JPH0760159B2 - コロイド粒子を用いたイムノクロマトグラフ法 - Google Patents

コロイド粒子を用いたイムノクロマトグラフ法

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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般にアッセイ方法および装置に関する。さら
に詳しくは、本発明は、特異的結合アッセイにクロマト
グラフ技術を利用したアッセイ方法および装置に関す
る。本発明の一つの態様においては、クロマトグラフ的
に可動で視覚的に検出可能なシグナルを生じ得る、コロ
イド粒子標識特異的結合物質を利用した方法および装置
が提供される。本発明の他の態様においては、コロイド
粒子標識物質を含む標識した特異的結合物質、および酵
素標識物質を利用した方法および装置が提供される。該
酵素標識物質は、準可溶性タンパク質の存在下でクロマ
トグラフ媒体上に乾燥させたものであり、試料やクロマ
トグラフ移動溶媒などの適当な溶媒の存在下ですみやか
に再可溶化することができる。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題） 免疫学的アッセイ法は、種々の臨床応用に非常に有用で
あることがわかっている。そのようなアッセイは、免疫
グロブリン（抗体）と特異的抗原決定基を示す物質（抗
原）とのあいだの特異的結合反応によるものである。抗
体は、抗原性を示すリガンド物質と選択的に結合する。
抗体は、抗原性を示すリガンド物質と特異的に反応し、
似た性質を有する他の物質から該リガンドを識別するこ
とができる。
免疫学的または他の特異的結合反応は直接的には観察で
きないことがしばしばあるので、そのような直接観察で
きないことのため種々の技術が工夫されている。そのよ
うな技術には、特異的結合ペアの一方を放射性同位元
素、発色団、蛍光団または酵素標識で標識することが含
まれる。放射性標識、発色団および蛍光団は放射線検出
器、分光光度計を用いて、または肉眼で検出することが
できる。特異的結合ペアの一方が酵素標識を付されてい
るときは、染料などの化合物が活性化されて検出可能な
シグナルを生じる反応システムの酵素的活性化により検
出することができる。
免疫学的特異的結合アッセイとしては、３つのタイプが
よく知られている。競合結合アッセイ法では、標識試薬
と非標識分析対象化合物とが結合物質上の結合部位に対
して競合する。インキュベーション期間の後、未結合物
質を洗い落とし、試料溶液中の分析対象物の濃度を決定
するために、結合部位に結合した標識試薬の量を標準量
と比較する。
免疫学的アッセイの第二のタイプはサンドイッチアッセ
イ法として知られているもので、一般に、分析対象物に
対し免疫学的に特異的な第一の結合物質を示す表面に分
析対象物の試料溶液を接触させることを含む。洗浄工程
の後、検出すべき分析対象物に特異的に反応する第二の
標識結合物質を含む溶液をアッセイに加える。この第二
の標識結合物質は、それ自身第一の結合物質と結合した
すべての分析対象物と結合するであろう。ついでアッセ
イシステムを洗浄工程に付して、分析対象物と結合しな
かった第二の標識結合物質をすべて取り除く。ついで残
った標識物質の量を測定するが、これは試料中に存在す
る分析対象物の量を表示するものであろう。「サンドイ
ッチアッセイ」という用語からしばしば理解されている
のは、第一の結合物質と標識試薬とが共に抗体かまたは
共に抗原であって「サンドイッチ」が抗体／抗原／標識
抗体の形であるような免疫学的アッセイに関連するもの
だとされているようであるが、サンドイッチアッセイと
いう語のより広い定義は他のタイプの３成分アッセイ法
を含むものであって、これには抗原／抗体／標識（抗免
疫グロブリン）のような形の「間接サンドイッチ」と称
されるものが含まれる。
免疫学的アッセイ法の第三のタイプは凝集アッセイ法で
あり、その代表例はよく知られた血液抗原と血清タイプ
のアッセイである。血清中の抗体と赤血球上に示された
抗原とのあいだの免疫学的反応は、抗原（赤血球）と抗
体との三次元的に架橋した網目構造の生成によって示さ
れる。血清／赤血球混合物の凝集によりテストウエル中
に巨視的なペレットを生成する結果となり、これは肉眼
でも見ることができる。
このような種々のイムノアッセイ法は、もともと試験管
のような装置中で「液相」アッセイとして行なわれたも
のであり、抗原／抗体結合体は遠心分離され沈でんされ
た。もっと近年になると、抗体または抗原をマイクロタ
イターウエルの表面上にコーティングし、そのようなウ
エルの溶液中で反応を行う方法が開発された。また「固
相」アッセイを行うための方法も開発され、それは多孔
質や繊維状物質を含む固体基体上の溶液中で免疫学的反
応を行うものである。そのような固相法では、多孔質担
体物質は細長い小片や他の形態に形作り、これに吸着、
吸収または共有結合により抗体または抗原を固定化す
る。固定化した結合ペアの一方と特異的反応性の分析対
象物を含有する試料物質を担体物質に加えると、分析対
象物は対応する結合ペアの一方との反応により固定化さ
れる。ついで反応しなかった試料物質は洗浄工程により
除き、その後、サンドイッチ型アッセイの場合には、標
識試薬を担体物質に加える。担体物質は、固定化された
分析対象物と反応し該分析対象物により固定化され得
る。ついで、標識試薬、従って分析対象物の存在の有無
を検出できるように担体物質を洗浄する。
「固相」アッセイ法の変形法が知られている。それは、
試料成分または試薬の１つまたはそれ以上をクロマトグ
ラフ溶媒移動により移動させるものである。グラッブ
（Grubb）らの米国特許第4,168,146号明細書には、抗体
が固定化された多孔質試験小片が開示されている。つい
で小片を、測定した量の分析対象抗原含有水溶液と接触
させる。試験溶液中の抗原分子は毛管作用により試験小
片中を移動していくが、結合した抗体はその抗体に特異
的な抗原の移動を遅らせるので、一定時間における抗原
分子の移動の程度は試験溶液中の抗原濃度の関数であ
る。ついで診断装置の抗原含有領域は、酵素または蛍光
発色団標識抗体を加えることにより表示される。
ギーゲル（Giegel）らの米国特許第4,517,288号明細書
には、不活性多孔質物質上で固相イムノアッセイを行う
方法が開示されている。該特許の開示するところによれ
ば、多孔質物質の特定の領域に結合物質を免疫学的に固
定化させ、この固定化結合物質を含有する領域に試料を
添加する。ついで分析対象物と結合する酵素標識指示物
質を該領域に加え、そこで該指示物質は該領域中に分析
対象物の量に相関する量で固定化される。ついで該領域
の中央に溶媒を加えて該領域から未結合標識指示物質を
クロマトグラフ的に除き、該領域中に残留している標識
指示物質の量を測定できるようにする。
本発明に関連するものとしては、ドイチュ（Deutsh）ら
の米国特許第4,094,647号、第4,235,601号および第4,36
1,537号各明細書の開示がある。これらは免疫学的およ
び他のタイプの特異的結合アッセイに関するものであ
り、試薬をクロマトグラフ溶媒移動により移動させるも
のである。一実施態様によれば、放射標識競合結合アッ
セイキットは、毛管現象により展開液体を移動させるこ
とができ試料を加えるための第一ゾーンを有する小片、
展開液体により移動させることが可能な第一試薬を含浸
させた第二ゾーン、および第二試薬を含浸させた第三ゾ
ーンからなる。さらに該装置は測定ゾーンおよび遅延要
素を含んでおり、該遅延要素は第二試薬かまたは小片の
物質であってよい。第一試薬は、（１）試料、（２）試
料および第二試薬、および（３）試料と競合する第二試
薬よりなる群から選ばれたものと反応することができ、
決定しようとする特徴に依存した量の生成物を生じる。
試料を第一ゾーンと接触させ、ついで小片を展開液体中
に含浸させて試料および第一試薬を移動させることによ
り反応生成物を生じさせる。遅延要素は生成物かまたは
第一試薬（移動試薬）の移動を遅らせてこれら二つを特
別に分離させ、ついで移動した要素を測定位置で測定す
る。
ドイチュらの特許は、クロマトグラフ的移動のあいだに
クロマトグラフ物質上に位置する試薬を試料物質および
他の試薬と混合させる方法に関するものである。そうい
った混合は有害なものではなく、競合結合アッセイにと
ってむしろ望ましいものでさえある。しかしながら、サ
ンドイッチ型の結合アッセイでは、非分析対象試料物質
と標識特異的結合試薬とのあいだの接触を避ける必要が
あるので望ましくない。
さらに本発明に関連するものとして、タンパク質固定化
に多孔質ニトロセルロースを使用することに関するゴー
ドン（Gordon）らの米国特許第4,452,901号明細書があ
る。該特許は、固定化されたタンパク質とは異なるタン
パク質であってアッセイにおいて引き続き使用されるい
かなる抗体とも交差反応をしないタンパク質の１または
それ以上のタイプで遮断処理（blocking treatmet）を
することによってニトロセルロースシートの残る結合能
を飽和させることができるならば、イムノアッセイ法に
ニトロセルロースシートを利用することができる旨を開
示している。
本発明の背景技術にさらに関連するものとしては、免疫
学的アッセイを行うための装置に関するゴードンらのEP
O出願第63,810号明細書（1982年11月３日公開）の開示
がある。この装置は、抗原、抗体またはその両方の境界
を定めた吸着領域の前もって選択された配列を含有する
多孔質固体支持体からなり、基体上の残る吸着部位はウ
シ血清アルブミンのようなタンパク質遮断剤で飽和され
ている。多孔質固体支持体としては種々の天然および合
成ポリマーおよびその誘導体から選択することができる
が、孔径が約0.15μｍ〜約15μｍで厚さが0.1mmのニト
ロセルロースシートが好ましい。抗原または抗体を直接
接触させることにより多孔質固体支持体に適用し、つい
で遮断剤とともにインキュベートする。ついで標識抗体
（抗免疫グロブリン抗体であってもよい）を使用するこ
とにより未知の抗原または抗体の検出アッセイを行う。
本件特許出願に特に関連のあるものとしては、ゴードン
らによる共願の米国特許第4,960,691号明細書（1986年
９月29日出願）があり、これは分析対象物および試薬物
質の連続的なクロマトグラフ移動を利用した特異的結合
アッセイを行うための装置に関するものである。洗浄お
よび添加工程は本来的に行うことができ、種々の複数工
程手順を行い試料物質と試薬との未熟混合を避けるため
に液体「微少回路（microcircuitry）」をプログラムす
ることができる。小片物質を処理するための好ましい遮
断溶液には、TBS溶液（0.15M NaCl、0.02トリス−HCl、
pH7.6）中の１％LBゼラチン（イノテック、ボーレン、
スイス）または生理食塩水中の３％ウシ血清アルブミン
（BSA）溶液が含まれる。
とりわけゴードンらの連続移動に関する出願は、試料中
の分析対象物の検出のための試験小片からなる装置に関
し、該試験小片は、選択したクロマトグラフ溶媒により
非固定化試薬および反応性成分をすみやかにクロマトグ
ラフ溶媒移動させることのできる一定の長さのクロマト
グラフ物質からなる。上記小片は、クロマトグラフ移動
が開始される第一の末端、クロマトグラフ移動が終了す
る第二の末端、およびこの二つの末端のあいだに位置す
る複数のゾーンを含む。上記ゾーンには、第一のゾーン
（第一の試薬で含浸されており、この第一の試薬は溶媒
中を可動であり、分析対象物と反応性があり、分析対象
物が固定化された状態にあるときは分析対象物により溶
媒移動に対して固定化されることができる）、第二のゾ
ーン（分析対象物を含有すると思われる試料を加えるた
めのもの）および第三のゾーン（第一のゾーンの下流に
位置し、第二の試薬で含浸されていて、該第二の試薬は
溶媒移動に対して固定化されており、分析対象物と選択
的に反応することができることにより該第三のゾーンに
おいて分析対象物を固定化させることができる）が含ま
れる。この装置はさらに次のようにして特徴付けられ
る。すなわち、試料を第二のゾーンに加えた後、第一の
末端をクロマトグラフ溶媒中に浸すと、分析対象物と第
一の試薬の相対的な移動度、または第二のゾーンと第三
のゾーンの相対的な位置関係は、分析対象物は第一の試
薬が第三のゾーンに達する前に第三のゾーンに配置され
て溶媒移動に対して固定化され、そのことによって第一
の試薬と反応性の妨害性の試料成分および非分析対象物
成分が、第一の試薬の第三のゾーンへの移動に先立つク
ロマトグラフ溶媒の移動により第三のゾーンから取り除
かれる。第三のゾーンに固定化された第一の試薬の存在
は、酵素、放射性同位元素または他の標識により検出す
ることができる。この装置は酵素標識試薬に使用するの
に特に適しているが、それは酵素基質および指示染料試
薬が小片上の異なるゾーンで用いられクロマトグラフ移
動により第三のゾーンへ適当な順序で移動されるからで
ある。
さらに本発明に関連するものは、イムノアッセイ手順に
コロイド粒子の分散液を用いるものに関する文献であ
る。フレンス（Frens）のNature、241、20〜23（1973）
には、塩化金をクエン酸ナトリウム水溶液で還元するこ
とによる種々の粒径の金ゾルの単一分散液の調製方法が
開示されている。粒子の核形成のあいだのクエン酸ナト
リウムの濃度を変化させることにより得られるゾルの粒
径を変化させることができる。単一分散された金粒子の
ゾルは、16nm〜約150nmの範囲の粒径を有し、その粒径
範囲でオレンジ色〜赤色〜すみれ色にわたる色を呈する
ことが開示されている。
