DE2122298C3 - Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Gewinnung des Enzyms Creatinin-amidohydrolase aus Mikroorganismen.
In der klinischen Chemie, besonders für die Funktionsdiagnostik der Niere, spielt die Bestimmung der Zwischen- und Endprodukte des Eiweißstoffwechsels eine wichtige Roile. Hierzu zählen auch Creatinin und Creatin. Die Bestimmung von Creatinin wurde daher schon wiederholt beschrieben. Die meisten der bekannten Methoden basieren auf der nichtenzymatischen Jaffe-Reaktion, die jedoch den Nachteil hat, unspezifisch zu sein.
Weiter wurde bereits eine spezifische mikrobiologische Bestimmungsmethode mit isolierten Bakterien beschrieben, wobei gewaschene Zellsuspensionen zur Creatinin-Messung verwendet wurden und die Bildung von Harnstoff und Ammoniak als Maß der Enzymwirkung herangezogen wurde. Lösliche, zum Creatininabbau befähigte Enzymextrakte konnten dabei jedoch nicht erhalten werden. Voraussetzung für die Schaffung
einer spezifischen Creatinin-Bestimmung mit Hilfe von Enzymer war jedoch die Auffindung von geeigneten, löslichen Enzymen, welche spezifische und meßbare Umsetzungen des Creatinine katalysieren können.
Roche, Lacombe und Girard (BBA 6, 210, 1950) charakterisierten in zwei Pseudomonas-Arten Creatinase, Creatininase und eine Glycocyaminase als spezifische Enzyme, die aus ihren Substraten aus der Guanidinogruppe Harnstoff in Freiheit setzten. Weiter wurde von Akamatsu und Mitarbeiter (Enzymologie, 15, Seiten 122,158,173,1951) in Erdbakterien ein als Creatinmutase bezeichnetes Enzym, welches die Gleichgewichtseinstellung zwischen Creatinin und Creatin bewirken soll. Hierbei wird folgender Abbauweg des Creatinins vermutet:
Creatbin
und
Sarcosin
Creatin
Glycin
Harnstoff
NH3
Nunmehr ist es gelungen, den hier vermuteten Weg des Creatinin-Abbaus zu bestätigen und erstmals ein Enzym in Mikroorganismen aufzufinden und in hoher Reinheit zu isolieren, welches an diesem Abbauweg entscheidend beteiligt ist.
Gegenstand der Erfindung ist die Isolierung und Reinigung dieses Enzymes.
jo Das eiTinduingsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase aus Mikroorganismen besteht darin, daß ein in einem creatininhaltigen Medium gezüchteter Mikroorganismus aufgeschlossen, aus der wasserlöslichen Aufschiußfraktion nach an sich
r, bekannten, bei pH-Werten über 7,0 durchgeführten biochemisichen Reinigungs- bzw. Fraklionierungsmethoden unter Anwendung eines Testes, bei dem aus zugesetztem Creatinin gebildetes Creatin in an sich bekannter Weise bestimmt wird, die Creatininamidohy-
4(i drolase gereinigt wird.
Durch das erfindungsgemäß erhältliche Enzym wird folgende Reaktion katalysiert:
Creatinin + H2O
Creatinin-amidohydrolase
Creatin
Da es sich bei der Gleichung um eine Gleichgewichtsreaktion unter Wasseraufnahme oder -abgabe handelt, wurde da s hier wirksame Enzym als Creatinin-amidohydrolase bezeichnet.
Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung des neuen I nzyms eignen sich Mikroorganismen allgemein, in denen das gewünschte Enzym adaptativ angereichert ist, was gewöhnlich dadurch geschieht, daß in Gegenwart oder unter Zusatz von Creatinin gezüchtet wird.
Aus den so gewonnenen Mikroorganismen wird durch Aufschluß die wasserlösliche Fraktion gewonnen. Als Aufschlußmethoden eignen sich die üblichen Methoden je nach der Festigkeit oder Widerstandsfähigkeit der Zellhaut des verwendeten Mikroorganismus. Besonders geeignet erwiesen sich die Hochdruckdispersion sowie der Ultraschallaufschluß. Weitere Beispiele für geeignete Aufschlußmethoden sind Desintegrationsmühlen, a:. B. nach B a I u t i η i und Schloßmann und auf ähnlicher Basis arbeitende Aufschiußmethoden. Auch chemische oder enzymatisch^ AufschluBmethoden sind anwendbar.
