JPH0347080A - トリプトファナーゼをコードするdna - Google Patents
トリプトファナーゼをコードするdnaInfo
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明はプロテウス(I’ro teus )属菌株由
来のトリプトファナーゼをコードするDN八へ列、1亥
DNA配列を発現ベクターに組み込んだ組換えプラスミ
ド、該&Il換えプラスミドを存する形質転換体及び該
形質転換体を用いてトリプトファナーゼを製造する方法
に関する。
来のトリプトファナーゼをコードするDN八へ列、1亥
DNA配列を発現ベクターに組み込んだ組換えプラスミ
ド、該&Il換えプラスミドを存する形質転換体及び該
形質転換体を用いてトリプトファナーゼを製造する方法
に関する。
トリプトファナーゼはトリプトファンをインドール、ピ
ルビン酸及びアンモニアに分解する反応を触媒する酵素
であり、反応式は以下の通りである。
ルビン酸及びアンモニアに分解する反応を触媒する酵素
であり、反応式は以下の通りである。
トリプトファン+H!0戸ヨインドール士ピルヒ゛ン酸
十N11゜ 上記の反応は可逆的であり、トリプトファナーゼを触媒
として用いることによりインドール、ピルビン酸及びア
ンモニアからトリプトファンを合成することが出来る。
十N11゜ 上記の反応は可逆的であり、トリプトファナーゼを触媒
として用いることによりインドール、ピルビン酸及びア
ンモニアからトリプトファンを合成することが出来る。
(従来の技術)
従来、トリプトファナーゼは例えばプロテウスレトゲリ
(ProLeus rettogeri)エシェリヒ
アコリ (Escherichia coli) K1
2株等、トリプトファナーゼ生産能を有する微生物をト
リプトファンまたはその誘導体の存在下で培養し、該培
養物がらトリプトファナーゼを採取することにより製造
されている。しかしながら、この方法では培地中にトリ
プトファンまたはその誘導体等の高価な物質を添加する
ことが必要であり、またトリプトファナーゼの収量も充
分ではなく、効率の良いトリプトファナーゼ製造方法の
開発が望まれていた。
(ProLeus rettogeri)エシェリヒ
アコリ (Escherichia coli) K1
2株等、トリプトファナーゼ生産能を有する微生物をト
リプトファンまたはその誘導体の存在下で培養し、該培
養物がらトリプトファナーゼを採取することにより製造
されている。しかしながら、この方法では培地中にトリ
プトファンまたはその誘導体等の高価な物質を添加する
ことが必要であり、またトリプトファナーゼの収量も充
分ではなく、効率の良いトリプトファナーゼ製造方法の
開発が望まれていた。
一方、プロテウス・インコンスタンス(Proteus
incons tans )に属する菌株がインドール
化合物又はその誘導体とピルビン酸エステルとアンモニ
ウムイオンとからL−トリプトファンまたはその誘導体
を生成する能力を有することが公知であった(特開昭6
2−205791号)。
incons tans )に属する菌株がインドール
化合物又はその誘導体とピルビン酸エステルとアンモニ
ウムイオンとからL−トリプトファンまたはその誘導体
を生成する能力を有することが公知であった(特開昭6
2−205791号)。
(発明が解決しようとする課題)
本発明の課題は、遺伝子操作技術を用いて培地中にトリ
プトファン又はその誘導体を添加することなく、トリプ
トファナーゼの生産性を向上させる新たな方法を提供す
ることにある。
プトファン又はその誘導体を添加することなく、トリプ
トファナーゼの生産性を向上させる新たな方法を提供す
ることにある。
(課題を解決するための手段)
本発明者らは、上記の課題を解決するために、トリプト
ファナーゼをコードするDNA配列、該DNA配列を発
現ベクターに組み込んだ組換えプラスミド、該プラスミ
ドを含有する形質転換体及び該形質転換体を用いてトリ
プトファナーゼを生産する方法について検討した。まず
トリプトファナーゼ生産菌の有するトリプトファナーゼ
遺伝子をクローニングし、該遺伝子のDNA配列を決定
した。次いで該DNA配列を発現ベクターに組み込んだ
組換えプラスミドを得、更に該プラスミドを含む形質転
換体@調製し、該形質転換体を用いるトリプトファナー
ゼの製造方法について検討し、本発明を完成するに至っ
た。
ファナーゼをコードするDNA配列、該DNA配列を発
現ベクターに組み込んだ組換えプラスミド、該プラスミ
ドを含有する形質転換体及び該形質転換体を用いてトリ
プトファナーゼを生産する方法について検討した。まず
トリプトファナーゼ生産菌の有するトリプトファナーゼ
遺伝子をクローニングし、該遺伝子のDNA配列を決定
