CN1242270C - 生物传感器及测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的生物传感器，设有展开被检查溶液的展开层，具有在上述展开层的局部被固定化的试剂部分，和包括以标记的干燥状态在上述展开层的局部被保持的、通过被检查溶液展开而可以洗提的试剂部分，通过测定上述试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分，上述试剂固定化部分多个存在，另外，各个试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力各不相同，所以可以检测前界现象。另外，提供了上述被检查溶液中的上述测定对象物浓度动态范围更大的测定准确性高的生物传感器。由此，即使在被检查溶液中的测定对象物浓度动态范围宽时，也可以检测前界现象，另外，提供了具有宽范围的测定动态范围的高精度且准确性高的生物传感器。
Description
技术领域
本发明是涉及生物传感器及测定方法，特别是涉及利用了色谱的生物传感器以及使用它的测定方法。
背景技术
已有的生物传感器设有展开被检查溶液的展开层，包括在上述展开层的局部被固定化的试剂部分，和以标记的干燥状态在上述展开层的局部被保持的、通过被检查溶液展开而可以洗提的试剂部分，通过测定上述试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分，作为这样的生物传感器的代表例有免疫色谱传感器。
作为免疫色谱传感器的一般例子是由设有加入被检查溶液的加入部分、多个展开层而构成，在上述展开层的局部将抗体进行固定化。另外，在比上述抗体固定化部分还上游处被标记的抗体以通过被检查溶液可以洗提的干燥状态保持。如果在加入部分加入必要量的被检查溶液，则浸透上述展开层、测定开始。测定结果通过与上述抗体固定化部分结合的标记抗体进行检测。作为标记物的一般例子有金胶体粒子，上述固定化部分的结合通过金胶体粒子可以目测，通过目测得到测定结果。这说明了把抗原抗体反应的夹层反应作为测定原理的情况，除此之外，即使把竞争反应作为测定原理，同样也会在固定化部分中以标记试剂的结合状态得到测定结果。而且，本发明说明书中的免疫色谱和免疫层析指的是相同的含义，使用由可以润湿的多孔质材料产生的反应层，通过测定使固定化试剂和标记试剂的复合体形成的物质的免疫测定法是利用了抗原抗体反应的测定体系，在通常免疫测定法中，相对于必要的B/F分离等洗涤操作，在被检查溶液浸透反应层即色谱载体的过程中进行B/F分离的测定体系。通常所有的试剂以干燥状态存在，在测定时被检查溶液润湿。作为标记物，一般使用金胶体、胶乳，但是也使用磁性粒子、酶、金胶体以外的金属胶体等。标记物是酶等时，使用者在测定操作方面包括加入酶基质和反应停止试剂的操作。另外，所谓一步免疫色谱指即使在上述免疫色谱中，使用者只通过加入被检查溶液的操作进行测定的测定法，因为使用者的基本测定操作只是加入被检查溶液的操作，所以叫做一步免疫色谱。另外，上述例子叙述了需要通过目测定性判定的情况，但是所需要的测定结果为半定量或者需要比其还高精度的判定时，有特开平10-274624号公报中所示的使用光学读取装置，利用透过方式读取的方法，以及特开平10-274653号公报中所示的利用照相机等画像进行读取、演算处理的方法。
另外，另一方面，作为不需要使用目测的直接检测出传感器的信号的测定器的传感器装置本身就具有可以定量的功能的例子，有特许第3005303号中的发明，以及特开平7-159398号公开特许、特开平8-278305号公开特许等。这些发明具有通过使用多个固定化试剂、在多个试剂固定化部分中使用标记试剂结合的部位的数量具有定量性的功能，以及通过使试剂固定化区域中的浓度变化而具有半定量的功能，以及在多个固定化区域中可以同时测定其它的测定项目。
近几年，在医疗诊断现场，POCT (ポイント·オブ·ケア·テステイング护理检测之要点)正在迅速普及。在POCT中，特别希望可以迅速、简便、正确的测定的装置。其中使用的基本原理具有使测定对象物适应宽范围的便利性，不但在临床领域，而且在食品卫生关连领域、环境检测领域等各种领域中都有所发展。另一方面，在局部被限制的测定项目中，也具有定量性的，但是大部分只是定性或者半定量程度的精度，一般把更加迅速、简便、而且可高精度地测定、以及在广泛领域都可以应用的技术作为课题。但是，在上述记载的方法中，根据在传感器部分中在试剂固定化部分中检测出标记试剂成分结合量，目的是进行测定对象物的测定，但是在试剂固定化部分中在标记试剂的结合方面有限度。首先，在利用夹层反应时，结果限制了测定抗原浓度领域。特别如果是抗原抗体反应，通常直线结合量进行增加的领域为约1位-2位。即使再多的测定对象抗原存在，也以一定的结合量饱和，不能结合再多的抗原。另外，测定对象抗原再增加时，就会产生前界现象(プロゾ一ン现象)。为此，测定对象抗原的浓度高时，有必要事前进行稀释。为了进行稀释、而且实施高精度的定量，理所当然的也要求稀释精度，需要稀释时使用的仪器，而且，稀释操作变为必须的。稀释操作对于通常化学的实验经验缺乏的不熟练的人来说是非常烦杂的，为此，存在不得不选择使用者的情况。另外，不要求这些操作精度时，可以使用一般的吸液玻璃管等进行比较简单的稀释操作，但是存在所谓精度差的问题。另外，在测定操作中附加必须的稀释操作，存在所谓需要时间的问题，在POCT中需要更加迅速的测定时，只能使用精度更低的定性或者半定量。另外，前界现象的大问题是实际的被测定溶液中的测定对象物是高浓度，但获得的是看上去相当于低浓度的结果。例如，在临床检查中测定时，由于根据检查结果选择对患者的处方，所以极端的情况下，也存在关于生命的持续性的情况，看到由前界现象产生的伪阴性，对于该测定来说就变成最致命的课题。
接着，在利用竞争反应时，随着测定对象抗原浓度的增加，在上述试剂固定化部分中，上述标记试剂结合量减少，上述测定对象抗原浓度在一定浓度以上时，就不结合。即使在这样的竞争反应中，在上述固定化试剂成分中使用抗体和抗原时，结合的性质、结果也限制了测定对象抗原浓度区域，与上述夹层反应相同，在测定对象抗原浓度高时稀释操作变为必须的，为了进行稀释、而且实施高精度的定量，理所当然的也要求稀释精度，需要稀释时使用的仪器，而且，稀释操作变为必须的。稀释操作对于通常化学的实验经验缺乏的不熟练的人来说是非常烦杂的，为此，存在不得不选择使用者的情况。另外，不要求这些操作精度时，可以使用一般的吸液玻璃管等进行比较简单的稀释操作，但是存在所谓精度差的问题。另外，在测定操作中增加必须的稀释操作，存在所谓需要时间的问题，在POCT中需要更加迅速的测定时，只能使用精度更低的定性或者半定量。而且，存在只能选择测定对象抗原浓度变化少的对象物等问题。另外，在对具有宽范围的浓度区域的测定对象物不进行稀释操作就进行测定时，只能使用多个传感器装置，多个使用时，由于测定者也使用测定对象物未知浓度的被检查溶液，所以有必要进行两次测定，操作性也烦杂，而且存在所谓成本高的问题。
发明内容
为了解决上述课题，本发明中的生物传感器，设有展开被检查溶液的展开层，含有在上述展开层的局部被固定化的试剂部分、和包括以标记的干燥状态在上述展开层的局部被保持的、通过被检查溶液展开而可以洗提的试剂部分，通过测定上述试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分的生物传感器，特征在于，存在多个上述试剂固定化部分，上述多个试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力各不相同的生物传感器，由于设置多个上述试剂固定化部分，另外，各个试剂固定化部分相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力不相同，所以可以检测前界现象，另外，可以把上述被检查溶液中的上述测定对象物浓度动态范围变得更大。在本说明书中叙述的所谓前界现象是指在抗原抗体反应中，例如，在测定抗原时，指抗原过剩区域和后地带区域，如果以上述免疫色谱传感器中的夹层反应为例进行叙述，则根据被检查溶液中的测定对象物浓度，在上述固定化试剂部分中，产生固定化试剂-测定对象物-标记试剂复合体，但是该复合体形成量随着被检查溶液中测定对象物浓度的提高而增加。但是，到达一定的状态时，上述复合体形成量饱和。而且，测定对象物浓度比它还高时，复合体形成量减少。最后到达没有全部形成复合体的区域。由于包括上述复合体形成量减少的区域、或者也与测定对象物高浓度存在无关的、几乎不能形成复合体的区域，所以把在这些区域中的现象称为前界现象。这说到底是以在把抗原作为测定对象物的免疫色谱传感器中的夹层反应为例进行表示的，但是不用说，即使在所谓以相同的形式使复合体形成的夹层反应体系中，测定对象物是抗体时，以及其它同样地，在应用结合反应的反应体系中，也会产生这样的现象。另外，所谓上述测定对象物动态范围表示可以测定的、被检查溶液中测定对象物浓度的宽度，例如，有根据测定方法原样测定被检查溶液的原液的浓度的情况，以及也有通过再稀释等可以测定的范围表现得更广的情况，但是其中所述的动态范围指不加以稀释等，原样使用被检查溶液时的纯粹的可以测定的范围。对于此，也是以完全干燥***即免疫色谱传感器为例进行说明，现在一般在临床现场，或者家庭中使用的，有以尿作为检测体的妊娠诊断药。这时，使用者通过使尿滴入传感器装置中，结束对于测定的操作，之后只是确认测定结果。即，如果是这种情况，则把原样滴下尿时实际可以测定的浓度范围叫做测定对象物动态范围。这是一个例子，即使对于其它的测定对象物、测定检测体、反应形式也相同。
如上所述，本发明即为解决上述问题，由于即使在被检查溶液中测定对象物浓度为高浓度的情况下，上述试剂固定化部分的试剂相对于上述测定对象物或者上述标记试剂的亲和力也不相同，所以本发明目的是检测前界现象，另外，由于这些多个试剂固定化部分的试剂具有各不相同的亲和力，所以本发明目的是既可以测定更广范围的测定对象物浓度，又由此提供了可以宽范围地选择测定对象物的生物传感器。
本发明权利要求第1项记载的发明是生物传感器，其设有展开被检查溶液的展开层，含有在上述展开层的局部被固定化的试剂部分，和包括以标记的干燥状态在上述展开层的局部被保持的、通过被检查溶液展开而可以洗提的试剂部分，通过测定上述试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分的生物传感器，存在多个上述试剂固定化部分，上述多个试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力各不相同为特征的生物传感器，是以设置多个上述试剂固定化部分，而且各个试剂相对于上述被检查溶液中上述测定对象物或者上述标记试剂的亲和力不相同为特征的。
