JP4815219B2 - 好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素遺伝子を含有するｄｎａ、組み換え体ｄｎａ、および好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素の製造法 - Google Patents

Description

本発明は、環状イソマルトオリゴ糖、サイクロデキストランを生産する酵素である好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素をコードする遺伝子、および好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素の製造方法に関する。

従来、サイクロデキストラン合成酵素遺伝子はバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のＴ−３０４０（特許文献１）およびバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のＵ−１５５（特許文献２）の２種類のみが報告されている。
Ｔ−３０４０株およびＵ−１５５株のサイクロデキストラン合成酵素は、グルコース７分子がα−１，６結合でつながった環状オリゴ糖ＣＩ−７、グルコース８分子がα−１，６結合でつながった環状オリゴ糖ＣＩ−８、グルコース９分子がα−１，６結合でつながった環状オリゴ糖ＣＩ−９等の比較的低分子のサイクロデキストランを生産するが、ＣＩ−１０以上の高分子サイクロデキストランを合成するという報告はない。
また、至適ｐＨは、Ｔ−３０４０酵素は５．５（特許文献１）、Ｕ−１５５酵素は６．０（特許文献２）といずれも酸性側で、Ｔ−３０４０酵素は６０℃、１５分の加熱で完全に失活し、カルシウムを添加した場合は安定化するが、６５℃、１５分の加熱で完全に失活する（非特許文献１）。また、Ｕ−１５５酵素は６０℃、１５分の加熱で完全に失活する（特許文献３）。アルカリ側で高い活性を示す酵素、６５℃よりも高温で加熱しても活性を有する酵素および該酵素をコードする遺伝子に関してはこれまでに得られていない。また、高分子サイクロデキストランを生産する酵素をコードする遺伝子もこれまで得られていない。

特許第３４２９５６９号明細書（特開平８−６６１９１号公報） 特許第３４８７７１１号明細書（特開平９−２３４０７３号公報） 特開２００５−１９２５１０号公報 Hiroshi Kawamoto, Tetsuya Oguma, Hiroshi Sekine, and Mikihiko Kobayashi, Immmobilization of cycloisomaltooligosaccharide glucanotransferase for the production of cycloisomaltooligosaccharides from dextran, Enzyme and Microbial Technology 28, 515-521 (2001)

本発明は、環状イソマルトオリゴ糖であるＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９だけでなく、ＣＩ−１０、およびこれより高分子のサイクロデキストランを作ることができるサイクロデキストラン合成酵素の提供を目的とする。
本発明に係るサイクロデキストラン合成酵素は、従来の酵素よりも比活性が高く、サイクロデキストランを効率よく生産することが期待できる。また、従来よりも高いｐＨで作用し、至適温度も高く、耐熱性も優れているので、汚染の心配が少ない条件で、迅速に、かつ効率的にサイクロデキストランを生産することができる。
さらに、本発明は係る酵素を生産するため、コードする酵素遺伝子の分離を行い、本酵素を本酵素遺伝子の組み換え体、または本酵素遺伝子を有する菌株から生産する方法を提供するものである。
本発明者らは、特許文献３に記載されたパエニバチルス・エスピー（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）５９８Ｋ株のゲノムＤＮＡよりサイクロデキストラン合成酵素遺伝子を含むＨｉｎｄIII断片を抽出し、該ＤＮＡ塩基配列を解読した。また、サイクロデキストラン合成酵素遺伝子をベクターＤＮＡに組み込み、大腸菌中で発現させ、好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素を生産させることに成功した。本発明は、これらの知見に基づいて完成された。

請求項１記載の本発明は、下記数１に記載の制限酵素開列地図を有し、かつ配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち34番目〜965番目のアミノ酸配列を有する好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素（分子量 １０７ｋｄ）遺伝子を含有するＤＮＡである。

