JPH0319690A - クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有するdna断片、該dna断片を有する組換えベクター及び該組換えベクターを有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラーゼの製造方法 - Google Patents
クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有するdna断片、該dna断片を有する組換えベクター及び該組換えベクターを有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラーゼの製造方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野〕
本発明は、タレアヂニン・ア当ドヒドロラーゼをコード
する遺伝子を有するDNA断片、該DNA断片を有する
組換えヘククー、該ヘクターを有する形質転換体および
該形質転換体を用いてクレアチニン・ア旦ドヒドロラー
ゼを製造する方法に関する。
する遺伝子を有するDNA断片、該DNA断片を有する
組換えヘククー、該ヘクターを有する形質転換体および
該形質転換体を用いてクレアチニン・ア旦ドヒドロラー
ゼを製造する方法に関する。
〔従来の技術]
タレアチニン・アごドヒドロラーゼ(creatini
neamidohydrolase, EC3.5+
2. 10)はタレアチニンとクレアチンの変換を触媒
する酵素であり、反応式は以下のとおりである。
neamidohydrolase, EC3.5+
2. 10)はタレアチニンとクレアチンの変換を触媒
する酵素であり、反応式は以下のとおりである。
クレアチニン・ア旦ドヒドロラーゼは血清中あるいは尿
中のタレアチニン及びクレアチンの測定に使用される。
中のタレアチニン及びクレアチンの測定に使用される。
従来、タレアチニン・アミドヒドロラーゼは、例えばシ
ュードモナス(Pseudomonas)属に属し、ク
レアヂニン・アミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物
を、タレアチニン,クレアチンまたはこれらの混合物の
存在下で培養し、培養物からタレアチニン・アジドヒド
ロラーゼを採取することにより製造されている(Ami
no Acid − Nucleic Acid第35
巻,39〜46. 1977)。
ュードモナス(Pseudomonas)属に属し、ク
レアヂニン・アミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物
を、タレアチニン,クレアチンまたはこれらの混合物の
存在下で培養し、培養物からタレアチニン・アジドヒド
ロラーゼを採取することにより製造されている(Ami
no Acid − Nucleic Acid第35
巻,39〜46. 1977)。
しかしながら、この方法は培地中にタレアチニン,クレ
アチン等高価な物質を添加することが必要であり、また
タレアチニン・アミドヒドロラーゼの収率も十分でなく
、効率よくクレアチニン・アミドヒドロラーゼを製造す
る方法の開発が望まれていた。
アチン等高価な物質を添加することが必要であり、また
タレアチニン・アミドヒドロラーゼの収率も十分でなく
、効率よくクレアチニン・アミドヒドロラーゼを製造す
る方法の開発が望まれていた。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明の課題は、遺伝子工学的手法により、タレアチニ
ン,クレアチン等の高価な物質を使用することなく、高
収率で効率良くタレアチニン・アミドヒドロラーゼを製
造しようとするものであって、このために、タレアチニ
ン・アミドヒドロラーゼ遺伝子を含有するDNA断片、
このDNA断片を含有する組換えベクター、及びこの組
換えベクターを保有する形質転換体を新たに提供するこ
とにある。
ン,クレアチン等の高価な物質を使用することなく、高
収率で効率良くタレアチニン・アミドヒドロラーゼを製
造しようとするものであって、このために、タレアチニ
ン・アミドヒドロラーゼ遺伝子を含有するDNA断片、
このDNA断片を含有する組換えベクター、及びこの組
換えベクターを保有する形質転換体を新たに提供するこ
とにある。
本発明者らは、上記の従来技術の問題点を解決するため
、タレアチニン・アミドヒドロラーセをコードする遺伝
子を有するDNA断片、該DNA断片を有する組換えヘ
クター、該ヘクターを有する形質転換体および該形質転
換体を用いてクレアチニン・アごトヒドロラーゼを製造
する方法について検削してきた。そして、また、クレア
チニン・アSト゛ヒトロラーゼ生産菌の有するタレアチ
ニン・ア壽ドヒドロラーゼ遺伝子をクローニングし、該
遺伝子を含有するDNA断片を得るとともに該遺伝子の
DNA配列を決定することに成功した。
、タレアチニン・アミドヒドロラーセをコードする遺伝
子を有するDNA断片、該DNA断片を有する組換えヘ
クター、該ヘクターを有する形質転換体および該形質転
換体を用いてクレアチニン・アごトヒドロラーゼを製造
する方法について検削してきた。そして、また、クレア
チニン・アSト゛ヒトロラーゼ生産菌の有するタレアチ
ニン・ア壽ドヒドロラーゼ遺伝子をクローニングし、該
遺伝子を含有するDNA断片を得るとともに該遺伝子の
DNA配列を決定することに成功した。
次いで該DNA断片を有する組換えベクターを得、さら
に該ヘクターを含む形質転換体を創製し、該形質転換体
を用いるクレアチニン・アミドヒドロラーゼの製造方法
を開発し、本発明を完或するに至った。
に該ヘクターを含む形質転換体を創製し、該形質転換体
を用いるクレアチニン・アミドヒドロラーゼの製造方法
を開発し、本発明を完或するに至った。
すなわち、本発明は、
(1) タレアヂニン・アごトヒドロラーゼをコード
する遺伝子を有するDNA断片。
する遺伝子を有するDNA断片。
(2) タレアチニン・ア貴トヒドロラーゼをコード
する遺伝子が、シュードモナス属に属する微生物由来の
ものである(1)記載のDNA断片。
する遺伝子が、シュードモナス属に属する微生物由来の
ものである(1)記載のDNA断片。
(3)以下のアミノ酸配列をコードするDNA配列を有
する(1)又は(2)記載のDNA断片。
する(1)又は(2)記載のDNA断片。
Met Ser Lys Ser Val
Phe Val Gly Glu LeuTh
r Trp Lys Glu Tyr Glu
^la Arg Val Ala八Ia Gl
y Asp CysGly Ala Leu G
1u Cys Met Asn νa1八Ia Va
l Cys LysGly Aha Leu
Val Gly Tyr Lys Ser Gly Asn tlis Phe八sp Ti
e Ile Arg八Ia Arg Arg
