JPH03151879A - リポプロテインリパーゼの遺伝情報を有するdna配列 - Google Patents
リポプロテインリパーゼの遺伝情報を有するdna配列Info
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- JPH03151879A JPH03151879A JP29320089A JP29320089A JPH03151879A JP H03151879 A JPH03151879 A JP H03151879A JP 29320089 A JP29320089 A JP 29320089A JP 29320089 A JP29320089 A JP 29320089A JP H03151879 A JPH03151879 A JP H03151879A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、微生物由来のリポプロティンリパーゼをコー
ドする遺伝子のDNA配列に関する。
ドする遺伝子のDNA配列に関する。
リボプロティンリパーゼ(以下、LPLと略する)は生
体中のカイロミクロン、その他の低比重りボタンバク質
のトリグリセライドを加水分解する特殊なトリアジルグ
リセロ−プロティンアシルハイドロラーゼ(EC3,1
,1,34)である、当該酵素は、その効率的な加水分
解に、例えばプロテアーゼ等の助力を必要とするいわゆ
るリパーゼ(トリアジルグリセロールアシルハイドロラ
ーゼ。
体中のカイロミクロン、その他の低比重りボタンバク質
のトリグリセライドを加水分解する特殊なトリアジルグ
リセロ−プロティンアシルハイドロラーゼ(EC3,1
,1,34)である、当該酵素は、その効率的な加水分
解に、例えばプロテアーゼ等の助力を必要とするいわゆ
るリパーゼ(トリアジルグリセロールアシルハイドロラ
ーゼ。
EC,3,1,1,3)と区別されている。
従来、LPLはシュードモナス属やクロモバクテリウム
属等の微生物や人、マウス、牛等の哺乳類に存在するこ
とが知られており、特に微生物由来のLPLが工業的に
製造されている(特公昭63−3594号公報)。
属等の微生物や人、マウス、牛等の哺乳類に存在するこ
とが知られており、特に微生物由来のLPLが工業的に
製造されている(特公昭63−3594号公報)。
LPLは特に臨床検査分野において、血清又はその他の
試料中のトリグリセライドの定量に広く利用されている
。しかしながら、LPLをコードする遺伝子のDNA配
列については人(Sciencel 1638〜164
1(1987)) 、マウス(J、 Biol。
試料中のトリグリセライドの定量に広く利用されている
。しかしながら、LPLをコードする遺伝子のDNA配
列については人(Sciencel 1638〜164
1(1987)) 、マウス(J、 Biol。
Chew、 z旦2エ 8463 〜8466(19
87)) 、 牛(Proc、 Natl。
87)) 、 牛(Proc、 Natl。
Acad、 Sci、 U、S、^、 U、 4369
〜4373(19B?))等哺乳類のものについては知
られているが、微生物由来のものに関しては全く知られ
ていなかった。
〜4373(19B?))等哺乳類のものについては知
られているが、微生物由来のものに関しては全く知られ
ていなかった。
なお、シュードモナスフラジが生産する、いわゆるリパ
ーゼについては、すでにDNA配列が知られているが(
Bioches+、 Biophys、 Res、 C
oanun。
ーゼについては、すでにDNA配列が知られているが(
Bioches+、 Biophys、 Res、 C
oanun。
L4LL185〜190(1986) 、特開昭64−
74992号公報)これらは上記したように明らかに本
発明とは異なる酵素である。
74992号公報)これらは上記したように明らかに本
発明とは異なる酵素である。
(発明が解決しようとする!io)
本発明の課題は、遺伝子工学的手法によりLPLを効率
良く生産したり、LPLの構造を明らかにするための、
微生物由来のLPLをコードする遺伝子のDNA配列を
提供することにある。
良く生産したり、LPLの構造を明らかにするための、
微生物由来のLPLをコードする遺伝子のDNA配列を
提供することにある。
本発明者らは、上記の課題を解決するため、微生物由来
のLPLをコードする遺伝子のDNA配列について検討
した。そして、LPL生産菌の有するLPL遺伝子をク
ローニングし、該遺伝子を含有するDNA断片を得ると
ともに該遺伝子のDNA配列を決定することに成功し、
さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
のLPLをコードする遺伝子のDNA配列について検討
した。そして、LPL生産菌の有するLPL遺伝子をク
ローニングし、該遺伝子を含有するDNA断片を得ると
ともに該遺伝子のDNA配列を決定することに成功し、
さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は微生物由来のLPLをコードする遺
伝子のDNA配列に関するものである。
伝子のDNA配列に関するものである。
本発明のLPLをコードする遺伝子のDNA配列は一義
的には決まらず、多種存在する可能性があり得る。この
ことは、よく知られているように、多くのアミノ酸にお
いて、それをコードする遺伝子のDNA配列が複数存在
することからも当然のことである0本発明者等により明
らかにされたLPLのアミノ酸配列をコードする遺伝子
の場合も、そのDNA配列は天然の遺伝子の塩基配列以
外にも多数の可能性があり、本発明のDNA配列は、天
然の−DNA配列のみに限定されるものではなく、本発
明により明らかにされたLPLのアミノ酸配列をコード
する他のDNA配列も含むものである。
的には決まらず、多種存在する可能性があり得る。この
ことは、よく知られているように、多くのアミノ酸にお
いて、それをコードする遺伝子のDNA配列が複数存在
することからも当然のことである0本発明者等により明
らかにされたLPLのアミノ酸配列をコードする遺伝子
の場合も、そのDNA配列は天然の遺伝子の塩基配列以
外にも多数の可能性があり、本発明のDNA配列は、天
然の−DNA配列のみに限定されるものではなく、本発
明により明らかにされたLPLのアミノ酸配列をコード
する他のDNA配列も含むものである。
さらに遺伝子組み換え技術によれば、基本となるDNA
特定の部位に、該DNAがコードするものの基本的な特
性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する
ように、人為的に変異を起こすことができる0本発明に
より提供される天然の塩基配列を有するDNAあるいは
天然のものとは異なる塩基配列を有するDNAに関して
も同様に人為的に挿入、欠失、置換を行うことにより天
然の遺伝子を同等あるいは改善された特性とすることが
可能であり、本発明はそのような変異遺伝子をも当然に
含むものである。
特定の部位に、該DNAがコードするものの基本的な特
性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する
ように、人為的に変異を起こすことができる0本発明に
より提供される天然の塩基配列を有するDNAあるいは
天然のものとは異なる塩基配列を有するDNAに関して
も同様に人為的に挿入、欠失、置換を行うことにより天
然の遺伝子を同等あるいは改善された特性とすることが
可能であり、本発明はそのような変異遺伝子をも当然に
含むものである。
本発明においてLPLをコードする遺伝子は、シュード
モナス属に属する微生物由来のものであることか好まし
い。
モナス属に属する微生物由来のものであることか好まし
い。
また、本発明におけるDNA配列は下記のアミノ酸配列
をコードするものであることが好適である。
をコードするものであることが好適である。
APPTTIVSAPAVR?WAW
さらに、本発明におけるDNA配列は下記のDNA配列
を有するものであることが好適である。
を有するものであることが好適である。
以下、本発明を実施するための各ステップについて詳細
に説明する。
に説明する。
(a)LPLをコードする遺伝子を有するDNA断片及
び組み換えベクターの調製 本発明に用いられる組み換えベクターは、例えばエシェ
リヒア属に属する微生物の培養された細胞内での複製能
を有するベクターDNAに、LPL生産能を有する微生
物から調製されたLPLをコードする遺伝子を有するD
NA断片を組み込んでなるものである。
び組み換えベクターの調製 本発明に用いられる組み換えベクターは、例えばエシェ
リヒア属に属する微生物の培養された細胞内での複製能
を有するベクターDNAに、LPL生産能を有する微生
物から調製されたLPLをコードする遺伝子を有するD
NA断片を組み込んでなるものである。
かかるものの好適な例としては、以下の如くして調製さ
れたものが例示される。すなわち、シュードモナスPS
−21(微工研菌寄第7026号)を栄養培地で培養し
、培養物を得る。この培養物を、例えば5.00Orp
m以上、好ましくは8゜000〜10.00Orpmで
5分以上、好ましくは10〜15分間遠心分離してシュ
ードモナスPS−21の菌体を得る。
れたものが例示される。すなわち、シュードモナスPS
−21(微工研菌寄第7026号)を栄養培地で培養し
、培養物を得る。この培養物を、例えば5.00Orp
m以上、好ましくは8゜000〜10.00Orpmで
5分以上、好ましくは10〜15分間遠心分離してシュ
ードモナスPS−21の菌体を得る。
この菌体より、例えばRecombinant ONA
Techniques(Rodriques、 R,
L、 et al、 Addison−WesleyP
ublishing Company、1983)記載
の方法、あるいはKoizumi J、らの方法(Bi
otech、 Bioengx 」ム721〜728.
