CN104937106A - 用于监测生物流体的***和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于诊断、研究和筛选生物流体(例如，与甲醇中毒、乙醇水平和乙二醇中毒有关)中的化学品的组合物和方法。具体地说，本公开涉及用于检测生物流体中的甲酸或甲酸盐、乙醇、乙二醇和其它临床相关化学品的现场护理***和方法。

Description

用于监测生物流体的***和方法
发明领域
本公开涉及用于诊断、研究和筛选生物流体(例如，与甲醇中毒、乙醇水平和乙二醇中毒有关)中的化学品的组合物和方法。具体地说，本公开涉及用于检测生物流体中的甲酸或甲酸盐、乙醇、乙二醇和其它临床相关化学品的现场护理(point of care)***和方法。
发明背景
甲醇中毒每年影响数千人，其中有大比例(15-50％)的人死亡并且有许多人永久地失明或有脑损伤。在捷克共和国的最近一次爆发中，到目前为止报道了超过40人死亡并且超过120人甲醇中毒。
早期诊断对于甲醇中毒的成功治疗至关重要。诊断是困难的，并且许多从未获得确定性诊断，因为很少可利用甲醇分析。另外，样品经常必须经过远距离传送用于分析反应，患者在此之后可能没有诊断就已死亡或离开医院。确认为没有S-甲酸盐增加的代谢性酸中毒的患者具有源于除甲醇中毒以外的原因的代谢性酸中毒并且需要不同治疗。
需要廉价、精确的早期诊断方法，从而允许在治疗有效时实施治疗。特别需要可在床边用于现场护理分析的***。
发明概述
本公开涉及用于诊断、研究和筛选生物流体(例如，与甲醇中毒、乙醇水平和乙二醇中毒有关)中的化学品的组合物和方法。具体地说，本公开涉及用于检测生物流体中的甲酸或甲酸盐、乙醇、乙二醇和其它临床相关化学品的现场护理***和方法。
例如，在一些实施方案中，本发明提供测定装置(例如，用于检测毒素或其代谢物的存在、不存在或水平)，其包括：包含以下物质的测试条：a)脱氢酶(例如，甲酸脱氢酶、醇脱氢酶或甘油脱氢酶；b)指示剂染料；和c)NAD+。在一些实施方案中，测试条进一步包含氨基脲与脱氢酶的组合。本发明不限于特定的指示剂染料。在一些示例性实施方案中，指示剂染料是(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)。本发明不限于用于构建测试条的特定材料。实例包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜(nylon membrane)或混合聚合物膜CQ(IPOC)。在一些实施方案中，测试条进一步包含样品施加垫。在一些实施方案中，测试条进一步包含碳水化合物(例如，海藻糖和/或葡聚糖)。在一些实施方案中，测试条进一步包含表面活性剂(例如，BioTerge AS 40)。在一些实施方案中，测试条进一步包含氧化剂(例如过硫酸氢钾制剂(oxone))。在一些实施方案中，测试条进一步包含牛血清白蛋白和/或心肌黄酶。在一些实施方案中，测试条被包裹在包含至少一个观察窗的外壳(例如，塑料外壳)中。
另外的实施方案提供包含上述测定装置中的任一个的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含第一测试条，所述第一测试条包含甲酸脱氢酶和NAD+；和第二测试条，所述第二测试条包含醇脱氢酶和NAD+。在一些实施方案中，测试条进一步包含氨基脲与脱氢酶的组合。
其它实施方案提供上述试剂盒中的任一个用于检测生物样品中的毒素或其代谢物(例如，甲酸、乙醇或乙二醇)的用途。
本发明的实施方案提供***，其包括：上述试剂盒中的任一个；和用于检测NADH的设备或装置(例如，血糖计或流通测定装置(flowthrough assay))。
在其它实施方案中，本发明提供用于检测来自受试者的生物样品中的毒素或其代谢物的方法，其包括：a)使生物样品与使所述毒素或其代谢物脱氢的脱氢酶和NAD+接触，使得所述毒素或其代谢物与所述脱氢酶和NAD反应以产生NADH；和b)检测NADH。本发明不限于特定的毒素或代谢物。实例包括但不限于甲醇、甲酸、乙醇或乙二醇。本发明不限于特定脱氢酶。实例包括但不限于甲酸脱氢酶、醇脱氢酶或甘油脱氢酶。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使生物样品与氨基脲接触。在一些实施方案中，生物样品是血液(例如，全血)、血清、血浆或尿。在一些实施方案中，脱氢酶和NAD+被包埋在测试条(例如，由合成材料构建)中。在一些实施方案中，使用血糖计、使用心肌黄酶和MTT或使用流通测定装置以分光光度法检测NADH。
在一些实施方案中，生物样品中存在甲酸指示受试者中的甲醇中毒。在一些实施方案中，所述方法进一步包括当生物样品中存在甲酸时治疗受试者的甲醇中毒的步骤。在一些实施方案中，治疗是乙醇或甲吡唑。在一些实施方案中，以70-130mg/dl的浓度施用乙醇。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在治疗期间监测受试者的生物样品中的乙醇水平的步骤。在一些实施方案中，所述方法在3小时或更少时间(例如，2小时或更少时间、1小时或更少时间、30分钟或更少时间、15分钟或更少时间、或5分钟或更少时间)内完成。
在一些实施方案中，本发明提供用于检测来自受试者的生物样品中的甲酸的方法，其包括：a)使生物样品与甲酸脱氢酶和NAD+接触，使得所述生物样品中的甲酸与所述甲酸脱氢酶和NAD反应以产生NADH；和b)检测所述NADH。
本发明进一步提供用于检测来自受试者的生物样品中的乙醇的方法，其包括：a)使生物样品与醇脱氢酶以及任选地氨基脲和NAD+接触，使得所述生物样品中的乙醇与醇脱氢酶以及任选地氨基脲和NAD反应以产生NADH；和b)检测所述NADH。
本发明另外提供用于检测来自受试者的生物样品中的乙二醇的方法，其包括：a)使生物样品与甘油脱氢酶和NAD+接触，使得所述生物样品中的乙二醇与甘油脱氢酶和NAD反应以产生NADH；和b)检测所述NADH。
本公开的另外的实施方案提供于下文的说明书和实施例中。
附图说明
图1显示甲酸/甲酸盐的检测的示意图。
图2显示确认为疑似甲醇中毒的患者或确认为未知来源的代谢性酸中毒的患者的示例性评价的流程图。
图3显示确认为疑似甲醇中毒的患者或确认为未知来源的代谢性酸中毒的患者的示例性评价的流程图。
图4显示不同甲酸盐浓度下的显色。
图5显示甲酸盐水平对色彩算法。
图6显示测量的甲酸盐对添加的甲酸盐。
图7显示血清中的甲酸盐的校准曲线
图8显示利用便携式测试条读取器在人血清中测量的甲酸盐(3次重复)。
图9显示全血中的甲酸盐的校准曲线。
图10显示利用便携式测试条读取器在全血中测量的甲酸盐(3次重复)。
