JP4415247B2 - 新規なグリセロールキナーゼ、該遺伝子及び該遺伝子を用いたグリセロールキナーゼの製造法 - Google Patents
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Description
本発明は、新規なグリセロールキナーゼをコードする遺伝子ならびに遺伝子組換え技術による該酵素の製造法に関する。
グリセロールキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３０）は、グリセロールをマグネシウムとＡＴＰに依存したリン酸化反応によりグリセロール−３−リン酸に変える反応を触媒する酵素である。このグリセロールキナーゼは、１９３７年に、Ｋａｌｃｋａｒによって、肝臓内に発見（例えば、非特許文献１参照。）されて以来、ラット肝、ハト肝、キャンディダ・ミコデルマ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｙｃｏｄｅｒｍａ ）、セルロモナス フラビゲナ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖｉｇｅｎａ）、サーマス フラーバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）などからの精製が報告され（例えば、非特許文献２〜５および特許文献１参照。）生物全般に広く存在する事が知られている。また、ヒト、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）サッカロマイセル・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サーマス フラーバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）などから遺伝子のクローニングが報告されている（例えば、非特許文献６〜９参照。）。特に、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において、該酵素は詳しく研究がなされており、１９６７年に、Ｈａｙａｓｈｉ らによって精製され（例えば、非特許文献１０参照。）、１９８８年にそのクローニングの報告がなされている（例えば、非特許文献１１参照。）。また、遺伝子調節の研究、アロステリック阻害剤による阻害の研究など、広い範囲においても既に研究されている。
特開昭５６−１２１４８４号公報
Ｈ．Ｋａｌｃｋａｒ著，「Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉａ」，１９３７年，第２巻，ｐ４７
Ｃ．Ｂｕｂｌｉｔｚ ら著，「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」，１９５４年，第２１１巻，ｐ９５１
Ｅ．Ｐ．Ｋｅｎｎｅｄｙ著，「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．」，１９６２年，第５巻，ｐ４７６
Ｈ．Ｕ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒら著，「Ｂｉｏｃｈｅｍ．」，１９６１年，第３３３号，ｐ４７１
Ｈ．Ｓ．Ｈｕａｎｇら著，「Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．」，１９９７年，第８３号，ｐ３２８
Ｃ．Ａ．Ｓａｒｇｅｎｔら著，「Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．」，１９９４年，第３巻，ｐ１３１７
Ｃ．Ｈｏｌｍｂｅｒｇ ら著，「Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」，１９９０年，第１３６巻，ｐ２３６７
Ｐ．Ｐａｖｌｉｋ ら著，「Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．」，１９９３年，第２４巻，ｐ２１
Ｈ．Ｓ．Ｈｕａｎｇら著，「Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ」，１９９８年，第１３８２巻，ｐ１８６
Ｓ．Ｈａｙａｓｈｉ ら著，「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９６７年，第２４２巻，ｐ１０３０
Ｄ．Ｗ．Ｐｅｔｔｉｇｒｅｗ ら著，「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９８８年，第２６３巻，ｐ１３５
一方グリセロールキナーゼの工業分野への応用では臨床検査薬用原料酵素として利用されている。すなわち、試料中の中性脂肪（トリグリセリド）をリパーゼで加水分解し、生じたグリセロールを該酵素によってグリセロール−３−リン酸に変換する。このグリセロールー３−リン酸はグリセロール−３−リン酸酸化酵素を用いた比色定量法やグリセロールー３−リン酸脱水素酵素を用いた紫外部吸収定量法などにより血中の中性脂質の測定に利用されている。
最近の生化学検査用臨床検査薬は溶液状態の検査薬が主流となってきた。そのため従来から酵素に求められる特性（基質に対する高反応性、厳密な基質特異性など）に加え検査薬溶液中での高い安定性も求められるようになってきた。検査薬溶液中の安定性に寄与する特性としては種々あげられるが、一般的に液状検査薬は長期の保存を可能にするため防腐剤を添加されている。この防腐剤が酵素を不安定化することがあるため、防腐剤に対する耐性が高い事も検査薬用酵素の望まれる性質の一つである。
これまで高い熱安定性をもつ酵素が液状診断薬で高い安定性を示すと考えられてきており、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）やサーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）など好熱菌由来のグリセロールキナーゼが汎用されていた。しかし、これらのグリセロールキナーゼは防腐剤に対する耐性が比較的低いという問題を有していた。
防腐剤に対する耐性の高い新規なグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の単離、ならびに遺伝子組換え技術による該酵素の製造法を確立し、該酵素の中性脂質及びグリセロールの定量への利用を可能とする。
本発明者らは上記問題を解決するため鋭意検討した結果、防腐剤に対して高い耐性を有する新規なグリセロールキナーゼを単離することに成功した。具体的には、このようなグリセロールキナーゼを生産する菌として、セルロモナス・エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）を見出した。該菌体より抽出した染
色体ＤＮＡよりグリセロールキナーゼ遺伝子の単離に成功し、そのＤＮＡの全塩基配列を決定した。さらに、グリセロールキナーゼを遺伝子組換え技術によって形質転換体に高生産させることに成功し、高純度なグリセロールキナーゼを安価に大量供給することを可能にした。なお上記菌株は、理化学研究所 生物基盤研究部微生物系統保存施設より購入可能である。
色体ＤＮＡよりグリセロールキナーゼ遺伝子の単離に成功し、そのＤＮＡの全塩基配列を決定した。さらに、グリセロールキナーゼを遺伝子組換え技術によって形質転換体に高生産させることに成功し、高純度なグリセロールキナーゼを安価に大量供給することを可能にした。なお上記菌株は、理化学研究所 生物基盤研究部微生物系統保存施設より購入可能である。
すなわち、本発明は、以下の各項のグリセロールキナーゼなどを提供する。
項１． 防腐剤に対して高い耐性を有する事を特徴とするグリセロールキナーゼ
項２． 防腐剤に対する耐性が、防腐剤１００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃，１週間共存させた時の活性残存率が７０％以上ある事を特徴とする項１記載のグリセロールキナーゼ
項３． 防腐剤がＮ−メチルイソチアゾロン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ）および／またはその誘導体である、項１または２に記載のグリセロールキナーゼ
項４． 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質である 項１記載のグリセロールキナーゼ。
（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質
項５． 配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるグリセロールキナーゼをコードする遺伝子。
項６． 以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるグリセロールキナーゼをコードする遺伝子。
（ｃ）配列表・配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡ
項７． 項１、２または３記載のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
項８． 項７記載の組換えベクターで宿主細胞を形質転換した形質転換体。
項９． 項８記載の形質転換体を培養し、グリセロールキナーゼを生成させ、該グリセロールキナーゼを採取することを特徴とするグリセロールキナーゼの製造法。
項１． 防腐剤に対して高い耐性を有する事を特徴とするグリセロールキナーゼ
項２． 防腐剤に対する耐性が、防腐剤１００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃，１週間共存させた時の活性残存率が７０％以上ある事を特徴とする項１記載のグリセロールキナーゼ
項３． 防腐剤がＮ−メチルイソチアゾロン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ）および／またはその誘導体である、項１または２に記載のグリセロールキナーゼ
項４． 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質である 項１記載のグリセロールキナーゼ。
（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質
項５． 配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるグリセロールキナーゼをコードする遺伝子。
項６． 以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるグリセロールキナーゼをコードする遺伝子。
（ｃ）配列表・配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡ
項７． 項１、２または３記載のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
項８． 項７記載の組換えベクターで宿主細胞を形質転換した形質転換体。
項９． 項８記載の形質転換体を培養し、グリセロールキナーゼを生成させ、該グリセロールキナーゼを採取することを特徴とするグリセロールキナーゼの製造法。
本発明により、公知のグリセロールキナーゼに比べ防腐剤に対する高い耐性を有する新規なグリセロールキナーゼをコードする遺伝子が単離され、遺伝子組換え技術による該酵素の製造法が確立され、グリセロールの定量への利用が可能となった。
本発明のグリセロールキナーゼは、防腐剤に対して高い耐性を有する事を特徴とするグリセロールキナーゼである。
また、本発明は、防腐剤に対する耐性が、防腐剤１００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃，１週間共存させた時の活性残存率が７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上である事を特徴とするグリセロールキナーゼである。