Aus der so erhaltenen wasserlöslichen Fraktion läßt sich die Creatinin-amidohydrolase anreichern, indem man ihre Eigenschaft, Creatinin in Creatin zu überführen, ausnützt Gebildetes Creatin läßt sich nach bekannten Methoden bestimmen, beispielsweise durch Zusatz von ATP und Messung von so gebildetem ADP in üblicher Weise. Es ist jedoch erforderlich, bei pH-Werten über 7 zu arbeiten und die jeweils angewendeten Reinigungsmethoden nach ihrer Anwendbarkeit bei diesen pH-Werten auszuwählen.
Eine weitere Methode, den Fortschritt des Anreicherungsverfahrens zu verfolgen, besteht darin, mit Creatin-amidinohydrolase das gebildete Creatin zu spalten unter Bildung von Sarcosin und Harnstoff und dann den Harnstoff in üblicher Weise, beispielsweise mittels der bekannten Reaktion unter Verwendung von Urease zu bestimmen.
Das Ausmaß der durchgeführten Reinigung hängt vom beabsichtigten Verwendungszweck des Enzyms bzw. der Enzyme ab. Falls ein zur enzymatischen Creatinin-Bestimmung geeignetes Präparat gewünscht ist, genügt bereits ein einziger Reinigungsschritt. Geeignete Reinigungsschritte sind beispielsweise PoIyanionenbehandlung. Fraktionierung mit organischen Lösungsmitteln oder Chromatographie. Unter Anwendung der obenerwähnten Bestimmungsmethoden ist es hierbei auf einfache Weise möglich, jeweils den Verbleib der gewünschten Enzyme festzustellen und diese in einem einzigen Schritt in erheblichem Maße anzureichern.
Da bei einer längeren Lagerung der geernteten und eingefrorenen Mikroorganismen eine Aktivitätsabnahme der gewünschten Enzyme zu befürchten ist, werden vorzugsweise die Zellen nach der Ernte möglichst rasch weiter aufgearbeitet. Zwei für das Verfahren der Erfindung bevorzugte Mikroorganismen sind Alcaligenes spec. WS 51400 ( = DSM 717) aus der Familie Achromo bactericeae und Penicillum WS 90001 ( = DSM 718)(Weihenstephan = WS).
Da Creatinin-amidohydrolase bei pH-Werten von 6 und darunter schnell an Aktivität verlieren, bei pH-Werten um 8,0 die größte Stabilität aufweisen, erfolgt der Aufschluß vorzugsweise zweckmäßig mit alkalischem Puffer. Vorzugsweise wird 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0 verwendet. Die Wahl des Puffers und der Pufferkonzentration sollte zweckmäßig je nach dem vorgesehenen weiteren Anreicherungsschritt so erfolgen, daß in dem für den Aufschluß verwendeten Puffer auch die weitere Anreicherung durchgeführt werden kann. Bei Aufschluß in der Hochdruckdispersion, üblicherweise bei etwa 700 bis 800 atü, kann die weitere Reinigung bei Anwendung einer Polyanionenbehandlung ohne vorherige Abtrennung der Zellrückstände durchgeführt werden. Geeignete Polyanionen sind beispielsweise Protaminsulfat oder wasserlösliches Polyäthylenimin. Bevorzugt wird ein Zusatz von wasserlöslichem Polyäthylenimin, beispielsweise in Form einer 10%igen Lösung von pH 8. Bei einer Lösung dieser Konzentration sind etwa 5% Zusatz, bezogen auf Aufschlußvolumen, erforderlich, bis kein weiterer Niederschlag mehr auftritt. Der Niederschlag wird durch physikalische Mittel, beispielsweise Filtrieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Die gewünschten Enzyme verbleiben im Überstand.
