JP2527035B2 - クレアチニン・アミドヒドロラ―ゼをコ―ドする遺伝子を含有するｄｎａ断片、該ｄｎａ断片を有する組換えベクタ―及び該組換えベクタ―を有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラ―ゼの製造方法 - Google Patents
クレアチニン・アミドヒドロラ―ゼをコ―ドする遺伝子を含有するｄｎａ断片、該ｄｎａ断片を有する組換えベクタ―及び該組換えベクタ―を有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラ―ゼの製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコー
ドする遺伝子を有するDNA断片、該DNA断片を有する組換
えベクター、該ベクターを有する形質転換体および該形
質転換体を用いてクレアチニン・アミドヒドロラーゼを
製造する方法に関する。
ドする遺伝子を有するDNA断片、該DNA断片を有する組換
えベクター、該ベクターを有する形質転換体および該形
質転換体を用いてクレアチニン・アミドヒドロラーゼを
製造する方法に関する。
クレアチニン・アミドヒドロラーゼ（creatinine ami
dohydrolase,EC3.5,2.10）はクレアチニンとクレアチン
の変換を触媒する酵素であり、反応式は以下のとおりで
ある。
dohydrolase,EC3.5,2.10）はクレアチニンとクレアチン
の変換を触媒する酵素であり、反応式は以下のとおりで
ある。
クレアチニン・アミドヒドロラーゼは血清中あるいは
尿中のクレアチニン及びクレアチンの測定に使用され
る。
尿中のクレアチニン及びクレアチンの測定に使用され
る。
従来、クレアチニン・アミドヒドロラーゼは、例えば
シュードモナス（Pseudomonas）属に属し、クレアチニ
ン・アミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物を、クレ
アチニン，クレアチンまたはこれらの混合物の存在下で
培養し、培養物からクレアチニン・アミドヒドロラーゼ
を採取することにより製造されている（Amino Acid・Nu
cleic Acid,第35巻,39〜46,1977）。
シュードモナス（Pseudomonas）属に属し、クレアチニ
ン・アミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物を、クレ
アチニン，クレアチンまたはこれらの混合物の存在下で
培養し、培養物からクレアチニン・アミドヒドロラーゼ
を採取することにより製造されている（Amino Acid・Nu
cleic Acid,第35巻,39〜46,1977）。
しかしながら、この方法は培地中にクレアチニン，ク
レアチン等高価な物質を添加することが必要であり、ま
たクレアチニン・アミドヒドロラーゼの収率も十分でな
く、効率よくクレアチニン・アミドヒドロラーゼを製造
する方法の開発が望まれていた。
レアチン等高価な物質を添加することが必要であり、ま
たクレアチニン・アミドヒドロラーゼの収率も十分でな
く、効率よくクレアチニン・アミドヒドロラーゼを製造
する方法の開発が望まれていた。
本発明の課題は、遺伝子工学的手法により、クレアチ
ニン，クレアチン等の高価な物質を使用することなく、
高収率で効率良くクレアチニン・アミドヒドロラーゼを
製造しようとするものであって、このために、クレアチ
ニン・アミドヒドロラーゼ遺伝子を含有するDNA断片、
このDNA断片を含有する組換えベクター、及びこの組換
えベクターを保有する形質転換体を新たに提供すること
にある。
ニン，クレアチン等の高価な物質を使用することなく、
高収率で効率良くクレアチニン・アミドヒドロラーゼを
製造しようとするものであって、このために、クレアチ
ニン・アミドヒドロラーゼ遺伝子を含有するDNA断片、
このDNA断片を含有する組換えベクター、及びこの組換
えベクターを保有する形質転換体を新たに提供すること
にある。
本発明者らは、上記の従来技術の問題点を解決するた
め、クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺
伝子を有するDNA断片、該DNA断片を有する組換えベクタ
ー、該ベクターを有する形質転換体および該形質転換体
を用いてクレアチニン・アミドヒドロラーゼを製造する
方法について検討してきた。そして、また、クレアチニ
ン・アミドヒドロラーゼ生産菌の有するクレアチニン・
アミドヒドロラーゼ遺伝子をクローニングし、該遺伝子
を含有するDNA断片を得るとともに該遺伝子のDNA配列を
決定することに成功した。次いで該DNA断片を有する組