（式中、ＨはＨｉｎｄIII、ＥはＥｃｏＲＩ、ＮはＮｄｅＩ、ＰはＰｓｔＩを示す。）
請求項２記載の本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素をコードするＤＮＡである。
請求項３記載の本発明は、配列表の配列番号２に示される塩基配列からなる請求項２記載のＤＮＡである。
請求項４記載の本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち34番目〜965番目のアミノ酸配列を有する好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素をコードするＤＮＡである。
請求項５記載の本発明は、好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素が、パエニバチルス属菌由来の酵素である請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡである。
請求項６記載の本発明は、請求項２〜４のいずれかに記載の好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素遺伝子または配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組み込んでなる組み換え体ＤＮＡである。

請求項７記載の本発明は、請求項６記載の組み換え体ＤＮＡを含む大腸菌を培地に培養し、培養物より好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素を採取することを特徴とする好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素の製造法である。
請求項８記載の本発明は、好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素生産能を有するパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６０４）を培養し、培養物より好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素を採取することを特徴とする好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素の製造法である。
請求項９記載の本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち34番目〜965番目のアミノ酸配列を有する好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素である。

環状イソマルトオリゴ糖であるサイクロデキストラン（ＣＩ）は、従来、４０℃、ｐＨ５．５〜６．０という低温で、弱酸性の、比較的汚染しやすい条件でのみでしか生産できなかった。しかも、抗う蝕剤とするには酸性であることは望ましくないため、ＣＩ製造後に、ｐＨを上げることが必要であった。
本発明により、より高温で、かつアルカリ性の条件で、Ｔ−３０４０由来のＣＩＴａｓｅよりも高い生産性で、より効率的にＣＩを生産する技術が開発され、より汚染の危険性を減らし、また、ｐＨ調整することなく抗う蝕剤としてのＣＩを生産することが可能となった。
また、既知酵素であるＴ−３０４０と異なり、酵素反応にカルシウムを必要としないため、生成したＣＩの精製を容易に行うことができる。しかも、本発明で得られたＣＩＴａｓｅは、高温による安定性が従来のＣＩＴａｓｅよりも高いことにより、ＣＩＴａｓｅを繰り返し使用する場合の反応、分離、濃縮の操作に伴う温度上昇にも耐えることができ、酵素の使用可能時間を大幅に延長することができる。さらに、本酵素は、抗う蝕性の高いＣＩ−７を最も良く生産し、包接能の高いＣＩ−１０をはじめとする高分子のＣＩも同様に生産することができる。

本発明者らは、上記課題を解決するために検討し、特許文献３記載のパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ菌株からサイクロデキストラン合成酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡを単離、および構造決定することに成功した。さらに、該ＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んでなる組み換え体ＤＮＡを得た。
該組み換え体ＤＮＡより成熟サイクロデキストラン合成酵素のみをコードする遺伝子を調製し、発現ベクターに組み込んで、該組み換え体ＤＮＡを含む大腸菌を培養すれば、好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素を効率よく製造することができる。

本発明によれば、請求項１記載の好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素遺伝子を含むＤＮＡより請求項６記載の組み換えＤＮＡを作成し、これを含んだ大腸菌を培養することによって好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素を生産することができる。
さらに、請求項８に記載のように、パエニバチルス属菌を培養することによっても該酵素を生産することができる。
上記微生物は、特開２００５−１９２５１０号公報に記載した取得方法で取得することができる。
本酵素は、低分子サイクロデキストランだけでなく、高分子のサイクロデキストランも効率よく合成することができる。

請求項１記載のＤＮＡは、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するサイクロデキストラン合成酵素をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号３に示される塩基配列を有するサイクロデキストラン合成酵素をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号４に示される塩基配列を有する成熟サイクロデキストラン合成酵素をコードするＤＮＡである。
本発明はまた、上記いずれかの記載のＤＮＡを含むＤＮＡ断片、並びに該組み換え体ＤＮＡを含む大腸菌をはじめとする微生物を培地に培養し、培養物よりサイクロデキストラン合成酵素を採取することを特徴とするサイクロデキストラン合成酵素の製造法を提供するものである。
本発明を、以下の実施例により説明する。