Anstelle einer Polyanionenfällung erwies sich auch eine Fällung mit organischem Lösungsmittel als vorteilhaft. Vorzugsweise wird hierbei Isopropanol verwendet. In diesem Fall werden die Zellriickständc nach dem Aufschluß zuerst entfernt, und dann wird bei Zimmertemperatur das organische Lösungsmittel zugesetzt. Die Isopropanol-Fraktionierung wird vorzugsweise so durchgeführt, daß bei 25° C pro Liter Aufschiußlösung 800 ml 90%iges Isopropanol zugesetzt und der Niederschlag abgetrennt wird. Der erhaltene Überstand wird erneut mit 500 mi Isopropanol je Liter versetzt und dir Niederschlag, der die beiden gewünschten Enzyme enthält, abgetrennt.
ίο Besonders bevorzugt ist eine kombinierte Anwendung der beiden obenerwähnten Methoden, nämlich Polyansonenfällung und anschließend Fraktionierung mit organischem Lösungsmittel.
Sowohl die mit einem einzigen Anreicherungsschritt als auch mit den beiden kombinierten Schritten erhaltenen Produkte sind bereits zur Verwendung in einer spezifischen Creatinin-Bestimmung geeigneL Die Enzyme Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase fallen hierbei jedoch stets gemeinsam an.
Falls eine Trennung der Enzyme gewünscht wird, werden die so erhaltenen Präparate anschließend durch Austauscherchromatographie getrennt. Als besonders geeigneter Austauscher erwies sich dabei ein schwach basischer Ionenaustauscher wie DEAE-Sephadex oder
>-> DEAE-Cellulose.
Bei Verwendung von DEAE-Sephadex werden die Enzyme bei geringer Ionenkonzentration, vorzugsweise etwa 0,01 bis 0,05 M, auf dem Austauscher adsorbiert. Anschließend v/ird der Austauscher mit einer lonenkonzentration von etwa 0,1 M gewaschen, wobei nichtaktive Begleitproteine entfernt werden. Creatinin-amidohydrolase läßt sich mit 0,2 M Pufferlösung eluieren. Die Creatin-amidinohydrolase verbleibt hierbei noch am Austauscher.
j-, Die oben beschriebene bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Kombination einer Isopropanol-Fraktionierung und einer Austauscherchromatographie führt zu einer etwa 100- bis 150fachen Anreicherung und ergibt ein Creatinin-amidohydrolase-präparat mit einer spezifischen Aktivität über 200 U/mg.
Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine sehr einfache Feinreinigung.des gewünschten Enzyms ohne Trennung
4r! erhalten werden, indem im Batch-Verfahren so viel Austauscher zugesetzt wird, bis beide Enzyme adsorbiert sind. Der Austauscher wird dann abgetrennt und, wie oben beschrieben, gewaschen und anschließend eluiert.
Eine weitere Möglichkeit zur Reinigung und Anreicherung des Enzyms besteht in der Salzfällung bzw. Salzfraktionierung, beispielsweise unter Verwendung von Ammoniumsulfat. Bei der Verwendung von Ammoniumsulfat fällt Creatinin-amidohydrolase bei einer Konzentration von 2,2 M.
Die Salzfällung eignet sich auch zur Gewinnung des Enzyms aus seinen Lösungen, wie sie beispielsweise bei der Elution des Austauschers erhalten werden. Durch Dialyse bei 4°C, zweckmäßig gegen verdünnten Puffer,
bo beispielsweise 0,02 M Diäthanolamin-puffer, pH 8,0, kann das Enzym von Salzen und anderen niedrigmolekularen Begleitstoffen befreit werden.
Die so erhaltenen Präparate können in eingefrorenem Zustand monatelang ohne Aktivitätsverlust gela-
dr, gen werden.
Eine weitere Rcinigungs- und Anreicherungsmethode besteht in einem Hitzeschritt bei 600C. Eine derartige Erhitzung während 5 Minuten führt zu keiner
merklichen Verringerung der Creatinin-amidohydrolase-Alctivität Im Gegensatz dabei verliert die Creatinamidohydrolase unter diesen Bedingungen ihre Aktivität
Das erfindungsgemäß erhältliche neue Enzym kann für wissenschaftliche Zwecke sowie zur spezifischen Bestimmung des Creatinins und Creatins verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
a) Isolierung hochgereinigter
Creatinin-amidohydrolase
Aus einem in Gegenwart von Creatinin gezüchteten Kulturansatz Alcaligenes spec. WS 51400 werden die Zellen (1 kg Trockengewicht) abgetrennt, mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0 auf 201 aufgenommen und ohne Kühlung in der Hochdruckdispersion bei ca. 800 atü aufgeschlossen. Der Extrakt wird mit 5 Vol.-% einer 10%igen Polyäthylenimin-Lösung (Mol-Gewicht ca. 1800) von pH 8,0 (ca. 1 1) versetzt Nach Zugabe von KCl (0,01 M Endmolarität) und NH4Cl (0,1 M Endmolarität) werden pro Liter Extrakt innerhalb von 10 Minuten 0,8 Volumen 90%iges wäßriges Isopropanol zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Der reichliche Niederschlag wird abzentrifugieru
Dem Überstand werden pro Liter weitere 0,45 Volumen 9O°/oiges Isopropanol zugegeben.