換えベクターを得、さらに該ベクターを含む形質転換体
を創製し、該形質転換体を用いるクレアチニン・アミド
ヒドロラーゼの製造方法を開発し、本発明を完成するに
至った。
め、クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺
伝子を有するDNA断片、該DNA断片を有する組換えベクタ
ー、該ベクターを有する形質転換体および該形質転換体
を用いてクレアチニン・アミドヒドロラーゼを製造する
方法について検討してきた。そして、また、クレアチニ
ン・アミドヒドロラーゼ生産菌の有するクレアチニン・
アミドヒドロラーゼ遺伝子をクローニングし、該遺伝子
を含有するDNA断片を得るとともに該遺伝子のDNA配列を
決定することに成功した。次いで該DNA断片を有する組
換えベクターを得、さらに該ベクターを含む形質転換体
を創製し、該形質転換体を用いるクレアチニン・アミド
ヒドロラーゼの製造方法を開発し、本発明を完成するに
至った。
すなわち、本発明は、 （１） クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードす
る遺伝子を有するDNA断片。
る遺伝子を有するDNA断片。
（２） クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードす
る遺伝子が、シュードモナス属に属する微生物由来のも
のである（１）記載のDNA断片。
る遺伝子が、シュードモナス属に属する微生物由来のも
のである（１）記載のDNA断片。
（３） 以下のアミノ酸配列をコードするDNA配列を有
する（１）又は（２）記載のDNA断片。
する（１）又は（２）記載のDNA断片。
（４） 以下のDNA配列を有する請求項２記載のDNA断
片。
片。
（５） （１）〜（４）いずれか記載のDNA断片を有す
る組換えベクター。
る組換えベクター。
（６） （５）記載の組換えベクターを有する形質転換
体。
体。
（７） （６）記載の形質転換体を培地に培養し、クレ
アチニン・アミドヒドロラーゼを蓄積せしめ、該クレア
チニン・アミドヒドロラーゼを採取することを特徴とす
るクレアチニン・アミドヒドロラーゼの製造法。
アチニン・アミドヒドロラーゼを蓄積せしめ、該クレア
チニン・アミドヒドロラーゼを採取することを特徴とす
るクレアチニン・アミドヒドロラーゼの製造法。
に関するものである。
尚、上記のクレアチニン・アミドヒドロラーゼ遺伝子
を含有するDNA断片については、よく知られているよう
に、多くのアミノ酸についてはそれをコードする遺伝子
のDNA配列は複数存在する。その塩基配列は一義的には
決まらず多数の可能性があり得る。本発明者等により明
らかにされたクレアチニン・アミドヒドロラーゼのアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子の場合も、そのDNA配列は
天然の遺伝子の塩基配列以外にも多数の可能性があり、
本発明のDNA配列は、天然のDNA配列のみに限定されるも
のではなく、本発明により明らかにされたクレアチニン
・アミドヒドロラーゼのアミノ酸配列をコードする他の
DNA配列も含むものである。さらに遺伝子組換え技術に
よれば、基本となるDNAの特定部位には、該DNAがコード
するものの基本的な特性を変化させることなく、あるい
はその特性を改善するように、人為的に変異を起すこと
ができる。本発明により提供される、天然の塩基配列を
有するDNAあるいは天然のものとは異なる塩基配列を有
するDNAに関しても同様に人為的に挿入、欠失、置換を
行うことにより天然の遺伝子を同等あるいは改善された
特性とすることが可能であり、本発明はそのような変異
遺伝子をも当然に含むものである。
を含有するDNA断片については、よく知られているよう
に、多くのアミノ酸についてはそれをコードする遺伝子
のDNA配列は複数存在する。その塩基配列は一義的には
決まらず多数の可能性があり得る。本発明者等により明
らかにされたクレアチニン・アミドヒドロラーゼのアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子の場合も、そのDNA配列は
天然の遺伝子の塩基配列以外にも多数の可能性があり、
本発明のDNA配列は、天然のDNA配列のみに限定されるも
のではなく、本発明により明らかにされたクレアチニン
・アミドヒドロラーゼのアミノ酸配列をコードする他の
DNA配列も含むものである。さらに遺伝子組換え技術に
よれば、基本となるDNAの特定部位には、該DNAがコード
するものの基本的な特性を変化させることなく、あるい
はその特性を改善するように、人為的に変異を起すこと
ができる。本発明により提供される、天然の塩基配列を