ロマノ（Romano）らのImmunochemistry、11、521〜22
（1974）には、電子顕微鏡でヒト赤血球抗原の像を得る
のに使用するために免疫グロブリンをコロイド状金粒子
で標識することが開示されている。金粒子（平均粒径；
約3nm）はフロキュレートする傾向があるが、ウマ血清
またはBSAの存在により安定化させることができる。
ゲオグヘーガン（Geoghegan）らのJ.Immuno.Meth.、3
4、11〜21（1980）には、受身凝集法に用いるためにコ
ロイド状金粒子を免疫グロブリンでコーティングするこ
とが開示されている。該文献（14頁）には、遠心分離し
てプールした金標識免疫グロブリンを１％ポリエチレン
グリコール（PEG）を含有する0.01Mリン酸バッファー食
塩水（PBS）（pH7.2）に再懸濁させることが開示されて
いる。該文献にはまた、金タンパク質複合体は遠心分離
のあいだには凝集しないが、マイクロタイター中の系列
希釈タンパク質の存在下で非特異的凝集を起こすことが
しばしばあると記載されている。
スレク（Surek）らのBiochem.and Biophys.Res.Comm.12
1、284〜289（1984）には、ニトロセルロース膜上に固
定化された特定の抗原を検出するためにプロテインＡ標
識コロイド状金粒子を用いることが開示されている。こ
の方法によれば、電気泳動ゲルをニトロセルロースフィ
ルター上にブロッティングし、ついでこれをPBS中の２
％BSA溶液で処理して非特異的結合を防ぐ。該フィルタ
ーを希釈抗血清または免疫前血清で処理しPBS−BSAで洗
浄する。ついで小片をコロイド状金の結合したプロテイ
ンＡとともに30〜60分間インキュベートすることにより
結合抗体の存在を検出することができる。ついでバッフ
ァーで数回短時間洗浄することにより、過剰の未結合コ
ロイド状金粒子を取り除く。
レーベリング（Leuvering）の米国特許第4,313,734号明
細書には、水性試験媒質中の免疫学的成分をインビトロ
決定するために金属ゾル粒子を用いることが開示されて
いる。特に開示されているのは抗原または抗体の検出用
試験キットであり、これは粒径が少なくとも5nmの金
属、金属化合物、または金属もしくは金属化合物でコー
ティングされたポリマー核の水性ゾル分散液の粒子に免
疫学的成分を結合させることにより得られた１またはそ
れ以上の標識成分を用いるものである。その１実施例に
よれば、ヒト胎盤性ラクトゲン（HPL）のアッセイを、
金粒子で標識したウサギ抗HPL抗体を用いて行ってい
る。メルチオレートを加えたBSA溶液およりリン酸バッ
ファーとともにインキュベートすることにより、マイク
ロタイタープレートウエル上に非標識ウサギ抗HPL抗体
をコーティングする。HPLの標準溶液をウエルに加え、
室温で２時間インキュベートする。粒径45〜70nmの金粒
子を結合したウサギ抗HPL抗体からなる溶液をウエルに
加え、室温で一夜インキュベートする。ついでウエルを
洗浄し、小容量分光光度計で光吸収を測定する。
スー（Hsu）のAnal.Biochem.142、221〜225（1984）に
は、ブロッティングイムノアッセイ法にイムノ金マーカ
ーシステムを用いることが開示されており、それによる
と精製タバコモザイクウイルス（TMV）をポリアクリル
アミドゲル中で電気泳動させ、ついでニトロセルロース
フィルターシート上に電気的に移す（electrotransferr
ed）。ニトロセルロースシートは焼き固めて結合を安定
化させ、５％通常ヤギ血清またはPBS中の0.05％ツイー
ン20で処理して非特異的な抗体結合を阻止する。フィル
ターは遮断溶液中に希釈したウサギ抗TMV抗体とともに
４℃で一夜インキュベートし、PBS中で洗浄し、ついで
フィルターを遮断溶液中の金標識ヤギ抗ウサギIgG中に
浸すことにより抗原−抗体複合体を検出する。この方法
に従えば、金標識IgGに30分間浸すことにより8nmもの少
量のTMVタンパク質を検出することができる。該文献に
はまた、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリド
ンおよびウシ血清アルブミンなどの薬剤が金マーカーの
安定性を高め得ることを開示している。ニトロセルロー
ス上のタンパク質の非特異的結合を防ぐためにツイーン
20を使用することが、金−IgG複合体の特異性を損なう
ことなくPBS中の0.05％ツイーン20を色付け手順に用い
ることができるとの観察とともに開示されている。通常
ヤギ血清は、貯蔵のあいだにプローブから解離するかも
しれない金粒子を吸着する傾向があるので好ましい遮断
剤とされる。
モアマンズ（Moremans）らのEPO出願第158,746号明細書
には、サンドイッチブロッティングオーバーレイアッセ
イにおいてコロイド状金属粒子を標識として用いること
が開示されている。検出すべき分析対象物に対し特異的
反応性を有する特異的結合物質をニトロセルロース小片
に適用し乾燥させる。ついで小片上のタンパク質結合部
位をウシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリエチレングリ
コールまたはツイーン20で処理することにより遮断す
る。ついで分析対象物を含有する試料を小片に適用し、
２時間インキュベートする。処理した小片を洗浄し空気
乾燥し、コロイド状金属粒子で標識した特異的結合剤と
ともに２時間インキュベートする。一実施例によれば、
抗チューブリン抗体の検出をピンク〜赤味がかった色
（20nm粒子）ないし紫がかった色（40nm粒子）を生じる
金粒子標識試薬により行う。このアッセイは5ng/μｌの
オーダーの感度を有することが開示されている。
さらに本発明に関連のあるものとして、放射性化学物質
のクロマトグラフ精製に関するホイ（Hoye）のJ.Chroma
tog.28、379〜384（1967）の開示がある。金イオンを移
動させるためにペーパークロマトグラフィー、薄層クロ
マトグラフィーおよび高電圧電気泳動を応用することが
開示されており、その成功の程度は様々であるが、一般
にコロイド状金粒子を移動させるには適していない。
コロイド状の重合染料物質を特異的結合アッセイに用い
ることも知られている。本件出願に関連するものはハー
シュフェルド（Hirschfeld）の米国特許第4,166,105号
明細書である。該特許は、反応性官能基を含有するポリ
マーにより蛍光染料分子を分析対象物特異的抗体に結合
して調製した、特異的抗原に反応性の標識特異的結合試
薬に関するものである。また本件出願に関連するものと
してヘンリー（Henry）の米国特許第4,452,886号明細書
の開示がある。該特許は特異的結合試薬に関するもの
で、これは実質的に40〜600個の発色団または蛍光基含
有モノマーからなる水溶性ポリマーに結合させた抗原ま
たは抗体からなる。
（課題を解決するための手段） 本発明は、クロマトグラフ的に可動な標識物質を利用し
た改良された特異的結合アッセイ法、キットおよび装置
を提供するものである。本発明の一つの態様によれば、
クロマトグラフ的に可動で視覚的に検出可能なシグナル
を生じ得る、コロイド粒子標識特異的結合物質を利用し
た方法および装置が提供される。本発明の他の態様にお
いては、コロイド粒子標識物質を含む標識した特異的結
合物質、および酵素標識物質を利用した方法および装置
が提供される。該酵素標識物質は、準可溶性タンパク質
の存在下でクロマトグラフ媒体上に乾燥させたものであ
り、試料やクロマトグラフ移動溶媒などの適当な溶媒の
存在下ですみやかに再可溶化することができる。
金などのコロイド粒子で標識した特異的結合物質は、選
択した溶媒およびクロマトグラフ移動促進剤によりクロ
マトグラフ媒体上でのすみやかなクロマトグラフ移動に
供することができ、クロマトグラフ溶媒移動アッセイ技
術を利用することによりコロイド粒子標識物質とその特
異的結合の相手との結合反応に要する時間が従来の方法
に比べて有為に短縮されることがわかった。また、カゼ
インのような準可溶性タンパク質を含む水溶性媒質の存
在下、標識および非標識物質を含む不安定なタンパク質
で固体基体物質を含浸させることにより、そのような基
体物質上に乾燥された上記タンパク質をすみやかに再可
溶化することができることもわかった。かくのごとく再
可溶化された標識物質は、ついで液相アッセイまたは電
子顕微鏡観察を行うために液体溶液中に保存することが
できる。従って、準可溶性タンパク質の存在下で不安定
なタンパク質を乾燥させることはコロイド粒子標識試薬
を含むそのようなタンパク質を安定で便利な形態で貯蔵
するための安価な手段を提供するものであり、ついでこ
の形態から再可溶化させクロマトグラフ溶媒移動に供す
ることができる。別法において、固体基体物質がクロマ
トグラフ媒体である場合は、不安定なタンパク質は再可
溶化させクロマトグラフ的に移動させて特異的結合アッ
セイ手順を行うことができる。
従って、本発明は試料中の分析対象物の存在の有無およ
び量を決定するための改良された特異的結合アッセイ装
置、キットおよび方法を提供するものである。コロイド
粒子標識アッセイでは視覚的に検出可能なシグナルが得
られ、放射性同位元素や酵素標識の使用ならびにそれら
に付随して必要となる検出装置や酵素結合体および指示
染料の添加などの必要がなくなる。競合結合アッセイお
よび直接結合（サンドイッチ型）アッセイの両方を行う
ための手段が本発明により提供される。試料中の分析対
象物の存在の有無および量を決定するための好ましいア
ッセイ法およびキットは、コロイド粒子標識物質および
クロマトグラフ移動促進剤を試料と混合することにより
提供される。ついでクロマトグラフ媒体に沿って試料お
よび標識物質をクロマトグラフ的に移動させ所望のアッ
セイを行うために、アッセイを行うのに有用な１または
それ以上の試薬を含浸させた１またはそれ以上の反応部
位からなるクロマトグラフ媒体を、試料、コロイド粒子
標識物質およびクロマトグラフ移動促進剤の混合物と接
触させる。
本発明はまた、準可溶性タンパク質の存在下、コロイド
粒子標識物質および酵素標識物質を含む標識物質を、ク
ロマトグラフ基体物質上の反応部位に含浸させ乾燥させ
ることを特徴とするアッセイ方法および装置をも提供す
る。この装置のクロマトグラフ媒体は１またはそれ以上
の反応部位を含んでおり、該反応部位では化学反応自体
が起こることは必要ないが、別の物質を含ませるかもし
くは固定化するかまたは分析対象物質を含有する試料を
含ませる。クロマトグラフ媒体はクロマトグラフ溶媒と
接触させると、クロマトグラフ溶媒は試料物質や他の任
意の物質や試薬と同様にコロイド粒子標識特異的結合物
質を可溶化しクロマトグラフ媒体に沿って移動させる。
固定化された特異的結合試薬の親和性は、流動物質中の
標識物質を有効に捕捉して標識結合成分がゾーン中に集
積するようにする。標識物質がコロイド粒子標識物質で
ある場合には、標識結合成分が捕捉ゾーンに集積し非濃
縮コロイド粒子標識物質のバックグラウンド流に対して
明確に識別できるような仕方で流動クロマトグラフ流中
の標識成分を固定化試薬が捕捉することができるような
固定化試薬の結合親和性であるという点において、重要
な利点が本発明により提供されるものである。
（発明の概要） 以下に本発明をさらに詳しく説明する。
本発明は、クロマトグラフ的に可動な標識特異的結合物
質を利用した改良された免疫学的および他の特異的結合
アッセイ法、キットおよび装置を提供するものである。
コロイド粒子標識特異的結合物質は非常に凝集しやすい
ものであるため、一般にクロマトグラフ溶媒移動アッセ
イ法によってはクロマトグラフ媒体上を急速かつ有効に
移動させることができないものである。本発明は、コロ
イド粒子、とりわけ、特に凝集しやすい粒径が約1nmよ
りも大きいコロイド粒子で標識した特異的結合物質を、
選択した溶媒およびクロマトグラフ移動促進剤によりク
ロマトグラフ媒体上のすみやかなクロマトグラフ移動に
供することができるという発見に基づくものである。コ
ロイド粒子、とりわけ粒径が約1nm未満のコロイド粒子
で標識した物質では本発明のクロマトグラフ移動促進剤
が不在であってもクロマトグラフ移動を行うことができ
るのであるが、そのようなクロマトグラフ促進剤を用い
ることで本発明のすべてのコロイド粒子標識試薬のすみ
やかなクロマトグラフ移動をより容易にすることができ
る。関連した発見として、コロイド粒子標識物質のクロ
マトグラフ溶媒移動により、そのような物質とその特異
的結合の相手との結合反応に要する時間が従来の方法に
比べて有為に短縮されることがわかった。レーベリング
の米国特許第4,313,734号明細書のような従来のイムノ
アッセイ法ではコロイド粒子標識特異的結合物質を１時
間から一夜（16時間）インキュベートすることが教示さ
れているのに対し、本発明のクロマトグラフ法では一般
に約５分未満、好ましくは約２分未満でクロマトグラフ
移動および特異的結合反応が急速に完了する。
さらに本発明の他の態様において、コロイド粒子、酵素
や他の標識物質を含む不安定なタンパク質性物質は、選
択した準可溶性タンパク質物質の存在下で固体基体物質
上に含浸させ乾燥させると適当な溶媒によりすみやかに
可溶化できることがわかった。固体基体物質がクロマト
グラフ媒体である場合は、標識物質は選択したクロマト
グラフ溶媒によりすみやかに再可溶化されクロマトグラ
フ媒体に沿って移動する。この発見の結果、本発明の特
異的結合アッセイ装置が提供されるが、この装置では、
コロイド粒子標識特異的結合物質を含む標識物質が乾燥
した安定な形態で装置上に組み込まれ、アッセイを行う
にはわずかに試料物質とクロマトグラフ溶媒が必要なだ
けである。
本発明に従えば、コロイド粒子標識物質を含む溶液を用