本発明における防腐剤に対する耐性は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５中で約５Ｕ／ｍＬのグリセロールキナーゼを２５℃で１週間共存させた場合の活性残存率で評価することができる。
また、本発明は、防腐剤に対する耐性が、防腐剤１００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃，１週間共存させた時の活性残存率が７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上である事を特徴とするグリセロールキナーゼである。
本発明における防腐剤に対する耐性は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５中で約５Ｕ／ｍＬのグリセロールキナーゼを２５℃で１週間共存させた場合の活性残存率で評価することができる。
防腐剤は、試薬を保存している間の微生物の増殖を抑制することを目的として、試薬に添加される物質をいう。このときの防腐剤の添加濃度は特に限定されるものではないが、十分な効果が得られる濃度であることが望ましい。防腐剤の添加濃度は、防腐剤の種類や添加する試薬の組成などによって異なるのは当然であり、適当な添加濃度の決定は当業者が適宜実施できることである。
抗生物質の使用については、近年、耐性菌の発生が問題視されていること等を考慮すると、真に必要な場合以外はのぞましくないと考えられる。また、既に存在する耐性菌の影響を受け、防腐効果が得られない可能性も考えられる。一方、蛋白質直接作用することができる防腐剤は、微生物が耐性を得ることが難しいと考えられる点でより好ましく、今後汎用されていく可能性が高い。このような防腐剤には、例えば、蛋白質のＳＨ基やアミノ基に作用すると言われているＮ−メチルイソチアゾロン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ、略称ＭＩＴ）および／またはその誘導体などが挙げられる。しかし、このような蛋白質に直接作用する防腐剤は当然、共存する酵素蛋白質にも作用するため、蛋白質の構造によっては不安定化を招く可能性がある。このように、防腐剤に対する耐性は、その防腐剤の作用機構と蛋白質の構造の両面に起因すると考えられる。
本発明のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子は、グリセロールキナーゼ生産微生物、例えばセルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）などから抽出しても良く、または化学的に合成することもできる。
上記遺伝子としては、例えば（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡがある。ＤＮＡの欠失、置換、付加の程度については、基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善するようにしたものを含む。これらの変異体を製造する方法は、従来から公知である方法に従う。
または、（ｃ）配列表・配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡ。
または、（ｃ）配列表・配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡ。
本発明のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を得る方法としては、例えばセルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）の染色体ＤＮＡを分離、精製した後、超音波破砕、制限酵素処理等を用いて、ＤＮＡを断片化したものと、リニアーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑末端または接着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換ベクターを構築する。こうして得られた組換えベクターは複製可能な宿主微生物に移入した後、グリセロールキナーゼ活性の発現を指標としてスクリーニングして、組換えベクターを保持する微生物を得る。 次いで該微生物を培養し、該培養菌体から該組換えベクターを分離・精製し、該組換えベクターからグリセロールキナーゼ遺伝子を採取すれば良い。
遺伝子供与体であるセルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）に由来するＤＮＡは、具体的には以下のように採取される。すなわち、供与微生物を例えば、１〜３日間攪拌培養して得られた培養物を遠心分離にて集菌し、次いでこれを溶菌させることによりグリセロールキナーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌方法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼ等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用され、さらに凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせても良い。
このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離・精製するには常法、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
また、現在市販されている各種のＤＮＡ抽出用キットを用いる事により純度の良いＤＮＡを効率的に取得する事も可能で有る。
また、現在市販されている各種のＤＮＡ抽出用キットを用いる事により純度の良いＤＮＡを効率的に取得する事も可能で有る。
微生物から分離・精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。
ベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合には、ラムダＺＡＰＩＩ （ストラタジーン製）、λｇｔ・１０、λｇｔ・１１などが使用できる。 またプラスミドとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣＢＭ２０、ｐＵＣＢＭ２１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０などが使用できる。
このようなベクターを、上述したグリセロールキナーゼ遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であれば良く、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要なら、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作成することもできる。
このようなベクターを、上述したグリセロールキナーゼ遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であれば良く、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要なら、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作成することもできる。
宿主微生物としては、組換えベクターが安定、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーＫ−１２株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２）、エシェリヒア・コリーＷ３１１０株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０）、エシェリヒア・コリーＣ６００株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００）、エシェリヒア・コリーＨＢ１０１株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）などを用いることができる。なおグリセロール無添加の培地では宿主に由来するグリセロールキナーゼの活性は無視できる程度に低いものの、グリセロールキナーゼが欠損した変異株を宿主に用いる事がより好ましく、エシェリヒア・コリーＫＭ１株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＭ１）も利用可能で有る。
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などが用いることができる。また、市販されている各種エシェリヒア・コリーコンピテントセルも使用可能で有る。このようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のグリセロールキナーゼを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとグリセロールキナーゼ活性を同時に発現する微生物を検索すれば良く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、且つグリセロールキナーゼを生成する微生物を選択すれば良い。
上記の方法により得られたグリセロールキナーゼ遺伝子の塩基配列は、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５−１２１０，１９８１）に記載されたジデオキシ法やその改良法に基づく市販の試薬と自動分析機を利用する事により解読可能で有る。またグリセロールキナーゼのアミノ酸配列は、決定した塩基配列より推定した。このようにして一度選択されたグリセロールキナーゼ遺伝子を保有する組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移入することも容易に実施することができる。また、グリセロールキナーゼ遺伝子を保有する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりグリセロールキナーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させ、宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常、多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の炭素源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。宿主微生物が資化可能であれば良く、たとえばグルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用できる。窒素源としては、宿主微生物が利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプトン、肉エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物のような有機窒素化合物や、硫安、塩安のよおおうな無機窒素化合物が使用できる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用できる。
