JPH03151879A - リポプロテインリパーゼの遺伝情報を有するｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物由来のリポプロティンリパーゼをコー
ドする遺伝子のＤＮＡ配列に関する。

〔従来技術〕

リボプロティンリパーゼ（以下、ＬＰＬと略する）は生
体中のカイロミクロン、その他の低比重りボタンバク質
のトリグリセライドを加水分解する特殊なトリアジルグ
リセロ−プロティンアシルハイドロラーゼ（ＥＣ３，１
，１，３４）である、当該酵素は、その効率的な加水分
解に、例えばプロテアーゼ等の助力を必要とするいわゆ
るリパーゼ（トリアジルグリセロールアシルハイドロラ
ーゼ。

ＥＣ，３，１，１，３）と区別されている。

従来、ＬＰＬはシュードモナス属やクロモバクテリウム
属等の微生物や人、マウス、牛等の哺乳類に存在するこ
とが知られており、特に微生物由来のＬＰＬが工業的に
製造されている（特公昭６３−３５９４号公報）。

ＬＰＬは特に臨床検査分野において、血清又はその他の
試料中のトリグリセライドの定量に広く利用されている
。しかしながら、ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配
列については人（Ｓｃｉｅｎｃｅｌ　１６３８〜１６４
１（１９８７））　、マウス（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　　ｚ旦２エ　８４６３　〜８４６６（１９
８７））　　、　牛（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、　Ｕ、　４３６９
〜４３７３（１９Ｂ？））等哺乳類のものについては知
られているが、微生物由来のものに関しては全く知られ
ていなかった。

なお、シュードモナスフラジが生産する、いわゆるリパ
ーゼについては、すでにＤＮＡ配列が知られているが（
Ｂｉｏｃｈｅｓ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃ
ｏａｎｕｎ。

Ｌ４ＬＬ１８５〜１９０（１９８６）　、特開昭６４−
７４９９２号公報）これらは上記したように明らかに本
発明とは異なる酵素である。

（発明が解決しようとする！ｉｏ） 本発明の課題は、遺伝子工学的手法によりＬＰＬを効率
良く生産したり、ＬＰＬの構造を明らかにするための、
微生物由来のＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を
提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記の課題を解決するため、微生物由来
のＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列について検討
した。そして、ＬＰＬ生産菌の有するＬＰＬ遺伝子をク
ローニングし、該遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ると
ともに該遺伝子のＤＮＡ配列を決定することに成功し、
さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は微生物由来のＬＰＬをコードする遺
伝子のＤＮＡ配列に関するものである。

本発明のＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列は一義
的には決まらず、多種存在する可能性があり得る。この
ことは、よく知られているように、多くのアミノ酸にお
いて、それをコードする遺伝子のＤＮＡ配列が複数存在
することからも当然のことである０本発明者等により明
らかにされたＬＰＬのアミノ酸配列をコードする遺伝子
の場合も、そのＤＮＡ配列は天然の遺伝子の塩基配列以
外にも多数の可能性があり、本発明のＤＮＡ配列は、天
然の−ＤＮＡ配列のみに限定されるものではなく、本発
明により明らかにされたＬＰＬのアミノ酸配列をコード
する他のＤＮＡ配列も含むものである。

さらに遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡ
特定の部位に、該ＤＮＡがコードするものの基本的な特
性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する
ように、人為的に変異を起こすことができる０本発明に
より提供される天然の塩基配列を有するＤＮＡあるいは
天然のものとは異なる塩基配列を有するＤＮＡに関して
も同様に人為的に挿入、欠失、置換を行うことにより天
然の遺伝子を同等あるいは改善された特性とすることが
可能であり、本発明はそのような変異遺伝子をも当然に
含むものである。

本発明においてＬＰＬをコードする遺伝子は、シュード
モナス属に属する微生物由来のものであることか好まし
い。

また、本発明におけるＤＮＡ配列は下記のアミノ酸配列
をコードするものであることが好適である。

ＡＰＰＴＴＩＶＳＡＰＡＶＲ？ＷＡＷ さらに、本発明におけるＤＮＡ配列は下記のＤＮＡ配列
を有するものであることが好適である。

以下、本発明を実施するための各ステップについて詳細
に説明する。

（ａ）ＬＰＬをコードする遺伝子を有するＤＮＡ断片及
び組み換えベクターの調製 本発明に用いられる組み換えベクターは、例えばエシェ
リヒア属に属する微生物の培養された細胞内での複製能
を有するベクターＤＮＡに、ＬＰＬ生産能を有する微生
物から調製されたＬＰＬをコードする遺伝子を有するＤ
ＮＡ断片を組み込んでなるものである。