いた方法により、試料中の物質を分析するためのキット
を調製し特異的結合アッセイ法を行うことができる。本
発明の方法はまたクロマトグラフ媒体を用いるものであ
り、該クロマトグラフ媒体は毛管現象を示し、選択した
クロマトグラフ溶媒により非固定化試薬および反応性試
薬成分をクロマトグラフ溶媒移動させることができ、固
定化試薬を含む反応部位を含む。該固定化試薬は、分析
すべき物質およびコロイド粒子標識物質よりなる群から
選ばれたものと結合することができる。本発明の方法
は、（ａ）分析すべき試料をクロマトグラフ媒体に接触
させ、（ｂ）該クロマトグラフ媒体上で該コロイド粒子
標識物質を移動させることによって該コロイド粒子標識
物質の少なくとも一部を反応部位に移動させて結合反応
させ、ついで（ｃ）試料中の分析対象物の存在の有無お
よび量を表示するため反応部位で該コロイド物質により
生じた検出可能な応答を決定する、ことからなる。
本発明の好ましい実施態様に従えば、固定化試薬および
試薬と試料物質の濃度は、コロイド粒子標識物質が反応
部位に集積し非濃縮コロイド粒子標識物質のバックグラ
ウンド流に対して検出できるように当業者が選択するこ
とができる。そうでない場合には、クロマトグラフ媒体
を洗浄またはすすぎ工程に供して未結合標識物質を取り
除くことができる。そのような洗浄工程は、共願の米国
特許第4,960,691号明細書に記載の手順に従っても行う
ことができる。
また分析すべき試料、コロイド粒子標識物質、クロマト
グラフ溶媒ないし他の溶媒および試薬は、それらをクロ
マトグラフ媒体に接触させる前に種々の可能な組合わせ
に従ってお互いに混合することができること、およびこ
れらの混合物および種々の成分は、当業者には明らかな
ように種々の順序でクロマトグラフ媒体に接触させるこ
とができることを理解しなければならない。さらに、ク
ロマトグラフ溶媒の代わりに試料またはコロイド粒子標
識物質含有溶液を用いることができ、その場合はこれら
が、試薬の固定化されている反応部位にコロイド粒子標
識物質を移動させることができることを理解しなければ
ならない。また共願の米国特許第4,960,691号明細書に
記載の方法に従ってクロマトグラフ溶媒を使用し、未反
応標識物質および他の固定化試料成分を試薬の固定化さ
れている反応部位から洗浄して除くことができることも
理解しなければならない。試薬を含ませている反応部位
で標識物質をクロマトグラフ媒体と接触させるときに
は、コロイド粒子標識物質と他の特異的結合試薬とのあ
いだの結合反応を促進するため、および非固定化標識物
質をゾーンから洗浄して除くためにクロマトグラフ溶媒
移動を利用することができる。
本発明の好ましい実施態様では、指示溶液がクロマトグ
ラフ移動促進剤をさらに含んでおり、この指示溶液と試
料を混合しクロマトグラフ媒体と接触させて分析対象物
質および標識特異的結合物質のクロマトグラフ移動を行
う。本発明の他の実施態様では、アッセイ装置において
試薬の固定化されている反応部位の上流側の１つまたは
それ以上の反応部位に試料物質およびコロイド粒子標識
物質を接触させ、クロマトグラフ媒体をクロマトグラフ
溶媒に接触させて試料および標識物質を第二の試薬が固
定化されている反応部位に移動させる。
サンドイッチ型アッセイは、コロイド粒子標識物質が分
析対象物との特異的結合反応に参与し得るような方法に
より行うことができる。競合結合アッセイ法もまた、コ
ロイド粒子標識物質が固定化試薬との特異的結合反応に
参与し得るようにして行うことができる。第二の試薬を
含ませた第二の反応部位をクロマトグラフ媒体が含むよ
うなキットを調製し方法を行うことができる。該第二の
試薬は溶媒移動に対して固定化されており、コロイド粒
子標識物質との選択的な反応を行うことによって該コロ
イド粒子標識物質を固定化された形で該第二の反応部位
に提供し、そこで該コロイド粒子標識物質を検出するこ
とができる。サンドイッチ型のアッセイでは、第二の反
応部位におけるコロイド粒子標識物質の存在はコントロ
ールとして働き、第一の試薬の反応性を確証する。競合
結合アッセイでは、第二の反応部位におけるコロイド粒
子標識物質の存在は、分析対象物質と固定化試薬とのあ
いだの競合の程度を示している。
本発明による他の方法および装置として、標識特異的結
合物質（コロイド粒子標識物質および酵素標識物質を含
むが、これらに限られるものではない）をアッセイ装置
のクロマトグラフ媒体に乾燥した状態で組み込み、これ
をすみやかに再可溶化させて選択クロマトグラフ溶媒に
よりクロマトグラフ媒体に沿ってクロマトグラフ的に移
動させるものがある。そういった特異的結合アッセイ装
置は、毛管現象を示し、選択したクロマトグラフ溶媒に
より１つまたはそれ以上の非固定化試薬および反応性試
料成分をクロマトグラフ溶媒移動させることができるク
ロマトグラフ媒体からなる。この装置はまた、準可溶性
タンパク質の存在下でコロイド粒子標識物質を含浸させ
乾燥させたものであって、該コロイド粒子標識物質はす
みやかに可溶化することができ該溶媒中をクロマトグラ
フ溶媒移動することができるものを含む第一の反応部
位、および該分析対象物および該コロイド粒子標識物質
よりなる群から選ばれたものを結合し得る試薬が固定化
された第二の反応部位をも含む。この装置は、（ａ）試
料をクロマトグラフ媒体と接触させ、（ｂ）該コロイド
粒子標識物質を可溶化させ、該コロイド粒子標識物質の
少なくとも一部を該第二の反応部位までクロマトグラフ
的に移動させて結合させ、ついで（ｃ）試料中の該分析
対象物の存在の有無または量を表示する手段として、該
第二の反応部位で該コロイド粒子標識物質により生じた
検出可能な応答を決定する、ことにより用いることがで
きる。
分析すべき試料はクロマトグラフ溶媒と混合することが
でき、この両者の混合物にクロマトグラフ媒体を接触さ
せることができることも理解しなければならない。さら
に、クロマトグラフ溶媒の代わりに該試料を用いること
もでき、該試料は該固定化された第一の試薬を可溶化す
ることができ、第二の試薬を含ませた第二のゾーンまで
それ自身と該標識第一試薬をクロマトグラフ的に移動さ
せることができる。
本発明の好ましい実施態様は、クロマトグラフ溶媒の代
わりに試料を用いたものであり、該試料は乾燥標識物質
を可溶化することができ、固定化試薬を含む第二の反応
部位まで分析対象物質および標識物質を移動させること
ができるものである。
サンドイッチ型のアッセイは、標識物質が分析対象物質
との特異的結合反応に参与し得るような方法により行う
ことができる。競合結合アッセイもまた、標識物質が固
定化試薬との特異的結合反応に参与し得るようにして行
うことができる。第三の試薬を含ませた第三の反応部位
をクロマトグラフ媒体が含むようなキットを調製し方法
を行うことができる。該第三の試薬は溶媒移動に対して
固定化されており、標識物質との選択的な反応を行うこ
とによって該標識物質を固定化された形で該第三の反応
部位に提供し、そこで該標識物質を検出することができ
る。サンドイッチ型のアッセイでは、第三の反応部位に
おける標識物質の存在はコントロールとして働き、標識
物質の反応性を確証する。競合結合アッセイでは、第三
の反応部位におけ標識物質の存在は、分析対象物質と標
識試薬とのあいだの競合の程度を示している。
本発明はまた、抗体、抗原、酵素標識特異的結合物質お
よびコロイド粒子標識特異的結合物質を含む不安定なタ
ンパク質を安定に貯蔵する方法をも提供するものであ
り、該タンパク質物質は適当な溶媒を加えることによっ
てすみやかに可溶化することができる。この方法は、準
可溶性タンパク質を含有する水性媒質の存在下、基体上
で好ましくは空気流のもとでタンパク質物質を乾燥させ
ることからなる。得られた生成物は、準可溶性タンパク
質を含有する水性媒質の存在下、不安定なタンパク質を
含浸させ乾燥させた固体基体からなる。一般に上記基体
はガラスやプラスチックなどのいかなる固体物質であっ
てもよいが、紙やニトロセルロースなどの多孔質または
繊維状マトリックスが好ましい。固体基体は、小片（ス
トリップ状）、ペレット、試験管壁やマイクロタイター
ウエルなどの種々の形態であってよい。準可溶性タンパ
ク質、好ましくはカゼインを含有する水溶液は、ポリエ
チレングリコール、ゼラチン、ウシ血清アルブミンおよ
び界面活性剤などのクロマトグラフ移動促進剤を任意に
含むことができる。
混合操作アッセイ装置（サンドイッチ型） 本発明の一実施態様に従えば、特異的結合アッセイを混
合操作（mix and run）技術により行うことができ、こ
の方法では、クロマトグラフ移動促進剤中に溶解させた
コロイド粒子標識第一特異的結合試薬からなる指示溶液
を分析対象物質含有試料と混合する。ついで試料と指示
溶液との混合物に本発明のアッセイ装置を浸し、第二の
試薬が固定化された第一のゾーンまで該混合物をクロマ
トグラフ的に移動させる。サンドイッチ型アッセイ法の
一実施態様に従えば、第一および第二の試薬は分析対象
物質と特異的に結合することができる。この実施態様で
は、標識した第一の試薬は分析対象物と混合した後で該
分析対象物質と結合する。標識した第一の試薬と分析対
象物質との結合体は、ついで第二の試薬との反応により
固定化に供され、第一のゾーンで視覚的に検出可能なシ
グナルを生じる。分析対象物質が存在していないと、標
識した第一の試薬は該ゾーンで結合せず、従ってシグナ
ルも生じないであろう。別のサンドイッチ型アッセイ法
は、標識した第一の試薬と特異的に反応する第三の試薬
を、コントロールを提供すべく第二のゾーンに固定化さ
せることによって行うことができる。さらに他の競合型
アッセイ法および装置が本発明によって提供され、それ
は固定化された第二の試薬が分析対象物質および標識し
た第一の試薬の両方と結合することができ、これらが固
定化試薬との結合において競合するものである。
以下、図面を参照しながら説明すると、第1a図、第1b図
および第1c図は試料液体中の分析対象物質を検出するた
めの試験装置10を示している。これは一定の長さのクロ
マトグラフ基体物質11からなり、該基体物質11にはクロ
マトグラフ溶媒移動が開始される第一の末端、クロマト
グラフ移動が終了する第二の末端15、および第二の試薬
を含浸した第一のゾーン13がある。該第二の試薬は溶媒
移動に対して固定化されており、分析対象物を固定化し
た形態で提供することができるように分析対象物と選択
的に反応し得るものである。この装置はさらに、クロマ
トグラフ物質11の全長にわたって添付した不活性な支持
小片（ストリップ）12を含む。
この装置10を使用する手順に従い、一定量の試料を、コ
ロイド粒子で標識した第一の試薬およびクロマトグラフ
移動促進剤からなる指示溶液と混合する。試料に加える
指示溶液中に含まれるクロマトグラフ移動促進剤の量お
よび濃度は、凝集を防ぎ、しかもコロイド粒子標識結合
試薬のすみやかなクロマトグラフ溶媒移動が得られるよ
うに選択する。サンドイッチ型の混合操作アッセイにお
いては、標識した第一の試薬は分析対象物質と反応して
特異的に結合する。ついで試料と指示溶液の混合物17を
入れた溶液16に試験装置10の第一の末端14を浸すと、標
識第一試薬／分析対象物質結合体を含む試料／指示溶液
混合物はクロマトグラフ物質11中を通って第一のゾーン
13へ進んでいく。第一のゾーン13に固定化された第二の
特異的結合試薬もまた分析対象物質と特異的に反応する
ことができ、分析対象物または第一試薬／分析対象物結
合体と反応して該第一のゾーン13に固定化されるであろ
う。しかしながら、クロマトグラフ溶媒移動は、分析対
象物と結合しなかった標識した第一の試薬が第一のゾー
ン13に固定化されなかった指示溶液物質とともに該ゾー
ンから移動し去っていくようにして行なわれる。クロマ
トグラフ溶媒移動は、試料／指示溶液混合物がなくなる
まで、または試料／指示溶液のフロントが装置中の第二
の末端15に達するまで続けられる。
試料中の存在する分析対象物は標識した第一の試薬と結
合して第一のゾーン13にクロマトグラフ的に移動し、そ
こで第二の試薬との特異的反応により固定化される。試
料中に充分な量の分析対象物が存在する場合には、こう
して第一のゾーン13に固定化されたコロイド粒子の総数
は視覚的に検出可能なシグナルを生じるようなものとな
るであろう。もちろん、試料中に分析対象物が存在しな
い場合には分析対象物も標識した第一の試薬も第一のゾ
ーンに固定化されることなく、従ってシグナルも生じな
いであろう。
混合操作アッセイ装置（競合型） 第１図に示した装置10は、競合型の特異的結合アッセイ
を行うように変更することができる。特に、固定化した
第二の試薬との結合に対し分析対象物と競合するように
コロイド粒子標識第一試薬を選択することができる。以
下、図面に沿って説明すると、第1a図〜第1c図は混合操
作競合型アッセイを行うための試験装置を示している。
競合型アッセイにおいて、装置そのものおよび固定化し
た第二の試薬の本体はサンドイッチ型アッセイのものと
同じである。両アッセイにおける唯一の違いは、コロイ
ド粒子標識第一試薬物質の本体にある。本発明のサンド
イッチ型アッセイキッドにおいて標識第一試薬は分析対
象物と特異的に反応するのに対し、競合型アッセイでは
標識第一試薬はアッセイすべき分析対象物の特異的結合
類似体であり、分析対象物と競合して固定化した第二の
試薬と特異的に反応する。
この装置10を使用する手順に従い、一定量の試験すべき
試料を、クロマトグラフ移動促進剤存在下のコロイド粒
子標識第一試薬からなる指示溶液と混合する。ついで試
料と指示溶液の混合物17を満たした容器16中に試験装置
10の第一の末端14を浸す。標識した第一の試験および分