した。次いで該DNA配列を発現ベクターに組み込んだ
組換えプラスミドを得、更に該プラスミドを含む形質転
換体@調製し、該形質転換体を用いるトリプトファナー
ゼの製造方法について検討し、本発明を完成するに至っ
た。
すなわち本発明は
(1)プロテウス(Proteus)属菌株由来のトリ
プトファナーゼをコードするDNA配列。
プトファナーゼをコードするDNA配列。
(2)請求項第1項記載のDNA配列を含む組換えプラ
スミド。
スミド。
(3)請求項第2項記載の組換えプラスミドにより形質
転換された形質転換体。
転換された形質転換体。
(4)請求項1項記載のDNA配列を組み込んだ組換え
プラスミドにより、生物細胞あるいは微生物を形質転換
し、得られた形質転換体を培養して培養物からトリプト
ファナーゼを採取することを特徴とするトリプトファナ
ーゼの製造方法。
プラスミドにより、生物細胞あるいは微生物を形質転換
し、得られた形質転換体を培養して培養物からトリプト
ファナーゼを採取することを特徴とするトリプトファナ
ーゼの製造方法。
からなるものである。
本発明のプロテウス(Proteus)属菌株由来のト
リプトファナーゼをコードするDNA配列は第1図に示
されるものである。
リプトファナーゼをコードするDNA配列は第1図に示
されるものである。
本発明のプロテウス(Proteus)属菌株由来のト
リプトファナーゼをコードするDNA断片は、第1図の
塩基配列の一部を有するものであっても、塩基配列が一
部欠失、置換されたり挿入が加わったものであっても、
トリプトファナーゼをコードする限り、本発明の範囲に
含まれる。以下、本発明を実施するための各段階につい
て詳細に説明する。
リプトファナーゼをコードするDNA断片は、第1図の
塩基配列の一部を有するものであっても、塩基配列が一
部欠失、置換されたり挿入が加わったものであっても、
トリプトファナーゼをコードする限り、本発明の範囲に
含まれる。以下、本発明を実施するための各段階につい
て詳細に説明する。
(a)トリプトファナーゼをコードする・DNA配列お
よび$JI換えプラスミドの調製 本発明においてトリプトファナーゼをコードするDNA
配列の採取源となるプロテウス属菌株としては、プロテ
ウス・インコンスタンス(Proteusi neon
s tans )が好ましく、上記DNA配列はプロテ
ウス・インコンスタンス(Proteus 1ncon
stans)の染色体DNAより分離できる。好適な例
としては、プロテウス・インコンスタンス(Prote
us 1nconstanscを栄養培地で培養し、こ
の培養物を5.OOOrpm以上、好ましくは8.00
0〜10.000rp…で5分間以上、好ましくは10
〜15分間遠心分離して菌体を得る。この菌体より、例
えばRodriquez R,L et al Rec
ombinantDNA Techniques(^
ddison−Wesley Pub!ishing
Company、 1983)或はKoizumi
J、et al、、Biotecb。
よび$JI換えプラスミドの調製 本発明においてトリプトファナーゼをコードするDNA
配列の採取源となるプロテウス属菌株としては、プロテ
ウス・インコンスタンス(Proteusi neon
s tans )が好ましく、上記DNA配列はプロテ
ウス・インコンスタンス(Proteus 1ncon
stans)の染色体DNAより分離できる。好適な例
としては、プロテウス・インコンスタンス(Prote
us 1nconstanscを栄養培地で培養し、こ
の培養物を5.OOOrpm以上、好ましくは8.00
0〜10.000rp…で5分間以上、好ましくは10
〜15分間遠心分離して菌体を得る。この菌体より、例
えばRodriquez R,L et al Rec
ombinantDNA Techniques(^
ddison−Wesley Pub!ishing
Company、 1983)或はKoizumi
J、et al、、Biotecb。
Bioeng、、27,721〜728.1985記載
の方法等により染色体DNAを得ることが出来る。
の方法等により染色体DNAを得ることが出来る。
この染色体DNAに制限酵素、例えばEcoRI (東
洋紡製)を30℃以上、好ましくは37°Cで、30分
以上、好ましくは、1〜2時間作用させて切断し、種々
の大きさの染色体DNA断゛片混合物を得る。このよう
にして得られたDNへ断片混合物から、例えばシg糖密
度勾配遠心分離等により低分子量(例えばIKbρ以下
)のIINA断片を除き、更にエタノール沈澱法等のf
i縮平手段より濃縮し、トリブトファナ−ゼをコードす
る遺伝子を含有するDNA断片混合物を得る。
洋紡製)を30℃以上、好ましくは37°Cで、30分
以上、好ましくは、1〜2時間作用させて切断し、種々