本发明权利要求第2项记载的发明是生物传感器，其设有展开被检查溶液的展开层，含有在上述展开层的局部被固定化的试剂部分，和包括以标记的干燥状态在上述展开层的局部被保持的、通过被检查溶液展开而可以洗提的试剂部分，是以加入上述被检查溶液的加入部分、标记试剂部分、试剂固定化部分的顺序设置的装置，通过测定上述试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分的生物传感器，上述试剂固定化部分多个存在，上述多个试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力各不相同为特征的生物传感器，是以顺序设置上述加入部分、标记试剂部分、试剂固定化部分的装置，另外，存在多个上述试剂固定化部分，而且各个试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中上述测定对象物或者上述标记试剂的亲和力不相同为特征的。
本发明权利要求第3项记载的发明是在权利要求第1项记载的或者权利要求第2项记载的生物传感器中，特征在于，在上述多个的试剂固定化部分中被固定化试剂是抗体，被检查溶液中的测定对象物是抗原，对于加入上述被检查溶液的部分，越是上游越可将相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力高的抗体固定，也即是在权利要求第1项或者权利要求第2项记载的生物传感器中，特征在于，上述试剂固定化部分是抗体，被检查溶液中的上述测定对象物是抗原，而且，对于加入上述被检查溶液的部分，检测体的浸透展开方向是上游，也就是，加入的被检查溶液展开开始后，使上述标记物一边洗提一边进行展开，但是其展开混合液越是首先接触的部分，对于上述抗原的亲和力越高。换句话说，是以加入上述被检查溶液后，越是后接触的上述试剂固定化部分，相对于上述抗原的亲和力越低为特征的。
本发明权利要求第4项记载的发明是在从权利要求第1项到权利要求第3项任一项记载的生物传感器中，特征在于，在上述多个试剂固定化部分中试剂是单克隆抗体，即在从权利要求第1项到权利要求第3项任一项记载的生物传感器中，是以上述多个试剂固定化部分的试剂分别是单克隆抗体为特征的。
本发明权利要求第5项记载的发明是在从权利要求第1项到权利要求第4项任一项记载的生物传感器中，特征在于，通过在上述多个试剂固定化部分中测定上述标记试剂结合量，将上述被检查溶液中的测定对象物进行定量，即在从权利要求第1项到权利要求第4项任一项记载的生物传感器中，是以通过在上述多个试剂固定化部分中测定上述标记试剂结合量，测定上述被检查溶液中的上述测定对象物为特征的。
本发明权利要求第6项记载的发明是在从权利要求第1项到权利要求第5项任一项记载的生物传感器中，特征在于，通过在上述多个试剂固定化部分中测定上述标记试剂结合量，检测前界现象，即在从权利要求第1项到权利要求第5项任一项记载的生物传感器中，是以通过在上述多个试剂固定化部分中测定上述标记试剂结合情况，在其测定中检测是否存在前界区域为特征的。对于前界现象如上所述，在本说明书中，所谓前界现象指在抗原抗体反应中，例如，在测定抗原时，指抗原过剩区域和后地带区域，上述免疫色谱传感器中的夹层反应为例进行叙述的，根据被检查溶液中的测定对象物浓度，在上述固定化试剂部分中，产生固定化试剂-测定对象物-标记试剂复合体，但是该复合体形成量随着被检查溶液中测定对象物浓度的提高而增加。但是，到达一定的状态时，上述复合体形成量饱和。还有，测定对象物浓度比它还高时，复合体形成量减少。另外过剩时，到达几乎没有形成复合体的区域。由于包括上述复合体形成量减少的区域、或者也与测定对象物高浓度存在无关的、几乎不能形成复合体的区域，所以通常所谓的地带区域或者地带现象的部分称为前界区域。这说到底是以免疫色谱传感器中的夹层反应为例进行表示的，但是不用说，即使在所谓以相同的形式使复合体形成的夹层反应体系中，测定对象物是抗体时，以及其它同样地，在应用结合反应的反应体系中，也会产生这样的现象。
本发明权利要求第7项记载的发明是在从权利要求第1项到权利要求第6项任一项记载的生物传感器中，通过测定上述多个试剂固定化部分相对于加入上述被检查溶液的部分的最上游位置的上述试剂固定化部分的标记试剂结合量，测定被检查溶液中的测定对象物的生物传感器，特征在于，也进行其它试剂固定化部分的标记试剂结合量的测定，根据其各自的测定结果，进行上述最上游的试剂固定化部分中标记试剂结合量测定值的前界判定，即在从权利要求第1项到权利要求第6项任一项记载的生物传感器中，是以通过在上述多个的试剂固定化部分中，测定上述标记试剂结合量，测定被检查溶液中的上述测定对象物，但是其实，为了进行被检查溶液的测定，在上述多个的试剂固定化部分中，从上述被检查溶液加入部分看出，利用最上游位置的部分，进行测定，通过对其它的试剂固定化部分中的标记试剂结合进行前界判定，可在上述最上游的试剂固定化部分中，上述标记试剂的结合判定是否存在前界区域为特征的。
本发明权利要求第8项记载的发明是在从权利要求第1项到权利要求第7项任一项记载的生物传感器中，特征在于，由于上述多个试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力各不相同，所以各个固定化部分中上述被检查溶液中的测定对象物浓度测定动态范围不相同，即在从权利要求第1项到权利要求第7项任一项记载的生物传感器中，是以由于上述多个试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力不相同，所以相对于上述被检查溶液中的上述测定对象物的动态范围不同为特征的。其中所述的动态范围，如上所述，指不加以稀释等，原样使用被检查溶液时的纯粹的可以测定的测定对象物浓度范围。对于此，也是以完全干燥***即免疫色谱传感器为例进行说明，现在一般在临床现场，或者家庭中使用的，有以尿作为检测体的妊娠诊断药。这时，使用者通过使尿滴入传感器装置中，结束对于测定的操作，之后只是确认测定结果，即，如果是这种情况，则把原样滴下尿时实际可以测定的范围叫做测定对象物动态范围。这是一个例子，即使对于其它的测定对象物、测定检测体、反应形式也相同。另外，即使测定时稀释等操作是必须的情况下，也把相对于其同一被检查溶液和同一被测定对象的检测灵敏度区域定义为动态范围。
本发明权利要求第9项记载的发明是在权利要求第8项记载的生物传感器中，特征在于，由于上述多个试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力各不相同，所以使上述被检查溶液中的测定对象物浓度测定动态范围变宽，即在权利要求第8项记载的生物传感器中，是以通过在上述多个试剂固定化部分中测定上述标记试剂结合量，测定被检查溶液中的上述测定对象物，但是上述多个试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的上述测定对象物或者上述标记试剂的亲和力各不相同，所以分别以相对于不同的上述被检查溶液中的测定对象物浓度的灵敏度表示，传感器装置的上述测定对象物动态范围宽为特征的。
本发明权利要求第10项记载的发明是在从权利要求第1项到权利要求第9项任一项记载的生物传感器中，特征在于，上述多个试剂固定化部分的试剂各自识别相同的表位，即在从权利要求第1项到权利要求第9项任一项记载的生物传感器中，是以上述多个试剂固定化部分中的试剂各自相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力不同，但是识别相同的表位为特征的。所谓识别相同的表位指其中上述多个试剂固定化部分亲和力各不相同，但是相对于相同的结合部位进行结合。
本发明权利要求第11项记载的发明是在从权利要求第1项到权利要求第10项任一项记载的生物传感器中，特征在于，上述试剂固定化部分为2个地方，即在从权利要求第1项到权利要求第10项任一项记载的生物传感器中，是以上述多个试剂固定化部分为2个地方为特征的。
本发明权利要求第12项记载的发明是在从权利要求第1项到权利要求第11项任一项记载的生物传感器中，特征在于，上述多个试剂固定化部分分别接触，即在从权利要求第1项到权利要求第11项任一项记载的生物传感器中，是以上述多个试剂固定化部分相互接触为特征的。
本发明权利要求第13项记载的发明是在从权利要求第1项到权利要求第12项任一项记载的生物传感器中，特征在于，上述展开层是横向流动方式，上述多个试剂固定化部分在对于上述被检查溶液的展开方向的垂直方向上以线状被固定，该线宽是0.5mm～2.0mm，另外，多个试剂固定化部分之间的线间距离是1.0mm以上，即在从权利要求第1项到权利要求第12项任一项记载的生物传感器中，是以上述展开层是横向流动方式，上述多个试剂固定化部分在对于上述被检查溶液的展开方向的垂直方向上以线状被固定，该线宽是0.5mm～2.0mm，另外，各上述试剂固定化部分的上述线间相隔是1.0mm以上为特征的。
本发明权利要求第14项记载的发明是在从权利要求第1项到权利要求第13项任一项记载的生物传感器中，特征在于，含有上述标记试剂成分、固定化试剂成分的所有的试剂以干燥状态存在，即在从权利要求第1项到权利要求第13项任一项记载的生物传感器中，是以含有上述标记试剂和固定化试剂的所有的试剂以干燥状态存在为特征的。
本发明权利要求第15项记载的发明是在从权利要求第1项到权利要求第14项任一项记载的生物传感器中，特征在于，上述被检查溶液是尿、唾液、血液，即在从权利要求第1项到权利要求第14项任一项记载的生物传感器中，是以上述被检查溶液是尿、唾液、血液为特征的。其中所谓血液包括含有血细胞等有形成分的全血、以及除去有形成分的血清、血浆。
本发明权利要求第16项记载的发明是在从权利要求第1项到权利要求第15项任一项记载的生物传感器中，特征在于，生物传感器是免疫色谱，即以从权利要求第1项到权利要求第15项任一项记载的生物传感器是免疫色谱为特征的。
本发明权利要求第17项记载的发明是利用从权利要求第1项到权利要求第16项任一项记载的生物传感器的测定方法，特征在于，通过测定上述多个试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，将被检查溶液中的测定成分定性或者定量的测定方法，即利用从权利要求第1项到权利要求第16项任一项记载的生物传感器的测定方法，是以该测定是在上述多个试剂固定化部分中，通过上述标记试剂的结合进行的方法为特征的。