析対象物を含む試料／指示溶液混合物は、クロマトグラ
フ基質物質11中を通して第一のゾーン13へと進んでい
く。ついで標識した第一の試薬および分析対象物は、第
一のゾーン13に固定化された第二の特異的結合試薬と結
合することについて競合する。しかしながら、クロマト
グラフ溶媒移動は、固定化した第二の試薬と特異的に結
合しない分析対象物およびコロイド粒子標識第一試薬物
質が、クロマトグラフ溶媒により第一のゾーン13から除
かれるようにして行なわれる。クロマトグラフ溶媒移動
は、試料／指示溶液がなくなるまで、または試料／指示
溶液のフロントが装置中の第二の末端15に達するまで続
けられる。
試料中に存在する分析対象物の量は、第一のゾーン13に
結合する標識した第一の試薬の量を決定するであろう。
試料中に存在する分析対象物の量を決定するために、標
識した第一の試薬の量および／または結合親和性を調節
することができる。
別の混合操作（サンドイッチアッセイ） 本発明の他の実施態様に従えば、コントロール機能を備
え、特定の分析対象物の検出のために陽性と陰性のシグ
ナルを与えるようなサンドイッチ型アッセイ用装置およ
びキットが提供される。以下、図面を参照しながら説明
すると、第2a図〜第2c図は一定の長さのクロマトグラフ
基体物質21からなる試験装置20を示している。該クロマ
トグラフ基体物質21には、クロマトグラフ溶媒移動が開
始される第一の末端25、およびクロマトグラフ溶媒移動
が終了する第二の末端26がある。この装置はまた第一の
ゾーン23を含み、これは分離され２またはそれ以上の領
域に分割され第二の試薬を含浸されている。該第二の試
薬は溶媒移動に対して固定化され、分析対象物を固定化
された形態にすべく分析対象物と選択的に反応すること
ができる。この装置20はまた第三の試薬を含浸した第二
のゾーン24をも含み、該第三の試薬は溶媒移動に対して
固定化されコロイド粒子標識第一試薬と選択的に反応す
ることができる。
第一のゾーン23および第二のゾーン24は、それらの一方
のみが、または両方が固定化試薬を含んでいるときに識
別できる形のシグナルが得られるように形づくることが
できる。たとえば、第一のゾーン23および第二のゾーン
24の形は、第2a図に示すように、第二のゾーン24のみに
標識を固定化したときはマイナス（−）の記号が示され
るようにすることができる。一方、第一のゾーン23およ
び第二のゾーン24の両方で標識が固定化されたときはプ
ラス（＋）の記号が示される。
検出すべき分析対象物に対して特異的に反応する試薬を
含浸した第一のゾーンは、クロマトグラフ流の方向に対
して、本来、垂直の方向に向けられるのが好ましい。こ
れは、分析対象物、従って標識した特異的結合試薬が、
ゾーンのしんがり端よりも先導する端で固定化される傾
向があるためである。細長いゾーンの大きい寸法の方が
クロマトグラフ流の方向に対して平行になるように向け
られていると、ゾーンの先導部は分析対象物の大部分を
捕そくしていまい、その結果、しんがりの端は分析対象
物をほとんど捕そくせず、得られる視覚シグナルは誤解
を招くような形となってしまう。第一のゾーンをクロマ
トグラフ流の方向に対し垂直にすることによって、より
強く識別性があり陽性の検出シグナルが得られる。
この装置20を使用する手順に従い、一定量の試験すべき
試料を、クロマトグラフ移動促進剤存在下のコロイド粒
子標識第一試薬からなる指示溶液と混合する。ついで試
料と指示溶液の混合物28を満たした容器127に試験装置2
0の第一の末端25を浸す。標識第一試薬／分析対象物結
合体を含む試料／指示溶液は、クロマトグラフ基質物質
21中を通して第一のゾーン23および第二のゾーン24へと
進んでいく。第一のゾーン23に固定化された第二の試薬
は分析対象物と特異的に反応するので、分析対象物およ
び分析対象物／標識第一試薬結合体を固定化するであろ
う。さらに第二のゾーン24に固定化された第三の試薬物
質は標識第一試薬と特異的に反応するので、第一試薬お
よび分析対象物／第一試薬結合体を固定化するであろ
う。
試料中に分析対象物が存在すると、指示溶液と試料の混
合物中に分析対象物／標識第一試薬結合体を生成し、該
結合体は第一のゾーン23および第二のゾーン24の両方で
固定化される。従って、本発明の一実施態様によれば、
プラス（＋）の記号および陽性のシグナルが得られる。
試料中に分析対象物が存在しないか閾値未満の量しか存
在しないときは、第二のゾーン24において第一の試薬が
第三の試薬と反応し、該ゾーンで固定化されて目に見え
るシグナルを生じる。分析対象物が存在しないので第一
のゾーン23では何も固定化されずシグナルもなく、ただ
マイナス（−）の記号のみが現れて分析対象物の存在し
ないことを示す。分析対象物の不在を示すことに加えて
第一のゾーン23ではなくて第二のゾーン24でシグナルが
存在することが、標識第一試薬の移動度を示し、本アッ
セイ装置の有用性の観点からコントロールとして働くで
あろう。
別の混合操作（競合型アッセイ） さらに本発明の他の実施態様に従えば、競合型混合操作
アッセイを行うためのアッセイ装置およびキットが提供
される。これは、検出すべき分析対象物およびコロイド
粒子標識第一試薬と特異的に反応する第二の試薬を含浸
した第一のゾーン、および標識した第一の試薬とは特異
的に反応するが分析対象物とは反応しない第三の試薬を
含浸した１またはそれ以上の第二のゾーンからなる。
以下、図に沿って説明すると、第3a図、第3b図および第
3c図は試料液体40中の分析対象物を検出するための試験
装置30を示している。この装置30は一定の長さのクロマ
トグラフ基体物質31からなり、これにはクロマトグラフ
溶媒移動が開始される第一の末端33およびクロマトグラ
フ溶媒移動が終了する第二の末端34がある。第二の末端
34は、必ずしも小片の実際の第二の末端である必要はな
い。装置30はまた第二の試薬を含浸させた第一のゾーン
からなる。この第二の試薬は溶媒移動に対して固定化さ
れており、分析対象物およびコロイド粒子で標識した第
一の試薬よりなる群から選ばれたものと選択的に反応す
ることができる。第一のゾーン35の下流には第二のゾー
ン36が位置しており、これは任意に１以上の領域からな
っていてよく、第三の試薬を含浸させてある。第三の試
薬は溶媒移動に対して固定化されており、標識第一試薬
とは特異的に反応するが分析対象物とは反応しない。こ
の装置にはまた右溶媒仕切り手段37および左溶媒仕切り
手段38が設けられ、これは第一の末端33から第一のゾー
ン35および第二のゾーン36への物質のクロマトグラフ流
を集束させる。両溶媒仕切り手段37および38はまた、第
二の末端34までのクロマトグラフ移動経路を広げること
により、クロマトグラフ基体物質の長さを有効に長くす
る。
この装置30を使用する手順に従い、一定量の試験すべき
試料を、クロマトグラフ移動促進剤の存在下のコロイド
粒子標識第一試薬からなる指示溶液と混合する。第一の
試薬はアッセイすべき分析対象物の特異的結合類似化合
物であり、第一のゾーン35に固定化された第二の試薬と
特異的に反応する。ついで試料と指示溶液の混合物40で
満たした容器39中に試験装置30の第一の末端33を浸す。
標識した第一の試薬および分析対象物を含む試料／指示
溶液混合物は、クロマトグラフ物質31中を通して第一の
ゾーン35へと進んでいく。ついでコロイド粒子標識した
第一の試薬および分析対象物は、第一のゾーン35に固定
化された第二の特異的結合試薬と結合することについて
競合する。しかしながら、クロマトグラフ溶媒移動は、
固定化した第二の試薬と特異的に結合しない分析対象物
および標識した第一の試薬物質がクロマトグラフ溶媒に
より第一のゾーン35から除かれ、第二の末端34の方に向
かって第二のゾーン36へ移動されるようにして行なわれ
る。ついで標識した第一の試薬（検出すべき分析対象物
がヒト抗第二試薬抗体であるときはマウス抗第二試薬抗
体であってよい）を第二のゾーン36に固定化した第三の
試薬（抗マウスIgG抗体であってよい）と反応させる。
第三の試薬は、標識した第一の試薬とは特異的に反応す
るが分析対象物とは反応しない。第三の試薬は標識した
第一の試薬と反応し、第二のゾーン36に固定化して検出
可能なシグナルを生じる。この装置はまた場合によって
さらに「第二のゾーン」を設けることにより、過剰の標
識第一試薬を試料物質と混合し、標識第一試薬が部分的
にまたは全部第一のゾーン35での結合から置換（displa
ced）されたときに、置換の程度を第二のゾーン36での
結合の程度から決定できるようにすることができる。ク
ロマトグラフ溶媒移動および装置中の試料／指示溶液の
進行は、試料／指示溶液がなくなるまで、または溶液の
フロントが右溶媒仕切り手段37行なわれ左溶媒仕切り手
段38の周囲を進行し装置の第二の末端34に達するまで続
けられる。
標識した特異的結合物質を前もって含浸させた装置 本発明のさらに別の実施態様は、クロマトグラフ溶媒移
動を行うことができる標識した特異的結合試薬（コロイ
ド粒子で標識したものおよび酵素で標識したものを含
む）をクロマトグラフ基体物質上に含浸させ乾燥させた
特異的結合アッセイ装置に関する。驚くべきことに、カ
ゼインのような準可溶性タンパク質の存在下で標識特異
的結合試薬物質を乾燥させることにより、標識物質のす
みやかなクロマトグラフ溶媒移動が得られるばかりでな
く、そのようなクロマトグラフ基体物質上に含浸させ乾
燥させた標識物質をすみやかに再可溶化させることがで
きることがわかった。かくして再可溶化した標識試薬
は、通常のクロマトグラフ溶媒システムにより効率的に
移動させることができ、特異的結合アッセイにおいて結
合させることができる。
クロマトグラフ基体物質を標識特異的結合試薬で含浸さ
せ、ついでこれを再可溶化させることができるようにな
ったことにより、標識試薬を添加する工程の省かれた種
々のアッセイ手順を行うことが可能になった。サンドイ
ッチ型および競合型の両アッセイを本発明のキットおよ
び小片を用いて行うことができる。
サンドイッチアッセイ装置 図面に沿って説明すると、第4a図、第4b図および第4c図
は試料中の分析対象物を検出するための試験装置50を示
しており、標識した第一の試薬が装置50上に含浸され乾
燥されている。この装置は一定の長さのクロマトグラフ
基体物質51からなっており、クロマトグラフ基体物質51
にはクロマトグラフ溶媒移動が開始される第一の末端54
およびクロマトグラフ溶媒移動が終了する第二の末端58
がある。上記一定の長さの基体物質51には第一のゾーン
55、第二のゾーン56および第三のゾーン57が含まれる。
第一の末端54と第一のゾーン55とのあいだには、右前溶
媒仕切り手段60、左前溶媒仕切り手段61および横溶媒仕
切り手段62で区切られたボックスが置かれている。右前
溶媒仕切り手段60と基体物質の右縁63とは右側のクロマ
トグラフ溶媒移動経路を形成し、左前溶媒仕切り手段61
と基体物質の左縁64とは左側のクロマトグラフ溶媒移動
経路を形成する。右クロマトグラフ溶媒移動経路と左ク
ロマトグラフ溶媒移動経路とは、第一のゾーン55および
遅延ボックスの下流で合流する。遅延ボックスは中央の
クロマトグラフ移動経路を形成し、この中には右後溶媒
仕切り手段および左後溶媒仕切り手段により区切られた
第二のゾーン56および第三のゾーン57が位置している。
第三のゾーン57の下流、右後溶媒仕切り手段65と右縁63
および左後溶媒仕切り手段66と左縁64はクロマトグラフ
溶媒移動経路を形成し、これはクロマトグラフ溶媒移動
の終了する第二の末端58に続いている。
第一のゾーン55は標識した第一の特異的結合試薬で含浸
されており、該試薬はクロマトグラフ溶媒68中で可動で
あり、分析対象物と反応することができ、分析対象物が
固定化された形であるときは分析対象物により溶媒移動
に対して固定化することができる。第二のゾーン56は第
一のゾーン55の下流にあり、分析すべき試料を受け取る
ための適当な部位を提供する。第三のゾーン57は第二の
ゾーン56の下流にあり、第二の試薬を含浸させてある。
第二の試薬は溶媒移動に対して固定化されており、分析
対象物を固定化した状態にするために分析対象物と選択
的に反応することができる。この装置はさらに、クロマ
トグラフ基体物質の全長にわたって添付した不活性な支
持小片52を含む。この装置はさらにカバープレート53を
含む。カバープレート53は場合によって透明であってよ
く、全長にわたってクロマトグラフ基体物質51の上に置
かれるが、クロマトグラフ物質51の第一の末端54は覆わ
ないで残している。カバープレート53はまた第二のゾー
ン56に対応する開口を区切り、該ゾーンを覆わないで残
している。取り外し可能なつまみ59が第二のゾーン56を
覆っている。
第4a図、第4b図および第4c図に示した装置50を使用する
手順に従い、まず、つまみ59を装置50から取り外し、検
出すべき物質の試料を第二のゾーン56に加え、取り外し
可能なつまみ59を元の位置に置く。ついで、クロマトグ
ラフ溶媒68を入れた容器67に装置50の第一の末端54を接
触させる。ついでクロマトグラフ溶媒68は、右クロマト
グラフ溶媒移動経路および左クロマトグラフ溶媒移動経
路に沿って中央のクロマトグラフ溶媒移動経路までクロ
マトグラフ物質の全長を通じて進んでいく。溶媒のある
部分は第二のゾーン56に向かって上方に移動してゆき、
また溶媒のある部分は第一のゾーン55に向かって下方に
移動してゆき標識した第一の試薬を可溶化する。第一の
末端54からのクロマトグラフ溶媒68の一部は右前溶媒仕
切り手段60と左前溶媒仕切り手段61とのあいだの遅延ボ
ックス中へ進んでいく。クロマトグラフ溶媒は横溶媒仕
