形態では、骨欠損部
は、骨ミネラルマトリックス１０を付加せずに、本発明
による骨形成細胞を担持するコラーゲンマトリックス２
０により覆われる。
【０００８】一実施形態によれば、上記コラーゲンマト
リックス材料は、細胞付着を阻止するために少なくとも
一つの平滑面を有し、細胞の通過を防ぐバリヤーとして
作用する、少なくとも一つのバリヤー層が含まれるコラ
ーゲン膜材料である。バリヤー層は更に平滑面の反対側
に繊維面を有し、この繊維面上には細胞増殖が可能であ
る。平滑面は治療領域から離れた位置にあることが好ま
しく、繊維面は治療領域の方を向いていることが好まし
い。好ましい実施形態では、バリヤー層は、主としてコ
ラーゲンＩ、コラーゲンIII又はこれらの混合物であ
る。適当な一材料は、本発明の譲渡人であるEd. Geistl
ich Soehne AG fur Chemische Industrieからのビオガ
イド(Biogide)（登録商標）である。ビオガイド（登録
商標）材料は、米国特許第５,８３７,２７８号に記載さ
れ、これは参考として本明細書に援用される。ビオガイ
ド（登録商標）は、ブタの腹膜に由来するものであり得
る。図３に示される材料は、細胞付着を阻止するために
少なくとも一つの平滑面を有し、細胞の通過を防ぐバリ
ヤーとして作用する、少なくとも一つのバリヤー層１１
５が含まれる。バリヤー層１１５は更に繊維面１１８を
有する。
【０００９】本発明によって使用され得る多層膜はバリ
ヤー層を含み、また、開孔スポンジ様テクスチャーを有
する主としてコラーゲンIIのマトリックス層を更に含
む。そのようなコラーゲン膜は、１９９７年１０月１０
日出願の英国特許出願第９７２１５８５.９号の優先権
主張に基づく、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／０２９７
６号、２０００年４月７日出願の米国特許出願第０９／
５４５,４６５号に記載されている。これらは参考とし
て本明細書に援用される。この膜は図４に示されるよう
なバリヤー層１１５を含み、また、開孔スポンジ様テク
スチャーを有する主としてコラーゲンIIのマトリックス
層１２０を更に含む。
【００１０】本発明によって使用され得るその他の多層
膜は、開孔スポンジ様テクスチャーを有する主としてコ
ラーゲンIIの中心マトリックス層を間にはさんだ一対の
バリヤー層を含む。この実施形態によると、バリヤー層
の平滑面は外側を向いており、バリヤー層の繊維面はマ
トリックス層の方の内側を向いている。この膜は、図５
に示されるような、二つのバリヤー層１１５を含み、そ
れぞれ外側を向いた平滑面１１６と、それらの間にはさ
まれたコラーゲンIIマトリックス層１２０とを有する。
【００１１】図６は、単一コラーゲンIIマトリックス層
１２０が本発明による骨形成細胞を担持する別の実施形
態を示す。
【００１２】コラーゲンは、動物体内においていくつか
の形で存在し、様々な組織は様々な割合でそれぞれのタ
イプを含む。骨コラーゲンは、主としてコラーゲンＩ及
びIIIを含む。軟骨は、少量のコラーゲンVI、IX、Ｘ、X
I及びXIIIと共に主としてコラーゲンIIを含む。皮膚及
び腱由来のコラーゲン材料は、ほとんどコラーゲンＩ及
び／又はIIIから構成されている。
【００１３】従って、本発明の一態様によれば、主とし
てコラーゲンIIの繊維を含む軟骨組織の再構成用の再吸
収性細胞外マトリックスを提供することにある。
【００１４】本発明によるコラーゲンIIマトリックス
は、少量のコラーゲンVI、IX、Ｘ、XI及びXIII含むこと
ができる。本発明によるマトリックスは、例えばコンド
ロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸及びヒア
ルロン酸などのグリコサミノグリカンを含むヒドロゲル
様材料も含むことができ、これらは、軟骨細胞が包埋さ
れて増殖できる天然媒質を提供する。本発明によるマト
リックスは、０．１〜４０重量％、例えば１〜１５重量
％、例えば約２〜３重量％、最も好ましくは約２．５重
量％のグリコサミノグルカンを含むことができる。
【００１５】本発明によるマトリックスは、脱脂及び、
グリコサミノグリカンと共にコラーゲン材料を残す他の
処理を受けている何れかの天然軟骨材料を含むことがで
き、あるいは精製コラーゲンの繊維を、グリコサミノグ
リカン及び／又は何れかの他の添加物と混合させること
ができる。そのような追加の添加物は、例えば軟骨細胞
のコラーゲン繊維への付着を助けるアンコリンII又はコ
ンドロネクチン、並びに軟骨誘導因子（ＣＩＦ）、イン
スリン様増殖因子（ＩＧＦ）及びトランスフォーミング
増殖因子β（ＴＧＦβ）などの増殖因子を含むことがで
きる。
【００１６】骨組織の再生を助けるためには、生体内の
移植の前又は後の何れかに、マトリックスには骨細胞、
骨芽細胞、間質幹細胞（例えば骨髄に存在する）又は骨
芽細胞形成幹細胞が注入される。移植直前にマトリック
スには、例えば注射（injection）によって細胞が注入
され得る。一方、一般には、移植後に細胞の懸濁液の直
接注射によってマトリックスに細胞を導入することが見
込まれる。この方法で、マトリックスに存在する細胞
は、新しい骨の再生をもたらすことができる。
【００１７】本発明における使用のための骨細胞、骨芽
細胞、骨芽細胞形成幹細胞は、骨芽細胞又は骨芽細胞形
成幹細胞を含む組織から単離された同種又は自己細胞を
含む細胞供給源から得られることができる。同種細胞
は、免疫反応及び感染性合併症の潜在性を有するから、
自己細胞から骨芽細胞又は骨芽細胞形成幹細胞を単離す
ることが好ましい。細胞を採取する技術は公知であり、
酵素的消化又は外増殖（outgrowth）培養が挙げられ
る。採取した細胞はそれから細胞培養で増やし、その
後、体内に再導入する。骨組織の最適な再生をもたらす
ためには、一般的に、少なくとも１０6、好ましくは少
なくとも１０7の細胞をマトリックスに注入するべきで
ある。
【００１８】これとは別に、間質幹細胞を含む骨髄又は
骨髄誘導体をマトリックスに充填することができる。
【００１９】一般的に、本発明によるマトリックスは、
ヒアルロン酸、コンドロイチン６−硫酸、ケラチン硫
酸、デルマタン硫酸などのグリコサミノグリカン（ＧＡ
Ｇｓ）を含むことが望ましく、これらは、骨芽細胞又は
骨芽細胞形成幹細胞が包埋されて増殖することができる
天然媒質を提供するのに役立つ。軟骨からのものと必ず
しも同じ組成、分子量及び生理的特性をもたない様々な
供給源からのグリコサミノグリカンをマトリックスに組
み込むことが可能であるが、より好ましいグリコサミノ
グリカンは軟骨そのものから抽出したものである。
【００２０】天然コラーゲン組織では、ＧＡＧｓは、少
なくとも一部分がプロテオグリカン（ＰＧｓ）の一成分
として存在する。ＰＧｓの形でのＧＡＧｓの使用は、Ｐ
Ｇｓのタンパク質含有量によって生じ得る潜在的な免疫
学的問題を考慮して望ましくない。従って、マトリック
スは、好ましくはいかなるプロテオグリカンを実質的に
含まない。好都合には、これは精製された無テロペプチ
ドのコラーゲン材料とグリコサミノグリカンとの混合物