培養温度は宿主微生物が生育し、グリセロールキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリー（Ｅ． ｃｏｌｉ）の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は培養条件により多少変動するが、グリセロールキナーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に終了すれば良く、通常２０〜４８時間程度である。培地ｐＨは宿主微生物が生育し、グリセロールキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、通常好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
培養液より菌体を回収する方法は、通常、用いられる方法により行えば良く、例えば遠心分離、濾過などにより回収することができる。培養液中のグリセロールキナーゼが菌体外にに分泌される場合は、この菌体分離液を用いれば良く、下記の菌体破砕後の方法に準じてグリセロールキナーゼを分離・精製できる。グリセロールキナーゼが菌体内に存在する場合は、前述したような酵素的または物理的破砕方法により破砕抽出することができる。このようにして得られた粗酵素抽出液から例えば硫安沈殿によりグリセロールキナーゼ画分を回収する。この粗酵素液を通常、用いる精製方法、例えば半透膜を用いた透析やセファデックスＧ−２５（アマシャムバイオサイエンス社）ゲル濾過などにより脱塩を行うことができる。
この操作の後、例えばフェニルセファロースファーストフロー（アマシャムバイオサイエンス社）カラムクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファロースファーストフロー（アマシャムバイオサイエンス社）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し精製酵素標品を得ることができる。この精製酵素標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一なバンドを示す程度に純化されている。
本発明の製法により得られたグリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質は、以下に示す理化学的性質を有する。
（１）作用：グリセロール ＋ ＡＴＰ ←→ グリセロールー３―リン酸 ＋ ＡＤＰ
（２）至適ｐＨ：約１０．０
（３）至適温度：約５０℃（２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．９、５分反応）
（４）ｐＨ安定性：約６．０−１０．０（２５℃で２０時間処理後も９０％以上の残存活性を 示す範囲）
（５）熱安定性：約４５℃以下（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で１５分処理後も９０％以上の残存活性を示す範囲）
（６）分子量：約５５，０００（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）、約１７６，０００（ゲル濾過）
（７）Ｋｍ値：約６．９×１０−６Ｍ（グリセロール）、約１．１１×１０−４Ｍ（ＡＴＰ）
（８）比活性：約４１．２Ｕ／ｍｇ
（９）５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で１００ｍｇ／Ｌ ＭＩＴと共存させた場合の活性残存率は４℃×１週間保存ではほぼ１００％（図５）、２５℃×１週間保存で約９２％（図６）であった。
（１）作用：グリセロール ＋ ＡＴＰ ←→ グリセロールー３―リン酸 ＋ ＡＤＰ
（２）至適ｐＨ：約１０．０
（３）至適温度：約５０℃（２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．９、５分反応）
（４）ｐＨ安定性：約６．０−１０．０（２５℃で２０時間処理後も９０％以上の残存活性を 示す範囲）
（５）熱安定性：約４５℃以下（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で１５分処理後も９０％以上の残存活性を示す範囲）
（６）分子量：約５５，０００（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）、約１７６，０００（ゲル濾過）
（７）Ｋｍ値：約６．９×１０−６Ｍ（グリセロール）、約１．１１×１０−４Ｍ（ＡＴＰ）
（８）比活性：約４１．２Ｕ／ｍｇ
（９）５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で１００ｍｇ／Ｌ ＭＩＴと共存させた場合の活性残存率は４℃×１週間保存ではほぼ１００％（図５）、２５℃×１週間保存で約９２％（図６）であった。
本発明のグリセロールキナーゼは、特にその存在形態を問わない。必要に応じ凍結乾燥、液状及びその他いずれの状態であってもよい。凍結乾燥の場合はさらに適当な賦形剤・安定化剤などを添加されていてもよい。液状では、さらに適当な緩衝液および／またはその他の成分などを添加されていてもよい。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例中、グリセロールキナーゼの活性は、以下のようにして測定した。ＡＴＰはオリエンタル酵母社より購入した。牛血清アルブミンはシグマアルドリッチ社より購入した。グリセロールー３−リン酸酸化酵素（コード番号Ｇ３Ｏ−３０１）、ペルオキシダーゼ（コード番号ＰＥＯ−３０１）は東洋紡績製を使用した。その他の試薬はナカライテスクより購入したものを使用した。
実施例中、グリセロールキナーゼの活性は、以下のようにして測定した。ＡＴＰはオリエンタル酵母社より購入した。牛血清アルブミンはシグマアルドリッチ社より購入した。グリセロールー３−リン酸酸化酵素（コード番号Ｇ３Ｏ−３０１）、ペルオキシダーゼ（コード番号ＰＥＯ−３０１）は東洋紡績製を使用した。その他の試薬はナカライテスクより購入したものを使用した。
＜測定法１：レートアッセイによるグリセロールキナーゼ活性を測定する方法＞
通常、この方法を用いて活性測定を行った。
グリセロールを基質とし、グリセロール−３−リン酸の生成量によって酵素活性を測定した。０．５％４―アミノアンチピリン水溶液０．２ｍｌ、１．５％フェノール水溶液０．２ｍｌ、グリセロールー３―リン酸酸化酵素２００Ｕ、ペルオキシダーゼ８０Ｕ、ＡＴＰ４８．４ｍｇに０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．９）を加え、総量２１ｍｌとし、これを以下の測定のための原液とした。各反応は、この測定原液を３ｍｌ取り、０．３Ｍグリセロール水溶液５０μｌ、酵素溶液１００μｌを添加し、混和後、３７℃に制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光度を３分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求めた（ΔＯＤｔｅｓｔ）。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液（０．２％牛血清アルブミンを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７．５）を１００μｌ加え上記同様に操作を行って１分間当りの吸光度変化量を求めた（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。
得られた吸光度変化量より下記計算式に基づきグリセロールキナーゼの酵素活性を算出した。なお上記条件下で１分間に１マイクロモルのグリセロールをリン酸化する酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
計算式
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．１５（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛１３．３×１／２×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）｝
３．１５ｍｌ＝反応混液液量
１３．３＝キノン色素の上記測定条件下でのミリモル吸光係数
１／２＝酵素反応で生成した過酸化水素の１分子から形成するキノン色素が１／２分子であることによる係数
１．０ｃｍ＝セルの光路長
０．１ｍｌ＝酵素サンプル液量
通常、この方法を用いて活性測定を行った。
グリセロールを基質とし、グリセロール−３−リン酸の生成量によって酵素活性を測定した。０．５％４―アミノアンチピリン水溶液０．２ｍｌ、１．５％フェノール水溶液０．２ｍｌ、グリセロールー３―リン酸酸化酵素２００Ｕ、ペルオキシダーゼ８０Ｕ、ＡＴＰ４８．４ｍｇに０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．９）を加え、総量２１ｍｌとし、これを以下の測定のための原液とした。各反応は、この測定原液を３ｍｌ取り、０．３Ｍグリセロール水溶液５０μｌ、酵素溶液１００μｌを添加し、混和後、３７℃に制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光度を３分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求めた（ΔＯＤｔｅｓｔ）。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液（０．２％牛血清アルブミンを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７．５）を１００μｌ加え上記同様に操作を行って１分間当りの吸光度変化量を求めた（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。
得られた吸光度変化量より下記計算式に基づきグリセロールキナーゼの酵素活性を算出した。なお上記条件下で１分間に１マイクロモルのグリセロールをリン酸化する酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
計算式
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．１５（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛１３．３×１／２×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）｝
３．１５ｍｌ＝反応混液液量
１３．３＝キノン色素の上記測定条件下でのミリモル吸光係数
１／２＝酵素反応で生成した過酸化水素の１分子から形成するキノン色素が１／２分子であることによる係数
１．０ｃｍ＝セルの光路長
０．１ｍｌ＝酵素サンプル液量
＜測定法２：至適温度を測定する方法＞
酵素の至適温度を見るためにこの方法を用いた。
３ｍｌの活性反応液（４ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ 塩化マグネシウムを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．９）を試験管に分注し、適当な濃度（測定法１の活性でおよそ１Ｕ／ｍｌ）に希釈したグリセロールキナーゼ溶液０．１ｍｌを加え、良く混合した後、各反応温度で約３分間予備加温する。次いで０．３Ｍのグリセロール水溶液を０．０５ｍｌ添加混合して反応を開始する。正確に１０分間反応させた後、１ｍｌの１Ｎ塩酸を添加して酵素反応を停止する。この反応停止液０．１５ｍｌを３ｍｌの発色液（０．０１％ ４アミノアンチピリン、０．０２％ フェノール、５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ、１６Ｕ／ｍｌ グリセロールー３−リン酸オキシダーゼを含む０．２ＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．９）に添加・混合し、３７℃で約５分間反応させ、５００ｎｍでの吸光度を測定した。この時、１ｍＭ Ｌ−グリセロールー３−リン酸溶液の吸光度も同時に求めて、各酵素反応により生じたＬ−グリセロールー３−リン酸の量を求めた。なお、盲検はグリセロールキナーゼ溶液の代わりに酵素希釈液を用いて各反応温度での酵素反応によらない非特異的なＬ−グリセロールー３−リン酸の生成を求めた。
