JP3108115B2 - イムノクロマトグラフ法による物質検出法 - Google Patents

イムノクロマトグラフ法による物質検出法

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JP3108115B2 JP03064504A JP6450491A JP3108115B2 JP 3108115 B2 JP3108115 B2 JP 3108115B2 JP 03064504 A JP03064504 A JP 03064504A JP 6450491 A JP6450491 A JP 6450491A JP 3108115 B2 JP3108115 B2 JP 3108115B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、いわゆるサンドイッチイムノア
ッセイと、反応・未反応成分の分離（一般的にはＢＦ分
離と呼ばれる)のためのクロマトグラフを併用したイム
ノクロマトグラフ法により、試料中の被検出物質の存在
の有無を文字の出現により判定する方法の改良法に関す
るものである。本発明方法は、体外診断薬分野、殊に目
視判定による診断が利用される分野で利用され、判定結
果が鮮明な文字として表示される為、特に訓練をしてい
ない人でも容易に診断結果を知ることができるものであ
る。
【０００２】従来から知られているイムノクロマトグラ
フ法の測定原理は以下の通りである。即ち、まず通常長
方形のクロマトグラフ媒体、例えば濾紙、のほぼ中央部
に被検出物質と特異的に結合する第一抗体を固定してお
く。別に、被検出物質と特異的に結合する第一抗体とは
異なる抗体、即ち第二抗体を用意し、これを検出しやす
い標識物質に結合させ、標識化された第二抗体を調製す
る。この第二抗体と、被検出物質を含んでいると思われ
る試料溶液を混合すると、(標識物質)−(第二抗体)−
(被検出物質)の結合物が生成する。この結合物を含む試
料溶液をクロマトグラフ媒体の末端に接触させて展開す
ると、結合物が展開方向に順次移動し、固定化された第
一抗体に到達し、(標識物質)−(第二抗体)−(被検出物
質)−(第一抗体)からなる複合体が形成される。この様
にして、第一抗体を固定した位置に、標識物質によるマ
ーク、例えば色が残存することとなり、これにより被検
出物質の存在を確認することができるのである。
【０００３】以上述べた様なイムノクロマトグラフ法を
利用した体外診断薬キットは現在、数多く知られてお
り、かつ市販されているが、その判定方法は第一抗体部
位に於けるスポットあるいはラインの着色の有無で検出
するものがほとんどである。この様な判定方法では、着
色の程度により陰性、陽性の判定が紛らわしい場合が起
こりうる。そこで使用者にとって判定が容易である(＋)
(−)による表示が提案されている(公開特許公報昭６４
−３２１６９号公報)。この方法は、クロマトグラフ媒
体上に(＋)文字のいずれか一方のライン、例えば縦方向
ラインに第一抗体を結合させ、一方、横方向ラインには
被検出物質標品または第二抗体に対する抗体を予め結合
させておくというものである。もし試料溶液が被検出物
質を含んでいない場合は、横方向のラインにのみ(標識
物質)−(第二抗体)−(被検出物質標品)または(標識物
質)−(第二抗体)−(第二抗体に対する抗体)からなる複
合体が形成され、結果として(−)文字が表われ、一方、
試料溶液中に被検出物質が含まれている場合には、(＋)
文字の横方向のラインには上記複合体が、縦方向ライン
には(標識物質)−(第二抗体)−(被検出物質)−(第一抗
体)からなる複合体が形成され、その結果、(＋)文字が
表われることになる。この方法によれば、仮にクロマト
グラフ媒体上に固定した被検出物質標品および／または
標識物質と予め結合させた第二抗体が何らかの理由で失
活していた場合、あるいは操作上に何らかの重大なミス
があった場合には、横方向のラインも表われないことと
なり、診断試験が正しく行われたか否かを判断すること
が出来る。この様に、この(＋)(−)表示法は、診断試験
の正当性を確認できるという大きな特徴も持っているも
のである。
【０００４】しかしながら、この(＋)(−)表示法は展開
方向に平行に描かれているライン、即ち(＋)文字の縦方