本发明权利要求第18项记载的发明是利用包括设有展开被检查溶液的展开层，含有相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者标记试剂的亲和力各不相同的试剂，在上述展开层的局部被固定化的试剂部分，和在标记的上述展开层的局部被保持的、通过被检查溶液展开而可以洗提的试剂部分的生物传感器，通过测定上述多个试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分的测定方法，特征在于，利用包括设有展开被检查溶液的展开层，含有相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力各不相同的试剂，在上述展开层的局部被固定化的多个试剂部分，和以标记的干燥状态在上述展开层的局部被保持的、通过被检查溶液展开而可以洗提的试剂部分的生物传感器，通过测定上述多个试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分。其中所谓定性，指在阳性、阴性判定中代表的2个阶段判定，所谓定量包括数值化的情况，以及也包括将阶段设为3个阶段以上的半定量。
本发明权利要求第19项记载的发明是在权利要求第17项或者权利要求第18项记载的测定方法中，特征在于，测定上述多个试剂固定化部分中标记试剂的结合量的方法是使用电磁放射线，即在权利要求第17项或者权利要求第18项记载的测定方法中，是以在上述多个试剂固定化部分中在标记试剂的结合量的测定方法中使用电磁放射线为特征的。
本发明权利要求第20项记载的发明是在权利要求第17项或者权利要求第19项记载的测定方法中，特征在于，测定上述多个试剂固定化部分中标记试剂的结合量的方法是测定电磁放射线反射的扩散电磁放射线，即在权利要求第17项或者权利要求第19项记载的测定方法中，是以在上述多个试剂固定化部分中，上述标记试剂的结合量的测定方法是照射电磁放射线时，测定反射的扩散电磁放射线为特征的。
本发明权利要求第21项记载的发明是在从权利要求第17项到权利要求第20项任一项记载的测定方法中，特征在于，通过相对于上述生物传感器扫描在上述测定中使用的电磁放射线源，或者，通过相对于上述电磁放射线源扫描上述生物传感器，测定上述试剂固定化部分的上述标记试剂结合量，即在从权利要求第17项到权利要求第20项任一项记载的测定方法中，是以在上述多个试剂固定化部分中对上述标记试剂结合量进行检测时，扫描上述电磁放射线源，或者，扫描上述生物传感器为特征的。
本发明权利要求第22项记载的发明是在从权利要求第17项到权利要求第21项任一项记载的测定方法中，特征在于，该测定方法是反射吸光度测定，光源随着上述多个试剂固定化部分变为线状而变为线状，光源的线状宽度是1.0mm以下，即在从权利要求第17项到权利要求第21项任一项记载的测定方法中，是以在上述多个试剂部分中，检测上述标记试剂结合量的方法是测定反射吸光度为特征的。这时，电磁放射线是光，优选可见光，另外，在上述试剂固定化部分中，检测上述标记试剂结合量的方法是照射上述可见光时被反射的扩散光。
本发明权利要求第23项记载的发明是在从权利要求第17项到权利要求第22项任一项记载的测定方法中，特征在于，分别测定上述多个试剂固定化部分中的结合量，并进行前界判定，即在从权利要求第17项到权利要求第22项任一项记载的测定方法中，是以在上述多个试剂固定化部分中，分别检测上述标记试剂的结合量后，由任意一个或者多个的检测结果判定前界区域为特征的。
本发明权利要求第24项记载的发明是在从权利要求第17项到权利要求第23项任一项记载的测定方法中，特征在于，在上述多个试剂固定化部分中，测定相对于加入上述被检查溶液的部分的最上游位置的上述试剂固定化部分的标记试剂结合量，同时也进行其它的试剂固定化部分的测定，由其各自的测定结果，进行在上述最上游的试剂固定化部分中的标记试剂结合量测定值的前界判定，即在从权利要求第17项到权利要求第23项任一项记载的测定方法中，是以从上述被检查溶液加入部分看出，把上述多个试剂固定化部分的最上游位置的上述试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量作为上述被检查溶液中的测定对象物进行测定，同时在其它的上述多个试剂固定化部分中，由上述标记试剂结合量判定在上述最上游部分中的测定是否存在前界区域为特征的。
本发明权利要求第25项记载的发明是在从权利要求第17项到权利要求第24项任一项记载的测定方法中，特征在于，在上述多个试剂固定化部分中，测定相对于加入上述被检查溶液的部分的最上游位置的上述试剂固定化部分的标记试剂结合量，同时也进行其它的试剂固定化部分的标记试剂结合量的测定，由其各自的测定结果，通过演算处理判定上述最上游的试剂固定化部分中标记试剂结合量测定范围、或者其它的试剂固定化部分中标记试剂结合量测定范围，在测定结果中使用任何一个标记试剂结合量，即在从权利要求第17项到权利要求第24项任一项记载的测定方法中，是以在上述多个试剂固定化部分中，通过检测上述标记试剂结合量，作为测定上述被检查溶液中上述测定对象物的方法的同时，另外，从加入被检查溶液的部分看出，通过上述标记物的结合量，测定最上游中上述固定化部分的被检查溶液中的测定对象物，但是这时，也检测其它的试剂固定化部分中上述标记试剂结合量，包括上述最上游，在各自的试剂固定化部分中，由上述标记试剂结合量，通过演算处理判定上述多个试剂固定化部分，也包括位于最上游的上述试剂固定化部分，无论在哪个试剂固定化部分中，上述被检查溶液中的上述测定对象物浓度测定中应该使用的结合的上述标记试剂量，通过在任何一个地方的上述试剂固定化部分中的结合量，测定上述被检查溶液中的测定对象物为特征的。
本发明权利要求第26项记载的发明是在从权利要求第17项到权利要求第25项任一项记载的测定方法中，特征在于，上述测定是由上述被检查溶液的加入操作开始的一步免疫色谱，即以从权利要求第17项到权利要求第25项任一项记载的测定方法使用通过加入被检查溶液的操作而开始测定的一步免疫色谱即生物传感器为特征的。
本发明权利要求第27项记载的发明是在从权利要求第1项到权利要求第10项、从权利要求第12项到权利要求第16项任一项记载的生物传感器中，特征在于，上述试剂固定化部分为3个地方，即在从权利要求第1项到权利要求第10项、从权利要求第12项到权利要求第16项任一项记载的生物传感器中，是以上述试剂固定化部分为3个地方为特征的。
本发明权利要求第28项记载的发明是在权利要求第27项记载的生物传感器中，特征在于，相对于加入上述被检查溶液的部分，最上游位置的上述试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物、或者上述标记试剂的亲和力最高，而且，位于第2和第3的试剂固定化部分的试剂的亲和力相同，即在权利要求第27项记载的生物传感器中，是以相对于加入上述被检查溶液的部分，最上游位置的上述试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物、或者上述标记试剂的亲和力最高，而且，位于第2和第3的试剂固定化部分的试剂的亲和力相同为特征的。
本发明权利要求第29项记载的发明是在从权利要求第17项到权利要求第26项任一项记载的测定方法中，特征在于，上述试剂固定化部分为3个地方，即在从权利要求第17项到权利要求第26项任一项记载的测定方法中，是以上述试剂固定化部分为3个地方为特征的。
本发明权利要求第30项记载的发明是在使用权利要求第28项记载的生物传感器的测定方法中，特征在于，通过测定上述多个试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分的测定方法，即在使用权利要求第28项记载的生物传感器的测定方法中，是以通过测定上述试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分为特征的。
本发明权利要求第31项记载的发明是在权利要求第30项记载的测定方法中，特征在于，上述3个地方的试剂固定化部分中，通过测定相对于加入上述被检查溶液部分的下游2个地方的固定化部分中上述标记试剂的结合量，检测前界区域，即在权利要求第30项记载的测定方法中，是以上述3个地方的试剂固定化部分中，通过测定相对于加入上述被检查溶液部分的下游2个地方的固定化部分中上述标记试剂的结合量，检测前界区域为特征的。
根据权利要求第1项记载的生物传感器，则其设有展开被检查溶液的展开层，含有在上述展开层的局部被固定化的试剂部分，和包括以标记的干燥状态在上述展开层的局部被保持的、通过被检查溶液展开而可以洗提的试剂部分，通过测定上述试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分的生物传感器，存在多个上述试剂固定化部分，上述多个试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力各不相同，对被检查溶液中的测定，即使测定对象物是高浓度，也不需要稀释操作等，获得了可以提供简易且迅速的生物传感器的效果，还有，可以检测前界区域，简易且迅速，同时具有获得准确性高的生物传感器的效果。
根据权利要求第2项记载的生物传感器，则其设有展开被检查溶液的展开层，含有在上述展开层的局部被固定化的试剂部分，和包括以标记的干燥状态在上述展开层的局部被保持的、通过被检查溶液展开而可以洗提的试剂部分，顺序设置加入上述被检查溶液的加入部分、标记试剂部分、试剂固定化部分的装置，通过测定上述试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分，存在多个上述试剂固定化部分，上述多个试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力各不相同，所以相对于上述被检查溶液中上述测定对象物浓度，可以提供具有宽范围的动态范围的生物传感器，还有，也可以检测前界现象，简易、迅速，而且具有获得准确性、通用性高的生物传感器的效果。
根据权利要求第3项记载的生物传感器，则在权利要求第1项或者权利要求第2项记载的生物传感器中，在上述多个的试剂固定化部分中被固定化试剂是抗体，被检查溶液中的测定对象物是抗原，对于加入上述被检查溶液的部分，越是上游越可将相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力高的抗体固定，所以在测定抗原时，通过将在上述多个试剂固定化部分中，具有相对于测定对象物或者上述标记试剂的多个不同的亲和力的抗体固定化，可以充分广泛地具有上述抗原浓度动态范围，另外，把加入上述被检查溶液的部分作为最上游，由于越是上游亲和力越高，所以可以在最上游的上述试剂固定化部分中，提供更高精度的生物传感器，在其它的上述试剂固定化部分中，可以检测前界，并获得可以提供更高精度且准确性高的生物传感器的效果。