有するDNAあるいは天然のものとは異なる塩基配列を有
するDNAに関しても同様に人為的に挿入、欠失、置換を
行うことにより天然の遺伝子を同等あるいは改善された
特性とすることが可能であり、本発明はそのような変異
遺伝子をも当然に含むものである。
以下本発明を実施するための各ステップについて詳細
に説明する。
に説明する。
（ａ） クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードす
る遺伝子を有するDNA断片及び組換えベクターの調製 本発明に用いられる組換えベクターは、例えばエシェ
リヒア属に属する微生物などの宿主微生物の培養された
細胞内での複製能を有するベクターDNAに、クレアチニ
ン・アミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物から調製
されたクレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする
遺伝子を有するDNA断片を組み込んでなるものである。
る遺伝子を有するDNA断片及び組換えベクターの調製 本発明に用いられる組換えベクターは、例えばエシェ
リヒア属に属する微生物などの宿主微生物の培養された
細胞内での複製能を有するベクターDNAに、クレアチニ
ン・アミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物から調製
されたクレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする
遺伝子を有するDNA断片を組み込んでなるものである。
好適な例としては、シュードモナス・プチダPS−７株
を栄養培地で培養し、培養物を得る。この培養物を、例
えば5,000rpm以上、好ましくは8,000〜10,000rpmで５分
以上、好ましくは10〜15分間遠心分離してシュードモナ
ス・プチダPS−７株の菌体を得る。
を栄養培地で培養し、培養物を得る。この培養物を、例
えば5,000rpm以上、好ましくは8,000〜10,000rpmで５分
以上、好ましくは10〜15分間遠心分離してシュードモナ
ス・プチダPS−７株の菌体を得る。
この菌体より、例えばRecombinant DNA Techniques
（Rodriguez R.L.et al.Addison−Wesley Publishing C
ompany,1983）記載の方法あるいはKoizumi J.らの方法
（Biotech.Bioeng.,27,721〜728,1985）等により染色体
DNAを得ることができる。
（Rodriguez R.L.et al.Addison−Wesley Publishing C
ompany,1983）記載の方法あるいはKoizumi J.らの方法
（Biotech.Bioeng.,27,721〜728,1985）等により染色体
DNAを得ることができる。
この染色体DNAに制限酵素、例えばEcoR I（東洋紡
製）を30℃以上、好ましくは37℃、酵素１〜100ユニッ
トで30分以上、好ましくは１〜２時間作用させて切断
し、種々の大きさの染色体DNA断片混合物を得る。
製）を30℃以上、好ましくは37℃、酵素１〜100ユニッ
トで30分以上、好ましくは１〜２時間作用させて切断
し、種々の大きさの染色体DNA断片混合物を得る。
このようにして得られたDNA断片混合物から、例えば
ショ糖密度勾配遠心分離等により低分子量のDNA断片（1
Kb以下）を除き、さらにエタノール沈澱法等の濃縮手段
により濃縮し、クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコ
ードする遺伝子を含有するDNA断片混合物を得る。
ショ糖密度勾配遠心分離等により低分子量のDNA断片（1
Kb以下）を除き、さらにエタノール沈澱法等の濃縮手段
により濃縮し、クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコ
ードする遺伝子を含有するDNA断片混合物を得る。
一方本発明に用いるベクターDNAとしては、如何なる
ものでもよく、例えばプラスミドベクターDNA,バクテリ
オファージベクターDNA等が挙げられるが、好適な例と
してはプラスミドベクターpBR322,pUC19（東洋紡製），
バクテリオファージベクターλZAP,EMBL3（STRATAGENE
製）等が挙げられる。
ものでもよく、例えばプラスミドベクターDNA,バクテリ
オファージベクターDNA等が挙げられるが、好適な例と
してはプラスミドベクターpBR322,pUC19（東洋紡製），
バクテリオファージベクターλZAP,EMBL3（STRATAGENE