酵素の至適温度を見るためにこの方法を用いた。
３ｍｌの活性反応液（４ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ 塩化マグネシウムを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．９）を試験管に分注し、適当な濃度（測定法１の活性でおよそ１Ｕ／ｍｌ）に希釈したグリセロールキナーゼ溶液０．１ｍｌを加え、良く混合した後、各反応温度で約３分間予備加温する。次いで０．３Ｍのグリセロール水溶液を０．０５ｍｌ添加混合して反応を開始する。正確に１０分間反応させた後、１ｍｌの１Ｎ塩酸を添加して酵素反応を停止する。この反応停止液０．１５ｍｌを３ｍｌの発色液（０．０１％ ４アミノアンチピリン、０．０２％ フェノール、５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ、１６Ｕ／ｍｌ グリセロールー３−リン酸オキシダーゼを含む０．２ＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．９）に添加・混合し、３７℃で約５分間反応させ、５００ｎｍでの吸光度を測定した。この時、１ｍＭ Ｌ−グリセロールー３−リン酸溶液の吸光度も同時に求めて、各酵素反応により生じたＬ−グリセロールー３−リン酸の量を求めた。なお、盲検はグリセロールキナーゼ溶液の代わりに酵素希釈液を用いて各反応温度での酵素反応によらない非特異的なＬ−グリセロールー３−リン酸の生成を求めた。
＜測定法３：至適ｐＨを測定する方法＞
酵素の至適ｐＨを見るためにこの方法を用いた。
３ｍｌの活性反応液（４ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ 塩化マグネシウムを含む５０ｍＭ濃度の各ｐＨ緩衝液）を試験管に分注し、適当な濃度（測定法１の活性でおよそ１Ｕ／ｍｌ）に希釈したグリセロールキナーゼ溶液０．１ｍｌを加え、良く混合した後、３７℃で約３分間予備加温する。次いで０．３Ｍのグリセロール水溶液を０．０５ｍｌ添加混合して反応を開始する。正確に１０分間反応させた後、１ｍｌの１Ｎ塩酸を添加して酵素反応を停止する。この反応停止液０．１５ｍｌを３ｍｌの発色液（０．０１％ ４アミノアンチピリン、０．０２％ フェノール、５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ、１６Ｕ／ｍｌ グリセロールー３−リン酸オキシダーゼを含む０．２ＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．９）に添加・混合し、３７℃で約５分間反応させ、５００ｎｍでの吸光度を測定した。この時、１ｍＭ Ｌ−グリセロールー３−リン酸溶液の吸光度も同時に求めて、各酵素反応により生じたＬ−グリセロールー３−リン酸の量を求めた。なお、盲検はグリセロールキナーゼ溶液の代わりに酵素希釈液を用いて各ｐＨの緩衝液での酵素反応によらない非特異的なＬ−グリセロールー３−リン酸の生成を求めた。
酵素の至適ｐＨを見るためにこの方法を用いた。
３ｍｌの活性反応液（４ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ 塩化マグネシウムを含む５０ｍＭ濃度の各ｐＨ緩衝液）を試験管に分注し、適当な濃度（測定法１の活性でおよそ１Ｕ／ｍｌ）に希釈したグリセロールキナーゼ溶液０．１ｍｌを加え、良く混合した後、３７℃で約３分間予備加温する。次いで０．３Ｍのグリセロール水溶液を０．０５ｍｌ添加混合して反応を開始する。正確に１０分間反応させた後、１ｍｌの１Ｎ塩酸を添加して酵素反応を停止する。この反応停止液０．１５ｍｌを３ｍｌの発色液（０．０１％ ４アミノアンチピリン、０．０２％ フェノール、５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ、１６Ｕ／ｍｌ グリセロールー３−リン酸オキシダーゼを含む０．２ＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．９）に添加・混合し、３７℃で約５分間反応させ、５００ｎｍでの吸光度を測定した。この時、１ｍＭ Ｌ−グリセロールー３−リン酸溶液の吸光度も同時に求めて、各酵素反応により生じたＬ−グリセロールー３−リン酸の量を求めた。なお、盲検はグリセロールキナーゼ溶液の代わりに酵素希釈液を用いて各ｐＨの緩衝液での酵素反応によらない非特異的なＬ−グリセロールー３−リン酸の生成を求めた。
［参考例］
セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）からのグリセロールキナーゼの精製
セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）を６０ｍｌのＬＢ液体培地（５００ｍｌ容坂口フラスコ）に１白金耳植菌し３０℃で一晩振とう培養した。本培養液を６Ｌのグリセロールキナーゼ生産培地（１０Ｌ−ジャーファーメンター、２％グリセロール、２％ポリペプトン（日本製薬製）、０．２％酵母エキス（オリエンタル酵母社製）、０．２％ＮａＣｌ、０．０２％硫酸マグネシウム、０．７％リン酸２カリウム、ｐＨ７．３）に全量植菌し３５℃にて約２０時間通気攪拌培養した。この時のグリセロールキナーゼの培地あたりの生産量は凡そ３Ｕ／ｍｌであった。
本培養液より遠心分離により菌体を回収し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５に懸濁後、ダイノミル破砕機を用いたガラスビーズ破砕によりグリセロールキナーゼを抽出し粗酵素液とした。この粗酵素液より硫安を添加し３５−５５％飽和度画分を回収した。この塩析画分をセファデックスＧ−２５（アマシャムバイオサイエンス社）ゲル濾過により脱塩した後、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社）カラムクロマトグラフィー、フェニルセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社）カラムクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２５ゲル濾過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィーに順次供して精製酵素標品を得た。上記精製結果を表１に示した。
セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）からのグリセロールキナーゼの精製
セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）を６０ｍｌのＬＢ液体培地（５００ｍｌ容坂口フラスコ）に１白金耳植菌し３０℃で一晩振とう培養した。本培養液を６Ｌのグリセロールキナーゼ生産培地（１０Ｌ−ジャーファーメンター、２％グリセロール、２％ポリペプトン（日本製薬製）、０．２％酵母エキス（オリエンタル酵母社製）、０．２％ＮａＣｌ、０．０２％硫酸マグネシウム、０．７％リン酸２カリウム、ｐＨ７．３）に全量植菌し３５℃にて約２０時間通気攪拌培養した。この時のグリセロールキナーゼの培地あたりの生産量は凡そ３Ｕ／ｍｌであった。
本培養液より遠心分離により菌体を回収し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５に懸濁後、ダイノミル破砕機を用いたガラスビーズ破砕によりグリセロールキナーゼを抽出し粗酵素液とした。この粗酵素液より硫安を添加し３５−５５％飽和度画分を回収した。この塩析画分をセファデックスＧ−２５（アマシャムバイオサイエンス社）ゲル濾過により脱塩した後、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社）カラムクロマトグラフィー、フェニルセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社）カラムクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２５ゲル濾過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィーに順次供して精製酵素標品を得た。上記精製結果を表１に示した。
上記方法により精製した蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ均一なバンドを示しその比活性は凡そ４０．９Ｕ／ｍｇ−タンパクであった。なお、蛋白質濃度は酵素溶液の２８０ｎｍでの吸光度が１Ａｂｓの時１ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度になるとしてし概算した。
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥより推定されるサブユニットの分子量は約５５，０００であった。更に、そのＮ末端アミノ酸配列をエドマン分解法を原理としたアミノ酸配列解析装置により解析した結果、Ｎ末端からの配列はＡｌａ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒａ−Ｉｌｅと同定された。
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥより推定されるサブユニットの分子量は約５５，０００であった。更に、そのＮ末端アミノ酸配列をエドマン分解法を原理としたアミノ酸配列解析装置により解析した結果、Ｎ末端からの配列はＡｌａ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒａ−Ｉｌｅと同定された。
［実施例１］
セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）からの染色体ＤＮＡの分離
セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌株をＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管；１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１白金耳植菌し、３０℃にて一晩振とう培養した。この菌体１ｍｌ分から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により菌体を回収した。回収した菌体よりＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｇｅｎｏｍ−キット（東洋紡績製）を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体ＤＮＡを抽出した。１ｍｌの菌体より約２０μｇの染色体ＤＮＡを取得できた。
セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）からの染色体ＤＮＡの分離
セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌株をＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管；１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１白金耳植菌し、３０℃にて一晩振とう培養した。この菌体１ｍｌ分から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により菌体を回収した。回収した菌体よりＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｇｅｎｏｍ−キット（東洋紡績製）を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体ＤＮＡを抽出した。１ｍｌの菌体より約２０μｇの染色体ＤＮＡを取得できた。