切り手段62の周囲を通っていくが、この横溶媒仕切り手
段はクロマトグラフ溶媒が第一のゾーン55に移動するま
での流れを遅れさせるものである。第一のゾーンにおけ
る標識した第一の試薬は、右溶媒移動経路および左溶媒
移動経路から流れてきた溶媒により既に可溶化されてお
り、遅延ボックス中を進んできた溶媒は可溶化された第
一の試薬に到達するや該第一の試薬を第二のゾーン56に
向けて移動させ始める。右溶媒移動経路および左溶媒移
動経路を通ってきたクロマトグラフ溶媒68は、ついで第
二のゾーン56に加えられた試料と接触し、試料を第三の
ゾーン57に移動させていく。第三のゾーン57において固
定化第二試薬物質は、試料中の分析対象物と選択的に反
応し固定化させる。試料の非分析対象成分は、第三のゾ
ーン57から運び去られてしまう。ついで標識した第一の
試薬は第三のゾーン57へ移動してゆき、分析対象物がす
べて固定化された状態にあるときは、そこで溶媒移動に
対して固定化される。分析対象物のなくなった試料およ
び第一の試薬のクロマトグラフ溶媒移動は、クロマトグ
ラフ溶媒68が基体物質の第二の末端58に達するまで続け
られる。
乾燥標識試薬、好ましくは乾燥酵素標識試薬および乾燥
コロイド粒子標識試薬を含む種々のサンドイッチ型アッ
セイ装置を本発明に従って調製することができる。分析
対象物や試料物質を試薬と成熟前に接触させること、お
よび試薬同士を接触させることは避けた方が望ましい場
合がしばしばある。従って、試料成分および種々の試薬
の相対的移動度またはゾーン同士の相対的位置関係は、
試薬および試料成分が所望の時間および位置でのみ混合
するように選択することができる。共願の米国特許第4,
960,691号明細書には、分析対象物の抗体が反応ゾーン
において溶媒移動に対して固定化され、血清試料中に含
まれる他の非分析対象抗体がクロマトグラフ溶媒移動に
よって第三のゾーンから取り除かれてしまうときまで
は、標識した第一の試薬物質（抗ヒト免疫グロブリン抗
体など）を試料物質（血清など）と接触させるのを避け
るのが望ましいようなクロマトグラフ溶媒移動アッセイ
を行うための種々の方法および 装置が開示されてい
る。加速および遅延経路を用いることは、試料物質また
は他の試薬の乾燥を防ぐうえで特に有用である。
競合アッセイ装置 可溶化できる特異的結合試薬を含む本発明のアッセイ装
置はまた、競合結合型のアッセイを行うのにも適してい
る。そのような方法では、サンドイッチ型のアッセイの
場合のように分析対象物と特異的に結合すべく固定化第
二試薬を選択する。しかしながら、標識した第一の試薬
は固定化した第二の試薬と競合的に結合するであろうよ
うな、分析対象物の特異的結合類似化合物となるように
選択する。本発明による競合型アッセイを行う際には、
分析対象物とコロイド粒子標識試薬とが固定化第二試薬
に接触する前に両者を互いに接触させないようにするこ
とは一般に必要とされない。従って、本発明の装置は、
分析対象物を含有する試料と標識した第一の試薬とを混
合するように設計することができる。もちろん、所望の
場合は、試料と標識した第一の試薬とが固定化第二試薬
と接触する前に両者が接触しないように設計することも
できる。
以下、図面に沿って説明すると、第5a図、第5b図および
第5c図は、試料中の分析対象物を検出するための競合結
合アッセイを行うための試験装置70を示しており、標識
した第一の試薬は装置70上に含浸され乾燥されている。
装置70は一定の長さのクロマトグラフ基体物質71からな
っており、クロマトグラフ基体物質71にはクロマトグラ
フ溶媒移動が開始される第一の末端74、およびクロマト
グラフ溶媒移動が終了する第二の末端77がある。基体物
質71は、第一のゾーン75および第二のゾーン76を含む。
第一のゾーンは、凝集防止バッファーを含有する準可溶
性タンパク質の存在下で標識第一試薬を含浸させてあ
る。第二のゾーン76は第一のゾーン75の下流にあり、第
二の試薬を含浸させてある。第二の試薬は、分析対象物
および標識第一試薬の両方と選択的結合反応を行い両者
を固定化した状態にすることができる。この装置はさら
に、クロマトグラフ基体物質71の全長にわたって添付し
た不活性な支持小片72を含む。この装置はさらにカバー
プレート73を含む。カバープレート73は、全長にわたっ
てクロマトグラフ物質51の上に置かれるが、クロマトグ
ラフ基体物質71の第一の末端74は覆わないで残してい
る。カバープレート73はまた第一のゾーン75に対応する
開口を区切り、該ゾーンを覆わないで残している。取り
外し可能なつまみ78が第一のゾーン75を覆っている。
第5a図、第5b図および第5c図に示した装置70を使用する
手順に従い、つまみ78を装置70から取り外し、検出すべ
き物質の試料を第一のゾーン75に加え、つまみ78を元の
位置に置く。ついで、クロマトグラフ溶媒80を入れた容
器79に装置70の第一の末端74を接触させる。ついでクロ
マトグラフ溶媒80はクロマトグラフ基体物質71の全長に
わたって進んでゆき、第一のゾーン75に含浸されていた
標識第一試薬および第一のゾーン75に加えてあった試料
を第二のゾーン76まで移動させていく。第二のゾーン76
において分析対象物と標識第一試薬は、両者がともに特
異的に反応する固定化された第二の試薬と競合すること
について競合する。非分析対象成分ならびに未結合の分
析対象物および第一の試薬物質は、クロマトグラフ溶媒
移動により第二のゾーン76から運び去られる。クロマト
グラフ溶媒移動は、クロマトグラフ溶媒がなくなるかま
たは溶媒のフロントが基体物質の第二の末端77に達する
まで続けられる。クロマトグラフ溶媒移動が終結する
と、第二のゾーン76を観察して該位置で固定化された標
識第一試薬の存在を決定することができる。ついで該位
置での標識第一試薬の存在は、試料中の分析対象物の存
在に関係づけることができる。第一の試薬がコロイド粒
子で標識されている場合には、第二のゾーンにおける該
粒子の存在は直接観察することができる。第一の試薬が
酵素標識で標識されている場合には、酵素基質や指示染
料のような他の試薬を第二のゾーンに加えて第一試薬の
存在を目に見えるようにする。
コロイド粒子についての説明 本発明は、特異的結合アッセイに標識として使用する場
合のコロイド粒子のクロマトグラフ移動特性を改良する
ための手段を提供することを目的とするものである。本
発明の方法、キットおよび装置に関連して用いることの
できるコロイド粒子は、特異的結合アッセイにおいて一
般に用いられるものであってよい。とりわけよく知られ
ているのは、コロイド状金属粒子、特にイムノアッセイ
を行うためのコロイド状金の使用である。重合染料粒子
（これはハーシュフェルドの米国特許第4,166,105号明
細書やヘンリーの米国特許第4,452,886号明細書などに
開示されている特異的結合アッセイ法においても標識と
して用いることができる）などの他のコロイド粒子も、
いまやクロマトグラフ移動特異的結合アッセイに用いる
ことができる。本発明に用いるのに特に好ましいコロイ
ド粒子標識には、共願の米国特許第4,954,452号（＝昭
和63年７月８日付日本特許出願）に記載のようにセレ
ン、テルル、硫黄などの非金属粒子が含まれ、中でもセ
レンがもっとも好ましい。
本発明の標識として用いるのに適したコロイド粒子に
は、特異的結合試薬の活性または他の試薬や分析対象物
を妨害することなく特異的結合試薬に結合させたものが
含まれる。該粒子は検出可能なものでなければならず、
比較的濃度で存在するときでも視覚的に検出可能なシグ
ナルを生じることが好ましい。粒子の大きさは直径が約
1nm〜約200nmの範囲であるのが一般に適しているが、こ
れより大きい粒子も小さい粒子も共に本発明に使用する
のに適している。本発明の方法は約1nmよりも大きな粒
子の場合にとりわけ有用であり、このような粒子は特に
凝集しやすいものである。約200nmよりも大きな粒子は
移動度が減少し、本発明のクロマトグラフ移動促進剤の
存在下であっても懸濁液から取り残される傾向がある。
一層大きな粒子もまた、クロマトグラフ移動物質の孔径
により移動が制限される。約1nmよりも小さな粒子は大
きな粒子よりも優れたクロマトグラフ移動度を示し、場
合によっては本発明のクロマトグラフ移動促進剤を使用
する必要がない。にもかかわらず、約1nmよりも小さな
粒子はシグナルが弱くなる傾向があるため、アッセイ手
順に使用するには余り適さない。
コロイド状金属粒子は本発明の標識として用いるのに特
に適しており、金属、または金属酸化物、金属水酸化物
や金属塩を含む金属化合物からなる粒子を含む。そのよ
うな粒子は一般に直径が約1nm〜約20nmの範囲であり、
直径が約40nm〜約80nmの範囲の粒子が特に好ましい。粒
子は純粋な金属または金属化合物からなっていてよい
が、金属または金属化合物をコーティングしたポリマー
核からなっていてもよい。そのような粒子は、純粋な金
属または金属化合物からなる粒子に似た性質を示すこと
が開示されている。適当な金属または金属化合物には、
金属としてプラチナ、金、銀および銅、金属化合物とし
てヨウ化銀、臭化銀、水酸化銅、酸化鉄、水酸化鉄また
は水和酸化鉄、水酸化アルミニウムまたは水和酸化アル
ミニウム、水酸化クロムまたは水和水酸化クロム、硫酸
銅、硫酸水銀、硫酸バリウム二酸化チタンよりなる群か
ら選ばれたものを含む。好ましい金属粒子には、金、銀
または酸化鉄からなる粒子が含まれる。
コロイド状金属粒子は、当該技術分野で一般に知られた
方法に従って製造することができる。特にフレンスのNa
ture、241、20（1973）には、種々の大きさの金ゾル粒
子の製造法が開示されている。金粒子の製造は、塩化金
の溶液を加熱沸騰させ、ついでクエン酸ナトリウムの溶
液と混合して塩化金を還元する方法により行うことがで
きる。上記二つの溶液を混合するとすぐに沸騰溶液は薄
い青色に変色して核生成の開始を示し、その後すぐに青
色が赤色に変わって単一分散粒子の生成を示す。塩化金
の還元は沸騰をさらに数分続けた後に完了する。得られ
る粒子の大きさは、クエン酸ナトリウム溶液の濃度を変
化させることにより調節することができる。他の金属お
よび金属化合物からなる粒子ならびにポリマー核からな
る粒子もまた同様の方法により得ることができる。金属
粒子標識からの視覚的に検出可能なシグナルの色は、金
属粒子の種類および粒径に既存して異なる。たとえば、
コロイド状金粒子の場合には、ゾルの粒径に依存してオ
レンジ〜赤〜青紫にわたる色を生じる。
セレン、テルルおよび硫黄などの非金属のコロイド粒子
は、共願の米国特許第4,954,452号明細書（＝昭和63年
７月８日付日本特許出願）に記載の方法により調製する
ことができる。
結合試薬とコロイド粒子の結合 本発明の特異的結合試薬とコロイド粒子標識の結合は、
当該技術分野で一般に知られた方法により行うことがで
きる。一つの一般的手順に従えば、タンパク質性の特異
的結合試薬とコロイド粒子をすみやかに混合し、ウシ血
清アルブミンやポリエチレングリコールなどの薬剤を加
えた溶液中でインキュベートする。懸濁液をまず低速で
遠心分離して大きな凝集物を取り除き、ついで高速で遠
心分離して試薬／コロイド粒子結合体のペレットを生じ
させた後、上澄み液を吸引して除く。ついで本発明のク
ロマトグラフ移動促進剤を含有する溶液中にペレットを
再懸濁させる。
コロイド粒子標識は特異的結合試薬に直接結合させる必
要はなく、コーティングするか他の試薬で前もって処理
するようにしてもよい。レーベリングの米国特許第4,31
3,734号明細書には金属ゾル粒子を不活性なポリマーお
よびコポリマーコーティングでコーティングする方法が
開示されている。金属ゾルをポリマーと接触させるよう
にしてもよいし、１またはそれ以上のモノマーを含有す
る環境にゾルを置いて重合反応を開始するようにしても
よい。不活性なポリマーでコーティングした後、吸着ま
たは共有結合により免疫学的な特異的結合成分をコーテ
ィング物質に結合させることができる。
準可溶性タンパク質についての説明 本明細書において用いる準可溶性タンパク質とは、天然
の形態においては疎水性であり水には溶けないが、アル
カリ精製処理のような化学処理を行うと一層親水性とす
ることができ、従って水中で均一な溶液または分散液を
生成することできるようなタンパク質をいう。上記化学
処理は、エステル結合または他の結合の開裂により、タ
ンパク質分子から疎水的な脂肪酸基を開裂して除くよう
に働くものである。この開裂によりタンパク質分子上に
はカルボキシル基および水酸基残基が残され、これらの
部位でタンパク質は一層親水性となる。本発明が単一の
理論に限定されるものではないが、該アルカリ処理によ
り準タンパク質にいくらか界面活性剤のような性質、す
なわち疎水性と親水性の両方を示す性質を付与されるよ
うに思われる。本発明を実施する場合に必要となる化学
処理はアルカリ処理である必要はなく、酸、界面活性
剤、またはアルコールや尿素などの溶媒で行ってもよ
い。
上記のごとく処理したタンパク質は強いクロマトグラフ
移動促進剤として働くことができ、従って不安定なタン
パク質や酵素標識試薬およびコロイド粒子標識試薬など
の試薬の凝集および不活化を防ぐことができる。さら
に、被処理準可溶性タンパク質は、不安定なタンパク質
物質とともに乾燥させたときに安定な貯蔵性を提供し、
乾燥状態で保存したときに凝集および不活化を防ぐ。一
方でこのタンパク質物質はすみやかに再可溶化すること
ができ、所望のときにクロマトグラフ移動アッセイに利
用することができる。不安定なタンパク質物質として
は、抗体；抗原；および酵素、コロイド粒子または他の
標識で標識したタンパク質を含む他の特異的結合タンパ
ク質が挙げられる。好ましい準可溶性タンパク質には、