の大きさの染色体DNA断゛片混合物を得る。このよう
にして得られたDNへ断片混合物から、例えばシg糖密
度勾配遠心分離等により低分子量(例えばIKbρ以下
)のIINA断片を除き、更にエタノール沈澱法等のf
i縮平手段より濃縮し、トリブトファナ−ゼをコードす
る遺伝子を含有するDNA断片混合物を得る。
本発明の組換えプラスミドはプロテウス(Proteu
s)属菌株由来のトリプトファナーゼをコードするDN
A配列をベクターDNAに組み込んだものである。
s)属菌株由来のトリプトファナーゼをコードするDN
A配列をベクターDNAに組み込んだものである。
本発明に用いるベクターDNAとしては、宿主となる生
物細胞又は微生物においてトリプトファン又はその誘導
体の添加を必要とすることなく、トリプトファンの発現
を行なわせるものである。例えばプラスミドベクターD
NA、バクテリオファージベクターDNA等があげられ
るが、好適な例として、プラスミドベクターpBR32
2、ρtlc19 (東洋紡51)、バクテリオファー
ジベクターλZAP、 E門BL3(Stratage
me製)等があげられる。
物細胞又は微生物においてトリプトファン又はその誘導
体の添加を必要とすることなく、トリプトファンの発現
を行なわせるものである。例えばプラスミドベクターD
NA、バクテリオファージベクターDNA等があげられ
るが、好適な例として、プラスミドベクターpBR32
2、ρtlc19 (東洋紡51)、バクテリオファー
ジベクターλZAP、 E門BL3(Stratage
me製)等があげられる。
本発明では、上記ベクターDNAにトリプトファナーゼ
をコードする遺伝子を含有するDNA断片混合物を連結
する。連結には例えば大腸菌DNAUガーゼ、T4DN
Aリガーゼ(東洋紡製)など、好ましくはT4DNAリ
ガーゼを4〜17°C1好ましくは4〜16゛Cにて1
時間以上、好ましくは4〜16時間作用させ、組換えI
INAを得る。このM換え[lNAを用いて、宿主微生
物、例えば[!、coltに−12、E、coli J
M109株、E、coli IIBIOI株、E、co
li C600株、14.coliXLI−blue株
(Stratagene製)などを形質転換あるいは形
質導入しそれぞれの菌体を得る。この形質転換および形
質導入は、例えばManiatis T、et al。
をコードする遺伝子を含有するDNA断片混合物を連結
する。連結には例えば大腸菌DNAUガーゼ、T4DN
Aリガーゼ(東洋紡製)など、好ましくはT4DNAリ
ガーゼを4〜17°C1好ましくは4〜16゛Cにて1
時間以上、好ましくは4〜16時間作用させ、組換えI
INAを得る。このM換え[lNAを用いて、宿主微生
物、例えば[!、coltに−12、E、coli J
M109株、E、coli IIBIOI株、E、co
li C600株、14.coliXLI−blue株
(Stratagene製)などを形質転換あるいは形
質導入しそれぞれの菌体を得る。この形質転換および形
質導入は、例えばManiatis T、et al。
Mo1ecular Cloning(Cold Sp
ring l1arbor、1982)記載の方法によ
り行うことが出来る。
ring l1arbor、1982)記載の方法によ
り行うことが出来る。
そして上記形質転換体あるいは形質導入体からトリプト
ファナーゼ生産能を有する菌株を、酵素免疫テストなど
によりスクリーニングし、トリプトファナーゼをコード
する遺伝子を含有する組換えDNAが得られる。更に上
記組換えDNA中のトリプトファナーゼをコートする遺
伝子を含有するDNA断片を常法に従い、小断片化して
上記ベクターDNAと連結し、トリプトファナーゼをコ
ードするDNA配列を有する組換えプラスミドを得るこ
とが出来る。
ファナーゼ生産能を有する菌株を、酵素免疫テストなど
によりスクリーニングし、トリプトファナーゼをコード
する遺伝子を含有する組換えDNAが得られる。更に上
記組換えDNA中のトリプトファナーゼをコートする遺
伝子を含有するDNA断片を常法に従い、小断片化して
上記ベクターDNAと連結し、トリプトファナーゼをコ
ードするDNA配列を有する組換えプラスミドを得るこ
とが出来る。
該g換えプラスミドに挿入されたD)JA断片の塩基配
列の決定を行ない、トリプトファナーゼをコードするD
NA断片を得る。
列の決定を行ない、トリプトファナーゼをコードするD
NA断片を得る。
(b)形質転換体の調製
(a)にて得られたトリプトファナーゼをコードするD
NA配列をベクターに組み込んだMi換えプラスミドを
、生物細胞あるいは微生物に導入することにより、所望
の遺伝形質とベクターDNAの形質を合せ持つ形質転換
体が得られる。宿主微生物としてはE、coli K1
