CN107080834A - 用于治疗腱病的血小板衍生生长因子组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供用于治疗腱病的组合物和方法，所述腱病例如腱鞘炎、腱退变或腱炎，包括跟腱病、髌腱病、外上髁炎即“网球肘”、内上髁炎即“高尔夫球员肘”、足底筋膜炎和肌腱套腱病，具体地讲，本文涉及通过给予包含血小板衍生生长因子(PDGF)的组合物治疗腱病的方法。

Description

用于治疗腱病的血小板衍生生长因子组合物和方法

本申请是原案申请日为2011年02月22日、原案申请号为201180010529.6 (国际申请号为PCT/US2011/025770)、发明名称为“用于治疗腱病的血小板衍生生长因子组合物和方法”的专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年2月22日提交的美国临时专利申请号61/306,938、2010年3月5日提交的美国临时专利申请顺序号61/311,284、2010年12月30日提交的美国临时专利申请顺序号61/428,809和2011年1月3日提交的美国临时专利申请号61/429,428的权益，所有申请都通过引用以其整体结合到本文中。

技术领域

本发明涉及用于治疗以下腱病(tendinopathy)的组合物和方法，例如腱鞘炎、腱退变(tendinosis)或腱炎，包括跟腱病(Achilles tendinopathy)、髌腱病、外上髁炎(lateral epicondylitis)即“网球肘”、内上髁炎即“高尔夫球员肘”、足底筋膜炎和肌腱套腱病，具体地讲，涉及通过给予包含血小板衍生生长因子(PDGF)的组合物治疗腱病的方法。

发明背景

肌腱是一种坚韧的纤维性***带，通常将肌肉与骨连接。肌腱的弹性特性调节运动期间的力，在无主动工作的情况下提供额外的稳定性。它们还以高效率储存和恢复能量。正常的健康肌腱主要由紧密压在一起的平行排列的I型胶原纤维组成，但也包括少量弹性蛋白和蛋白聚糖。由其高度特化的超微结构、低水平的血管形成和缓慢的胶原更新所致，肌腱如果受损则痊愈非常缓慢，并且很难恢复其最初的强度。部分撕裂通过快速产生无序的III型胶原而愈合，无序的III型胶原比正常肌腱弱。肌腱受损区域的损伤复发是普遍的。

腱病是肌腱的慢性病症或损伤，似乎由分解代谢和合成代谢反应之间的不平衡导致，这种不平衡是由过度使用或老化致使肌腱逐步磨损而引起的。这种不平衡的结果是肌腱变性、衰弱、撕裂和疼痛。相比之下，急性肌腱损伤例如肌腱破裂或从骨上脱落十分突然，通常需要手术修复破裂或使肌腱与骨再附着。任何人都可能发生腱病，但在其工作、运动或常规日常活动中趋于一再进行相同动作的人更可能发生腱病。腱病通常在受累部位引起疼痛、僵硬和丧失强度。

术语腱病是指两种类型的肌腱损伤：腱退变和腱炎。该术语还包括腱鞘炎，一种发生在某些肌腱例如屈肌腱和跟腱中的肌腱外衬腱病。

腱退变是肌腱的非炎性损伤，其特征在于因过度使用引起的通常呈在肌腱中和肌腱周围的组织微撕裂形式的肌腱的肌腱内变性，导致损伤区域周围肌腱修复细胞的数目增加。肌腱的变性是由肌腱的胶原纤维、细胞和血管成分的损伤或结构破坏引起的，其可降低肌腱的抗张强度，如果不治疗的话，可导致肌腱破裂。胶原组构的变化的特征在于纤维分离/松散/卷曲、平行取向丧失、纤维直径减小和胶原总体密度降低。此外，也可发生被红细胞、血纤蛋白和纤连蛋白沉积物包绕的胶原微撕裂。另一方面，存在III型(修复性)胶原增加。这些基质组构变化可导致在偏振光显微术下双折射降低。除胶原含量和组构以外，腱退变的特征还在于在受累区域粘液样基质(蛋白聚糖)增加和细胞密度改变。一些区域含有异常丰富的肌腱细胞，其有成圆形的核和蛋白聚糖和蛋白质产生增加的超微结构迹象。相比之下，受累肌腱的其它区域可含有比正常少的肌腱细胞，其具有小的固缩核。腱退变的另一个特有特征是毛细血管和微动脉增生。通过电子显微镜术鉴定出腱退变中肌腱变性的若干亚类：(1)低氧变性，(2)透明变性，(3)粘液样变性(mucoid或myxoid degeneration)，(4)纤维蛋白样变性，(5)类脂质变性，(6)钙化，和(7)纤维软骨和骨转化。这些病理可以不同的发生率共存，这取决于解剖部位和引起这些病理的损伤的性质(例如缺氧与机械载荷；急性与慢性损伤)。例如，粘液样变性区域通过光学显微镜术、大的粘液斑和纤维之间的空泡表征。然而，类脂质变性的特征在于肌腱内脂质蓄积异常，导致胶原纤维结构被破坏。在一些情况下，腱退变伴发肌腱局灶性坏死或钙化。它是引起关节周围慢性疼痛的一个十分常见的原因。腱退变的特征还在于缺乏初期炎症反应。炎性细胞被认为是修复过程的早期介质，没有它腱退变可能变成慢性病况。

与腱退变有关的含水量的特征性增加和胶原基质的结构破坏可通过超声检查或磁共振成像诊断。症状可从肌腱局部区域的单纯疼痛和僵硬到受损肌腱附近整个关节周围的烧灼感而不同。对于许多患者，疼痛常常在活动期间和活动之后恶化，肌腱和关节区域在次日可能变得更僵硬，因为肿胀对肌腱的活动有重大影响。

腱炎是肌腱的炎性损伤，其特征在于像在腱退变中观察到的变性，但还伴有伴发血管破坏和炎性修复反应的肌腱炎症。腱炎常常伴有成纤维细胞和成肌纤维细胞增殖，以及出血和组织化肉芽组织。腱炎一般通过所涉及的身体部位来命名，例如跟腱炎(影响跟腱)或髌腱炎(亦称为“跳跃膝”，影响髌腱)，但是有某些例外，例如外上髁炎(亦称为“网球肘”，影响桡侧腕短伸肌腱)。症状可从持续性疼痛或疼痛和局部僵硬到发炎肌腱附近整个关节周围的烧灼感而不同。在一些情况下，腱炎的特征在于肿胀，有时伴有发热和发红；在关节周围还可有可见结节。对于许多患者，疼痛通常在活动期间和活动之后恶化，次日肌腱和关节区域可变得僵硬，因为肌肉因肌腱活动而收紧。

现行治疗在性质上主要是治标的，治疗在传统上集中在抗炎方法上，包括用非甾体抗炎药(NSAID)治疗、类固醇注射和物理治疗，尽管腱退变往往与炎症反应不相关的事实。最近，测试了冲击波疗法、水平激光疗法、硬化疗法和其它实验性治疗。对于大部分，似乎一些治疗(例如NSAID和可的松注射)提供短期缓解，而现行治疗的长期益处尚不清楚。因此，需要与现有治疗方式相比提供长期益处的治疗腱病的改进方法。

PDGF存储于血小板的α-颗粒中，并在组织修复期间由局部活化细胞(包括巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞)分泌。PDGF-BB是急性肌腱损伤出血和炎症的主要产物之一。血小板衍生生长因子-BB (PDGF-BB)是一种伤口愈合蛋白质，已知其对于包括骨(成骨细胞)和肌腱(肌腱细胞)细胞在内的间充质源细胞是趋化性的(细胞迁移)和促有丝***的(细胞增殖)。此外，已表明PDGF-BB增量调节血管内皮生长因子(VEGF)，导致血管生成(血管重建)增加，这是成功再生过程所必需的。

跟腱是人体中最厚和最强的肌腱，这允许它支持高载荷。其中跟腱起作用的机械载荷环境使之易于破裂。跟腱破裂可作为各种因素的结果而发生，然而破裂常常与退行性病变有关。(Mafulli N，Wong J，Almekinders L. Types and epidemiology oftendinopathy (腱病的类型和流行病学). Clinics in Sports Medicine. 2003;22:675-692)。在修复过程后，破裂的跟腱显示I型胶原减少，而III型胶原的量相对增加。这种组成的变化导致交联较少和抗张强度降低。甚至在愈合后，破裂的跟腱由于细胞过多、结构破坏和胶原交联减少而仍旧较弱(Maffulli N, Moller HD, Evans CH. Tendon Healing: Canit be Optimized (肌腱愈合：可能最优化吗) British Journal of Sports Medicine,2002;36:315-316)。对于跟腱破裂的最佳治疗存在争论，对保守(非手术)和手术治疗两者有赞成的也有反对的。非手术治疗导致较高的再破裂率且强度降低，但却避免了与手术有关的费用和风险。(Inglis AE, Scott WN, Sculco TP等. Ruptures of the tendoachillis: an objective assessment of surgical and non-surgical treatment (跟腱破裂：手术和非手术治疗的客观评价). J Bone Joint Surg Am. 1976;58:990-993；Nistor L. Surgical and Nonsurgical treatment of Achilles tendon rupture: aprospective randomized trial (跟腱破裂的手术和非手术治疗：前瞻性随机试验). JBone Joint Surg Am 1981 63(3):394-9；Chalmers J. Review Article: Treatment ofAchilles tendon ruptures (综述文章：跟腱破裂的治疗). Journal of OrthopaedicSurgery 2008(1):97-99)。手术修复伴有手术和麻醉风险；然而它提供增强的强度、较低的再破裂率和较早恢复体育活动。(Nistor L. Surgical and Nonsurgical treatment ofAchilles tendon rupture: a prospective randomized trial (跟腱破裂的手术和非手术治疗：前瞻性随机试验). J Bone Joint Surg Am 1981 63(3):394-9；Rettig A,Liotta FJ, Klootwyk TE, Porter DA, Mieling P. Potential Risk of Rerupture inPrimary Achilles Tendon Repair in Athletes Younger than 30 years of Age (30岁以下运动员重大跟腱修复中再破裂的潜在风险). Am J of Sports Med 2005:33(1):119-123)。不论临床医生对急性跟腱破裂的治疗的偏爱，手术修复在活跃患者群的这些损伤的各种治疗中将继续占有一席之地。与现行的治疗方式相比，强化生物修复过程从而改善肌腱愈合，可能导致更快恢复活动并改进临床结局。

有关肌腱愈合的生物学增强已有若干体内和体外研究。参见例如：Seeherman HJ,Archambault JM, Rodeo SA,等. rhBMP-12 accelerates healing of rotator cuffrepairs in a sheep model (rhBMP-12加快绵羊模型的肌腱套修复的愈合). J Bone Joint Surg Am. 2008;90(10):2206-2219；Chan BP, Fu SC, Qin L等.Supplementation-time dependence of growth factors in promoting tendon healing(促进肌腱愈合中的生长因子的补充-时间依赖性). Clin Orthop Relat Res. 2006;448:240-247；Uggen JC, Dines J, Uggen CW等. Tendon gene therapy modulates thelocal repair enviroment in the shoulder (肌腱基因治疗调节肩部的局部修复环境).J Am Osteopath Assoc. 2005;105(1):20-21；Gelberman R, Thomopoulos S, Sakiyama-Elbert S等. The early effects of sustained platelet-derived growth factoradministration on the functional and structural properties of repairedintrasynovial flexor tendons: an in vivo biomechanic study at 3 weeks incanines (持续给予血小板衍生生长因子对经修复的滑膜内屈肌腱的功能和结构性质的早期作用：犬中三周的体内生物力学). J Hand Surg Am. 2007;32(3):373-379；Thomopoulos S, Das R, Silva MJ等. Enhanced flexor tendon healing throughcontrolled delivery of PDGF-BB (通过受控递送PDGF-BB加快屈肌腱愈合). J Orthop Res. 2009;27(9): 1209-1215；Thomopoulos S, Zaegel M, Das R等. PDGF-BB releasedin tendon repair using a novel delivery system promotes cell proliferationand collagen remodeling (采用新的递送***在肌腱修复中释放的PDGF-BB促进细胞增殖和胶原重建). J Orthop Res. 2007;25(10): 1358-1368；Dines J, Grande D, DinesD. Tissue Engineering and Rotator Cuff Tendon Healing (组织工程学和肌腱套肌腱愈合). J Shoulder Elbow Surg, 2007年9月/10月: 204S-206S。

以足够的剂量并在合适的时程内将rhPDGF-BB递送至修复部位在实现所需临床效果中很重要。若干研究描述了用生物成分(biologies)涂覆的缝线。参见例如Rickert M,Jung M, Adiyaman M, Richter W, Wimank HG. Growth and differentiation factor 5coated suture stimulates tendon healing in an Achilles tendon model in rats(生长和分化因子5涂覆的缝线刺激大鼠跟腱模型的肌腱愈合). Growth Factors 2001;19: 115-126；Weiler A, Forster C, Hunt P, Falk R, Jung T, Unterhauser FN,Bergmann V, Schmidmaier G, Haas NP. The Influence of Locally AppliedPlatelet-Derived Growth Factor-BB on Free Tendon Graft Remodeling AfterAnterior Cruciate Ligament Reconstruction (前十字韧带重建后局部施用血小板衍生生长因子-BB对游离肌腱移植物重建的影响). American Journal of Sports Medicine2004; 32(4):881-891；Dines J, Weber L, Razzano P等. The Effect of GrowthDifferentiation Factor-5-Coated Sutures on Tendon Repair in a Rat Model (大鼠模型中生长分化因子-5涂覆的缝线对肌腱修复的作用). J Shoulder Elbow Surg 2007;16:215S-221S；Uggen C, Dines J, McGarry M等. The effect of Recombinant HumanPlatelet Derived growth Factor BB coated sutures on Rotator cuff Healing in aSheep Model (绵羊模型中重组人血小板衍生生长因子BB涂覆的缝线对肌腱套愈合的作用). Arthroscopy: 2010:26(11): 1456-1462。

所需要的是用于将PDGF递送至肌腱以用于例如修复破裂的肌腱(例如破裂的跟腱)的改良缝线。

概述

一方面，本文提供治疗腱病的方法，所述方法包括给予受累部位有效量的包含PDGF和缓冲液的组合物。在一些实施方案中，腱病是腱退变。在一些实施方案中，腱病是腱炎。在一些实施方案中，腱病是腱鞘炎。在一些实施方案中，PDGF选自PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD。在一些实施方案中，PDGF是PDGF-BB。在一些实施方案中，PDGF是重组人(rh) PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约75 μg和约7,500 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约500 μg-约1,000 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约5,000 μg至约7,500 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约450 μg-约3000 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约400 μg-约1000 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约500 μg-约900 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约600 μg-约800 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约650 μg-约750 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含每剂量约700 μg的PDGF-BB。在一些实施方案中，组合物的体积为约1.0-约2.0 ml/剂量。在一些实施方案中，组合物的体积为约1.5 ml/剂量。在一些实施方案中，缓冲液选自磷酸缓冲盐溶液(“PBS”)、乙酸钠、乙酸铵、乙酸、柠檬酸、柠檬酸钠、三(羟甲基)氨基乙烷(“tris”)、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(“HEPES”)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(“MOPS”)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(“MES”)、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(“ADA”)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸) (“PIPES”)和N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(“ACES”)。在一些实施方案中，缓冲液是乙酸钠。在一些实施方案中，乙酸钠的浓度介于约10 mM和约100 mM之间。在一些实施方案中，乙酸钠的浓度约为20 mM。在一些实施方案中，组合物的pH介于约4.0和约7.0之间。在一些实施方案中，组合物的pH约为6。在一些实施方案中，通过直接注射至受累部位来给药。在一些实施方案中，受累部位是骨-肌腱连接处。在一些实施方案中，受累部位是肌腱。在一些实施方案中，腱病选自跟腱病、髌腱病、外上髁炎、内上髁炎、足底筋膜炎和肌腱套腱病。在一些实施方案中，腱病是外上髁炎。在一些实施方案中，以单剂量给予组合物。在一些实施方案中，通过单次注射给予组合物。在一些实施方案中，以不止一个剂量给予组合物。在一些实施方案中，通过单次注射一周一次给予组合物达4周。在一些实施方案中，与基线相比，该方法导致在给药约7天内肌腱强度提高至少约60%。在一些实施方案中，与基线相比，该方法导致在给药约7天内肌腱强度提高至少约65%。在一些实施方案中，与基线相比，该方法导致在给药约7天内肌腱强度提高至少约70%。在一些实施方案中，该方法导致肌腱在给药约7天内达到其最终强度的至少约80%，其中在给药后约21天测量最终强度。在一些实施方案中，该方法导致肌腱在给药约7天内达到其最终强度的至少约85%，其中在给药后约21天测量最终强度。在一些实施方案中，该方法导致肌腱在给药约7天内达到其最终强度的至少约90%，其中在给药后约21天测量最终强度。

另一方面，本文提供治疗腱病的方法，所述方法包括给予受累部位有效量的由PDGF和缓冲液组成的组合物。在一些实施方案中，腱病是腱退变。在一些实施方案中，腱病是腱炎。在一些实施方案中，腱病是腱鞘炎。在一些实施方案中，PDGF选自PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD。在一些实施方案中，PDGF是PDGF-BB。在一些实施方案中，PDGF是重组人(rh) PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约75 μg和约7,500 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约500μg-约1,000 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约5,000 μg至约7,500 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约450 μg-约3000 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约400 μg-约1000 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约500 μg-约900 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约600 μg-约800 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约650 μg-约750 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含每剂量约700μg的PDGF-BB。在一些实施方案中，组合物的体积为约1.0-约2.0 ml/剂量。在一些实施方案中，组合物的体积为约1.5 ml/剂量。在一些实施方案中，缓冲液选自磷酸缓冲盐溶液(“PBS”)、乙酸钠、乙酸铵、乙酸、柠檬酸、柠檬酸钠、三(羟甲基)氨基乙烷(“tris”)、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(“HEPES”)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(“MOPS”)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(“MES”)、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(“ADA”)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸) (“PIPES”)和N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(“ACES”)。在一些实施方案中，缓冲液是乙酸钠。在一些实施方案中，乙酸钠的浓度介于约10 mM和约100 mM之间。在一些实施方案中，乙酸钠的浓度约为20 mM。在一些实施方案中，组合物的pH介于约4.0和约7.0之间。在一些实施方案中，组合物的pH约为6。在一些实施方案中，通过直接注射至受累部位来给药。在一些实施方案中，受累部位是骨-肌腱连接处。在一些实施方案中，受累部位是肌腱。在一些实施方案中，腱病选自跟腱病、髌腱病、外上髁炎、内上髁炎、足底筋膜炎和肌腱套腱病。在一些实施方案中，腱病是外上髁炎。在一些实施方案中，以单剂量给予组合物。在一些实施方案中，通过单次注射给予组合物。在一些实施方案中，以不止一个剂量给予组合物。在一些实施方案中，通过单次注射一周一次给予组合物达4周。在一些实施方案中，与基线相比，该方法导致在给药约7天内肌腱强度提高至少约60%。在一些实施方案中，与基线相比，该方法导致在给药约7天内肌腱强度提高至少约65%。在一些实施方案中，与基线相比，该方法导致在给药约7天内肌腱强度提高至少约70%。在一些实施方案中该方法导致肌腱在给药约7天内达到其最终强度的至少约80%，其中在给药后约21天测量最终强度。在一些实施方案中，该方法导致肌腱在给药约7天内达到其最终强度的至少约85%，其中在给药后约21天测量最终强度。在一些实施方案中，该方法导致肌腱在给药约7天内达到其最终强度的至少约90%，其中在给药后约21天测量最终强度。在一些实施方案中，该方法由给予受累部位有效量的由PDGF和缓冲液组成的组合物组成。