根据权利要求第4项记载的生物传感器，则在从权利要求第1项到权利要求第3项任一项记载的生物传感器中，由于在上述多个试剂固定化部分中试剂是单克隆抗体，所以即使在进行大量生产时，即使需要多个具有相同性能的的生物传感器时，由于单克隆抗体具有均匀的性质，生物传感器也可以兼具高生产效率和制备稳定性，迅速且准确性高，而且具有可以多个或者大量制备表现出均匀性能的生物传感器的效果。
根据权利要求第5项记载的生物传感器，则在从权利要求第1项到权利要求第4项任一项记载的生物传感器中，通过在上述多个试剂固定化部分中测定上述标记试剂结合量，将上述被检查溶液中的测定对象物进行定量，所以上述多个试剂固定化部分各自的试剂相对于上述测定对象物或者上述标记试剂的亲和力不同，不是目测判定的含糊判定其上述标记试剂结合量，因为使测定结果数值化，所以简便且迅速，另外具有准确性，而且具有获得高精度的生物传感器的效果。
根据权利要求第6项记载的生物传感器，则在从权利要求第1项到权利要求第5项任一项记载的生物传感器中，通过在上述多个试剂固定化部分中测定上述标记试剂结合量，检测前界现象，所以在其测定中，试剂固定化部分的上述标记试剂的结合量可以判定前界区域，进而具有获得准确性高的生物传感器的效果。
根据权利要求第7项记载的生物传感器，则在从权利要求第1项到权利要求第6项任一项记载的生物传感器中，通过测定上述多个试剂固定化部分相对于加入上述被检查溶液的部分的最上游位置的上述试剂固定化部分的标记试剂结合量，测定被检查溶液中的测定对象物的生物传感器，也进行其它试剂固定化部分的标记试剂结合量的测定，根据其各自的测定结果，进行上述最上游的上述试剂固定化部分中标记试剂结合量测定值的前界判定，所以把被检查溶液加入部分作为最上游时，可测定上述多个试剂固定化部分中最上游位置的试剂固定化部分中标记试剂的结合量，可以定量精度高的测定，在上述试剂固定化部分以外的部分中相对于试剂固定化部分测定上述标记试剂结合量，可进行前界判定，而且准确性高，还有，具有得到简易、迅速、高精度的生物传感器的效果。
根据权利要求第8项记载的生物传感器，则在从权利要求第1项到权利要求第7项任一项记载的生物传感器中，由于上述多个试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力各不相同，所以各个固定化部分中上述被检查溶液中的测定对象物浓度测定动态范围不相同，所以在上述多个试剂固定化部分中，每个具有不同的被检查溶液浓度动态范围，具有获得可以测定多个测定对象物动态范围的生物传感器的效果。
根据权利要求第9项记载的生物传感器，则在权利要求第8项记载的生物传感器中，由于上述多个试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者上述标记试剂的亲和力各不相同，使上述被检查溶液中的测定对象物浓度测定动态范围变宽，所以在上述多个试剂固定化部分中，通过标记试剂结合量的测定进行测定，但是通过分别合并多个试剂固定化部分的上述测定对象物浓度动态范围，可以更广范围的测定。由此，不需要稀释等烦杂的操作，而且具有获得在一次的测定中可以测定广范围的测定对象物浓度的生物传感器的效果。
根据权利要求第10项记载的生物传感器，则在从权利要求第1项到权利要求第9项任一项记载的生物传感器中，上述多个试剂固定化部分各自识别相同的表位，所以在上述多个试剂固定化部分的试剂中，即使反应形式为标记试剂-固定化试剂、标记试剂、测定对象物-固定化试剂的哪一个，在分子水平上关于反应的立体障碍都小，更稳定，而且具有获得简易、正确、迅速的生物传感器的效果。
根据权利要求第11项记载的生物传感器，则在从权利要求第1项到权利要求第10项任一项记载的生物传感器中，上述试剂固定化部分为2个地方，所以上述测定对象物浓度动态范围广，而且可以使检测前界的最小限度的试剂组成成为可能，而且，具有获得廉价的、迅速、简易、准确性高的生物传感器的效果。
根据权利要求第12项记载的生物传感器，则在从权利要求第1项到权利要求第11项任一项记载的生物传感器中，上述多个试剂固定化部分分别接触，所以一般地，试剂固定化部分中上述展开溶液的展开变得不均匀，但是上述多个试剂固定化部分看上去变为一个地方，以更加均匀的状态保持展开上述展开层的展开溶液的浸透，具有高精度的、且宽广的测定对象物动态范围，而且，具有获得可以检测前界的生物传感器的效果。
根据权利要求第13项记载的生物传感器，则在从权利要求第1项到权利要求第12项任一项记载的生物传感器中，上述展开层是横向流动方式，上述多个试剂固定化部分在对于上述被检查溶液的展开方向的垂直方向上以线状被固定，该线宽是0.5mm～2.0mm，另外，多个试剂固定化部分之间的线间距离是1.0mm以上，所以在上述展开层上的上述多个试剂固定化部分展开上述被检查溶液时，展开很容易变得不均匀，但是变为0.5mm～2.0mm，所以抑制了其不良影响，同时可以目测，另外，各自的试剂固定化部分之间是1.0mm以上，可以通过目测识别，更加简易迅速，获得了高精度且准确性优良的、而且目测性优良的生物传感器。另外，这对使用光学的测定仪的上述生物传感器也是有效的。
根据权利要求第14项记载的生物传感器，则在从权利要求第1项到权利要求第13项任一项记载的生物传感器中，含有上述标记试剂成分、固定化试剂成分的所有的试剂以干燥状态存在，所以上述多个试剂固定化部分与上述测定对象物或者上述标记试剂的亲和力不同，上述测定对象物浓度动态范围非常宽，另外，具有检测前界区域的功能，而且，由于是完全干燥，所以保存稳定性能优良，还有，获得了携带自由的生物传感器。
根据权利要求第15项记载的生物传感器，则在从权利要求第1项到权利要求第14项任一项记载的生物传感器中，上述被检查溶液是尿、唾液、血液，迅速的对应是必须的，在临床检查领域中，准确性高，而且获得了可以提供简便、迅速的生物传感器的效果。
根据权利要求第16项记载的生物传感器，则在从权利要求第1项到权利要求第15项任一项记载的生物传感器中，是免疫色谱，在简易免疫测定法即市场上正在普及的免疫色谱中，使用者不会错误判定，准确性高，而且获得了可以实现现有的免疫色谱具有的简易操作的效果。
根据权利要求第17项记载的测定方法，则作为利用从权利要求第1项到权利要求第16项任一项记载的生物传感器的测定方法，通过测定上述多个试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，将被检查溶液中的测定成分定性或者定量，在被检查溶液的测定中，测定对象物即使是高浓度，也不需要稀释操作等，获得了可以简易且迅速的测定的测定方法，同时可以检测前界区域，简易且迅速，同时获得了使准确性高的测定成为可能的效果。
根据权利要求第18项的测定方法，则利用包括设有展开被检查溶液的展开层，含有相对于上述被检查溶液中的测定对象物或者标记试剂的亲和力各不相同的试剂，在上述展开层的局部被固定化的试剂部分，和在标记的上述展开层的局部被保持的、通过被检查溶液展开而可以洗提的试剂部分的生物传感器，通过测定上述多个试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分，在被检查溶液的测定中，测定对象物即使是高浓度，也不需要稀释操作等，获得了可以简易且迅速的测定的效果，另外可以检测前界区域，简易且迅速，同时获得了使准确性高的测定成为可能的效果。
根据权利要求第19项记载的测定方法，则在权利要求第17项或者权利要求第18项记载的测定方法中，测定上述多个试剂固定化部分中标记试剂的结合量的方法是使用电磁放射线，所以上述测定对象物浓度动态范围宽，而且可以检测前界，还有，不是根据目测判断，获得了数值化的、能够更加准确的判断的测定效果。
根据权利要求第20项记载的测定方法，则在权利要求第17项或者权利要求第19项记载的测定方法中，测定上述多个试剂固定化部分中标记试剂的结合量的方法是测定电磁放射线反射的扩散电磁放射线，所以在相同方向配置光源、受光部分，使用可以更加小型化的手法，而且，上述测定对象物浓度动态范围宽，可以检测前界，另外，不是根据目测判断，获得了数值化的能够更加准确的判断的测定效果。
根据权利要求第21项记载的测定方法，则在从权利要求第17项到权利要求第20项任一项记载的测定方法中，通过相对于上述生物传感器扫描在上述测定中使用的电磁放射线源，或者通过相对于上述电磁放射线源扫描上述生物传感器，测定上述试剂固定化部分的上述标记试剂结合量，所以在上述试剂固定化部分中，通过把上述标记试剂的检测作为相对于上述多个试剂固定化部分以外的展开层的信号进行检测，排除了不由上述测定对象物浓度起因的因素的影响，另外，可以准确地检测上述多个试剂固定化部分中上述标记试剂结合量，具有提供更加准确且精度高的测定方法的效果。
根据权利要求第22项记载的测定方法，则从权利要求第17项到权利要求第21项任一项记载的测定方法是反射吸光度测定，光源随着上述多个试剂固定化部分变为线状而变为线状，光源的线状宽度是1.0mm以下，所以上述测定对象物浓度动态范围宽，而且可以检测前界，另外，由于光源为1.0mm以下，所以消费能量变小，同时在上述多个试剂固定化部分的上述标记试剂结合量中，噪音的影响变小，可以准确且高精度的测定，优选在上述记载的生物传感器中，是与上述多个试剂固定化部分相等的宽度，而且，也是比上述多个试剂固定化部分间的距离小的值。
根据权利要求第23项的测定方法，则在从权利要求第17项到权利要求第22项任一项记载的测定方法中，分别测定上述多个试剂固定化部分中的结合量，并进行前界判定，所以，在上述多个试剂固定化部分中的上述标记试剂结合量的测定中，通过在各自的试剂固定化部分中测定上述结合量，获得可以判别上述测定是否在前界区域内的测定效果。
根据权利要求第24项记载的测定方法，则在从权利要求第17项到权利要求第23项任一项记载的测定方法中，在上述多个试剂固定化部分中，测定相对于加入上述被检查溶液的部分的最上游位置的上述试剂固定化部分的标记试剂结合量，同时也进行其它的试剂固定化部分的测定，由其各自的测定结果，进行在上述最上游的试剂固定化部分中的标记试剂结合量测定值的前界判定，所以把被检查溶液加入部分作为最上游时，通过测定上述多个试剂固定化部分中位于最上游的试剂固定化部分中的标记试剂的结合量，可以高定量精度的测定，通过测定相对于上述试剂固定化部分以外的部分中的试剂固定化部分的上述标记试剂结合量，进行前界判定，而且准确性高，另外，获得了可以简易、迅速、高精度的测定效果。