1985)等により染色体DNAを得ることができる。
Techniques(Rodriques、 R,
L、 et al、 Addison−WesleyP
ublishing Company、1983)記載
の方法、あるいはKoizumi J、らの方法(Bi
otech、 Bioengx 」ム721〜728.
1985)等により染色体DNAを得ることができる。
この染色体DNAにBam1ll、EcoRI、5au
3AI、 (東洋紡製)等の制限酵素を用いて、部分分
解又は完全分解することにより、種々の大きさの染色体
DNA断片混合物を得る。
3AI、 (東洋紡製)等の制限酵素を用いて、部分分
解又は完全分解することにより、種々の大きさの染色体
DNA断片混合物を得る。
このようにして得られたDNA断片混合物から、例えば
シg糖密度勾配遠心分離等により低分子量のDNA断片
を除き、さらにエタノール沈澱法等の濃縮手段により濃
縮し、LPLをコードする遺伝子を含有するDNA断片
混合物を得る。
シg糖密度勾配遠心分離等により低分子量のDNA断片
を除き、さらにエタノール沈澱法等の濃縮手段により濃
縮し、LPLをコードする遺伝子を含有するDNA断片
混合物を得る。
一方、本発明に用いるベクターDNAとしては、如何な
るものでもよく、例えばプラスミドヘクターDNA、バ
クテリオファージベクターDNA等が挙げられるが、好
適な例としてはプラスミドベクターpBR322,pυ
C19(東洋紡製)、バクテリオファージベクターEM
BL3.λZAP (STl?ATAlliENE製)
等が挙げられる。
るものでもよく、例えばプラスミドヘクターDNA、バ
クテリオファージベクターDNA等が挙げられるが、好
適な例としてはプラスミドベクターpBR322,pυ
C19(東洋紡製)、バクテリオファージベクターEM
BL3.λZAP (STl?ATAlliENE製)
等が挙げられる。
次に、上記ベクターDNAに上記のようにして得たLP
Lをコードする遺伝子を含有するDNA断片混合物を連
結する。連結には、例えば大腸菌DNAリガーゼ、T、
−DNAリガーゼ(東洋紡製)等、好ましくはT、−D
NAリガーゼを4〜37℃、好マシ<は4〜16°c−
t’酵素1〜1oOユニット1時間以上、好ましくは4
〜16時間作用させて組み換えDNAを得る。
Lをコードする遺伝子を含有するDNA断片混合物を連
結する。連結には、例えば大腸菌DNAリガーゼ、T、
−DNAリガーゼ(東洋紡製)等、好ましくはT、−D
NAリガーゼを4〜37℃、好マシ<は4〜16°c−
t’酵素1〜1oOユニット1時間以上、好ましくは4
〜16時間作用させて組み換えDNAを得る。
この組み換えDNAを用いて、例えばE、coli K
12、好ましくはE、coli JM109株、E、c
oli H81(11株、E、coli P2392株
、E、coli XLI−blue株(STRATAG
ENE)等を形質転換あるいは形質導入して、それぞれ
の菌体を得る。この形質転換及び形質導入は、例えばM
o1ecular Cloning(Maniatis
T、 et at、 ColdSpring )la
rbor、1982)記載の方法により行うことができ
る。
12、好ましくはE、coli JM109株、E、c
oli H81(11株、E、coli P2392株
、E、coli XLI−blue株(STRATAG
ENE)等を形質転換あるいは形質導入して、それぞれ
の菌体を得る。この形質転換及び形質導入は、例えばM
o1ecular Cloning(Maniatis
T、 et at、 ColdSpring )la
rbor、1982)記載の方法により行うことができ
る。
(b)LPLをコードする遺伝子のDNA配列を存した
組み換えプラスミドの調製 上記菌株よりのLPLをコードする遺伝子を含有する組
み換えDNAの検索は、公知のハイブリダイゼーション
による方法、抗LPL抗体を用いる方法、ハロー形成等
によるLPL活性を検出する方法等いずれの方法でも行
うことができる。
組み換えプラスミドの調製 上記菌株よりのLPLをコードする遺伝子を含有する組
み換えDNAの検索は、公知のハイブリダイゼーション
による方法、抗LPL抗体を用いる方法、ハロー形成等
によるLPL活性を検出する方法等いずれの方法でも行
うことができる。
さらに上記組み換えDNA中のLPLをコードする遺伝
子を含有するDNA断片を常法に従い小断片化して上記