另一方面，本文提供用于治疗腱病的包含有效量的PDGF和缓冲液的组合物。在一些实施方案中，腱病是腱退变。在一些实施方案中，腱病是腱炎。在一些实施方案中，腱病是腱鞘炎。在一些实施方案中，PDGF选自PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD。在一些实施方案中，PDGF是PDGF-BB。在一些实施方案中，PDGF是重组人(rh) PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量包含介于每剂量约75 μg和约7,500 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量包含介于每剂量约500 μg-约1,000 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量包含介于每剂量约5,000 μg至约7,500 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量包含介于每剂量约450 μg-约3000 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量包含介于每剂量约400 μg-约1000 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量包含介于每剂量约500 μg-约900 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量包含介于每剂量约600 μg-约800 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量包含介于每剂量约650 μg-约750 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量包含每剂量约700 μg的PDGF-BB。在一些实施方案中，组合物的体积为约1.0-约2.0 ml/剂量。在一些实施方案中，组合物的体积为约1.5 ml/剂量。在一些实施方案中，缓冲液选自磷酸缓冲盐溶液(“PBS”)、乙酸钠、乙酸铵、乙酸、柠檬酸、柠檬酸钠、三(羟甲基)氨基乙烷(“tris”)、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(“HEPES”)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(“MOPS”)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(“MES”)、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(“ADA”)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸) (“PIPES”)和N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(“ACES”)。在一些实施方案中，缓冲液是乙酸钠。在一些实施方案中，乙酸钠的浓度介于约10 mM和约100 mM之间。在一些实施方案中，乙酸钠的浓度约为20 mM。在一些实施方案中，组合物的pH介于约4.0和约7.0之间。在一些实施方案中，组合物的pH约为6。在一些实施方案中，治疗包括通过直接注射到受累部位来给予组合物。在一些实施方案中，受累部位是骨-肌腱连接处。在一些实施方案中，受累部位是肌腱。在一些实施方案中，腱病选自跟腱病、髌腱病、外上髁炎、内上髁炎、足底筋膜炎和肌腱套腱病。在一些实施方案中，腱病是外上髁炎。在一些实施方案中，以单剂量给予组合物。在一些实施方案中，通过单次注射给予组合物。在一些实施方案中，以不止一个剂量给予组合物。在一些实施方案中，通过单次注射一周一次给予组合物达4周。在一些实施方案中，与基线相比，治疗导致在给药约7天内肌腱强度提高至少约60%。在一些实施方案中，与基线相比，治疗导致在给药约7天内肌腱强度提高至少约65%。在一些实施方案中，与基线相比，治疗导致在给药约7天内肌腱强度提高至少约70%。在一些实施方案中，治疗导致肌腱在给药约7天内达到其最终强度的至少约80%，其中在给药后约21天测量最终强度。在一些实施方案中，治疗导致肌腱在给药约7天内达到其最终强度的至少约85%，其中在给药后约21天测量最终强度。在一些实施方案中，治疗导致肌腱在给药约7天内达到其最终强度的至少约90%，其中在给药后约21天测量最终强度。在一些实施方案中，组合物由有效量的PDGF和缓冲液组成。

另一方面，本文提供与本文所述方法关联的本文所述PDGF组合物的用途，除非另有说明或如从具体的上下文来看是显然的。本文所述PDGF组合物还可用于制备用于本文所述方法的药物。

附图简述

图1表示rhPDGF-BB治疗对肌腱细胞细胞迁移的作用。

图2表示rhPDGF-BB治疗对肌腱细胞细胞增殖的作用，通过BrdU掺入测定。

图3表示右腿肌腱-跟骨(calcaneous)连接处的注射部位。用使用28.5G针的胰岛素注射器进行注射。

图4表示在处理用于生物力学测试的试验动物后大鼠趾-跟-腓肠肌复合体的代表性图像。

图5表示跟骨(C)-跟腱(T)附着部位侧边矢状切面的代表性图像。

图6A表示治疗后7天胶原酶诱导的大鼠跟腱损伤模型中，肌腱内施用重组人血小板衍生生长因子同种型BB (“rhPDGF-BB”)的总体观察的肌腱生长的剂量反应研究结果。rhPDGF-BB治疗后7天，单次注射中等(10.2 μg)或高(102 μg)剂量的rhPDGF-BB引起肌腱大小显著增加。

图6B表示rhPDGF-BB治疗后21天同一研究的结果。治疗后21天，单次注射高(102 μg)剂量的rhPDGF-BB对肌腱大小的作用与仅用乙酸钠缓冲液注射的作用相当。

图7是与图6A和图6B相同的数据的不同图示，表示在rhPDGF-BB治疗后7天和21天总体肌腱大小(0 =无生长至3 =强烈生长)。

图8表示在rhPDGF-BB治疗后7天和21天跟骨附着部的肌腱宽度(μm ± SEM)。

图9表示在rhPDGF-BB治疗后7天和21天肌腱体处的肌腱宽度(μm ± SEM)。

图10表示在rhPDGF-BB治疗后7天和21天rhPDGF-BB对细胞增殖速率(细胞计数 ±SEM)的作用。

图11表示跟腱的机械性质：在rhPDGF-BB治疗后7天和21天的最大破裂载荷(N ±SEM)。

图12表示IV给药后的平均血清rhPDGF-BB浓度-时间值(concentration-timevalue)。

图13表示在IT给药后的平均血清rhPDGF-BB浓度-时间值。

图14A表示在各个时间点从Vicryl缝线释放的rhPDGF-BB的量的体外释放概况。

图14B表示在48小时内体外从4-0 Vicryl缝线累积释放的rhPDGF-BB (平均值±SEM)。

图14C表示rhPDGF-BB的估计体内累积剂量对比缝线涂覆溶液中的起始rhPDGF-BB浓度。

图14D表示植入的4-0 Vicryl缝线长度。

详述

本文引用的所有参考文献，包括而不限于专利、专利申请和科技参考文献，均在此通过引用以其整体结合到本文中。

本发明的组合物和方法出人意料地导致腱病治疗得到改进。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法导致肌腱的强度提高和肌腱强度复原的速度加快。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法导致肌腱的强度提高。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法导致肌腱强度复原的速度加快。例如，随着肌腱在损伤后愈合，肌腱的生物力学强度随着肌腱愈合的过程而提高。给予本发明的组合物可导致更快地提高肌腱强度。虽不希望受理论束缚，但强度的这种更快速的提高可能有助于促进肌腱的愈合；只要承载不进一步加大肌腱损伤，肌腱上的承载一般提高肌腱的愈合反应，因为它一般引起组织重建和重构改进。肌腱强度的较快的初始提高(例如因给予本发明的组合物引起)可导致更快地在肌腱上开始承载的能力，因此进一步提高肌腱愈合反应。虽不希望受理论束缚，可通过细胞增殖和/或胞外基质的产生增加，和/或通过组织的组构改进(例如胞外基质组构的改进)引起肌腱强度的改善。

此外，虽不希望受理论束缚，但本发明人出人意料地发现当将本发明的组合物直接给予肌腱(例如通过注射)时，PDGF保持定位于给药部位(例如在注射部位)。例如，如在下面的实施例5中的进一步详述，预料不到的是给予由缓冲液中的PDGF组成的组合物可引起PDGF保持定位于注射部位。

定义

本文所用术语“治疗”是指设计以改变待治疗病症(例如腱病，例如腱退变、腱炎或腱鞘炎)的临床病理的天然进程的临床干预。所需治疗效果包括例如以下的一种或多种：减轻受累关节或肢体的疼痛或僵硬、提高受累关节或肢体的活动性和强度、减缓腱病进展的速率、减轻炎症、提高肌腱强度、提高肌腱强度恢复的速率、改善或减轻病症状态和缓解或改善预后。例如，如果与腱病相关的一种或多种症状减轻或消除，则个体被成功“治疗”。

本文所用术语“有效量”是指对达到所需治疗或预防效果有效(以剂量计且持续所需的时间)的最低限度的量。可以一次或多次给药来提供有效量。

本文提及的值或参数前的“约”也包括(和描述)涉及该值或参数本身的实施方案。

本文和随附权利要求书中所用的单数形式包括复数所指物，除非文中另明确说明。例如，提及“PDGF同二聚体”是提及一个或多个PDGF同二聚体，并包括其本领域技术人员已知的等同物等。

要理解的是，本文所述本发明的所有方面和实施方案包括“包含”、“包括”各方面和实施方案及“基本由各方面和实施方案组成”。要理解的是，“基本由所述要求组成的”的方法或组合物只包括规定的步骤或材料和不会在实质上影响所述方法和组合物的基本特征和新的特征的步骤或材料(例如给予受累部位有效量的基本上由PDGF和缓冲液组成的组合物或基本上由有效量的缓冲溶液中的PDGF组成的组合物)。

血小板衍生生长因子及其组合物

本文所用术语“血小板衍生生长因子”或“PDGF”是指4种不同的PDGF同种型的任一种，其通过两种不同的受体激活细胞反应。所述同种型包括A (观察到作为同二聚体(命名为PDGF-AA)并作为与B同种型的异二聚体(命名为PDGF-AB)的一部分)、B (观察到作为同二聚体(命名为PDGF-BB)并作为与A同种型的异二聚体(命名为PDGF-AB)的一部分)、C (观察到为同二聚体，其命名为PDGF-CC)和D (观察到为同二聚体，其命名为PDGF-DD)。在本文中总的来说，术语“PDGF”一般是指已知的PDGF同二聚体和异二聚体(例如PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD)。

本文提供治疗个体的腱病的方法和用于这些方法的组合物。总体来说，治疗方法包括将包含PDGF的组合物给予患有腱病的个体的受累部位。准确地讲，治疗方法包括将包含PDGF和缓冲液的组合物给予腱病的部位。在一些实施方案中，组合物包含PDGF和缓冲液(例如PDGF的缓冲溶液)。

在一些实施方案中，组合物包含PDGF和缓冲液。在一些实施方案中，PDGF包括选自PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC、PDGF-DD的PDGF二聚体及其混合物和衍生物。在一些实施方案中，PDGF二聚体是同二聚体。在一些实施方案中，PDGF同二聚体选自PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-DD。在一些实施方案中，PDGF同二聚体是PDGF-BB。在一些实施方案中，PDGF二聚体是异二聚体。在一些实施方案中，PDGF异二聚体是PDGF-AB。

在一些实施方案中，PDGF可获自天然来源。在一些实施方案中，PDGF可通过重组DNA技术产生。在一些实施方案中，可采用本领域技术人员已知的肽合成技术例如固相肽合成，来产生PDGF或其片段。

当从天然来源获得时，PDGF可来源于生物流体。在一些实施方案中，生物流体可包括与活体有关的任何处理或未处理的流体(包括血液)。生物流体还可包括血液成分，包括血小板浓缩液、单采血液成分提取的血小板、富集血小板的血浆、血浆、血清和新鲜冷冻的血浆。生物流体可包括从血浆分离并重新悬浮于生理液体或缓冲液的血小板。

当通过重组DNA技术产生时，可将编码单一单体(例如PDGF B链或A链)的DNA序列***培养的用于表达的原核细胞或真核细胞中，以便随后产生同二聚体(例如PDGF-BB或PDGF-AA)。在一些实施方案中，PDGF包括PDGF同二聚体(例如PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC或PDGF-DD)。在一些实施方案中，PDGF异二聚体可如下产生：将编码异二聚体的两个单体单元的DNA序列***培养的原核细胞或真核细胞中，使翻译的单体单元通过细胞加工产生异二聚体(例如PDGF-AB)。在一些实施方案中，PDGF包含PDGF异二聚体(例如PDGF-AB)。市售的重组人PDGF-BB可获自许多商业来源，包括但不限于Leinco Technologies, Inc. (St.Louis, MO)和R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)。

在本文描述的一些实施方案中，PDGF包含重组人PDGF (“rhPDGF”)。在一些实施方案中，重组人PDGF (“rhPDGF”)是选自rhPDGF-AA、rhPDGF-BB、rhPDGF-AB、rhPDGF-CC、rhPDGF-DD的PDGF二聚体及其混合物和衍生物。在一些实施方案中，重组人PDGF是rhPDGF同二聚体。在一些实施方案中，重组人PDGF同二聚体选自rhPDGF-AA、rhPDGF-BB、rhPDGF-CC和rhPDGF-DD。在一些实施方案中，重组人PDGF同二聚体是rhPDGF-BB。在一些实施方案中，重组人PDGF是rhPDGF异二聚体。在一些实施方案中，重组人PDGF异二聚体是rhPDGF-AB。

在一些实施方案中，PDGF-B包含一个或多个下列片段：完整人B链的氨基酸1-31、1-32、33-108、33-109和/或1-108。美国专利号5,516,896的图15中提供人PDGF B链的完整氨基酸序列(氨基酸1-109)。要理解的是，本发明的PDGF-BB组合物可包含完整人PDGF-B(氨基酸1-109)及其片段的组合。可使用PDGF的其它片段，例如美国专利号5,516,896中公开的片段。在一些实施方案中，PDGF-BB包含全长人PDGF-B (氨基酸1-109)的至少65%。在一些实施方案中，PDGF-BB包含全长人PDGF-B (氨基酸1-109)的至少75%、80%、85%、90%、95%或99%。

在一些实施方案中，组合物包含选自PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD的PDGF二聚体(例如rhPDGF二聚体)，且组合物包含以下浓度范围的PDGF二聚体：约0.01mg/ml-约10.0 mg/ml、约0.05 mg/ml-约5.0 mg/ml、约0.1 mg/ml-约1.0 mg/ml或约0.1mg/ml-约2.0 mg/ml、约0.1 mg/ml-约3.0 mg/ml、约0.1 mg/ml-约4.0 mg/ml、约0.1 mg/ml-约0.4 mg/ml、约0.1 mg/ml-约5.0 mg/ml、约0.9 mg/ml-约1.5 mg/ml。在一些实施方案中，组合物包含浓度为约3.4 mg/ml的PDGF二聚体。在一些实施方案中，组合物包含浓度为约1.0 mg/ml的PDGF二聚体。在一些实施方案中，组合物包含浓度为约0.34 mg/ml的PDGF二聚体。在一些实施方案中，组合物包含任一以下浓度的PDGF二聚体：约0.05 mg/ml、约0.1mg/ml、约0.15 mg/ml、约0.2 mg/ml、约0.25 mg/ml、约0.3 mg/ml、约0.35 mg/ml、约0.4mg/ml、约0.45 mg/ml、约0.5 mg/ml、约0.55 mg/ml、约0.6 mg/ml、约0.65 mg/ml、约0.7mg/ml、约0.75 mg/ml、约0.8 mg/ml、约0.85 mg/ml、约0.9 mg/ml、约0.95 mg/ml、约1.0mg/ml、约1.5 mg/ml、约2.0 mg/ml、约2.5 mg/ml、约3.0 mg/ml、约3.5 mg/ml、约4.0 mg/ml、约4.5 mg/ml或约5.0 mg/ml。要理解的是，这些浓度只是具体实施方案的实例，PDGF二聚体的浓度可落入上述任何浓度范围内。

在一些实施方案中，PDGF二聚体(例如rhPDGF二聚体)是PDGF-BB。在一些实施方案中，组合物包含以下浓度范围的PDGF-BB：约0.01 mg/ml-约10.0 mg/ml、约0.05 mg/ml-约5.0 mg/ml、约0.1 mg/ml-约1.0 mg/ml或约0.1 mg/ml-约2.0 mg/ml、约0.1 mg/ml-约3.0mg/ml、约0.1 mg/ml-约4.0 mg/ml、约0.1 mg/ml-约5.0 mg/ml、约0.1 mg/ml-约0.4 mg/ml、约0.9 mg/ml-约1.5 mg/ml。在一些实施方案中，组合物包含浓度为约3.4 mg/ml的PDGF-BB。在一些实施方案中，组合物包含浓度为约1.0 mg/ml的PDGF-BB。在一些实施方案中，组合物包含浓度为约0.34 mg/ml的PDGF-BB。在一些实施方案中，组合物包含任一种下列浓度的PDGF-BB：约0.05 mg/ml、约0.1 mg/ml、约0.15 mg/ml、约0.2 mg/ml、约0.25 mg/ml、约0.3 mg/ml、约0.35 mg/ml、约0.4 mg/ml、约0.45 mg/ml、约0.5 mg/ml、约0.55 mg/ml、约0.6 mg/ml、约0.65 mg/ml、约0.7 mg/ml、约0.75 mg/ml、约0.8 mg/ml、约0.85 mg/ml、约0.9 mg/ml、约0.95 mg/ml、约1.0 mg/ml、约1.5 mg/ml、约2.0 mg/ml、约2.5 mg/ml、约3.0 mg/ml、约3.5 mg/ml、约4.0 mg/ml、约4.5 mg/ml或约5.0 mg/ml。要理解的是，这些浓度只是具体实施方案的实例，且rhPDGF-BB的浓度可落入上述任何浓度范围内。

在一些实施方案中，PDGF选自PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD。不同量的PDGF可用于本发明的组合物。可采用的PDGF的量包括但不限于以下范围的量：约1 μg-约50 mg、约10 μg-约25 mg、约100 μg-约10 mg、约250 μg-约5 mg和约450 μg-约3 mg。在一些实施方案中，PDGF是PDGF-BB。不同量的PDGF-BB可用于本发明的组合物。可采用的PDGF-BB的量包括但不限于以下范围的量：约1 μg-约50 mg、约10 μg-约25 mg、约100 μg-约10 mg、约250 μg-约5 mg和约450 μg-约3 mg。