根据权利要求第25项记载的测定方法，则在从权利要求第17项到权利要求第24项任一项记载的测定方法中，在上述多个试剂固定化部分中，测定相对于加入上述被检查溶液的部分的最上游位置的上述试剂固定化部分的标记试剂结合量，同时也进行其它的试剂固定化部分的测定，由其各自的测定结果，通过演算处理判定上述最上游的试剂固定化部分中标记试剂结合量测定范围、或者其它的试剂固定化部分中标记试剂结合量测定范围，在测定结果中使用任何一个标记试剂结合量，所以在上述多个试剂固定化部分中，各个被检查溶液具有不同的被检查溶液浓度动态范围，具有可以测定多个测定对象物动态范围的效果。
根据权利要求第26项记载的测定方法，则在从权利要求第17项到权利要求第25项任一项记载的测定方法中，上述测定方法是由上述被检查溶液的加入操作开始的一步免疫色谱，虽是免疫测定法，同时不需要洗涤操作，除了保持了简易迅速的一步免疫色谱的优点，而且，可以检测前界，能够提供更加准确性高的测定方法，同时只通过同样的测定操作，就获得了可以提供能够更宽范围的测定测定对象物浓度范围测定的测定方法的效果。
根据权利要求第27项记载的生物传感器，则在从权利要求第1项到权利要求第10项、从权利要求第12项到权利要求第16项任一项记载的生物传感器中，上述试剂固定化部分为3个地方，所以具有准确性、可靠性高的测定对象物浓度动态范围，而且可以前界检测的试剂组成变为可能，具有获得更加迅速、简易、且准确性、可靠性高的生物传感器的效果。
根据权利要求第28项记载的生物传感器，则在权利要求第27项记载的生物传感器中，相对于加入上述被检查溶液的部分，最上游位置的上述试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物、或者上述标记试剂的亲和力最高，而且，位于第2和第3的试剂固定化部分的试剂的亲和力相同，所以具有准确性、可靠性高的测定对象物浓度动态范围，而且可以前界检测的试剂组成变为可能，上述试剂固定化部分为3个地方，同时由两种固定化试剂构成，由于更少的试剂组成，廉价的且3个地方的试剂固定化部分，所以具有获得准确性、可靠性高的生物传感器的效果。
根据权利要求第29项记载的测定方法，则在从权利要求第17项到权利要求第26项任一项记载的测定方法中，由于从上述试剂固定化部分的3个地方获得信号，所以具有可以准确性、可靠性且迅速、简易性高的测定效果。
根据权利要求第30项记载的测定方法，则在使用权利要求第28项记载的生物传感器的测定方法中，试剂固定化部分为3个地方，同时由两种固定化试剂构成，由于更少的试剂组成，廉价的且3个地方的试剂固定化部分，所以具有能够准确性、可靠性的测定效果。
根据权利要求第31项记载的测定方法，则在权利要求第30项记载的测定方法中，上述3个地方的试剂固定化部分中，通过测定相对于加入上述被检查溶液部分的下游2个地方的固定化部分中上述标记试剂的结合量，检测前界区域，具有可以准确性、可靠性且迅速、简易性高的测定效果。
附图的简单说明
第1图表示本发明实施方式1的生物传感器的分解图(第1(a)图)，表示本发明实施方式1中生物传感器的斜视图(第1(b)图)。
第2图是本发明实施方式1中的测定图。
第3图是本发明实施方式1中的测定波形图。
第4图是本发明实施方式1中的多浓度测定结果图。
第5图是本发明实施方式1中的测定动态范围概略图(第5(a)图)，本发明实施方式1中的前界判定概略图(第5(b)图)。
第6图表示本发明的试剂固定化部分为3个地方的形式即实施方式2的生物传感器的分解图(第6(a)图)，表示本发明实施方式2中生物传感器的斜视图(第6(b)图)。
第7图是本发明实施方式2中的测定波形图。
第8图是本发明实施方式2中的多浓度测定结果图。
第9图是本发明实施方式2中的测定结果概略图。
为实施发明的最佳方式
(实施方式1)
下面，参照第1图说明本发明的实施方式1。第1(a)图是表示本发明一个实施方式的生物传感器的分解图，第1(b)图表示本发明一个实施方式中的生物传感器的斜视图。在第1图中，2表示展开层，由硝化纤维素构成。如果这些在展开层中使用的材料是可以由被检查溶液湿润的材料，则可以由滤纸、无纺布、薄膜、布、玻璃纤维等多孔质的任意材料构成。另外，4表示标记试剂，是以干燥状态、由被检查溶液可以洗提的状态、相对于被检查溶液中的测定对象物保持金胶体标记抗体。5，9表示试剂固定化部分I、和试剂固定化部分II，是对于被检查溶液中的测定对象物的抗体，而且，哪个抗体在与上述标记试剂不同的表位结合和测定对象物结合，都以干燥状态被固定化，以便被检查溶液中的测定对象物和上述标记试剂形成复合体。另外，试剂固定化部分I(5)中使用的抗体和试剂固定化部分II(9)中使用的抗体都由相对于被检查溶液中的测定对象物的亲和力不同的抗体构成。另外，从加入被检查溶液的部分来看，越是上游越会迅速的与被检查溶液和被测定对象物接触，所以优选使用相对于上述测定对象物的亲和力高的抗体。另外，在试剂固定化部分I和试剂固定化部分II中使用的抗体可与上述标记试剂、测定对象物形成3元复合体即可，因此，相对于测定对象物的表位，既可以相同，也可以不同。另外，图以上述多个试剂固定化部分是2个地方的例子表示的，但是不必2个地方，如果是2个地方以上，则可以根据其目的自由选择，即使在展开层上的形状方面，并不是必须是线状，可以自由选择点状、或者字符形状、键型形状等。在第1图中的上述试剂固定化部分5，9在空间上是分离的，但是即使对于此，并不是必须分离，也可以以看上去为一体的线状的样子接触。另外，其中所述的标记方法，选择的是把上述试剂固定化部分中的结合作为检测手段，并且金胶体只不过是一个例子，使用者可以根据需要任意选择酶、蛋白质、色素、荧光色素、乳液等着色粒子。6表示不透过液体的薄板材料，在此，由透明PET带构成。具有与微细空间1连接的部分，以及除去上述被检查溶液到达的终端，粘着覆盖展开层的结构。由于使其覆盖了，所以隔断保护了向被检查溶液的加入部分以外的点样，同时具有防止来自外部的污染的作用。其中所谓的来自外部的污染指不小心的接触被检查溶液以及实验者的手等直接接触展开层等。覆盖时，优选使用透明的材料，由于覆盖试剂固定化部分5的部分是确认测定结果的部分，所以至少优选具有可以透过的状态。另外，需要更高精度测定的情况，是展开层的上部，特别是含有并粘着密闭的上述标记试剂部分、以及上述固定化部分，而且，可以采取以相同方式使相对于被检查溶液的浸透方向的平行侧面粘着密闭的结构。3表示展开层中的开放部分，7表示保持展开层的底板，其中由白色PET薄膜构成。底板7具有加固展开层的作用，同时在被检查溶液中使用血液、唾液、尿等感染危险性的某种溶液时，也具有将其隔断的作用。另外，由于展开层润湿时具有透光性的情况等，所以也可以具有隔断光的效果。8表示微细空间形成材料，具有形成被检查溶液依靠毛细管现象流入的空间的作用，并由使透明PET薄膜叠层来构成。另外，微细空间形成材料8在被检查溶液加入后，使用生物传感器时，对被检查溶液也具有防护外部污染的作用。其中所谓的防护表示不小心被检测溶液的粘着和飞溅。微细空间形成材料8可以使用ABS、聚苯乙烯、聚氯乙稀等、其它的合成树脂材料、金属、玻璃等不透过溶液的材料，另外，优选透明或者半透明，但是不透明的有颜色的，即使是不透明的材料也可以由任意的材料构成。1表示微细空间，微细空间1由上述微细空间形成材料8形成，依靠毛细管现象流入检测体。另外，微细空间1与上述展开层2连接，通过被检查溶液向上述微细空间的流入，开始向展开层2的浸透。
下面，使用第1(b)图对它的测定进行说明。如果使被检查溶液在微细空间1接触，依靠毛细管现象则不需要机械操作，被检查溶液自然地流入上述微细空间中。被检查溶液的流入量是否充足，可以透过微细空间形成材料来确认。另外，也有限制被检查溶液加入量的情况，如果是需要一定量，则由于把上述微细空间的体积看作上述一定体积，所以可以精度高地限制加入量，另外，在需要上述被检查溶液为一定量以上的情况下，由于可以使其保持一定量以上的体积，所以可以根据需要调节。在上述微细空间内，保持细胞收缩试剂10，而且其中使用氯化钾。细胞收缩试剂10是在上述被检查溶液中含有细胞成分时应该设置的试剂，使用不含细胞成分的被检查溶液时并不特别必要。另外细胞收缩试剂(细胞成分收缩剂)10如果具有收缩细胞的效果，则即使是上述氯化钾以外的无机盐、包括氯化钠、磷酸钠盐等的无机化合物以及、甘氨酸、谷氨酸等氨基酸；脯氨酸等亚胺酸；葡萄糖、蔗糖、海藻糖等糖类；山梨醇等糖醇，也同样可以进行。含有这样的细胞收缩试剂(细胞成分收缩剂)10的体系，特别是把全血作为被检查溶液使用时特别有效。流入上述微细空间的被检查溶液由上述微细空间和展开层的接触部分向展开层浸透。被检查溶液到达标记试剂部分4时，标记部分4开始溶出。之后，被检查溶液中存在测定对象物时，上述金胶体标记抗体一边反应，一边进行浸透，被检查溶液到达试剂固定化部分I(5)，在上述测定对象物存在时，根据其量，形成固定化抗体I-测定对象物-标记抗体的复合体。接着，被检查溶液到达试剂固定化部分II(9)，在上述测定对象物存在时，根据其量，在上述试剂固定化部分5没有结合的标记试剂部分4，形成固定化抗体II-测定对象物-标记抗体的复合体。在上述试剂固定化部分中，标记抗体的结合不存在测定对象物，或在检测灵敏度以下的量时，标记抗体的大半不结合就通过。而且，此被检查用液到达展开层中的开放部分3。开放部分3由于没有上述不透过薄板而被开放，所以上述被检查溶液到达后或者到达的同时挥发或者蒸发，而且，在开放部分被检查溶液渗出，且只在开放部分中的展开层的上部，上述被检查溶液与在上述微细空间内的展开层上部的被检查溶液达到相同的高度，或者达到规定高度。由于这些效果，所以上述展开层的被检查溶液的浸透和浸透方向不需要吸水用的材料，测定中被控制一定方向。一般地，往往设计吸水部分代替开放部分。其相对于在展开层的反应部分中使用的材料，可使用保水效果、吸水效果更高的多孔质材料，进而吸水和吸引被检查溶液，进一步在展开层上，具有使上述被检查溶液通过的作用和可以缩短测定时间的作用。
上述开放部分3具有与这些相同的效果，特别是使用上述微细空间或者上述开放部分的手法，特别适合被检查溶液为微量的情况，即，由指尖的穿刺得到的血液和被检查溶液为极微量时，特别适合。接着通过确认上述试剂固定化部分I(5)中的标记试剂的结合状态和试剂固定化部分II(9)得到测定结果。需要定性判定时也可以根据目测判定。另外需要精度高的测定时，通过使用液体不透过性材料使相对于上述展开层的被检查溶液浸透方向的平行侧面和展开层上面粘着密闭，使上述被检查溶液的浸透整流，而且，根据被检查溶液中的上述测定对象物的量形成均匀量的复合体，使用含有反射吸光度的扩散电磁放射线的反射光或者透过光等，通过测定标记物的结合量，得到定量的结果。其中电磁放射线优选可见光区或者近可见光区，作为电磁放射线源，可以根据使用者的需要选择LED(Light Emitting Diode；发光二极管)、LD(Laser Diode；激光二极管)等。另外，在被检查溶液中的测定对象物浓度检测中使用上述试剂固定化部分I部分，通过使用亲和力低的抗体，也可以在前界检测时使用试剂固定化部分II(9)中的上述标记试剂结合量。另外，上述反应例叙述的是关于抗原抗体反应中的夹层反应，但是根据选择的试剂，使用和被检查溶液中的测定对象物进行竞争反应的试剂时，也可以为竞争反应。另外在抗原抗体反应以外，利用特殊的结合时，可以由形成任意的结合反应体系的试剂成分构成。