向のラインは鮮明に発色させることが難しいという重大
な欠点を有する。これは、次の様な理由による。即ち、
試料溶液中に被検出物質が含まれていた場合、(標識物
質)−(第二抗体)−(被検出物質)からなる結合物が(＋)
文字の縦方向のラインの下端に達した時、第一抗体と反
応して(標識物質)−(第二抗体)−(被検出物質)−(第一
抗体)からなる複合体を形成するが、このラインの下端
部で形成された複合体が試料溶液の移動を妨げ、縦方向
ラインの上部の固定化第一抗体には試料溶液が接触しな
いこととなり、その結果、添付の図面を参照すれば理解
される様に、横方向ラインより下部にあるラインだけが
反応したり、あるいは縦方向のラインの上端、下端のみ
が反応したりして、正しい(＋)文字が形成されないから
である。
【０００５】この様な理由で、(＋)(−)表示法による現
在市販されている診断薬キットには、上端あるいは中央
部の欠けた不完全な(＋)文字でも陽性と判定する旨の指
示書が付されているのが現状である。
【０００６】上記の欠点を克服する為、以下に示す様な
工夫がなされてはいる。
【０００７】(１) 最初から展開方向と平行なライン
(縦方向ライン)を標識と同じ色で印刷しておき、展開方
向に垂直なライン(横方向ライン)上で反応が起った場合
に「＋」として表示されるもの、例えば、市販のＰＡＣＩ
ＦＩＣ ＢＩＯＴＥＣ社製Ｃ・Ａ・Ｒ・Ｄ・Ｓ±RＯ・ＳTMが
ある。
【０００８】(２) クロマトグラフ展開方向を縦横のラ
インに対し斜めにする方法、例えば、市販のＡＢＢＯＴ
Ｔ ＬＡＢ.社製ＴＥＳＴＰＡＣＫ＋ＰlusTMがある。
【０００９】しかしながら、これらの方法も、種々の欠
点を有し、満足し得るものではない。即ち、(１)の方法
では、先に述べた診断試験の正当性を確認するための手
段、即ち横方向のラインに予め被検出物質標品を結合さ
せておく、という方法を採用することができず、診断試
験の信頼性を担保することができない。また、(２)の方
法では、「く」の字状に反応が起るのみで、何ら上記欠点
を克服することができず、正しく(＋)文字を形成させる
ことができない。
【００１０】本発明者らは、かかる状況に鑑み、明瞭に
(＋)(−)表示が現れる方法を開発すべく、種々検討を重
ねた結果、驚くべきことに、試料溶液の移動通路上に適
当な妨害手段を設けて展開液の流れを乱すという極めて
原始的な手段を施すことにより、(＋)文字の縦方向のラ
イン上の第一抗体を完全に反応させることができること
を見い出した。更に研究を続けた結果、(＋)(−)表示を
他の文字、例えばＹＥＳ、ＮＯを表わす「Ｙ」、「Ｎ」文字
にしても、同様に鮮明に描き得ることを確認した。本発
明は、かかる知見に基いて完成されたものである。
【００１１】即ち本発明は、試料溶液中に存在しうる被
検出物質と特異的に結合する第一抗体をクロマトグラフ
媒体のほぼ中央部に文字状に固定し、該クロマトグラフ
媒体の下部または上部から該被検出物質と特異的に結合
する標識化された第二抗体を含有している該試料溶液を
展開させ、標識化された第二抗体と結合した試料溶液中
に存在しうる該被検出物質を文字状に固定化された第一
抗体に捕捉させることによって、該試料溶液中の被検出
物質の存在または非存在を、標識物質により視覚的に検
出可能となった文字により判定することからなるイムノ
クロマトグラフ法による物質検出法であって、固定化さ
れた第一抗体の直前、あるいは直前および直後に展開液
通過妨害手段を設けることにより、標識化された第二抗
体と結合した被検出物質と文字状に固定化された第一抗
体との接触を良好ならしめることを特徴とする方法を提
供するものである。
【００１２】本明細書に於いて試料溶液とは、検出しよ
うとする物質、即ち被検出物質が含まれている、あるい
は含まれている疑いのある生体から採取した体液、例え
ば血液、尿、あるいはその適当な希釈液を意味する、被
検出物質とは、免疫反応に関与する物質、特に各種の診
断に於いて検出の対象となっている抗原性物質、ハプテ
ンおよび抗体を意味する。本発明において、検出の対象
として適した抗原性物質としては甲状腺刺激ホルモン
(ＴＳＨ)、卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、ヒト絨毛性腺刺