本発明に係るパエニバチルス属菌株のゲノムＤＮＡの取得方法の詳細について、以下に示す。
パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株の保存菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６０４）を１白金耳、１リットル中にデキストランまたはブルーデキストラン（ファルマシア社製）、好ましくはブルーデキストラン２０００（アマシャム・ファルマシア製）１〜５ｇ、好ましくは２ｇ、酵母エキス（バクト社製）５ｇ、トリプトン（バクト社製）１０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇを含み、ｐＨを７．０に調整し、寒天１５ｇを加えた平板培地に塗抹する。ブルーデキストランを用いた場合は、通常３０℃で１晩から２晩培養すると、ハローを形成する。１晩から３日間程培養してコロニーを生育させる。

次に、上記コロニーから定法により、ゲノムＤＮＡを調製する。例えば、１コロニーを１リットル中に酵母エキス（バクト社製）５ｇ、トリプトン（バクト社製）１０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇを含み、ｐＨを７．０に調整した液体（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ、以下ＬＢと省略することがある）培地１５０ｍｌに接種し、３０℃で一晩から２日間程振盪培養した後に、菌体を遠心によって集める。これを１１ｍｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、２２ｍｇのリゾチームを加え、３７℃で１時間保持する。
次に、１０％ＳＤＳを０．６ｍｌ、プロテイナーゼＫ（メルク社製）（２ｍｇ／１００μｌ）を６０ｍｌ加え、３７℃で１時間保持する。
さらに、室温で５Ｍ ＮａＣｌを２ｍｌ加えて混合し、ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液（１０％ ＣＴＡＢ、０．７Ｍ ＮａＣｌ）を１．６ｍｌ加え、良く混合して６５℃で１０分反応させる。次いで、１５ｍｌのクロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１液を加え、１０，０００×ｇ、１５分間遠心する。水層を分取し、これに等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１液を加えて、再び１０，０００×ｇ、１５分間遠心する。水層を分取し、これに０．６容のイソプロパノールを加え、白い糸状の沈殿を、先をシールしたパスツールピペットに巻き取り、７０％エタノールで洗浄する。１０μｇ／ｍｌＴＥのＲＮａｓｅＡを０．３ｍｌ加え、３７℃で３０分保温後、６０％容のＰＥＧ溶液（２０％ポリエチレングリコール６０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を加えて氷中で２時間置く。１５，０００×ｇで１５分間遠心後、上清を捨て、０．８ｍｌの７０％エタノールで洗浄、乾燥し、１００μｌのＴＥに溶解する。

上記ＤＮＡを鋳型とし、プライマー１（配列表の配列番号６）とプライマー３（配列表の配列番号８）、またはプライマー２（配列表の配列番号７）とプライマー３（配列表の配列番号８）を用いてＤＮＡを増幅する。なお、配列中のｙはｔまたはｃ、ｒはａまたはｇを示す。また、プライマー３（配列表の配列番号８）の６番目のｎは、特殊塩基であるイノシンを示す。

ＰＣＲの条件については、例えば反応液１００μｌで、９４℃にて５分間加温の後、９４℃１分、５５℃１分、７２℃２．５分を３０サイクル行った。増幅したＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動で分離、切り出し、精製し、プラスミドベクター、例えばＴ７―ＢｌｕｅＲ―Ｔベクターなどに導入し、ＤＮＡ塩基配列を、ＤＮＡシーケンサを用いて決定した。