製）等が挙げられる。
次に上記ベクターDNAに上記のようにして得たクレア
チニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有
するDNA断片混合物を連結する。連結には例えば大腸菌D
NAリガーゼ,T4−DNAリガーゼ（東洋紡製）など、好まし
くはT4−DNAリガーゼを４〜37℃、好ましくは４〜16℃
で酵素１〜100ユニット１時間以上、好ましくは４〜16
時間作用させ、組換えDNAを得る。
チニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有
するDNA断片混合物を連結する。連結には例えば大腸菌D
NAリガーゼ,T4−DNAリガーゼ（東洋紡製）など、好まし
くはT4−DNAリガーゼを４〜37℃、好ましくは４〜16℃
で酵素１〜100ユニット１時間以上、好ましくは４〜16
時間作用させ、組換えDNAを得る。
この組換えDNAを用いて、例えばE.coli K−12、好ま
しくはE.coli JM109株、E.coli HB101株、E.coli XL1−
blue株（STRATAGENE製）などを形質転換あるいは形質導
入して、それぞれの菌体を得る。この形質転換及び形質
導入は、例えばMolecular Cloning（Maniatis T.et al.
Cold Spring Harbor,1982）記載の方法により行なうこ
とができる。
しくはE.coli JM109株、E.coli HB101株、E.coli XL1−
blue株（STRATAGENE製）などを形質転換あるいは形質導
入して、それぞれの菌体を得る。この形質転換及び形質
導入は、例えばMolecular Cloning（Maniatis T.et al.
Cold Spring Harbor,1982）記載の方法により行なうこ
とができる。
そして上記菌株よりクレアチニン・アミドヒドロラー
ゼ生産能を有する菌株をスクリーニングすることによ
り、クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺
伝子を含有する組換体DNAが得られる。さらに上記組換
えDNA中のクレアチニン・アミドヒドロラーゼをコード
する遺伝子を含有するDNA断片を常法に従い小断片化し
て上記プラスミドベクターDNAと連結し、クレアチニン
・アミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有するDN
A配列を有する組換えプラスミドを得ることができる。
ゼ生産能を有する菌株をスクリーニングすることによ
り、クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺
伝子を含有する組換体DNAが得られる。さらに上記組換
えDNA中のクレアチニン・アミドヒドロラーゼをコード
する遺伝子を含有するDNA断片を常法に従い小断片化し
て上記プラスミドベクターDNAと連結し、クレアチニン
・アミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有するDN
A配列を有する組換えプラスミドを得ることができる。
（ｂ） 形質転換体の調製 このようにして得られたクレアチニン・アミドヒドロ
ラーゼをコードする遺伝子を含有するDNA配列を有する
組換えプラスミドを前記の形質転換法により例えばエシ
ェリヒア属、シュードモナス属、バチルス属、に属する
微生物に導入することにより、所望の遺伝形質とベクタ
ーDNAの形質を併せもつ形質転換体が得られる。
ラーゼをコードする遺伝子を含有するDNA配列を有する
組換えプラスミドを前記の形質転換法により例えばエシ
ェリヒア属、シュードモナス属、バチルス属、に属する
微生物に導入することにより、所望の遺伝形質とベクタ
ーDNAの形質を併せもつ形質転換体が得られる。
前記エシェリヒア属に属する微生物としてはE.coli J
M109,E.coli HB101,E.coli C600,E.coli DH−１等が挙
げられる。かくして得られた微生物の好適な例として
は、例えばE.coli JM109（pCNH521）（FERM P−10748）
がある。
M109,E.coli HB101,E.coli C600,E.coli DH−１等が挙
げられる。かくして得られた微生物の好適な例として
は、例えばE.coli JM109（pCNH521）（FERM P−10748）
がある。
（ｃ） クレアチニン・アミドヒドロラーゼの製造 上記で得られた形質転換体を培養するには、クレアチ
ニン・アミドヒドロラーゼの生産に適した培地であって
且つ宿主微生物の生育に適した培地を用いる。