2株、E、coli JM109株、E、coli H
8101株、E、coli C600株、E、coli
Dll−1株等が挙げられる。このようにして得られ
た好適な例としては、例えばE、coli IIBIO
I (pTE1920)がある。
NA配列をベクターに組み込んだMi換えプラスミドを
、生物細胞あるいは微生物に導入することにより、所望
の遺伝形質とベクターDNAの形質を合せ持つ形質転換
体が得られる。宿主微生物としてはE、coli K1
2株、E、coli JM109株、E、coli H
8101株、E、coli C600株、E、coli
Dll−1株等が挙げられる。このようにして得られ
た好適な例としては、例えばE、coli IIBIO
I (pTE1920)がある。
(C)トリプトファナーゼの製造
上記(b)で得られた形質転換体を培養するにはトリプ
トファナーゼの生産に適した培地であって、且つ宿主微
生物の生育に適した培地を用いる0通常エシェリヒア属
の生育培地として用いられているLB培地(トリプトン
、酵母エキス、食塩) 、BPB培地(Dirco;ポ
リペプトン、酵母エキス、リン酸カリウム)等を基本培
地として用いればよい。その他、必要に応じて他の炭素
源、窒素源及びアミノ酸、ビタミン等の栄養素を添加し
てもよい。培養方法は、通常振とう培養あるいは通気攪
拌培養で行う。培養温度は20〜45℃の範囲、好まし
くは37°C付近、培養初発pHはpH6,0〜7.5
、好ましくはpH6,2〜6.8付近で行うのがよい。
トファナーゼの生産に適した培地であって、且つ宿主微
生物の生育に適した培地を用いる0通常エシェリヒア属
の生育培地として用いられているLB培地(トリプトン
、酵母エキス、食塩) 、BPB培地(Dirco;ポ
リペプトン、酵母エキス、リン酸カリウム)等を基本培
地として用いればよい。その他、必要に応じて他の炭素
源、窒素源及びアミノ酸、ビタミン等の栄養素を添加し
てもよい。培養方法は、通常振とう培養あるいは通気攪
拌培養で行う。培養温度は20〜45℃の範囲、好まし
くは37°C付近、培養初発pHはpH6,0〜7.5
、好ましくはpH6,2〜6.8付近で行うのがよい。
これら以外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施
できる。
できる。
培養期間は10〜40時間で生育し、菌体内にトリプト
ファナーゼが生育蓄積される。
ファナーゼが生育蓄積される。
本酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いればよ
い。例えば抽出法には、超音波破砕、ガラスピーズを用
いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性剤などい
ずれを用いてもよい。更に抽出液については、公知の硫
安やばう硝等の塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシ
ウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミ
ンなどの凝集法さらにはDE八へ(ジエチルアミノエチ
ル)セファロース(ファルマシア製) 、CM (カル
ボキシメチル)等のイオン交換クロマトグラフィーおよ
びゲル濾過法等により精製することが出来る。
い。例えば抽出法には、超音波破砕、ガラスピーズを用
いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性剤などい
ずれを用いてもよい。更に抽出液については、公知の硫
安やばう硝等の塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシ
ウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミ
ンなどの凝集法さらにはDE八へ(ジエチルアミノエチ
ル)セファロース(ファルマシア製) 、CM (カル
ボキシメチル)等のイオン交換クロマトグラフィーおよ
びゲル濾過法等により精製することが出来る。
(発明の効果)
本発明のトリプトファナーゼをコードするDNA配列を
含む組換えプラスミドを有する形質転換体を培養すると
、トリプトファンを培地に添加することなくトリプトフ
ァナーゼを効率よく生産することが可能となる。
含む組換えプラスミドを有する形質転換体を培養すると
、トリプトファンを培地に添加することなくトリプトフ
ァナーゼを効率よく生産することが可能となる。
(実施例)
以下、実施例を挙げ本発明の詳細な説明を行う。
プロテウス・インコンスタンス(Proteusinc
onstans) IP012931株を栄養培地(ポ
リペプトン1%、酵母x−jrス0.59A、食塩0.