カゼイン、ゼインおよび卵白タンパク質の非アルブミン
成分などの物質が挙げられ、１〜５％の濃度のカゼイン
が本発明に用いるのに特に好ましい。好ましい準可溶性
タンパク質物質としては、ビタミン非含有カゼイン（シ
グマ・ケミカル、セントルイス、MO、カタログ番号Ｃ−
3400）、ゼイン（シグマ・ケミカル、カタログ番号Ｚ−
3625）、および可溶化および移動のための準可溶性タン
パク質および不活性なアルブミン分画の両方からなる卵
白タンパク質（シグマ・ケミカル、カタログ番号Ａ−52
53）が挙げられる。純粋なアルブミン物質が可溶化と移
動を促進しないので、可溶化と移動に有効な卵白タンパ
ク質成分は卵白アルブミンでないことは知られているこ
とである。
クロマトグラフ移動促進剤についての説明 本明細書において用いるクロマトグラフ移動促進剤と
は、溶液中の特異的結合物質および試薬の凝集および不
活化を防ぎ、さらにそれらのクロマトグラフ移動を促進
するような物質をいう。クロマトグラフ移動促進剤は液
体でも固体でもよく、固体の場合にはバッファー塩溶液
として溶液中に溶解されているのが好ましい。適当なク
ロマトグラフ移動促進剤には、ポエチレングリコール、
ゼラチンやウシ血清アルブミンなどのタンパク質性物
質、およびドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、デオキシ
コール酸ナトリウム（DOC）およびトリトンX100などの
界面活性剤などの物質が含まれる。特に好ましいのは、
カゼインなどの準可溶性タンパク質を用いることであ
る。準可溶性タンパク質はまた、所望のときにクロマト
グラフ溶媒移動により標識試薬をすみやかに再可溶化さ
せ移動させることができるような仕方で、クロマトグラ
フ基体物質を含む固体基体物質上に標識試薬を含浸させ
乾燥させるのに用いることができる。
クロマトグラフ移動促進剤を標識物質と混合し、混合操
作キットにおいて指示溶液の成分として用いる場合に
は、該促進剤は、カゼイン処理または他の処理をした準
可溶性タンパク質をバッファー塩溶液中のPEGのような
他のクロマトグラフ移動促進剤と組み合わせたものであ
るのが好ましい。特に好ましいクロマトグラフ移動促進
バッファーは、２％カゼインとPBS中の0.1％PEGとの組
み合わせからなる。バッファー成分および指示溶液成分
の濃度は、ある特定の試料の大きさに対して充分な濃度
の成分を提供して標識試薬の凝集および不活性化を防
ぎ、それらのクロマトグラフ自動を促進するように本発
明の混合操作キットを行う際に選択する。
カゼイン含有溶液存在下のコロイド粒子標識特異的結合
試薬は1.0に近いRf値を示すのに対し、PEG含有バッファ
ー中のコロイド粒子標識物質は0.7に近いRf値を示す。
適当なクロマトグラフ移動促進剤中のカゼイン濃度は約
0.1％（w/v）〜約５％以上の範囲にわたるが、約２％の
濃度が好ましい。約５％以上の濃度は抗凝集またはバッ
ファーのクロマトグラフ移動促進性を高めないように思
われるが、一方、本発明の試験小片上に乾燥させた標識
試薬を再可溶化させるのを妨害する傾向がある。
唯一のクロマトグラフ移動促進剤としてPEGを含む溶液
は、本発明のある実施態様を行うのに適している。PEG
含有バッファーは、0.7もの高いRf値を有する。適当な
クロマトグラフ移動促進バッファー中の好ましいPEG濃
度は、約0.05％〜約２％の範囲であり、約１％が特に好
ましい。適当なPEGポリマーは種々の分子量を有してよ
いが、約20,000の分子量が特に好ましい。
一般にゼラチンは、ゼラチン含有溶液が約0.2のRf値し
か示さないので、単独でクロマトグラフ移動促進剤とし
て用いるのは適当でない。それにもかかわらず、本発明
の他の抗凝集性物質と組み合わせて用いるときには有用
である。しかしながら、一般にゼラチンは、約２％以上
の濃度で用いると凝集させる傾向があるので適当でな
い。
本発明のクロマトグラフ移動促進剤に用いるのに適した
バッファー溶液は、約５〜９のpHを有していなければな
らず、また分析対象物および試薬の反応性またはそれら
のクロマトグラフ移動を妨害するようであってはならな
い。好ましいバッファー溶液のpHは約７であり、トリス
およびPBSのようなバッファーを含む。
クロマトグラフ媒体についての説明 本発明に有用なクロマトグラフ媒体には、毛管現象を示
し、選択したクロマトグラフ溶媒により非固定化試薬や
反応性試料成分をクロマトグラフ溶媒移動させることが
できるようなクロマトグラフ基体物質が含まれる。本発
明に用いるクロマトグラフ基体物質は小片（ストリップ
状）であることが好ましいが、クロマトグラフカラム中
の粒子やゲル物質を含む他の形態も想定することがで
き、これらに限られるものではない。ペーパークロマト
グラフィーに用いる織った繊維状物質および織らない繊
維状物質のような広い範囲のクロマトグラフ小片物質を
本発明に用いることができるが、微多孔質または微細顆
粒状薄層クロマトグラフ物質は本発明によるアッセイの
スピードおよび解析力を高めるので特に好ましい。クロ
マトグラフ物質は不活性であって、一般に試料成分、試
薬、コロイド粒子標識、バッファーまたは反応生成物の
いづれとも物理的または化学的に反応してはならない。
本発明に使用するのに特に適した薄層クロマトグラフ基
体物質には、シリカや微細顆粒セルロースなどの顆粒状
薄層クロマトグラフ物質が含まれる。好ましい非顆粒状
多孔質物質には、微多孔質セルロースエステル、たとえ
ば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸などの炭素数１
〜７のアルカリカルボン酸などの脂肪族カルボン酸との
セルロースエステルが含まれる。特に好ましいのはニト
ロセルロースから作られた微多孔質物質であり、ここで
ニトロセルロースはセルロースのいかなる硝酸エステル
をも包含するものとする。好ましいクロマトグラフ物質
には、ニトロセルロースと上記カルボン酸セルロースエ
ステルとの組み合わせが含まれる。従って、純粋なセル
ロースエステルを、６炭素当たり３個の硝酸基を含むセ
ルロースエステルを構成するものとして用いることがで
きる。最も好ましいのは、タイプ（Type）SMWP物質（ミ
リポア・コーポレーション（Millipore Corp.）、ベッ
ドフォード、マサチューセッツ）であり、これは５μｍ
の孔径を有する。
種々のクロマトグラフ基体物質は、それ自体フィルム、
小片、シートなどの適当な形態で用いることができる。
これら基体物質はまた、紙、ガラス、プラスチック、金
属または織物などの適当は不活性支持物質上にコーティ
ングし接着しラミネートすることができる。好ましい不
活性物質の一つはマイラーである。そのような支持物質
はクロマトグラフ基体物質の構造上の支持となるばかり
でなく、アッセイ手順中の試薬および溶媒物質の蒸発を
も防ぐ。カバープレートもまたそのような不活性物質で
作ることができる。カバープレートは本発明の実施に必
ずしも必要ではないが、さらに構造上の支持を付与し、
アッセイ手順中の試薬および溶媒物質の蒸発を防ぐ。そ
のようなカバープレートはアッセイの進行状態を見るこ
とができるように透明であってよく、また試料物質、ク
ロマトグラフ溶媒または試薬を加えるための口部を備え
ていてよい。
アッセイを行うクロマトグラフ媒体の形態および大きさ
はいかようであってもよいが、約0.01mm〜約0.5mmの範
囲の厚さ、最も好ましくは約0.1mmの厚さの小片の形態
であることが好ましい。小片の他の部分の寸法について
は広い範囲で変化させることができるが、アッセイ進行
の時間を短縮し物質の使用を最小にするため相当小さく
するのが好ましい。小片が極めて小さいときは、取り扱
いや結果の観察を容易にするために適当なハンドルまた
はホールダーに取り付けてもよい。幅が約3mmで長さが7
5mmまでの小片が、本発明の単一経路装置を製造するの
に特に適していることがわかった。孔径は広い範囲で変
化させることができるが、約0.05μｍ〜約５μｍの範囲
が好ましい。孔径の下限は、移動させる分析対象物、試
薬およびコロイド粒子標識の大きさにより限定される。
孔径が余りにも小さすぎると、アッセイ物質の移動は遅
くなるか、または全然移動されなくなる。一方、孔径の
上限は、結合能により限定される。一般にクロマトグラ
フ移動がすみやかに行なわれ、アッセイが５分未満、好
ましくは約２分ないし２分未満で完了するのが好まし
い。クロマトグラフ移動が余り速すぎて、試薬がお互い
に特異的に結合する時間がないために特異的結合能が失
われるようであってはならない。従って、孔径と基体の
厚さの組合わせは、所望のスピードおよび解析力を得る
ために、クロマトグラフ溶媒、特異的試薬、試料物質お
よびコロイド粒子標識の特性に従って変化させることが
できる。
本発明の小片物質を調製するに際し、物質中、または物
質の縁中に不規則性があって物質中で不均一な流れを起
こすようなことは避けるのが望ましい。小片物質を作る
ための手段としては、タングステンカーバイドの回転刃
を有するカッターを使用することが含まれる。しかし、
好ましい手段はレーザーカッティングを用いることであ
り、これは大量生産技術に適している。
本発明の装置のクロマトグラフ媒体は化学的に不活性で
あることが好ましいので、溶媒移動に対して特異的結合
試薬を固定化しようと思ういづれかのゾーンで活性化さ
せなればならないであろう。基体物質および第二の試薬
の特定の化学的性質に従って、試薬を固定化するために
種々の方法を用いる必要があるであろう。一般にクロマ
トグラフ媒体がニトロセルロースまたは混合ニトロセル
ロースエステルである場合には、試薬を固定化するため
にいかなる特別の化学的結合も必要とされない。他の物
質および試薬のために種々の技術を用いることができ、
これにはカルボニルジイミダゾール、グルタールアルデ
ヒド、コハク酸などの物質による官能化（functionaliz
ation）、または臭化シアンなどの物質による処理が含
まれる。他の適当な反応には、アルデヒド基、カルボニ
ル基およびアミノ基を還元するためにシッフ塩基および
ホウ化水素で処理することが含まれる。DNA、RNAおよび
ある種の抗原は、クロマトグラフ物質上に焼き付けるこ
とにより溶媒移動に対して固定化することができる。焼
き付けは、約60℃〜約120℃の範囲の温度で約５分間〜
約12時間の範囲の時間、好ましくは約80℃で約２時間行
う。
溶媒移動仕切り 試薬および試料物質の連続移動を行うために、共願の米
国特許第4,960,691号明細書に開示されているような種
々の手段が知られている。
本発明によるクロマトグラフ流をブロックする溶媒仕切
りは、種々の物理的または化学的エッチング法により行
うことができる。幅0.1mm未満の間隙が液体が流れるの
を防ぐことができるのがわかった。そのような仕切りを
形成するために好ましい手段には、レーザーエッチング
法を用いることが含まれる。CO2レーザーを一つの手順
として用いることができ、その場合、背部にマイラーを
付けたニトロセルロースを支持固定物上に取り付け、こ
れを非常に近い位置許容性を有するコンピューター制御
Ｘ−Ｙテーブル上に取り付ける。別のやり方としては、
ビーム移動機構を用いてもよい。適当な光学レンズを用
いビームの焦点を注意深く合わせることにより、直径約
0.005インチのレーザービームスポットをニトロセルロ
ース上に焦点を合わせることができる。レーザーの出力
を注意深く調節することにより、幅約0.005インチのニ
トロセルロースの狭い通路を背部のマイラーから除くか
背部のマイラーまで溶かし去る。レーザーからの光とニ
トロセルロースとの有利な組合わせ効果のため、CO2レ
ーザーを使用することが特に好ましい。にもかかわら
ず、レーザービームの波長が溶媒移動物質に所望の効果
を生じさせるものである限り、他の型のレーザーも適し
ている。移動ビームまたはＸ−Ｙテーブルを用いること
により、正確な通路を調節した（baffled）チャネルま
たは他の入り組んだ形態をニトロセルロース上に作るこ
とができる。
特異的結合試薬についての説明 本発明に用いるのに適した特異的結合試薬には、リガン
ドとレセプターからなる特異的結合ペアの一方であるよ
うな物質が含まれる。リガンドとレセプターは、レセプ
ターがリガンドに特異的に結合して他の似た性質を有す
る物質からリガンドを識別することができるという点で
互いに関連している。本発明の方法は、キットおよび装
置は、特異的結合試薬が抗原と抗体である免疫学的アッ
セイ法を行うのに特に有用である。アビジン、ビオチ
ン、ストレプトアビジン（strepatavidin）および抗ビ
オチンなどの特異的結合物質もまた、コロイド粒子で標
識し本発明によるクロマトグラフ溶媒移動アッセイに利
用することができる。本発明の方法、キットおよび装置
は、DNAおよびRNAハイブリダイゼーションアッセイ、お
よびホルモンや他の生物学的に活性な薬剤のレセプター
の関与するものを含む他の特異的結合アッセイを行う上
でも有用であることが証明された。
本発明の免疫学的アッセイを行うのに有用な抗体には、
生物学的流体中での検出が望まれている種々の分析対象
物と特異的に反応するものが含まれる。そのような抗体
は好ましくはIgG、IgM抗体またはこれらの混合物であ
り、これらは非分析対象分子と結合することのできる抗
体との会合体を本質的に含んでいない。抗体はポリクロ
ーナルであってもモノクローナルであってもよく、市販
されており、マウス腹水、組織培養物または当該技術分
野で知られた他の技術により得ることができる。モノク
ローナル抗体産出のためのハイブリドーマ法について
は、ウォンズ（Wands J.R.）およびズラウスキー（V.R.