からマトリックスを調製することによって実現され得
る。
【００２１】マトリックスに存在するその他の添加物に
は、例えば軟骨細胞のコラーゲンII繊維への付着を助け
るコンドロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ア
ルギン酸カルシウム又はアンコリンII、骨及び軟骨細胞
増殖促進ホルモン類、並びに軟骨誘導因子（ＣＩＦ）、
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ホモダイマー又はヘ
テロダイマーとして存在するトランスフォーミング増殖
因子β（ＴＧＦβ）、骨形成タンパク質−１（ＯＰ−
１）などの増殖因子、及び天然又は組み換えヒトＢＭＰ
−２、ＢＭＰ−３（オステオゲニン）、ＢＭＰ−４、Ｂ
ＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ｂＦＧＦ、ＣＤＭＰなどの骨形
成因子（ＢＭＰｓ）、又はその他の骨格マトリックス分
子、並びにトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−
β、ＴＧＦ−β１）、血管内皮増殖因子（ＥＧＦ／ＶＥ
ＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ／ＩＧＦ−
１）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）
及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）などのシグナルペ
プチドが挙げられる。これらをコードする核酸配列、又
はこれらの生体内での生成を誘導又は促進可能である核
酸配列を、本発明のマトリックス材料に組み込むことが
できる。
【００２２】上述のように、本発明に使用する生成物
は、骨生成細胞への分化に関与する幹細胞のための担体
としても作用することができる。このような幹細胞は、
試験管内で増殖させてそれらの数を増やすことができ、
増殖因子と共に又は増殖因子を伴うことなく担体マトリ
ックス中で修復部位に適用される。一例としては骨髄間
質細胞である。これらをコードする核酸配列、又はこれ
らの生体内での生成を誘導又は促進可能である核酸配列
を、本発明のマトリックス材料に組み込むことができ
る。
【００２３】ＢＭＰ−２は、独立的に骨形成の二経路−
骨の直接形成と、軟骨の形成（これはその後除去され骨
に置き換わる）と−に影響を与える。種々の供給源の皮
質骨からの抽出により得られた骨マトリックスを含むＢ
ＭＰｓとコラーゲンとの複合体は、約９０％のコラーゲ
ンと、約１０％の、ＢＭＰ活性用又はＢＭＰ／ＮＣＰ誘
導性軟骨形成用の非コラーゲン性タンパク質（ＮＣＰ）
とを含む。骨マトリックス不溶性コラーゲン性マトリッ
クス及びラミニン又はフィブロネクチンは、ＢＭＰｓの
担体として作用する。一般に、マトリックスは約１００
μｇ〜約５ｍｇの増殖因子を含むことができる。これら
をコードする核酸配列、又はこれらの生体内での生成を
誘導又は促進可能である核酸配列を、本発明のマトリッ
クス材料に組み込むことができる。
【００２４】本発明により使用するためのマトリックス
材料は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、体内のカルシウ
ムの調節に関与するポリペプチドを充填することもでき
る。これらをコードする核酸配列、又はこれらの生体内
での生成を誘導又は促進可能である核酸配列を、本発明
のマトリックス材料に組み込むことができる。
【００２５】上述のように、本発明は、遺伝子又は核酸
補充マトリックスを、そこに組み込まれた細胞増殖促進
遺伝物質又はＤＮＡと共に含むことができる。マトリッ
クス材料は、細胞増殖促進遺伝物質の持続した放出を提
供することができる。マトリックスから体内への放出に
おいて、上記遺伝物質は、細胞増殖及び治癒を促進する
ように体内において細胞を形質転換することができる。
【００２６】本発明は、細胞増殖促進核酸配列を充填す
るマトリックス材料、好ましくは単離又は精製された核
酸配列を提供することもまたできる。その配列は、ＤＮ
Ａ配列又はＲＮＡ配列であることができる。特に好まし
い実施形態では、マトリックス材料は単離された遺伝子
配列、最も好ましくは単離されたＤＮＡを充填する。
【００２７】本発明により使用するための核酸配列は、
軟骨細胞増殖、骨細胞増殖又はその両方を促進すること
ができる。
【００２８】本発明により使用するための精製された治
療用核酸配列は、何れかの適当な供給源から得られるこ
とができ、マトリックス材料に充填されて細胞増殖を促
進することができる。一実施形態では、レトロウィルス
ベクター、又は何れかの他の適当な遺伝子運搬（carryi
ng）及び遺伝子導入メカニズムが利用される。例えば、
レトロウィルスベクターは、ヒト骨形成タンパク質７
（ＢＭＰ−７）ｃＤＮＡを間葉系幹細胞に安定的に導入
するために利用できる。
【００２９】遺伝子治療は、治療遺伝子又はその他の遺
伝子物質の細胞及び組織への送達を含む。
【００３０】更に以下に記述されるように、本発明のコ
ラーゲンマトリックスは、水性コラーゲンスラリーの形
成、スラリーの任意部分脱水、所望形状へのスラリーの
成形、スラリーの乾燥、化学、紫外線（ＵＶ）放射又は
熱水架橋によるコラーゲン繊維の部分架橋、及びインプ
ラント材料の滅菌により調製することができる。あるい
は、化学架橋などの架橋は、スラリーの調製後及び成形
より前に行うことができる。
【００３１】好ましい実施形態では、成形された材料は
凍結乾燥により乾燥され、約０．１〜５００μｍの範囲
内の孔サイズを達成する。本発明によるマトリックス用
の好ましい孔サイズは、約５０〜４００μｍの範囲内、
最も好ましくは約７０〜１２０μｍの範囲内である。
【００３２】好ましくは凍結乾燥後のマトリックスの密
度は、約０．１〜０．３ｇ／ｍ3、好ましくは約０．１
８〜０．２２ｇ／ｍ3、最も好ましくは約０．２ｇ／ｍ3
の範囲内である。
【００３３】コラーゲン材料は、凍結乾燥工程の前又は
後に架橋させて、マトリックスを安定化することができ
る。これはマトリックスの機械的安定性を高め、体内に
よる吸収速度を低下させるのにもまた役立つ。理想的に
は、架橋度は、マトリックスの分解速度が組織再生の速
度に合うように決められなければならない。物理的に
は、架橋は加熱によって行われ得るが、これは望ましく
ない吸収性減少を避けるために注意深く行わなければな
らない。１００〜１２０℃の温度に約３０分〜約５時間
加熱することが好ましい。より好ましくは、架橋はＵＶ
ランプを使用して、例えば８時間までＵＶ照射を行うこ
とができる。
【００３４】上述のように、コラーゲンマトリックス材
料は、グリコサミノグリカン類（ＧＡＧｓ）を有利に含
む。後者は実際にコラーゲンと反応し、若干の架橋を行
い、不溶性生成物を生成する。必要ならば、更なる架橋
は、上記のように材料の加熱、ＵＶ照射によって、又は
更なる化学架橋によって行うことができる。グリコサミ
ノグリカンとコラーゲンとの反応は、周囲温度で、ｐＨ