图11显示缓冲溶液中的乙醇的校准曲线。
图12显示测量的乙醇对添加的乙醇。
图13显示全血中的乙醇的校准曲线。
图14显示利用实验室制得的测试条读取器对全血中的乙醇的测量。
图15显示便携式比色计的通道1上的甲酸盐测试条的读数。
图16显示便携式比色计的通道3上的甲酸盐测试条的读数。
定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语、符号和其它科学术语或专门名词均具有与本公开所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文所描述和引用的许多技术和程序为本领域技术人员所充分理解，并且通常使用常规方法得以采用。如果适当，除非另有说明，否则涉及使用商购的试剂盒和试剂的程序通常依照制造商规定的方案和/或参数进行。本文引用的所有专利、申请、公开的申请和其它出版物均以引用方式整体并入。如果本部分中所陈述的定义与以引用方式并入本文中的专利、申请、公开的申请和其它出版物中所陈述的定义相反或以其它方式不一致，则以本部分中所陈述的定义而非以引用方式并入本文中的定义为准。
如本文所用的，“一(a)”或“一(an)”意指“至少一”或“一或多于一”。
如本文所用的，术语“检测(detect)”、“检测(detecting)”或“检测(detection)”可描述可检测组成的一般发现或辨别行为或特殊观察。
术语“干试剂测试条”是指呈测试条形式的分析装置，其中将怀疑含有分析物的试样流体施加至所述条(其常常由例如纸、硝酸纤维素和纤维素的吸湿性强的材料制成)。测试流体和任何悬浮的分析物可沿所述条流动至反应区，其中所述分析物(如果存在)与检测剂相互作用以指示所述分析物的存在、不存在和/或量。
术语“样品施加区域”是指其中将流体样品引导至测试条(例如本文所描述的干试剂测试条或其它测定装置)的区域。在一个实例中，可通过外部施加如利用滴管或其它施加器将样品引导至样品施加区域。在另一实例中，例如当将测试条浸入容纳样品的容器中时，可将样品施加区域直接浸没在样品中。在再一实例中，可将样品倾倒或压榨至样品施加区域上。
术语“固体载体”或“衬底”意指不溶的或可通过后续反应变得不溶的材料。多种多样的固体载体为本领域技术人员已知并且包括但不限于硝酸纤维素、反应盘的孔壁、多孔板、试管、聚苯乙烯珠、磁珠、膜、微粒(例如胶乳粒子)和羊(或其它动物)红细胞。该术语涵盖具有足以允许试剂进入的孔隙度以及固定试剂和/或分析物的合适表面亲和力的任何合适的多孔材料。例如，硝酸纤维素的多孔结构对众多种试剂具有极好的吸收和吸附性质。尼龙具有类似的特征并且也是合适的。微孔结构是有用的，具有呈水合状态的凝胶结构的材料也是有用的。
有用的固体载体的其它实例包括：天然的聚合碳水化合物和它们的合成修饰的、交联的或取代的衍生物，例如琼脂、琼脂糖、交联的海藻酸、取代的和交联的瓜尔胶(guar gum)、纤维素酯(尤其是与硝酸和羧酸的纤维素酯)、混合纤维素酯和纤维素醚；天然含氮聚合物，例如蛋白质和衍生物，包括交联的或修饰的明胶；天然烃聚合物，例如胶乳和橡胶；可利用合适地多孔结构制备的合成聚合物，例如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯和其部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、上述缩聚物的共聚物和三元共聚物，例如聚酯、聚酰胺和其它聚合物，例如聚氨酯或聚环氧化合物；多孔无机材料，例如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐(包括硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙)，碱金属和碱土金属、铝和镁的硅酸盐；和铝或硅的氧化物或水合物，例如黏土、氧化铝、滑石、高岭土(kaolin)、沸石、硅胶或玻璃(这些材料可与上述聚合材料用作过滤器)；和上述类别的混合物或共聚物，例如通过在已有天然聚合物上起始合成聚合物的聚合获得的接枝共聚物。
如本文所用的，术语″样品″以其最广泛的意义使用。在某种意义上，其意在包括从任何来源获得的样本或培养物、以及生物样品和环境样品。生物样品可从动物(包括人)获得并且涵盖流体、固体、组织和气体。生物样品包括血液(例如，全血)、血液制品，例如血浆、血清、尿、唾液、痰等。然而，所述实例不应被解释为限制可适用于本发明的样品类型。
发明详述
本公开涉及用于诊断、研究和筛选生物流体(例如，与甲醇中毒、乙醇水平和乙二醇中毒相关)中的化学品(例如，毒素或其代谢物)的组合物和方法。具体地说，本公开涉及用于检测生物流体中的甲酸或甲酸盐、乙醇、乙二醇和其它临床相关化学品的现场护理***和方法。
甲酸是甲醇的毒性(有毒)代谢物，并且没有该甲醇的形成将不会对人有毒(d’Alessandro等，Env.Health Perspectives 102：1681994；Hovda等，J.Analytical Toxicology 292005；这些文献中的每一个均以引用方式整体并入本文中)。甲醇中毒的治疗利用甲醇向甲酸代谢的抑制剂。
可用于检测甲醇中毒的选择非常少。甲醇分析费用昂贵并且不容易得到(在挪威仅几个中心进行甲醇分析，在纽约，分析需要几天，并且在发展中国家，如果它完全可能，则其经常需要几周)。存在替代性间接方法(渗透压测量)，但它们是非特异性的，并且在西方世界以外几乎从不可用。
本公开的实施方案提供针对缺乏用于甲醇中毒的快速(例如，少于几小时、或少于几分钟)、成本有效的测试的解决方案。在一些实施方案中，本发明提供用于利用商购的血糖监测***的修改版本检测生物流体中的临床相关化学品(例如，甲酸、甲酸盐、乙醇或乙二醇)的简化方法。
在一些实施方案中，本发明提供用于检测甲酸的***和方法以检测甲醇中毒、乙醇水平或乙二醇水平。本文所描述的***和方法简单、廉价、快速且利用现有硬件。
I.测定装置、试剂盒和***
本公开的实施方案提供包括用于流动测定或毛细管测定的测试条的测定装置(例如，单独或在试剂盒或***中)。在一些实施方案中，利用其中生物流体流动至干试剂上的测试条或其它干化学***(参见例如美国专利4,774,192和4,877,580；这些专利中的每一个均以引用方式整体并入本文中)。
例如，在一些实施方案中，使用实验部分中描述的方法产生测试条。干化学试剂***的组分吸收到用于测试条的衬底中的顺序通常由涉及化学相容性的考虑因素和/或与在常见溶剂中的溶解度相关的其它因素规定。