上記増幅ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドをそれぞれＤＩＧＤＮＡラベリングキット（ロシュ社製）などでラベリングを行う。
５９８Ｋ株ゲノムＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで分解後、アガロースゲル電気泳動を行い、サイズ５〜６ｋｂの幅を切り出し、ＤＮＡを抽出、ジーンクリーンキット（Ｑ−ＢＩＯ社）などを用いて精製する。抽出、精製したこれらＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋などのプラスミドベクターに組み込む。
これらの組み換えプラスミドを大腸菌ＤＨ５αなどに形質転換し、アンピシリン５０〜１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（寒天１．５％）に塗抹し、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ（−）−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）でカラーセレクションして白色のコロニーを形質転換体として分離した。
これらコロニーをそれぞれアンピシリン５０〜１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３７℃、１晩培養した。培養菌体を集め、プラスミドを精製し、アプライドバイオシステムズ社製ＡＢＩＰＲＩＳＭ ３１０ ＧＥＮＥＴＩＣ ＡＮＡＬＹＺＥＲ を用いてＤＮＡ塩基配列を決定した。決定したサイクロデキストラン合成酵素遺伝子を含むＨｉｎｄIII／ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。

配列表の配列番号２に示した塩基配列のうち、サイクロデキストラン合成酵素遺伝子は、配列表の配列番号３に示す通りである。配列番号３より、コードする推定アミノ酸配列は、配列番号１および図５の□で囲んでいない配列のように示される。なお、図５の□で囲んだアミノ酸配列は、５９８Ｋ株の培養液より生産されたサイクロデキストラン合成酵素のアミノ末端（最もＮ−末側の配列、Ala Ser Gly Asp Val Glu Arg Val）および同酵素のリシルエンドペプチダーゼ（ワコー社製）分解物より得られた内部アミノ酸配列（その他の□で囲み配列）であり、すべて遺伝子より推定したアミノ酸配列と一致している（図５）。

Ｎ−末側の配列が明らかになったので、配列表の配列番号２に示した塩基配列よりシグナル配列Met Ala Ile Arg Asn Lys Gly Trp Leu Leu Leu Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Leu Pro Pro Trp Gln Pro Ala Ala Leu Glu Gln Thr Ala His Alaを取り除き、定法により発現用ベクターに組み込むようにＤＮＡ断片を作成する。例えば、発現用ベクターｐＥＴ２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込む場合は、本ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで切断する。同制限酵素で切断した断片をｐＥＴ２３ｄに組み込み、これをｐＣＩＴ５９８と名付けた。これを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させる。具体的には、ｐＣＩＴ５９８溶液を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、アンピシリン５０〜２００μｇ／ｍｌを含むＬＢ平板培地に塗抹し、３７℃で９時間〜１２時間培養する。

上記平板培地に生育した１コロニーを、アンピシリン５０〜２００μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩振盪培養する。これを１０００ｍｌの同様の培地に接種し、３７℃で振盪培養し、６００ｎｍの吸光度が０．４〜０．９に達したとき、望ましくは０．５前後に達したときに、培養液の入ったフラスコを氷水で冷却し、直ちにイソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略記することがある。）（ワコー社製）を０．５ｍＭとなるように加え、さらに１８℃で２２時間培養を続け、タンパクの生産誘導を行った。
培養終了後、培養物を遠心分離することにより菌体を沈殿として回収した。続いて、回収した菌体を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に懸濁し、超音波によって細胞破砕した。細胞破砕後、遠心分離（１５，０００×ｇ、２０分間、４℃）することにより上清を回収した。
これに最終濃度０．５Ｍの硫酸アンモニウムを加え、氷冷しながら一晩放置し、再び遠心分離（１５，０００×ｇ、２０分間、４℃）することにより沈殿を回収した。これに１０ｍｌの水を加え、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に対して一晩透析したものを粗酵素液とした。