２．５〜３．５範囲で行うことができる。材料はこのよ
うな処理後直ぐに凍結及び凍結乾燥にかけるのがよい。
【００３５】例えば、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）など
のＧＡＧｓは、公知の方法を利用して、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｅ
ＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を
使用してマトリックスに共有結合させることができる。
ＥＤＣ／ＮＨＳ架橋は、デルマタン硫酸、ヘパリン及び
ヘパラン硫酸、及びヒアルロン酸、並びに上記のような
ＣＳが含まれ得る、ＧＡＧｓをマトリックスに固定する
ために利用することができる。
【００３６】スラリー形成は、コラーゲン塊のｐＨを高
めることによって行うことができる。この操作では、そ
の塊を約４℃に冷やし、冷ＮａＯＨ水溶液を４℃でｐＨ
値が約６．５〜７．５になるまで添加することによりｐ
Ｈ値をゆっくりと上昇させる。その後、その塊を周囲温
度に約１５〜２５時間保持する。このときに、スラリー
が形成され、スラリー形成後、その塊を成形して凍結及
び凍結乾燥することができる。
【００３７】もう一つの別の方法は、空気を除去した
後、コラーゲン塊をｐＨ値約６．８〜７．４にまで中性
にする。混合物を型に入れ、３７℃で約１５〜２０時間
インキュベートする。微細なスラリーが生じ、それをそ
の後凍結及び凍結乾燥することができる。
【００３８】スラリーの成形後、材料は凍結させる。再
現可能な孔サイズを得るために、凍結は注意深く調節し
なければならず、凍結速度及び時間、ｐＨ値及び粒子サ
イズは、正確に調節しなければならない。
【００３９】次にマトリックスを凍結乾燥し、続いて約
１１０〜１３０℃に加熱する。このやり方で、若干の架
橋が行われる。その後、凍結乾燥したマトリックスを必
要な厚さに調整することができる。次にこのマトリック
スを、例えばガンマ照射又はエチレンオキシドによって
滅菌する。強い照射、例えば線量２５ｋＧｙの60Ｃｏの
照射による滅菌はＢＭＰｓを不活性化することがある。
このような状況では、滅菌マトリックスは移植前に滅菌
食塩水中のＢＭＰｓを注入することができる。
【００４０】本発明によるマトリックスの厚さは、約
０．２〜２ｃｍ、好ましくは約０．３〜１．５ｃｍ、よ
り好ましくは約０．４〜１ｃｍ、最も好ましくは約０．
５〜０．８ｃｍの範囲内であることができる。
【００４１】架橋を行うときは、化学薬剤を利用して行
うことができ、種々のアルデヒド類、例えばヒアルロン
酸ポリアルデヒド、ホルムアルデヒド又はグリオキサー
ルを使用することができる。適当な化学架橋薬剤として
は、ヒアルロン酸ポリアルデヒド、ヘキサメチレンジイ
ソシアネート、ジ−エチル−３（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、及びＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド（ＮＨＳ）又はＥＤＣとＮＨＳとの混
合物が挙げられる。
【００４２】様々な、時として望ましくない特性を有す
る広範のグリコサミノグリカン及びプロテオグリカンが
存在する。従って、軟骨からのグリコサミノグリカンと
同一の組成、分子量及び生理的特性をもたない様々な供
給源からのグリコサミノグリカンをマトリックスに組み
込むことが可能であるが、軟骨そのものからのグリコサ
ミノグリカンを使用することが特に好ましい。
【００４３】上述のように、マトリックスが水性液体と
接触したときに膨潤する範囲を制約し、一方ではマトリ
ックスの再吸収能を保持しておくために、コラーゲンマ
トリックスをある程度の架橋させておくことが望まし
い。そのような膨潤は、強度及び形状を失うことにな
る。本発明によるマトリックスは、軟骨組織を脱脂し次
いで塩基による処理を施し、これによってプロテオグリ
カン及びグリコサミノグリカンを除去することによって
有利に製造することができる。
【００４４】軟骨材料は、通常には容易に入手可能な動
物供給源、例えばウシ、ヒツジ又はブタからの材料であ
る。好ましい材料はブタからのヒアリン軟骨である。こ
れは望ましい比率でコラーゲン及びグリコサミノグリカ
ンを含有し、適当に大量で入手可能である。
【００４５】軟骨は、屠殺後冷凍し、例えば約８ｍｍの
粒子径にサイズを小さくすることが好ましい。サイズを
小さくする前に、軟骨を水に浸漬し、そして肉、骨及び
その他の所望でない材料を機械的に分離することが好ま
しい。
【００４６】次にこの粒子状の軟骨をアセトンなどの水
混和性有機溶媒で処理することにより脱水させることが
好ましく、これは若干の脂肪を除去するためにも有用で
ある。脱水はコラーゲン繊維を収縮し、相互に分離し、
その次の脱脂工程が最適化されるようになる。次に材料
を炭化水素などの脂肪溶媒、例えばヘキサン又はハロゲ
ン化炭化水素で脱脂させる。
【００４７】脱脂後、材料を完全に洗浄し、本来存在し
ていた水量と同じ量を取り込むまで洗浄を続ける。この
操作により、この材料は以下の塩基処理のために最適化
される。
【００４８】塩基処理は、強アルカリ、例えばアルカリ
金属水酸化物、例えば水酸化ナトリウムで例えば１〜８
重量％の濃度で行うことができる。処理時間は、原材料
及びアルカリ濃度によって変わるが、一般には１０〜４
８時間である。処理温度は一般に２０℃以下である。ｐ
Ｈ値は、通常は１２〜１４の範囲である。上述の条件
は、ＮａＯＨによる処理に対して最適なものである。他
の塩基による処理では、若干変更した条件を必要とする
ことがある。
【００４９】塩基処理は以下の効果を有する：少量の残
留脂肪がけん化される。非コラーゲンのアルカリ可溶タ
ンパク質が変性され、破壊され、溶解され、そして除去
される。コラーゲン中のアミド基がけん化され、それに
よってコラーゲンの電荷及び等電点が変わる。細菌、プ
リオン及びウイルスが不活性化され、これによりコラー
ゲンが滅菌される。
【００５０】この処理によりプロテオグリカンが、以下
のように特徴付けできる有用な修飾を受けることが見い
出される：
【００５１】プロテオグリカン中のグリコサミノグリカ
ンとコアタンパク質との共有結合が開裂される。これに
よってグリコサミノグリカンを、プロテオグリカンのタ
ンパク質から脱離することができる。これをβ−脱離と
称する。
【００５２】塩基処理により、コアタンパク質が小さい
ペプチドに分断され、これらは透析又は限外濾過によっ
て反応混合物から除去することができる。
【００５３】強い負電荷のために、グリコサミノグリカ
ンは水溶性塩を形成し、これらはコラーゲンから部分的
に洗浄されることができる。しかしながら、これらは塩
基処理では開裂されないか又はごく僅か開裂されるだけ
であり、透析によりペプチドから分離することができ
る。グリコサミノグリカンの一部分（コラーゲンの約３
重量％）はコラーゲンに結合している。
【００５４】精製されたグリコサミノグリカンは、塩基
処理工程から生じた抽出物を透析又は限外濾過すること
によって得ることができる。