在一些实施方案中，本发明的测试条包括多孔衬底，例如膜。多孔衬底优选地在确定的反应区中优选地被允许检测目标分析物的干化学试剂浸渍。在一些实施方案中，多孔衬底被包裹在包含至少一个观察窗的外壳中。在一些实施方案中，多孔衬底在外壳内滑动，使得其可通过观察窗观察，并且衬底的一部分延伸至外壳以外，使得其可被用户抓握，并且在外壳内滑动和/或从外壳移除。在所述装置的操作中，将流体样品(例如体液样品)与多孔衬底接触放置。在一些实施方案中，所述装置还包括样品施加区域(或储库(reservoir))以接收和暂时保持所需体积的流体样品。在一些实施方案中，样品施加区域促进样品施加至多孔衬底，优选地施加于多孔衬底的样品接收表面处并且邻近含有干化学试剂的反应区。样品的流体组分在施加至多孔衬底时通过衬底基质。在该过程中，样品中的分析物(例如，甲酸盐、乙醇、乙二醇)可与试剂(例如，使用本文所描述的方法沉积的干化学试剂)特异性地相互作用，参与化学反应，并且产生可检测信号。可在所述过程的任何时间(例如在施加样品后)增加任选的洗涤步骤。
在优选的实施方案中，样品接收表面基本上不可透过细胞和微粒物质，但允许分析物扩散至多孔衬底中，使得分析物可与干化学试剂接触。在一些实施方案中，将样品施加至多孔衬底的样品接收表面，从而允许样品的流体部分吸附至多孔衬底的基质中和检测指示剂分子。在一些实施方案中，指示剂分子提供样品中目标分析物(例如，甲酸盐)的量的比色定量(例如，半定量测量)。在一些实施方案中，目标分析物与试剂在反应区中的相互作用产生与特定分析物的特定测定值的存在相关的特征性色值集合。在一些实施方案中，测定装置进一步包含比色器，所述比色器包括多个以有序的、优选线性的次序布置的不同色场，每个场的色彩暗示分析物的特定测定值。在一些实施方案中，将比色器布置于外壳上，使得多孔膜可相对于比色器移动以匹配反应区的色彩与比色器上的相应色彩以暗示分析物的特定测定值。在一些实施方案中，单独地(例如，在单独的条上)提供比色器并且通过比较比色器与多孔衬底上的反应区来获得分析物的特定测定值。在一些实施方案中，倘若多孔膜包含样品接收表面，则可优选地倒转所述装置，使得从样品接收表面的相反侧读出色彩。在一些实施方案中，还可将多孔衬底或外壳内的多孔衬底***反射率计、光度计或荧光计中；并且测量报告分子且将其与目标分析物的标准曲线进行比较。仪器然后将基于其观察和与标准的比较报告值。
在一些实施方案中，通过利用含有蛋白质、葡萄糖、糊精或葡聚糖、淀粉、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡喀烷酮(PVP)或等同物的第一溶液进行处理来调整多孔衬底。所述调整的目的是双重的：(a)有效地减少衬底基质内的空隙空间和(b)帮助或促进生物样品的流体部分的吸附。在一些实施方案中，将调整剂与试剂***的一种或多种相互作用材料组合并且同时吸收至衬底中。倘若将调整剂与试剂组合物的相互作用材料组合，则其被衬底的吸收将必定在指示剂分子的吸收之后。
倘若独立于试剂***的相互作用材料实现多孔衬底的所述调整，则在受控条件下干燥所述衬底，然后与一种或多种含有测定组分的溶液接触，所述测定组分例如溶解于合适缓冲液中的酶、底物和指示剂(或指示剂分子的化学前体)。
在一些实施方案中，所述溶液还含有″流动控制剂″。该试剂调节该样品的流体部分在整个衬底的基质内的扩散/分布速率。因此，可有效地阻止在添加流体样品后试剂在膜基质内的色谱分离。在添加该第三溶液后，将衬底风干用于移除过量流体，冻干并且避光。
一旦已制备试剂递送***，即将被干化学试剂浸渍的所得衬底用于对全血或其它样品的分析具有特异性的几种测试条配置中的任一种。
在研发本公开的实施方案的过程中进行的实验筛选了多种色彩指示剂、用于溶解测定试剂的缓冲液、表面活性剂和改进测定组分的稳定性的另外试剂。尽管不将本公开限于特定组分，但在用于检测甲酸盐的一些实施方案中，使用了色彩指示剂MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑鎓)。在一些实施方案中，利用HEPES缓冲液(pH 8)、海藻糖和葡聚糖、BioTerge表面活性剂和过硫酸氢钾制剂来优化性能。
在用于检测乙醇的一些实施方案中，使用了EPPS缓冲液(pH 8.4)并且使用血清白蛋白(BSA)来保护醇脱氢酶免于降解。
沉积于衬底上的特定测定试剂取决于待检测的分析物。在一些实施方案中，本公开可用于检测甲醇(例如，通过甲酸盐)、乙醇或乙二醇。在一些实施方案中，测定试剂包括脱氢酶(例如，甲酸脱氢酶、醇脱氢酶和任选地氨基脲、或甘油脱氢酶)、NAD+、任选地心肌黄酶和指示剂染料(例如，MTT)。用于特定测定条装置中的特定材料将取决于许多变量，包括例如待检测的分析物、样品体积、所需流速和其它。在一些实施方案中，样品垫接收样品，并且可用于从样品移除微粒。在一些实施方案中，样品垫是纤维素。样品垫可用一种或多种脱模剂处理，所述脱模剂例如缓冲液、盐、蛋白质、洗涤剂和表面活性剂。所述脱模剂可用于例如促进缀合物-垫组分的再溶解并且用于阻断横向流动装置的其它组件(例如硝酸纤维素膜)中的非特异性结合部位。代表性的脱模剂包括例如海藻糖或葡萄糖(1％-5％)、PVP或PVA(0.5％-2％)、Tween 20或Triton X-100(0.1％-1％)、酪蛋白(1％-2％)、SDS(0.02％-5％)和PEG(0.02％-5％)。
本公开的实施方案的测试条不限于特定衬底的使用。衬底的物理特征(抗拉强度、厚度等)当然与测试条制造一致；也就是说，其应当具有足够的尺寸稳定性和完整性以允许调整剂、试剂混合剂(cocktail)和/或指示剂的依序吸收和干燥而不损失其物理强度。衬底的物理属性还应当优选地提供足够耐久性和柔性以适应用于连续制造测试条的自动化过程。另外，衬底的物理特征应当以其它方式与含水流体在所预期的使用环境中的吸收和保持一致。
衬底优选地相对化学惰性；也就是说，基本上对化学试剂***的组分以及对待与衬底内的试剂***反应的样品的组分均不起反应。然而，预期衬底表面和/或其基质的某些固有性质可对试剂***的组分和/或流体样品的组分展现一些亲和力。这一自然吸引在某些情况下可有利地用于将试剂混合剂和/或样品的组分固定于一部分衬底之上或之内且由此实现混合剂/样品的组分的一种类型的分离或各向异性分布。这种基于衬底的自然结合亲和力的类型的分离可有利地用于临床化学测定。
衬底的光学性质也应使得能够进行显示指示剂物质的反应的有效观察/监测。因此，这一要求将预期衬底提供足够对比度的背景以允许以相对较低的浓度观察指示剂物质。倘若指示剂是荧光团，则膜的背景荧光应当在所监测的目标波长下最小或基本上没有荧光。
倘若衬底的固有特征无益于指示剂的有效监测，则可能需要将颜料引入干化学试剂***中。例如，可能潜在地适用于本发明的某些膜可以是有色的或透明的。将颜料引入化学试剂***中提供借以测量指示剂物质的合适背景。