［実施例２］ ＰＣＲによるグリセロールキナーゼ遺伝子の増幅
ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）用プライマーは、現在クローニングの報告がされているエシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）、バチルス・ズブリルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のグリセロールキナーゼの塩基配列を基にして作製した。配列表・配列番号３、配列表・配列番号４に記載される塩基配列はＰＣＲ用プライマーを示す。実施例１で得たＤＮＡ１００ｎｇ、各プライマー２００ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合物１０μｌ、反応緩衝液１０μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー製）２．５Ｕを混和し１００μｌとした。これを９４℃、１分間の変性反応、４５℃、１分間のアニーリング反応、および７２℃、３分間の伸長反応を３０サイクル繰り返してＰＣＲを行った。その結果、目的の大きさである約８００ｂｐのフラグメントが増幅された。このＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、推定されるアミノ酸配列をシュードモナス アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のグリセロールキナーゼのアミノ配列と比較したところ、高い相同性を示したので、目的のグリセロールキナーゼ遺伝子の一部が増幅されたことが明らかとなった。
ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）用プライマーは、現在クローニングの報告がされているエシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）、バチルス・ズブリルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のグリセロールキナーゼの塩基配列を基にして作製した。配列表・配列番号３、配列表・配列番号４に記載される塩基配列はＰＣＲ用プライマーを示す。実施例１で得たＤＮＡ１００ｎｇ、各プライマー２００ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合物１０μｌ、反応緩衝液１０μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー製）２．５Ｕを混和し１００μｌとした。これを９４℃、１分間の変性反応、４５℃、１分間のアニーリング反応、および７２℃、３分間の伸長反応を３０サイクル繰り返してＰＣＲを行った。その結果、目的の大きさである約８００ｂｐのフラグメントが増幅された。このＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、推定されるアミノ酸配列をシュードモナス アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のグリセロールキナーゼのアミノ配列と比較したところ、高い相同性を示したので、目的のグリセロールキナーゼ遺伝子の一部が増幅されたことが明らかとなった。
［実施例３］ グリセロールキナーゼ遺伝子全長のクローニング
実施例１で取得した染色体ＤＮＡ約２μｇを種々の制限酵素で消化後、０．７％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを、実施例２で得たＰＣＲ産物をプローブとしＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、試薬に添付されたプロトコールに準じてサザンハイブリダイゼーションによりグリセロールキナーゼ遺伝子の断片をスクリーニングした。その結果、グリセロールキナーゼ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片はＫｐｎＩ（東洋紡績製）とＮｏｔＩ（東洋紡績製）により切断された約６．５ｋｂの断片として検出された。
次いでこのＤＮＡ断片をＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キット（東洋紡績製）を用いて、取扱説明書に記載された手順によりアガロースゲルより回収した。一方０．５μｇのｐｕＣＢＭ２１（ベーリンガーマンハイム社）を同じくＫｐｎＩとＮｏｔＩで切断し、バクテリアルアルカリホスファターゼ（東洋紡績製）にて脱リン酸化処理した。その後、両ＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキット（東洋紡績製）にて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒアコリーＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡績製）を形質転換した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃，終夜培養して形質転換体を取得した。なおこの組換えベクターはｐＣＧＫ１と命名した。
実施例１で取得した染色体ＤＮＡ約２μｇを種々の制限酵素で消化後、０．７％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを、実施例２で得たＰＣＲ産物をプローブとしＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、試薬に添付されたプロトコールに準じてサザンハイブリダイゼーションによりグリセロールキナーゼ遺伝子の断片をスクリーニングした。その結果、グリセロールキナーゼ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片はＫｐｎＩ（東洋紡績製）とＮｏｔＩ（東洋紡績製）により切断された約６．５ｋｂの断片として検出された。
次いでこのＤＮＡ断片をＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キット（東洋紡績製）を用いて、取扱説明書に記載された手順によりアガロースゲルより回収した。一方０．５μｇのｐｕＣＢＭ２１（ベーリンガーマンハイム社）を同じくＫｐｎＩとＮｏｔＩで切断し、バクテリアルアルカリホスファターゼ（東洋紡績製）にて脱リン酸化処理した。その後、両ＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキット（東洋紡績製）にて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒアコリーＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡績製）を形質転換した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃，終夜培養して形質転換体を取得した。なおこの組換えベクターはｐＣＧＫ１と命名した。
［実施例４］ グリセロールキナーゼ酵素遺伝子の塩基配列決定
ｐＣＧＫ１にクローニングされたグリセロールキナーゼ遺伝子の塩基配列はｐＵＣ系ベクターの汎用シークエンシング用プライマーを用い、ビッグダイターミネーターサイクルシーケンシングＦＳレディーリアクションキット（アプライドバイオシステムズ社製）及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー社製）により挿入ＤＮＡの両端よりＤＮＡ配列を決定した。更にこの確認した配列を基に更にプライマーを作成しプライマーウォーキングにより挿入ＤＮＡ配列の全長を決定した。
決定したグリセロールキナーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームに該当するＤＮＡ配列及びＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号２に示した。またＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列の内、第２残基目のＡｌａを含む７残基分の配列が精製酵素のアミノ酸配列解析により得られた結果と完全に一致していた。また開始コドンのメチオニンを除いた推定アミノ酸配列より算出されるグリセロールキナーゼの分子量は５５１４２であり、セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）から精製された酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析より求められた分子量と良く一致した。
ｐＣＧＫ１にクローニングされたグリセロールキナーゼ遺伝子の塩基配列はｐＵＣ系ベクターの汎用シークエンシング用プライマーを用い、ビッグダイターミネーターサイクルシーケンシングＦＳレディーリアクションキット（アプライドバイオシステムズ社製）及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー社製）により挿入ＤＮＡの両端よりＤＮＡ配列を決定した。更にこの確認した配列を基に更にプライマーを作成しプライマーウォーキングにより挿入ＤＮＡ配列の全長を決定した。
決定したグリセロールキナーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームに該当するＤＮＡ配列及びＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号２に示した。またＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列の内、第２残基目のＡｌａを含む７残基分の配列が精製酵素のアミノ酸配列解析により得られた結果と完全に一致していた。また開始コドンのメチオニンを除いた推定アミノ酸配列より算出されるグリセロールキナーゼの分子量は５５１４２であり、セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）から精製された酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析より求められた分子量と良く一致した。
［実施例５］ グリセロール欠損宿主の造成
ＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されているエシェリヒア・コリー（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来グリセロールキナーゼの塩基配列より配列表・配列番号５及び配列表・配列番号６のプライマーを作成した。またエシェリヒア・コリー（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｋ１２株の染色体ＤＮＡは実施例１と同様の方法により取得した。
この染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、各プライマー２００ｐｍｏｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ混合物１０μｌ、反応緩衝液１０μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー製）２．５Ｕを混和し１００μｌとした。これを９４℃、３分間の変性反応、９８℃、３０秒間の変性反応、６８℃、３分間のアニーリング＋伸長反応を４１サイクル繰り返し、次いで９８℃、３０秒間の変性反応、６８℃、３分間のアニーリング＋伸長反応、７２℃、１０分間の伸長反応を１サイクルしてＰＣＲを行った。この結果目的遺伝子と同じ約１．５ｋｂのＰＣＲ産物を取得した。