【００５５】本発明の操作によれば、酵素的処理は種々
の異なる物質が存在することを見込んで一般には使用さ
れない。しかしながら、次の工程には材料を有機酸又は
無機酸、例えば塩酸で処理することが含まれる。
【００５６】これは以下の効果を有する：必要としない
酸感受性材料が除去される。繊維構造が緩められる。次
に材料は、一般には材料のｐＨ値が２．５〜４．０とな
るまで洗浄される。材料のｐＨ値は正確に調節すること
が好ましい。材料のｐＨ値は軟骨の横断面にわたって均
一にするべきである。
【００５７】酸処理後、軟骨は水膨潤状態である。次に
材料は例えばコロイドミルを用いて機械的にサイズを小
さくさせる。次に水性媒質中のコラーゲンの濃度は約
２．５〜３．５重量％である。この混合物のｐＨ値は、
若干酸性、例えば３．５〜４．５にすべきである。
【００５８】この点で、１つ以上のグリコサミノグリカ
ンを、精製されたコラーゲン塊に、例えばコラーゲンの
０．１〜４０重量％、好ましくは１〜１５重量％の範囲
で加えることができる。
【００５９】コラーゲンに加えるグリコサミノグリカン
は、上述のように天然軟骨から抽出されることが好まし
い。マトリックスはコラーゲンのほかに、グリコサミノ
グリカンヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸及びケラチ
ン硫酸を含む。コンドロイチン硫酸及びケラチン硫酸は
コアタンパク質に共有結合されているが、実際にヒアル
ロン酸はプロテオグリカンに結合されてはいるが共有結
合的にではない。
【００６０】塩基の作用によってコアタンパク質との結
合が開裂し、グリコサミノグリカンがタンパク質から遊
離される。更に、コアタンパク質は小さいペプチドに開
裂され、これらは透析又は限外濾過によって容易に除去
される。コアタンパク質が免疫学上活性であり得るか
ら、コアタンパク質が除去されることが重要である。従
って、コアタンパク質の除去が、本発明の方法の重要部
分である。
【００６１】塩基抽出物からのグリコサミノグリカンの
回収は、以下のように行うことができる：媒質を６〜８
の範囲のｐＨ値に中和する。非コラーゲンタンパク質を
カオリンなどの吸着剤による処理によって除去する。液
体の限外濾過は１００００ダルトン未満の分子量の通過
を可能とする膜を用いて行われる。液体の濃縮は約２〜
５重量％の固形分含量まで行われる。
【００６２】グリコサミノグリカンをコラーゲンと混和
した後、材料をコロイドミル中で更に均質化し、固形分
含量を１．５〜２．５重量％に調整する。次にこの塊を
２つのタイプの製品、即ちスポンジ又はコラーゲンシー
トの製造に用いることができる。
【００６３】スポンジの製造には、均質化により得られ
る塊を冷凍する。冷凍は正確に調節しなければならず、
これにより冷凍時間、ｐＨ値及び粒子サイズは再現可能
な孔サイズを提供するために正確に維持される。次に、
冷凍生成物を凍結乾燥する。凍結乾燥後、スポンジを少
なくとも２時間１２０〜１４０℃に加温する。このよう
にして材料は軽度の架橋によって安定化される。凍結乾
燥後、材料を所望の厚さに切断し、必要な形状に打ち抜
きし、滅菌し、そして包装する。
【００６４】不十分な強度のためにスポンジの使用はい
くつかの分野で使用が制限されているので、本発明によ
るコラーゲンマトリックスは広範囲の医療適応で使用す
るのに適したコラーゲンシートの製造に有利に使用する
ことができる。
【００６５】コラーゲンシートの製造には、液状懸濁液
中の精製コラーゲン繊維の濃度は、０．２〜３重量％、
有利には０．５〜２重量％の範囲にあるべきである。空
気は除いておくことが好ましい。
【００６６】次に中間工程としてゲルを形成させる。コ
ラーゲンゲルの製造は、ゲル形成のための既知の様々の
技術によって行うことができる。
【００６７】次にゲルを通常はプレートの上で乾燥させ
る。このようにして水が除去されるだけではなく、細胞
の増殖に非常に有益である不溶性コラーゲン−グリコサ
ミノグリカン生成物が形成される。
【００６８】上述のように、本発明による使用のための
マトリックスは、多孔性骨ミネラルマトリックス材料又
はコラーゲンマトリックス材料と多孔性骨ミネラルマト
リックス材料との組合せを含むことができる。本発明に
より使用されるマトリックス材料を含む骨ミネラルは、
本発明によるコラーゲンマトリックス材料に関する上記
概要のように何れかの適当な添加物を含んでよい。
【００６９】精製した骨ミネラルは、例えば国際特許出
願第ＷＯ８６／０７２６５号（ＰＣＴ／ＧＢ８６／００
３１０）に記載されるような生成物であってもよい。こ
のような生成物は、例えばウシ大腿骨などの粒子状の骨
を厳密に脱脂し、アンモニア又は有機アミンで処理し
て、残ったタンパク質を分解し、続いて大量の水で洗浄
することによって調製してもよい。こうした材料は、実
施において再吸収可能を維持し、改造プロセスを助け
る。
【００７０】また、粒子状の海綿骨又は皮質骨を例えば
９００℃で２４時間、か焼することによって、精製した
骨ミネラルを調製することも可能である。このように、
か焼した骨ミネラルは、永続的な非再吸収可能なインプ
ラント、例えば顎堤追加物が要求されるときに用いられ
る。いずれの場合においても、有機材料を除去した後に
骨は過度に脆くなり、その強度は本発明による処理によ
って大きく改善される。
【００７１】本発明は、上顎骨における、膝および脊椎
などの関節における、骨組織の欠損部を再構成するため
に有用である。
【００７２】本発明のための骨ミネラル生成物は、多孔
性骨ミネラルの粒子及び／又はコラーゲン繊維を含んで
もよく、骨芽細胞及び骨細胞に対する基質を与えること
によって骨の再生をもたらす。また、本発明の生成物の
コラーゲンは、脆い骨ミネラルに強度を付与する。
【００７３】本発明の一態様によれば、精製した粒子状
の骨ミネラル生成物は、医学用途のために提供され、前
記ミネラルの粒子は、あらゆる内因性の有機材料を実質
的に含まず、少なくともその表面に再吸収可能で生理的
適合性のコラーゲン材料、好ましくはコラーゲンII材料
を有する。
【００７４】屠殺した動物から得られる骨は、大量に入
手可能な安価な原材料である。それはコラーゲン組織に
よって結合される５０〜６０％の非常に細かく結晶化し
たヒドロキシルアパタイトを含み、かなりの量のタンパ
ク質及びその他の物質、並びに関連する脂肪及び筋肉組
織を含む。その生物学的に形成された結晶構造から見
て、それは高度に生体適合性の補てつ骨代替品としても
考えられる。また大きい比表面積を有することから、そ
れは例えば吸収剤又は緩効性薬のための支持体としても
用いることもできる。
【００７５】天然の骨ミネラルは、特定の程度の結晶
性、性質及び大きさ（不規則なプレート様の形態、厚さ
５−１０ｍｍ、長さ１０−５０ｍｍ）、並びにカルシウ
ム対リン酸塩の比（３７．５−３８．０％カルシウム及
び１５．５−５１９．０％リン）から得られる界面化学
を有する微結晶などのヒドロキシアパタイトを含む。ま
た、天然の骨ミネラル中には、少量の非結晶性の相と、
ミネラルのブルッシャイト（Brushite）及びニヒトロッ