在本发明的一些实施方案中，可通过采用例如美国专利号6,221,625、5,747,273和5,290,708中描述的酶联免疫测定法或本领域已知的用于测定PDGF浓度的任何其它测定法，来测定PDGF (例如rhPDGF)(包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD)的浓度。当提供于本文中时，rhPDGF的摩尔浓度根据PDGF同二聚体的分子量(例如PDGF-BB，MW约25 kDa)确定。

在本发明的一些实施方案中，PDGF (例如rhPDGF)可以是高度纯化的形式。在加到本发明的溶液中之前，本文使用的纯化PDGF包括具有大于约95% (重量) PDGF的组合物。溶液可采用任何药学上可接受的缓冲剂或稀释剂制备。在一些实施方案中，PDGF可以是基本纯的。在加入本发明的溶液中之前，本文使用的基本纯化的PDGF包括具有约5%-约95% (重量) PDGF的组合物。在一个实施方案中，在加入本发明的溶液中之前，基本纯化的PDGF包括具有约65%-约95% (重量) PDGF的组合物。在一些实施方案中，在加入本发明的溶液中之前，基本纯化的PDGF包括具有约70%-约95%、约75%-约95%、约80%-约95%、约85%-约95%或约90%-约95% (重量)PDGF的组合物。可将纯化的PDGF和基本纯化的PDGF加入组合物中。

在又一个实施方案中，PDGF可以是部分纯化的。在富集血小板的血浆、新鲜冷冻的血浆或需要收集和分离以产生PDGF的任何其它血液产品的情况下，本文使用的部分纯化的PDGF包括具有PDGF的组合物。本发明的实施方案预期，本文提供的任何PDGF同种型(包括同二聚体和异二聚体)可以是纯化的或部分纯化的。本发明的包含PDGF混合物的组合物可以部分纯化的比例包含PDGF同种型或PDGF片段。在一些实施方案中，可按照美国申请顺序号11/159,533 (美国专利公布号2006/0084602 A1)中披露的方法制备部分纯化的和纯化的PDGF。

在本文所述的任何实施方案中，高度纯化的或部分纯化的PDGF选自PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD。在本文所述的任何实施方案中，高度纯化的或部分纯化的PDGF是PDGF-BB。

缓冲液

在一些实施方案中，组合物包含PDGF和缓冲液，优选药学上可接受的缓冲液。适用于本发明的PDGF溶液的缓冲液可包括但不限于碳酸盐、磷酸盐(例如磷酸缓冲盐溶液)、盐水、组氨酸、乙酸盐(例如乙酸钠或乙酸铵)、酸性缓冲液(例如乙酸、柠檬酸、柠檬酸钠和HCl)和有机缓冲液例如赖氨酸、Tris缓冲液(例如三(羟甲基)氨基乙烷)、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(“ADA”)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸) (PIPES)和N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)。

可根据与PDGF的生物相容性及缓冲液阻止不良蛋白质修饰的能力来选择缓冲液。另外，可根据与宿主组织的相容性和药学上的可接受性来选择缓冲液。在一些实施方案中，PDGF组合物包含乙酸钠缓冲液中的PDGF。在一些实施方案中，乙酸钠缓冲液中的PDGF选自PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD。在一些实施方案中，乙酸钠缓冲液中的PDGF是rhPDGF-BB。

可以不同的摩尔浓度使用缓冲液，例如约0.1 mM-约100 mM、约1 mM-约100 mM、约10 mM-约100 mM、约1 mM-约50 mM、约5 mM-约40 mM、约10 mM-约30 mM或约15 mM-约25 mM或这些范围内的任何摩尔浓度。在一些实施方案中，以约20 mM的摩尔浓度使用乙酸盐缓冲液。可以不同的浓度使用缓冲液，例如约0.01 mg/ml-约10 mg/ml、0.05 mg/ml-约5 mg/ml、约0.5 mg/ml-约5 mg/ml、0.1 mg/ml-约1 mg/ml和约0.5 mg/ml-约1 mg/ml或这些范围内的任何浓度。

在另一个实施方案中，包含PDGF的溶液可通过将冻干的PDGF溶于水中制备，其中在溶解前，将PDGF从合适的缓冲液中冻干。

按照本发明的一些实施方案，包含PDGF和缓冲液的组合物的pH的范围可为约3.0-约8.0或约4.0-约7.0。在一些实施方案中，包含PDGF和缓冲液的组合物的pH的范围为约5.0-约8.0，更优选约5.5-约7.0，最优选约5.5-约6.5或这些范围内的任何值。在本文描述的一些实施方案中，PDGF组合物的pH介于约4.0和约7.0之间。在本文描述的一些实施方案中，PDGF组合物的pH介于约5.0和约7.0之间。在本文描述的一些实施方案中，PDGF组合物的pH为约4.0、约5.0、约6.0或约7.0。在一些实施方案中，包含PDGF和缓冲液的组合物的pH可与PDGF或任何其它所需要的生物活性剂的持久稳定性和功效相容。PDGF一般在酸性环境中更稳定。因此，按照一些实施方案，本文提供PDGF组合物的酸性贮存制剂。按照一些实施方案，包含PDGF和缓冲液的组合物的pH优选为约3.0-约7.0，更优选约4.0-约6.5。然而，在具有中性pH范围的溶液中可使PDGF的生物活性最佳。因此，在一些实施方案中，本文提供包含PDGF和缓冲液的组合物的中性pH制剂。按照该实施方案，组合物的pH优选为约5.0-约8.0，更优选约5.5-约7.0，最优选约5.5-约6.5。

在一些实施方案中，可通过本文所述缓冲液控制包含PDGF的溶液的pH。不同的蛋白质显示不同的pH范围，在此范围内蛋白质是稳定的。蛋白质稳定性主要受蛋白质的等电点和电荷影响。pH范围可影响蛋白质的构象结构以及蛋白质对蛋白水解降解、水解、氧化和可引起蛋白质结构和/或生物活性改变的其它过程的敏感性。

在一些实施方案中，本文提供的PDGF组合物包含选自PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD和PDGF-AB的PDGF和选自PBS、乙酸钠、乙酸铵、乙酸、柠檬酸、柠檬酸钠、三(羟甲基)氨基乙烷、HEPES、MOPS、MES、ADA、PIPES和ACES的缓冲液。在一些实施方案中，本文提供的PDGF组合物包含rhPDGF-BB和选自PBS、乙酸钠、乙酸铵、乙酸、柠檬酸、柠檬酸钠、三(羟甲基)氨基乙烷、HEPES、MOPS、MES、ADA、PIPES和ACES的缓冲液。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-BB和PBS。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-BB和乙酸钠。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-BB和乙酸铵。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-BB和乙酸。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-BB和柠檬酸。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-BB和柠檬酸钠。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-BB和三(羟甲基)氨基乙烷。在一些实施方案中，rhPDGF组合物包含PDGF-BB和HEPES。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-BB和MOPS。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-BB和MES。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-BB和ADA。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-BB和PIPES。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-BB和ACES。

在本文描述的一些实施方案中，缓冲液的浓度介于1 mM和1000 mM之间。在本文描述的一些实施方案中，缓冲液的浓度介于10 mM和1000 mM之间。在本文描述的一些实施方案中，缓冲液的浓度介于100 mM和1000 mM之间。在本文描述的一些实施方案中，缓冲液的浓度介于5 mM和500 mM之间。在本文描述的一些实施方案中，缓冲液的浓度介于50 mM和500 mM之间。在本文描述的一些实施方案中，缓冲液的浓度介于10 mM和100 mM之间。在本文描述的一些实施方案中，缓冲液的浓度介于20 mM和200 mM之间。在本文描述的一些实施方案中，缓冲液的浓度为10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90mM或100 mM。

在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-AA和约pH=6.0的20 mM乙酸钠。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-AB和约pH=6.0的20 mM乙酸钠。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-BB和约pH=6.0的20 mM乙酸钠。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-CC和约pH=6.0的20 mM乙酸钠。在一些实施方案中，PDGF组合物包含rhPDGF-DD和约pH=6.0的20 mM乙酸钠。

剂量和给药方案

可根据肌腱治疗面积的相对大小，由在大鼠肌腱模型中鉴定的PDGF的有效剂量推算用于其它个体(例如人)的有效量。例如，人跟腱的治疗面积约为大鼠跟腱治疗面积的69倍，因此用于人患者的PDGF的有效量或剂量可约为在大鼠肌腱模型中确定的PDGF的有效量或剂量的69倍。

通过给予本文提供的PDGF组合物递送的示例性有效量或剂量包括但不限于约450μg-约3,000 μg/剂量、约1 μg-约10,000 μg/剂量，包括例如以下的任一种：约1 μg-约7,500 μg/剂量、约1 μg-约5,000 μg/剂量、约1 μg-约2,500 μg/剂量、约1 μg-约1,000 μg/剂量、约1 μg-约500 μg/剂量、约1 μg-约250 μg/剂量、约1 μg-约100 μg/剂量、约10 μg-约10,000 μg/剂量、约10 μg-约7,500 μg/剂量、约10 μg-约5,000 μg/剂量、约10 μg-约2,500 μg/剂量、约10 μg-约1,000 μg/剂量、约10 μg-约500 μg/剂量、约10 μg-约250 μg/剂量、约10 μg-约100 μg/剂量、约25 μg-约10,000 μg/剂量、约25 μg-约7,500 μ/剂量、约25μg-约5,000 μg/剂量、约25 μg-约2,500 μg/剂量、约25 μg-约1,000 μg/剂量、约25 μg-约500 μg/剂量、约25 μg-约250 μg/剂量、约25 μg-约100 μg/剂量、约50 μg-约10,000 μg/剂量、约50 μg-约7,500 μg/剂量、约50 μg-约5,000 μg/剂量、约50 μg-约2,500 μg/剂量、约50 μg-约1,000 μg/剂量、约50 μg-约500 μg/剂量、约50 μg-约250 μg/剂量、约50 μg-约100 μg/剂量、约50 μg-约100 μg/剂量、约75 μg-约10,000 μg/剂量、约75 μg-约7,500μg/剂量、约75 μg-约5,000 μg/剂量、约75 μg-约2,500 μg/剂量、约75 μg-约1,000 μg/剂量、约75 μg-约500 μg/剂量、约75 μg-约250 μg/剂量、约75 μg-约125 μg/剂量、约100 μg-约200 μg/剂量、约200 μg-约300 μg/剂量、约300 μg-约500 μg/剂量、约500 μg-约1,000 μg/剂量、约1,000 μg-约2,500 μg/剂量、约1,000 μg-约5,000 μg/剂量、约1,000 μg-约7,500 μg/剂量、约1,000 μg-约10,000 μg/剂量、约2,500 μg-约5,000 μg/剂量、约2,500 μg-约7,500 μg/剂量、约5,000 μg-约7,500 μg/剂量、约10,000 μg-约50,000 μg/剂量、约50,000 μg-约100,000 μg/剂量、约100,000 μg-约200,000 μg/剂量、约200,000 μg-约300,000 μg/剂量、约300,000 μg-约400,000 μg/剂量或约400,000 μg-约500,000 μg/剂量。

在一些实施方案中，以约400 μg-约1000 μg/剂量、约500 μg-约900 μg/剂量、约600 μg-约800 μg、约650 μg-约750 μg/剂量、约700 μg/剂量给予PDGF。

在一些实施方案中，以50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL、350 μL、400 μL、450 μL、500 μL、550 μL、600 μL、650 μL、700 μL、750 μL、800 μL、850 μL、900 μL、950 μL、1000 μL或更大的体积给予本文提供的剂量。在一些实施方案中，以100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL、600 μL、700 μL、800 μL、900 μL、1000 μL、1100 μL、1200 μL、1300 μL、1400 μL、1500 μL、1600 μL、1700 μL、1800 μL、1900 μL、2000 μL或更大的体积给予本文提供的剂量。在一些实施方案中，以约1000 μL-约2000 μL、约1250-约1750 μL、约1300μL-约1600 μL或约1500 μL的体积给予本文提供的剂量。

本文提供的PDGF组合物可以单次日剂量给予，或者总日剂量可以分开的剂量给予，例如每日2次、3次或4次。在一些实施方案中，本文提供的PDGF组合物的单次日剂量可一天一次给予达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天。PDGF组合物还可以低于每日的频率给予，例如一周6次、一周5次、一周4次、一周3次、一周2次、一周1次、每两周一次、每3周一次、每月一次、每两月一次、每3月一次、每4月一次、每5月一次或每6月一次。

在一些实施方案中，在一定时间内间隔给予PDGF组合物。在一些实施方案中，一周一次给予PDGF组合物达1、2、3、4、5、6或更多个月。在一些实施方案中，一月两次给予PDGF组合物达1、2、3、4、5、6或更多个月。在一些实施方案中，每月一次给予PDGF组合物达1、2、3、4、5、6或更多个月。

治疗腱病的方法

本文所用术语“腱病”是指慢性肌腱损伤，例如腱退变、腱炎和腱鞘炎。示例性腱病包括但不限于跟腱病、髌腱病、外上髁炎即“网球肘”、内上髁炎、足底筋膜炎和肌腱套腱病。

本文所用术语“腱退变”是指肌腱的非炎性损伤，其特征在于因过度使用引起的通常呈在肌腱中和肌腱周围的组织微撕裂形式的肌腱的肌腱内变性，导致损伤区域周围肌腱修复细胞数目增加。肌腱的变性由肌腱的胶原纤维、细胞和血管成分的损伤或结构破坏引起，其可降低肌腱的抗张强度，如果不治疗的话，可导致肌腱破裂。在一些情况下，腱退变伴发肌腱的局灶性坏死或钙化。

本文所用术语“腱炎”是指肌腱的炎性损伤，其特征在于像在腱退变观察到的变性，但还伴有肌腱炎症、血管破坏和炎性修复反应。腱炎常常与成纤维细胞和成肌纤维细胞增殖以及出血和组织化肉芽组织有关。一般腱炎通过所涉及的身体部位来命名，例如跟腱炎(影响跟腱)或髌腱炎(亦称为“跳跃膝”，影响髌腱)，但是有某些例外，例如外上髁炎(亦称为“网球肘”，影响桡侧腕短伸肌腱)。

可通过本发明的方法治疗的腱病包括人体或哺乳动物体中任何肌腱的腱病。在一些实施方案中，腱病是腱退变。在一些实施方案中，腱病是腱炎。在一些实施方案中，腱病是腱鞘炎。

可通过本发明的方法治疗的肌腱包括人体或哺乳动物体的任何肌腱。肌腱的非限制性实例包括髌腱、胫骨前肌腱、跟腱、腘绳肌腱、半腱肌腱、股薄肌腱、外展肌腱、内收肌腱、冈上肌腱、冈下肌腱、肩胛下肌腱、小圆肌腱、屈肌腱、股直肌腱、胫骨后肌腱和股四头肌腱。

在一些实施方案中，肌腱是足或踝的肌腱。在一些实施方案中，足或踝的肌腱选自长伸肌、长屈肌、趾长伸肌、趾短伸肌、腓骨长肌、腓骨短肌、短屈肌、趾长屈肌、胫骨后肌、跟腱和跖腱膜。

在一些实施方案中，肌腱是腿部肌腱。在一些实施方案中，腿部肌腱选自髌腱、胫骨前肌腱、跟腱、腘绳肌腱、半腱肌腱、股薄肌腱、外展肌腱和内收肌腱。在一些实施方案中，肌腱选自屈肌腱、股直肌腱、胫骨后肌腱和股四头肌腱。

在一些实施方案中，肌腱是肩部肌腱。在一些实施方案中，肩部肌腱选自冈上肌腱、冈下肌腱、肩胛下肌腱和小圆肌腱(肌腱套复合体)。

在一些实施方案中，肌腱是肘部肌腱。在一些实施方案中，肘部肌腱选自二头肌腱、三头肌腱、桡侧腕短伸肌腱、伸肌总腱、指伸肌腱、小指伸肌腱、尺侧腕伸肌腱、旋后肌腱、屈肌总腱、旋前圆肌腱、桡侧腕屈肌腱、掌长肌腱、尺侧腕屈肌腱和屈指浅肌腱。在一些实施方案中，肌腱是腕部肌腱。在一些实施方案中，腕部肌腱选自二头肌腱、三头肌腱、桡侧腕短伸肌腱、伸肌腱总腱、指伸肌腱、小指伸肌腱、尺侧腕伸肌腱、旋后肌腱、屈肌腱总腱、旋前圆肌腱、桡侧腕屈肌腱、掌长肌腱、尺侧腕屈肌腱、屈指浅肌腱、拇短屈肌腱、拇长屈肌腱、拇短展肌腱、拇长展肌腱、指深屈肌腱、指浅屈肌腱、拇短伸肌腱和拇长伸肌腱。在一些实施方案中，肌腱是手部肌腱。在一些实施方案中，手部肌腱选自拇短屈肌腱、拇长屈肌腱、拇短展肌腱、拇长展肌腱、指深屈肌腱、指浅屈肌腱、拇短伸肌腱和拇长伸肌腱。

在一些实施方案中，腱病是肌腱套腱病。在一些实施方案中，肌腱套腱病选自冈上肌腱病、冈下肌腱病、肩胛下肌腱病和小圆肌腱病。

在一些实施方案中，腱病是在肱骨外髁附着部的伸肌肌群起点、主要在桡侧腕短伸肌(ECRB)肌腱中的外上髁炎即“网球肘”。在一些实施方案中，患有外上髁炎的受试者患有相关疼痛(例如持续至少约6个月)，如经视觉模拟评分法(Visual Analog Score, VAS)报告为=50的疼痛所证明。在一些实施方案中，患有外上髁炎的受试者患有相关疼痛例如持续至少约6个月，该疼痛随外上髁上的压力和/或腕伸展受阻而加重。在一些实施方案中，腱病是位于旋前圆肌和肱骨内髁的桡侧腕屈肌起点之间界面上的内上髁炎即“高尔夫球员肘”。

在一些实施方案中，腱病是髌腱病。在一些实施方案中，腱病是跟腱病。在一些实施方案中，腱病是足底筋膜炎。在一些实施方案中，腱病是足底内侧筋膜炎。在一些实施方案中，腱病是足底外侧筋膜炎。