LeuTyr Glu Asn Ser 11e Asp Leu Ala Ala Gly Jle GIn Leu Ser Tyr Trp Ala Val lie GlnVal Ph
e Glu ThrTyr Pro Asp Le
u Val 八sp tlis ProTyr A
sp Val PheVal Leu GIn tlis Asp Val 八rg Val Met Pro Gln Gln Pro Gay Met Leu Pro ValGly lli
s }lis Met Leu Leu Pro ThrAla Glu
Arg Ile Gay Leu Gin Tyr [.ys Ser Gly Gly Thr Thr Ser LeuGlu Le
u Ala Arg Val Leu Met AsnMet Ph
e Ice VaILeu Arg Glu
Leu Asp Phe Lys νaI Asp Phe Val I.ys Gln Leu Tyr Pro tlis Gly Gly His Glu Gly Arg Tyr Val νal Asp Pro Glu Gly Ser Leu Met LeuVal 八s
p Leu AspPro Ala Thr
PhePro Val ^sp Pro Ala Leu Arg νal Pro Pro 八Ia Arg Thr Pro Ala Pro Gly Thr L
eu Ser Ser AlaLys Thr Ala
Ser Arg Glu Lys Gly Glu
Leurle Leu Glu Val Cys
Val Gln Gly Ile AlaAsp
Ala Tle Arg Glu Glu P
he Pro Pro Thr(4)以下のDNA配列
を有する請求項2記載のDNA断片。
Phe Val Gly Glu LeuTh
r Trp Lys Glu Tyr Glu
^la Arg Val Ala八Ia Gl
y Asp CysGly Ala Leu G
1u Cys Met Asn νa1八Ia Va
l Cys LysGly Aha Leu
Val Gly Tyr Lys Ser Gly Asn tlis Phe八sp Ti
e Ile Arg八Ia Arg Arg
LeuTyr Glu Asn Ser 11e Asp Leu Ala Ala Gly Jle GIn Leu Ser Tyr Trp Ala Val lie GlnVal Ph
e Glu ThrTyr Pro Asp Le
u Val 八sp tlis ProTyr A
sp Val PheVal Leu GIn tlis Asp Val 八rg Val Met Pro Gln Gln Pro Gay Met Leu Pro ValGly lli
s }lis Met Leu Leu Pro ThrAla Glu
Arg Ile Gay Leu Gin Tyr [.ys Ser Gly Gly Thr Thr Ser LeuGlu Le
u Ala Arg Val Leu Met AsnMet Ph
e Ice VaILeu Arg Glu
Leu Asp Phe Lys νaI Asp Phe Val I.ys Gln Leu Tyr Pro tlis Gly Gly His Glu Gly Arg Tyr Val νal Asp Pro Glu Gly Ser Leu Met LeuVal 八s
p Leu AspPro Ala Thr
PhePro Val ^sp Pro Ala Leu Arg νal Pro Pro 八Ia Arg Thr Pro Ala Pro Gly Thr L
eu Ser Ser AlaLys Thr Ala
Ser Arg Glu Lys Gly Glu
Leurle Leu Glu Val Cys
Val Gln Gly Ile AlaAsp
Ala Tle Arg Glu Glu P
he Pro Pro Thr(4)以下のDNA配列
を有する請求項2記載のDNA断片。
GGCAATCACT TCCCCGGC,AC
CACCAGCCTG GATGGCGCCACCC
TGACTGG CACGGTGCAG GACA
TCATCC GCGAGCTGGCGCGCCATG
GT GCGCGT(:GCC TGGTACTG
AT GAACGGCCACTACG八八八八TT
CCATGTTCAT CGTCGAAGGC
ATCGACCTCGGGGACATCGA GCA
CGGCGGC GTCTTCGAGA CCTC
CCTGATATCCTGGAGG TCTGCGT
CCA G(;GCATTGCC GACGCTA
TCCGCGAGGAGTT CCCGCCCACC
TGA(5) (1)〜(4)いずれか記載のD
NA断片を有する組換えヘクター。
CACCAGCCTG GATGGCGCCACCC
TGACTGG CACGGTGCAG GACA
TCATCC GCGAGCTGGCGCGCCATG
GT GCGCGT(:GCC TGGTACTG
AT GAACGGCCACTACG八八八八TT
CCATGTTCAT CGTCGAAGGC
ATCGACCTCGGGGACATCGA GCA
CGGCGGC GTCTTCGAGA CCTC
CCTGATATCCTGGAGG TCTGCGT
CCA G(;GCATTGCC GACGCTA
TCCGCGAGGAGTT CCCGCCCACC
TGA(5) (1)〜(4)いずれか記載のD
NA断片を有する組換えヘクター。
(6) (5)記載の組換えベクターを有する形質転
換体。
換体。
(7) (6)記載の形質転換体を培地に培養し、タ
レアチニン・アミドヒドロラーゼを蓄積せしめ、該タレ
アチニン・アミドヒドロラーゼを採取することを特徴と
するクレアチニン・アミト゛ヒ1′ロラーゼの製造法。
レアチニン・アミドヒドロラーゼを蓄積せしめ、該タレ
アチニン・アミドヒドロラーゼを採取することを特徴と
するクレアチニン・アミト゛ヒ1′ロラーゼの製造法。
に関するものである。
尚、上記のタレアチニン・アミドヒドロラーゼ遺伝子を
含有するDNA断片については、よく知られているよう
に、多くのアミノ酸についてはそれをコードする遺伝子
のDNA配列は複数存在する。その塩基配列は一義的に
は決まらず多数の可10 能性があり得る。本発明者等により明らかにされたタレ
アチニン・アミトヒトロラーゼのアξノ酸配列をコート
する遺伝子の場合も、そのDNA配列は天然の遺伝子の
塩基配列以外にも多数の可能性があり、本発明のDNA
配列は、天然のDNA配列のみに限定されるものではな
く、本発明により明らかにされたタレアチニン・アミド
ヒドロラーゼのアミノ酸配列をコードする他のDNA配
列も含むものである。さらに遺伝子組換え技術によれば
、基本となるDNAの特定部位に、該DNAがコー1・
するものの基本的な特性を変化させることなく、あるい
はその特性を改善するように、人為的に変異を起すこと
ができる。本発明により提供される、天然の塩基配列を
有するDNAあるいは天然のものとは異なる塩基配列を
有するDNA6こ関しても同様に人為的に挿入、欠失、
置換を行うことにより天然の遺伝子を同等あるいは改善