カイト（Nihitlockite）及びオクタ−リン酸カルシウム
を含むその他のリン酸カルシウム結晶性の相とが存在す
る。骨の無機相は、天然に生じる微結晶及び有機相の除
去により生成された微結晶の間の超微細構造の間隔（１
０−１００ｍｍ）を含む多孔性、微細な空間（１−２０
ミクロン、骨細胞の裂孔、小管、血管の通路、フォルク
マン管、及びハーバース系の管（１００−５００ｍｍ）
を含む）を含む。多孔性の尺度である比表面積は、水銀
多孔度測定によって決定されるときに５０〜１００ｍ2
／ｇｍの範囲である。骨ミネラルの結晶性は、Ｘ線回折
と、電子顕微鏡法による多孔性、微結晶の形態及び大き
さによって特徴付けることができる。熱重量分析によっ
て少量の非アパタイトの微結晶を検出することができ
る。
【００７６】しかしながら、天然の骨ミネラルの組成及
び構造は、試験管内で形成した生成物又は予め調製され
た天然産出のヒドロキシアパタイトによって複製するこ
とはできない。天然の骨ミネラルを精製するための２つ
の方法、即ちか焼及び溶媒抽出が提案されている。
【００７７】か焼の際に骨の有機構成成分の灰化のため
に必要とされる温度は、やや高い。これは、かなり粗い
結晶の形成と共にミネラル部分の広範囲の再結晶化が起
こる。このようにして形成された材料は比較的小さい比
表面積を示す。従って、このような材料は、移植におい
て新たな骨を形成するために容易に改造されず、インプ
ラントはいつまでも改造されないままとなるが、これは
いくつかの目的に対しては許容可能であり得る。
【００７８】抽出プロセスにおいては、適当な溶媒を用
いて、脱脂した骨からタンパク質を抽出する。次にその
結果得られる骨ミネラルを洗浄して溶媒を除去する。
【００７９】どちらの場合でも、天然の骨から有機不純
物が除去されて骨ミネラルのみが残ると、その材料の強
度は急激に減少し、その結果、精製した骨ミネラルの個
々の断片は極端に脆くなる。これは、材料の取り扱いが
難しくなり、移植において望ましくない影響がもたらさ
れるおそれがある。
【００８０】骨ミネラルは、通常平均直径０．１〜１０
ｍｍの範囲の粒子の形である。コラーゲンII繊維に組入
れるための粒子は、好ましくはスポンジフォサ（spongi
fosa）骨であり、一般的には大きさが０．１〜５ｍｍの
範囲、好ましくは０．５〜２ｍｍの範囲にある。骨ミネ
ラル粒子を密に詰めるために、２つ以上の粒子の大きさ
の混合物、例えば０．２５〜１ｍｍ及び１〜２ｍｍ、又
は広範囲の例えば０．２５〜２ｍｍの大きさの粒子を用
いることが有益であり得る。
【００８１】精製した骨ミネラルは、例えば上述の方法
によって得られてもよい。従って、例えば、エーテル例
えばジメチルエーテル、ケトン例えばアセトン、又は炭
化水素若しくはハロゲン化炭化水素例えばヘプタン又は
メチルシクロヘキサン又はトルエンのような、１つ以上
の慣用の脂肪溶媒を用いて脂肪を除去してもよい。
【００８２】手順を更に進める前に、エタノールなどの
水混和性溶媒による中間抽出によって、トルエンなどの
抽出用溶媒を除去することが有利であり得る。コラーゲ
ン材料は、好ましくは高温にて、例えばグリセロール中
の水酸化カリウムなどの塩基のようなタンパク質分解
剤、又は例えばエチレンジアミンなどのアミンのような
有機塩基、又はホルムアミドなどのアミドを用いて溶解
させてもよい。このような薬剤は水洗による除去を容易
にするために水混和性であることが好ましい。特に良好
な結果は、還流するエチレンジアミンによって抽出した
骨を用いて得られている。
【００８３】抽出は各段階において、必要であれば溶媒
を交換しながら、それ以上の材料が抽出されなくなるま
で、例えば１週間から２週間までの間続けることが有利
であり得る。最初のタンパク質除去の後、骨は抽出前よ
りもその段階においてより砕け易くなっているため、更
に細かく砕くことが有利であり得る。塩基による処理の
後、例えば蒸発及び／又は適当には水洗によって、過剰
な溶媒が厳密に除去される。
【００８４】この材料は通常、乾燥工程にかける。この
段階において、例えば更なる精製をもたらし得る熱処理
によって材料を滅菌することが便利であり得る。
【００８５】一般に所有する米国特許第５，５７３，７
７１号（参考として本明細書に援用する）は、骨ミネラ
ルをタイプＩコラーゲン（コラーゲンＩ）、又はタイプ
ＩコラーゲンとタイプIIIコラーゲンとの混合物（コラ
ーゲンＩ及びコラーゲンIII）で作られたマトリックス
によって強化される医薬用の骨ミネラル生成物を開示す
る。
【００８６】コラーゲンは、動物体内においていくつか
の形で存在し、様々な組織は様々な割合でそれぞれのタ
イプを含む。薬品及び化粧品に用いられるコラーゲンス
ポンジ材料は一般的に皮膚及び腱に由来するものであ
り、主としてコラーゲンＩ及び／又はコラーゲンIIIを
含む。骨コラーゲンは主としてコラーゲンＩ及びコラー
ゲンIIを含む。
【００８７】コラーゲンII材料は、実質的に純粋なコラ
ーゲンIIに加えて、コラーゲンIIと共に混合された種々
の割合のコラーゲンＩ、コラーゲンIII及びそれらの混
合物を含んでもよい。例えばコラーゲンII材料は、約
０．１−１０重量％（好ましくは約０．１−５重量％）
のコラーゲンIII、及び／又は約１−５０重量％のコラ
ーゲンＩが混合されてもよい。
【００８８】コラーゲンII材料は、製造及び使用におけ
る生成物の取り扱い特性を改善するために、個々の粒子
の各々を注入してもよい。その場合には、コラーゲンII
材料：精製された骨ミネラルの重量比は、有利には１：
４０より大きく、好ましくは１：８より大きく４：１よ
り小さい、好ましくは１：２より小さい。有利には、コ
ラーゲンII材料は、約１−３０重量％、好ましくは約５
−１５重量％の本発明の骨ミネラル生成物を含む。コラ
ーゲンII材料は骨ミネラルの多孔性構造に入り込み、骨
ミネラルに強度を与えるが、骨ミネラルの移植において
免疫組織反応も与える天然の骨にあらかじめ存在する天
然タンパク質材料のいくつかを効果的に置換する。
【００８９】コラーゲンII材料は、成形物を形成し得る
粒子状の骨材料用のマトリックスを与えるために用いら
れてもよい。この場合には、ゼラチンのようなゲル形成
高分子物質と共にコラーゲンIIを用いることも可能であ
る。繊維材料：骨ミネラルの重量比は、例えば１：４０
〜３：２０の範囲、例えば約１：１０であってもよい。
ゲル相は、２〜２０重量％、例えば約５％の骨ミネラル
の量であることが有利である。ゲル相としてゼラチンを
用いるとき、それは例えば約０．２８のホルムアルデヒ
ドで軽く架橋させてもよい。
【００９０】骨ミネラルは、スポンジフォサ（spongifo
sa）骨から得ることが好ましく、コラーゲンII繊維とつ
ながれて、マトリックスに物理的強度を加える。好まし
い実施形態では、本発明による骨ミネラル／コラーゲン
生成物をマトリックスとして用いて、付加的な骨欠失が
存在する関節中の軟骨の欠損部を再生する。
【００９１】本発明による骨ミネラル生成物は、上顎、
膝、足、脊椎などにおける骨の再生のために用いられて
もよく、また例えば腰骨から大腿骨部の修正を含む整形
外科手術における改造インプラント又は補てつ骨代替