かかるものの好適な例としては、以下の如くして調製さ
れたものが例示される。すなわち、シュードモナスＰＳ
−２１（微工研菌寄第７０２６号）を栄養培地で培養し
、培養物を得る。この培養物を、例えば５．００Ｏｒｐ
ｍ以上、好ましくは８゜０００〜１０．００Ｏｒｐｍで
５分以上、好ましくは１０〜１５分間遠心分離してシュ
ードモナスＰＳ−２１の菌体を得る。

この菌体より、例えばＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＯＮＡ
　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｓ、　Ｒ，
Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　Ａｄｄｉｓｏｎ−ＷｅｓｌｅｙＰ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８３）記載
の方法、あるいはＫｏｉｚｕｍｉ　Ｊ、らの方法（Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ、　Ｂｉｏｅｎｇｘ　」ム７２１〜７２８．
１９８５）等により染色体ＤＮＡを得ることができる。

この染色体ＤＮＡにＢａｍ１ｌｌ、ＥｃｏＲＩ、５ａｕ
３ＡＩ、　（東洋紡製）等の制限酵素を用いて、部分分
解又は完全分解することにより、種々の大きさの染色体
ＤＮＡ断片混合物を得る。

このようにして得られたＤＮＡ断片混合物から、例えば
シｇ糖密度勾配遠心分離等により低分子量のＤＮＡ断片
を除き、さらにエタノール沈澱法等の濃縮手段により濃
縮し、ＬＰＬをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片
混合物を得る。

一方、本発明に用いるベクターＤＮＡとしては、如何な
るものでもよく、例えばプラスミドヘクターＤＮＡ、バ
クテリオファージベクターＤＮＡ等が挙げられるが、好
適な例としてはプラスミドベクターｐＢＲ３２２，ｐυ
Ｃ１９（東洋紡製）、バクテリオファージベクターＥＭ
ＢＬ３．λＺＡＰ　（ＳＴｌ？ＡＴＡｌｌｉＥＮＥ製）
等が挙げられる。

次に、上記ベクターＤＮＡに上記のようにして得たＬＰ
Ｌをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物を連
結する。連結には、例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ、
−ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）等、好ましくはＴ、−Ｄ
ＮＡリガーゼを４〜３７℃、好マシ＜は４〜１６°ｃ−
ｔ’酵素１〜１ｏＯユニット１時間以上、好ましくは４
〜１６時間作用させて組み換えＤＮＡを得る。

この組み換えＤＮＡを用いて、例えばＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ
１２、好ましくはＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　Ｈ８１（１１株、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｐ２３９２株
、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＸＬＩ−ｂｌｕｅ株（ＳＴＲＡＴＡＧ
ＥＮＥ）等を形質転換あるいは形質導入して、それぞれ
の菌体を得る。この形質転換及び形質導入は、例えばＭ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓ
　Ｔ、　ｅｔ　ａｔ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　）ｌａ
ｒｂｏｒ、１９８２）記載の方法により行うことができ
る。

（ｂ）ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を存した
組み換えプラスミドの調製 上記菌株よりのＬＰＬをコードする遺伝子を含有する組
み換えＤＮＡの検索は、公知のハイブリダイゼーション
による方法、抗ＬＰＬ抗体を用いる方法、ハロー形成等
によるＬＰＬ活性を検出する方法等いずれの方法でも行
うことができる。

さらに上記組み換えＤＮＡ中のＬＰＬをコードする遺伝
子を含有するＤＮＡ断片を常法に従い小断片化して上記
プラスミドベクターＤＮＡと連結し、ＬＰＬをコードす
る遺伝子のＤＮＡ配列を存した組み換えプラスミドを得
ることができる。

（Ｃ）ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列の決定 上記ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を有した組
み換えプラスミドよりＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮ
Ａ配列を決定するには、公知の方法、例えばＳａｎｇｅ
ｒ等によるｄｉｄｅｏｘｙ法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、　、７１．５４６３
〜５４６７、１９７７）を用いて決定することができる
。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

（１）シュードモナスＰＳ−２１の染色体ＤＮＡの調製 シュードモナスｐｓ−２１（微工研菌寄第７０２６号）
をＬＢ培地（ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５
％、塩化ナトリウム１．０％、ｐ　Ｈ７，４）　１００
ｄに接種し、３０″Ｃで８時間振盪培養して培養物を得
た。この培養物を１２．００Ｏｒｐｍ、１０分間遠心分
離して湿菌体約１ｇを得た後、該菌体からＲｅｃｏ＋１
ｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｒｏｄ
ｒｉｑｕｅｚ　Ｒ，Ｌ。