(实施方式2)
下面，参照第6图说明本发明的实施方式2。第6(a)图是表示本发明实施方式2的生物传感器的分解图，第6(b)图是表示本发明实施方式2中的生物传感器的斜视图。在第6图中，2表示展开层，由硝化纤维素构成。如果这些在展开层中使用的材料是可以由被检查溶液湿润的材料，则可以由滤纸、无纺布、薄膜、布、玻璃纤维等多孔质的任意材料构成。另外，4表示标记试剂，是以干燥状态、由被检查溶液可以洗提的状态、相对于被检查溶液中的测定对象物保持金胶体标记抗体。5，9，14表示试剂固定化部分I、和试剂固定化部分II、试剂固定化部分III，是对于被检查溶液中的测定对象物的抗体，而且，以干燥状态被固定化，以便被检查溶液中的测定对象物和上述标记试剂形成复合体。另外，试剂固定化部分I(5)中使用的抗体和试剂固定化部分II(9)和试剂固定化部分III(14)中使用的抗体都由相对于被检查溶液中的测定对象物的亲和力不同的抗体构成。另外，从加入被检查溶液的部分来看，越是上游越会迅速的与被检查溶液和被测定对象物接触，所以优选使用相对于上述测定对象物的亲和力高的抗体。另外，在试剂固定化部分I和试剂固定化部分II、试剂固定化部分III中使用的抗体可与上述标记试剂、测定对象物形成3元复合体即可，因此，相对于测定对象物的表位，既可以相同，也可以不同。另外，图以上述多个试剂固定化部分是3个地方的例子表示的，但是这是在上述实施方式1中所示的2个地方的情况下，对扩大测定动态范围的情况特别有效，扩大后可以检测前界，另外，也可以进一步扩大测定动态范围。在上述2个的情况下已经叙述了，但是求出更宽的测定动态范围的情况和、在各自的试剂固定化部分中需要狭窄的测定动态范围，而且通过使上述试剂固定化部分的亲和力变化而保持测定动态范围的情况等，并不是必须3个地方，如果是3个地方以上，则可以根据其目的自由选择。另外，在3个地方以上使用的情况下，也可以是3个地方以上的各自的试剂固定化部分全部是不同的亲和力的情况和由两种亲和力不同的固定化试剂构成的情况。另外，这时，试剂固定化部分可以自由组合，也不用说可以根据使用者的目的选择。即使在展开层上的形状方面，并不是必须是线状，可以自由选择点状、或者字符形状、键型形状等。在第6图中的上述试剂固定化部分在空间上是分离的，但是即使对于此，并不是必须分离，也可以以看上去为一体的线状的样子接触。另外，其中所述的标记方法，选择的是把上述试剂固定化部分中的结合作为检测手段，并且金胶体只不过是一个例子，使用者可以根据需要任意选择酶、蛋白质、色素、荧光色素、乳液等着色粒子。6表示不透过液体的薄板材料，在此，由透明PET带构成。具有与微细空间1连接的部分，以及除去上述被检查溶液到达的终端，粘着覆盖展开层的结构，由于使其覆盖了，所以隔断保护了向被检查溶液的加入部分以外的点样，同时具有防止来自外部的污染的作用。其中所谓的来自外部的污染指不小心的接触被检查溶液以及实验者的手等直接接触展开层等。覆盖时，优选使用透明的材料，由于覆盖试剂固定化部分I(5)、试剂固定化部分II(9)、试剂固定化部分III(14)的部分是确认测定结果的部分，所以至少优选具有可以透过的状态。另外，需要更高精度测定的情况，是展开层的上部，特别是含有并粘着密闭的上述标记试剂部分以及上述固定化部分，而且，可以采取以相同方式使相对于被检查溶液的浸透方向的平行侧面粘着密闭的结构。3表示展开层中的开放部分，7表示保持展开层的底板，其中由白色PET薄膜构成。底板7具有加固展开层的作用，同时在被检查溶液中使用血液、唾液、尿等感染危险性的某种溶液时，也具有将其隔断的作用。另外，由于展开层润湿时具有透光性的情况等，所以也可以具有隔断光的效果。8表示微细空间形成材料，具有形成被检查溶液依靠毛细管现象流入的空间的作用，并由使透明PET薄膜叠层来构成。另外，微细空间形成材料8在被检查溶液加入后，使用生物传感器时，对被检查溶液也具有防护外部污染的作用。其中所谓的防护表示不小心被检查溶液的粘着和飞溅。微细空间形成材料8可以使用ABS、聚苯乙烯、聚氯乙稀等、其它的合成树脂材料、金属、玻璃等不透过溶液的材料，另外，优选透明或者半透明，但是不透明的有颜色的，即使是不透明的材料也可以由任意的材料组成。1表示微细空间，微细空间1由上述微细空间形成材料8形成，依靠毛细管现象流入检测体。另外，微细空间与上述展开层2连接，通过被检查溶液向上述微细空间的流入，开始向展开层2的浸透。
下面，使用第6(b)图对它的测定进行说明。如果使被检查溶液在微细空间1接触，依靠毛细管现象则不需要机械操作，被检查溶液自然地流入上述微细空间中。被检查溶液的流入量是否充足，可以透过微细空间形成材料来确认。另外，也有限制被检查溶液加入量的情况，如果是需要一定量，则由于把上述微细空间的体积看作上述一定体积，所以可以精度高地限制加入量，另外，在需要上述被检查溶液为一定量以上的情况下，由于可以使其保持一定量以上的体积，所以可以根据需要调节。在上述微细空间内，保持细胞收缩试剂10，而且其中使用氯化钾。细胞收缩试剂10是在上述被检查溶液中含有细胞成分时应该设置的试剂，使用不含细胞成分的被检查溶液时并不特别必要。另外细胞收缩试剂(细胞成分收缩剂)10如果具有收缩细胞的效果，则即使是上述氯化钾以外的无机盐、包括氯化钠、磷酸钠盐等的无机化合物以及、甘氨酸、谷氨酸等氨基酸；脯氨酸等亚胺酸；葡萄糖、蔗糖、海藻糖等糖类；山梨醇等糖醇，也同样可以进行。含有这样的细胞收缩试剂(细胞成分收缩剂)10的体系，特别是把全血作为被检查溶液使用时特别有效。流入上述微细空间的被检查溶液由上述微细空间和展开层的接触部分向展开层浸透。被检查溶液到达标记试剂部分(4)时，标记部分4开始溶出。之后，被检查溶液中存在测定对象物时，上述金胶体标记抗体一边反应，一边进行浸透，被检查溶液到达试剂固定化部分I(5)，在上述测定对象物存在时，根据其量，形成固定化抗体I-测定对象物-标记抗体的复合体。接着，被检查溶液到达试剂固定化部分II(9)，在上述测定对象物存在时，根据其量，对于在上述试剂固定化部分(5)没有结合的标记试剂部分(4)，形成固定化抗体II-测定对象物-标记抗体的复合体。另外，被检查溶液到达试剂固定化部分III(14)，在上述测定对象物存在时，根据其量，对于在上述试剂固定化部分(5)和试剂固定化部分(9)没有结合的标记试剂部分(4)，形成固定化抗体III-测定对象物-标记抗体的复合体。在上述试剂固定化部分中，标记抗体的结合不存在测定对象物，或在检测灵敏度以下的量时，标记抗体的大半不结合就通过。而且，此被检查用液到达展开层中的开放部分3。开放部分3由于没有上述不透过薄板而被开放，所以上述被检查溶液到达后或者到达的同时挥发或者蒸发。而且，在开放部分被检查溶液渗出，且只在开放部分中的展开层的上部，上述被检查溶液与在上述微细空间内的展开层上部的被检查溶液达到相同的高度，或者达到规定高度。由于这些效果，所以上述展开层的被检查溶液的浸透和浸透方向不需要吸水用的材料，测定中被控制一定方向。一般地，往往设计吸水部分代替开放部分。其相对于在展开层的反应部分中使用的材料，可使用保水效果、吸水效果更高的多孔质材料，进而吸水和吸引被检查溶液，进一步在展开层上，具有使上述被检查溶液通过的作用和可以缩短测定时间的作用。上述开放部分3具有与这些相同的效果，特别是使用上述微细空间或者上述开放部分的手法，特别适合被检查溶液为微量的情况，即，由指尖的穿刺得到的血液和被检查溶液为极微量时，特别适合。接着通过确认上述试剂固定化部分I(5)中的标记试剂的结合状态和试剂固定化部分II(9)、试剂固定化部分III(14)得到测定结果。需要定性判定时也可以根据目测判定。另外需要精度高的测定时，通过使用液体不透过性材料使相对于上述展开层的被检查溶液浸透方向的平行侧面和展开层上面粘着密闭，使上述被检查溶液的浸透整流，而且，根据被检查溶液中的上述测定对象物的量形成均匀量的复合体，使用含有反射吸光度的扩散电磁放射线的反射光或者透过光等，通过测定标记物的结合量，得到定量的结果。其中电磁放射线优选可见光区或者近可见光区，作为电磁放射线源，可以根据使用者的需要选择LED(Light Emitting Diode；发光二极管)、LD(Laser Diode；激光二极管)等。另外，在被检查溶液中的测定对象物浓度检测中使用上述试剂固定化部分I(5)，通过使用亲和力低的抗体，也可以在前界检测时使用试剂固定化部分II(9)、试剂固定化部分III(14)中的上述标记试剂结合量。另外，上述反应例叙述的是关于抗原抗体反应中的夹层反应，但是根据选择的试剂，使用和被检查溶液中的测定对象物进行竞争反应的试剂时，也可以为竞争反应。另外在抗原抗体反应以外，利用特殊的结合时，可以由形成任意的结合反应体系的试剂成分构成。
实施例
通过以下的实施例，更加详细地说明实施本发明的方法。而且，本发明并不受以下实施例的任何限制。
(全CRP的定量1)
制备含有在硝化纤维素膜上固定化抗CRP抗体A的试剂固定化部分I、以及固定化抗CRP抗体B的试剂固定化部分II、还有保持抗CRP抗体C和金胶体的复合体的标记试剂的免疫色谱试片。该免疫色谱试片示于第1图中。图中，免疫色谱试片包括固定化抗体的试剂固定化部分I(5)、试剂固定化部分II(9)，和在比其在加入被检查溶液的展开开始点还近的部分的、含有抗CRP抗体C和金胶体的复合体的区域即标记试剂4，和被检查溶液导入部分1。该免疫色谱试片如下进行制备。
a)免疫色谱试片的调制
准备使用磷酸缓冲溶液进行稀释而进行浓度调节的抗CRP抗体A溶液。使用溶液输出装置将该抗体溶液涂覆在硝化纤维素膜上。由此，在硝化纤维素膜上获得试剂固定化部分即抗体固定化线I。接着同样在离开被检查溶液导入部分下游2mm的部分，涂覆比在上述抗体固定化线I中使用的抗体亲和力还低的抗CRP抗体B。将该硝化纤维素膜干燥后，在含有1％脱脂乳的Tris-HCl缓冲溶液中浸渍，缓慢振荡30分钟。30分钟后，将膜移动到Tris-HCl缓冲溶液槽中，缓慢振荡10分钟后，在另一个Tris-HCl缓冲溶液槽中再缓慢振荡10分钟，进行膜的洗涤。进行2次洗涤后，从液槽中取出膜，并在室温干燥。