激ホルモン(ｈＣＧ)、黄体形成ホルモン(ＬＨ)が挙げら
れる。本発明において検出の対象として適したハプテン
としては、エストロン、エストラジオール、テストステ
ロン、プロゲステロンおよびそれらのエステル誘導体が
挙げられる。
【００１３】クロマトグラフ媒体とは、クロマトグラフ
ィーに通常使用されている担体、例えばガラスフィルタ
ー、ニトロセルロース、ナイロン、濾紙などをいう。標
識物質としては、金コロイド粒子、着色ラテックス、不
溶性染料ポリマーなどの着色物質が望ましいが、発色試
薬を接触させることにより発色する様な非着色物質であ
ってもよい。
【００１４】本発明において、展開液通過妨害手段と
は、第二抗体を含んでいる試料溶液からなる展開液の流
れを乱すための手段をいい、典型的にはクロマトグラフ
媒体に設けられた切欠き、媒体上に塗布された疎水性物
質などを意味する。かかる妨害手段を設ける位置は特に
厳密な選択を要するものではないが、展開液の展開方向
に照らして、第一抗体固定部位の上流であって、特にク
ロマトグラフ媒体の側縁部が望ましい。更に、下流側に
も設けることが好ましいこともある。
【００１５】切欠きの形状には特に限定はなく、直方
形、半円形、三角形、略三角形など、あらゆる形状のも
のが有効である。従って、疎水性物質を塗布する場合
も、あらゆる形状で適用することができる。
【００１６】疎水性物質としては、クロマトグラフ媒体
に付着させ得るものであればいかなる物質であってもよ
く、塗布時点では親水性であってもその後に重合などに
よって疎水性に変化させ得る例えば親水性ポリマーなど
も含まれる。使用に便利な具体例は油性インキである。
【００１７】クロマトグラフ媒体に第一抗体を固定する
方法はよく知られている。すなわち、抗体試薬を直接的
あるいは間接的に固定化する方法が考えられる。直接的
に固定化する方法としては(１)臭化シアン、グルタルア
ルデヒドおよびカルボジイミドを用いて共有結合で固定
化する方法(共有結合法)、(２)物理的吸着により固定化
する方法(非共有結合法)がある。間接的に固定化する方
法としては、ラテックス粒子などの不溶性の微粒子に抗
体試薬を結合させた後に固定化する方法があり、結合方
法としては共有結合法、非共有結合法のいづれの手段も
可能である。この場合、ラテックス粒子の粒径は、クロ
マトグラフ媒体に十分に捕獲されるが、クロマトグラフ
展開中に移動しない様な適度のサイズのものを選択す
る。
【００１８】標識化された第二抗体は、凍結乾燥物とし
て準備しておき、診断試験を行う際、試料溶液と混合す
る。あるいはまた、この標識化された第二抗体を不織布
などの多孔性ポリマーに含浸させて凍結乾燥し、これを
クロマトグラフ媒体上の第一抗体固定部位の上流側にセ
ットしておいてもよい。この場合、試験者は、試料溶液
にクロマトグラフ媒体の末端を接触させるだけでよく、
標識化された第二抗体と試料溶液を混合するという操作
を省略することができる。即ち、標識化された第二抗体
は試料溶液の展開方向にセットされているので、展開途
中で試料溶液により溶出されると共に、(標識物質)−
(第二抗体)−(被検出物質)からなる結合物が生成し、こ
れが固定化された第一抗体まで運ばれることとなる。
【００１９】本明細書に於いては、記述の都合上、第一
抗体−被検出物質(抗原)−第二抗体のサンドイッチ法に
基いて説明しているが、本発明は抗原−被検出物質(抗
体)−被検出物質に対する抗体からなる系でも実施でき
ることは当業者には容易に理解されよう。従って、本発
明は、被検出物質が抗原である場合に限らず抗体である
場合も包含するものであり、その場合は、本明細書中の
抗体と抗原なる文字を適宜読みかえることにより、本発
明を実施することができる。
【００２０】
【実施例】以下に実施例をあげて本発明をより詳細に説
明するが、本発明はこの実施例によりなんら限定される
ものではない。
【００２１】実施例１ (１) 固相ラテックスＡの調製 市販ラテックスエマルジョン(積水化学製、Ｎ−４５０)
を固形分濃度が０.６重量％となるようリン酸緩衝生理
食塩水(以下「ＰＢＳ」という)により希釈し、その１ml
と、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(以下「hＣＧ」という)