在一些优选的实施方案中，用于本发明的测试条的衬底是硝酸纤维素、尼龙或混合聚合物膜CQ(IPOC)。有用衬底的其它实例包括：天然的聚合碳水化合物和它们的合成修饰的、交联的或取代的衍生物，例如琼脂、琼脂糖、交联的海藻酸、取代的和交联的瓜尔胶、纤维素酯(尤其是与硝酸和羧酸的纤维素酯)、混合纤维素酯和纤维素醚；天然含氮聚合物，例如蛋白质和衍生物，包括交联的或修饰的明胶；天然烃聚合物，例如胶乳和橡胶；可利用合适地多孔结构制备的合成聚合物，例如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯和其部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、上述缩聚物的共聚物和三元共聚物，例如聚酯、聚酰胺和其它聚合物，例如聚氨酯或聚环氧化合物；和上述类别的混合物或共聚物，例如通过在已有天然聚合物上起始合成聚合物的聚合获得的接枝共聚物。
预期上文所描述的多孔衬底优选地呈片或条的形式。所述片或条的厚度可在范围内变化，例如，约0.01mm至0.5mm、约0.02mm至0.45mm、约0.05mm至0.3mm、约0.075mm至0.25mm、约0.1mm至0.2mm或约0.11mm至0.15mm。
固体载体的表面可通过引起试剂(例如，测定试剂)与载体共价键接的化学过程来活化。然而，任何其它合适的方法均可用于将试剂固定至固体载体，包括但不限于离子相互作用、疏水相互作用、共价相互作用等。导致试剂固定于固相上的特定力对于本文所描述的方法和装置并不重要。
除非另外受到物理约束，否则衬底可以任何合适的形状(例如膜、片、条或板)使用，或其可被涂覆或粘合或层压至适当的惰性载体(例如纸、玻璃、塑料薄膜或织物)上。
在一些实施方案中，本发明的测定条装置包括吸收材料条或多孔材料条(例如微孔膜)，其在一些情况下，可由各自在可邻接和/或重叠的区中彼此接合的不同物质制成。在一些实例中，吸收条可固定于支撑性非相互作用材料(例如非织造聚酯)上，例如，以增加所述条的刚度。
在一些实施方案中，例如通过浸泡或点样将流体样品(或悬浮于流体中的样品)在样品接收表面引导至条。使用本领域技术人员熟知的方法收集或获得样品。可从任何生物源获得含有待检测的分析物的样品。生物源的实例包括人或动物的血清、血浆、尿、脊髓液、唾液、发酵液、淋巴液、组织培养流体和腹水液。样品可在测定前被稀释、纯化、浓缩、过滤、溶解、悬浮或以其它方式操作以优化结果。流体经远侧迁移穿过所述条的所有功能区。流体在个别功能区中的最终分布取决于所用材料的吸附能力和尺寸。
可适用于本发明的其它有用的测定装置格式描述于例如美国专利号4,770,853；PCT公开号WO 88/08534和欧洲专利号EP-A 0 299428、和美国专利号5,229,073、5,591,645、4,168,146、4,366,241、4,855,240、4,861,711、4,703,017、5,451,504、5,451,507、5,798,273、6,001,658和5,120,643；欧洲专利号0296724、WO 97/06439和WO98/36278，这些专利全部以引用方式并入本文中。
在一些实施方案中，本发明提供包含对于测量生物样品(例如，血液、血浆、血清或尿)中的毒素或其代谢物(例如，甲酸/甲酸盐、乙醇或乙二醇)有用、必要或足够的组分的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：脱氢酶(例如，甲酸脱氢酶、醇脱氢酶(任选地与氨基脲组合)或甘油脱氢酶)、指示剂染料(例如，MTT)、NAD+、阳性对照和使用指导。在一些实施方案中，脱氢酶、NAD+、指示剂染料和任何另外组分被包埋于测试条上。在一些实施方案中，试剂盒包含用于鉴别生物样品中的多种分析物(例如，乙醇和甲醇)的试剂(例如，多个测试条，每个测试条对不同分析物具有特异性；或检测多种分析物的单一条)。
在一些实施方案中，试剂盒通常是便携式的并且提供简单、快速和/或成本有效的方式来确定分析物的存在或不存在，而无需例如现场护理设施中的实验室设施。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括一个或多个如本文所公开的测定装置和任选地读取器或其它检测装置，以及载体构件，例如箱、袋、包(satchel)、塑料纸板箱(例如模制塑料或其它透明包装)、封套(wrapper)(例如密封的或可密封的塑料、纸或金属封套)、或其它容器。在一些实例中，试剂盒组件将被装入在单个包装单元(例如箱或其它容器)中，所述包装单元可具有其中可放置试剂盒的一个或多个组件的隔室。在其它实例中，试剂盒包括一个或多个容器，例如小瓶、管等，所述容器可保持例如一种或多种待测试的生物样品、阳性和/或阴性对照样品或溶液、稀释剂(例如，磷酸盐缓冲液或盐水缓冲液)、检测剂试剂、和/或洗涤溶液(例如，缓冲液、盐水缓冲液或蒸馏水)。
其它试剂盒实施方案包括注射器、手指剌破(finger-prick)装置、酒精棉片(alcohol swab)、纱布块(gauze square)、棉球、绷带、胶乳手套、具有不同数量槽的孵育托盘、粘着板密封物(adhesive plate sealer)、数据报告片(可用于处置、收集和/或处理生物样品)。试剂盒还可任选地含有用于将样品引入测定装置的样品室中的器具，包括例如滴管、一次性移液管(Dispo-pipette)、毛细管、橡胶球(例如，用于毛细管)等。其它试剂盒实施方案可包括用于抛弃用过的测定装置的一次性构件和/或与该装置使用的其它物品(例如患者样品等)。所述一次性构件可包括但不限于能够容纳来自所抛弃的材料的漏出物的容器，例如塑料、金属或其它不可渗透的袋、箱或容器。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒将包括测定装置的使用说明书。所述说明书可提供关于如何向测试装置施加样品、等待形成结果所需或合理的时间量的指导，和关于如何读取和解释测试结果的细节。所述说明书还可包括标准，例如用于比较测试结果的标准表格、图表或图。这些标准可任选地包括使用测试装置对分析物进行定量所需的信息，例如使信号强度或信号线数与因此存在于样品中的分析物的量相关的标准曲线。