另一方面，本文提供治疗腱病的方法，所述方法包括将有效量的包含PDGF和缓冲液的组合物给予受累部位。在一些实施方案中，PDGF选自PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD。在一些实施方案中，PDGF是PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约75 μg和约7,500 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约500 μg-约1,000 μg之间的PDGF-BB。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约450 μg至约3,000 μg之间的PDGF。在一些实施方案中，有效量的组合物包含介于每剂量约5,000 μg至约7,500 μg之间的PDGF-BB。

在一些实施方案中，缓冲液选自磷酸缓冲盐溶液(“PBS”)、乙酸钠、乙酸铵、乙酸、柠檬酸、柠檬酸钠、三(羟甲基)氨基乙烷(“tris”)、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(“HEPES”)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(“MOPS”)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(“MES”)、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(“ADA”)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸) (“PIPES”)和N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(“ACES”)。在一些实施方案中，缓冲液是乙酸钠。在一些实施方案中，乙酸钠的浓度介于约10 mM和约100 mM之间。在一些实施方案中，乙酸钠的浓度约为20 mM。在一些实施方案中，乙酸钠的pH介于约4.0和约7.0之间。在一些实施方案中，乙酸钠处于约pH 6。

在一些实施方案中，通过直接注射至受累部位来给药。在一些实施方案中，采用在有或没有超声引导的“密击技术(peppering technique)”完成直接注射。“密击技术”是在把针***触痛区域后，在不使针露出皮肤的情况下，通过抽拉、重新定向针并将针重新***来进行多次少量注射的注射方法。

在一些实施方案中，受累部位是骨-肌腱连接处。在一些实施方案中，受累部位是肌腱。在一些实施方案中，腱病选自跟腱病、髌腱病、外上髁炎、内上髁炎、足底筋膜炎和肌腱套腱病。在一些实施方案中，通过单次注射给予组合物。在一些实施方案中，通过单次注射一周一次给予组合物达4周。

在一些实施方案中，腱病是腱退变。在一些实施方案中，腱退变选自长伸肌腱退变、长屈肌腱退变、趾长伸肌腱退变、趾短伸肌腱退变、腓骨长肌腱退变、腓骨短肌腱退变、短屈肌腱退变、趾长屈肌腱退变、胫骨后肌腱退变、跟腱腱退变和跖腱膜腱退变。在一些实施方案中，腱退变选自髌骨腱退变、胫腓前腱退变、腘绳肌腱退变、半腱肌腱退变、股薄肌腱退变、展肌腱退变和收肌腱退变。在一些实施方案中，腱退变选自屈肌腱退变、股直肌腱退变、胫骨后肌腱退变和股四头肌腱退变。在一些实施方案中，腱退变选自冈上肌腱退变、冈下肌腱退变、肩胛下肌腱退变和小圆肌腱退变。

在一些实施方案中，腱退变选自二头肌腱退变、三头肌腱退变、桡侧腕短伸肌腱退变、伸肌总腱腱退变、指伸肌腱退变、小指伸肌腱退变、尺侧腕伸肌腱退变、旋后肌腱退变、屈肌总腱腱退变、旋前圆肌腱退变、桡侧腕屈肌腱退变、掌长肌腱退变、尺侧腕屈肌腱退变和屈指浅肌腱退变。在一些实施方案中，腱退变选自二头肌腱退变、三头肌腱退变、桡侧腕短伸肌腱退变、伸肌总腱腱退变、指伸肌腱退变、小指伸肌腱退变、尺侧腕伸肌腱退变、旋后肌腱退变、屈肌总腱腱退变、旋前圆肌腱退变、桡侧腕屈肌腱退变、掌长肌腱退变、尺侧腕屈肌腱退变、屈指浅肌腱退变、拇短屈肌腱退变、拇长屈肌腱退变、拇短展肌腱退变、拇长展肌腱退变、指深屈肌腱退变、指浅屈肌腱退变、拇短伸肌腱退变和拇长伸肌腱退变。在一些实施方案中，腱退变选自拇短屈肌腱退变、拇长屈肌腱退变、拇短展肌腱退变、拇长展肌腱退变、指深屈肌腱退变、指浅屈肌腱退变、拇短伸肌腱退变和拇长伸肌腱退变。

在一些实施方案中，腱病是腱炎。在一些实施方案中，腱炎选自长伸肌腱炎、长屈肌腱炎、趾长伸肌腱炎、趾短伸肌腱炎、腓骨长肌腱炎、腓骨短肌腱炎、短屈肌腱炎、趾长屈肌腱炎、胫骨后肌腱炎、跟腱腱炎和跖腱膜腱炎。在一些实施方案中，腱炎选自髌腱炎、胫腓前腱炎、腘绳肌腱腱炎、半腱肌腱炎、股薄肌腱炎、展肌腱炎和收肌腱炎。在一些实施方案中，腱炎选自屈肌腱炎、股直肌腱炎、胫骨后肌腱炎和股四头肌腱炎。在一些实施方案中，腱炎选自冈上肌腱炎、冈下肌腱炎、肩胛下肌腱炎和小圆肌腱炎。

在一些实施方案中，腱炎选自二头肌腱炎、三头肌腱炎、桡侧腕短伸肌腱炎、伸肌总腱腱炎、指伸肌腱炎、小指伸肌腱炎、尺侧腕伸肌腱炎、旋后肌腱炎、屈肌总腱炎、旋前圆肌腱炎、桡侧腕屈肌腱炎、掌长肌腱炎、尺侧腕屈肌腱炎和屈指浅肌腱炎。在一些实施方案中，腱炎选自二头肌腱炎、三头肌腱炎、桡侧腕短伸肌腱炎、伸肌总腱腱炎、指伸肌腱炎、小指伸肌腱炎、尺侧腕伸肌腱炎、旋后肌腱炎、屈肌总腱炎、旋前圆肌腱炎、桡侧腕屈肌腱炎、掌长肌腱炎、尺侧腕屈肌腱炎、屈指浅肌腱炎、拇短屈肌腱炎、拇长屈肌腱炎、拇短展肌腱炎、拇长展肌腱炎、指深屈肌腱炎、指浅屈肌腱炎、拇短伸肌腱炎和拇长伸肌腱炎。在一些实施方案中，腱炎选自拇短屈肌腱炎、拇长屈肌腱炎、拇短展肌腱炎、拇长展肌腱炎、指深屈肌腱炎、指浅屈肌腱炎、拇短伸肌腱炎和拇长伸肌腱炎。

本发明的方法可导致以下一种或多种的改善：减轻受累关节或肢体的疼痛、减少受累关节或肢体的僵硬、增加受累关节或肢体的活动性、提高受累关节或肢体的强度、降低腱病进展的速率、减轻炎症、提高肌腱强度或提高肌腱强度恢复的速率。用于测量治疗的疗效的各种方法包括但不限于：臂肩手失能评分(Arm, Shoulder and Hand Score, DASH)、视觉模拟评分法(VAS)和握力测试。在一些实施方案中，治疗导致DASH的治疗前评分降低至少25%。在一些实施方案中，治疗导致VAS的治疗前评分降低至少25%。在一些实施方案中，治疗导致随施加压力和/或关节屈曲的疼痛减轻。在一些实施方案中，治疗导致随施加压力和/或关节屈曲的疼痛减轻且关节活动性增加。在一些实施方案中，治疗不会导致任何异常的骨生长。在一些实施方案中，治疗不会导致任何异常的肌腱生长。在一些实施方案中，治疗是安全的，且为受试者所耐受。在一些实施方案中，通过由以下的一种或多种方法鉴定的不良事件或异常情况的缺乏来评价组合物的安全性和耐受性：身体检查、生命体征测定、实验室测试、X射线和/或MRI成像。

在一些实施方案中，治疗导致肌腱的强度提高。在一些实施方案中，治疗导致更快速的肌腱强度恢复速率。在一些实施方案中，与基线相比，治疗导致在给予本发明的组合物约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天内，肌腱强度提高至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%。在一些实施方案中，与基线相比，治疗导致在给予本发明的组合物约7天内肌腱强度提高至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%。在一些实施方案中，与基线相比，治疗导致在给予本发明的组合物约7天内肌腱强度提高至少约60%。在一些实施方案中，与基线相比，治疗导致在给予本发明的组合物约7天内肌腱强度提高至少约65%。在一些实施方案中，与基线相比，治疗导致在给予本发明的组合物约7天内肌腱强度提高至少约70%。在一些实施方案中，在给予本发明的组合物约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天内，肌腱达到其最终强度的至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%，其中在治疗后约21天测量最终强度。在一些实施方案中，肌腱在给予本发明的组合物约7天内达到其最终强度的至少约80%，其中在治疗后约21天测量最终强度。在一些实施方案中，肌腱在给予本发明的组合物约7天内达到其最终强度的至少约85%，其中在治疗后约21天测量最终强度。在一些实施方案中，肌腱在给予本发明的组合物约7天内达到其最终强度的至少约90%，其中在治疗后约21天测量最终强度。可在例如动物模型中，例如在大鼠胶原酶模型中测量肌腱强度，其中肌腱强度为测定的破裂载荷。实施例3中更详细地描述了测量肌腱强度的实例。

药盒

另一方面，本文提供包括装有包含PDGF和缓冲液的组合物的药盒。在一些实施方案中，药盒包括装有冻干PDGF的第一容器和装有用于溶解冻干PDGF的缓冲液的第二容器。在一些实施方案中，药盒包括装有冻干PDGF和缓冲液的第一容器，和装有用于溶解冻干PDGF和缓冲液的水的第二容器。在一些实施方案中，缓冲液选自磷酸缓冲盐溶液(“PBS”)、乙酸钠、乙酸铵、乙酸、柠檬酸、柠檬酸钠、三(羟甲基)氨基乙烷(“tris”)、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(“HEPES”)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(“MOPS”)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(“MES”)、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(“ADA”)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸) (“PIPES”)和N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(“ACES”)。在一些实施方案中，缓冲液是乙酸钠。在一些实施方案中，乙酸钠的浓度介于约10 mM和约100 mM之间。在一些实施方案中，乙酸钠的浓度约为20 mM。在一些实施方案中，乙酸钠的pH介于约4.0和约7.0之间。在一些实施方案中，乙酸钠约处于pH 6。

在一些实施方案中，药盒还包括从商业、治疗和用户角度而言是需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、注射器和有使用说明的包装说明书。本文所用术语“包装说明书”是指通常包括在药物商品包装中的用法说明，内有有关适应症、用法、剂量、给药、禁忌、与包装产品组合的其它药物和/或有关使用这种药物的警告事项的信息。

缝线

还提供PDGF涂覆的缝线和制作这种缝线的方法。缝线可用于例如治疗个体的肌腱(例如治疗肌腱撕裂)。合适的缝线包括例如由丙交酯和乙交酯共聚物制成的缝线(例如Vicryl缝线(例如4-0 Vicryl缝线))。合适的涂覆方法包括例如浸渍涂布方法，例如描述于DinesJ, Weber L, Razzano P等. The Effect of Growth Differentiation Factor-5-CoatedSutures on Tendon Repair in a Rat Model (生长分化因子-5涂覆的缝线对大鼠模型的肌腱修复的作用). J Shoulder Elbow Surg 2007;16:215S-221S的浸渍涂布方法，其可任选改变以清除明胶。本申请人出人意料地发现，在缺乏明胶时可将高剂量的PDGF涂覆到某些类型的缝线上。在一些实施方案中，缝线不含明胶。在一些实施方案中，缝线涂层不含明胶。在一些实施方案中，缝线涂层不含聚乳酸、聚乙醇酸或乳酸-乙醇酸共聚物。在一些实施方案中，涂覆缝线的方法不包括利用明胶。在一些实施方案中，缝线涂层基本由PDGF组成。在一些实施方案中，缝线涂层由PDGF和缓冲液组成。在一些实施方案中，缝线涂层由PDGF组成。还可使用缝线治疗个体，例如哺乳动物。可使用本发明的缝线治疗的哺乳动物的非限制性实例包括人、宠物(例如狗、猫、兔、仓鼠等)、实验室动物(例如小鼠、大鼠)、农场动物(例如马、牛、绵羊、山羊等)。

在一些实施方案中，加载到缝线上的PDGF的量为至少约10 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，加载到缝线上的PDGF的量为至少约100 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，加载到缝线上的PDGF的量为至少约1000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，加载到缝线上的PDGF的量为至少约5000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，加载到缝线上的PDGF的量为至少约6000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，加载到缝线上的PDGF的量为约10-约20,000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，加载到缝线上的PDGF的量为约100-约10,000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，加载到缝线上的PDGF的量为约500-约8,000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，加载到缝线上的PDGF的量为约1000-约8,000 ngPDGF/cm缝线。在一些实施方案中，加载到缝线上的PDGF的量为约4000-约8,000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，加载到缝线上的PDGF的量为约6000-约7,000 ng PDGF/cm缝线。

在一些实施方案中，体外测量的48小时内从缝线释放的PDGF的累积量为至少约10ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，体外测量的48小时内从缝线释放的PDGF的累积量为至少约100 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，体外测量的48小时内从缝线释放的PDGF的累积量为至少约1000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，体外测量的48小时内从缝线释放的PDGF的累积量为至少约5000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，体外测量的48小时内从缝线释放的PDGF的累积量为至少约6000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，体外测量的48小时内从缝线释放的PDGF的累积量为约10-约20,000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，体外测量的48小时内从缝线释放的PDGF的累积量为约100-约10,000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，体外测量的48小时内从缝线释放的PDGF的累积量为约500-约8,000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，体外测量的48小时内从缝线释放的PDGF的累积量为约1000-约8,000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，体外测量的48小时内从缝线释放的PDGF的累积量为约4000-约8,000 ng PDGF/cm缝线。在一些实施方案中，体外测量的48小时内从缝线释放的PDGF的累积量为约6000-约7,000 ng PDGF/cm缝线。测量PDGF体外累积释放的合适方法包括例如实施例7中描述的方法。本发明的涂覆缝线可有利地提供体内连续给药。

提供下面的实施例仅用于说明目的，而不以任何方式意图限制本发明的范围。

实施例

实施例1：正常的和患病的原代人肌腱细胞因响应rhPDGF-BB而增殖

本项研究测定了rhPDGF-BB是否直接激活来源于腱病患者的原代肌腱细胞的增殖和/或趋化性。该结论可支持rhPDGF-BB在腱病中的治疗潜力的构想。

患者与方法

患者

10名腱病患者参与了该项研究，包括5名跟腱腱病患者和5名胫后肌腱(PTT)的腱病患者。还包括进行了全膝关节置换的另外5名患者。

肌腱细胞的原代培养

本应弃去的肌腱组织获自在对临床适应症进行的重建手术期间的正常和受损肌腱。这些组织包括跟腱或PTT的腱病部分，以及屈趾长肌(FDL)肌腱组织、跟腱组织和髌腱组织的健康(无腱病)部分。原代肌腱细胞外植体培养完获自这些组织并在传代3-5次时进行了试验。通过在实时PCR测定法中用特异性引物，评价肌腱细胞特异性基因scleraxis和胶原a1(I)、a2(I)和a1(III)基因的表达，来证实肌腱细胞身份。

细胞增殖

将肌腱细胞单层培养物用胰蛋白酶消化，重新悬浮于含有0.5%透析胎牛血清的DMEM/F12培养基中，使之贴壁过夜，然后与已滴定浓度的rhPDGF-BB温育24小时。采用市售可得的测定法(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)，根据在细胞DNA合成期间掺入的BrdU，评价细胞增殖速率的改变。对于每种剂量的rhPDGF-BB，对各培养物进行一式三份的测定。

细胞迁移

肌腱细胞单层培养物用胰蛋白酶消化，重新悬浮于含有0.5%透析胎牛血清的DMEM/F12培养基中，并接种到96孔ChemoTx®一次性细胞迁移***(Neuro Probe，Gaithersburg，MD)的上室。下室装有已滴定浓度的rhPDGF-BB。使肌腱细胞跨分隔各室的膜迁移48小时。然后将96孔板离心，冻融三次以裂解迁移的细胞。采用市售可获自Promega (Madison，WI)的试剂盒，根据胞质的乳酸脱氢酶(LDH)，测量有活力的迁移细胞的量。

统计分析

应用单因素方差分析确定用rhPDGF-BB刺激是否以剂量依赖性方式刺激影响肌腱细胞增殖。

结果

仅肌腱细胞培养物而非对照肺成纤维细胞培养物或对照原代T淋巴细胞培养物表达scleraxis mRNA，而肌腱细胞和成纤维细胞而非淋巴细胞表达胶原基因mRNA。

在所有情况下，参与或不参与疾病进程的肌腱组织的肌腱细胞通过加快BrdU掺入而对rhPDGF-BB刺激起反应(p < 0.05，单因素方差分析)。该反应是剂量依赖性的，并在10、50和150 ng/mL的rhPDGF-BB下观察到。即使所有细胞培养物对rhPDGF-BB刺激起反应，但患者中在rhPDGF-BB刺激后掺入BrdU的量仍有显著差异。与对照无刺激的培养物相比，BrdU的掺入增加至最小2.1 ± 0.2倍到最大10.7 ± 0.5倍。5名患者的肌腱细胞的反应自相矛盾，其中较低rhPDGF-BB浓度(10 ng/mL)而非较高rhPDGF-BB浓度(50和150 ng/mL)在BrdU掺入方面的增加较大。在来源于这些患者的腱病组织和正常组织两者的肌腱细胞中观察到这种自相矛盾的反应。在响应rhPDGF-BB刺激时，来源于4名患者的健康肌腱的肌腱细胞掺入的BrdU是来源于患病组织的肌腱细胞掺入的BrdU的2倍。在响应rhPDGF刺激时，一名患者中，来自患病组织的肌腱细胞掺入的BrdU是未参与疾病过程的组织的肌腱细胞掺入的BrdU的4倍。图2表示对于健康和患病肌腱细胞在第1天、第4天和第8天加入培养基的0、10、50和150 ng/ml PDGF的BrdU掺入(y轴，吸光度)。吸光度的增加与增殖增加一致，其中健康和患病肌腱细胞两者在第1天响应于PDGF。

