CN1094759C - 骨基质明胶载体的去活方法 - Google Patents

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本发明属于生物医学的材料制备领域。特别适用于生物医学中骨形态发生蛋白(BMP)的骨基质明胶载体。本发明方法是利用还原剂破坏其分子内和分子间的二硫键和天然活性的空间构象，使双体结构还原成单体结构，失去诱导活性并与胶原蛋白去复合。该方法的特点是破坏维持蛋白质生理活性的分子结构和构象，提高了抽提去活效率。

Description

骨基质明胶载体的去活方法
本发明是属于生物医学的材料制备领域，特别适用于骨形态发生蛋白(BMP)的骨基质明胶载体。
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，简称BMP)是一种具有独特诱导成骨功能的机体蛋白因子，在机体骨组织再生和修复过程中发挥着关键作用。现在已可从牛、马、猪、羊、兔、鼠和人骨或骨肉瘤中生化提取不同种属来源的骨形态发生蛋白(BMP)，或利用生物工程技术制备基因重组的人的骨形态发生蛋白(BMP)。利用其诱导成骨活性，有望实现人体断骨的快速再生连接和缺骨的快速再生修复，在骨科和口腔科临床具有广泛的应用前景，并具有重大的经济和社会效益。
为了充分发挥骨形态发生蛋白(BMP)的独特的诱导成骨活性并取得良好的临床治疗效果，需要满足三个条件：一、保证骨形态发生蛋白(BMP)的天然立体构象和双体结构的完整，使其活性不被破坏；二、使骨形态发生蛋白(BMP)与适当的载体复合，为被诱导转化的新生成骨细胞提供附着位点，同时载体还起到缓释和引导成骨方向和范围的作用；三、不引起免疫反应。
骨基质明胶(bone matrix gelatine，简称BMG)是从牲骨中提取的，主要成分是胶原蛋白。它成本低廉并具有良好的生物相容性。由于胶原蛋白组成和结构的高度保守，使其种属差异极小，基本不引起免疫炎症反应，可被人体自然吸收和同化。经过去活处理的骨基质明胶(BMG)本身无诱导活性，并具有多孔网架的微观结构，是骨形态发生蛋白(BMP)的极佳的载体材料。
在牲骨中，天然存在的骨形态发生蛋白(BMP)和其它非胶原蛋白成分与骨基质明胶(BMG)相复合并构成了牛骨基质。为了制备安全实用的骨形态发生蛋白(BMP)载体材料骨基质明胶(BMG)，需要去除骨基质中的骨形态发生蛋白(BMP)和大量的非胶原蛋白组分。这不仅可以得到无诱导成骨活性的惰性胶原载体，而且通过去除大量高种属特异性的非胶原蛋白，得到无免疫原性的骨基质明胶(BMG)载体。所以去活处理是骨基质明胶(BMG)载体的制备中的关键步骤。
现有技术中主要是将牲骨经粉碎并脱脂脱钙后，用高浓度的强变性剂盐酸胍将水不溶性的骨形态发生蛋白(BMP)等非胶原性蛋白溶解抽提去除，水洗去胍后冻干，制成去活胶原载体。详细过程参见U.S.Patent4975526。
上述现有方法在实践中存在的问题主要是由于骨基质颗粒大小差异和盐酸胍抽提效率等因素的影响，为了保证得到无诱导活性的载体，需要长时间的和反复的抽提，并可能在不同批次间存在差异。未被去除的骨形态发生蛋白(BMP)由于双体结构未被破坏，除去盐酸胍后仍可能复性并具有活性；部分与胶原蛋白紧密结合的非胶原蛋白和被包裹其中的骨形态发生蛋白(BMP)蛋白始终难于被抽提去除。
本发明的目的是提出一种能够破坏活性成分的天然结构，提高抽提去活效率，和保证骨基质明胶(BMG)载体的诱导惰性及无免疫原性的去活骨形态发生蛋白(BMP)载体骨基质明胶(BMG)的制取方法。
根据本发明的目的，我们所采用去活处理骨基质明胶(BMG)载体的方法是利用还原剂破坏其分子内和分子的二硫键，破坏其天然活性的空间构象，使双体结构还原成单体结构，使其失去诱导活性并与胶原蛋白去复合，而且还利于被抽提除去。本发明的骨基质明胶载体骨基质明胶(BMG)的去活方法是将新鲜的牲骨股骨去骺端，剔除肌内，筋膜和骨髓后进行脱脂脱水处理，其特征在于脱脂脱水处理是在1∶1的乙醇、***中进行后，并于4℃再进行破碎研磨，过筛，保留75-425μm尺寸大小的组分，1mol盐酸脱钙，水洗至中性后再次脱脂并干燥保存，再将所获脱钙骨基质DBM经2molCaCL2，0.5mol乙二胺四乙酸钠(EDTA)pH 8.0，55℃温水顺序抽提(5倍体积，搅拌过夜)后，再采用还原剂与变性剂溶液，按5-10倍体积与DBM混合并于室温下抽提24-48小时。抽提后用8mol尿素洗涤，再用pH5.5的酸溶液于60℃下处理8-12小时，用水充分洗涤至中性，冷冻干燥后，将所得去活骨基质明胶(BMG)粉粒置于4℃保存。在上述本发明去活方法中二次抽提溶液还原剂是指0.05-0.2mol二硫苏糖醇(DTT)溶液或0.7molβ-巯基乙醇(BME)溶液中的任意一种。而与还原剂混合的变性剂是指4-6mol盐酸胍/0.5mol CaCl2 pH7.0溶液或者说6-8mol尿素/0.5mol CaCl2 pH7.0溶液中的任一一种。