このＰＣＲ産物をＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キットを用いて、取扱説明書に記載された手順により精製した後、約０．２μｇのＰＣＲ産物と制限酵素ＳｍａＩで切断した０．５μｇのｐＵＣ１９とをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキットにて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒアコリーＪＭ１０９（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃，終夜培養して形質転換体を取得した。なおこの組換えベクターはｐＵＣＧＫと命名した。
このｐＵＣＧＫを制限酵素ＢｓｔＥＩＩ（東洋紡績製）で切断し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈハイキット（東洋紡績製）を用いて取扱い説明書に記載された手順で切断末端を平滑化した。一方、ｐＵＣＫ４（アマシャムバイオサイエンス社製）をＨｉｎｃＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動でカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離後、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キットを用いて精製回収した。この両断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキットにて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒアコリーＪＭ１０９（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンをを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃，終夜培養して形質転換体を取得した。この組換えベクターはｐＵＣＧＫｍと命名した。更にこのｐＵＣＧＫｍを制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡績製）とＳａｌＩ（東洋紡績製）で切断し、アガロースゲル電気泳動でグリセロールキナーゼ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子を含む断片を分離後、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キットを用いて精製回収した。一方温度感受性プラスミドｐＣＨ０２（ｐＳＣ１０１プラスミドからの誘導体；Ｓ．Ｍａｔｓｕｙａｍａら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１７５，３３１（１９８４））もＥｃｏＲＩ（東洋紡績製）とＳａｌＩ（東洋紡績製）で切断しグリセロールキナーゼ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子を含む断片とＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキットにて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒア・コリーＫ−１２株（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ−１２）をジーン・パルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により形質転換した。なお、エレクトロポレーションの条件はジーンパルサーの使用マニュアルのエシェリヒア・コリーの条件に従った。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンをを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃，終夜培養して形質転換体を取得した。
この形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／２０ｍｌ試験管）に植菌し、３７℃にて２４時間振とう培養した。この培養液を更に新たなカナマイシンを含むＬＢ液体培地に植え継ぐことを４回繰返した。この培養液を滅菌した生理食塩水で希釈した後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布してシングルコロニーを分離した後、アンピシリン感受性でかつカナマイシン耐性のコロニーを分離しエシェリヒア・コリーＫＭ１株（Ｅ． ｃｏｌｉ ＫＭ１）とした。
このエシェリヒア・コリーＫＭ１株（Ｅ． ｃｏｌｉ ＫＭ１）を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むトレフィックブロス（５ｍｌ仕込み／２０ｍｌ試験管；１．２％ポリペプトン、２．４％酵母エキス、０．５％グリセロール、０．２３１％リン酸１カリウム、１．２５４％リン酸２カリウム）に植菌し、３７℃で２４時間振とう培養した後、１ｍｌの培養液から遠心分離により菌体を回収し、１ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５に懸濁した。この懸濁液を超音波破砕機により菌体を破砕し、遠心分離の後の上清を粗酵素としてグリセロールキナーゼの活性を測定したが有意な酵素活性は検出されなかった。
ＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されているエシェリヒア・コリー（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来グリセロールキナーゼの塩基配列より配列表・配列番号５及び配列表・配列番号６のプライマーを作成した。またエシェリヒア・コリー（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｋ１２株の染色体ＤＮＡは実施例１と同様の方法により取得した。
この染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、各プライマー２００ｐｍｏｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ混合物１０μｌ、反応緩衝液１０μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー製）２．５Ｕを混和し１００μｌとした。これを９４℃、３分間の変性反応、９８℃、３０秒間の変性反応、６８℃、３分間のアニーリング＋伸長反応を４１サイクル繰り返し、次いで９８℃、３０秒間の変性反応、６８℃、３分間のアニーリング＋伸長反応、７２℃、１０分間の伸長反応を１サイクルしてＰＣＲを行った。この結果目的遺伝子と同じ約１．５ｋｂのＰＣＲ産物を取得した。
このＰＣＲ産物をＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キットを用いて、取扱説明書に記載された手順により精製した後、約０．２μｇのＰＣＲ産物と制限酵素ＳｍａＩで切断した０．５μｇのｐＵＣ１９とをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキットにて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒアコリーＪＭ１０９（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃，終夜培養して形質転換体を取得した。なおこの組換えベクターはｐＵＣＧＫと命名した。
このｐＵＣＧＫを制限酵素ＢｓｔＥＩＩ（東洋紡績製）で切断し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈハイキット（東洋紡績製）を用いて取扱い説明書に記載された手順で切断末端を平滑化した。一方、ｐＵＣＫ４（アマシャムバイオサイエンス社製）をＨｉｎｃＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動でカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離後、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キットを用いて精製回収した。この両断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキットにて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒアコリーＪＭ１０９（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンをを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃，終夜培養して形質転換体を取得した。この組換えベクターはｐＵＣＧＫｍと命名した。更にこのｐＵＣＧＫｍを制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡績製）とＳａｌＩ（東洋紡績製）で切断し、アガロースゲル電気泳動でグリセロールキナーゼ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子を含む断片を分離後、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キットを用いて精製回収した。一方温度感受性プラスミドｐＣＨ０２（ｐＳＣ１０１プラスミドからの誘導体；Ｓ．Ｍａｔｓｕｙａｍａら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１７５，３３１（１９８４））もＥｃｏＲＩ（東洋紡績製）とＳａｌＩ（東洋紡績製）で切断しグリセロールキナーゼ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子を含む断片とＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキットにて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒア・コリーＫ−１２株（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ−１２）をジーン・パルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により形質転換した。なお、エレクトロポレーションの条件はジーンパルサーの使用マニュアルのエシェリヒア・コリーの条件に従った。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンをを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃，終夜培養して形質転換体を取得した。
この形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／２０ｍｌ試験管）に植菌し、３７℃にて２４時間振とう培養した。この培養液を更に新たなカナマイシンを含むＬＢ液体培地に植え継ぐことを４回繰返した。この培養液を滅菌した生理食塩水で希釈した後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布してシングルコロニーを分離した後、アンピシリン感受性でかつカナマイシン耐性のコロニーを分離しエシェリヒア・コリーＫＭ１株（Ｅ． ｃｏｌｉ ＫＭ１）とした。