在所有情况下，肌腱细胞对50 ng/mL和150 ng/mL的rhPDGF-BB都有趋化反应。未将肌腱细胞暴露于10 ng/mL rhPDGF-BB中进行趋化性实验，因为在预实验中反应低下。此外，反应是剂量依赖性的，对150 ng/mL rhPDGF-BB的趋化性大于对50 ng/mL rhPDGF-BB的趋化性。然而，与对150 ng/mL rhPDGF-BB作出的反应相比，5名患者的肌腱细胞以更大的趋化性对50 ng/mL rhPDGF-BB作出反应，150 ng/mL rhPDGF-BB中迁移细胞的数目显著下降(p < 0.05，双侧斯氏t检验)。与无刺激对照相比，患者中对rhPDGF-BB的最大趋化应答有变化，增加至1.4 ± 0.1倍到4.0 ± 0.5倍。在来源于腱病或健康肌腱组织的匹配肌腱细胞培养物中，肌腱细胞对rhPDGF-BB的趋化性没有统计显著性差异(p > 0.05)。图1表示培养在浓度为0、50或150 ng/ml的PDGF中的细胞的趋化性(y轴表示光密度增加)。用1250、2500、5000和10000个初始细胞评价迁移。

结论

这些实验的结果表明，来源于健康和腱病组织的肌腱细胞通过提高增殖速率和趋化率(chemotaxis rate)而对rhPDGF-BB起反应。重要的是，一些患者的肌腱细胞显示对PDGF的自相矛盾的反应，其中比起较低的剂量，较高剂量引起较少作用。同样重要的是，在某些情况下，相对于来自健康肌腱的肌腱细胞，来自患病肌腱的肌腱细胞对PDGF的反应有差别，这就表明在临床背景中适当给药可能是最重要的。

实施例2：rhPDGF-BB的安全性研究

局部注射试验。

本项研究的目的是确定在跟腱内递送给大鼠后rhPDGF-BB的局部毒性。跟腱内给药模拟临床中用于治疗外上髁炎的rhPDGF-BB的给药途径。在跟腱-跟骨连接处的注射部位模拟桡侧腕短伸肌腱和外上髁骨的附着部位。

本项研究使用Sprague Dawley大鼠。在研究期间将动物关养在相同的实验室设施中。所有的关养和饲养管理都符合动物福利法(Animal Welfare Act)和“实验室动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)”。按照标准方案给大鼠供食和供水。因适当的研究相关事件(例如麻醉)而撤除食物和水。在研究前使动物适应设施最少5天。该适应期允许动物适应研究室环境。

三批不同浓度的无菌重组人PDGF-BB用于研究：(1) 10.3 mg/ml rhPDGF-BB，在20mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0±0.5)中；(2) 5.2 mg/ml rhPDGF-BB，在20 mM乙酸钠缓冲液(pH6.0±0.5)中；和(3) 1.7 mg/ml rhPDGF-BB，在20 mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0±0.5)中。溶媒对照样品为无菌20 mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0±0.5)，其按照标准方法制备。

采用用于处理试验品和对照品的标准实验室安全规程。准确地讲，在制备和给予剂量时戴上手套、面罩、实验服(即实验工作服)和护目用具。

将动物随机分成4组，每组n=60，每组有30只雄性和30只雌性。每组每只在四头肌的骨腱连接处接受单次肌腱内注射下列化合物：(1) 20 mM乙酸钠；(2) 20 mM乙酸钠中的51 μg rhPDGF-BB；(3) 20 mM乙酸钠中的156 μg rhPDGF-BB；或(4) 20 mM乙酸钠中的515μg rhPDGF-BB。用配置了28.5G针的胰岛素注射器进行注射。所有动物在第1天通过单次跟腱内注射接受试验品。第1组动物接受乙酸钠(NaOAc)，而第2-4组动物接受剂量水平分别为36.69、112.23和370.50 μg/mm²的rhPDGF-BB。

在rhPDGF-BB注射后1天、2周和6周处死每组的三分之一。在完成生命期治疗组后，按照美国农业部动物福利法及实验室动物护理和使用指南(USDA Animal Welfare Act,The Guide for Care and Use of Laboratory Animals) (ILAR出版，1996，NationalAcademy Press)和HSS兽医规程(HSS veterinary procedures)，使动物安乐死后，收获组织。通过过量给予CO₂使动物安乐死。通过缺乏反射(眨眼、回缩等)来证实死亡。

评价标准包括临床观察、身体评价、体重和食物消耗测量、临床病理、尸体剖检、器官重量及注射和未注射后腿踝的组织病理学评价，包括检查肌腱毒性和骨毒性。

对动物进行血液学评价、凝血研究和各种临床化学研究。血液学评价包括下列测量：白细胞计数(WBC)；红细胞计数(RBC)；测定血红蛋白(Hb)、平均红细胞血红蛋白(MCH)水平、血细胞比容(HCT)和平均红细胞Hb浓度(MCHC)；血小板计数；测定红细胞平均体积(MCV)和评价白细胞差异，包括嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、%嗜中性粒细胞、%淋巴细胞、%单核细胞和%嗜酸性粒细胞)。凝血研究测量活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)。临床化学研究包括下列分析：碱性磷酸酶(ALP)、葡萄糖(GLU)、白蛋白(ALB)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、球蛋白(Glob)、天冬氨酸转氨酸(AST)、胆固醇(CHOL)、钾(K)、γ谷氨酰转移酶(GGT)、甘油三酯(TRIG)、氯离子(Cl)、肌酸酐(CREAT)、血液尿素氮(BUN)、钠(Na)、无机磷(PHOS)、钙(Ca)、A/G比和总蛋白质(TPROT)。

结果

以36.69 μg/mm²、112.23 μg/mm²、370.50 μg/mm²的剂量水平给大鼠单次跟腱内注射rhPDGF-BB对死亡率或濒死率无影响。此外，在临床观察、对体重或食物消耗的作用方面没有与试验品相关的生物学显著差异。

第2天，与对照(第1组)相比时，在对治疗大鼠任何组进行分析的血液学或尿液分析参数的任一个没有统计学或生物学上的显著差异。在白细胞和凝血参数方面观察到变化，但这些变化与注射外源蛋白质的最低急性炎症反应一致。此外，在几个血清化学参数中还观察到最小变化。然而，这些变化被视为个体动物变异的结果，不被视为是生物学上显著的，并且不与任何器官特异性毒性有关。

在第16和43天，与对照(第1组)相比时，对治疗大鼠任何组进行分析的血液学、白细胞、凝血或尿液分析参数的任一个，都无生物学上显著的差异。

没有试验品相关的宏观观察；所有宏观观察均被视为是偶然发生的。

在第2天，在大鼠的对照和治疗组中观察到急性出血和亚急性炎症，虽然似乎频率和严重程度在大鼠治疗组中较大。在第16天，急性出血消退，且亚急性炎症很少发生。大鼠治疗组显示，除浅屈肌腱和跟腱的肌腱细胞肥大和增生以外，上述肌腱的腱旁组织(paratendon)有纤维组织形成和新血管形成。到第43天，纤维组织形成和新血管形成的严重性得到改善；在大多数治疗大鼠中，肌腱细胞仍显示肥大和增生。

第二物种局部注射试验。

本项研究的目的在于确定在跟腱内递送给狗后，重组人血小板衍生生长因子(rhPDGF-BB)的局部毒性。

本研究使用比格犬(Beagle dog)。在研究期间将动物关养在相同的实验室设施中。所有的关养和饲养管理都符合动物福利法和“实验室动护管理和使用指南”。按照标准方案给狗供食和供水。因适当的研究相关事件(例如麻醉)而撤除食物和水。在研究前使动物适应设施最少5天。该适应期允许动物适应研究室环境。

三批不同浓度的无菌重组人PDGF-BB用于研究：(1) 10 mg/ml rhPDGF-BB，在20mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0±0.5)中；(2) 3 mg/ml rhPDGF-BB，在20 mM乙酸钠缓冲液(pH6.0±0.5)中；和(3) 1 mg/ml rhPDGF-BB，在20 mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0±0.5)中。溶媒对照样品是无菌20 mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0±0.5)，其按照标准方法制备。

采用用于处理试验品和对照品的标准实验室安全规程。准确地讲，在制备和给予剂量时戴上手套、面罩、实验服(即实验工作服)和护目用具。

将动物随机分成4组，每组n=24，每组有12只雄性和12只雌性。每组各个在四头肌的骨腱连接处接受单次肌腱内注射下列组合物：(1) 20 mM乙酸钠；(2) 20 mM乙酸钠中的1.5 mg rhPDGF-BB；(3) 20 mM乙酸钠中的4.5 mg rhPDGF-BB；或(4) 20 mM乙酸钠中的15mg rhPDGF-BB。用配置28.5G针的具有1.5 ml固定剂量体积的胰岛素注射器进行注射。

在rhPDGF-BB注射后1天、2周和6周处死每组的三分之一。在完成生命期治疗组后，按照美国农业部动物福利法及实验室动物护理和使用指南(ILAR出版，1996，NationalAcademy Press)和HSS兽医规程，使动物安乐死后，收获组织。在用戊巴比妥钠(Fatal-Plus^®或合适的替代品)诱导的深度麻醉下通过放血使动物安乐死。

对动物进行血液学评价、凝血研究和各种临床化学研究。

血液学评价包括下列测量：白细胞计数(WBC)；红细胞计数(RBC)；测定血红蛋白(Hb)、平均红细胞血红蛋白(MCH)水平、血细胞比容(HCT)和平均红细胞Hb浓度(MCHC)；血小板计数；测定红细胞平均体积(MCV)和评价白细胞差异，包括嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、%嗜中性粒细胞、%淋巴细胞、%单核细胞和%嗜酸性粒细胞)。凝血研究测量活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)。临床化学研究包括下列分析：碱性磷酸酶(ALP)、葡萄糖(GLU)、白蛋白(ALB)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、球蛋白(Glob)、天冬氨酸转氨酸(AST)、胆固醇(CHOL)、钾(K)、γ谷氨酰转移酶(GGT)、甘油三酯(TRIG)、氯离子(Cl)、肌酸酐(CREAT)、血液尿素氮(BUN)、钠(Na)、无机磷(PHOS)、钙(Ca)、A/G比和总蛋白质(TPROT)。

还评价了局部组织的组织病理学，包括检查肌腱毒性和骨毒性。

rhPDGF-BB对狗无毒性。

急性全身性毒性。本项研究的目的是确定通过静脉内注射给予的rhPDGF-BB的全身毒性。

本研究使用Sprague-Dawley大鼠。在研究期间将动物关养在相同的实验室设施中。所有的关养和饲养管理都符合动物福利法和“实验室动物护理和使用指南”。按照标准方案给动物供食和供水。因适当的研究相关事件(例如麻醉)而撤除食物和水。在研究前使动物适应设施最少5天。该适应期允许动物适应研究室环境。

在本研究中使用在20 mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0±0.5)中的3.0 mg/ml和0.3 mg/ml的无菌重组人PDGF-BB。给药当天，将部分0.3 mg/mL溶液1:10稀释于20 mM乙酸钠缓冲液中以产生同样用于研究的0.03 mg/ml溶液。对照样品是无菌20 mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0±0.5)，其按照标准方法制备。

采用用于处理试验品和对照品的标准实验室安全规程。准确地讲，在制备和给予剂量时戴上手套、面罩、实验服(即实验工作服)和护目用具。

将动物随机分成4组，每组n=40 (20只雄性和20只雌性/组)。剂量组1接受体积为1.4 ml/kg的20 mM乙酸钠(pH 6.0±0.5)的单次静脉内注射；剂量组2接受体积为1.4 ml/kg的20 mM乙酸钠(pH 6.0±0.5)中的3.0 mg/ml rhPDGF-BB的单次静脉内注射；剂量组3接受体积为1.4 ml/kg的20 mM乙酸钠(pH 6.0±0.5)中的0.3 mg/ml rhPDGF-BB的单次静脉内注射；剂量组4接受体积为1.4 ml/kg的20 mM乙酸钠(pH 6.0±0.5)中的0.03 mg/mlrhPDGF-BB的单次静脉内注射。

评价动物的死亡和严重毒性的其它体征。在研究期间，观察动物的成活率、临床检查、体重、食物消耗、眼科检查和临床病理。在第2天和第14天的尸体剖检(10只雄性和10只雌性/组/时间点)时，对动物进行临床病理评价，包括血液学、凝血、血清化学和尿液分析以及完整的尸体剖检。

实施例3：胶原酶诱导的大鼠跟腱损伤模型中肌腱内(IT)施用rhPDGF-BB的剂量反应

本项研究的目的是测定大鼠肌腱胶原酶模型中肌腱内施用rhPDGF-BB的剂量反应，以证实rhPDGF-BB对跟腱损伤和重建的修复作用。我们假设肌腱内递送rhPDGF-BB可通过增量调节细胞增殖和恢复肌腱的生物力学强度引起肌腱修复。

对于间充质源的细胞例如成骨细胞、肌腱细胞、软骨细胞和间充质干细胞，重组人血小板衍生生长因子BB (rhPDGF-BB)是促有丝***的和趋化性的。因此，当引入损伤的肌骨骼部位时，rhPDGF-BB将***细胞和祖细胞吸引至治疗部位，刺激其增殖，导致细胞数目增加，所述细胞随后沉积基质以使受损组织再生。此外，如上述实施例1所述，暴露于PDGF-BB的肌腱细胞显示DNA合成和趋化增加。

胶原酶诱导的大鼠跟腱损伤模型

没有单独的充分确立的模型用于评价腱病。然而，胶原酶诱导的大鼠跟腱损伤模型被广泛用于跟腱损伤。该模型引起被视为等同于腱炎的变性肌腱反应，并且与上坡踏车(uphill treadmill)过度使用模型(4个月)相比，快速形成腱炎损伤(3天内)。因此，它是筛选rhPDGF-BB对肌腱损伤的作用的快速模型。因此，该模型享有相对快的诱导期，而且作为rhPDGF-BB的治疗作用的筛选，该模型是非常合适的，是临床腱炎的代表。

总共一百六十五(165)只雄性Sprague Dawley大鼠用于该研究。给大鼠在其右跟腱注射胶原酶，接着在胶原酶注射后7天，在损伤部位进行rhPDGF-BB或对照(仅缓冲液)的单次注射治疗。使用带有28.5G针的胰岛素注射器，将胶原酶和rhPDGF-BB或对照(仅缓冲液)注射到大鼠右跟腱的骨-肌腱连接处附近。

将动物分成11组，每组n=15，如表1所示。在利用该模型的文献中所报道的研究，历史上使用每治疗组8-9只动物用于生物力学测试，3-6只动物用于组织学分析。

试验品和对照品

本研究对照组利用在无rhPDGF-BB的胶原酶处理的大鼠跟腱中大鼠肌腱的自然修复反应作为对照以接近受损肌腱的自然愈合反应。研究试验品使用rhPDGF-BB作为注射药物以辅助肌腱的再生。对于间充质源细胞，例如成骨细胞、肌腱细胞、软骨细胞和间充质干细胞，重组人血小板衍生生长因子BB (rhPDGF-BB)是促有丝***的和趋化性的。因此，当引入损伤的肌骨骼部位时，rhPDGF-BB将***细胞和祖细胞吸引至治疗部位，刺激其增殖，导致细胞数目增加，所述细胞随后沉积基质以使受损组织再生。此外，如上述实施例1所示，暴露于PDGF-BB的肌腱细胞显示DNA合成和趋化性增加。

两批不同浓度的无菌重组人PDGF-BB用于研究：(1) 3.4 mg/ml rhPDGF-BB，在20mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0±0.5)中；和(2) 0.34 mg/ml rhPDGF-BB，在20 mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0±0.5)中。溶媒对照样品是无菌20 mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0±0.5)，其按照标准方法制备。剂量包括：1.02 μg、10.2 μg和102 μg rhPDGF-BB。制备两种浓度的NaOAc缓冲液中的rhPDGF-BB：3.4 mg/ml和0.34 mg/ml。当以30 μl肌腱内递送时，达到102 μg和10.2 μg剂量水平。对于1.02 μg剂量，0.34 mg/mL溶液用20 mM NaOAc缓冲液1:10稀释。胶原酶以粉末形式购自Sigma-Aldrich (目录号C-6885；St. Louis, MO)，在含有50 mM NaH₂PO₄和150 mMNaCl的PBS (pH 7.4±0.5)中复溶至所需浓度(10 mg/mL)。

在开始研究时，将3.4 mg/ml rhPDGF-BB、0.34 mg/ml rhPDGF-BB和20 mM乙酸钠缓冲液试验品的至少两个未开启、未使用的小瓶保持在相同的贮存条件(4℃)下作为用于给药、稳定性和浓度分析的小瓶。采用UV/Vis分光光度测定法和反相HPLC分析进行稳定性和剂量验证分析。

采用用于处理试验品和溶媒对照品的标准实验室安全规程。准确地讲，在制备和给予剂量时戴上手套、面罩、实验服(即实验工作服)和护目用具。

试验***(动物和动物护理)

一百六十五(165)只雄性Sprague Dawley大鼠(Charles River Laboratories，Int'l，Wilmington，MA)用于该研究。在研究选择之前，通过肉眼检查筛选所有动物以确保健康和正常步态。根据其体重(在胶原酶注射时约315克)，选择用于研究的所有动物。以写在大鼠尾部的独特编号识别每只大鼠。根据大鼠体重将其随机分配到每组。

在研究期间，将大鼠关养在同一实验室设施中。所有的关养和饲养管理符合动物福利法和“实验室动物护理和使用指南”。因适当的研究相关事件(例如麻醉)而撤除食物和水，除此之外任意提供。在研究前使动物适应设施最少5天。该适应期允许动物适应研究室环境。

实验设计

动物(15只/组)，每笼关养4只，用异氟烷麻醉，夹住后踝区域，清洁用于注射。使用带有28.5G针的胰岛素注射器，将胶原酶(50 μl，10 mg/ml溶于含有50 mM NaH₂PO₄和150 mMNaCl的PBS (pH 7.4)中)注射到所有大鼠右跟腱的骨-肌腱连接处附近(图3)。胶原酶注射后7天，使用带有28.5G针的胰岛素注射器，以30 μl总体积给予溶媒或1.02 μg、10.2 μg或102 μg的rhPDGF-BB治疗。在7天(基线)、14天和28天将动物处死用于肌腱损伤的组织病理学评价和生物力学评价。在每组15只动物中，6只动物用于组织病理学，取9只动物的后腿(经治疗和未治疗的后肢两者)，切开，冷冻用于后续生物力学评价。下面提供生物力学评价的描述。

表1. 治疗组

生命期观察和测量

至少每日观察动物直到处死。动物治疗符合美国农业部动物福利法(9 CFR，第1、2和3部分)概述的规程及实验室动物护理和使用指南(ILAR出版，1996，National AcademyPress)和HSS兽医规程规定的条件。