に対するウサギ抗体(濃度６００μg／ml)１mlとをエッ
ペンドルフ遠沈管に採り、室温で２時間振盪してラテッ
クス粒子にウサギ抗体を結合させた。ついで濃度０.１
重量％のウシ血清アルブミン(以下「ＢＳＡ」という)を含
有するＰＢＳを用いてラテックス粒子を３回遠心沈降処
理によって洗浄し、最終的に２mlとなるようＰＢＳに再
懸濁することにより、固相ラテックスＡを調製した。
【００２２】(２) 固相ラテックスＢの調製 前記固相ラテックスＡのウサギ抗hＣＧ抗体の代わり
に、hＣＧ(帝国臓器製薬製)を用い、同様の処理をして
固相ラテックスＢを調製した。
【００２３】(３) 金コロイド粒子の調製 濃度０.０１重量％の塩化金水溶液２００mlを沸騰さ
せ、これに濃度１重量％のクエン酸ナトリウム水溶液を
加え、溶液の色が薄い黄色から紫色あるいは赤色に変わ
るまで加熱沸騰を行って、平均粒径が０.０３μmの金コ
ロイド分散液を調製した。
【００２４】(４) 金コロイド粒子標識抗体の調製 金濃度が０.０１重量％である上記の金コロイド分散液
に炭酸カリウム溶液を加えてpＨを７.６に調製し、これ
にhＣＧに対するモノクローナル抗体(周知のハイブリド
ーマ法によって得られたもので、マウス腹水、あるいは
細胞培養上清より調製されたもの)を、金コロイド分散
液１ml当り１０μgとなる割合で加え、その１０mlに濃
度３０重量％のＢＳＡを０.１ml加え、遠心沈降処理し
て上澄液を除去し、ＢＳＡを濃度０.１重量％で含有す
るＰＢＳを用いて３回遠心沈降処理により洗浄し、上記
ＰＢＳ１０mlに再分散させた後、その０.２５mlを試験
管に分注した(Ａ法)。
【００２５】上記金コロイド標識抗体再分散液０．２５
mlを１２×１２mmのベンリーゼR不織布(旭化成製)に含
浸させ凍結乾燥することにより、金コロイド標識抗体含
有不織布を調製した(Ｂ法)。
【００２６】(５) クロマトグラフストリップＡの調製 市販ガラスフィルター(東洋濾紙製、ＧＣ−５０)より１
２×６０mmの膜ストリップを裁断し、これをガラス板
(ＴＬＣ板)上に置き、取り扱い易くするためにテープで
とめた。ストリップの下端から３０mmの位置に、アキュ
ラジェッターTM液体噴射装置(ノードソン社製)およびＸ
Ｙテーブルエアロステージ(ＴＨＫ社製)を用いて、展開
方向に沿って即ちストリップの長手方向と平行に固相ラ
テックスＡ０.１μl／mmを１０mmの長さに噴射印刷し
た。風乾後、展開方向に垂直即ちストリップの短辺に平
行に固相ラテックスＢ ０.１μl／mmを１０mmの長さに
噴射印刷し、「＋」を印字した。
【００２７】(６) クロマトグラフストリップＢの調製 上記のクロマトグラフストリップＡの下端より１０mmか
ら１５mmの間を切断し、その部分を上記の金コロイド標
識抗体含有不織布にて再度全長６０mmのストリップにな
るようにホッチキスにてつなぎ合わせた。
【００２８】(７) クロマトグラフストリップＣの調製 上記市販ガラスフィルターより１２×８０mmの膜ストリ
ップを裁断し、これをガラス板(ＴＬＣ板)上に固定し
た。ストリップの下端より３０mmの位置に、上記印刷装
置を用いて固相ラテックスＡ ０.１μl／mmにより「Ｙ」
を、ストリップの下端より５０mmの位置に固相ラテック
スＢ ０.１μl／mmにより「Ｎ」を印刷した。
【００２９】(８) hＣＧ含有試料の調製 注射用hＣＧ「ゴナトロピン５０００」(帝国臓器製薬製)
を、濃度０.１重量％のＢＳＡを含有するＰＢＳにより
希釈して、１ml中のhＣＧ濃度がそれぞれ２５mＩＵ、５
０mＩＵおよび１００mＩＵのhＣＧ含有試料を調製し
た。
【００３０】(９) ツーステップイムノクロマトグラフ
ィーにおける「＋」 「−」表示に対する切欠きの検討 上記クロマトグラフストリップＡに、反応部位(第一抗
体固定部位)をはさんで種々の切欠きを入れ(図１参
照)、その切欠いた部分では試料溶液と金コロイド標識
抗体の混合液が展開できないようにした。
【００３１】上記の金コロイド標識抗体を入れた試験管
に、上記のhＣＧ含有試料の各々の５００μlまたはブラ
ンクとして濃度０.１重量％のＢＳＡを含有するＰＢＳ
５００μlを加えて攪拌し、得られた混合液に、上記種
々の切欠きを入れたクロマトグラフストリップＡまたは