5% ) 1ooIIJffi ニ接触し、37℃で1
0時間振とぅ培養し培養液を得た。
onstans) IP012931株を栄養培地(ポ
リペプトン1%、酵母x−jrス0.59A、食塩0.
5% ) 1ooIIJffi ニ接触し、37℃で1
0時間振とぅ培養し培養液を得た。
この培養液をI2.00Orpm、1u分間遠心分離し
て湿菌体を得た。該菌体からRodriquez R,
I、et al。
て湿菌体を得た。該菌体からRodriquez R,
I、et al。
Recombinant DNA Technique
s(Addison−WesleyPublishin
g Company、1983)記載の方法により染色
体DNAを調製した。
s(Addison−WesleyPublishin
g Company、1983)記載の方法により染色
体DNAを調製した。
該染色体DNAを制限酵素EcoRI (東洋紡製)2
5ユニツトで37°C11時間切断した。切断後5〜2
0%シヨ糖密度勾配遠心分離を行い、2〜20Kbp画
分のDNA断片を調製した。
5ユニツトで37°C11時間切断した。切断後5〜2
0%シヨ糖密度勾配遠心分離を行い、2〜20Kbp画
分のDNA断片を調製した。
バクテリアファージヘクターλ−ZAP (EcoRT
切断済み、S tra tagene製)1μgと上記
(1)で得たEcoRJで切断した染色体DNA0.5
μgをT、I)NAIJガーゼ(東洋紡製)1ユニツト
で16°C112時間反応させDNAを連結した。
切断済み、S tra tagene製)1μgと上記
(1)で得たEcoRJで切断した染色体DNA0.5
μgをT、I)NAIJガーゼ(東洋紡製)1ユニツト
で16°C112時間反応させDNAを連結した。
連結したDNAはλDNAインビトロパッケージングキ
ットGigapack Gold (Stratage
ne製)を用いてパンケージソゲした。パッケージング
により得られた組換えファージはManiatis T
、et al MolecularCloning(C
old SpringHarbor、1982)記載の
方法によりE、coli XLI−Blue株(S L
ra tagene製)に形質導入した。使用(INA
1ug当たり約2 xlO6個のファージプラークが
得られた。
ットGigapack Gold (Stratage
ne製)を用いてパンケージソゲした。パッケージング
により得られた組換えファージはManiatis T
、et al MolecularCloning(C
old SpringHarbor、1982)記載の
方法によりE、coli XLI−Blue株(S L
ra tagene製)に形質導入した。使用(INA
1ug当たり約2 xlO6個のファージプラークが
得られた。
トリプトファナーゼをコードするDNA配列を有する組
換えファージの検索は酵素免疫テストにより行った。酵
素免疫テストはGene Expressionキット
(ベーリンガーマンハイム製)を用いて行った。本酵素
免疫テストはトリプトファナーゼ約10pgの検出限界
を示し、上記ファージプラーク1000個当り1〜3個
の陽性発色が得られた。
換えファージの検索は酵素免疫テストにより行った。酵
素免疫テストはGene Expressionキット
(ベーリンガーマンハイム製)を用いて行った。本酵素
免疫テストはトリプトファナーゼ約10pgの検出限界
を示し、上記ファージプラーク1000個当り1〜3個
の陽性発色が得られた。
酵素免疫テストで陽性のプラーク3個よりS tra
tagene製λZAP使用マニュアルの指示に従い組