在胶原酶注射前和处死后记录体重。食物消耗是定性的。

在合适的研究终点将全部动物处死。未观察到不按时间表的动物死亡。在生命期治疗组完成后，按照美国农业部动物福利法及实验室动物护理和使用指南(ILAR出版，1996，National Academy Press)以及HSS兽医规程，使动物安乐死，并收获组织。通过过量给予CO₂使动物安乐死。通过缺乏反射(眨眼、回缩等)证实死亡。

总体肌腱大小

临尸体剖检前，按照以下体系对踝的厚度进行评分：0 = 无生长；1 = 轻微生长；2 =中等生长；3 = 强烈生长。

组织学

在尸体剖检时，在整个足浸于10%中性缓冲***(NBF)的情况下，小心地将皮肤从后踝区域上剥离，并弯曲固定。在10% NBF中最少12小时，并在10%甲酸中最少4-5天已脱钙后，在中间和侧面两边修整踝(其特别重点在肌腱-骨连接处)，以得到约¼英寸厚的组织块(具有肌腱附着的踝的中央部分)，并置于标记的组织盒中。将经修整的踝组织块以矢状方向加工用于石蜡包埋。使用旋转切片机，以200微米逐层切片切取代表性的4-6微米厚的切片，直到得到适宜观察的骨-肌腱连接处，然后将这类切片用苏木精和伊红(H&E)、Masson三色染液染色，并用于增殖细胞核抗原(PCNA)的免疫组织化学(IHC)检测。

在异氟烷麻醉期间，通过降主动脉vacutainer给所有动物采血用于最终的血清(采集10 ml血液)。在室温下将血液以l,800g离心10分钟以得到血清。在2 ml Eppendorf®管中提供多达1 ml血清。分析前将血清保存在-70℃下。

如下所述进行组织病理学评价。采用光学显微镜术，通过评价各组织学样本(载玻片)的3个等距视野列(field column)，来进行不同参数的测量。

所测量的组织病理学参数包括：

(1) 炎症。通过H&E染色测定炎性细胞类型(嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞)。如下为炎症评分：(a) 0 = 无炎症；(b) 1 = 极少炎症(100%单核细胞；无嗜中性粒细胞)；(c)2 = 中度炎症(嗜中性粒细胞=19%；其余细胞为单核细胞)；和(d) 3 = 明显炎症(嗜中性粒细胞=20%；其余细胞为单核细胞)。

(2) 胶原组构。通过H&E和三色染色，对胶原原纤维的组构进行评价。如下为胶原组构评分：(a) 0 =胶原原纤维完全无序；(b) 1 =一些胶原原纤维排列成行，但胶原束大部分高度无序；(c) 2 =胶原原纤维高度排列成行，然而胶原束仍有些无序；和(d) 3 =存在于组织中的胶原原纤维完全排列成行，没有胶原束结构被破坏。

(3) 胶原纤维密度。通过H&E和三色染色，对修复组织中的胶原纤维密度进行评价。如下为胶原纤维密度评分：(a) 0 = 低密度胶原束；(b) 1 =中等密度胶原束；和(c) 2= 极致密胶原束。

(4) 修复部位的肌腱血管形成。通过H&E和三色染色，测定修复组织中的血管形成。如下为血管形成评分：(a) 0 = 无(无血管形成存在)；(b) 1 = 中度；和(c) 2 = 大量。

(5) 细胞增殖。采用PCNA (增殖细胞核抗原)的免疫组织化学(IHC)，对细胞增殖进行评价。采用目镜测微计，在测微计上勾画出39.4x 197 μm (7762 μm2)或10 x 50单位的面积。对各样本具有这种尺寸的3个视野进行计数。对这3个等距视野中的增殖细胞进行计数。

(6) 肌腱宽度测量。在显微镜下并使用目镜测微计，测定2个不同位置的肌腱尺寸。测定跟骨附着点(被认为最能代表附着部位的厚度的不相切面(non-tangentialarea))和肌腱自身(远离具有相关增殖反应的附着部位的肌腱体的最厚不相切面)的尺寸。

应用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验(非参数的)，分析半定量组织病理学数据。采用单因素方差分析(1-way ANOVA)以及适当的多重比较事后检验，分析所有组间的可适用数据。

生物力学测试

99只动物用于本项研究的这个部分。除对侧无胶原酶处理肌腱以外，还对损伤诱导的肌腱进行评价。评价了总共123个生物力学样本。上表1中概述了治疗分配额。

在股骨处剥离腿，并剥离外皮(de-sleeved)至足中段。使用解剖刀，将跟腱-腓肠肌复合体从胫骨上剥离。简单地说，自跟骨附着部开始，将解剖刀沿胫骨移动以分离复合体，留下大部分肌肉与肌腱连接以允许握住用于生物力学测试。在分离肌腱后，在与跖的连接处取出胫骨，保留附着的足用于远端握住以进行生物力学测试(图4)。将整个跖-跟腱-腓肠肌样本包裹在浸泡盐水的纱布中，在进行生物力学分析前在-20℃下冷冻保存。

在机械测试前，使样品在含有蛋白酶抑制剂的PBS中于4℃融化长达4小时。将肌腱样品拍干(patted dry)，除去过多的肌肉以利于将样品固定在夹具上。用剪刀修整骨以利于固定。

所有机械测试在Instron测试架(模型5566)上进行，在测试架上在样品浸入装有PBS的浴液槽中的同时对样品进行测试。精确位移控制(displacement control)用于各样本，使用具±0.5%载荷准确度的100N测压元件测量所得载荷。所有数据采集和装置控制用个人电脑进行，其中可在10 Hz下获取数据。

将样本安装在两个粗糙表面板和砂纸之间的液压夹具上，以防止在拉力测试期间样品滑动。将0.1N的预载荷施于样本上，记录样本的长度，接着在载荷0.1N和1N之间预循环10个循环。以0.1%/秒的应变速率将单轴拉力位移施于构件上，记录所得载荷。测试样品到拉伸损坏，直到达到骨折，观察所测量的载荷< 0.05N。测试前，测量了样本的横切面积。所有样本经盲测，无可辨认的组别分类的指示。

测试后，分析所采集的数据以分别确定：(1)线性劲度，和(2)载荷-位移或应力-应变曲线的线性部分的弹性模量。还从载荷数据确定最大载荷和极限抗张强度。可应用Reimann求和法，用数字计算弹性韧度(elastic toughness)，其定义为直到峰值负荷的力位移曲线下面积。

采用相互作用双因素方差分析和Fisher LSD事后检验(p<0.05)分析生物力学数据。应用单因素方差分析(1-way ANOVA)，以及合适的多重比较事后检验，分析所有组间的可适用数据。

应力是归一化至样品的横切面积的样本上的载荷。应变代表归一化至样品的起始长度的样本长度的变化。因此，应力与应变曲线是载荷与位移曲线的归一化形式(消除样本尺寸方面的变异效应)。例如，较长的肌腱将具有较大的总位移。另一方面，较宽的肌腱可比较窄的肌腱承受更大的载荷。样本与样本间尺寸的这些微小变异显著影响它们可承载的载荷和位移的大小。当这些变量通过它们尺寸归一化为应力和应变时，分析不再依赖于样本的尺寸。直接从载荷与位移曲线得出的所有性质称为结构性质。从归一化应力与应变曲线得到的所有性质称为材料性质。

线性劲度是从载荷与位移曲线的线性部分的最小二乘拟合求出的结构性质。它代表了样本的抗拉刚度。

弹性模量是从应力与应变曲线的线性部分的最小二乘拟合求出的材料性质。它代表了肌腱材料的抗拉刚度。

最大载荷是在牵引期间样本可以承受的最大载荷。

极限抗拉应力是通过样本的横切面积归一化的最大载荷。

韧性是材料对折断或断裂的抗性。其通常以能量单位来衡量，计算为直到失效的载荷-位移曲线下面积。

结果

rhPDGF-BB对总体踝厚度的作用

单次肌腱内注射rhPDGF-BB后7天观察到总体踝厚度的剂量依赖性增加(图6A和图7，在Tx后第7天)，在注射后7天，中等(10.2 μg)和高(102 μg)剂量引起肌腱大小显著增加。在Tx后第21天，溶媒对照组(乙酸钠缓冲液)以外的所有组显示总体踝厚度减少，这就表明在治疗后21天组织进行重建(图6B和图7，在Tx后第21天)。图6A、图6B和图7中的数据以rhPDGF-BB治疗后7天和21天的模拟量表(analog scale)为基础(0 =无生长至3 =强烈生长)。所报告的数据是每组n=6只动物的踝厚度的平均值(± SEM)。

rhPDGF-BB对体重的作用

在治疗时，动物的平均体重为314.48克。在治疗后7天和21天，平均体重分别为396.4和467.0克。在任一时间点上，体重方面无治疗相关性变化。

rhPDGF-BB对骨的作用

既未鉴定出异常的骨生长，也未鉴定出再吸收。

rhPDGF-BB对跟骨附着处的肌腱宽度的作用

图8显示在治疗后第7和21天在跟骨附着部测量的肌腱宽度(μm ± SEM)。所报告的数据为每组n=6只动物跟骨附着部肌腱宽度的平均值(± SEM)；*相对于溶媒对照组的p=0.01。使用目镜测微计通过显微镜术测量肌腱宽度。

观察到与溶媒相比，治疗后7天(在Tx后第7天)，用32.4 μg/kg rhPDGF-BB剂量组的跟骨附着部肌腱宽度显著增加(约137%增加) (图8，在Tx后第7天)。用3.24和324 μg/kgrhPDGF-BB治疗的动物未显示肌腱宽度显著增加，但与溶媒对照相比时趋于较高。在治疗后21天测出用或不用rhPDGF-BB治疗的动物的肌腱宽度之间无显著差异(图8，在Tx后第21天)。与治疗后第7天相比，到治疗后第21天(图8，在Tx后第21天)，32.4 μg/kg rhPDGF-BB剂量组显示肌腱宽度减少40%，这就表明肌腱重建(图8)。

rhPDGF-BB对肌腱中部处肌腱宽度的作用

图9表示在治疗后第7和21天所测量的肌腱中部(tendon mid-body)的肌腱宽度(μm ±SEM)。所报告的数据是每组n=6只动物肌腱体处肌腱宽度的平均值(± SEM)；*相对于溶媒组的p<0.05。使用目镜测微计通过显微镜术测量肌腱宽度。

在治疗后第7天，观察到相对于溶媒对照组，用32.4 μg/kg rhPDGF-BB剂量的肌腱宽度增加约97% (图9，在Tx后第7天)。相对于溶媒和非治疗(Tx)组，在3.24和324 μg/kg剂量组中观察到非显著的剂量依赖性增加。到第21天，未观察到组间肌腱宽度的显著差异(图9，在Tx后第21天)。然而，与治疗后第7天相比，在第21天，32.4 μg/kg rhPDGF-BB剂量组显示肌腱宽度减少116%，这就表明肌腱重建。

rhPDGF-BB对细胞增殖的作用

通过阳性PCNA免疫染色的细胞的细胞计数进行细胞增殖的定量(图10)。所报告的数据是每组n=6只动物的细胞计数的平均值(± SEM)；*相对于溶媒的p< 0.05。对每个样本具有相同尺寸的3个视野进行统计。

在rhPDGF-BB组中观察到细胞密度剂量依赖性地增加。在治疗后第7天，观察到细胞增殖rhPDGF-BB剂量依赖性地增加(图10，在Tx后第7天)；相对于溶媒对照，在32.4和324μg/kg剂量组中观察到细胞增殖显著增加(图10，在Tx后第7天)，表明分别增加约60%和约72%。然而，到第21天，未观察到细胞增殖的显著差异(图10，在Tx后第21天)。对于32.4和324μg/kg rhPDGF-BB剂量组，观察到回复到溶媒对照增殖水平，表明rhPDGF-BB的增殖反应是可逆的(图10，在Tx后第21天)。

rhPDGF-BB对炎症的作用

在所有时间点上，所有组间都观察到由巨噬细胞和单核细胞组成的轻微至中度炎症(表2)。

表2：在治疗后7和21天采用模拟量表(0 =无炎症至3 =重度炎症)的rhPDGF-BB对 炎症的作用。

rhPDGF-BB对血管形成的作用

在所有组间和时间点间未观察到血管形成的显著变化(表3)。

表3：在治疗后7和21天采用模拟量表(0 =无至2 =重度)的rhPDGF-BB对血管形成 的作用。

rhPDGF-BB对胶原密度的作用

在所有组间和时间点间未观察到胶原密度的显著变化(表4)。

表4：在治疗后7和21天采用模拟量表(0 =无至2 =重度)的rhPDGF-BB对胶原密度 的作用。

rhPDGF-BB对胶原组构的作用

所有组间和时间点间未观察到胶原组构的显著变化(表5)。

表5：在治疗后7和21天采用模拟量表(0 =无至3 =高度有序)的rhPDGF-BB对胶原 组构的作用。

生物力学：rhPDGF-BB对最大破裂载荷的作用

在该模型中，未治疗组根据最大破裂载荷值随时间而自发修复(图11)。在治疗后第7天，在32.4 μg/kg剂量组相对于溶媒对照和未治疗组，破裂的平均最大载荷值显著增加(分别增加约43%和27%) (图11，在Tx后第7天)。到治疗后第21天，与溶媒对照相比，最大破裂载荷仍显著提高(图11，在Tx后第21天)。在治疗后的第21天，32.4 μg/kg剂量组和未治疗组的平均最大载荷相似，表明rhPDGF-BB治疗相对于未治疗提高修复速率。然而，在给药后第21天，与32.4 μg/kg剂量组和未治疗组相比，溶媒和324 μg/kg rhPDGF-BB组具有显著较低的最大破裂载荷值。所报告的数据是每组n=9只动物的最大破裂载荷的平均值(± SEM)；+相对于“溶媒”组的p<0.05，**相对于“未治疗”组的p<0.05。

表6表示未受损对侧肌腱和rhPDGF-BB治疗和未治疗的肌腱的机械强度。

表6：在胶原酶注射后7、14和28天跟腱的最大破裂载荷值(N ± SEM)。

所报告的数据是每组n=9只动物的最大破裂载荷的平均值(± SEM)。

在胶原酶注射后第14天32.4 μg/kg rhPDGF-BB组的平均最大破裂载荷值(26.8N)相对于胶原酶注射后第14天的未受损肌腱(19.03 N)增加41%。这就表明在32.4 μg/kgrhPDGF-BB组中，生物力学性质比正常发育中的肌腱成熟得快。此外，32.4 μg/kg rhPDGF-BB组在胶原酶注射后第14天的平均最大破裂载荷(26.8 N)接近胶原酶注射后第28天的未受损肌腱(27.98 N)。未受损和未治疗(已注射胶原酶)组在第7、14和28天的最大破裂载荷值相似。在第14天(在Tx后第7天)，32.4 μg/kg rhPDGF-BB组的最大破裂载荷值比溶媒、未受损和未治疗组的高，分别增加43%、41%和27%。然而，在第28天(在Tx后第21天)，在未受损、未治疗和32.4 μg/kg rhPDGF-BB组中的最大破裂载荷相似(表6)。

结论

生命期参数

踝厚度结果表明，rhPDGF-BB治疗后7天肌腱大小方面有剂量依赖性增加，但到21天，生长受阻，且组织重建成减小的尺寸。

跨组间和时间点间体重无显著差异。

微观评价

rhPDGF-BB在性质上增加细胞增殖，尤其是成纤维细胞的增殖。细胞增殖和显微镜下的肌腱宽度的增加是可逆的，表明可能的适应期以重建组织。

在本研究条件下，在一次肌腱内递送后的3周时间内未观察到来自rhPDGF-BB的局部不良作用。没有异常的骨或肌腱生长，且未鉴定出骨再吸收。炎症是单核细胞性质的。细胞的形态学是成纤维细胞性质的。

生物力学

生物力学破裂载荷数据表明，与无rhPDGF-BB治疗的组群相比，在肌腱的机械强度方面，rhPDGF-BB开始较快的修复反应。虽然到治疗后第21天，细胞增殖和肌腱宽度回复到基线，但是这并不导致肌腱强度的生物力学损失。

总结

该项研究中的生物学和生物力学结果证实了注射至肌腱的rhPDGF-BB的局部安全性。在一次rhPDGF-BB注射后，存在肌腱生长的初始阶段，肌腱生长在21天时间内减弱。该研究在显微镜下使用目镜测微计测量了肌腱宽度，并使用PCNA免疫染色测量细胞增殖。得自这些测量的结果表明，在治疗后7天，用32.4 μg/kg rhPDGF-BB治疗的动物在显微镜下的肌腱宽度和细胞增殖增加。然而，到治疗后第21天，肌腱宽度和增殖回复至对照水平。在rhPDGF-BB注射至肌腱中后，在21天时间内既未观察到异位骨或骨异常，也未观察到肌腱生长异常。

显微镜下肌腱宽度和细胞增殖的早期增加对应的是肌腱的机械强度的增强。虽然到治疗后第21天细胞增殖和肌腱宽度回复到基线，但是这并不导致肌腱强度的生物力学损失，而是使肌腱生物力学改进持续。

该项研究的结果在临床上对于治疗外上髁炎患者可能尤其引人注目。在外上髁炎中，存在桡侧腕短伸肌(ECRB)肌腱的退行性病变，表现为疼痛和受累臂和手耐受载荷的功能性减退。预期作为在该研究中描述的大鼠跟腱病模型所显示的rhPDGF-BB治疗的结果，肌腱的增加的生物力学强度和结构改变将在临床上转化成给患有外上髁炎的患者止痛并恢复该患者的功能。

实施例4. 静脉内给予rhPDGF-BB后在Sprague-Dawley大鼠中重组人血小板衍生生长因子-BB (rhPDGF-BB)的药代动力学

本项研究的目的是评价作为单次静脉内剂量给予雄性Sprague-Dawley大鼠的rhPDGF-BB的药代动力学。设计该研究以评价在静脉内给药后新鲜rhPDGF-BB自体液(血清)的清除率。为了更好地理解rhPDGF-BB的药代动力学和药效动力学性质，测定了静脉内暴露之后的全身清除率。

我们假设rhPDGF-BB在静脉内给药后可具有快速的清除率。

研究设计

大鼠模型

大鼠是用于评价各类化学药品的药代动力学和毒性的常用啮齿动物模型，对于大鼠存在大量的历史数据库。总共四十八(48)只雄性Sprague Dawley大鼠用于该研究。动物被分成2组，为6只动物/组/时间点(表7)。按照研究目的、本发明人的学术需要和同期学术标准，设计该研究以使用可接受的最少数目的动物。该设计提供足够的组大小可供进行有意义的数据分析。用胰岛素注射器(28.5 G)通过静脉内递送将rhPDGF-BB给予外侧尾静脉。