ニン・アミドヒドロラーゼの生産に適した培地であって
且つ宿主微生物の生育に適した培地を用いる。
本発明を実施するに当っては、通常エシェリヒア属の
生育培地として用いられるLB培地（トリプトン，酵母エ
キス，食塩）、BPB培地（Difco,ポリペプトン，酵母エ
キス，リン酸カリウム）、栄養・寒天培地（Difco 000
1）、トリプトン、食塩培地等を基本培地として用いれ
ばよい。その他、必要に応じて炭素源、窒素源の他にア
ミノ酸、ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
生育培地として用いられるLB培地（トリプトン，酵母エ
キス，食塩）、BPB培地（Difco,ポリペプトン，酵母エ
キス，リン酸カリウム）、栄養・寒天培地（Difco 000
1）、トリプトン、食塩培地等を基本培地として用いれ
ばよい。その他、必要に応じて炭素源、窒素源の他にア
ミノ酸、ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
培養方法は通常振盪培養あるいは通気撹拌培養で行な
う。培養温度は20〜45℃の範囲、好ましくは37℃付近、
培養pHは５〜８の範囲、好ましくはpH7付近に制御する
のが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育
すれば実施できる。培養期間は１〜２日間で生育し、菌
体内にクレアチニン・アミドヒドロラーゼが生成蓄積さ
れる。
う。培養温度は20〜45℃の範囲、好ましくは37℃付近、
培養pHは５〜８の範囲、好ましくはpH7付近に制御する
のが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育
すれば実施できる。培養期間は１〜２日間で生育し、菌
体内にクレアチニン・アミドヒドロラーゼが生成蓄積さ
れる。
本酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いれば
よい。例えば、抽出法には超音波粉砕、ガラスビーズを
用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性剤な
ど、いずれを用いてもよい。
よい。例えば、抽出法には超音波粉砕、ガラスビーズを
用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性剤な
ど、いずれを用いてもよい。
さらに抽出液については公知の硫安や芒硝などの塩析
法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集
法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法さら
にはDEAE（ジエチルアミノエチル）セファロース（ファ
ルマシア製）,CM（カルボキシメチル）セファロース
（ファルマシア製）などのイオン交換クロマト法および
セファクリルＳ−300（ファルマシア製）などのゲル濾
過法などにより精製することができる。
法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集
法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法さら
にはDEAE（ジエチルアミノエチル）セファロース（ファ
ルマシア製）,CM（カルボキシメチル）セファロース
（ファルマシア製）などのイオン交換クロマト法および
セファクリルＳ−300（ファルマシア製）などのゲル濾
過法などにより精製することができる。
上記精製手段により得られる精製クレアチニン・アミ
ドヒドロラーゼの理化学的性質はDNA供与株、例えばシ
ュードモナス・プチダPS−７株の生産するクレアチニン
・アミドヒドロラーゼの理化学的性質と全く同様であ
る。
ドヒドロラーゼの理化学的性質はDNA供与株、例えばシ
ュードモナス・プチダPS−７株の生産するクレアチニン
・アミドヒドロラーゼの理化学的性質と全く同様であ
る。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
（１） シュードモナス・プチダPS−７株の染色体DNA
の調製 シュードモナス・プチダPS−７株を栄養培地（ポリペ
プトン2.0％、酵母エキス0.4％、麦芽エキス0.1％、リ
ン酸１カリウム0.3％、リン酸２カリウム1.4％、硫酸マ
グネシウム0.01％、グルコース2.0％）100mlに接種し、
30℃で８時間振盪培養して培養液を得た。この培養物を
12,000rpm,10分間遠心分離して湿菌体約1gを得た後、該
菌体からRecombinant DNA Techniques（Rodriguez R.L.