コントロールとして切欠きを入れていないクロマトグラ
フストリップＡの下端を５mmだけ浸漬し、当該試料溶液
を展開させた。５分経過後、反応部位における「＋」ある
いは「−」表示を目視で比較した。表示の出現形式の結果
を図１に示す。
【００３２】(１０) ツーステップイムノクロマトグラ
フィーにおける「＋」 「−」表示に対する油性インキの塗
布の検討 上記クロマトグラフストリップＡに、反応部位をはさん
で種々のパターンに市販の油性インキ(修正液、ゼブラ
株式会社製)を塗布し(図２参照)、乾燥後上記(９)と同
じ試料溶液と金コロイド標識抗体の混合液に浸漬し、５
分間の展開後目視にて反応部位における「＋」あるいは
「−」表示を比較した。表示の出現形式の結果を図２に示
す。
【００３３】(１１) ワンステップイムノクロマトグラ
フィーにおける「＋」 「−」表示に対する切欠きの検討 上記イムノクロマトグラフストリップＢに、上記(９)と
同じく種々の切欠きを入れ(図３参照)、それを(９)と同
じ濃度のhＣＧ含有試料およびブランクとしたＢＳＡ含
有ＰＢＳ５００μlを入れた試験管に、その下端５mmだ
け浸漬し、５分間の展開後目視にて反応部位における
「＋」あるいは「−」表示を比較した。表示の出現形式の結
果を図３に示す。
【００３４】(１２) ワンステップイムノクロマトグラ
フィーにおける「＋」 「−」表示に対する油性インキの塗
布の検討 上記クロマトグラフストリップＢに、(１０)と同じく市
販の油性インキの塗布を行い、乾燥後それを(１１)と同
じ試料溶液にその下端５mmだけ浸漬し、５分間の展開後
目視にて反応部位における「＋」あるいは「−」表示を比較
した。表示の出現形式の結果を図４に示す。
【００３５】(１３) ツーステップイムノクロマトグラ
フィーにおける「Ｙ」 「Ｎ」表示に対する切欠きの検討 上記イムノクロマトグラフストリップＣの「Ｙ」 「Ｎ」の
印刷部位をはさんで切欠きを入れ(図５参照)、それを
(９)と同じくhＣＧ含有試料およびブランクとしたＢＳ
Ａ含有ＰＢＳ５００μlを入れた試験管に、その下端５m
mだけ浸漬し、１０分間の展開後目視にて反応部位にお
ける「Ｙ」あるいは「Ｎ」表示を比較した。表示の出現形式
の結果を図５に示す。
【００３６】図１〜図５から明らかな様に、本発明方法
に従ってクロマトグラフ媒体上に展開液通過妨害手段を
設けた場合は(＋)文字のみならず(Ｙ)、(Ｎ)などの複雑
な文字ですら鮮明に表現される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 切欠きを設けたクロマトグラフストリップ上
の(＋)(−)表示の結果を示す模式図。
【図２】 油性インクを塗布したクロマトグラフストリ
ップ上の(＋)(−)表示の結果を示す模式図。
【図３】 切欠きを設け、第二抗体を予め結合させたク
ロマトグラフストリップ上の(＋)(−)表示の結果を示す
模式図。
【図４】 油性インクを塗布し、第二抗体を予め結合さ
せたクロマトグラフストリップ上の(＋)(−)表示の結果
を示す模式図。
【図５】 切欠きを設けたクロマトグラフストリップ上
の(Ｙ)(Ｎ)表示の結果を示す模式図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭64−32169（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−176659（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−299464（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−96559（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−63454（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−38971（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−107965（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−244370（