试验品和对照品

试验品是0.4 mg/ml在20 mM乙酸钠缓冲液(pH:6.0 +/-0.5)中的rhPDGF-BB。对照品是20 mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0 +/-0.5)。

在开始研究时，将0.4 mg/ml rhPDGF-BB和20 mM乙酸钠(乙酸盐)缓冲液试验品的至少两个未开启、未使用的小瓶保持在相同的贮存条件(4℃)下作为用于给药、稳定性和浓度分析的小瓶。进行了稳定性和剂量验证分析，其由UV/Vis分光光度测定法和反相HPLC分析(附录II)构成。

采用用于处理试验品和对照品的标准实验室安全规程。准确地讲，在制备和给予剂量时戴上手套、面罩、实验服(即实验工作服)和护目用具。

测试***

四十八(48)只雄性Sprague Dawley大鼠用于该研究。根据其体重选择用于该研究的大鼠。在治疗时，平均体重约为227克。通过用不褪色记号笔写上的唯一尾部数字来辨别每只大鼠。因适当的研究相关事件(例如麻醉)而撤除食物和水，除此之外任意提供。在研究选择之前，通过肉眼检查筛选所有动物。

给予试验品

选择静脉内递送以实现100%生物利用度和血清中rhPDGF-BB的药代动力学性质。根据之前的大鼠肌腱胶原酶模型(参见实施例3)中肌腱内施用rhPDGF-BB的剂量反应功效研究来选择剂量水平。根据大鼠称重为0.227 kg，用于该研究的最大剂量浓度为100 μg或0.44mg/kg。

给四十八只大鼠称重，并随机分配到2个组，每组二十四只大鼠。按大鼠体重将其随机分配到每组。

在给药前记录体重。第1组动物按1.1 mL/kg的目标剂量体积，接受0.44 mg/kg(440 μg/kg)的rhPDGF-BB的单次静脉内剂量。第2组动物按1.1 mL/kg的目标剂量体积，接受溶媒对照(NaOAc缓冲液)。使用胰岛素注射器(28.5 G)通过外侧尾静脉法实现静脉内注射。采集约300 μl血清。

表7. 治疗组

*采血时间：

所有组的动物1-6= 基线、1分钟、l小时、48小时

所有组的动物7-12= 基线、5分钟、4小时、72小时

所有组的动物13-18= 基线、10分钟、8小时、96小时

所有组的动物19-24= 基线、20分钟、24小时、168小时

临床观察

至少每日观察动物直到处死。在rhPDGF-BB注射之前和处死之前记录体重。食物消耗是定性的。

在合适的研究终点将全部动物处死。在生命期治疗组完成后，通过过量给予CO₂使动物安乐死。通过缺乏反射(眨眼、回缩等)证实死亡。在该研究中未进行肉眼检查(gross)或组织病理学。未记录到不按时间表的动物死亡。

采集血清

在血清管中采集约600 μl血液，在室温下以1,800g离心10分钟得到血清。在2mLeppendorf管中提供约300 μl血清。在分析前将血清保存在-70℃下。

血清分析

在每个时间点测量rhPDGF-BB血清浓度。利用得自R&D systems的Quantikine ELISA试剂盒定量测量rhPDGF-BB。

药代动力学分析

利用WinNonlin的非区室模块计算下列参数：终末半衰期(t1/2)、Tmax、Cmax、AUC0-最后和CL。如采用Quantikine ELISA试剂盒测定法在血清中所测定的，利用不同时间点上存在的rhPDGF-BB的量进行分析。

统计学

统计分析限于说明性参数，例如平均值、标准差和变差系数(适当时)。

结果

所有动物在治疗时的平均体重为227克。动物接受440.53 μg/kg rhPDGF-BB的平均剂量。

平均血清rhPDGF-BB浓度-时间值见图12。给药后1分钟达到Cmax (6161.2 ng/mL)。之后在5分钟和1小时之间rhPDGF-BB浓度下降。自1小时至168小时，rhPDGF-BB浓度低于定量测定的水平(<0.156 ng/mL)。

表8表示雄性Sprague-Dawley大鼠中IV给予rhPDGF-BB的药代动力学分布。递送的平均剂量为440 μg/kg。在0.0167小时(1分钟)时观察到Tmax，其Cmax为6161.2 ng/mL。AUC0-最后为375.64小时*ng/mL，清除率(CL)为17.5 mL/分钟/kg。

表8：IV给药的药代动力学数据分析

结论

静脉内(IV)给予rhPDGF-BB导致高的初始全身暴露。它是立即清除型分子，其在给药后头10分钟内快速从血液中清除。

实施例5. 在肌腱内给予rhPDGF-BB后Sprague Dawley大鼠中rhPDGF-BB的药代动力学。

本项研究的目的是评价作为单次肌腱内剂量给予雄性Sprague-Dawley大鼠的rhPDGF-BB的药代动力学。设计该研究以评价在肌腱内递送后rhPDGF-BB全身性暴露和清除率。

研究设计

大鼠模型

大鼠是用于评价各类化学药品的药代动力学和毒性的常用啮齿动物模型，对于大鼠存在大量历史数据库。总共三十二(32)只雄性Sprague Dawley大鼠用于该研究。将动物随机分配到4组，每组8只动物(表9)。按照研究目的、本发明人的学术需要和同期学术标准，设计该研究以使用可接受的最少数目的动物。该设计提供足够的组大小可供进行有意义的数据分析。

试验品和对照品

试验品如下：(1) 20 mM乙酸钠缓冲液(pH:6.0 +/-0.5)中的3.4 mg/ml rhPDGF-BB；和(2) 20 mM乙酸钠缓冲液(pH:6.0 +/-0.5)中的0.34 mg/ml rhPDGF-BB。对照品是20 mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0 +/-0.5)。

在开始研究时，将3.4和0.34 mg/ml rhPDGF-BB和20 mM乙酸钠(乙酸盐)缓冲液试验品和对照品的至少两个未开启、未使用的小瓶保持在相同的贮存条件(4℃)下作为用于给药、稳定性和浓度分析的小瓶。进行了稳定性和剂量验证分析，其由UV/Vis分光光度测定法和反相HPLC分析构成。

包括在该研究中的剂量为1.02、10.2和102 μg rhPDGF-BB。通过分别注射30 μl3.4 mg/ml和0.34 mg/ml来实现102和10.2 μg剂量。对于1.02 μg剂量，0.34 mg/ml以1:10用NaOAc缓冲液稀释。

采用用于处理试验品和对照品的标准实验室安全规程。准确地讲，在制备和给予剂量时戴上手套、面罩、实验服(即实验工作服)和护目用具。

测试***

三十二(32)只雄性Sprague Dawley大鼠用于该研究，根据其体重(注射时约294克)进行选择。按大鼠体重将其随机分配到每组。

通过在其尾部写上的唯一号码辨认每只大鼠。因适当的研究相关事件(例如麻醉)而撤除食物和水，除此之外任意提供。在研究选择之前，通过肉眼检查筛选所有动物。

动物的治疗符合FIMR的CCP标准规程，该规程遵循美国农业部动物福利法(9 CFR，第1、2和3部分)概述的规程和实验室动物护理和使用指南(ILAR出版，1996，NationalAcademy Press)规定的条件。

给予试验品

跟腱内给药模拟临床上给予rhPDGF-BB。肌腱-跟骨连接处的注射部位模拟肌腱和骨的附着部位。

根据之前在大鼠肌腱胶原酶模型(参见实施例3)中肌腱内施用rhPDGF-BB的剂量反应功效研究，选择剂量水平。根据大鼠称重为0.294 kg，用于该研究的最大剂量浓度为102 μg或0.347 mg/kg。

将平均体重为294克的三十二只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分配到4个组，每组8只动物。第1、2和3组以30 μL/动物(0.102 mL/kg)的目标递送体积，在接近骨腱连接处的右跟腱中分别接受347 μg/kg、34.7 μg/kg和3.47 μg/kg rhPDGF-BB的单次肌腱内平均推注剂量。第4组以30 μL/动物的目标递送体积，接受20mM乙酸钠缓冲液的单次肌腱内注射。使用胰岛素注射器(28.5 G)，将治疗药注射至接近骨腱连接处的右跟腱。在以下所列采血时间为了血清用空的lcc注射器(26G)通过尾静脉给动物采血(约400μ1全血，约200μ1血清)。采用Quantikine ELISA测量血清中的rhPDGF-BB。

表9. 治疗组

*采血时间为：

所有组的动物1-4= 基线、1分钟、10分钟、20分钟、4小时、24小时和72小时

所有组的动物5-8= 基线、5分钟、8小时、48小时、96小时和168小时

将约400 μl血液采集到血清管中，在室温下以1,800g离心10分钟得到血清。在2 mLeppendorf管中提供约200 μl血清。在分析以测量存贮血清样品中的rhPDGF-BB的量之前，将血清保存在-70℃下。

临床观察

至少每日观察动物直到处死。在rhPDGF-BB注射之前记录体重。食物消耗是定性的。未记录到不按时间表的动物死亡。

在合适的研究终点将全部动物处死。在生命期治疗组完成后，通过过量给予CO₂使动物安乐死。通过缺乏反射(眨眼、回缩等)证实死亡。在该研究中未进行肉眼检查或组织病理学。

血清分析

在每个时间点测量rhPDGF-BB血清浓度。如下采用得自R&D Systems (Minneapolis，MN)的用于定量测定人血小板衍生生长因子-BB浓度ELISA试剂盒的Quantikine® 人PDGF-BB免疫测定法，定量测量rhPDGF-BB。

首先，用前将试剂盒中的全部试剂放到室温下。接下来，采用与用于试验样品相同批次的rhPDGF-BB，绘制rhPDGF-BB的标准曲线。使用试剂盒所提供的稀释缓冲液，将rhPDGF-BB稀释至10 ng/ml。然后将该溶液1:2系列稀释至0.15625 ng/ml的浓度。待测试样品使用相同的稀释缓冲液稀释，使得浓度值正好落入0.15625 ng/ml-10 ng/ml的rhPDGF-BB标准曲线内。

确定一式两份测定所有样品需要的孔数，对微量滴定板上各8孔条带适当编号。将100 μl/孔的Assay Diluent RD1X加至各孔中，接着加入100 μl的标准品和样品。然后将板用粘合盖(adhesive cover)盖上，在定轨摇床(设置在50-70次旋转/分钟)上于室温温育约2小时。抽吸各孔，用300 μL洗涤缓冲液洗涤。重复4次。接下来，将200 μl抗rhPDGF-BB缀合物(随R & D试剂盒供应，无需稀释)加入各孔。将板用新的粘合盖盖上，在设置在50-70次旋转/分钟的定轨摇床上于室温温育约1.5小时。重复抽吸和洗涤步骤，然后将200 μl底物溶液(随R & D试剂盒提供，无需稀释)加入各孔中。样品然后在定轨摇床上在室温下避光温育约30分钟。将50 μl终止溶液(随R & D试剂盒提供，无需稀释)加入各孔中，如果显色不均，则用8道多道吸液管上下抽吸2-4次将溶液混匀。在加入终止溶液的30分钟内，在设置为450nm (用540 nm的波长校正)的微板读数器中测定各孔的光密度。将光密度读数输入Microsoft Excel以进行分析。

计算各样品的平均值。利用各板的标准曲线，计算各试验样品的rhPDGF-BB浓度。利用各样品的rhPDGF-BB浓度和总体积，计算存在于各样品中的蛋白质总量。

药代动力学分析

利用WinNonlin的非区室模块计算下列参数：终末半衰期(t_1/2)，最大观测浓度的时间(T_max)、出现在T_max时的最大观测浓度(C_max)、从t=0小时到t=最终观察时间的药物浓度与时间曲线下面积(AUC_0-最后)和生物利用度(%F)。如利用Quantikine ELISA试剂盒测定法在血清中所测定的，利用存在于不同时间点上的rhPDGF-BB的量进行分析。

可以计算其它参数，例如：根据最终的观测浓度计算时间=0外推至无限的药物浓度与时间曲线下面积(AUC_inf)、静脉内给药的全身清除率(CL)和肌腱内给药的全身清除率(CL/F)。

统计学

统计分析限于说明性参数，例如平均值、标准差和变差系数(适当时)。

结果

所有动物在治疗时的平均体重为294克。动物接受347 μg/kg (102 μg)、34.7 μg/kg(10.2 μg)或3.47 μg/kg (1.02 g) rhPDGF-BB的平均剂量。

347 μg/kg剂量组的平均血清rhPDGF-BB浓度-时间值见图13。观察到在5分钟和8小时之间血清中rhPDGF-BB浓度降低。自8小时至168小时，血清中rhPDGF-BB的浓度低于ELISA定量的水平(<0.156 ng/mL)。在所有时间点上，34.7 μg/kg和3.47 μg/kg剂量组血清中的rhPDGF-BB浓度低于定量测定的水平(<0.156 ng/mL)。

表10表示在347 μg/kg剂量组的雄性Sprague-Dawley大鼠中肌腱内(IT)给予rhPDGF-BB和实施例4中描述的静脉内(IV)给药的440 μg/kg剂量组的参数的药代动力学分析。在0.083小时(4.98分钟)时观察到Tmax，其Cmax浓度为16.3 ng/mL。AUC0-最后为12.58ng*小时/mL，生物利用度为3.34%。对于34.7 μg/kg和3.47 μg/kg剂量组，在所有时间点上，血清中的rhPDGF-BB浓度低于定量测定的水平(<0.156 ng/mL)，因此未计算药代动力学参数。

表10：IT给药(347 μg/kg剂量组)和IV给药(440 μg/kg剂量组)的药代动力学数据 分析

结论

肌腱内(IT)给予rhPDGF-BB导致快速的最初低的全身性暴露。在低于347 μg/kgrhPDGF-BB的剂量下，未观察到可检出的rhPDGF-BB血清浓度。

在347 μg/kg rhPDGF-BB IT剂量下，所给予剂量的约3.34%达到全身循环，而Cmax值仅为在IV给药后观察到的值的0.26%。因此，rhPDGF-BB在肌腱内给药后在吸收到血清中后被快速清除。考虑到在肌腱内给药后rhPDGF-BB的生物利用度低(约3.34%)，这出人意料地预示着rhPDGF-BB被保留在作用部位。

实施例6：rhPDGF-BB注射对外上髁炎的作用的II期随机单次递增剂量双盲安慰剂对照多中心研究。

本项研究的目的是评价作为外上髁炎(亦称为“网球肘”)治疗的rhPDGF-BB注射的疗效。

研究基地/研究组。该研究在多达6个临床基地进行。研究人群为一百(100)名受试者，随机分成4组，每组二十五(25)名受试者。各组包括5名安慰剂患者和20名积极治疗患者。

研究人群：保守治疗失败三(3)个月的临床诊断为外上髁炎的受试者。

研究设计。本研究是II期随机单次递增剂量双盲安慰剂对照多中心研究。在取得参加研究知情同意书后，招募符合研究招募入选标准的合格受试者。手术后24周跟踪受试者。随机化跟踪研究招募按照1:1:1:1:1方案把受试者分到下列治疗组之一：(1)剂量A：仅缓冲液——对照组；(2)剂量B：缓冲液+ 0.45 mg rhPDGF-BB；(3)剂量C：缓冲液+ 0.75 mgrhPDGF-BB；(4)剂量D：缓冲液+ 1.5 mg rhPDGF-BB；和(5)剂量E：缓冲液+ 3.0 mg rhPDGF-BB。所有剂量的总体积为1.5 ml rhPDGF-BB溶液/剂量(分别对应于0.3 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml和2.0 mg/ml的rhPDGF-BB治疗组，以70 kg人为基础分别对应于6.4、10.7、21.4和42.9 μg rhPDGF-BB/kg)。缓冲液为20 mM乙酸钠(pH=6.0)。

采用分层递增方法进行随机化。初始随机化遵循采用以下方式将受试者分到治疗组的统计学上有检验效能的(statistically powered)递增方案：将预先确定的统计学上有检验效能数目的受试者随机分到剂量A (仅缓冲液——对照组)或剂量B (缓冲液+ 0.3mg/ml rhPDGF-BB)。对于该初始剂量耐受性(剂量B)，一旦达到预定数目，第二层随机化将预先确定的统计学上有检验效能数目的待随机分配的受试者加到剂量A、剂量B或额外选项剂量C (缓冲液+ 0.5 mg/ml rhPDGF-BB)。重复将统计学上有检验效能数目的受试者加入随机化方案的各层内的这种相同方式，直到将剂量D (缓冲液+ 1.0 mg/ml rhPDGF-BB)和剂量E ((缓冲液+ 2.0 mg/ml rhPDGF-BB)引入随机化方案，且达到研究招募目标。

采用“密击技术”，将指定剂量的单次注射给予肌腱。“密击技术”是在把针***触痛区域后，在不使针露出皮肤的情况下，通过抽拉、重新定位针并将针重新***来进行多次少量注射的注射方法。

针对注射部位的局部反应(发红、肿胀、搔痒、疼痛)、慢性损伤区域的疼痛的任何增加和***反应的任何迹象，对受试者进行评价。如果受试者报告上述症状的发生，则根据受试者的评价和研究人员的决定，确定严重程度和与研究药物的相关性，并记录在指定的研究eCRF中。如果确定症状的严重程度和相关性与rhPDGF-BB治疗有关，则将该信息立即知会赞助人以及适当的监管当局。然后做出此时是继续招募还是停止受试者招募的决定。

获得手术前前后位(AP)和侧位X光片用于基线成像，并在手术前进行长达四(4)周。获取手术后二十四(24)周各研究方案的其它AP和侧位X光片。当所有受试者完成二十四(24)周随访时，进行最后的安全性评价。

入选标准。包括在该研究中的受试者是患有受阻旋后(resisted supination)或腕背屈的其症状可重现、临床诊断为外上髁炎且≥ 21岁的受试者。

排除标准。不包括在该研究中的受试者是在过去三(3)个月接受既往皮质甾类注射治疗或已进行治疗外上髁炎的手术干预的受试者；对酵母来源的产品有***反应的受试者；有腕管综合征史的受试者；有颈椎神经根病史的受试者和在治疗六(6)个月内受累肘部有创伤的受试者。