采用本发明的骨基质明胶载体去活方法经实验具有以下特点：将制备过程分为DBM粗制和骨基质明胶(BMG)精制两部分并分别保存所制取得材料，有利于实现质量可控的载体材料的批量制备。
通过CaCL2、EDTA、55℃温水顺序抽提，可大约去掉20％的可溶性非胶原蛋白。
通过高浓度盐酸胍或尿素的变性作用，将水不溶性的骨形态发生蛋白(BMP)和其它非胶原蛋白的分子内和分子间氢键破坏，破坏其蛋白空间构象；通过DTT和BME的还原作用，破坏骨形态发生蛋白(BMP)等非胶原蛋白的分子内和分子间二硫键，使多聚体和双体解离为单体，破坏蛋白的活性结构。利用变性剂和还原剂的协同作用，使紧密地包聚在骨基质高度交联结构中的不溶性蛋白易于被溶解抽提，并不再具有维持其生理活性的分子结构和构象，提高了抽提去活效率。
通过热酸处理使与胶原蛋白有化学键合的蛋白解离下来，而对胶原蛋白纤维只有少量的降解作用。
经上述制备和去活处理的骨基质明胶骨基质明胶(BMG)不再具有潜在的诱导成骨活性和免疫原性，而具有微观多孔网架结构和良好的生物相容性，是一种易与骨形态发生蛋白(BMP)复合的可降解的安全的骨形态发生蛋白(BMP)载体。
实施例
冶金部钢铁研究总院生物材料与工程中心于1994年8月至11月间在河北省大厂县收集新鲜牛股骨按照上述方法经过清理、破碎、清洗、脱脂脱水、研磨粉碎、筛分、脱钙、清洗、脱脂脱水、干燥保存等步骤制备了约20千克的牛骨脱钙骨基质(DBM)。于1995年初至1998年中在中心实验室用(DBM)材料制备骨基质明胶(BMG)，并通过动物实验检测载体的安全性和效果，取得满意的结果。形成上述制备方法。按照上述方法分别制备了4批共800克牛骨骨基质明胶(BMG)载体，经过小鼠皮下植入实验检验，组织切片观察，均未发现有诱导成骨活性和免疫炎症反应，生物安全性良好。
以下为实施例的具体实施方案。
实施例1；本实施例是采用10Kg的新鲜牛骨股骨去骺端，剔除肌肉、筋膜和骨髓后进行脱脂、脱水处理，其脱脂脱水处理是在1∶1的乙醇、***中进行后并于4℃再进行破碎研磨，过筛，保留75-425μm尺寸大小的组分，1mol盐酸脱钙，水洗至中性后再次脱脂并干燥保存，再将所获脱钙骨基质(DBM)经2mol CaCL2，0.5mol乙二胺四乙酸钠(EDTA)pH8.0，55℃温水顺序抽提(5倍体积，搅拌过夜)后，再采用含有0.07mol二硫苏糖醇(DTT)的4mol盐酸胍/0.5mol CaCl2 pH7.0溶液按7倍体积与脱钙骨基质(DBM)混合并于室温下抽提30小时，抽提后用8mol尿素洗涤，再用pH5.5的酸溶液于60℃下处理8小时，用水充分洗涤至中性，冷冻干燥后，将所得去活骨基质明胶粉粒置于4℃保存。
实施例2；本实施例是采用5Kg的新鲜牛骨股骨去骺端，剔除肌肉、筋膜和骨髓后进行脱脂、脱水处理，其脱脂脱水处理是在1∶1的乙醇、***中进行后并于4℃再进行破碎研磨，过筛，保留75-425μm尺寸大小的组分，1mol盐酸脱钙，水洗至中性后再次脱脂并干燥保存，再将所获脱钙骨基质DBM经2mol CaCL2，0.5mol EDTA pH8.0，55℃温水顺序抽提(5倍体积，搅拌过夜)后，再采用含有0.7mol β-巯基乙醇(BME)的6mol盐酸胍/0.5mol CaCl2 pH7.0溶液按9倍体积与脱钙骨基质(DBM)混合并于室温下抽提40小时，抽提后用8mol尿素洗涤，再用pH5.5的酸溶液于60℃下处理10小时，用水充分洗涤至中性，冷冻干燥后，将所得去活骨基质明胶粉粒置于4℃保存。
实施例3；本实施例是采用5Kg的新鲜牛骨股骨去骺端，剔除肌肉、筋膜和骨髓后进行脱脂、脱水处理，其脱脂脱水处理是在1∶1的乙醇、***中进行后并于4℃再进行破碎研磨，过筛，保留75-425μm尺寸大小的组分，1mol盐酸脱钙，水洗至中性后再次脱脂并干燥保存，再将所获脱钙骨基质DBM经2mol CaCL2，0.5mol乙二胺四乙酸钠(EDTA)pH8.0，55℃温水顺序抽提(5倍体积，搅拌过夜)后，再采用含有0.15mol二硫苏糖醇(DTT)的8mol尿素/0.5mol CaCl2 pH7.0溶液按6倍体积与脱钙骨基质(DBM)混合并于室温下抽提24小时，抽提后用8mol尿素洗涤，再用pH5.5的酸溶液于60℃下处理11小时，用水充分洗涤至中性，冷冻干燥后，将所得去活骨基质明胶粉粒置于4℃保存。