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−228354（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−254761（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−138961（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−138870（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−506095（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543 521 G01N 31/22 121 G01N 33/52

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試料溶液中に存在しうる被検出物質と特
    異的に結合する第一抗体をクロマトグラフ媒体のほぼ中
    央部に文字状に固定し、該クロマトグラフ媒体の末端か
    ら該被検出物質と特異的に結合する標識化された第二抗
    体を含有している該試料溶液を展開させ、標識化された
    第二抗体と結合した試料溶液中に存在しうる該被検出物
    質を文字状に固定化された第一抗体に捕捉させることに
    よって、該試料溶液中の被検出物質の存在または非存在
    を、標識物質により視覚的に検出可能となった文字によ
    り判定することからなるイムノクロマトグラフ法による
    物質検出法であって、試料溶液の展開方向に照して固定
    化された第一抗体の直前、あるいは直前および直後に展
    開液通過妨害手段を設けることにより、標識化された第
    二抗体と結合した被検出物質と文字状に固定化された第
    一抗体との接触を良好ならしめることを特徴とする方
    法。
  2. 【請求項２】 被検出物質と特異的に結合する標識化さ
    れた第二抗体を含有している試料溶液が、試料溶液と標
    識化された第二抗体とを予め混合することにより調製さ
    れるものである請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 被検出物質と特異的に結合する標識化さ
    れた第二抗体を含有している試料溶液が、試料溶液の展
    開方向に照らして第一抗体の前方に結合させた第二抗体
    に、第二抗体不含の試料溶液が展開途上で接触すること
    により調製されるものである請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 クロマトグラフ媒体がガラスフィルタ
    ー、ニトロセルロースおよびナイロンからなる群から選
    ばれる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 標識物質が金コロイド粒子、着色ラテッ
    クスおよび不溶性染料ポリマーからなる群から選ばれる
    請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】 第一抗体の水溶液でクロマトグラフ媒体
    上に直接印刷することにより第一抗体を固定する請求項
    １〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 第一抗体を結合させたラテックスでクロ
    マトグラフ媒体上に印刷することにより第一抗体を固定
    する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 展開液通過妨害手段がクロマトグラフ媒
    体の長手方向の側縁部に設けられた切欠きである請求項
    １〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 展開液通過妨害手段がクロマトグラフ媒
    体に塗布された疎水性物質である請求項１〜７のいずれ
    かに記載の方法。
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