された特性とすることが可能であり、本発明はそのよう
な変異遺伝子をも当然に含むものである。
含有するDNA断片については、よく知られているよう
に、多くのアミノ酸についてはそれをコードする遺伝子
のDNA配列は複数存在する。その塩基配列は一義的に
は決まらず多数の可10 能性があり得る。本発明者等により明らかにされたタレ
アチニン・アミトヒトロラーゼのアξノ酸配列をコート
する遺伝子の場合も、そのDNA配列は天然の遺伝子の
塩基配列以外にも多数の可能性があり、本発明のDNA
配列は、天然のDNA配列のみに限定されるものではな
く、本発明により明らかにされたタレアチニン・アミド
ヒドロラーゼのアミノ酸配列をコードする他のDNA配
列も含むものである。さらに遺伝子組換え技術によれば
、基本となるDNAの特定部位に、該DNAがコー1・
するものの基本的な特性を変化させることなく、あるい
はその特性を改善するように、人為的に変異を起すこと
ができる。本発明により提供される、天然の塩基配列を
有するDNAあるいは天然のものとは異なる塩基配列を
有するDNA6こ関しても同様に人為的に挿入、欠失、
置換を行うことにより天然の遺伝子を同等あるいは改善
された特性とすることが可能であり、本発明はそのよう
な変異遺伝子をも当然に含むものである。
以下本発明を実施するための各ステップについで詳細に
説明する。
説明する。
(a) タレアチニン・アごドヒI・ロラーゼをコー
lする遺伝子を有するDNA断片及び組換えヘクターの
調製 本発明に用いられる組換えベクターは、例えばエシェリ
ヒア属に属する微生物などの宿主微生物の培養された細
胞内での複製能を有するベククDNAに、タレアチニン
・アミ1゛ヒトロラーゼ生産能を有する微生物から調製
されたクレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする
遺伝子を有するDNA断片を組の込んでなるものである
。
lする遺伝子を有するDNA断片及び組換えヘクターの
調製 本発明に用いられる組換えベクターは、例えばエシェリ
ヒア属に属する微生物などの宿主微生物の培養された細
胞内での複製能を有するベククDNAに、タレアチニン
・アミ1゛ヒトロラーゼ生産能を有する微生物から調製
されたクレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする
遺伝子を有するDNA断片を組の込んでなるものである
。
好適な例としては、シュードモナス・プチダPS7株を
栄養培地で培養し、培養物を得る。この培養物を、例え
ば5, OOOrpm以上、好ましくは8.000〜]
0.000rpmで5分以上、好ましくは10〜15分
間遠心分離してシュードモナス・プチダPS−7株の菌
体を得る。
栄養培地で培養し、培養物を得る。この培養物を、例え
ば5, OOOrpm以上、好ましくは8.000〜]
0.000rpmで5分以上、好ましくは10〜15分
間遠心分離してシュードモナス・プチダPS−7株の菌
体を得る。
この菌体より、例えばRccombinant DNA
Techniques (Rodriguez R.
l..et al. Addison−WeSleyP
ublishing Company. 1983)記
載の方法あるいはl1 12 Koizumi J.らの方法(Biotech.Bi
oeng.,27, 721〜728. 1985)等
により染色体DNAを得ることができる。
Techniques (Rodriguez R.
l..et al. Addison−WeSleyP
ublishing Company. 1983)記
載の方法あるいはl1 12 Koizumi J.らの方法(Biotech.Bi
oeng.,27, 721〜728. 1985)等
により染色体DNAを得ることができる。
この染色体DNAに制限酵素、例えばEcoRI(東洋
紡製)を30゜C以上、好ましくは37”C、酵素1〜
100ユニットで30分以上、好ましくは1〜2時間作
用させて切断し、種々の大きさの染色体DNA断片混合
物を得る。
紡製)を30゜C以上、好ましくは37”C、酵素1〜
100ユニットで30分以上、好ましくは1〜2時間作
用させて切断し、種々の大きさの染色体DNA断片混合
物を得る。
このようにして得られたDNA断片混合物から、例えば
シヨ糖密度勾配遠心分離等により低分子量のDNA断片
(IKb以下)を除き、さらにエタノール沈澱法等の濃
縮手段により濃縮し、タレアチニン・アミドヒドロラー
ゼをコードする遺伝子を含有するDNA断片混合物を得
る。
シヨ糖密度勾配遠心分離等により低分子量のDNA断片
(IKb以下)を除き、さらにエタノール沈澱法等の濃
縮手段により濃縮し、タレアチニン・アミドヒドロラー
ゼをコードする遺伝子を含有するDNA断片混合物を得
る。
一方本発明に用いるベクターDNAとしては、如何なる
ものでもよく、例えばプラスミドヘクタDNA ハタ
テリオファージヘクターDNA等が挙げられるが、好適
な例としてはプラスミドヘククーpBR322, pU
c19(東洋紡製), バクテリオファージベクターλ
ZAP,EMBL3(STRATAGENE製)等が挙
げられる。
ものでもよく、例えばプラスミドヘクタDNA ハタ
テリオファージヘクターDNA等が挙げられるが、好適
な例としてはプラスミドヘククーpBR322, pU
c19(東洋紡製), バクテリオファージベクターλ
ZAP,EMBL3(STRATAGENE製)等が挙
げられる。
次に上記ヘクターDNAに」二記のようにして得たタレ
アチニン・アミトヒドロラーゼをコードする遺伝子を含
有するDNA断片混合物を連結する。
アチニン・アミトヒドロラーゼをコードする遺伝子を含
有するDNA断片混合物を連結する。
連結には例えば大腸菌D N A IJガーゼ,T,−
DNAリガーゼ(東洋紡製)など、好ましくはT4−D
NAリガーゼを4〜37“C1好ましくは4〜16゜C
で酵素1〜100ユニッ1・1時間以上、好ましくは4
〜16時間作用させ、組換えDNAを得る。
DNAリガーゼ(東洋紡製)など、好ましくはT4−D
NAリガーゼを4〜37“C1好ましくは4〜16゜C
で酵素1〜100ユニッ1・1時間以上、好ましくは4
〜16時間作用させ、組換えDNAを得る。
この組換えDNAを用いて、例えば[i.coli K
12、好ましくはE.coli JM]09株、E.c
oli IIBIOI株、E.coli XLI−bl
ue株(STRATAGENE製)などを形質転換ある
いは形質導入して、それぞれの菌体を得る。この形質転
換及び形質導入は、例えばMolecular Clo
ning(Maniatis T.et al.col
d Spring Harbor, 1982)記載の
方法により行なうことができる。
12、好ましくはE.coli JM]09株、E.c
oli IIBIOI株、E.coli XLI−bl
ue株(STRATAGENE製)などを形質転換ある
いは形質導入して、それぞれの菌体を得る。この形質転