ｅｔ　ａｌ、　Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ　Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８３）記載の方
法により染色体ＤＮＡｖ１１．８ｍｇを調製した０次に
、この染色体ＤＮＡ　１００μｇを制限酵素ＭｂｏＩ（
宝酒造社製）で常法に従い部分分解し、５〜２０％シｇ
糖密度勾配遠心分離を行って７〜２３Ｋｂ画分のＤＮＡ
断片約１０μｇを調製した。

（２）ＬＰＬをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片
及び該ＤＮＡ断片を有する組み換えベクターの調製 バクテリオファージベクターＥＭＢ　Ｌ　３　（Ｂ　ａ
ｍＨＩ切断済、５ＴＲＡＴＡＣＥＮＥ製）　ｔμｇと上
記（１）で得られたＤＮＡ断片０．５μｇをＴ。

−ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）１ユニツトで１６℃、１
２時間反応させＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはλ
ＤＮＡインビトロパンケージングキットＧｉｇａｐａｃ
ｋ　Ｇｏｌｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いてパッ
ケージングした。パッケージングにより得られた組み換
えファージはＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓＴ、ｅｔ　ａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ、　１９８２）記載の方法でＥ、
ｃｏｌｉ　Ｐ２３９２（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）に形
質導入した。使用ＤＮＡ断片０当たり、約ｌＸｌ０’個
のファージプラークが得られた。

（３）ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を有した
組み換えプラスミドの調製 ＬＰＬをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片を有す
る組み換えファージの検索はプラーク・ハイブリダイゼ
ーションにより行った。すなわち、シュードモナスＰＳ
−２１生産のＬＰＬのアミノ酸配列より２１ｍａ　ｒの
ミックスプローブを作成し、Ｔ４−ポリヌクレオチドキ
ナーゼとγ−５２ｐＡＴＰを用いてアイソトープラベル
してＤＮＡプローブとした。常法に従いプラーク・ハイ
ブリダイゼーシッンを行ったところ、上記ファージプラ
ーク１０００個当たり、２〜３個の陽性シグナルが得ら
れた。

陽性シグナルを示す組み換えファージ１種を純化し、常
法に従ってファージＤＮＡを調製したところ、約１５Ｋ
ｂｐのＤＮＡが挿入されていた（第１図参照〕。

次いで、この１５Ｋｂｐの挿入ＤＮＡを種々の制限酵素
で切断してｐＵｃ１９にサブクローニングし、ＬＰＬを
コードする遺伝子のＤＮＡ配列を含有する組み換えプラ
スミド５ｕｂｃｌｏｎｅ　Ａを得た。

５ｕｂｃｌｏｎｅ　Ａの挿入ＤＮＡ約４．３　Ｋ　ｂは
種々の制限酵素により特徴付けられた（第１図参照）。

（４）ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列の決定 上記（３）の５ｕｂｃｌｏｎｅ　Ａをさらに種々の制限
酵素で切断して小断片化し、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　”Ｄ
ＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ　（東洋紡製）を
用いて塩基配列の決定を行った。その結果、第２図に示
すようなオーブンリーディングフレームの存在が認めら
れた。

オーブンリーディングフレームの塩基配列及びアミノ酸
配列を第２図に示した。なお、このオーブンリーディン
グフレーム中には、シュードモナスＰＳ−２１の生産す
るＬＰＬのＮ末端アミノ酸配列と相同配列が存在しく第
２図下部）、ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列で
あることが確認された。

〔発明の効果〕

本発明はＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を提供
するものであり、このＤＮＡ配列により、ＬＰＬの効率
的生産やＬＰＬの構造解析等が可能になると期待される
。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラーク・ハイブリダイゼーションで陽性シグ
ナルを示す組み換えファージの挿入ＤＮＡの制限酵素地
図及び５ｕｂｃｌｏｎｅ　Ａ挿入ＤＮＡの制限酵素地図
を示す。 第２図はシュードモナスＰＳ−２１由来ＬＰＬをコード
する遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するＤＮＡ配列を示す
、尚、下部はシュードモナスＰＳＳ−２１の生産するＬ
ＰＬのＮ末端アミノ酸配列と相同配列部位を示す。 第２図 ＡＶＩＩＩＩＩＡ１１

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物由来のリボプロテインリパーゼをコードす
   る遺伝子のＤＮＡ配列。
2. （２）微生物がシュードモナス属に属する微生物である
   請求項１記載のＤＮＡ配列。
3. （３）下記のアミノ酸配列をコードする請求項１又は２
   記載のＤＮＡ配列。 【遺伝子配列があります。】
4. （４）下記のＤＮＡ配列を有する請求項１又は２記載の
   ＤＮＡ配列。 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】