品、例えば外傷における骨欠失部の代替、顎顔面手術に
おける改造、又は顎堤追加物を含む歯周の欠損部及び抜
歯窩の充填として用いられてもよい。本発明の注入され
た粒子材料は、種々の骨の窩洞に詰め物をするために用
いることができ、その減少した脆さは取り扱い及び詰め
物をする手法を助けることにおいて重要である。
【００９２】本発明は、上顎骨の欠損部の修復や、軟骨
とその下にある骨との両方が損傷を受けている関節の欠
損部の再生に適用可能である。本発明の骨ミネラル／コ
ラーゲン生成物は、骨の損傷領域を充填するために用い
ることができ、次いで骨欠損部の充填された領域をコラ
ーゲン膜で覆うことができる。
【００９３】再生を促進するために、移植前に本発明の
骨ミネラル／コラーゲンマトリックスに細胞外で培養し
た骨芽細胞又は骨芽細胞形成幹細胞を加えることもで
き、切開手術又は関節鏡手術の際に、その充填したマト
リックスを移植できる。あるいは、又はそれらに加え
て、移植したマトリックスをコラーゲンＩ、II及び／又
はIIIを含むコラーゲン膜によって覆うことができ、又
は合成膜によって覆うことができる。このようなコラー
ゲン膜又は合成膜は、細胞外で培養した骨芽細胞又は骨
芽細胞形成幹細胞と共に代替的又は付加的に充填されて
もよく、この膜は切開手術又は関節鏡手術によって充填
された骨インプラントの上に適用される。
【００９４】上述の国際特許出願に示されるように骨が
薬剤担体として用いられるとき、骨ミネラルは１つ以上
の吸収された薬剤又はその他の生理活性物質を有用に担
持することができる。一実施形態によれば、本発明の生
成物は、少なくとも１つの吸収された医薬もしくは生物
活性物質、又は軟骨及び／又は骨を再生するための細胞
に分化する能力を有する間葉幹細胞を含む。
【００９５】骨ミネラルに吸収され得る生理活性物質
は、少なくとも部分的に水溶性であることが好ましく、
例えばペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシ
ドなどの抗生物質、スルホンアミド、特にホルムアルデ
ヒドとタウリンアミド又はＮ−置換タウリンアミドとの
縮合生成物などの抗菌物質を含む。この後者の化合物
は、下記式によって表わされることができ、
【００９６】
【化１】
【００９７】式中、Ｒ1は水素又はＣ1-4アルキル基であ
り、Ｒ2は水素又は下記式の群であり、
【００９８】
【化２】
【００９９】式中、Ｒ1は上記と同じ意味を有する。Ｒ1
及びＲ2の両方が水素である式（Ｉ）の化合物はタウル
ルタム（taurultam）であり、一方、Ｒ1が水素でありＲ
2が式（II）を有する化合物はタウロリジン（taurolidi
ne）である。これらの化合物は、メチロール転移剤とし
て作用し、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方を破壊
するだけでなく、細菌により生産されるエンドトキシン
及びエキソトキシンの両方を不活性化することにも効果
的である。
【０１００】その他の有用な生理活性物質は、骨の再生
を助力可能なタンパク質及びポリペプチド、特に骨マト
リックス及び骨細胞に由来する非コラーゲンタンパク質
を含む。それらは、骨格増殖因子及び形態形成及び脈管
形成因子、並びにトランスフォーミング骨増殖因子など
のマイトジェン因子を含む。オセイン又はより好ましく
はオステオポエチンのようなマトリックスによる増殖因
子は特に有益である。
【０１０１】一実施形態によれば、医薬活性物質は、Ｂ
ＭＰ−２−８などの骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）、又
はその他の骨格マトリックス分子、並びにトランスフォ
ーミング増殖因子−β即ちＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１、
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子
（ＩＧＦ）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨ
ｒＰ）及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）などのシグ
ナルペプチドからなる群より選択される。
【０１０２】生理活性物質は、例えば注入されたゼラチ
ンなどの高分子物質に代替的又は付加的に組入れられて
もよいことが認識される。これは上述の骨増殖因子など
のタンパク質に対して特に適当である。
【０１０３】生理活性物質の吸収及び／又は吸着は、好
ましくは滅菌条件下で、処理された骨ミネラルをその水
溶液に浸漬することによって行われることが好ましい。
活性物質の濃度は、吸着及び／又は吸収を容易にするた
めに比較的高いことが好ましく、その活性材料の溶解度
に部分的に依存する。
【０１０４】上述の生成物のいずれかについて、本発明
によるマトリックスは活性物質を補足することができ
る。従って、水溶性又は水分散性であるいずれの生理活
性物質を使用することができる。従って、本マトリック
スは、例えばタウロリジン、タウルルタムなどの抗菌
剤、又は例えばテトラサイクリン及びゲンタマイシンな
どの抗生物質のような医薬物質を有利に含有することが
できる。
【０１０５】本発明の一実施形態による方法は、上顎骨
又はその他の骨格欠損部における骨欠損部を露出し、損
傷骨の領域に大きさを合わせた充填マトリックスを挿入
し、及びいずれかの適当な手段、例えば接着剤又は骨欠
損部上にマトリックスを縫合することによって損傷骨の
領域に大きさを合わせたマトリックスを固定することを
含む。
【０１０６】以下の実施例は、説明の手段にのみ提供す
るものである。 （実施例１）新たに屠殺したブタの凍結軟骨を冷水に浸
し、完全に洗浄し、肉残渣、骨及び硬質断片から機械的
に精製した。続いて、その材料を流水下で３０分間洗浄
した。続いて、その材料をホモジナイザー中で３回粉砕
した。大きさを縮小させた後の光学的粒子の大きさは約
８ｍｍであった。この軟骨断片をアセトンで各８時間ず
つ４回洗浄することにより脱水した。次いで軟骨をｎ−
ヘキサンで４回抽出することにより脱脂した。各処理は
少なくとも８時間続けた。ヘキサン：軟骨の比は１：１
０であった。脱脂後、軟骨を飲料水中で膨潤させた。
水：材料の比は１０：１であり、処理時間は２４時間で
あった。次いでその材料をＮａＯＨ（５重量％）で処理
し、これによって軟骨：液体の比は１：４であり、処理
時間は３２時間であった。処理の間、軟骨断片を十分に
撹拌した。続いて、アルカリを軟骨から洗浄した。これ
により、もとのｐＨ１４が９〜１１に下がった。溶解し
た不純物を洗い流して、軟骨から分離した。アルカリ処
理によって得られた液体は、グリコサミノグリカンの回
収のために集められた。次いでコラーゲン材料を最初に
ｐＨ値１．０以下にて強ＨＣｌ（約３重量％）で処理を
行った。処理時間は４〜６時間であった。続いて、材料
を冷水でｐＨ値が３〜３．５に上昇するのに十分な時間
洗浄した。すべての不純物が除去され、生成物はスポン
ジ又はその他のコラーゲン材料の生成に適当な塩を含ま