Der so gebildete Niederschlag, welcher Creaiininamidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase enthält, wird abgetrennt und in 400 ml 0,02 M Kaiiumphosphatpuffer pH 8,0 aufgenommen. Ein ungelöster Rückstand
ίο wird abgetrennt und der Obersland auf eine mit dem gleichen Puffer äquilibrierte Säule mit DiäthylaminoäthanoI-Gruppen enthaltenden vernetzten Dextran (3,5 cm χ 1 m) gegeben. Nach dem Aufziehen wird die Säule mit 1 Vol. 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0 gewaschen und dann mit 0,2 M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0 eluiert. Die Creatinin-amidohydrolase-haltigen Fraktionen werden vereinigt, bei pH 8,0 mit Ammoniumsulfat auf 2,2 M eingestellt, das ausgefallene Enzym abzentrifugiert und in 0,02 M Diälhanolaminpuffer pH 8,0 auf 100 ml gelöst und 4 Stunden bei +40C gegen gleichen Puffer dialysiert Man erhält so in einer Gesamtausbeute von 64% ein Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 303 U/mg. Die nachstehende Tabelle zeigt zusammenfassend die in den einzelnen Stufen dieses Verfahrens erhaltenen Aktivitäten und Ausbeuten.
Schritt U (25 C) Protein in g U/mg Ausbeute
%
Dispersionsaufschluß 2,8 · 105 98,6 2,8 100
Polyäthylenimin-Überstand 2,6 · 105 66,2 3,9 93
1. Isopropanolzusatz (Überstand) 2,16 ■ 105 32,6 6,6 77
2. Isopropanolzusatz (Niederschi.) 1,97 ■ 105 6,9 28,5 71
Chrom, in mit Diäthylaminoäthanol- 1,8 ■ I05 0,59 303 64
Gruppen enthaltendem vernetzten Dextran
(Eluate)
Bei Aufschluß mit Hilfe von Ultraschall anstelle der Hochdruckdispersion konnte der Gehalt an Creatininamidohydrolase bei etwa gleicher spezifischer Aktivität auf das 2,5fache, bezogen auf eingesetzte Mikroorganismen, Trockengewicht erhöht werden.
Die wie oben beschrieben erhaltene Creatinin-amidohydrolase weist eine Gleichgewichtskonstante
[Creatin]
[Creatinin]
K = 1,27
(370C; pH 8,0) auf.
Die Michaelis-Konstante für Creatinin als Substrat KM = 3,3 · 10-2M(37°C;pH8,0).
Beispiel 2
Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen, jedoch wird die Chromatographie mit Diäthyiaminoäthanol-gruppen enthaltendem vernetzten! Dextran durch ein Batch-Verfahren mit Diäthylaminoäthanolgruppen enthaltendem vernetztem Dextran ersetzt.