換えプラスミドを切り出した。得られた3種の組換えプ
ラスミドをEcoRIで切断すると3種の組換えプラス
ミド共通に8.3KbPのDNA断片が見いだされた。
tagene製λZAP使用マニュアルの指示に従い組
換えプラスミドを切り出した。得られた3種の組換えプ
ラスミドをEcoRIで切断すると3種の組換えプラス
ミド共通に8.3KbPのDNA断片が見いだされた。
この8.3KbpのDNA断片は種々の制限酵素により
特徴付けされた(第3図)。
特徴付けされた(第3図)。
この8.3KbpのEcoRI断片約47/gから旧n
dl[[(東洋紡製)を用いて切断し、約4 Kbpの
EcoRI−Hind■断片を得た。生じたDNA断片
はアガロース電気泳動後、DNA精製キット、GENE
CLEANTM (BIo 101製)を用いてアガロ
ースゲルよりの抽出及び精製を行った。
dl[[(東洋紡製)を用いて切断し、約4 Kbpの
EcoRI−Hind■断片を得た。生じたDNA断片
はアガロース電気泳動後、DNA精製キット、GENE
CLEANTM (BIo 101製)を用いてアガロ
ースゲルよりの抽出及び精製を行った。
約4 KbpのEcoRI−11ind m DNA断
片約1ugを、EcoRlllind [[[にて切断
間環したプラスミドベクターBIuescriptKS
(門−13) (StrataBene製)約0.
5μと混合し、T4リガーゼ1ユニントで16°C11
2時間反応させてDNAを連結させ組換えプラスミドp
TE201を得た。
片約1ugを、EcoRlllind [[[にて切断
間環したプラスミドベクターBIuescriptKS
(門−13) (StrataBene製)約0.
5μと混合し、T4リガーゼ1ユニントで16°C11
2時間反応させてDNAを連結させ組換えプラスミドp
TE201を得た。
更に取得DNA断片の小型化を進めるためにKil。
5equence用Deletion Kit (宝酒
造製)を用い、そのマニュアルに従いEcoRI切断サ
イト側から約1.7にbp、 Hind IIIサイト
側から約0.7Kbpの塩基をデイレ−ジョンさせ、挿
入DNA断片が約1.6Kbpとなった組換えプラスミ
ドpTE202を得た。
造製)を用い、そのマニュアルに従いEcoRI切断サ
イト側から約1.7にbp、 Hind IIIサイト
側から約0.7Kbpの塩基をデイレ−ジョンさせ、挿
入DNA断片が約1.6Kbpとなった組換えプラスミ
ドpTE202を得た。
ついで、プラスミドpTE202を、その有するマルチ
クローニングサイトを利用しにpnlおよび5acTで
切断し所望するDNA断片を切り出した。
クローニングサイトを利用しにpnlおよび5acTで
切断し所望するDNA断片を切り出した。
得られた約1.6Kbpのにpnl−3acl断片約1
μgを、Kpnl−5aclで切断間環した発現ベクタ
ーpUc19約0.5μgと混合しT4リガーゼ1ユニ
ットで16°(,12時間反応させてDNAを連結させ
組換えプラスミドpTE1920を得た。
μgを、Kpnl−5aclで切断間環した発現ベクタ
ーpUc19約0.5μgと混合しT4リガーゼ1ユニ
ットで16°(,12時間反応させてDNAを連結させ
組換えプラスミドpTE1920を得た。
この組換えプラスミドpTE1920は発現ベクターp
Uc19の有するランクプロモーター(Lac Pro
moter)の制御下に生物学的活性を有するトリプト
ファナーゼをコードする。
Uc19の有するランクプロモーター(Lac Pro