ないコラーゲン塊であった。上記目的のために、意図さ
れる結果によりこの軟骨塊を脱気し、凍結及び凍結乾燥
してもよい。
【０１０７】（実施例２）実施例１におけるアルカリ処
理によって得られた抽出物は、グリコサミノグリカン、
アルカリ、変性タンパク質及び塩を含んでいた。抽出物
を最初にＨＣｌで中和し、中和後のｐＨ値は６となっ
た。次いで抽出物を、変性タンパク質を除去する作用を
有する濾過助剤、即ちケイ藻土で処理した。０．５重量
％のケイ藻土を抽出物中に導入し、変性タンパク質と一
緒に濾過によって除去した。次いでその上清を約１００
００ダルトンにて分子量カットオフを有する膜を使用し
て限外濾過を行った。これにより塩は除去され、精製さ
れたグリコサミノグリカンが残った。このように得られ
たグリコサミノグリカン溶液を上記コラーゲン材料と混
合して、グリコサミノグリカンを含むコラーゲンIIマト
リックスを得た。
【０１０８】（実施例３） （１）コラーゲンスポンジ及びフリース中のヘキソサミ
ン及びアミノ酸残基の測定 正確に秤量した各々の試料（約１０ｍｇ）を密封管中の
１０ｍｌの３Ｍ又は６ＭのＨＣｌ中で、精製窒素下、
１．０５℃で１５又は２０時間で加水分解した。その管
を冷蔵庫中で冷却し管を開封した後、内容物を２５ｍｌ
の長頸フラスコに移し、真空回転乾燥器（Rotavapor RE
120, Buchi, Switzerland）中で水ジェット真空下、４
０℃で乾燥させた。残留物を５ｍｌの水に溶解した後、
残留物を再度水ジェット真空下で乾燥させた。次いで、
残留物をｐＨ２．２の５ｍｌローディング緩衝液（Ｎａ
+に関して０．２Ｍ）に溶解した。グルコサミン及びガ
ラクトサミン値の測定には、アリコート（aliquot）と
ローディング緩衝液と（１＋１０）の前希釈後、３Ｍの
ＨＣｌで加水分解した１５０μｌの試料をアミノ酸分析
器（AlphaPlus，4151型，Pharmacia-LKB，Freiburg）の
カートリッジに注入し、コンピュータ（Shimadzu，Duss
eldorf）を用いて標準と比較することにより評価した。
同じ手順を６ＭのＨＣｌで加水分解した試料で行い、こ
の場合は５０μｌを更に試験用カートリッジに注入し
た。ヘキソサミン及びチロシンについての最高値は３Ｍ
のＨＣｌによる加水分解後にのみ得られ、一方バリン、
イソロイシン及びロイシンについての最高値は６ＭのＨ
Ｃｌによる加水分解後にのみ得られるので、３Ｍ及び６
ＭのＨＣｌにおける二重の加水分解がヘキソサミン及び
アミノ酸分析の最適化に必要である。
【０１０９】（２）コラーゲンスポンジ及びフリース中
の天然コラーゲン含量の測定 試料の２５〜３０ｍｇ（正確に秤量した）を、６ｍｇ／
ｍｌのトリプシン溶液（ウシ膵臓からの凍結乾燥調製
物、Boehringer，Mannheim)の１．５ｍｌを添加した
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（pA，Merck，Darmsta
dt）ｐＨ８．２の３０ｍｌ中に導入し、振盪水浴（Jula
bo SWI，Seelbach）中で２３±１℃で８時間インキュベ
ートした。試料を冷室で４℃に冷却した後、４℃で６０
Ｔｉ−Ｒｏｔｏｒ(Beckman，Munich)中で３２０００Ｒ
ＰＭにて３０分間遠心分離した。残留物を直径２５ｍｍ
のＤｉａｆｌｏｗ−ＦｉｌｔｅｒＰＭ１０（Amicon，Wi
tten）を通して撹拌限外濾過セル（Mod 8010，Amicon，
Witten）において濾過し、１ｍｌの濾液を６ＭのＨＣｌ
で２０時間１０５℃で加水分解した。加水分解物の更な
る処理及び分析は、更に、乾燥状態まで２回蒸発させた
後の試料の溶解を１５０μｌのローディング緩衝液中で
行い、これにより１５０μｌをアミノ酸分析器の試験用
カートリッジに注入すること以外は、上記（１）に記載
された手順と同じである。アミノ酸分析後得られるヒド
ロキシプロリン値（μｍｏｌ／ｇ出発物質）は、試料中
の分解性コラーゲンの部分を表す。全コラーゲン含量を
表す、加水分解（６ＭのＨＣｌ）及び分析を並行した試
料（上記（１）参照）のヒドロキシプロリン値を前記ヒ
ドロキシプロリン値と比較するとき、トリプシン非分解
性コラーゲンである「天然」の百分率比が示される。結
果を以下の表に示す：
【０１１０】
【表１】
【０１１１】（実施例４）ウシ大腿骨を熱湯中できれい
になるまで煮沸し、５〜１０ｍｍの粒子径に細かく砕
き、ソクスレー（Sohxlet）装置において２４時間トル
エンの還流下で抽出した。この材料を更にエタノールで
抽出してトルエンを除去し、次いで、高温にてエチレン
ジアミン及び水（８５：１５）の共沸混合物で、数回溶
媒を交換しながら実質的にそれ以上有機材料が抽出され
なくなるまで８日間抽出した。次いで生成物を１００℃
にて風乾した。乾燥した生成物を０．２〜２ｍｍの平均
粒子径に更に細かく砕き、オートクレーブで滅菌した。
典型的に直径が１０ｍｍのウシ大腿骨スポンジフォサ骨
の断片を、最終の顆粒化を省略して同じ技術によって精
製した。
【０１１２】（実施例５）新たに屠殺したブタの凍結軟
骨を冷水に浸し、完全に洗浄し、肉の残渣、骨及び硬質
断片から機械的に精製した。続いて、その材料を流水下
で３０分間洗浄した。続いて、その材料をホモジナイザ
ー中で３回粉砕した。大きさを減少させた後の光学的粒
子の大きさは約８ｍｍであった。この軟骨断片をアセト
ンで各８時間ずつ４回洗浄することにより脱水した。次
いで軟骨をｎ−ヘキサンで４回抽出することによって脱
脂した。各処理は少なくとも８時間続けた。ヘキサン：
軟骨の比は１：１０であった。脱脂後、軟骨を飲料水中
で膨張させた。水：材料の比は１０：１であり、処理時
間は２４時間であった。次いでその材料をＮａＯＨ（５
重量％）で処理し、これよって軟骨：液体の比は１：４
であり、処理時間は３２時間であった。処理の間、軟骨
断片を十分に攪拌した。続いて、アルカリを軟骨から洗
浄した。これにより、もとのｐＨ１４が９〜１１に下が
った。溶解した不純物を洗い流して、軟骨から分離し
た。アルカリ処理によって得られた液体は、グリコサミ
ノグリカンの回収のために集められた。次いでコラーゲ
ン材料を最初にｐＨ値１．０以下にて強いＨＣｌ（約３
重量％）で処理した。処理時間は４〜６時間であった。
続いて、材料を冷水でｐＨ値が３〜３．５まで上昇する
のに十分な時間洗浄した。すべての不純物が除去され、
生成物はスポンジ又はその他のコラーゲン材料の生成に
適当な塩を含まないコラーゲンの塊であった。上記目的
のために、意図される結果によりこの軟骨の塊を脱気
し、凍結及び凍結乾燥してもよい。
【０１１３】（実施例６）実施例５におけるアルカリ処
理によって得られた抽出物は、グリコサミノグリカン、
アルカリ、変性タンパク質及び塩を含んでいた。抽出物
を最初にＨＣｌで中和し、中和後のｐＨ値は６となっ
た。次いで抽出物を、変性タンパク質を除去する作用を
有する濾過助剤、即ちケイ藻土で処理した。０．５重量
％のケイ藻土を抽出物中に導入し、変性タンパク質と一
緒に濾過によって除去した。次いでその上清を、約１０
０００ダルトンにて分子量カットオフを有する膜を用い
て限外濾過を行った。これにより塩は除去され、精製さ