向0.01％氯金酸的回流中的100℃溶液中加入1％柠檬酸溶液调制金胶体。连续不断地回流30分钟后，室温放置并冷却。在使用0.2M的碳酸钾溶液、并调节到pH9的上述金胶体溶液中，加入抗CRP抗体C并搅拌数分钟后，通过加入pH9的10％BSA(牛血清蛋白质)溶液并使最终加入量为1％，并进行搅拌，从而调制了检测物质即抗体-金胶体复合体(标记抗体)。通过将上述标记抗体溶液在4℃、20000G下进行50分钟离心分离，分离标记抗体，将其悬浮于洗涤缓冲液(1％BSA·磷酸缓冲液)中后，进行上述离心分离，洗涤分离标记抗体。将该标记抗体悬浮于洗涤缓冲液中，使用0.8μm的过滤器过滤后，调节到当初的金胶体溶液量的十分之一量，并在4℃下贮藏。将上述金胶体标记抗体溶液安置在溶液输出装置上，涂敷，从抗CRP抗体固定化A和抗CRP抗体固定化B干燥膜上的固定化线I、以及固定化线II分开，由被检查溶液加入开始方向依次为标记抗体、固定化线I、固定化线II的位置关系，之后使膜真空冷冻干燥。由此，在固定化膜上获得具有标记试剂的反应层载体。
接着，在由厚度0.5mm的白色PET构成的底板上粘着含有调制的标记试剂的反应层载体，并裁剪为5.0mm的宽度。裁剪后，将各片从标记抗体保持部分到终端部分，卷起厚度为100μm的透明带。在没有卷起的透明带的始端部分中央，粘着通过叠层厚度100μm的透明PET而制备的空间形成材料，进而形成间隙部分(宽5.0mm×长12.0mm×高0.5mm)。上述空间形成材料是如下制成的：点样预先调制为1.5M的氯化钾水溶液后，使用液体氮直接冷冻，进行冷冻干燥，由此，制备了具有以干燥状态保持氯化钾的收缩剂保持部分的空间形成材料。如此制备免疫色谱试片。
b)试样的调制
将加入了抗凝固剂即EDTA·2K的人的血液调制为血细胞比容值为45％。通过向该血液中加入已知浓度的CRP溶液，调制各种含有已知浓度的CRP血液。
c)试片上的显色程度的测定
在生物传感器中，向试样导入部分加入约50μl的含有CRP的全血，通过向吸水部分方向展开处理，使其进行抗原抗体反应，从而在抗体固定化部分进行显色反应。向该生物传感器加入试样5分钟后，使用反射吸光度测定仪测定其显色状况，将其示于第2图中。第2图表示本发明的一个实施方式中的测定图，在第2图中的11表示光源，是635nm的半导体激光，另外，检测侧12受光元件由光电二极管构成。另外，扫描生物传感器10侧，从上述展开层的反射扩散光演算处理试剂固定化部分I(5)和试剂固定化部分II(9)中的上述标记试剂结合量，获得作为吸光度的结果。其一测定结果示于第3图。第3图表示本发明的一个实施方式中的测定波形图，上述多个试剂固定化部分是2个地方，相对于上述加入被检查溶液的展开部分而在上游使用亲和力高的抗体时，且抗原浓度为某一定浓度时，获得第3图样式的波形。这是固定光源和受光元件，并扫描传感器侧。从通过这样获得的波形，读取波峰值(反射吸光度)。为了获得这样的波形，也可以操纵光源侧。
接着，将作为血清浓度含有0.1mg/dl、0.3mg/dl、1.0mg/dl、3.0mg/dl、7.0mg/dl、17.0mg/dl、37.0mg/dl、80.0mg/dl的CRP全血加入到生物传感器中进行展开处理。对于各CRP浓度的血液的生物传感器上的试剂固定化部分的显色状况利用反射吸光度测定仪测定。测定635nm的吸光度，根据各CRP浓度作图。将该图示于第4图中。第4图表示本发明的一个实施方式中的多浓度测定结果图，第4图中的横轴表示预先分别注入测定中使用的被检查溶液，通过使用市售测定装置测定的CRP浓度。其中，作为市售装置，使用胶乳免疫凝集法的试剂和装置。第4图的纵轴表示得到的吸光度。白色曲线是由上述试剂固定化部分I(5)获得的吸光度，黑色曲线是上述试剂固定化部分II(9)获得的吸光度。由图上的两者显然可知，对于CRP的灵敏度不同。接着，使用第5(a)图和第5(b)图进行说明。第5(a)图表示本发明的一个实施方式中的测定动态范围概略图，第5(b)图表示本发明的一个实施方式中的前界判定概略图。第5(a)图是上述第4图中所示的结果的概略图。如果看第5(a)图可知，为表示试剂固定化部分I和试剂固定化部分II中不同的CRP灵敏度，上述被检查溶液中的CRP测定范围不同。即，根据该图的CRP，吸光度增加的区域动态范围1是试剂固定化部分I中的测定区域，另外，动态范围2变为试剂固定化部分2中的可以测定CRP的区域。通过利用这些试剂固定化部分I、和试剂固定化部分2的各自的结果，可以实现动态范围3的测定动态范围。例如，获得在试剂固定化部分的A1或者A4的吸光度时，试剂固定化部分II的吸光度如果是表示B1时，那就是A1的CRP浓度，如果是表示B4时，就是A4中的CRP浓度。这样在一个试片上，而且在一次测定中可以测定宽范围的测定动态范围。下面使用第5(b)图对前界现象检测进行说明。第5(b)图也与刚才说明的第5(a)图相同，是标准地表示第4图中的测定结果图。如果看第5(b)图可知，为表示试剂固定化部分I和试剂固定化部分II中不同的CRP灵敏度，上述被检查溶液中的CRP测定范围不同。利用该性质，检测前界现象。在该图中，用黑三角曲线表示的B-point表示在该免疫色谱试片中，前界判定临界值。所谓前界判定临界值是在例如试剂固定化部分I中的吸光度是A1和A4时，试剂固定化部分II中的吸光度相对于A1为B1，是刚才前界判定临界值以下的值。这时，通过代入试剂固定化部分I中的标准曲线，可知该被检查溶液的CRP浓度是A1。但是，试剂固定化部分中的吸光度是B4时，其为刚才的CRP浓度是B-point地点以上的值。为此，可以判断上述试剂固定化部分I的标准曲线以外的部分。这样，通过把某一定的临界值以上的、或者以下的作为基准，可以判定是否为前界区域。其中所述的标准曲线是指在相对于CRP浓度上升而吸光度上升的区域，通常预先利用已知浓度的被检查溶液进行计算，然后测定未知的被检查溶液时，从获得的吸光度计算该未知被检查溶液中的CRP浓度的计算式。
(全血CRP的定量2)
制备含有在硝化纤维素膜上固定化抗CRP抗体D的试剂固定化部分I、以及固定化抗CRP抗体E的试剂固定化部分II、以及试剂固定化部分III、还有保持抗CRP抗体F和金胶体的复合体的标记试剂的免疫色谱试片。该免疫色谱试片示于第6图中。图中，免疫色谱试片包括固定化抗体的试剂固定化部分I(5)、试剂固定化部分II(9)、试剂固定化部分III(14)，和在比其在加入被检查溶液的展开开始点还近的部分的、含有抗CRP抗体F和金胶体的复合体的区域即标记试剂4，和被检查溶液导入部分1。该免疫色谱试片如下进行制备。
a)免疫色谱试片的调制
准备使用磷酸缓冲溶液进行稀释而进行浓度调节的抗CRP抗体D溶液。使用溶液输出装置将该抗体溶液涂覆在硝化纤维素膜上。由此，在硝化纤维素膜上获得试剂固定化部分即抗体固定化线I。接着同样在离开被检查溶液导入部分下游2mm的部分以及再离开2mm的部分，涂覆比在上述抗体固定化线I中使用的抗体亲和力还低的抗CRP抗体E。由此，得到试剂固定化线II、和试剂固定化线III。将该硝化纤维素膜干燥后，在含有1％脱脂乳的Tris-HCl缓冲溶液中浸渍，缓慢振荡30分钟。30分钟后，将膜移动到Tris-HCl缓冲溶液槽中，缓慢振荡10分钟后，在另一个Tris-HCl缓冲溶液槽中再缓慢振荡10分钟，进行膜的洗涤。进行2次洗涤后，从液槽中取出膜，并在室温干燥。
向0.01％氯金酸的回流中的100℃溶液中加入1％柠檬酸溶液调制金胶体。连续不断地回流30分钟后，室温放置并冷却。在使用0.2M的碳酸钾溶液、并调节到pH9的上述金胶体溶液中，加入抗CRP抗体F并搅拌数分钟后，通过加入pH9的10％BSA(牛血清蛋白质)溶液并使最终加入量为1％，并进行搅拌，从而调制了检测物质即抗体-金胶体复合体(标记抗体)。通过将上述标记抗体溶液在4℃、20000G下进行50分钟离心分离，分离标记抗体，将其悬浮于洗涤缓冲液(1％BSA·磷酸缓冲液)中后，进行上述离心分离，洗涤分离标记抗体。将该标记抗体悬浮于洗涤缓冲液中，使用0.8μm的过滤器过滤后，调节到当初的金胶体溶液量的十分之一量，并在4℃下贮藏。将上述金胶体标记抗体溶液安置在溶液输出装置上，涂敷，从抗CRP抗体固定化D和抗CRP抗体固定化E干燥膜上的固定化线I以及固定化线II、固定化线III分开，由被检查溶液加入开始方向依次为标记抗体、固定化线I、固定化线II、固定化线III的位置关系，之后使膜真空冷冻干燥。由此，在固定化膜上获得具有标记试剂的反应层载体。
接着，在由厚度0.5mm的白色PET构成的底板上粘着含有调制的标记试剂的反应层载体，并裁剪为5.0mm的宽度。裁剪后，将各片从标记抗体保持部分到终端部分，卷起厚度为100μm的透明带。在没有卷起的透明带的始端部分中央，粘着通过叠层厚度100μm的透明PET而制备的空间形成材料，进而形成间隙部分(宽5.0mm×长12.0mm×高0.5mm)。上述空间形成材料是如下制成的：点样预先调制为1.5M的氯化钾水溶液后，使用液体氮直接冷冻，进行冷冻干燥，由此，制备了具有以干燥状态保持氯化钾的收缩剂保持部分的空间形成材料。如此制备免疫色谱试片。
b)试样的调制
将加入了抗凝固剂即EDTA·2K的人的血液调制为血细胞比容值为45％。通过向该血液中加入已知浓度的CRP溶液，调制各种含有已知浓度的CRP血液。
c)试片上的显色程度的测定
在生物传感器中，向试样导入部分加入约50μl的含有CRP的全血，通过向吸水部分方向展开处理，使其进行抗原抗体反应，从而在抗体固定化部分进行显色反应。与在实施例(全血CRP的定量1)中说明的第2图相同的方式，测定向该生物传感器加入试样5分钟后的显色情况。该一测定结果示于第7图中。
第7图表示本发明的一个实施方式中的测定波形图，上述多个试剂固定化部分是3个地方，相对于上述加入被检查溶液的展开部分而在上游使用亲和力高的抗体，在上述试剂固定化部分II和试剂固定化部分III中使用同一抗体时，且抗原浓度为某一定浓度时，获得第7图样式的波形。这是固定光源和受光元件，并扫描传感器侧。从通过这样获得的波形，读取波峰值(反射吸光度)。为了获得这样的波形，也可以操纵光源侧。
接着，将作为血清浓度含有0.1mg/dl、0.3mg/dl、0.6mg/dl、1.0mg/dl、3.0mg/dl、6.0mg/dl、10.0mg/dl、15.0mg/dl、20.0mg/dl、30.0mg/dl的CRP全血加入到生物传感器中进行展开处理。对于各CRP浓度的血液的生物传感器上的试剂固定化部分的显色状况利用反射吸光度测定仪测定。测定635nm的吸光度，根据各CRP浓度作图。将该图示于第8图中。
第8图表示本发明的一个实施方式中的多浓度测定结果图，第8图中的横轴表示预先分别注入测定中使用的被检查溶液，通过使用市售测定装置测定的CRP浓度。其中，作为市售装置，使用胶乳免疫凝集法的试剂和装置。第8图的纵轴表示得到的吸光度。圆形白色曲线是由上述试剂固定化部分I(5)获得的吸光度，圆形黑色曲线是从上述试剂固定化部分II(9)获得的吸光度，三角形白色曲线是从上述试剂固定化部分III(14)获得的吸光度。由图上的各试剂固定化部分显然可知，对于CRP的灵敏度不同。接着，使用第9图进行说明。