Zurawski）のガストロエンテロロジー、80:225（198
1）；マーシャク−ロスシュタイン（Marshak−Rothstei
n A.）らのJ.Immunol.122:2491（1979）；オイ（Oi V.
Y.）およびヘルツェンバーグ（L.L.Herzenbeg）の「イ
ムノグロブリン・プロデューシング・ハイブリッド（Im
munoglobulin Producing Hybrid）」、ミッシェル（Mis
hell B.B.）およびシーギ（S.M.Shiigi）編、セレクテ
ッド・メソッズ・イン・セルラー・イムノロジー（Sele
cted Methods in Cellular Immunology）、サンフラン
シスコW.H.フリーマン・パブリッシング（Freeman Publ
ishing）、1979;およびクング（Kung）らの米国特許第
4,515,893号明細書に典型的な記載がある。異なる抗原
特異性を有するモノクローナル抗体の混合物、またはモ
ノクローナル抗体とポリクローナル抗体の混合物を用い
るのが望ましい。さらに本発明の特異的結合試薬として
抗体分子の断片を用いることが想定でき、これには当該
技術分野で知られた半抗体分子およびFab、Fab′または
Ｆ（ab′）2断片が含まれる。しかしながら、抗体の特
定の採取源にもかかわらず、一般に不純物を含んでいな
いことが好ましい。抗体はカラムクロマトグラフィーや
他の通常の手段により精製することができるが、知られ
たアフィニティー精製法により精製するのが好ましい。
本発明のイムノアッセイを行うのに有用な抗原およびハ
プテンには、天然のものであるか合成したものであるか
にかかわらず、本発明のクロマトグラフ小片物質上に存
在するときに、分析対象物である抗体が特異的に反応す
る抗原決定部位を示すような物質を含む。合成抗原に
は、通常の化学合成により作られたもの、および組換え
DNA技術により作られたものが含まれる。抗原はまた本
発明に従って酵素およびコロイド粒子で標識することが
でき、抗体分析対象物の検出のためにサンドイッチ型ア
ッセイに、抗原分析対象物の検出のために競合型アッセ
イに用いることができる。
本発明による方法および装置は、核酸ハイブリダイゼー
ションアッセイを含む広い範囲の特異的結合アッセイを
行うのに有用であることが期待される。本発明に有用な
DNAおよびRNAハイブリダイゼーション物質には、分析対
象物の遺伝子物質に一般に相補的な塩基配列を有するDN
AおよびRNAポリヌクレオチドプローブが含まれる。本発
明のプローブは、一般に約25〜約10,000塩基、好ましく
は約30〜約5,000塩基を有する。プローブは分析対象物
の遺伝子物質の塩基配列に完全に相補的である必要はな
く、塩基配列のあいだに約70％またはそれ以上の相同性
があれば一般にハイブリダイズするであろう。DNAおよ
びRNAのハイブリダイゼーションに関する条件について
はクローサ（Crosa）らのJ.Bact.115（３）、904〜911
（1973）に一般に開示されている。ポリヌクレオチドプ
ローブ物質は、技術分野でよく知られた方法により得ら
れることができる［たとえば、コーンバーグ（Kornber
g）、DNAレプリケーション（Replication）、W.H.フリ
ーマン、サンフランシスコ、670〜679（1978）；ダラス
（Dallas）らのJ.Bacteiol.139、850〜858（1979）およ
びソ（So）らのNature、277、453〜456（1979）参
照］。
遮断剤についての説明 本発明の特異的結合のための装置を調製するのに有用な
遮断剤は、クロマトグラフ媒体上の過剰の結合部位を遮
断することのできる剤である。そのような過剰の結合部
位は、本発明の試料物質または試薬のクロマトグラフ溶
媒移動を妨害するであろう。一般に、特異的結合試薬を
試料物質およびクロマトグラフ溶媒と混合する混合操作
アッセイを行う場合には、クロマトグラフ基体物質を遮
断する必要はない。しかしながら、試料または試薬をク
ロマトグラフ溶媒の不在下で小片上に含浸させてある場
合には、クロマトグラフ溶媒物質上の過剰の結合部位を
遮断することは特に有用である。本発明の装置を構築す
る際、クロマトグラフ媒体に試薬を含浸させて所望の位
置で固定化する。いったん試薬を所望のゾーンに固定化
すると、クロマトグラフ物質上の過剰の結合部位を遮断
する。これは、他の試薬や試料物質のクロマトグラフ溶
媒移動を妨害することがあるからである。カゼイン、ゼ
ラチンまたは全血清などから採ったタンパク質からなる
遮断溶液を使用するのが特に適している。そのようなタ
ンパク質は、アッセイの試薬物質を妨害しないかまたは
交差反応しないように選択する。過剰の部位の遮断を行
うには、生理食塩水中の0.2％カゼイン溶液中にクロマ
トグラフ基体物質を浸し、小片物質を空気乾燥させるこ
とにより行うことができる。他の方法としては、基体物
質を0.1％ゼラチン溶液または0.1％BSA溶液に浸し、つ
いで空気乾燥させることが挙げられる。
クロマトグラフ溶媒システムについての説明 本発明による「浸漬操作（dip and run）」アッセイを
行うためのキットでは、アッセイの可動要素をクロマト
グラフ移動させるために、試料物質と指示溶液自体の混
合物を用いる。アッセイ装置が浸漬操作の態様になって
おらず少量の試料をアッセイ装置の第一の末端でない位
置に加える場合には、アッセイ装置上の種々の試薬およ
び試料成分を移動させるためにクロマトグラフ溶媒が必
要となる。本発明による特異的結合アッセイに適したク
ロマトグラフ溶媒システムは、分析対象物、標識試薬お
よびその他の試薬物質を可溶化することができ、それら
をクロマトグラフ物質上で移動させることができるもの
である。そのような溶媒は、移動させようとする物質と
小片物質とのあいだの静電的相互作用を防ぐために充分
なイオン強度を有していなければならない。本発明によ
るイムノアッセイ手順に用いるのに好ましい溶媒は、中
性の範囲のpHの生理食塩水である。タンパク質およびド
デシル硫酸ナトリウム（SDS）、トリトンX100およびデ
オキシコール酸ナトリウム（DOC）などの界面活性剤も
またクロマトグラフ溶媒に加えてもよい。この場合に加
える量は、小片物質との非特異的結合を最小限に抑える
が、所望の結合および固定化反応を妨害するような過剰
の量ではない量である。高速液体クロマトグラフ（HPL
C）溶媒および高速薄層クロマトグラフ（HPTLC）などの
他のクロマトグラフ溶媒もまた使用することができ、こ
れはタンパク質および他の反応物質の可溶化に有利であ
り、小片物質への結合を最小にする。
つぎに実施例にもとづいて本発明をさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。
実施例１ 本実施例では、カゼインをアルカリ処理精製手順に供し
た。本質的にビタミンを含んでいないカゼイン（200g、
シグマ・ケミカル、セントルイス、MO、カタログ番号Ｃ
−3400）を蒸留水（800ml）と混合した。ついで2M水酸
化ナトリウム（１）、ついで30％過酸化水素（4ml）
を加え、混合物を室温で一夜撹拌した。
上記物質をブフナー漏斗上のファットマン（Whatman）N
o.1フィルター紙で濾過し、濾液に100％（氷）酢酸（約
94.6ml）を加えてpHを7.5にした。混合物を上記と同様
にして再び濾過し、濾液に酢酸（約220ml）を加えてpH
を約4.5にした。混合物を30分間インキュベートする
と、その間に大きなタフィー状の塊が溶液から沈でんし
た。上澄み液を小さなRC5C遠心管中、2800rpmで30分間
遠心分離し、ペレットをタフィー状の塊に加え、ついで
これを脱イオン化水で洗浄した。
ついでタフィー状の塊を撹拌し、0.15Mアンモニア水溶
液（１）中に溶解した。カゼインが溶液中に分散して
いかない場合には、pHが7.5に達するまで濃（15M）水酸
化アンモニウム溶液を加えなければならなかった。つい
でカゼインを一夜凍結乾燥させて完全に乾燥させ、136g
の収量を得た。
実施例２ 本実施例では、本発明の方法を行うためにコロイド状金
／抗体結合体を調製した。操作手順のあいだシリコーン
処理ガラス製品［シグマシリコット（Sigma silicot
e）］を使用した。0.01％塩化金（HAuCL4・3H2O、フィ
ッシャー・サイエンティフィック（Fisher Scientifi
c）、Ｇ−54−１、200ml）を沸騰させ、１％クエン酸ナ
トリウム溶液（2ml）を加え、溶液の色が薄い黄色から
紫ないし赤色に変わるまで沸騰を５分間続けた。pHを7.
6に調節するために炭酸カリウム溶液（0.02M）を懸濁液
に加え、ついでヤギ抗ヒトIgG（キルケガール−ペリー
（Kirkegaard−Perry）、ガイテルスブルグ（Gaithersb
urg）、MD、1mg/ml）を金懸濁液（0.01％金）1ml当たり
IgG約10μｇとなるように加えた。
室温で１分間インキュベートした後、金懸濁液（10ml）
に30％ウシ血清アルブミン水溶液（0.1ml）を加えた。
ソーバル（Sorval）RC5C遠心管のSS34ローター中、3000
rpmで遠心分離させることにより凝集物質を除いた。上
澄み液をさらに6000rpmで遠心分子工程に１時間供し
た。ペレット中のコロイド状金結合体をPBS（0.9％NaCl
中の0.05Mリン酸カリウムバッファー、pH7.4）中の２％
ウシ血清アルブミン中に再び懸濁させた。液体貯蔵のた
めの好ましい条件は４℃であった。膜に加える直前に、
実施例１で調製したカゼインの準可溶性調製物を加えて
濃度を１％にした。ついで結合体を乾燥状態で長期にわ
たって貯蔵したが、乾燥状態で37℃で６カ月貯蔵しても
活性は失われなかった。
実施例３ 本実施例では、風疹抗体の検出のためのサンドイッチ型
アッセイ装置を製造し使用した。厚さが約0.1mmで平均
孔径が５μｍの微多孔質ニトロセルロース物質をマイラ
ーおよび接着剤（モノコート（Monokote）、トップ・フ
ライト・モデルズ（Top Flite Models,Inc.）、シカ
ゴ、IL）でラミネートした。1cm×3.5cmの大きさの小片
を高圧レーザーでカッティングし、溶媒移動レーンおよ
び遅延ボックスを第4a〜第4c図の装置の一般的なデザイ
ンに従ってレーザーエッチングにより作った。風疹抗体
（アボット・ラボラトリーズ、ノースシカゴ、IL、0.2
μｌ、2500HA力価）を小片の第三のゾーンに加え、そこ
で固定化し空気乾燥させた。ついでLBゼラチンの0.1％
水溶液（イノテック（Inotech）、ボーレン（Wohle
n）、スイス）とともに室温で10分間インキュベートす
ることによりクロマトグラフ小片上の非特異的結合部位
を遮断し、小片を空気流中で乾燥させた。ついで実施例
２で調製した凝集防止バッファー中の金粒子標識ヤギ抗
ヒトIgG（１μｌ）を各小片の第一のゾーン（遅延ボッ
クスの隣）に加え、乾燥させた。
ついで第一のゾーンと第三のゾーンとのあいだにある第
二のゾーンに風疹抗体に対して陽極および陰性の血清試
料を加え、TBSおよび１％トリトンX100からなるクロマ
トグラフ移動溶媒中に小片の第一の末端を浸した。液体
のフロントを約2.5分間にわたって装置の第二の末端ま
で進行させ、試料物質および金標識ヤギ抗ヒトIgGを第
三のゾーンまで移動させた。陽性の試料と固定化した標
識第一試薬との反応から、第三のゾーンに赤色のスポッ
トが得られた。陰性の血清で試験した小片では第三のゾ
ーンにシグナルが得られなかった。
実施例４ 本実施例では、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（HCG）の
検出のための混合操作サンドイッチ型イムノアッセイ装
置を製造し使用した。この装置は第2a〜第2c図の装置と
一般的に同じ設計で作られており、陰性のコントロール
として試料中の標識第一特異的試薬の存在を確証するシ
グナルを生じ、さらにHCG分析対象物の存在を示すシグ
ナルを生じる。実施例３の方法に従い、厚さが約0.1mm
で平均孔径が５μｍの微多孔質ニトロセルロース物質を
マイラーおよびセメント（モノコート）でラミネートし
た。
第一のゾーンにおいて、１％ショ糖を含有する生理食塩
水バッファー中の抗HCGポリクローナル抗体（2mg/ml、
0.35μｌ）からなる第二の試薬を小片に含浸させた。第
二のゾーンにおいては、１％ショ糖を含有するトリスバ
ッファー生理食塩水中のヤギ抗マウスIgG（100μg/ml、
0.45μｌ）からなる第三の試薬を小片に含浸させた。上
記二つのゾーンは小片の第一の末端から約10mmのところ
に位置しており、両者の配置は、第二のゾーンがマイナ
ス（−）の記号を示し、第一のゾーンが第二のゾーンの
両サイドに位置することにより両方のゾーンが一緒にな
ってプラス（＋）の記号を形成するようになっている。
抗HCG抗体（アボット・ラボラトリーズ、ノースシカ
ゴ、IL）を、実施例２の方法により炭酸カリウムでpH6.