換及び形質導入は、例えばMolecular Clo
ning(Maniatis T.et al.col
d Spring Harbor, 1982)記載の
方法により行なうことができる。
そして上記菌株よりタレアチニン・アミドヒドロラーゼ
生産能を有する菌株をスクリーニングすることにより、
タレアチニン・アミドヒドロラゼをコードする遺伝子を
含有する組換体DNAが13 14 得られる。さらに上記組換えDNA中のタレアチニン・
ア健I・ヒ1゛ロラーゼをコードする遺伝子を含イfず
るDNA断片を常法に従い小断片化して上記ブラスミl
・ヘクターDNAと連結し、タレアチニン・ア旦ドヒド
ロラーゼをコードする遺伝子を含有するDNA配列を有
する絹換えプラスミトを得ることができる。
生産能を有する菌株をスクリーニングすることにより、
タレアチニン・アミドヒドロラゼをコードする遺伝子を
含有する組換体DNAが13 14 得られる。さらに上記組換えDNA中のタレアチニン・
ア健I・ヒ1゛ロラーゼをコードする遺伝子を含イfず
るDNA断片を常法に従い小断片化して上記ブラスミl
・ヘクターDNAと連結し、タレアチニン・ア旦ドヒド
ロラーゼをコードする遺伝子を含有するDNA配列を有
する絹換えプラスミトを得ることができる。
(b) 形質転換体の調製
このようにして得られたクレアチニン・アミドヒドロラ
ーゼをコードする遺伝子を含有するDNA配列を有する
Mi換えプラスミドを前記の形質転換法により例えばエ
シェリヒア属、シュードモナス属、バヂルス属、に属す
る微生物に導入することにより、所望の遺伝形質とベク
ターDNAの形質を併せもつ形質転換体が得られる。
ーゼをコードする遺伝子を含有するDNA配列を有する
Mi換えプラスミドを前記の形質転換法により例えばエ
シェリヒア属、シュードモナス属、バヂルス属、に属す
る微生物に導入することにより、所望の遺伝形質とベク
ターDNAの形質を併せもつ形質転換体が得られる。
前記ユシェリヒア属に属する微生物としてはE.col
i J旧09 E.coli HBIOI, E.c
oli C600. [i.coliDl+−1等が挙
げられる。かくして得られた微生物の好適な例としては
、例えばE.coli JM109(pcNH521)
(FERM P−10748)がある。
i J旧09 E.coli HBIOI, E.c
oli C600. [i.coliDl+−1等が挙
げられる。かくして得られた微生物の好適な例としては
、例えばE.coli JM109(pcNH521)
(FERM P−10748)がある。
(C) クレアチニン・アミドヒドロラーゼの製造上
記で得られた形質転換体を培養するには、クレアチニン
・アミドヒドロラーゼの生産に適した培地であって且つ
宿主微生物の生育乙こ適した培地を用いる。
記で得られた形質転換体を培養するには、クレアチニン
・アミドヒドロラーゼの生産に適した培地であって且つ
宿主微生物の生育乙こ適した培地を用いる。
本発明を実施するに当っては、通常エシェリヒア属の生
育培地として用いられるL B培地(1・リプトン,酵
母エキス,食塩)、BPB培地(Dircoポリペプト
ン,酵母エキス,リン酸カリウム)、栄養・寒天培地(
1)ifco 0001)、1・リブ1・ン、食塩培地
等を基本培地として用いればよい。その他、必要に応し
て炭素源、窒素源の他にア多ノ酸、ビタミン等の栄養素
を添加してもよい。
育培地として用いられるL B培地(1・リプトン,酵
母エキス,食塩)、BPB培地(Dircoポリペプト
ン,酵母エキス,リン酸カリウム)、栄養・寒天培地(
1)ifco 0001)、1・リブ1・ン、食塩培地
等を基本培地として用いればよい。その他、必要に応し
て炭素源、窒素源の他にア多ノ酸、ビタミン等の栄養素
を添加してもよい。
培養方法は通常振盪培養あるいは通気撹拌培養で行なう
。培養温度は20〜45゜Cの範囲、好ましくは37゜
C付近、培養pHは5〜8の範囲、好ましくはpH7付
近に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用す
る菌株が生育すれば実施できる。
。培養温度は20〜45゜Cの範囲、好ましくは37゜
C付近、培養pHは5〜8の範囲、好ましくはpH7付
近に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用す
る菌株が生育すれば実施できる。
培養期間は1〜2日間で生育し、菌体内にタレアチニン
・アミドヒド℃コラーゼが生威蓄積される。
・アミドヒド℃コラーゼが生威蓄積される。
15
16
本酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いればよ
い。例えば、抽出法には超音波破砕、ガラスビーズを用
いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性剤など、
いずれを用いてもよい。
い。例えば、抽出法には超音波破砕、ガラスビーズを用
いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性剤など、
いずれを用いてもよい。
さらに抽出液については公知の硫安や芒硝などの塩析法
、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法
、プロタミンやボリエチレンイミンなどの凝集法さらに
はDEΔE(ジエチルア実ノエチル)セファロース (
ファルマシア製),CM(カルボキシメチル)セファロ
ース (ファルマシア製)などのイオン交換クロマト法
および七フアクリルS−300(ファルマシア製)など
のゲル濾過法などにより精製することができる。
、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法
、プロタミンやボリエチレンイミンなどの凝集法さらに
はDEΔE(ジエチルア実ノエチル)セファロース (
ファルマシア製),CM(カルボキシメチル)セファロ
ース (ファルマシア製)などのイオン交換クロマト法
および七フアクリルS−300(ファルマシア製)など
のゲル濾過法などにより精製することができる。
上記精製手段により得られる精製タレアチニン・アミド
ヒドロラーゼの理化学的性質はDNA供与株、例えばシ
ュードモナス・プチダPS−7株の生産するクレアチニ
ン・アジドヒドロラーゼの理化学的性質と全く同様であ
る。
ヒドロラーゼの理化学的性質はDNA供与株、例えばシ
ュードモナス・プチダPS−7株の生産するクレアチニ
ン・アジドヒドロラーゼの理化学的性質と全く同様であ
る。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
(1) シュードモナス・プチダPS−7株の染色体
DNAの調製 シュートモナス・プチダPS−7株を栄養培地(ボリペ
プトン2.0%、酵母エキス04%、麦芽エキス0.1
%、リン酸1カリウム0.3%、リン酸2カリウム1.