第9图表示本发明的一个实施方式中的测定结果概略图，而且第9图是上述第8图中所示的结果的概略图。如果看第9图可知，为表示试剂固定化部分I和试剂固定化部分II、试剂固定化部分III中不同的CRP灵敏度，上述被检查溶液中的CRP测定范围不同。另外，可知即使在亲和力相等的试剂固定化部分II和试剂固定化部分III中，相对于CRP的灵敏度也不同。图中CRP浓度A时，获得的信号只是试剂固定化部分I(Al)，而且可知浓度A时，通过使用试剂固定化部分I可以进行CRP测定。图中B时，信号从试剂固定化部分I(B1)和试剂固定化部分III(B3)获得。但是在该浓度区域内，没有来自试剂固定化部分II的信号。由这些关系可知，这时，由试剂固定化部分I获得的信号不是试剂固定化部分I中的前界区域，而是可以线性回归的区域。接着，图中CRP浓度C和CRP浓度D、CRP浓度E时，从C1～C3、D1～D3、E1～E3、3个地方所有的试剂固定化部分获得信号。这时可知，试剂固定化部分I(C1、D1、E1)已经在前界区域，但是有来自试剂固定化部分II(C2、D2、E2)、试剂固定化部分III(C3、D3、E3)的信号。下面，对CRP浓度C和CRP浓度D、CRP浓度E进行叙述。在CRP浓度C中，有来自3个地方所有的信号，而且在试剂固定化部分II(C2)和试剂固定化部分III(C3)中，其信号有相当的差。这时，使用试剂固定化部分III可以酸出CRP浓度。CRP浓度D、CRP浓度E中，试剂固定化部分II(D2、E2)和试剂固定化部分III(D3、E3)的信号从CRP浓度D向CRP浓度E接近。由于该接近部分的关系，如果想广泛使用测定动态范围时，假设到CRP浓度C，使用试剂固定化部分III、在越过CRP浓度C时，可以使用试剂固定化部分II求出CRP浓度。这看起来只可能是来自试剂固定化部分II的信号，但是在不在本图中的非常高浓度的抗原CRP的情况下，在相同的信号下存在降低的情况。可以准确地判断可以测定区域(在本图中根据CRP浓度线性变化的部分)、或抗原过剩区域，另外CRP浓度E以上的情况，所有的信号相当接近，并可以判断本测定体系的前界区域。由此，测定对象物是未知浓度的被检查溶液的测定，上述试剂固定化部分是3个地方，另外使用的固定化用试剂是2种时，出人意料地，不仅可以使用一个生物传感器测定更宽的测定动态范围，而且可以更正确的测定前界区域检测等。这是以在3个地方的固定化的实施例表示的，但是不用说，使用者当然可以根据需要改变固定化部分的多数化，还可以根据需要改变根据使用抗体的亲和力的各试剂固定化部分的关系。其中所述的所谓信号，是在上述试剂固定化部分中，来自结合的上述标记试剂的信号，根据它的必要性，也可以通过目测判定，但是为了更准确地测定，优选使用如本例中所示的检测仪。
而且，作为在本发明实施方式中的生物装置，通常使用硝化纤维素和玻璃纤维滤纸这样的由任意的多孔质性载体构成的色谱法材料构成的生物传感器。由这样的材料构成的生物传感器是利用了例如抗原抗体反应这样的任意的测定原理，具有分析检测某些特定物质，进行定性或者定量的功能。
另外，在本发明实施例中，使用在同一硝化纤维素膜上设有标记试剂和试剂固定化部分的生物传感器，但是把在和硝化纤维素不同的材料例如无纺布类的多孔质性载体上载有标记试剂的作为标记试剂，即使放在支撑体上也没有任何问题。作为构成标记试剂的标记物使用金胶体已有实例，但是也可以是着色物质、荧光物质、磷光物质、发光物质、氧化还原物质、酶、核酸、内质网，只要是在反应前后产生某些变化的物质都可以使用。
另外，在本实施例中，是以标记试剂是一个地方，而试剂固定化部分是多个的例子表示的，但是标记试剂不一定是一个地方，也可以由多个试剂固定化部分和多个试剂的组合构成。例如在多个试剂固定化部分中在各试剂固定化部分的上游也可以采取布置各自标记试剂的构成，制造上的工序变得复杂，但是不用说可以在任意的位置上以任意的数量设置。
作为测定的试样溶液，例如有水和水溶液、尿、血液、血浆、血清、唾液等体液，溶解了固体以及粉体和气体的溶液等，其用途为例如尿检查和妊娠检查、水质检查、便检查、土壤分析、食品分析等。另外，作为被检物质即C反应性蛋白质(CRP)已有实例叙述，但是还可以举例的是抗体、免疫球蛋白、激素、酶以及肽等蛋白质以及蛋白质衍生物以及细菌、病毒、真菌类、支原体、寄生虫以及这些的产物及其成分的感染性物质、治疗药以及乱用药等药物以及肿瘤标记。具体的讲，即使是例如绒毛性性腺刺激激素(hCG)、黄体激素(LH)、甲状腺刺激激素、滤胞形成激素、甲状旁腺刺激激素、肾上腺皮质刺激激素、***、***特异性抗原、B型肝炎表面抗原、肌红蛋白、CRP、心肌肌蛋白、HbAlc、清蛋白等也没有任何问题。根据上述的形式，简便且迅速，高灵敏度、高性能的同时，实现了可以检测前界区域的准确性高的测定。另外，简便且迅速，高灵敏度、高性能的同时，可以实现在一次测定中，测定对象物动态范围足够大的测定。
产业上利用的可能性
使用本发明中的免疫色谱的生物传感器以及利用它的测定方法，并不限于在临床领域等医疗诊断现场，还可在食品卫生关连领域、环境检测领域等各种领域中，作为进行简易、准确而且迅速的测定来利用。
Claims (25)
1.生物传感器，其设有展开被检查溶液的展开层，含有在上述展开层上加入上述被检查溶液的加入部分，在上述展开层的局部试剂被固定化的试剂固定化部分，和包括以标记的干燥状态在上述展开层的局部被保持的、通过被检查溶液展开而可以洗提的标记试剂部分，通过测定上述试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分，
特征在于，存在多个上述试剂固定化部分，上述多个试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物的亲和力各不相同。
2.权利要求第1项记载的生物传感器，特征在于，是以加入上述被检查溶液的加入部分、标记试剂部分、试剂固定化部分的顺序设置的上述展开层上的各部分。
3.权利要求第1项或者权利要求第2项记载的生物传感器，特征在于，在上述多个的试剂固定化部分中被固定化试剂是抗体，被检查溶液中的测定对象物是抗原，对于加入上述被检查溶液的部分，越是上游越将相对于上述被检查溶液中的测定对象物的亲和力高的抗体固定化。
4.权利要求第1项或权利要求第2项记载的生物传感器，特征在于，在上述多个试剂固定化部分中试剂是单克隆抗体。
5.权利要求第1项或权利要求第2项记载的生物传感器，特征在于，上述多个试剂固定化部分的各个试剂相对于测定对象物的浓度测定动态范围不相同。
6.权利要求第1项或权利要求第2项记载的生物传感器，特征在于，上述多个试剂固定化部分的试剂各自识别相同的表位。
7.权利要求第1项或权利要求第2项记载的生物传感器，特征在于，上述试剂固定化部分是2个地方。
8.权利要求第1项或权利要求第2项记载的生物传感器，特征在于，上述多个试剂固定化部分相互接触，形成一体的线状。
9.权利要求第1项或权利要求第2项记载的生物传感器，特征在于，上述展开层是横向流动方式，上述多个试剂固定化部分在对于上述被检查溶液的展开方向的垂直方向上以线状被固定，该线宽是0.5mm-2.0mm，另外，多个试剂固定化部分之间的线间距离是1.0mm以上。
10.权利要求第1项或权利要求第2项记载的生物传感器，特征在于，含有上述标记试剂成分、固定化试剂成分，而且所有的试剂为干燥状态。
11.权利要求第1项或权利要求第2项记载的生物传感器，特征在于，上述被检查溶液是尿、唾液、血液。
12.权利要求第1项或权利要求第2项记载的生物传感器，特征在于，生物传感器是免疫色谱。
13.权利要求第1项或权利要求第2项记载的生物传感器，特征在于，上述试剂固定化部分是3个地方以上。
14.权利要求第13项记载的生物传感器，特征在于，相对于加入上述被检查溶液的部分，最上游位置的上述试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物的亲和力最高。
15.测定方法，其是使用了权利要求第1项记载的生物传感器的测定方法，特征在于，通过测定上述多个试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分。
16.测定方法，其是使用了权利要求第2项记载的生物传感器的测定方法，特征在于，通过测定上述多个试剂固定化部分中上述标记试剂的结合量，定性或者定量被检查溶液中的测定成分。
17.权利要求第15项或者权利要求第16项记载的测定方法，特征在于，测定上述多个试剂固定化部分中标记试剂的结合量的方法是使用电磁放射线。
18.权利要求第17项记载的测定方法，特征在于，固定上述生物传感器，通过相对于上述生物传感器扫描在上述测定中使用的电磁放射线源，或者，固定上述电磁放射线源，通过相对于上述电磁放射线源扫描上述生物传感器，测定上述试剂固定化部分的上述标记试剂结合量。
19.权利要求第15项或权利要求第16项记载的测定方法中，特征在于，该测定方法是反射吸光度测定，光源为线状，光源的线状宽度是1.0mm以下。
20.权利要求第15项或权利要求第16项记载的测定方法，特征在于，分别测定上述多个试剂固定化部分中的结合量，并进行前界判定。
21.权利要求第15项或权利要求第16项记载的测定方法，特征在于，在上述多个试剂固定化部分中，测定相对于加入上述被检查溶液的部分的最上游位置的上述试剂固定化部分的标记试剂结合量，同时也进行其它的试剂固定化部分的标记试剂结合量的测定，由其各自的测定结果，进行在上述最上游的试剂固定化部分中的标记试剂结合量测定值的前界判定。
22.权利要求第15项或权利要求第16项记载的测定方法，特征在于，在上述多个试剂固定化部分中，测定相对于加入上述被检查溶液的部分的最上游位置的上述试剂固定化部分的标记试剂结合量，同时也进行其它的试剂固定化部分的标记试剂结合量的测定，通过演算处理判定上述最上游的试剂固定化部分中标记试剂结合量测定范围、或者其它的试剂固定化部分中标记试剂结合量测定范围，在测定结果中使用任何一个标记试剂结合量。
23.权利要求第15项或权利要求第16项记载的测定方法，特征在于，上述测定是由上述被检查溶液的加入操作开始的一步免疫色谱。
24.权利要求第15项或权利要求第16项记载的测定方法，特征在于，上述试剂固定化部分是3个地方以上。
25.使用权利要求第24项记载的生物传感器的测定方法，特征在于，相对于加入上述被检查溶液的部分，最上游位置的上述试剂固定化部分的试剂相对于上述被检查溶液中的测定对象物的亲和力最高。
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