なお、粗酵素液は、パエニバチルス５９８Ｋ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６０４）を、デキストランを含む培地で培養することによっても得ることができる。例えば、５０ｍＭリン酸二ナトリウム、５０ｍＭリン酸一カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．００２％塩化カルシウム、０．００２％塩化マンガン、０．００２％硫酸鉄、０．１％酵母エキス、０．１〜２％、好ましくは０．５％のデキストラン、好ましくはデキストランＴ−４０（アマシャム・ファルマシア社製）、０．４％塩化アンモニウムから成る５０ｍｌの液体培地に、パエニバチルス５９８Ｋ株の保存菌株より一白金耳植菌し、３０℃で１５０ｒｐｍ、４日間振盪培養を行う。次いで、遠心分離（１００００×ｇ、２０分間、４℃）することにより上清を回収し、これを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に対して一晩透析したものを粗酵素液とした。

上記段落番号００１８に記載の粗酵素液および段落番号００１９に記載の粗酵素液は、下記の方法によって精製した。

Ｒｅｓｏｕｒａｃｅ Ｑ（１ｍｌ）（アマシャム・ファルマシア社製）に粗酵素を供し、Ａ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５ｍＭ ＮａＣｌ）およびＢ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１Ｍ ＮａＣｌ）の０〜６０％直線濃度勾配によって、流速０．５ｍｌ／分で、４８分間溶出する。これをＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ １００００ＮＭＷＬ フィルターユニット（ミリポア社製）を用いて１００μｌ程度に濃縮する。
これをＳｕｐｅｒｏｓｅ １２（アマシャム・ファルマシア社製）で５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で、０．５ｍｌ／分の流速で溶出し、得られた酵素溶液を精製酵素として用いる。段落番号００１８に記載の粗酵素液からはリコンビナント・サイクロデキストラン合成酵素を、段落番号００１９記載の粗酵素液からはネイティブ・サイクロデキストラン合成酵素をそれぞれ精製することができる。

酵素の活性測定は、この精製酵素液に、最終濃度が２％になるように、デキストランＴ４０（ファルマシア社製）、５０ｍＭ トリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、５０℃で反応させることにより行う。酵素反応は、１０分間沸騰水中に置くことにより停止する。
次いで、室温に冷却後、これにグルコアミラーゼ（ワコー社製）およびＨＢＤａｓｅを加え、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で３０℃で一晩反応を行い、残存した直鎖のオリゴ糖またはデキストランをすべてグルコースまで分解する。ＨＢＤａｓｅは、特開平１０−２２９８７６号公報記載のスフィンゴバクテリウム・エスピー Ｖ−５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０８６）を培養して得られたものでもよく、また、特開２００１−０５４３８２号公報記載の大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−３）（ＦＥＲＭ Ｐ−１７５１０）等の多分岐デキストラン水解酵素遺伝子を導入した大腸菌形質転換体を培養して得られたものでもよい。酵素反応は、１０分間沸騰水中に置くことにより停止し、しかる後、室温に冷却後、等量のアセトニトリルを添加し、１５，０００×ｇ、１０分遠心して沈殿を除く。

上記反応液をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジ（ウォーターズ社製）などの逆相カラム処理したものを高速液体クロマトグラフＬＣ−１０ＡＤＶＰ（島津社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いて５０％アセトニトリルで流速１ｍL／分および噴霧蒸発光散乱検出器ＥＬＳＤ−ＬＴ（島津社製）で、分析ソフトウェアＣＬＡＳＳ−ＶＰ（島津社製）を用いて分析し、ＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９のピークの面積より、生産されるＣＩの量を算出する。活性は、ＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９の総量より求めた。

パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株由来のリコンビナント好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素の性質は以下の通りである。

パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株由来のリコンビナント好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素（以下、５９８ＫＣＩＴａｓｅと省略する場合がある。）は、組み換えＤＮＡであるｐＣＩＴ５９８より発現することによって生産され、配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列を有する。

生成した５９８ＫＣＩＴａｓｅを、段落番号００２１に示した方法で精製し、特許文献１に示す既知のサイクロデキストラン合成酵素であるバチルス・サーキュランスＴ−３０４０株由来のリコンビナントサイクロデキストラン合成酵素（以下、Ｔ３０４０ＣＩＴａｓｅと省略する場合がある）と性質を比較した。