在一些实施方案中，本公开提供包含本文所描述的测定装置和检测装置的***。在一些实施方案中，利用当前可用的血糖计来检测毒素或其代谢物的水平(例如，甲酸水平、或甲酸或甲酸盐的存在或不存在、乙醇水平、或乙二醇水平(例如，使用本文所描述的化学性质))。例如，在一些实施方案中，利用商购的血糖计(例如，来自Life Scan，Milpitas，CA；Abbott Laboratories，Abbott Park，Illinois；RocheDiagnostics，Indianapolis，IN))。例如，在一些实施方案中，利用使用图1中所描述的化学性质将葡萄糖脱氢酶与将NAD转化为NADH偶合的葡萄糖计(参见例如美国专利号6,312,888；以引用方式整体并入本文中)。在NADH存在下，使用心肌黄酶作为催化剂，将黄色MTT((3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑鎓，黄色四唑)转变为紫色甲臜(formazan)，以分光光度法对所述紫色甲臜进行定量。如果校准以毫摩尔/每升计，则产生每分子一分子NADH的所有反应均使用与葡萄糖测量相同的校准。
所述血糖计利用了测试条(例如，那些本文所描述的测试条)。将血液施加至测试条。将测试条***血糖计中，所述血糖计然后测量NADH的产生(例如，以分光光度法)。在所述实施方案中，用甲酸脱氢酶、醇脱氢酶(任选地与氨基脲组合)或甘油脱氢酶替换葡萄糖脱氢酶。然后利用上文所描述的化学性质来测量血液或尿中的甲酸/甲酸盐。
本发明不限于使用血糖计用于检测。在一些实施方案中，将本文所描述的化学性质应用于毛细管微流体平台(参见例如Chem.Soc.Rev.，2010，39，1153-1182；以引用方式整体并入本文中)、纸基装置(参见例如Anal.Chem.2009，81，8447-8452；以引用方式整体并入本文中)、实验室测试条读取器或滤纸。
II.方法：
在一些实施方案中，本文所描述的装置、试剂盒、***和方法可用于在现场监测甲醇爆发、乙二醇中毒和乙醇水平。在一些实施方案中，***、试剂盒和方法可用于其中能够在现场快速且廉价地检测甲醇中毒特别有用的发展中世界。本文所描述的***和方法能够使用一滴血液在15-120秒内提供确定性诊断而不依赖于实验室装备。
乙醇中毒、代谢性酸中毒和甲醇中毒的症状可能难以区别。另外，一些甲醇中毒事件是乙醇被甲醇污染的结果。重要的是能够快速地区别酸中毒、乙醇中毒和甲醇中毒以施用适当的治疗。因此，在一些实施方案中，本文所描述的***和方法可用于区别受试者中对甲醇和乙醇的暴露或未知来源或其它来源的代谢性酸中毒。使用用于检测甲醇的测试条(例如，用于检测甲酸/甲酸盐的测试条)和用于检测乙醇的测试条来快速提供诊断。
在一些实施方案中，使用本文所描述的***和方法来监测对甲醇中毒的治疗。在一些实施方案中，通过施用乙醇或甲吡唑来治疗甲醇中毒。在用乙醇治疗期间，重要的是密切监测乙醇的血液水平以将它们保持在适当的治疗范围(例如，70-130mg/dl)内。本公开的实施方案的测试条可用于快速检测血液中的乙醇水平并且适用于用乙醇进行监测性治疗。在一些实施方案中，同时测量甲酸盐水平与乙醇水平以确认该治疗是有效的。
实验
提供以下实施例以证实和进一步说明本公开的某些优选实施方案和方面并且不应将其解释为限制本公开的范围。
实施例1
试剂
1.商购自例如Sigma和许多其它公司的NAD(烟酰胺二核苷酸)。
2.来自Roche的甲酸脱氢酶(目录编号244 678，含有80U或其它浓度)
3.磷酸盐缓冲液(pH＝7.5)，例如0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH＝7.5)
供使用的试剂的制备：
NAD和甲酸脱氢酶两者均以干燥状态出售并且稳定达延长的时期。
1.将约0.2g NAD溶解于30ml缓冲液中。(试剂1)
2.将一瓶甲酸脱氢酶(80U)的内含物溶解于5ml缓冲液中(试剂2)
两种试剂均在4-8℃稳定约4-5天并且冷冻试剂(优选在-40℃或低于-40℃)稳定多个月。
分析
1.混合1份样品(血清或血液)、10份试剂1和5份试剂2。
2.在37℃孵育5-10分钟或在20℃孵育7-10min。
3.在光度计中在340nm下测量吸光度。
结果的评价
1.试剂本身(在样品不存在下)产生约0.1-0.3的吸光度。
2.甲酸盐通常存在于血清中并且产生小于0.1的额外吸光度。
3.高于试剂的吸光度超过0.1的吸光度是病理的并且指示增加的甲酸盐浓度。含有5mmol/l甲酸盐的血清通常显示0.7-0.8的吸光度，也就是说高于试剂的吸光度0.6-0.7个吸光度单位。
在一些实施方案中，对含有已知量的甲酸盐的血清与作为对照的患者血清样品一起进行分析并且校准所分析的患者样品中的甲酸盐浓度。
实施例2
本实施例描述了比色的干试剂测试条的研发，所述干试剂测试条用于通过简单的浸泡和读取(dip and read)程序以≤2mM的检测限测量于缓冲溶液中在0-20mM范围内的甲酸盐。所述条还可用于测量例如全血和血清中的甲酸盐。
所研发的甲酸盐测试条是干试剂、自配量(self-dosing)、“浸泡和读取”的比色测试装置，其以干燥状态含有测量甲酸盐所需的所有试剂。使用以下试剂：甲酸脱氢酶(Roche Applied Sciences)、心肌黄酶(Sigma D2197)、MTT(Sigma M2128)、NAD(Sigma N1636)。甲酸盐配方中还包含其它组分以实现更较好的酶稳定性和条性能。
如下制得所述条：
a.首先通过制备HEPES缓冲液(pH 7.9)来制备单一试剂混合物。
b.从100U/mL母液(在相同缓冲液中)添加酶。
c.将所有其它成分作为干粉添加至所述混合物中并且轻轻搅拌。
d.通过简单的浸泡工艺将PVP/PES混合的聚合物多孔膜用试剂混合物浸渍。
e.将膜在45℃干燥1小时。
f.通过双面粘着剂将膜附着至白色聚苯乙烯塑料载体。
用于甲酸盐的半定量测量的程序简单且快速。所述程序涉及将所述条浸入测试溶液中并且对所述条的色彩与色表进行比较。所述分析需要约2分钟。在所述条的一侧上施加血液并且从另一侧记录结果。
所研发的测试条还可用于利用适当的反射计定量地测量甲酸盐。
评价4种不同的色彩指示剂，所有心肌黄酶底物，包括MTT、INT、NBT和2，6-二氯酚吲哚酚。它们都没有MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑鎓作用得好。本研究中使用MTT。
评价几种生物pH缓冲液和其它pH缓冲液，包括在7.5-8.5的pH范围内的磷酸盐、硼酸盐、咪唑、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、Tris、bis-Tris、bis-Tris丙烷、Epps和HEPES。发现HEPES(pH 8)更优选，因为其提供更低的背景色彩和更好的稳定性。针对在1-20mM范围内最好的测试条性能和甲酸盐检测来优化缓冲液、指示剂和酶活性的浓度。