Ausgehend von 100 g Alcaligenes spec. WS 51 400 werden 100 ml des in 0,02 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8.0, gelösten zweiten Isopropanol-niederschlags mit so viel Diäihyiaminoäthanolgruppen enthaltendem vernetztem Dextran versetzt, bis im Überstand etwa je 5% des Enzyms verbleiben (etwa 20 g feucht abgepreßter Austauscher). Der Austauscher wird abfiltriert mit ca 100 ml 0,08 M Kaliumphosphatpuffer. pH 8,0 gewaschen und mit 100 ml 0,2 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8.0, enthaltend 0,3 M KCl, 15 Minuten bei +4°C gerührt und anschließend filtriert. Im Eluat findet sich das Enzym. Durch Fällung mit Ammoniumsulfat kann ein Präparat mit 31,5 U/mg Creatinin-amidohydrolase gewonnen werden, wie die nachstehende Tabelle zeigL
Isolierung von Creatinin-amidohydrolase aus 100 g (Trockengewicht) Alcaligenes spec. WS 51400
Schritt Protein Creatinin-amido- U/mg
in g hydroiase 0,92
U 13.9
Aufschluß 26.1 ZA ' O4
2. isopropanolzusalz i.43 ! QS · ! 0J 31.5
(Niederschlag)
Chromatogr. U.37Ö 1,16- 10"
Eluat 0.5 M pH 8.0
Beispiel 3
7 g (Trockengewicht) eines in Gegenwart von Crealinin gewachsenen Aijüügenes spec. WS 51400 wurden geerntet und bei dH 8,0 mit Ultraschall iHjfgpschlosscn. Die erhaltene Suspension wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit 0,8 Volumen Isopropanol versetzt, 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und zentrifugiert. Der Überst?r>d wird mit weiteren 0,4' Volumen Isopropanol versetzt und erneui zentrifugiert Der Niederschlag wird, wie in Beispiel 1 beschrieb_τ aufgenommen und über eine Säule mit Diäthylamino äthanol-Gruppen enthaltendem vernetztem Dextrai Chromatographien, wobei lediglich die Creatinin-ami dohydroiasc eiüiert wird. Die nachstehende Tabelli zeigt die Pinzelheiten dieses Verfahrens. Das erhalten! Präparat war zur Creatinin-Bestiinmung geeignet.
Schritt
U (25 C) Protein U/mg Ausbeute
i» g
Uitralischaii- i,5 · i03 l,7S0 0,85 10Ü Aufschluß
2. Isopropanol- 1,2 ■ 103 0,119 10,1 80 zusatz (Niederschlag)
Chromatogr. 0,7 103 0,028 25 47 Eluat
Bei den in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Versuchen wurde aus Creatinin in Gegenwart von Creatinin-amidohydrolase gebildetes Creatin bestimmt durch Zusatz von Adenosintriphosphat (ATP), welches in Gegenwart von Creatinphosphokinase (CPK) in Creatinphosphat und Adenosindiphosphat (ADP) überführt wird. Gebildetes ATP wird mit Pyruvat-Kinasf (PK) und Lactatdehydrogenase (LDH) sowie Phospho enolpyruvat (PEP) unter NADH-Verbrauch in ATF überführt und der Verbrauch an NADH optisch gemessen. Diese bekannten Schritte lassen sich wie folgi darstellen:
(1) Creatin +ATP ► Creatinphosphat + ADP
PK
(2) ADP + PEP -i-^-» Pyruvat + ATP
(3) Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD +

Claims (7)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Gewinnung von Creatinin-amidohydrolase, dadurch gekennzeichnet, daß ein in einem creatininhaltigen Medium gezüchteter Mikroorganismus aufgeschlossen, aus der wasserlöslichen Aufschlußfraktion nach an sich bekannten, bei pH-Werten über 7,0 durchgeführten biochemischen Reinigungs- bzw. Fraktionierungsmethoden unter Anwendung eines Testes, bei dem aus zugesetztem Creatinin gebildetes Creatin in an sich bekannter Weise bestimmt wird, die Creatininamidohydrolase gereinigt und anschließend ggf. die Creatin-amidinohydrolase von so gewonnener Creatinin-amidohydrolase durch Austauscherchromatographie abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein mechanischer Aufschluß durchgeführt wird, insbesondere unter Anwendung von Hochdruckdispersion, Ultraschall oder Desintegrationsmühle.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Polyanionenfraktionierung durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Polyäthylenimin- Fällung bei einer Pufferkonzentration von etwa 0,1 M durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine zweistufige Fällung mit Isopropanol durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme an einen schwach basischen Ionenaustauscher bei einer lonenkonzeniralion unter 0,1 M adsorbiert, der Austauscher mit etwa 0,1 M Puffer gewaschen und die Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase mit einer Ionenkonzentration von 0,2 M bzw. 0,5 M eluiert werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Alcaligenes spec. WS 51400 oder Penicillium WS 90001 verwendet wird.
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