4%、硫酸マグネシウム0.Ol%、グルコース2.0
%)100mA+に接種し、30゜Cで8時間振盪培養
して培養液を得た。この培養物を12, OOOrpm
10分間遠心分離して湿菌体約1gを得た後、該菌体か
らRecombinant DNA Techniqu
es(RodriguezR.L.et al.Add
ison−Wesley PublishingCom
pany+1983)記載の方法により染色体DNA約
1.8mgを調製した。次にこの染色体DNAIOOμ
gを制限酵素EcoRT(東洋紡製)50ユニットで3
7゜C、3時間切断した。切断後5〜20%シヨ糖密度
勾配遠心分離を行なって1〜10Kb画分のDNA断片
約10μgを言周製した。
DNAの調製 シュートモナス・プチダPS−7株を栄養培地(ボリペ
プトン2.0%、酵母エキス04%、麦芽エキス0.1
%、リン酸1カリウム0.3%、リン酸2カリウム1.
4%、硫酸マグネシウム0.Ol%、グルコース2.0
%)100mA+に接種し、30゜Cで8時間振盪培養
して培養液を得た。この培養物を12, OOOrpm
10分間遠心分離して湿菌体約1gを得た後、該菌体か
らRecombinant DNA Techniqu
es(RodriguezR.L.et al.Add
ison−Wesley PublishingCom
pany+1983)記載の方法により染色体DNA約
1.8mgを調製した。次にこの染色体DNAIOOμ
gを制限酵素EcoRT(東洋紡製)50ユニットで3
7゜C、3時間切断した。切断後5〜20%シヨ糖密度
勾配遠心分離を行なって1〜10Kb画分のDNA断片
約10μgを言周製した。
(2) タレアチニン・アミドヒドロラーゼをコー1
する遺伝子を含有するDNA断片及び該DN17 18 A断片を有する組換えヘクターの調製 ハタテリオファージヘクターλZAP (EcoRI切
断済、STRATAGENE製)lμgと上記(])で
得られたEcoRIで切断した染色体DNA0.5μg
をT4−DNAリガーゼ(東洋紡製)■ユニットで■6
゜C、12時間反応させDNAを連結した。連結したD
NAはλDNAインビト口パンケージングキットGig
apackGold (STRATAGENE製)を用
いてパソケージングした。パッケージングにより得られ
た組換えファジはMolecular Cloning
(Maniatis T.et al.coldSpr
ing llarbor, 1982)記載の方法でE
.coli XLIblue (STRATAGENE
製) (Nucleic Acid Research
Vol.16 No.15 7583 〜7600、1
98B)に形質導入した。使用DNAIμg当り約IX
IO’個のファージプラークが得られた。
する遺伝子を含有するDNA断片及び該DN17 18 A断片を有する組換えヘクターの調製 ハタテリオファージヘクターλZAP (EcoRI切
断済、STRATAGENE製)lμgと上記(])で
得られたEcoRIで切断した染色体DNA0.5μg
をT4−DNAリガーゼ(東洋紡製)■ユニットで■6
゜C、12時間反応させDNAを連結した。連結したD
NAはλDNAインビト口パンケージングキットGig
apackGold (STRATAGENE製)を用
いてパソケージングした。パッケージングにより得られ
た組換えファジはMolecular Cloning
(Maniatis T.et al.coldSpr
ing llarbor, 1982)記載の方法でE
.coli XLIblue (STRATAGENE
製) (Nucleic Acid Research
Vol.16 No.15 7583 〜7600、1
98B)に形質導入した。使用DNAIμg当り約IX
IO’個のファージプラークが得られた。
タレアチニン・アミトヒドロラーゼをコードする遺伝子
を含有するDNAを有する組換えファージ検索は、酵素
免疫テストにより行なった。酵素免疫テストは、Gen
e Expression(ヘーリンガーマイハイム製
)を用いて行なった。本酵素免疫テス1・は、タレアヂ
ニン・アミドヒドロラーゼ約100pgの検出限界を示
し、上記ファージプラーク1000個あたり1〜2個の
陽性信号が得られた。
を含有するDNAを有する組換えファージ検索は、酵素
免疫テストにより行なった。酵素免疫テストは、Gen
e Expression(ヘーリンガーマイハイム製
)を用いて行なった。本酵素免疫テス1・は、タレアヂ
ニン・アミドヒドロラーゼ約100pgの検出限界を示
し、上記ファージプラーク1000個あたり1〜2個の
陽性信号が得られた。
酵素免疫テストで陽性のプラーク3個よりSTRATA
GENE製λZAP使用マニュアルの指示に従い組換え
プラスミドを切り出した。得られた3種の組換えプラス
sトをEcoRIで切断ずると、異なったハンドの他に
3種の組換えプラスご]に共通な4.2KbのDNA断
片が見い出された。この4.2 KbのEcoRI断片
約2μgから^pa+(東洋紡製)を用いて2.5Kb
のApaI−[icoRI断片を切断した。生したDN
A断片は、低融点アガロースゲル中でその大きさに応し
て分離され、2.5KbのApal−EcoRI断片が
単離された。
GENE製λZAP使用マニュアルの指示に従い組換え
プラスミドを切り出した。得られた3種の組換えプラス
sトをEcoRIで切断ずると、異なったハンドの他に
3種の組換えプラスご]に共通な4.2KbのDNA断
片が見い出された。この4.2 KbのEcoRI断片
約2μgから^pa+(東洋紡製)を用いて2.5Kb
のApaI−[icoRI断片を切断した。生したDN
A断片は、低融点アガロースゲル中でその大きさに応し
て分離され、2.5KbのApal−EcoRI断片が
単離された。
低融点アガロースからのDNA断片の単紬はStryh
l K.の方法(Struhl K.,Biotect
+niques, 3452. 1985)により行な
った。他のすべてのDNA断片の単離もこの方法で行な
った。
l K.の方法(Struhl K.,Biotect
+niques, 3452. 1985)により行な
った。他のすべてのDNA断片の単離もこの方法で行な
った。
プラスもFヘクターBluescript KS(旧3
−) (STRATAG[!N製)約1.llBを八p
aI及びEcoRIで切断して19 20 開環し、これに前記調製した2.5Kbの八pal−E
coRl断片約0.5μgを混合し、T4−DNAリガ
ーゼ1ユニソトで16゜C、12時間反応させてDNA
を連結させ組換え体プラス旦ドpCNH 2を得た。こ
の2.5KbのApal−EcoRI断片は種々の制限
酵素により特徴付けられた(第2図参照)。