図１は、５９８ＫＣＩＴａｓｅおよびＴ３０４０ＣＩＴａｓｅが生産するＣＩをＨＰＬＣにより分析した図である。５９８ＫＣＩＴａｓｅは、Ｔ−３０４０ＣＩＴａｓｅがＣＩ−８を最も良く生産するのに対し、ＣＩ−７を最も良く生産するＣＩＴａｓｅである。

図２に５９８ＫＣＩＴａｓｅおよびＴ３０４０ＣＩＴａｓｅの至適ｐＨを示す。ｐＨ４〜５．５までは５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５〜９までは５０ｍＭのトリス−マレイン酸緩衝液を用いて、５９８ＫＣＩＴａｓｅは５０℃、Ｔ３０４０ＣＩＴａｓｅは４０℃で、その他の条件については段落番号００２２および００２３に記載した条件で活性を測定した。その結果、Ｔ３０４０ＣＩＴａｓｅの至適ｐＨが５．５〜６付近であるのに対し、５９８ＫＣＩＴａｓｅの至適ｐＨは８とアルカリ側にあり、５９８ＫＣＩＴａｓｅは好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素であることがわかった。
ｐＨ安定性については、５９８ＫＣＩＴａｓｅは５０℃において、Ｔ３０４０ＣＩＴａｓｅは４０℃において、共に１５分間のインキュベーションでは、ｐＨ５以上で安定であった。

図３に５９８ＫＣＩＴａｓｅおよびＴ３０４０ＣＩＴａｓｅの至適温度を示す。５９８ＫＣＩＴａｓｅは５０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、Ｔ３０４０ＣＩＴａｓｅは５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で、その他の条件は段落番号００２２および００２３に記載した条件で活性を測定した。その結果、Ｔ３０４０ＣＩＴａｓｅの至適温度が４０℃であるのに対し、５９８ＫＣＩＴａｓｅの至適温度は５０℃と高温側にあり、５９８ＫＣＩＴａｓｅは、より高温で反応を行うことができることが明らかになった。なお、表１の数値は、それぞれの酵素につき、無添加の場合を１００として、相対値で示した。

図４に示すように、温度安定性については、１５分間のインキュベーションでは、５９８ＫＣＩＴａｓｅは５０℃まではほとんど活性が低下しないが、Ｔ３０４０ＣＩＴａｓｅは５０℃ではほぼ活性が消失した。また、Ｔ−３０４０ＣＩＴａｓｅは、６０℃で完全に失活するのに対し、５９８ＫＣＩＴａｓｅは、７０℃で約２０％、８０℃でも約１０％の活性が残存し、５９８ＫＣＩＴａｅは、耐熱性のＣＩＴａｓｅであることが明らかになった。

表１に示すように、Ｔ−３０４０ＣＩＴａｓｅがカルシウムイオンで活性が約１．４倍に上昇するが、５９８ＫＣＩＴａｓｅはいずれの二価イオンを添加した場合も、活性の上昇が見られない。このように、５９８ＫＣＩＴａｓｅは、カルシウムを添加しなくとも最大の活性を得られるという特徴がある。

パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株由来のネイティブ好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素も、ＣＩ−７を最も多く生産し、至適ｐＨは８．０、至適温度は５０℃、カルシウム非依存性、アミノ末端のアミノ酸配列は、図５の□で囲んだ配列、Ala Ser Gly Asp Val Glu Arg Valであり、請求項１などに記載の好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素（分子量 １０７ｋｄ）遺伝子の推定アミノ酸配列の、推定シグナル配列を取り除いたアミノ酸配列と一致する。
したがって、好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素（分子量 １０７ｋｄ）遺伝子は、パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株の菌体外ＣＩＴａｓｅをコードしていると言うことができる。