れたグリコサミノグリカンが残った。このように得られ
たグリコサミノグリカン溶液を上記コラーゲン材料と混
合して、グリコサミノグリカンを含むコラーゲンIIマト
リックスを得た。
【０１１４】（実施例７）実施例６から得られたコラー
ゲンII材料２．０ｇをブレンダー中で５００ｇの蒸留水
とともに細かく砕いた。この分散物を遠心分離し、上清
の水を除去した。得られたコラーゲン繊維スラリーに、
上記実施例１の手順によって精製されたウシの顆粒化皮
質骨１７．５ｇを加え、続いて十分混合して吸水管（７
０ｍｍ）により水を除去した。顆粒化骨は粒子径０．５
〜１．０ｍｍを有する。水の除去後、９％ｗ／ｗの水性
ゼラチン溶液を５ｍｌ加え（３５％水性ホルムアルデヒ
ドの０．６％によって架橋）、混合物を再び吸引して乾
燥させた。スポンジ塊を断片に切断し、６０℃にて真空
中で乾燥させた。このスポンジの断片をポリエチレン容
器中に詰め、ガンマ照射により滅菌した。
【０１１５】（実施例８）実施例１、２、３、４及び７
により生成されたマトリックスは、骨細胞、骨芽細胞、
骨髄中の間質幹細胞又は骨芽細胞形成幹細胞の懸濁液で
充填され、本発明による骨治癒組み合わせ材料を形成す
る。骨芽細胞を自己細胞供給源から培養し、実験室外で
増殖させ、マトリックスに充填させ、次いで欠損部、例
えば歯周及び／又は上顎骨の骨欠失部、又は全身の骨格
欠損部に移植する。上記に引用したビオガイド(Biogid
e)（登録商標）などのバリヤー機能を有し得るコラーゲ
ン膜で移植部位を覆う。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の一実施形態による骨形成細胞を担持
する多孔性骨ミネラル材料の正面略図である。
【図２】 本発明により処理された骨欠失領域の部分断
面の略図である。
【図３】 本発明の一実施形態による骨形成細胞を担持
する一層コラーゲンマトリックスを示す側面略図であ
る。
【図４】 本発明の他の実施形態による骨形成細胞を担
持する二層マトリックスを示す側面略図である。
【図５】 本発明の別の実施形態による骨形成細胞を担
持する三層マトリックスを示す側面略図である。
【図６】 本発明のさらに他の実施形態による骨形成細
胞を担持する一層マトリックスを示す側面略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 500140219 Ｂａｈｎｈｏｆｓｔｒａｓｓｅ 40， Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ 157， 6110 Ｗｏｌ ｈｕｓｅｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ (72)発明者 ペーター・ガイストリッヒ スイス国、6362 スタンススタット、ケー ルジーテンストラーセ 19 Ｆターム(参考） 4C081 AB04 BA12 BA13 CC05 CC06 CD042 CD052 CD062 CD072 CD082 CD121 CD151 CD17 CD26 CD27 CD28 CD29 CD34 CE01 CE02 CF011 CF031 DA01 DA04 DA12 DB02 DB03 DC11 DC12 DC13 EA11

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 骨細胞、骨芽細胞、間質幹細胞、及び骨
    形成骨芽細胞への分化が決定付けられた幹細胞からなる
    群より選択される培養骨形成細胞を担持するマトリック
    スを含む骨治癒材料であって、前記マトリックスが、天
    然コラーゲン含有動物組織から得られる精製コラーゲン
    と、実質的に天然骨の結晶構造を有し、内在性有機物質
    を実質的に含まない天然骨から得られる多孔性骨ミネラ
    ルと、前記精製コラーゲン及び多孔性骨ミネラルの組合
    せとからなる群より選択される骨治癒材料。
  2. 【請求項２】 前記間質幹細胞が骨髄に存在し、前記マ
    トリックスが前記骨髄を担持する、請求項１記載の材
    料。
  3. 【請求項３】 前記骨形成細胞が培養される、請求項１
    記載の材料。
  4. 【請求項４】 前記マトリックスが前記多孔性骨ミネラ
    ルである、請求項１記載の材料。
  5. 【請求項５】 前記マトリックスが前記組合せである、
    請求項１記載の材料。
  6. 【請求項６】 前記コラーゲンが、コラーゲンＩ、コラ
    ーゲンIII又はこれらの混合物を含む、請求項５記載の
    材料。
  7. 【請求項７】 前記コラーゲンがコラーゲンIIを含む、
    請求項５記載の材料。
  8. 【請求項８】 前記マトリックスが前記精製コラーゲン
    を含み、前記精製コラーゲンが、コラーゲンＩ、コラー
    ゲンIII又はこれらの混合物を含む、請求項１記載の材
    料。
  9. 【請求項９】 前記マトリックスが前記精製コラーゲン
    を含み、前記精製コラーゲンがコラーゲンIIを含む、請
    求項１記載の材料。
  10. 【請求項１０】 骨組織を再構成するための請求項１記
    載の材料の利用方法であって、骨欠損部と請求項１記載
    の材料とを接触させて、前記骨欠損部における骨組織の
    再構成を促進させることを含む、該方法。
  11. 【請求項１１】 前記間質幹細胞が骨髄に存在し、前記
    マトリックスが前記骨髄を担持する、請求項１０記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】 前記骨形成細胞が培養される、請求項
    １０記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記マトリックスが前記多孔性骨ミネ
    ラルである、請求項１０記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記マトリックスが前記組合せであ
    る、請求項１０記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記コラーゲンが、コラーゲンＩ、コ
    ラーゲンIII又はこれらの混合物を含む、請求項１４記
    載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記コラーゲンがコラーゲンIIを含
    む、請求項１４記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記マトリックスが前記精製コラーゲ
    ンを含み、前記精製コラーゲンが、コラーゲンＩ、コラ
    ーゲンIII又はこれらの混合物を含む、請求項１０記載
    の方法。
  18. 【請求項１８】 前記マトリックスが前記精製コラーゲ
    ンを含み、前記精製コラーゲンがコラーゲンIIを含む、
    請求項１０記載の方法。
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