6に調節したコロイド状金懸濁液（1ml）とともにインキ
ュベートした。この場合、金懸濁液1ml当たりIgG約10μ
ｇを加えるようにした。ついでコロイド状金標識抗HCG
抗体（10μｌ）からなる指示溶液を調製した。実施例１
の10％アルカリ処理カゼインおよび１％PEG（分子量20,
000）を含有するトリスバッファー生理食塩水（10μ
ｌ）に金粒子標識抗体を加えた。ついで指示溶液を、種
々の量のHCGを加えておいた尿試料（100μｌ）と混合し
た。
ついで試料と指示溶液の混合物に試験小片の第一の末端
を接触させ、液体のフロントをゾーンを通って小片の第
二の末端まで上昇させた。試料溶液にHCG抗原が全く含
まれていないときは、試料と指示溶液の混合物は小片中
を進んでいった。ヤギ抗マウスIgGが固定化されている
第二のゾーンに接触すると、標識抗HCG抗体は選択的免
疫学的反応により固定化された。試料溶液中にHCGが存
在しないと、第一のゾーンにおいて第二の試薬との特異
的結合は生じなかった。かくしてコロイド状金標識試薬
によりマイナス（−）の形態で視覚的に検出可能なシグ
ナルが得られ、これは試薬が操作可能性であるが試料中
にHCGが不在であることを示していた。
試料溶液にHCGが含まれているときは、標識抗HCG抗体は
分析対象物と特異的に結合して標識結合体を生成した。
試料溶液と指示溶液の混合物は、クロマトグラフ溶媒移
動により第一のゾーンおよび第二のゾーンを通って第二
の末端へと移動していった。ポリクローナル抗HCG抗体
を固定化してある第一のゾーンに接触すると、HCG抗原
と抗HCG抗体との特異的結合反応により金標識抗体/HCG
結合体が固定化された。同時に、第二のゾーンと接触し
ているHCG/抗体結合体および未結合標識抗HCG抗体は、
該ゾーンに固定化されたヤギ抗マウスIgG抗体と接触す
ることにより固定化された。かくして第一および第二の
両ゾーンで固定化されたコロイド状金標識試薬により、
プラス（＋）記号の形態の視覚的に検出可能なシグナル
が得られ、これは試料中にHCGが存在することを示して
いた。この形のHCG感度は22ミリIU/mlの低いものであっ
た。
実施例５ 本実施例では、実施例４の方法に従い、Ａ多糖類（AP
S）の検出のための混合操作サンドイッチ型イムノアッ
セイ装置を製造し使用した。実施例４に従ってニトロセ
ルロース小片を調製し、第一のゾーンに固定化したポリ
クローナル抗APS抗体で処理した。
ウサギポリクローナル抗APS抗体（アボット・ラボラト
リーズ、ノースシカゴ、IL）を、実施例２の方法により
炭酸カリウムでpH7.2に調節したコロイド状金懸濁液（1
ml）とともにインキュベートした。この場合、金懸濁液
1ml当たり抗APS抗体約10μｇを加えるようにした。つい
でコロイド状金標識抗APS抗体（10μｌ）からなる指示
溶液を調製した。実施例１の10％アルカリ処理カゼイン
および１％PEGを含有するトリスバッファー生理食塩水
（10μｌ）に金粒子標識抗体を加えた。ついで指示溶液
を、種々の量のAPS（アボット・ラボラトリーズ、ノー
スシカゴ、IL）を加えておいた小片用スワブ抽出バッフ
ァー（100μｌ）と混合した。
ついで試料と指示溶液の混合物に試験小片の第一の末端
を接触させ、液体のフロントを第一のゾーンを通って小
片の第二の末端まで上昇させた。試料中に存在するAPS
は、指示溶液中の抗APS抗体と反応し結合して結合体を
形成した。ついでこれらの結合体は、APSと第一のゾー
ンに固定化された抗APSポリクローナル抗体との反応に
より第一のゾーンに固定化された。スワブ抽出試料中の
APSの存在は、コロイド金粒子が該ゾーンで濃縮される
結果として紫色が現れてくることにより示された。この
形の装置のAPS感度は0.5ng/mlAPSの低いものであった。
実施例６ 本実施例では、実施例３の一般的な手順に従い、ブタ抗
旋毛虫抗体を検出するためのサイドイッチ型イムノアッ
セイ装置を製造した。ニトロセルロースアッセイ小片を
調製し、検出ゾーンに固定化した部分精製旋毛虫抗原
（米国農務省）で処理した。
種々の大きさのコロイド状セレン粒子を、共願の米国特
許第4,954,452号（昭和63年７月８日付日本特許出願）
の方法に従い製造した。それぞれ水（4ml）を入れた個
々のガラスびんに種々の容量（40、80および150μｌア
リコート）の濃縮セレンゾルをピペットにて加え、0.01
M炭酸カリウムを加えることにより各溶液のpHを7.2に調
節した。ついで各ガラスびんにヤギ抗ブタ抗体（1mg/ml
濃度、キルケガール−ペリー、150μｌ）を加えた。溶
液を混合し、10分間インキュベートした。各溶液にアル
カリ処理カゼインの0.5％溶液の0.5mlアリコートを加
え、よく混合した。各セレン結合体溶液の3mlアリコー
トをTDxテーブル遠心管上で1mlずつ遠心分離し、上澄み
液をデカントして除いた後、各結合体のペレットを集め
た。各結合体の集めたペレットを、TBS（20μｌ）中の
４％カゼイン溶液に再懸濁させた。ついでセレン粒子標
識抗体指示溶液の0.5μｌアリコートを各小片の第一の
ゾーン（遅延ボックスの隣）に加え、乾燥させた。
ついで第一のゾーンと第三のゾーンとのあいだにある第
二のゾーンに旋毛虫抗体を含有する陽性および陰性の血
清試料を加え、TBSおよび１％トリトンX100からなるク
ロマトグラフ移動溶媒中に小片の第一の末端を浸した。
液体のフロントを約2.5分間にわたって装置の第二の末
端まで進行させ、試料物質およびセレン標識抗ブタ抗体
を第三のゾーンまで移動させた。すべての結合体から視
覚的に陽性のシグナルが得られたが、80nmセレン粒子を
使用した結合体から最良の結果が得られた。すべての結
合体について、特異的な結合を示さない陰性のコントロ
ールに対して試験した。
実施例７ 本実施例では、実施例４の手順に従って、混合操作サン
ドイッチ型イムノアッセイ装置を製造し使用した。金粒
子とともに抗HCG抗体をインキュベートする代わりに、
共願の米国特許第4,954,452号（＝昭和63年７月８日付
日本特許出願）の方法に従って調製したコロイド状セレ
ン粒子とともに抗体をインキュベートした。種々の濃度
のHCGに対して種々の大きさのセレン粒子を試験した。8
0nm粒子を使用した結合体から最良の結果が得られ、そ
の検出限界は20mlU/mlであった。これより大きいまたは
小さい粒子で標識した抗体からは、下記第１表に示すよ
うにより感度の低い結果が得られた。すべての結合体に
ついて、特異的な結合を示さない陰性のコントロールに
対して試験した。
実施例８ 本実施例では、実施例３の一般的な手順に従い、風疹抗
体を検出するためのサンドイッチ型イムノアッセイ装置
を製造し使用した。しかしながら、風疹抗体を検出する
のに、金粒子標識ヤギ抗ヒトIgGの代わりにアルカリホ
スファターゼ標識ヤギ抗ヒトIgG（キルケガール−ペリ
ー）を第二のゾーンに固定化させて用いた。アルカリホ
スファターゼ標識IgG（1mg/ml、１μｌ）を１％アルカ
リ処理カゼインを含有するPBS溶液中に希釈し、各小片
の第一のゾーンに加え乾燥させた。ついでアッセイ装置
を製造することができ、長期にわたって貯蔵し、アッセ
イ結果を目に見えるようにするために酵素基質および指
示染料を試験小片に加えた他は実施例３の金標識アッセ
イ装置と同様のやり方で使用した。
なお本発明を行うに際し、上記で示した本発明の好まし
い実施態様を記載から、当業者は数多くの修正ないし変
更を加えることが期待できるであろう。クロマトグラフ
アッセイ技術にコロイド粒子標識試薬を用いることは適
用範囲の広いものであって、開示した特定の実施例に限
られるものではない。従って、当該技術の範囲内で本発
明を変化に富んだ方法および様式で行うことは当を得た
ことである。
【図面の簡単な説明】
第1a図、第2a図、第3a図、第4a図および第5a図は、本発
明の５つの異なる形態の試験装置の正面平面図、 第1b図、第2b図、第3b図、第4b図および第5b図は、それ
ぞれ第1a図、第2a図、第3a図、第4a図および第5a図に示
した試験装置の1b−1b、2b−2b、3b−3b、4b−4bおよび
5b−5b線での断面図、 第1c図、第2c図および第3c図は、それぞれ一定容量の試
料物質および指示溶液と接触させた第1a図、第2a図およ
び第3a図に示した試験装置の断面図、 第4c図および第5c図は、それぞれ一定の容量のクロマト
グラフ溶媒と接触させた第4a図および第5a図に示した試
験装置の断面図、 第６図は、第4a図に示した試験装置の６−６線での断面
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４５ Ｍ ５８３ (56)参考文献 特開 昭57−63454（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−15100（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−25553（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−47894（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−185160（ＪＰ，Ａ) 米国特許 4407943（ＵＳ，Ａ) 欧州特許公開 192320（ＥＰ，Ａ)

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試料中の分析対象物の存在の有無または量
    を決定する方法であって、下記工程 （ａ）準可溶性タンパク質の存在下でコロイド粒子標識
    物質を含浸させ乾燥させたものを含む第一の反応部位
    と、該分析対象物および該コロイド粒子標識物質よりな
    る群から選ばれたものと結合し得る固定化試薬を含む第
    二の反応部位との少なくとも二つの反応部位を有するク
    ロマトグラフ媒体に該試料を接触させ、 （ｂ）該標識物質を可溶化させ、該標識物質の少なくと
    も一部を該第二の反応部位までクロマトグラフ的に移動
    させて結合させ、ついで （ｃ）該試料中の該分析対象物の存在の有無または量を
    表示する手段として、該第二の反応部位で該標識物質に
    より生じた検出可能な応答を決定する ことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】前記クロマトグラフ媒体が第三の反応部位
    をも含み、該第三の反応部位は第一の固定化試薬と同じ
    かまたは異なっていてよく該標識物質と結合し得る第二
    の固定化試薬を含むものであり、さらに （ｄ）該試料中の該分析対象物の存在の有無または量を
    表示する手段として、該第三の反応部位で該標識物質に
    より生じた検出可能な応答を決定する工程を含む、特許
    請求の範囲第（１）項記載の方法。
  3. 【請求項３】１またはそれ以上の特異的結合反応により
    試料中の分析対象物の存在の有無または量を決定するた
    めの試験装置であって、 （ａ）毛管現象を示し、選択したクロマトグラフ溶媒に
    より１または２以上の非固定化試薬および反応性試料成
    分のすみやかなクロマトグラフ溶媒移動を行うことがで
    きるクロマトグラフ媒体、 （ｂ）準可溶性タンパク質の存在下でコロイド粒子標識
    物質を含浸させ乾燥させたものであって、該コロイド粒
    子標識物質はすみやかに可溶化することができ該溶媒中
    をクロマトグラフ溶媒移動することができるものである
    ものを含む第一の反応部位、および （ｃ）該分析対象物および該標識物質よりなる群から選
    ばれたものと結合し得る固定化試薬を含む第二の反応部
    位 からなることを特徴とする試験装置。
  4. 【請求項４】試料中の分析対象物の存在の有無または量
    を決定するための特異的結合アッセイに使用するための
    キットであって、 （ａ）クロマトグラフ移動促進剤の存在下でコロイド粒
    子標識物質を含む溶液、および （ｂ）毛管現象を示し、選択したクロマトグラフ溶媒に
    より１または２以上の非固定化試薬および反応性試料成
    分のすみやかなクロマトグラフ溶媒移動を行うことがで
    き、少なくとも１つの反応部位を含み、該反応部位は、
    該分析対象物および該コロイド粒子標識物質よりなる群
    から選ばれたものと結合し得る固定化試薬を含むもので
    あるクロマトグラフ媒体 からなることを特徴とするキット。
  5. 【請求項５】コロイド粒子標識試薬、および 乾燥状態から再可溶化させ該コロイド粒子標識試薬のク
    ロマトグラフ溶媒移動を可能にする充分な量の準可溶性
    タンパク質、からなる組成物。
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