このエシェリヒア・コリーＫＭ１株（Ｅ． ｃｏｌｉ ＫＭ１）を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むトレフィックブロス（５ｍｌ仕込み／２０ｍｌ試験管；１．２％ポリペプトン、２．４％酵母エキス、０．５％グリセロール、０．２３１％リン酸１カリウム、１．２５４％リン酸２カリウム）に植菌し、３７℃で２４時間振とう培養した後、１ｍｌの培養液から遠心分離により菌体を回収し、１ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５に懸濁した。この懸濁液を超音波破砕機により菌体を破砕し、遠心分離の後の上清を粗酵素としてグリセロールキナーゼの活性を測定したが有意な酵素活性は検出されなかった。
［実施例６］ グリセロールキナーゼ発現ベクターｐＣＧＫ１２の構築
ｐＣＧＫ１を制限酵素ＮｃｏＩ（東洋紡績製）とＮｏｔＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動によりグリセロールキナーゼ遺伝子を含む約２ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。次いでこのＤＮＡ断片をＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キットを用いて、取扱説明書に記載された手順によりアガロースゲルより回収した。一方０．５μｇのｐＳＥ３８０（インビトロゲン社製）を同じくＮｃｏＩとＮｏｔＩで切断し、バクテリアルアルカリホスファターゼ（東洋紡績製）にて脱リン酸化処理した。その後、両ＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキットにて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９株（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）のコンピテントセル（東洋紡績製）を形質転換した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃，終夜培養して形質転換体を取得した。なおこの組換えベクターはｐＣＧＫ１２と命名した。
次いでｐＣＧＫ１２により形質転換されたエシェリヒア・コリーＪＭ１０９株（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（５ｍｌ／３０ｍｌ試験管仕込み）に植菌し、３７℃で終夜振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−キット（東洋紡績製）を用いてｐＣＧＫ１２を精製した。５ｍｌの菌体より約２０μｇの精製ｐｌａｓｍｉｄを得た。
更にこのｐＣＧＫ１２を０．０５μｇ／μｌ濃度に調整し、実施例５で取得したグリセロールキナーゼ欠損株であるエシェリヒア・コリーＫＭ１株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＭ１）を宿主とし、ジーン・パルサーを用いたエレクトロポレーション法によりｐＣＧＫ１２を導入した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地で選択し、３０℃終夜培養で２種の抗生物質に対して同時に耐性を示すコロニーを形質転換体として選抜した。この時の形質転換効率はおよそ１×１０６ｃｆｕ／μｇ−ＤＮＡであった。
なお、本形質転換体であるエシェリヒア・コリーＫＭ１（ｐＣＧＫ１２）株（E.coli KM1(pCGK12)）は独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに微生物寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９９２として平成１４（２００２）年９月３日に寄託した。
ｐＣＧＫ１を制限酵素ＮｃｏＩ（東洋紡績製）とＮｏｔＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動によりグリセロールキナーゼ遺伝子を含む約２ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。次いでこのＤＮＡ断片をＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キットを用いて、取扱説明書に記載された手順によりアガロースゲルより回収した。一方０．５μｇのｐＳＥ３８０（インビトロゲン社製）を同じくＮｃｏＩとＮｏｔＩで切断し、バクテリアルアルカリホスファターゼ（東洋紡績製）にて脱リン酸化処理した。その後、両ＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキットにて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９株（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）のコンピテントセル（東洋紡績製）を形質転換した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃，終夜培養して形質転換体を取得した。なおこの組換えベクターはｐＣＧＫ１２と命名した。
次いでｐＣＧＫ１２により形質転換されたエシェリヒア・コリーＪＭ１０９株（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（５ｍｌ／３０ｍｌ試験管仕込み）に植菌し、３７℃で終夜振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−キット（東洋紡績製）を用いてｐＣＧＫ１２を精製した。５ｍｌの菌体より約２０μｇの精製ｐｌａｓｍｉｄを得た。
更にこのｐＣＧＫ１２を０．０５μｇ／μｌ濃度に調整し、実施例５で取得したグリセロールキナーゼ欠損株であるエシェリヒア・コリーＫＭ１株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＭ１）を宿主とし、ジーン・パルサーを用いたエレクトロポレーション法によりｐＣＧＫ１２を導入した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地で選択し、３０℃終夜培養で２種の抗生物質に対して同時に耐性を示すコロニーを形質転換体として選抜した。この時の形質転換効率はおよそ１×１０６ｃｆｕ／μｇ−ＤＮＡであった。
なお、本形質転換体であるエシェリヒア・コリーＫＭ１（ｐＣＧＫ１２）株（E.coli KM1(pCGK12)）は独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに微生物寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９９２として平成１４（２００２）年９月３日に寄託した。
［実施例７］組換えグリセロールキナーゼの発現及び精製酵素の取得
実施例６で得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（５ｍｌ仕込み／２０ｍｌ試験管）に１白金耳植菌し３０℃で一晩振とう培養を行い種培養液とした。この培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１Ｌのトレフィックブロス（１本当り２５０ｍｌ仕込み／２Ｌ容坂口フラスコ）に１％植菌し３７℃にて２０時間振とう培養を実施した。培養終了時のグリセロールキナーゼ活性は培養液１ｍｌ当り約６．８Ｕ／ｍｌであった。
この培養液より遠心分離により菌体を回収後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５に菌体を懸濁し、フレンチプレスにより菌体を破砕した。次いで菌体破砕液に０．１ＭになるようＮａＣｌを溶解し、更に５％ポリエチレンイミン水溶液を対液０．５％添加し遠心分離により不溶物を除去して粗酵素液とした。
次いで、該粗酵素液に６０％飽和度になるよう硫安塩析を行い、沈殿物を遠心分離により回収した後５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５にて再溶解した。更にセファデックスＧ−２５（アマシャムバイオサイエンス社製）ゲル濾過により脱塩した後、ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムにアプライし、０．２Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、０．２Ｍ〜０．６Ｍ ＮａＣｌのリニアグラジェントにより溶出した。
更にこのグリセロールキナーゼ活性画分を集め、２０％飽和度になるよう硫安を添加し、不溶物を遠心分離により除去した。この酵素液を２０％飽和度硫安を含んだ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で緩衝化したＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムにアプライし、同緩衝液で洗浄した後、２０％〜０％飽和度硫安のリニアグラジェントにより溶出した。このグリセロールキナーゼ活性画分を回収し、セファデックスＧ−２５ゲル濾過により脱塩して精製酵素標品とした。上記精製結果を表２に示した。
上記方法により精製した蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ均一なバンドを示しその比活性は凡そ４１．２Ｕ／ｍｇ−タンパクであった。蛋白質濃度は参考例１と同様に概算した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥより推定されるサブユニットの分子量は約５５，０００であり、ＴＳＫ−Ｇ３０００ ＳＷ（直径７．６ｍｍ、高さ３０ｃｍ、東ソー（株）製）ゲル濾過によるネイティブ酵素の分子量は約１７６，０００であった。
実施例６で得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（５ｍｌ仕込み／２０ｍｌ試験管）に１白金耳植菌し３０℃で一晩振とう培養を行い種培養液とした。この培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１Ｌのトレフィックブロス（１本当り２５０ｍｌ仕込み／２Ｌ容坂口フラスコ）に１％植菌し３７℃にて２０時間振とう培養を実施した。培養終了時のグリセロールキナーゼ活性は培養液１ｍｌ当り約６．８Ｕ／ｍｌであった。
この培養液より遠心分離により菌体を回収後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５に菌体を懸濁し、フレンチプレスにより菌体を破砕した。次いで菌体破砕液に０．１ＭになるようＮａＣｌを溶解し、更に５％ポリエチレンイミン水溶液を対液０．５％添加し遠心分離により不溶物を除去して粗酵素液とした。
次いで、該粗酵素液に６０％飽和度になるよう硫安塩析を行い、沈殿物を遠心分離により回収した後５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５にて再溶解した。更にセファデックスＧ−２５（アマシャムバイオサイエンス社製）ゲル濾過により脱塩した後、ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムにアプライし、０．２Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、０．２Ｍ〜０．６Ｍ ＮａＣｌのリニアグラジェントにより溶出した。