进行另外组分的筛选以实现更好的酶稳定性和条性能。这些组分是聚合物，例如聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、BSA、Metocell、Klucel和Gantez；和碳水化合物，例如：蔗糖、乳糖醇、乳糖、环糊精、山梨醇和海藻糖。所述碳水化合物中的多数改进测试条在40℃干燥条件下的稳定性。选择海藻糖与葡聚糖添加剂的组合。
进行不同表面活性剂的筛选以改进测试条润湿性质。Brige 35、BioTerge AS 40、Triton X-100、Tween 20、苯扎铵(benzalconium)、胆酸钠、Igepal 210、Chemal LA-9、Tetronic 1307、Pluronic L64、StandapolES-1、Rhodasuron 870。多数洗涤剂对背景色彩具有负作用。BioTergeAS 40不影响背景色彩并且被选择作为测试条配方的添加剂。
评价例如氯胺T、亚硝酸钠和过硫酸氢钾制剂的氧化剂添加剂作为NADH清除剂以改进在1-20mM甲酸盐范围内的测试条色彩差异(color distinction)。选择过硫酸氢钾制剂来改进色彩差异并且优化其浓度。
筛选几种多孔膜作为用于甲酸盐测试条的基质并且将最好的用于本研究中。其包括：硝酸纤维素Hi-Flow膜(Millipore)、Nitrobind和BioTrace(Pall)；尼龙膜Immunodyne ABC、Biodyne A和Biodyne B(Pall)；用于血液分离的PES膜Vivid GR、GX、GF(Pall)、Cytosep 1660(Pall)；来自(IPOC)的混合聚合物膜X、NX、CQ和SG。硝酸纤维素和尼龙膜显示相当好的性能和低背景显色。然而，选择了混合聚合物膜CQ(IPOC)，因为其可用于血液分离并且可用于全血测试装置。
研发用于甲酸盐标准溶液中的半定量甲酸盐测量的色表。使用生理缓冲溶液制备甲酸盐标准物。利用Evik实验室制得的反射计进行甲酸盐的定量测量。
如下文所描述的制备甲酸盐测试条样品并且进行评价。
利用色表进行半定量分析并且利用色彩分析器(Evik实验室)进行定量分析以评价甲酸盐测试条的性能。
-半定量甲酸盐测量
用于甲酸盐的半定量测量的程序简单且快速。所述程序涉及将条浸入测试溶液中5秒，将其取出并且在2分钟内对所述条的色彩与色表进行比较。当溶液中的甲酸盐水平从0mM变成20mM或高于20mM时，所述条从黄色变成紫色。用于测量甲酸盐的色表具有4个色块，指示0mM、1mM、5mM和20mM。如果所述条的色彩匹配所述色块中的一个，则可在相应的色块下读取甲酸盐水平。如果所述条的色彩在相邻色块之间，则应当使用甲酸盐水平的中间数。所得结果参见表1。
表1.利用色表半定量测量甲酸盐的结果。
-甲酸盐测试条的仪器读数
进行本研究以证实定量测量甲酸盐的可行性并且用于初步确定精确度和检测限。在条活化后1分钟、2分钟和3分钟内利用Evik色彩分析器收集几种甲酸盐标准物的RGB(红色、绿色、蓝色)数值。结果示于图4中。
确定用于计算甲酸盐水平的色彩算法(特殊RGB组合)和方程。结果示于图5中。
制备甲酸盐溶液(0mM、1mM、3mM、5mM、10mM和20mM，在PBS缓冲液中)。在这些溶液中的每一种中活化2-3个条(重复)并且在条活化后2分钟内利用Evik色彩分析器确定甲酸盐浓度。在样品甲酸盐水平与测量的甲酸盐水平之间观察到良好的相关性。结果示于图6中。在条活化后1分钟内观察到类似结果，但当时有更高的数据离散性。
结果显示所研发的测试条原型可用于以小于1mM的检测限定量测量在0-20mM范围内的甲酸盐。
实施例3
本实施例描述血清和全血中的甲酸盐的检测。
血清中的甲酸盐
所用的材料：
对于本研究，使用早期研发的甲酸盐测试条配方和来自Cedarlane laboratories的汇集的人血清。
血清样品的制备：
通过向人血清中添加甲酸盐母液(0.1M和0.5M，pH 7.5)来制备具有0mM、1mM、3mM、5mM、10mM和20mM甲酸盐的血清样品。
条活化：
将20μL血清样品放置在甲酸盐试剂垫的顶表面上。5秒后，从条表面移除过量液体。在条活化后2分钟内测量所述条的色彩。
目视评价：
目视读数显示血清中的所有甲酸盐水平(0mM、1mM、3mM、5mM、10mM和20mM)之间的明显色彩差异。所述条的色彩在0-20ppm甲酸盐范围内从淡黄色-浅绿色变成绿色变成蓝色。浅绿色色调归因于黄色血清色彩。
仪器条读数：
利用由Evik Diagnostics公司(Canada)制得的实验室测试条读取器进行仪器读数。利用血清中的标准甲酸盐溶液校准比色计。收集0mM、1mM、3mM、5mM、10mM和20mM甲酸盐的RGB数值。基于该数据研发色彩算法(参见图7)。观察到血清本身以及在血清中活化的测试条具有黄色色调。因此，为了消除来自血清的潜在干扰，进行色彩算法的特殊校正。从针对具有甲酸盐的血清样品获得的RGB数值减去针对在“零甲酸盐”血清样品中活化的条获得的标准化的RGB数值。选择标准化的B/G比率作为用于血清中的甲酸盐的色彩算法(图7)。
人血清中的定量甲酸盐测量的结果：
制备具有0mM、1mM、3mM、5mM、10mM和20mM甲酸盐的血清样品并且对每个甲酸盐水平进行三次重复。如图8中所示，观察到测量的甲酸盐与甲酸盐标准物之间的良好相关性。
全血中的甲酸盐
所用的材料：
为了测量血液中的甲酸盐，使用如本文所描述的甲酸盐测试条。从Cedarlane laboratories获得羊全血样品。使用两种类型的血样：柠檬酸盐处理的血液和脱纤维蛋白的血液。
血样的制备：
通过向塑料容器中的全血中添加甲酸盐母液(0.1M和0.5M，pH7.5)来制备具有0mM、1mM、3mM、5mM、10mM和20mM甲酸盐的血样。
早期研发的用于测量的测试条的评价：
首先测试与针对缓冲溶液所研发的条设计相同的条设计。将20μL血样放置在试剂垫的顶表面上。5秒后，从条表面移除过量血液。在条活化后2分钟内目视观察所述条的色彩。
观察到在“零ppm”甲酸盐样品中活化的测试条具有相当强的红色。在5ppm、10ppm和20ppm甲酸盐下见到蓝色色调的明显增加。然而，在0ppm、1ppm和3ppm甲酸盐中活化的条没有观察到色彩差异或观察到非常小的色彩差异。
新的基于孔的甲酸盐测试条的研发。
评价用于全血施加的几种不同设计。例如，评价两种试剂和血液分离膜的堆叠。评价用于垂直和横向血液分离的膜。由于手动装置组件而观察到一些看起来有前景但有显著结果可变性的组合。两个膜之间的不均匀接触界面导致不均匀的垫润湿和色彩。
通过在用于垂直血液分离的多孔膜上直接施加甲酸盐试剂配方获得多数可再现的结果。通过双面粘着薄膜将甲酸盐试剂纸附着至穿孔塑料载体件。由此使试剂纸的两个表面暴露于环境。
基于孔的甲酸盐测试条的活化：