moter)の制御下に生物学的活性を有するトリプト
ファナーゼをコードする。
一方、岨換えプラスミドPTE201の挿入DNA断片
の小型化をデイレ−シラン法で進めるに当たり生じた種
々の大きさのディレーションミュータントより1本鎖D
NAを調製し、得られた1本鎖DNAについて7−De
aza−3equencing Kit (東洋紡製)
を用いて塩基配列の決定を行った。次いで組換えプラス
ミドpTE1920に挿入されているDNA断片の塩基
配列の決定を行った。トリプトファナーゼをコードする
塩基配列を第1図に示す。
の小型化をデイレ−シラン法で進めるに当たり生じた種
々の大きさのディレーションミュータントより1本鎖D
NAを調製し、得られた1本鎖DNAについて7−De
aza−3equencing Kit (東洋紡製)
を用いて塩基配列の決定を行った。次いで組換えプラス
ミドpTE1920に挿入されているDNA断片の塩基
配列の決定を行った。トリプトファナーゼをコードする
塩基配列を第1図に示す。
上記トリプトファナーゼをコードするDNA配列を有す
る組み換えプラスミドpTE1920を用いMania
tis T、et al Mo1ecular Clo
ning(Cold Springflarbor、
19B2)記載の方法によりE、coli IIBIO
Iを形質転換してE、coli )IBIOI(pTE
1920)を調整した。
る組み換えプラスミドpTE1920を用いMania
tis T、et al Mo1ecular Clo
ning(Cold Springflarbor、
19B2)記載の方法によりE、coli IIBIO
Iを形質転換してE、coli )IBIOI(pTE
1920)を調整した。
本形質転換体は誘導物質なしに可溶性タンパク質の約6
0%まで目的とするトリプトファナーゼを生産した。
0%まで目的とするトリプトファナーゼを生産した。
トリプトファナーゼの活性測定法は、0.2χインドー
ル、1.1χピルビン酸ナトリウム、1,1χ塩化アン
モニウム、0.1mMピリドキサールリン酸ン容液中に
て、20℃、30分間反応後、トリプトファンの生成量
をHPLC(日立製作断裂)にて測定した。酵素活性は
20°Cで1分間に1マイクロモルのトリプトファンを
生成する酵素活性を1ユニントとした。
ル、1.1χピルビン酸ナトリウム、1,1χ塩化アン
モニウム、0.1mMピリドキサールリン酸ン容液中に
て、20℃、30分間反応後、トリプトファンの生成量
をHPLC(日立製作断裂)にて測定した。酵素活性は
20°Cで1分間に1マイクロモルのトリプトファンを
生成する酵素活性を1ユニントとした。
■供与株プロテウス・インコンスタンス(Proteu
s 1nconstans)及びE、coli HBI
OI(pTE1920)株の酵素生産性を培地(ポリペ
プトン2%、酵母エキス2%、ラクトース0.3%、食
塩0.5%、アンビシシリン50μg/ml)にて比較
した。
s 1nconstans)及びE、coli HBI
OI(pTE1920)株の酵素生産性を培地(ポリペ
プトン2%、酵母エキス2%、ラクトース0.3%、食
塩0.5%、アンビシシリン50μg/ml)にて比較
した。
各々の株の培養活性を下記の第1表に示すが、E、co
li HBLOI(pTE1920)株では、トリプト
ファン等の誘導なしにトリプトファナーゼが高生産され
ていることがわかる。
li HBLOI(pTE1920)株では、トリプト
ファン等の誘導なしにトリプトファナーゼが高生産され
ていることがわかる。
第1表
上記の酵素生産性の比較に用いた培地と同様の培地6!