更にこのグリセロールキナーゼ活性画分を集め、２０％飽和度になるよう硫安を添加し、不溶物を遠心分離により除去した。この酵素液を２０％飽和度硫安を含んだ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で緩衝化したＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムにアプライし、同緩衝液で洗浄した後、２０％〜０％飽和度硫安のリニアグラジェントにより溶出した。このグリセロールキナーゼ活性画分を回収し、セファデックスＧ−２５ゲル濾過により脱塩して精製酵素標品とした。上記精製結果を表２に示した。
上記方法により精製した蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ均一なバンドを示しその比活性は凡そ４１．２Ｕ／ｍｇ−タンパクであった。蛋白質濃度は参考例１と同様に概算した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥより推定されるサブユニットの分子量は約５５，０００であり、ＴＳＫ−Ｇ３０００ ＳＷ（直径７．６ｍｍ、高さ３０ｃｍ、東ソー（株）製）ゲル濾過によるネイティブ酵素の分子量は約１７６，０００であった。
上記方法により得られたグリセロールキナーゼは下記特性を有していた。
（１）作用：下記の反応を触媒した。
グリセロール ＋ ＡＴＰ ←→ グリセロールー３―リン酸 ＋ ＡＤＰ
（２）作用ｐＨ：反応ｐＨと相対活性との関係を図１に示した。
至適ｐＨは約１０．０であった。
（３）作用温度：反応温度と相対活性との関係を図２に示した。
至適温度：約５０℃（２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．９、５分反応）
（４）ｐＨ安定性：ｐＨ安定性を図３に示した。
約６．０〜１０．０（２５℃で２０時間後も９０％以上の残存活性を示す範囲）で安定であった。
（５）熱安定性：熱安定性を図４に示した。
約４５℃以下（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で１５分間処理後も９０％以上の残存活性を示す範囲）で安定であった。
（６）分子量：約５５，０００（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）、約１７６，０００（ゲル濾過）
（７）Ｋｍ値：約６．９×１０−６Ｍ（グリセロール）、約１．１１×１０−４Ｍ（ＡＴＰ）グリセロール及びＡＴＰに対するＫｍ値はグリセロールキナーゼの活性測定法＜測定法１＞に記載の方法に準拠し、グリセロールまたはＡＴＰの濃度を変更して各基質濃度でのグリセロールキナーゼ活性を測定し、ラインウィーバー バークの式（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｅｑｕａｔｉｏｎ）よりＫｍ値を算出した。
（８）比活性：約４１．２Ｕ／ｍｇ
（９）防腐剤存在耐性：５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で１００ｍｇ／Ｌ ＭＩＴと共存させた場合の活性残存率を図５及び図６に示した。活性測定は、測定法１で行った。
４℃×１週間保存ではほぼ１００％、２５℃×１週間保存でも約９２％の活性残存率であった。その他の防腐剤と共存させた場合の活性残存率も合わせて示した。
尚、比較対象の他起源グリセロールキナーゼはサーマス・フラーバス（Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ；東洋紡績製）以外はシグマアルドリッチジャパン社より購入した。また使用した防腐剤の内Ｎ−メチルイソチアゾロン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ、略号ＭＩＴ）とイミダゾリヂニルウレア（Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｙｌｕｒｅａ、略号ＩＺＵ）はロッシュダイアグノステッィク社より購入し、プロクリン１５０（ＰｒｏＣｌｉｎ １５０）とプロクリン３００（ＰｒｏＣｌｉｎ ３００）はシグマアルドリッチジャパン社より購入した。
本発明のグリセロールキナーゼは２５℃、１週間保存でも９０％以上の活性残存率を示した。
また比較例として図７にサーマス・フラーバス（Ｔ． ｆｌａｖｕｓ）との熱安定性比較を図７に示した。サーマス・フラーバス（Ｔ． ｆｌａｖｕｓ）由来グリセロールキナーゼが本発明に比べ明らかに高い熱安定性を有するにも関わらず、本発明のグリセロールキナーゼの方が防腐剤共存下の安定性が高い事が示されており、本発明のグリセロールキナーゼが防腐剤に対して優れた耐性能を有する事が示された。
（１）作用：下記の反応を触媒した。
グリセロール ＋ ＡＴＰ ←→ グリセロールー３―リン酸 ＋ ＡＤＰ
（２）作用ｐＨ：反応ｐＨと相対活性との関係を図１に示した。
至適ｐＨは約１０．０であった。
（３）作用温度：反応温度と相対活性との関係を図２に示した。
至適温度：約５０℃（２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．９、５分反応）
（４）ｐＨ安定性：ｐＨ安定性を図３に示した。
約６．０〜１０．０（２５℃で２０時間後も９０％以上の残存活性を示す範囲）で安定であった。
（５）熱安定性：熱安定性を図４に示した。
約４５℃以下（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で１５分間処理後も９０％以上の残存活性を示す範囲）で安定であった。
（６）分子量：約５５，０００（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）、約１７６，０００（ゲル濾過）
（７）Ｋｍ値：約６．９×１０−６Ｍ（グリセロール）、約１．１１×１０−４Ｍ（ＡＴＰ）グリセロール及びＡＴＰに対するＫｍ値はグリセロールキナーゼの活性測定法＜測定法１＞に記載の方法に準拠し、グリセロールまたはＡＴＰの濃度を変更して各基質濃度でのグリセロールキナーゼ活性を測定し、ラインウィーバー バークの式（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｅｑｕａｔｉｏｎ）よりＫｍ値を算出した。
（８）比活性：約４１．２Ｕ／ｍｇ
（９）防腐剤存在耐性：５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で１００ｍｇ／Ｌ ＭＩＴと共存させた場合の活性残存率を図５及び図６に示した。活性測定は、測定法１で行った。
４℃×１週間保存ではほぼ１００％、２５℃×１週間保存でも約９２％の活性残存率であった。その他の防腐剤と共存させた場合の活性残存率も合わせて示した。
尚、比較対象の他起源グリセロールキナーゼはサーマス・フラーバス（Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ；東洋紡績製）以外はシグマアルドリッチジャパン社より購入した。また使用した防腐剤の内Ｎ−メチルイソチアゾロン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ、略号ＭＩＴ）とイミダゾリヂニルウレア（Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｙｌｕｒｅａ、略号ＩＺＵ）はロッシュダイアグノステッィク社より購入し、プロクリン１５０（ＰｒｏＣｌｉｎ １５０）とプロクリン３００（ＰｒｏＣｌｉｎ ３００）はシグマアルドリッチジャパン社より購入した。
本発明のグリセロールキナーゼは２５℃、１週間保存でも９０％以上の活性残存率を示した。
また比較例として図７にサーマス・フラーバス（Ｔ． ｆｌａｖｕｓ）との熱安定性比較を図７に示した。サーマス・フラーバス（Ｔ． ｆｌａｖｕｓ）由来グリセロールキナーゼが本発明に比べ明らかに高い熱安定性を有するにも関わらず、本発明のグリセロールキナーゼの方が防腐剤共存下の安定性が高い事が示されており、本発明のグリセロールキナーゼが防腐剤に対して優れた耐性能を有する事が示された。
本発明のグリセロールキナーゼは、防腐剤に対して高い耐性を有し、液状検査薬中での安定性に優れる等の特性を持つため、臨床検査分野で用いられる酵素として優れており、産業界に寄与することが大である。
Claims (1)
- 下記の（１）〜（３）に示す工程を含む中性脂肪（トリグリセリド）の測定において、下記の（４）〜（８）のいずれかで示されるグリセロールキナーゼを用いる事を特徴とする、中性脂肪測定における下記の（ａ）〜（ｃ）からなる群で示される物質のうちいずれかに対する耐性を向上する方法。
（１）試料中の中性脂肪をリパーゼで加水分解しグリセロールを得る工程
（２）グリセロールをグリセロールキナーゼによってグリセロール−３−リン酸に変換する工程
（３）グリセロールー３−リン酸を、グリセロール−３−リン酸酸化酵素を用いた比色定量法やグリセロールー３−リン酸脱水素酵素を用いた紫外部吸収定量法などにより、定量する工程
（４）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（５）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質
（６）配列表・配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡによりコードされ、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質
（７）配列表・配列番号２に記載される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が付加、欠失または置換された塩基配列からなるＤＮＡによりコードされ、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質
（８）配列表・配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、
または、該塩基配列において１もしくは数個の塩基が付加、欠失または置換された塩基配列からなるＤＮＡ、
または、配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるグリセロールキナーゼをコードするＤＮＡ、
または、配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であるグリセロールキナーゼをコードするＤＮＡを、
宿主・ベクター系に適用し、得られた形質転換体を培養して得られたタンパク質であり、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質
（ａ）１００ｍｇ／ＬのＮ−メチルイソチアゾロン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ）および／またはその誘導体
（ｂ）０．８ｍｌ／Ｌのプロクリン（ＰｒｏＣｌｉｎ）（登録商標）１５０（５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、および、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）および／またはその誘導体
（ｃ）０．３ｍｌ／Ｌのプロクリン（登録商標）３００（５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、および、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）および／またはその誘導体）
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