将10μL血样放置在试剂垫的顶表面上。15秒后，从条表面移除过量血液。在条活化后2分钟内通过所述条的相反(底部)侧上的孔读取所述条的色彩。
基于孔的甲酸盐测试条的目视读数：
通过比较在两个在0-20mM甲酸盐范围内的相邻血样中活化的条的色彩来进行目视读数。目视读数显示具有0mM、1mM、3mM、5mM、10mM和20mM甲酸盐的血液中的所有甲酸盐水平之间的明显色彩差异。
基于孔的甲酸盐测试条的仪器读数：
利用由Evik Diagnostics公司制得的便携式测试条读取器进行仪器读数。观察到，当在“零ppm”血样中活化所述条时仍然观察到小的红色色调。因此，为了消除这一来自血液的干扰，进行色彩算法的校正。从针对具有甲酸盐的血样获得的RGB数值减去针对在“零甲酸盐”血样中活化的空白条获得的标准化的RGB数值。选择标准化的(Rb-Rf)*(Bf-Bb)方程作为用于血液中的甲酸盐的色彩算法(图9)。
全血中的定量甲酸盐测量的结果：
制备具有0mM、1mM、3mM、5mM、10mM和20mM甲酸盐的血样并且对每个甲酸盐水平进行三次重复。如图10中所示，观察到全血中测量的甲酸盐与甲酸盐标准物之间的良好相关性。
实施例4
本实施例描述了使用测试条检测缓冲溶液中的乙醇。
在早期研发的甲酸盐测试条配方中用甲酸脱氢酶(FDH)替换醇脱氢酶(ADH)。
除了在测试条配方中用醇脱氢酶(ADH)替换甲酸脱氢酶(FDH)外，以与早期研发的甲酸盐测试条相同的方式制备乙醇条。
通过浸入0mM、0.25mM、0.5mM和1.5mM乙醇的乙醇缓冲溶液中来活化乙醇条。在所述条活化后1-10分钟内没有观察到显色。ADH在这些条件下不起作用。
新的乙醇测试条(E-02A配方)的研发。
所用的材料：
从Sigma-Aldrich获得醇脱氢酶。使用与针对甲酸盐测试条相同的心肌黄酶和MTT。调节支撑性组分以在Immunodyne尼龙多孔膜(Pall)上提供目视色彩变化。
乙醇测试条的制备：
通过将多孔尼龙膜浸入浸渍混合物中并且在40℃干燥30min来制备测试条。通过双面粘着膜将试剂垫附着至塑料载体。
乙醇样品的制备：
通过向PBS缓冲液中添加乙醇母液(10g/L)来制备在PBS缓冲液中具有0g/L、0.125g/L、0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L和1.5g/L乙醇的乙醇样品。
测试条活化：
将所述条浸入乙醇溶液中5秒并且将其移出。利用滤纸移除过量液体。在条活化后2分钟内利用于Evik Diagnostics公司(Canada)制得的实验室测试条读取器读取所述条的色彩。
乙醇测试条的仪器读数：
选择标准化的(Ro-Rf)/(Bo-Bf)比率作为用于缓冲溶液中的乙醇的色彩算法。在0-0.75g/L乙醇内增加色彩算法。在0-0.75g/L乙醇范围内校准所述条(参见图11)。
使用该校准曲线，利用EDI条读取器测量PBS缓冲液中的0g/L、0.125g/L、0.25g/L、0.5g/L和0.75g/L乙醇的乙醇样品。结果示于图12中。在添加的乙醇与测量的乙醇之间观察到良好相关性。这些结果指示，为了测量全血中的乙醇，血样应当以至少1∶2(v/v)稀释。
实施例5
本实施例描述使用测试条检测全血中的乙醇。
利用全血对乙醇测试条(配方E-2A)的评价。
发现用于测量缓冲溶液中的乙醇的乙醇测试条(配方E-2A)对于全血样品并不起作用。因此研发与血液分离膜相容的新配方，并且设计基于孔的测试条。
新的基于孔的乙醇测试条原型(配方E-3B)的研发。
所用的材料：
从Sigma-Aldrich获得醇脱氢酶。使用与针对甲酸盐测试条相同的心肌黄酶和MTT(实施例2)。改变支撑性组分。从Cedarlanelaboratories获得羊全血样品。使用两种类型的血样：柠檬酸盐处理的血液和脱纤维蛋白的血液。
新的基于孔的乙醇测试条(配方E-3B)的制备：
评价几种不同的掩蔽剂以降低血液分离膜材料对醇脱氢酶稳定性的作用。评价用增稠剂(聚合物)对血液分离膜的预处理。牛血清白蛋白(BSA)的添加保护醇脱氢酶免于降解。首先制备EPPS缓冲液(pH8.4)并且在温和搅拌下将如表2中所示的所有其它试剂溶解于该溶液中。
表2
通过如上文实施例2中所描述的浸渍工艺将该醇试剂配方直接施加至用于垂直血液分离的多孔膜。将试剂纸在炉中在40℃干燥30min。通过双面粘着薄膜将乙醇试剂纸基质附着至穿孔塑料载体件。由此使试剂纸的两个表面暴露于环境。
血样的制备：
通过向塑料容器中的全血中添加乙醇母液(100g/L)来制备具有0g/L、0.125g/L、0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L和1.5g/L乙醇的血样。
基于孔的乙醇测试条的活化：
将10μL血样放置在试剂垫的顶表面上。15秒后，从条表面移除过量血液。在条活化后3分钟内通过所述条的相反(底部)侧上的孔读取所述条的色彩。
基于孔的乙醇测试条的目视读数：
通过比较在两个在0-1.5g/L乙醇范围内的相邻血样中活化的条的色彩来进行目视读数。目视读数显示血液中的所有乙醇水平(0g/L、0.125g/L、0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L、1.0g/L和1.5g/L乙醇)之间的明显色彩差异。
基于孔的乙醇测试条的仪器读数：
利用由Evik Diagnostics公司制得的实验室测试条读取器进行仪器读数。观察到，当在“零ppm”血样中活化所述条时观察到小的红色色调。因此，为了消除这一来自血液的干扰，进行色彩算法的特殊校正。从针对具有乙醇的血样获得的R数值减去针对在“零乙醇”血样中活化的空白条获得的标准化的R数值。选择R值作为用于血液中的乙醇的色彩算法(图13)。
全血中的乙醇的定量测量的结果：
制备具有0g/L、0.125g/L、0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L和1.5g/L乙醇的血样并且对每个乙醇水平进行三次重复。如图14中所示，观察到全血中测量的乙醇与添加的乙醇之间的线性相关性。
实施例6
本实施例描述对商购的便携式比色计上的甲酸盐条测定的分析。
来自ITS的水质计：
多通道便携式比色计/测试条读取器(Pool Check i测试条分析器)购自ITS公司(USA)。该测试条读取器被设计用于同时测量6种不同的水溶性组分。所述水质计适用于使用具有特定测试垫大小的规则测试条。ITS声称它们的水质计是“医疗”质量的水质计。
所用的方法：
使用6通道条读取器以查明一个或多个通道是否允许利用所研发的甲酸盐测试条测量甲酸盐。制备在所述条上具有特定的测试垫大小和测试垫位置的改良的甲酸盐测试条。评价制备的条在每个通道上的性能。
改良的甲酸盐测试条的活化。