Claims (3)

1、一种骨基质明胶载体的去活方法，该方法是将新鲜的牲骨股骨去骺端，剔除肌肉、筋膜和骨髓后进行脱脂、脱水处理，其特征在于：脱脂脱水处理是在1∶1的乙醇、***中进行后并于4℃再进行破碎研磨，过筛，保留75-425μm尺寸大小的组分，1mol盐酸脱钙，水洗至中性后再次脱脂并干燥，保存，再将所获材料脱钙骨基质DBM经2mol CaCL2，0.5mol乙二胺四乙酸钠EDTA pH8.0，55℃温水顺序抽提5倍体积，搅拌过夜后，再采用含有还原剂与变性剂溶液，按5-10倍体积与DBM混合并于室温下抽提24-48小时，抽提后用8mol尿素洗涤，再用pH5.5的酸溶液于60℃下处理8-12小时，用水充分洗涤至中性，冷冻干燥后，将所得去活骨基质明胶粉粒置于4℃保存。
2、根据权利要求1所述去活方法，其特征在于：还原剂是指0.05-0.2mol二硫苏糖醇DTT溶液或0.7molβ-巯基乙醇BME溶液中的任意一种。
3、根据权利要求1、2所述去活方法，其特征在于：还原剂的变性剂是指4-6mol盐酸胍/0.5mol CaCl2 pH7.0溶液或者说6-8mol尿素/0.5mol CaCl2pH7.0溶液中的任意一种。
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