−) (STRATAG[!N製)約1.llBを八p
aI及びEcoRIで切断して19 20 開環し、これに前記調製した2.5Kbの八pal−E
coRl断片約0.5μgを混合し、T4−DNAリガ
ーゼ1ユニソトで16゜C、12時間反応させてDNA
を連結させ組換え体プラス旦ドpCNH 2を得た。こ
の2.5KbのApal−EcoRI断片は種々の制限
酵素により特徴付けられた(第2図参照)。
次に上記2.5KbのApal−EcoRI断片約2/
l/gをAccl(東洋紡製)0.5ユニントで37゜
C、1時間制限的に反応させ、1.5KbのAccl−
EcoRI断片を切断し、上記Struhl K.の方
法によりI. 5 KbのAccl−EcoRI断片を
単離した。またプラスミトヘクターpUc19(東洋紡
製)約1μgをAccI及びEcoR I断片で切断し
て開環し、これに前記調製した1.5KbのAccl−
EcoRI断片約0.5μgを混合し、T4−DNAリ
ガーゼ1ユニソトで16゜C、12時間反応させてDN
Aを連結させ、組換えプラスミドpcNI+521を得
た(第2図参照)。pcNH521は大腸菌中でランク
プロモーター(Lac Promoter)の制御下、
生物学的活性のタレアチニン・アミドヒドロラーゼをコ
ードする。
l/gをAccl(東洋紡製)0.5ユニントで37゜
C、1時間制限的に反応させ、1.5KbのAccl−
EcoRI断片を切断し、上記Struhl K.の方
法によりI. 5 KbのAccl−EcoRI断片を
単離した。またプラスミトヘクターpUc19(東洋紡
製)約1μgをAccI及びEcoR I断片で切断し
て開環し、これに前記調製した1.5KbのAccl−
EcoRI断片約0.5μgを混合し、T4−DNAリ
ガーゼ1ユニソトで16゜C、12時間反応させてDN
Aを連結させ、組換えプラスミドpcNI+521を得
た(第2図参照)。pcNH521は大腸菌中でランク
プロモーター(Lac Promoter)の制御下、
生物学的活性のタレアチニン・アミドヒドロラーゼをコ
ードする。
一方1.5Kbの八ccT−EcoRI断片を各種制限
酵素で切断してM13mpl8あるいはmpl9ファー
ジDNA(東洋紡製)に連結した後常法に従い一木鎮D
NAを調製した。得られた一本鎖DNAについて、Ml
3シークエンシングキット (旧3 Sequenci
ngKit東洋紡製)を用いて、塩基配列の決定を行な
った。
酵素で切断してM13mpl8あるいはmpl9ファー
ジDNA(東洋紡製)に連結した後常法に従い一木鎮D
NAを調製した。得られた一本鎖DNAについて、Ml
3シークエンシングキット (旧3 Sequenci
ngKit東洋紡製)を用いて、塩基配列の決定を行な
った。
決定した塩基配列及びア≧ノ酸配列を第1図に示した。
(3) タレアチニン・ア旦ドヒドロラーゼをコー1
〜するDNAを含む組換えプラスミトを含有する形質転
換体の調製 上記クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺
伝子を含有するDNA配列を有する組換えプラス砦ドで
あるpcNII521を用い前記MolecularC
loning(Maniatis T.et al.c
old Spring llarbor,1982)記
載の方法によりE.coli J旧09;(東洋紡製)
(Gene,Vo1.33(1985) 103〜I
19)を形質転換してE.coli JM109(pc
NII521)(FERM P−10748)を調製し
た。本形質転換体はラックプロモーターの誘導物質であ
るIPTC;(イソプロビル−β−Dチオガラクトピラ
ノシド)(ナカライ・テスク製)21 22 存在下、菌体内可溶性タンパク質の約40%までタレア
チニン・アミドヒドロラーゼを生産していた。
〜するDNAを含む組換えプラスミトを含有する形質転
換体の調製 上記クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺
伝子を含有するDNA配列を有する組換えプラス砦ドで
あるpcNII521を用い前記MolecularC
loning(Maniatis T.et al.c
old Spring llarbor,1982)記
載の方法によりE.coli J旧09;(東洋紡製)
(Gene,Vo1.33(1985) 103〜I
19)を形質転換してE.coli JM109(pc
NII521)(FERM P−10748)を調製し
た。本形質転換体はラックプロモーターの誘導物質であ
るIPTC;(イソプロビル−β−Dチオガラクトピラ
ノシド)(ナカライ・テスク製)21 22 存在下、菌体内可溶性タンパク質の約40%までタレア
チニン・アミドヒドロラーゼを生産していた。
次に各菌株によるタレアチニン・アξドヒドロラーゼの
生産性について、以下の第1表に示す。
生産性について、以下の第1表に示す。
なお、第1表中、E.coli JM109(pcNl
l2)は、上記(2)で得られた2.5KbのApa1
4coRI断片を含む組換え体ブラスミトp C N
112でE.coli Jl’ll09を形質転換する
ことにより得られた形質転換体である。
l2)は、上記(2)で得られた2.5KbのApa1
4coRI断片を含む組換え体ブラスミトp C N
112でE.coli Jl’ll09を形質転換する
ことにより得られた形質転換体である。
タレアチニン・アミドヒドロラーゼの活性測定は0.1
Nクレアチン溶液0. 9 mQ.に酵素液0. 1
mlを加え、37゜CでIO分間反応の後Jaffe反
応(CIin.Chem. 1, 55. 1953)
によりタレアチニンの生威量を測定した。酵素活性は3
7゜Cで1分間に1マイクロモルのクレアチニンを生戒
ずる酵素力価を1ユニントとした。また培養はシュー1
′モナス・ブチダPS−7株は前記八mino Aci
d;Nucleic Acid第35巻37 〜46.
1977記載の方法、E.coliはI、■培地(ト
ノプトン1%、酵母エキス0.5%、食塩1%、アンピ
シリンSoμg/m9., pH7.4)にI PT
Gを0.2mM添加あるいは無添加で37゜C、16時
間培養しで菌体内酵素活性を測定した。
Nクレアチン溶液0. 9 mQ.に酵素液0. 1
mlを加え、37゜CでIO分間反応の後Jaffe反
応(CIin.Chem. 1, 55. 1953)
によりタレアチニンの生威量を測定した。酵素活性は3
7゜Cで1分間に1マイクロモルのクレアチニンを生戒
ずる酵素力価を1ユニントとした。また培養はシュー1
′モナス・ブチダPS−7株は前記八mino Aci
d;Nucleic Acid第35巻37 〜46.