プラスミドベクターDNAと連結し、LPLをコードす
る遺伝子のDNA配列を存した組み換えプラスミドを得
ることができる。
子を含有するDNA断片を常法に従い小断片化して上記
プラスミドベクターDNAと連結し、LPLをコードす
る遺伝子のDNA配列を存した組み換えプラスミドを得
ることができる。
(C)LPLをコードする遺伝子のDNA配列の決定
上記LPLをコードする遺伝子のDNA配列を有した組
み換えプラスミドよりLPLをコードする遺伝子のDN
A配列を決定するには、公知の方法、例えばSange
r等によるdideoxy法(Proc、 Natl。
み換えプラスミドよりLPLをコードする遺伝子のDN
A配列を決定するには、公知の方法、例えばSange
r等によるdideoxy法(Proc、 Natl。
Acad、 Sci、υ、S、A、 、71.5463
〜5467、1977)を用いて決定することができる
。
〜5467、1977)を用いて決定することができる
。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
(1)シュードモナスPS−21の染色体DNAの調製
シュードモナスps−21(微工研菌寄第7026号)
をLB培地(ポリペプトン1.0%、酵母エキス0.5
%、塩化ナトリウム1.0%、p H7,4) 100
dに接種し、30″Cで8時間振盪培養して培養物を得
た。この培養物を12.00Orpm、10分間遠心分
離して湿菌体約1gを得た後、該菌体からReco+1
binant DNA Techniques(Rod
riquez R,L。
をLB培地(ポリペプトン1.0%、酵母エキス0.5
%、塩化ナトリウム1.0%、p H7,4) 100
dに接種し、30″Cで8時間振盪培養して培養物を得
た。この培養物を12.00Orpm、10分間遠心分
離して湿菌体約1gを得た後、該菌体からReco+1
binant DNA Techniques(Rod
riquez R,L。
et al、 Addison−Wesley Pub
lishing Company、1983)記載の方
法により染色体DNAv11.8mgを調製した0次に
、この染色体DNA 100μgを制限酵素MboI(
宝酒造社製)で常法に従い部分分解し、5〜20%シg
糖密度勾配遠心分離を行って7〜23Kb画分のDNA
断片約10μgを調製した。
lishing Company、1983)記載の方
法により染色体DNAv11.8mgを調製した0次に
、この染色体DNA 100μgを制限酵素MboI(
宝酒造社製)で常法に従い部分分解し、5〜20%シg
糖密度勾配遠心分離を行って7〜23Kb画分のDNA
断片約10μgを調製した。
(2)LPLをコードする遺伝子を含有するDNA断片
及び該DNA断片を有する組み換えベクターの調製 バクテリオファージベクターEMB L 3 (B a
mHI切断済、5TRATACENE製) tμgと上
記(1)で得られたDNA断片0.5μgをT。
及び該DNA断片を有する組み換えベクターの調製 バクテリオファージベクターEMB L 3 (B a
mHI切断済、5TRATACENE製) tμgと上
記(1)で得られたDNA断片0.5μgをT。
−DNAリガーゼ(東洋紡製)1ユニツトで16℃、1
2時間反応させDNAを連結した。連結したDNAはλ
DNAインビトロパンケージングキットGigapac
k Gold(STRATAGENE製)を用いてパッ
ケージングした。パッケージングにより得られた組み換
えファージはMo1ecular Cloning(M
aniatisT、et al、 Co1d Spri
ng Harbor、 1982)記載の方法でE、
coli P2392(STRATAGENE製)に形
質導入した。使用DNA断片0当たり、約lXl0’個
のファージプラークが得られた。
2時間反応させDNAを連結した。連結したDNAはλ
DNAインビトロパンケージングキットGigapac
k Gold(STRATAGENE製)を用いてパッ
ケージングした。パッケージングにより得られた組み換
えファージはMo1ecular Cloning(M
aniatisT、et al、 Co1d Spri
ng Harbor、 1982)記載の方法でE、
coli P2392(STRATAGENE製)に形
質導入した。使用DNA断片0当たり、約lXl0’個
のファージプラークが得られた。