研究持续时间。招募时间约为9个月。随访包括手术后直到二十四(24)周的握力测试和四肢体检。监测安全终点直到在二十四(24)周的最后一次视察。

主要结果测量。(1)安全性。通过评价不良事件的发生，来评价rhPDGF-BB的安全性和耐受性。rhPDGF-BB是安全的，并为受试者所耐受。

次要结果测量。研究手术前视察2次和在四(4)、八(8)、十二(12)和二十四(24)周时的手术后研究巡视时，完成下列评价：(1)臂肩手失能评分(DASH)。(2)视觉模拟评分法(VAS)。(3)通过握力测试测量的作用真实性。用rhPDGF-BB的治疗导致肌腱的临床结局中的一个或多个有益变化，例如与治疗前评分(DASH和VAS)相比的改善变化、随施加压力和/或腕屈曲时的疼痛减轻、受累肢活动性增加和/或握力加大。

实施例7：大鼠模型中rhPDGF-BB涂覆的缝线对肌腱愈合的作用：组织学和生物力学研究。

摘要

引言。跟腱撕裂是常常需要手术修复的常见损伤。该研究的目的是双重的：(1)确定用rhPDGF-BB涂覆的缝线是否可成功地将该因子的合适量递送到修复部位，和(2)根据生物力学和组织学，确定用rhPDGF-BB涂覆的缝线是否可改善大鼠跟腱模型的愈合。

方法。采用之前描述的浸渍涂布方法，用不同浓度的rhPDGF (0、0.3、1.0和10.0mg/ml)涂覆4-0 Vicryl缝线。0 rhPDGF组用作对照。采用ELISA以确定在不同浸涂溶液中涂覆后缝线上的所得rhPDGF浓度。

横切大鼠跟腱，使用4种缝线类型之一急速修复。在手术后4周收获肌腱。针对胶原组构和血管生成，对各样本的组织学切片进行评分。对各样本进行单轴拉力生物力学分析，提供载荷和延伸数据。针对各样本的弹性模量、极限抗张强度和弹性韧度，对原始数据进行分析。

结果。缝线用rhPDGF成功涂覆，其中较高浸涂浓度在缝线产生较大量的rhPDGF。组织学分析表明在对照和PDGF组之间，在胶原评分或血管生成方面无显著差异。生物力学结果表明在对照(1.0 ± 0.2 MPa)和高剂量PDGF组(1.9 ± 0.5 MPa和2.1 ± 0.5 MPa)之间，在极限抗拉应力方面有显著差异。与其它所有组相比，在PDGF 10 mg/ml组(7.22，SD3.79)中拉力弹性模量显著较高。这就证实用PDGF涂覆的缝线有积极的剂量反应且强度得到改进。

结论。该研究证实了我们的设想，即rhPDGF-涂覆的缝线可以积极的剂量依赖性方式改进经修复的肌腱的材料性质。

引言

在目前研究中，我们假设4-0 Vicryl缝线可用可再现量的rhPDGF-BB成功涂覆，而且用rhPDGF-BB涂覆的缝线对大鼠跟腱修复的增加可以剂量依赖性方式提高修复，正如在生物力学和组织学上进行的评价一样。

材料与方法

该研究分两部分进行：1)体外缝线涂覆和分析，和2)大鼠模型的体内跟腱修复。手术经IUCAC批准。

第1部分：缝线涂覆：采用前述浸渍涂布方法(Dines J, Weber L, Razzano P等.The Effect of Growth Differentiation Factor-5-Coated Sutures on Tendon Repairin a Rat Model (生长分化因子-5涂覆的缝线对大鼠模型的肌腱修复的作用). JShoulder Elbow Surg 2007;16:215S-221S)，将4组的4-0 Vicryl缝线(Ethicon，Somerville，NJ)用以下涂覆：(1) 20 mM乙酸钠缓冲液(载体对照)，(2) 含0.3 mg/mlrhPDGF-BB的缓冲液，(3) 含1.0 mg/ml rhPDGF-BB的缓冲液，和(4) 含10.0 mg/mlrhPDGF-BB的缓冲液。简单地说，在用70%乙醇处理后，将缝线(带针)浸入含有或不含rhPDGF-BB (0、0.3、1.0和10.0 mg/ml)的乙酸钠缓冲液中达30分钟，然后风干。与Dines等人描述的方法不一样，涂覆溶液中不使用明胶。把缝线修整为15 cm长度用于体内研究。修整缝线的其余长度用于体外分析。

体外rhPDGF-BB释放：将在乙酸盐缓冲液(第1组)或rhPDGF-BB (第2-4组)的溶液中涂覆的缝线(n=5/组)置于洗脱缓冲液(具有2%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1% L-谷氨酰胺和1% HEPES缓冲液的极限必需培养基)中，在摇床上于37℃温育。在1、6、24和48小时的时间点上完全交换洗脱缓冲液。采用PDGF-BB ELISA (人PDGF-BB DuoSet，R&D Systems，Minneapolis，MN)，测定每个时间点上释放的总rhPDGF-BB。

第II部分：研究设计：48只Sprague-Dawley大鼠(350-400克)以盲法方式随机分到4个治疗组之一(n=12只/组)。各组由上述浸涂溶液中的4个不同浓度的rhPDGF-BB与对照组(0 mg/ml rhPDGF-BB)和3个实验组(0.3、1.0和10.0 mg/ml rhPDGF-BB起始涂覆浓度)组成。

手术操作：所有手术在无菌条件下进行。在跟腱之上切开1.5 cm皮肤切口。采用钝器解剖法暴露跟腱。此时，用解剖刀片在其跟骨上的附着部近端横切肌腱。使用4组之一的缝线，采用一种改良的Mason-Allen缝合和一种简单的间断缝合，立即修复肌腱。

由大鼠跟腱的小尺寸所致，在实施任一种缝合时都无困难。皮肤用间断未涂覆的Vicryl缝线闭合。在手术修复后，允许动物正常走动。4周后，处死大鼠，收获肌腱，包括跟骨和近端腓肠-比目鱼肌复合体的骨块。将样本随机分配到生物力学分析(n=8/组，新鲜冷冻)或组织学分析(n=4/组，***固定)。

生物力学：采用配备载荷准确度为+/-0.5%的100N测压元件的Instron***(型号5566)，对各样本进行单轴拉力生物力学分析。在含有蛋白酶抑制剂的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，在4℃下融化长达4小时后，切开样品除去过多肌肉，将跟骨和腓肠-比目鱼肌端包裹在220粗砂砂纸中。把样本在气动夹具之间固定，并浸于PBS浴液槽中。对样品预加载张力(1N)后，测量样品尺寸。然后，以0.25%/秒的应变速率对肌腱进行张力延伸。样本被拉失效，用个人电脑采集所得载荷和延伸数据，在10 Hz下获取数据。测试后，分析所采集的数据以分别确定(1)线劲度，和(2)载荷-位移或应力-应变曲线的线性部分的弹性模量。还自负荷曲线计算最大载荷和极限抗张强度。

组织学：在跟腱附着部位从跟骨上剥离出肌腱样本，对经修复的跟腱进行加工，并包埋在石蜡中。各样本的矢状切片用Mallory三色或天狼猩红染色。利用之前文献所述的胶原组构和血管生成程度的评分***(Dines J, Weber L, Razzano P等. The Effect ofGrowth Differentiation Factor-5-Coated Sutures on Tendon Repair in a RatModel (生长分化因子-5涂覆的缝线对大鼠模型的肌腱修复的作用). J Shoulder ElbowSurg 2007;16:215S-221S)，由3位不知情观察人员对载玻片拍照并评分。3名对治疗组不知情的独立观察人员对各载玻片进行评价。计算各治疗组的总分，并比较统计显著性。

统计分析：利用以时间作为重复测量的重复测量方差分析，分析体外释放的rhPDGF-BB的量。用非线性(重对数图尺)最小二乘法拟合来拟合释放的rhPDGF-BB的累积量和递送的总剂量与起始涂覆浓度的关系曲线。对于生物力学参数，利用单因素方差分析与Bonferroni多重比较检验，来确定组间的差异。对组织学分级评分的统计分析利用Kruskal-Wallis检验与Dunn双重比较事后检验进行。生物力学数据表示为平均值± SEM，组织学评分表示为中位值(范围)。以p <0.05确定显著性。

结果

体外rhPDGF-BB释放：体外释放数据表示为通过缝线长度归一化的释放的rhPDGF-BB的量(ng/cm) (图14A和14B)。在包括第1组(0 mg/ml)的所有组中测量体外释放，第1组被视为其它组的基线测量(累积释放：1.3 ± 0.1 ng/cm)。在温育的第1小时后，观察到从缝线中rhPDGF-BB的快速释放(bolus release) (第2组：6.29 ± 3.0 ng/cm；第3组：68.81 ±9.3 ng/cm；第4组：5809.42 ± 541.6 ng/cm) (图14A)。初始快速释放接下来是在整个48小时时间点内额外rhPDGF-BB的持续逐渐释放。48小时温育内释放的rhPDGF-BB的累积量是剂量依赖性的，其中浸涂溶液的浓度越高，所释放的rhPDGF-BB增加；与第2组(0.3 mg/ml；14.0 ± 5.7 ng/cm)和第3组(1.0 mg/ml；126.8 ± 18.8 ng/cm)相比，第4组(10 mg/ml；6495.9 ± 552.6 ng/cm)显著增加(p<0.001) (图14B)。释放的rhPDGF-BB的累积量在第2组和第3组间并无显著不同(p>0.05)。释放的rhPDGF-BB的累积量(Y，ng/cm)与起始涂覆浓度(X，mg/ml)通过以下等式呈对数比例(R²=0.9575)：

Y = 10^{(1.711*log(X) + 2.102)}。

手术和总体观察：所有动物对手术都有良好反应，除第3组(分配到组织学)的1只动物除外，该动物手术后继发于麻醉并发症隔夜死亡。用于修复的缝线长度在组间一致(第1组：4.8 ± 0.1 cm；第2组：4.7 ± 0.2 cm；第3组：4.8 ± 0.1 cm；第4组：4.8 ± 0.1cm；p=0.94) (图14D)。根据体外所释放的rhPDGF-BB的平均量和缝线长度，每组的体内剂量(平均值± SD)计算为：第1组：0 ng；第2组：66.0 ± 61.2 ng；第3组：602.5 ± 190.9 ng；第4组：31,342.6 ± 6774.5 ng。与所释放的rhPDGF-BB的累积量类似，所递送的体内剂量(Y，ng)藉以下等式与起始涂覆浓度(X，mg/ml)成对数比例(R²=0.9859) (图14C)：

Y = 10^{(1.732*log(X) + 2.757)}。

生物力学：由于Instron试验机械测试当天的误差所致，5个样本不能够用于生物力学分析。所得用于生物力学分析的样本数为：n=7 (第1组、第2组和第3组)和n=6 (第4组)。

观察到修复肌腱的结构性质(极限载荷和刚度)无显著差异(p>0.16)，然而，与对照组(第1组)相比，极限载荷的平均值(第1组：22.1 ± 1.8 N；第2组：31.6 ± 3.5 N；第3组：28.0 ± 3.7 N；第4组：27.6 ± 1.8 N)和刚度(第1组：6.7 ± 0.4 N/mm；第2组：8.9± 0.8 N/mm；第3组：8.0 ± 1.0 N/mm；第4组：7.9 ± 0.7 N/mm)在接受rhPDGF-BB的组中一致较高。

与第1组(0.21 ± 0.03 cm²)和第2组(0.23 ± 0.04 cm²)相比，在第4组(0.14 ±0.05 cm²)中观察到横截面积(CSA)显著减小(p<0.05)。与第2组相比，第3组(0.17 ± 0.02cm²)中的CSA也显著减小(p<0.05)。CSA的减小导致修复肌腱中材料性质(极限抗张强度和弹性模量)的显著差异。与0 mg/ml (1.0 ± 0.1 MPa)和0.3 mg/ml (1.4 ± 0.1 MPa)rhPDGF-BB组相比，10.0 mg/ml rhPDGF-BB组(2.1 ± 0.2 MPa)的极限抗张强度显著增加(p<0.05)；与0 mg/ml组相比，1.0 mg/ml (1.9 ± 0.2 MPa) rhPDGF-BB组中的极限抗张强度也显著增加。与所有其它组(0 mg/ml：3.5 ± 0.4 MPa；0.3 mg/ml：4.4 ± 0.4 MPa；1.0mg/ml rhPDGF-BB：4.9 ± 0.7 MPa)相比，在10.0 mg/ml (7.22 ± 1.5 MPa) rhPDGF-BB组中观察到弹性模量显著增加(p<0.05)。0、0.3和1.0 mg/ml rhPDGF-BB组彼此间无统计性差异。

组织学：对每组的4只动物(第3组的n=3)进行了组织学分析。通过3个级别对各个切片进行评分，测定平均分值。平均分值表示为中位值(范围)。组织学分析表明组间的胶原组构或血管生成评分无显著差异。然而，与对照组相比，在rhPDGF-BB组中观察到更趋于正常外观的趋势，特别是胶原组构评分。

讨论

在该研究中，我们证实可将rhPDGF-BB成功地涂覆在Vicryl缝线上，体外从缝线释放的rhPDGF-BB的量有赖于起始涂覆浓度。在结构机械性质(极限载荷和刚度)方面或通过组织学未观察到显著差异，但在rhPDGF-BB治疗组中的这些性质有改进的趋势。对于材料生物力学性质，观察到对rhPDGF-BB涂覆的缝线的剂量依赖性的反应，正如材料机械性质(极限抗拉应力和弹性模量)提高所显示的一样。

在生物力学上，对于极限强度和弹性模量，用最高剂量的rhPDGF-BB观察到显著差异。极限强度(亦称为极限抗张强度或极限抗拉应力)和弹性模量(亦称为弹性模数)表示通过肌腱的尺寸性质(位移和CSA)归一化的结构性质(极限载荷和刚度)，并且是组织质量的度量。在该研究中，CSA随rhPDGF-BB的剂量增加而降低说明了材料性质提高。CSA的减小表示更组织化的肌腱。虽然在组织学上观察到胶原组构随rhPDGF-BB趋于改进的趋势，但是这种评分未达到统计显著性，正如对CSA所观察到的一样，可能是分配给组织学的样品数量小所致。无论如何，改进的胶原组构的趋势，结合CSA减小，表明与对照缝线相比，最高剂量的rhPDGF-BB促进更好质量的肌腱组织(极限强度和弹性模量增加)。

定量测定rhPDGF-BB的使用剂量是评价缝线涂覆方法的效率和对肌腱愈合的剂量依赖性作用所必需的。体外分析表明自最高涂覆浓度(10 mg/ml)释放的rhPDGF-BB的量显著增加，然而在两个较低涂覆浓度(0.3和1.0 mg/ml)下，甚至所释放的rhPDGF-BB的平均累积量(分别为14.0 ± 5.7 ng/cm与126.8 ± 18.8 ng/cm)有9倍差异，也未注意到有显著差异。这与极限强度和弹性模量在两个较低剂量组中无显著差异的观察结果一致。

该研究表明，递送rhPDGF-BB能够提高大鼠跟腱的生物学修复。该研究的限制是这些结果的解读如何受在该研究所用样品大小的影响。对生物力学用8只动物/组，对于组织学用4只动物/组来设计该研究。由于在机械测试一天中Instron测试装置的误差所致，5个样本未包括在该分析中，降低了统计检验效能。结果对于实验组，在极限载荷和刚度等性质中的较小差异无法视为显著，即使它们的平均值与对照组相比，似乎增加。

在生长因子的应用中，如果结果常常是剂量依赖性的，则当动物大小增加时，可能需要递送较大的剂量。初步研究(数据未显示)显示，所递送剂量对起始涂覆浓度和缝线表面积两者有依赖性，这就表明对于较大动物按比例增加剂量是能实现的。

所示结果表明，在临床应用上使用rhPDGF-BB涂覆的缝线可具有改善患者的肌腱愈合和提高患者功能的潜力。

参考文献

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Claims (15)

1.有效量的包含PDGF和缓冲液的溶液的组合物在制备用于治疗腱病的药物中的用途，其中所述组合物的有效量包含每剂量约75 μg-约7,500 μg，其中通过肌腱内注射将所述组合物给予至腱病部位。

2.权利要求1的用途，其中所述腱病是腱退变、腱炎或腱鞘炎。

3.权利要求1或2的用途，其中所述PDGF选自PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD，优选PDGF-BB，更优选重组人(rh) PDGF-BB。

4.权利要求3的用途，其中所述有效量的组合物包含每剂量约500 μg-约1,000 μg之间的PDGF-BB，每剂量约5,000 μg至约7,500 μg之间的PDGF-BB，每剂量约450 μg-约3000 μg之间的PDGF-BB，每剂量约400 μg-约1000 μg之间的PDGF-BB，每剂量约500 μg-约900 μg之间的PDGF-BB，每剂量约600 μg-约800 μg之间的PDGF-BB，或每剂量约650 μg-约750 μg之间的PDGF-BB，优选每剂量约700 μg的PDGF-BB。

5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述组合物的体积为约1.0-约2.0 ml/剂量，优选约1.5 ml/剂量。

6.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述缓冲液选自磷酸缓冲盐溶液(“PBS”)、乙酸钠、乙酸铵、乙酸、柠檬酸、柠檬酸钠、三(羟甲基)氨基乙烷(“tris”)、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(“HEPES”)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(“MOPS”)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(“MES”)、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(“ADA”)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸) (“PIPES”)和N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(“ACES”)，优选乙酸钠。

7.权利要求6的用途，其中乙酸钠的浓度介于约10 mM和约100 mM之间，优选为约20mM。

8.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述组合物的pH介于约4.0和约7.0之间，优选为约6。

9.权利要求1-8中任一项的用途，其中通过直接注射至受累部位来给予所述组合物。

10.权利要求9的用途，其中所述受累部位是骨-肌腱连接处或肌腱。

11.权利要求1-10中任一项的用途，其中所述腱病选自跟腱病、髌腱病、外上髁炎、内上髁炎、足底筋膜炎和肌腱套腱病，优选外上髁炎。

12.权利要求1-11中任一项的用途，其中以单剂量给予所述组合物，优选通过单次注射给予所述组合物。

13.权利要求1-12中任一项的用途，其中以不止一个剂量给予所述组合物，优选通过单次注射一周一次给予所述组合物达4周。

14.权利要求1-13中任一项的用途，其中与基线相比，所述组合物导致在给药约7天内肌腱强度提高至少约60%、约65%或约70%。

15.权利要求1-14中任一项的用途，其中所述组合物导致肌腱在给药约7天内达到其最终强度的至少约80%、约85%或约90%，其中在给药后约21天测量最终强度。