1977記載の方法、E.coliはI、■培地(ト
ノプトン1%、酵母エキス0.5%、食塩1%、アンピ
シリンSoμg/m9., pH7.4)にI PT
Gを0.2mM添加あるいは無添加で37゜C、16時
間培養しで菌体内酵素活性を測定した。
上記データよりE.coli JM109(pcNII
521)においてタレアチニン・アミドヒドロラーゼは
、タレアチニンの誘導なしにランクプロモーターの制御
下高生産されていることが明らかである。
521)においてタレアチニン・アミドヒドロラーゼは
、タレアチニンの誘導なしにランクプロモーターの制御
下高生産されていることが明らかである。
(4) E.coli JM109(pcNII52
1)によるクレアチニン・アミドヒドロラーゼの生産及
び該酵素の精製 前記のL B培地(トリプトン1%、酵母エキス0.5
%、食塩1%、pH7.4)61を1042−ジャーフ
ァメンターに分注し、121゜C、15分間オートク2
3 24 レーブを行い放冷後、50mg/dアンピシリン(ナカ
ライ・テスク製)+ 200mM IPTGを無菌
的に6 ml添加した。この培地に上記と同一組成の培
地で予め37゜Cで16時間振盪培養したE.colt
JM109(pcN11521)の培養液60m{を
接種し、37゜Cで16時間通気攪拌培養した。培養終
了後のタレアチニン・アミドヒドロラーゼ活性ば15.
7U/mp.であった。培養液6lを遠心分離にて集菌
し、50mM K− ’Jン酸緩jIj?ffl pH
7,5+ 200mffiに懸濁し、常法により超音波
破砕した後、15,000rpmで20分間遠心分離し
てタレアチニン・アξドヒドロラーゼの粗酵素液を得た
。
1)によるクレアチニン・アミドヒドロラーゼの生産及
び該酵素の精製 前記のL B培地(トリプトン1%、酵母エキス0.5
%、食塩1%、pH7.4)61を1042−ジャーフ
ァメンターに分注し、121゜C、15分間オートク2
3 24 レーブを行い放冷後、50mg/dアンピシリン(ナカ
ライ・テスク製)+ 200mM IPTGを無菌
的に6 ml添加した。この培地に上記と同一組成の培
地で予め37゜Cで16時間振盪培養したE.colt
JM109(pcN11521)の培養液60m{を
接種し、37゜Cで16時間通気攪拌培養した。培養終
了後のタレアチニン・アミドヒドロラーゼ活性ば15.
7U/mp.であった。培養液6lを遠心分離にて集菌
し、50mM K− ’Jン酸緩jIj?ffl pH
7,5+ 200mffiに懸濁し、常法により超音波
破砕した後、15,000rpmで20分間遠心分離し
てタレアチニン・アξドヒドロラーゼの粗酵素液を得た
。
このようにして得た粗酵素液にポリエチレンイミンを用
いて除核酸処理を施した後、硫酸アンモニウムを用いた
塩析分画を行なった。塩析沈澱物を50雌の50mM
K−リン酸緩衝液、pH7.5に溶解し、50mM K
−リン酸緩衝液、pH7.5にて平衡化したDEAE−
セファロース (ファノレマシア製)カラムクロマ1・
グラフィーに供し、0〜0,5Mの食塩濃度勾配}岩出
l去により0. 1〜0.3Mの食塩濃度範囲でタレア
チニン・アs Fヒドロラーゼ活性画分を得た。このク
レアチニン・アミドヒトロラーゼ活性画分を限外濾過機
にて濃縮した後、50mM Kリン酸緩衝液、pH7.
5で平衡化したセファデックスG−25(ファルマシア
製)にてゲル濾過した。
いて除核酸処理を施した後、硫酸アンモニウムを用いた
塩析分画を行なった。塩析沈澱物を50雌の50mM
K−リン酸緩衝液、pH7.5に溶解し、50mM K
−リン酸緩衝液、pH7.5にて平衡化したDEAE−
セファロース (ファノレマシア製)カラムクロマ1・
グラフィーに供し、0〜0,5Mの食塩濃度勾配}岩出
l去により0. 1〜0.3Mの食塩濃度範囲でタレア
チニン・アs Fヒドロラーゼ活性画分を得た。このク
レアチニン・アミドヒトロラーゼ活性画分を限外濾過機
にて濃縮した後、50mM Kリン酸緩衝液、pH7.
5で平衡化したセファデックスG−25(ファルマシア
製)にてゲル濾過した。
最終的に常法に従い凍結乾燥することにより、純化され
たタレアチニン・アくドヒドロラーゼ粉末49000ユ
ニントを得た。収率は52%であった。
たタレアチニン・アくドヒドロラーゼ粉末49000ユ
ニントを得た。収率は52%であった。
得られた酵素のpH活性を第3図、至適温度を第4図、
pH安定性を第5図及び熱安定性を第6図に示す。これ
らクレアチニン・ア業ドヒトロラーゼの理化学的性質は
DNA供与体であるシュードモナス・ブチダPS−7株
の生産するタレアチニン・アミドヒドロラーゼの理化学
的性質と全く同じであった。
pH安定性を第5図及び熱安定性を第6図に示す。これ
らクレアチニン・ア業ドヒトロラーゼの理化学的性質は
DNA供与体であるシュードモナス・ブチダPS−7株
の生産するタレアチニン・アミドヒドロラーゼの理化学
的性質と全く同じであった。
本発明の形質転換体は、クレアチン、タレアチニン等の
高価な物質を培地に添加する必要なしに極めて優れたク
レアチニン・アξドヒドロラーゼ生産性を示し、本発明
により効率的、経済的にク25 26 レアヂニン・アミドヒトロラーゼを生産することが可能
となった。
高価な物質を培地に添加する必要なしに極めて優れたク
レアチニン・アξドヒドロラーゼ生産性を示し、本発明
により効率的、経済的にク25 26 レアヂニン・アミドヒトロラーゼを生産することが可能
となった。
第1図はシュードモナス・プチダPS−7株のタレアチ
ニン・ア呉ドヒドロラーゼをコートする遺伝子のDNA
配列及び対応ずるア旦ノ酸配列を示す。 第2図はシュードモナス・プチダPS−7株からの1.