(3)LPLをコードする遺伝子のDNA配列を有した
組み換えプラスミドの調製 LPLをコードする遺伝子を含有するDNA断片を有す
る組み換えファージの検索はプラーク・ハイブリダイゼ
ーションにより行った。すなわち、シュードモナスPS
−21生産のLPLのアミノ酸配列より21ma rの
ミックスプローブを作成し、T4−ポリヌクレオチドキ
ナーゼとγ−52pATPを用いてアイソトープラベル
してDNAプローブとした。常法に従いプラーク・ハイ
ブリダイゼーシッンを行ったところ、上記ファージプラ
ーク1000個当たり、2〜3個の陽性シグナルが得ら
れた。
組み換えプラスミドの調製 LPLをコードする遺伝子を含有するDNA断片を有す
る組み換えファージの検索はプラーク・ハイブリダイゼ
ーションにより行った。すなわち、シュードモナスPS
−21生産のLPLのアミノ酸配列より21ma rの
ミックスプローブを作成し、T4−ポリヌクレオチドキ
ナーゼとγ−52pATPを用いてアイソトープラベル
してDNAプローブとした。常法に従いプラーク・ハイ
ブリダイゼーシッンを行ったところ、上記ファージプラ
ーク1000個当たり、2〜3個の陽性シグナルが得ら
れた。
陽性シグナルを示す組み換えファージ1種を純化し、常
法に従ってファージDNAを調製したところ、約15K
bpのDNAが挿入されていた(第1図参照〕。
法に従ってファージDNAを調製したところ、約15K
bpのDNAが挿入されていた(第1図参照〕。
次いで、この15Kbpの挿入DNAを種々の制限酵素
で切断してpUc19にサブクローニングし、LPLを
コードする遺伝子のDNA配列を含有する組み換えプラ
スミド5ubclone Aを得た。
で切断してpUc19にサブクローニングし、LPLを
コードする遺伝子のDNA配列を含有する組み換えプラ
スミド5ubclone Aを得た。
5ubclone Aの挿入DNA約4.3 K bは
種々の制限酵素により特徴付けられた(第1図参照)。
種々の制限酵素により特徴付けられた(第1図参照)。
(4)LPLをコードする遺伝子のDNA配列の決定
上記(3)の5ubclone Aをさらに種々の制限
酵素で切断して小断片化し、5equenase ”D
NA Sequencing Kit (東洋紡製)を
用いて塩基配列の決定を行った。その結果、第2図に示
すようなオーブンリーディングフレームの存在が認めら
れた。
酵素で切断して小断片化し、5equenase ”D
NA Sequencing Kit (東洋紡製)を
用いて塩基配列の決定を行った。その結果、第2図に示
すようなオーブンリーディングフレームの存在が認めら
れた。
オーブンリーディングフレームの塩基配列及びアミノ酸
配列を第2図に示した。なお、このオーブンリーディン
グフレーム中には、シュードモナスPS−21の生産す
るLPLのN末端アミノ酸配列と相同配列が存在しく第
2図下部)、LPLをコードする遺伝子のDNA配列で
あることが確認された。
配列を第2図に示した。なお、このオーブンリーディン
グフレーム中には、シュードモナスPS−21の生産す
るLPLのN末端アミノ酸配列と相同配列が存在しく第
2図下部)、LPLをコードする遺伝子のDNA配列で
あることが確認された。
本発明はLPLをコードする遺伝子のDNA配列を提供
するものであり、このDNA配列により、LPLの効率
的生産やLPLの構造解析等が可能になると期待される
。
するものであり、このDNA配列により、LPLの効率
的生産やLPLの構造解析等が可能になると期待される
。
第1図はプラーク・ハイブリダイゼーションで陽性シグ
ナルを示す組み換えファージの挿入DNAの制限酵素地
図及び5ubclone A挿入DNAの制限酵素地図
を示す。 第2図はシュードモナスPS−21由来LPLをコード
する遺伝子のDNA配列及び対応するDNA配列を示す
、尚、下部はシュードモナスPSS−21の生産するL
PLのN末端アミノ酸配列と相同配列部位を示す。 第2図 AVIIIIIA11
ナルを示す組み換えファージの挿入DNAの制限酵素地
図及び5ubclone A挿入DNAの制限酵素地図
を示す。 第2図はシュードモナスPS−21由来LPLをコード
する遺伝子のDNA配列及び対応するDNA配列を示す
、尚、下部はシュードモナスPSS−21の生産するL
PLのN末端アミノ酸配列と相同配列部位を示す。 第2図 AVIIIIIA11
Claims (4)
- (1)微生物由来のリボプロテインリパーゼをコードす