将所述条在具有0mM、1mM、3mM、10mM和20mM甲酸盐的PBS缓冲液中浸泡3秒。通过振荡移除过量液体并且将所述条放置在条槽上。在所述条活化后2分钟内在每个通道上读取所述条的色彩。
所得结果：
发现两个通道(通道#1(TC，总氯)和通道#3(FC，游离氯))允许测量在0-20mM范围内的甲酸盐。两个ITS条(TC和FC)在0-10ppmTC或FC范围内从淡黄色变成蓝色变成紫色。该色彩变化类似于甲酸盐测试条的色彩范围。
图15显示通道#1(TC)上的条的性能。如图15中所示，当在该通道上评价甲酸盐条时，在所有甲酸盐水平(0mM、1mM、3mM、10mM和20mM甲酸盐)之间均观察到良好的色彩差异(相对单位，TC ppm)。
图16显示通道#3(FC)上的条的性能。所述条的色彩(相对单位，FC ppm)相对于甲酸盐标准物的改变是几乎线性的。在这种情况下，检测限较低，1mM甲酸盐被读作0mM。
尽管已结合本公开描述多种实施方案，但应当理解，所要求保护的本发明不应过度限于所述具体实施方案。实际上，本发明所描述的组合物和方法的多种修改和变化对本领域技术人员来说将是显而易见的，且意在属于所附权利要求的范围内。

Claims (41)

1.一种测定装置，其包括：
多孔衬底，其包含a)选自由甲酸脱氢酶、醇脱氢酶和甘油脱氢酶组成的组的试剂；b)指示剂染料；和c)NAD+。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述指示剂染料是(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)。
3.如权利要求1所述的装置，其中所述多孔衬底选自由硝酸纤维素膜、尼龙膜和混合聚合物膜CQ(IPOC)组成的组。
4.如权利要求1所述的装置，其中所述多孔衬底包含样品接收表面。
5.如权利要求1所述的装置，其中所述多孔衬底进一步包含碳水化合物。
6.如权利要求5所述的装置，其中所述碳水化合物是海藻糖和/或葡聚糖。
7.如权利要求1所述的装置，其中所述多孔衬底进一步包含表面活性剂。
8.如权利要求7所述的装置，其中所述表面活性剂是BioTergeAS 40。
9.如权利要求1所述的装置，其中所述多孔衬底进一步包含氧化剂。
10.如权利要求9所述的装置，其中所述氧化剂是过硫酸氢钾制剂。
11.如权利要求1所述的装置，其中所述多孔衬底进一步包含牛血清白蛋白。
12.如权利要求1所述的装置，其中所述多孔衬底进一步包含心肌黄酶。
13.如权利要求1所述的装置，其中所述多孔衬底被包裹在包含至少一个观察窗的外壳中。
14.如权利要求1所述的装置，其中所述多孔衬底进一步包含氨基脲
15.一种试剂盒，其包含：如权利要求1至14中任一项所述的测定装置。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含第一测试条，所述第一测试条包含甲酸脱氢酶和NAD+；和第二测试条，所述第二测试条包含醇脱氢酶和NAD+。
17.如权利要求15或16所述的试剂盒用于检测生物样品中的甲酸、乙醇或乙二醇的存在的用途。
18.一种***，其包括：
a)如权利要求15或16所述的试剂盒；和
b)用于检测NADH的装置。
19.如权利要求18所述的***，其中所述装置是血糖计或流通测定装置。
20.一种用于检测来自受试者的生物样品中的毒素或其代谢物的方法，其包括：
a)使生物样品与使所述毒素或其代谢物脱氢的脱氢酶和NAD+接触，使得所述毒素或其代谢物与所述脱氢酶和NAD反应以产生NADH；和
b)检测所述NADH。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述毒素或其代谢物选自由甲醇、甲酸、乙醇和乙二醇组成的组。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述脱氢酶选自由甲酸脱氢酶、醇脱氢酶和甘油脱氢酶组成的组。
23.如权利要求20所述的方法，其进一步包括使所述生物样品与氨基脲接触。
24.如权利要求20所述的方法，其中所述生物样品是血液、血清、血浆或尿。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述脱氢酶和所述NAD+被包埋在测试条中。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述测试条选自由硝酸纤维素膜、尼龙膜和混合聚合物膜CQ(IPOC)组成的组。
27.如权利要求20所述的方法，其中以分光光度法检测所述NADH。
28.如权利要求20所述的方法，其中使用血糖计检测所述NADH。
29.如权利要求20所述的方法，其中使用心肌黄酶和MTT检测所述NADH。
30.如权利要求20所述的方法，其中使用流通测定装置检测所述NADH。
31.如权利要求20所述的方法，其中所述生物样品中存在所述甲酸指示所述受试者中的甲醇中毒。
32.如权利要求31所述的方法，其进一步包括当所述生物样品中存在甲酸时治疗所述受试者的甲醇中毒的步骤。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述治疗是乙醇或甲吡唑。
34.如权利要求33所述的方法，其中以70-130mg/dl的浓度施用所述乙醇。
35.如权利要求32所述的方法，其进一步包括在所述治疗期间监测所述受试者的所述生物样品中的乙醇水平的步骤。
36.如权利要求20所述的方法，其中所述方法在1小时或更少时间内完成。
37.如权利要求20所述的方法，其中所述方法在5分钟或更少时间内完成。
38.一种用于检测来自受试者的生物样品中的甲酸的方法，其包括：
a)使生物样品与甲酸脱氢酶和NAD+接触，使得所述生物样品中的甲酸与所述甲酸脱氢酶和NAD+反应以产生NADH；和
b)检测所述NADH。
39.一种用于检测来自受试者的生物样品中的乙醇的方法，其包括：
a)使生物样品与醇脱氢酶和NAD+接触，使得所述生物样品中的乙醇与所述醇脱氢酶和NAD+反应以产生NADH；和
b)检测所述NADH。
40.一种用于检测来自受试者的生物样品中的乙醇的方法，其包括：
a)使生物样品与醇脱氢酶和氨基脲和NAD+接触，使得所述生物样品中的乙醇与所述醇脱氢酶和氨基脲和NAD反应以产生NADH；和
b)检测所述NADH。
41.一种用于检测来自受试者的生物样品中的乙二醇的方法，其包括：
a)使生物样品与甘油脱氢酶和NAD+接触，使得所述生物样品中的乙二醇与所述甘油脱氢酶和NAD反应以产生NADH；和
b)检测所述NADH。
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