を、102−ジャーファーメンタ−に分注し、121℃
、15分間オートクレーブ殺菌を行い放冷後、50mg
/dアンピシリンを6d添加した。この培地に上記と同
じ培地にて予め37°Cで8時間振とう培養したE、c
oli IIBIOI(pTE1920) の’?t
a ン夜を60tnl接種し、37℃にて24時間通
気攪拌培養を行った。培養終了時のトリプトファナーゼ
活性は1.050/d−Brothであった。
を、102−ジャーファーメンタ−に分注し、121℃
、15分間オートクレーブ殺菌を行い放冷後、50mg
/dアンピシリンを6d添加した。この培地に上記と同
じ培地にて予め37°Cで8時間振とう培養したE、c
oli IIBIOI(pTE1920) の’?t
a ン夜を60tnl接種し、37℃にて24時間通
気攪拌培養を行った。培養終了時のトリプトファナーゼ
活性は1.050/d−Brothであった。
培養液6I!、から遠心分離により菌体を集め、50m
M K−リン#t1M街′epH7,5,500dに
懸濁し、常法によるガラスピーズを用いる機械的な破砕
法により菌体を破砕した。この菌体破砕液からトリプト
ファナーゼの粗酵素液を遠心分離により得た。
M K−リン#t1M街′epH7,5,500dに
懸濁し、常法によるガラスピーズを用いる機械的な破砕
法により菌体を破砕した。この菌体破砕液からトリプト
ファナーゼの粗酵素液を遠心分離により得た。
このようにして得た粗酵素液にポリエチレンイミンによ
る除核酸処理を施した後、硫酸アンモニウムを用いた塩
析分画を行った。ここで得られた塩折沈澱物を、50d
の5011IMのに一リン酸緩衝液、pH7,5に再溶
解し、同緩衝液により平衡化されたDEAE−セファロ
ース(ファルマシア製)カラムクロマトグラフィーに供
し、0〜0.針の食塩濃度勾配溶出法により約0.1〜
0.3Mの食塩濃度範囲でトリプトファナーゼ活性画分
を得た。このトリプトファナーゼ活性画分を限外濾過機
にて濃縮後、50s+M K−リン酸緩衝液、pl+
7.5で平衡化したセファデックスG−25(ファルマ
シア!!iりカラムクロマトグラフィーにてゲル濾過を
おこなった。このようにして純化されたトリプトファナ
ーゼ365゜ユニットを得た。収率は58%であった。
る除核酸処理を施した後、硫酸アンモニウムを用いた塩
析分画を行った。ここで得られた塩折沈澱物を、50d
の5011IMのに一リン酸緩衝液、pH7,5に再溶
解し、同緩衝液により平衡化されたDEAE−セファロ
ース(ファルマシア製)カラムクロマトグラフィーに供
し、0〜0.針の食塩濃度勾配溶出法により約0.1〜
0.3Mの食塩濃度範囲でトリプトファナーゼ活性画分
を得た。このトリプトファナーゼ活性画分を限外濾過機
にて濃縮後、50s+M K−リン酸緩衝液、pl+
7.5で平衡化したセファデックスG−25(ファルマ
シア!!iりカラムクロマトグラフィーにてゲル濾過を
おこなった。このようにして純化されたトリプトファナ
ーゼ365゜ユニットを得た。収率は58%であった。
第1 図ハフ”ロチウス・インコンスタンス(Prot
eusfnconstans )株のトリプトファナー
ゼをコードするDN^配列を示し、第2図は対応するア
ミノ酸配列を示す。 第3図は組換えプラスミドpTE1920の構築経過を
示す。 第1図(a) ATCGCT AAA AGA ATT GT
A GAA CCA TTCCGC0 ATT AAA ATG GTA GAA
AAT ATCCGT ATT CCA0
eusfnconstans )株のトリプトファナー
ゼをコードするDN^配列を示し、第2図は対応するア
ミノ酸配列を示す。 第3図は組換えプラスミドpTE1920の構築経過を
示す。 第1図(a) ATCGCT AAA AGA ATT GT
A GAA CCA TTCCGC0 ATT AAA ATG GTA GAA
AAT ATCCGT ATT CCA0
Claims (4)
- (1)プロテウス(Proteus)属菌株由来のトリ
プトファナーゼをコードするDNA配列。 - (2)請求項第1項記載のDNA配列を含む組換えプラ
スミド。 - (3)請求項第2項記載の組換えプラスミドにより形質
転換された形質転換体。 - (4)請求項1項記載のDNA配列を組み込んだ組換え
プラスミドにより、生物細胞あるいは微生物を形質転換
し、得られた形質転換体を培養して培養物からトリプト
ファナーゼを採取することを特徴とするトリプトファナ
ーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18152289A JPH0347080A (ja) | 1989-07-13 | 1989-07-13 | トリプトファナーゼをコードするdna |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18152289A JPH0347080A (ja) | 1989-07-13 | 1989-07-13 | トリプトファナーゼをコードするdna |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0347080A true JPH0347080A (ja) | 1991-02-28 |
Family
ID=16102235
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP18152289A Pending JPH0347080A (ja) | 1989-07-13 | 1989-07-13 | トリプトファナーゼをコードするdna |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0347080A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000348166A (ja) * | 1999-04-02 | 2000-12-15 | Japan Tobacco Inc | 円筒形状物品の外観検査装置 |
-
1989
- 1989-07-13 JP JP18152289A patent/JPH0347080A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000348166A (ja) * | 1999-04-02 | 2000-12-15 | Japan Tobacco Inc | 円筒形状物品の外観検査装置 |
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