る遺伝子のDNA配列。 - (2)微生物がシュードモナス属に属する微生物である
請求項1記載のDNA配列。 - (3)下記のアミノ酸配列をコードする請求項1又は2
記載のDNA配列。 【遺伝子配列があります。】 - (4)下記のDNA配列を有する請求項1又は2記載の
DNA配列。 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP29320089A JPH03151879A (ja) | 1989-11-10 | 1989-11-10 | リポプロテインリパーゼの遺伝情報を有するdna配列 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP29320089A JPH03151879A (ja) | 1989-11-10 | 1989-11-10 | リポプロテインリパーゼの遺伝情報を有するdna配列 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03151879A true JPH03151879A (ja) | 1991-06-28 |
Family
ID=17791719
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP29320089A Pending JPH03151879A (ja) | 1989-11-10 | 1989-11-10 | リポプロテインリパーゼの遺伝情報を有するdna配列 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH03151879A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU718990B2 (en) * | 1996-05-22 | 2000-05-04 | Rohm Gmbh | Lysophospholipase produced from Aspergillus by recombinant methods |
US7993876B2 (en) | 2006-10-02 | 2011-08-09 | Ab Enzymes Gmbh | DNA encoding phospholipases and methods of using same |
US8202715B2 (en) | 2006-10-02 | 2012-06-19 | Ab Enzymes Gmbh | Cloning, expression and use of acid lysophospholipases |
-
1989
- 1989-11-10 JP JP29320089A patent/JPH03151879A/ja active Pending
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU718990B2 (en) * | 1996-05-22 | 2000-05-04 | Rohm Gmbh | Lysophospholipase produced from Aspergillus by recombinant methods |
US7993876B2 (en) | 2006-10-02 | 2011-08-09 | Ab Enzymes Gmbh | DNA encoding phospholipases and methods of using same |
US8202715B2 (en) | 2006-10-02 | 2012-06-19 | Ab Enzymes Gmbh | Cloning, expression and use of acid lysophospholipases |
US8507241B2 (en) | 2006-10-02 | 2013-08-13 | Ab Enzymes Gmbh | Cloning, expression and use of acid lysophospholipases |
US8653241B2 (en) | 2006-10-02 | 2014-02-18 | Ab Enzymes Gmbh | Phospholipase polypeptide and a DNA encoding same |
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