5KbDNA断片及びプラスミドpllc19よりのp
CNII521構造経過を示す。 第3図は実施例1のタレアチニン・アミドヒドロラーゼ
のpH活性を示す。図中p H 5. 5は50mM酢
酸緩衝液、pH 6. 0 〜8. 0は50mM K
−リン酸緩衝液、pH 8. 5 〜9. 0は50m
M炭酸緩衝液を用いて行なった。 第4図は実施例1のクレアチニン・アミドヒドロラーゼ
の至適温度を示す。 第5図は実施例1のタレアチニン・ア実ドヒドロラーゼ
のpH安定性を示す。図中p I−1 6. 0〜8.
0は50mM K−リン酸緩衝液、 pH 8. 5
〜9. 0は50IIIM炭酸緩衝液を用いて行なった
。 第6図は実施例1のタレアチニン・アミドヒドロラーゼ
の熱安定性を示す。
ニン・ア呉ドヒドロラーゼをコートする遺伝子のDNA
配列及び対応ずるア旦ノ酸配列を示す。 第2図はシュードモナス・プチダPS−7株からの1.
5KbDNA断片及びプラスミドpllc19よりのp
CNII521構造経過を示す。 第3図は実施例1のタレアチニン・アミドヒドロラーゼ
のpH活性を示す。図中p H 5. 5は50mM酢
酸緩衝液、pH 6. 0 〜8. 0は50mM K
−リン酸緩衝液、pH 8. 5 〜9. 0は50m
M炭酸緩衝液を用いて行なった。 第4図は実施例1のクレアチニン・アミドヒドロラーゼ
の至適温度を示す。 第5図は実施例1のタレアチニン・ア実ドヒドロラーゼ
のpH安定性を示す。図中p I−1 6. 0〜8.
0は50mM K−リン酸緩衝液、 pH 8. 5
〜9. 0は50IIIM炭酸緩衝液を用いて行なった
。 第6図は実施例1のタレアチニン・アミドヒドロラーゼ
の熱安定性を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺
伝子を有するDNA断片。 2、クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺
伝子が、シュードモナス属に属する微生物由来のもので
ある請求項1記載のDNA断片。 3、以下のアミノ酸配列をコードするDNA配列を有す
る請求項1又は2記載のDNA断片。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ 4、以下のDNA配列を有する請求項2記載のDNA断
片。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ 5、請求項1〜4いずれかの項記載のDNA断片を有す
る組換えベクター。 6、請求項5記載の組換えベクターを有する形質転換体
。 7、請求項6記載の形質転換体を培地に培養し、クレア
チニン・アミドヒドロラーゼを蓄積せしめ、該クレアチ
ニン・アミドヒドロラーゼを採取することを特徴とする
クレアチニン・アミドヒドロラーゼの製造法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1152182A JP2527035B2 (ja) | 1989-06-16 | 1989-06-16 | クレアチニン・アミドヒドロラ―ゼをコ―ドする遺伝子を含有するdna断片、該dna断片を有する組換えベクタ―及び該組換えベクタ―を有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラ―ゼの製造方法 |
DE69018130T DE69018130T2 (de) | 1989-06-16 | 1990-06-14 | DNA-Fragment, das ein für Kreatininamidohydrolase kodierendes Gen enthält. |
EP90111266A EP0402929B1 (en) | 1989-06-16 | 1990-06-14 | A dna fragment containing a gene encoding creatinine amidohydrolase |
US07/908,620 US5627065A (en) | 1989-06-16 | 1992-06-29 | DNA fragment containing a gene encoding creatinine amidohydrolase |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1152182A JP2527035B2 (ja) | 1989-06-16 | 1989-06-16 | クレアチニン・アミドヒドロラ―ゼをコ―ドする遺伝子を含有するdna断片、該dna断片を有する組換えベクタ―及び該組換えベクタ―を有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラ―ゼの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0319690A true JPH0319690A (ja) | 1991-01-28 |
JP2527035B2 JP2527035B2 (ja) | 1996-08-21 |
Family
ID=15534848
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1152182A Expired - Fee Related JP2527035B2 (ja) | 1989-06-16 | 1989-06-16 | クレアチニン・アミドヒドロラ―ゼをコ―ドする遺伝子を含有するdna断片、該dna断片を有する組換えベクタ―及び該組換えベクタ―を有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラ―ゼの製造方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5627065A (ja) |
EP (1) | EP0402929B1 (ja) |
JP (1) | JP2527035B2 (ja) |
DE (1) | DE69018130T2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007125824A1 (ja) * | 2006-04-25 | 2007-11-08 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 基質との親和性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体、および、クレアチニン測定用試薬組成物 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7198785B2 (en) * | 2003-12-09 | 2007-04-03 | Brown University | Systems and methods related to degradation of uremic toxins |
JP5130480B2 (ja) * | 2007-09-27 | 2013-01-30 | 東洋紡株式会社 | キレート剤耐性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体 |
WO2009041409A1 (ja) | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | クレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体 |
JP5130479B2 (ja) * | 2007-09-27 | 2013-01-30 | 東洋紡株式会社 | クレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を向上させる方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2122298C3 (de) * | 1971-05-05 | 1979-02-22 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase |
DE2122255C3 (de) * | 1971-05-05 | 1987-01-22 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Creatinin |
US4652639A (en) * | 1982-05-06 | 1987-03-24 | Amgen | Manufacture and expression of structural genes |
DE3500184A1 (de) * | 1985-01-04 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Mikroorganismus und plasmid fuer konstitutive creatinamidinohydrolase-bildung sowie verfahren zur herstellung derselben |
JPS6437292A (en) * | 1987-08-04 | 1989-02-07 | Toyo Jozo Kk | Dna having genetic information of creatinase and use thereof |
-
1989
- 1989-06-16 JP JP1152182A patent/JP2527035B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-06-14 EP EP90111266A patent/EP0402929B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-14 DE DE69018130T patent/DE69018130T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-06-29 US US07/908,620 patent/US5627065A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J BIOCHEM=1979 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007125824A1 (ja) * | 2006-04-25 | 2007-11-08 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 基質との親和性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体、および、クレアチニン測定用試薬組成物 |
US7816116B2 (en) | 2006-04-25 | 2010-10-19 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Modified creatinine amide hydrolase having improved affinity for substrate, and reagent composition for determination of creatinine |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0402929B1 (en) | 1995-03-29 |
DE69018130D1 (de) | 1995-05-04 |
US5627065A (en) | 1997-05-06 |
EP0402929A1 (en) | 1990-12-19 |
JP2527035B2 (ja) | 1996-08-21 |
DE69018130T2 (de) | 1995-09-14 |
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