バチルス・サーキュランスＴ−３０４０株およびパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株由来のリコンビナントＣＩＴａｓｅおよびパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株由来のネイティブＣＩＴａｓｅの比活性は、順に、０．９３６Ｕ／ｍｇ、１．９２Ｕ／ｍｇ、１．９５Ｕ／ｍｇであり、５９８Ｋ株由来のＣＩＴａｓｅは、従来の酵素であるＴ−３０４０ＣＩＴａｓｅよりも２倍比活性が高く、反応性において優れている。ただし、１ユニットは、１分間に１μｍｏｌのＣＩを生産する酵素量とする。

本発明によって得られたパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株由来のＣＩＴａｓｅ遺伝子を発現することによって得られた組み換え体ＤＮＡを含む大腸菌（請求項７）、あるいはパエニバチルス属菌（請求項８）を培養することによって培養液より得られた好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素は、５０℃、ｐＨ８．０の、高温、アルカリ性で、カルシウム無添加の条件で、良好にサイクロデキストランを生産することができる。得られたサイクロデキストランは、抗う蝕剤、包接剤として食品産業、化学産業等で使用することができる。

本発明により、好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素遺伝子を含有するＤＮＡ、組み換え体ＤＮＡが提供され、さらに該サイクロデキストランの製造法が提供される。
本発明により得られるサイクロデキストランは、食品、医薬品、化成品などに応用できる。また、このサイクロデランは、サイクロデキストリンよりも水溶性が極めて高いため、不溶性物質の包接による可溶化の効果が高いものと期待される。

（ａ）はパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株由来リコンビナントＣＩＴａｓｅが生産する、環状オリゴ糖（ＣＩ）を示すＨＰＬＣ分析の図および（ｂ）はバチルス・サーキュランスＴ３０４０株由来リコンビナントＣＩＴａｓｅが生産する、環状オリゴ糖を示すＨＰＬＣ分析の図である。図中の数字7〜14は、それぞれＣＩ−7〜ＣＩ−14を示す。 パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株由来リコンビナントＣＩＴａｓｅおよびバチルス・サーキュランスＴ３０４０株由来リコンビナントＣＩＴａｓｅの至適ｐＨを示す図である。 パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株由来リコンビナントＣＩＴａｓｅおよびバチルス・サーキュランスＴ３０４０株由来リコンビナントＣＩＴａｓｅの至適温度を示す図である。 パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株由来リコンビナントＣＩＴａｓｅおよびバチルス・サーキュランスＴ３０４０株由来リコンビナントＣＩＴａｓｅの温度安定性を示す図である。 配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列のパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株由来好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素の推定アミノ酸配列（通常文字）と、同菌株の培養液から得られる菌体外サイクロデキストラン合成酵素のアミノ末端および部分アミノ酸配列（□囲み文字）を示す図である。

Claims (9)

1. 下記数１に記載の制限酵素開列地図を有し、かつ配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち34番目〜965番目のアミノ酸配列を有する好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素（分子量 １０７ｋｄ）遺伝子を含有するＤＮＡ。
   

   

   
   （式中、ＨはＨｉｎｄIII、ＥはＥｃｏＲＩ、ＮはＮｄｅＩ、ＰはＰｓｔＩを示す。）
2. 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素をコードするＤＮＡ。
3. 配列表の配列番号２に示される塩基配列からなる請求項２記載のＤＮＡ。
4. 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち34番目〜965番目のアミノ酸配列を有する好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素をコードするＤＮＡ。
5. 好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素が、パエニバチルス属菌由来の酵素である請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ。
6. 請求項２〜４のいずれかに記載の好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素遺伝子または配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組み込んでなる組み換え体ＤＮＡ。
7. 請求項６記載の組み換え体ＤＮＡを含む大腸菌を培地に培養し、培養物より好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素を採取することを特徴とする好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素の製造法。
8. 好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素生産能を有するパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６０４）を培養し、培養物より好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素を採取することを特徴とする好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素の製造法。
9. 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち34番目〜965番目のアミノ酸配列を有する好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素。

Images