et al.Addison−Wesley Publishing Company,1983）記
載の方法により染色体DNA約1.8mgを調製した。次にこの
染色体DNA 100μｇを制限酵素EcoR I（東洋紡製）50ユ
ニットで37℃、３時間切断した。切断後５〜20％ショ糖
密度勾配遠心分離を行なって１〜10Kb画分のDNA断片約1
0μｇを調製した。
の調製 シュードモナス・プチダPS−７株を栄養培地（ポリペ
プトン2.0％、酵母エキス0.4％、麦芽エキス0.1％、リ
ン酸１カリウム0.3％、リン酸２カリウム1.4％、硫酸マ
グネシウム0.01％、グルコース2.0％）100mlに接種し、
30℃で８時間振盪培養して培養液を得た。この培養物を
12,000rpm,10分間遠心分離して湿菌体約1gを得た後、該
菌体からRecombinant DNA Techniques（Rodriguez R.L.
et al.Addison−Wesley Publishing Company,1983）記
載の方法により染色体DNA約1.8mgを調製した。次にこの
染色体DNA 100μｇを制限酵素EcoR I（東洋紡製）50ユ
ニットで37℃、３時間切断した。切断後５〜20％ショ糖
密度勾配遠心分離を行なって１〜10Kb画分のDNA断片約1
0μｇを調製した。
（２） クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードす
る遺伝子を含有するDNA断片及び該DNA断片を有する組換
えベクターの調製 バクテリオファージベクターλZAP（EcoR I切断済、S
TRATAGENE製）１μｇと上記（１）で得られたEcoR Iで
切断した染色体DNA0.5μｇをT4−DNAリガーゼ（東洋紡
製）１ユニットで16℃、12時間反応させDNAを連結し
た。連結したDNAはλDNAインビトロパッケージングキッ
トGigapack Gold（STRATAGENE製）を用いてパッケージ
ングした。パッケージングにより得られた組換えファー
ジはMolecular Cloning（Maniatis T.et al.Cold Sprin
g Harbor,1982）記載の方法でE.coli XL1−blue（STRAT
AGENE製）（Nucleic Acid Research Vol.16,No.15,7583
〜7600,1988）に形質導入した。使用DNA 1μｇ当り約１
×106個のファージプラークが得られた。
る遺伝子を含有するDNA断片及び該DNA断片を有する組換
えベクターの調製 バクテリオファージベクターλZAP（EcoR I切断済、S
TRATAGENE製）１μｇと上記（１）で得られたEcoR Iで
切断した染色体DNA0.5μｇをT4−DNAリガーゼ（東洋紡
製）１ユニットで16℃、12時間反応させDNAを連結し
た。連結したDNAはλDNAインビトロパッケージングキッ
トGigapack Gold（STRATAGENE製）を用いてパッケージ
ングした。パッケージングにより得られた組換えファー
ジはMolecular Cloning（Maniatis T.et al.Cold Sprin
g Harbor,1982）記載の方法でE.coli XL1−blue（STRAT
AGENE製）（Nucleic Acid Research Vol.16,No.15,7583
〜7600,1988）に形質導入した。使用DNA 1μｇ当り約１
×106個のファージプラークが得られた。
クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺伝
子を含有するDNAを有する組換えファージ検索は、酵素
免疫テストにより行なった。酵素免疫テストは、Gene E
xpression（ベーリンガーマイハイム製）を用いて行な
った。本酵素免疫テストは、クレアチニン・アミドヒド
ロラーゼ約100pgの検出限界を示し、上記ファージプラ
ーク1000個あたり１〜２個の陽性信号が得られた。
子を含有するDNAを有する組換えファージ検索は、酵素
免疫テストにより行なった。酵素免疫テストは、Gene E
xpression（ベーリンガーマイハイム製）を用いて行な
った。本酵素免疫テストは、クレアチニン・アミドヒド
ロラーゼ約100pgの検出限界を示し、上記ファージプラ
ーク1000個あたり１〜２個の陽性信号が得られた。
酵素免疫テストで陽性のプラーク３個よりSTRATAGENE
製λZAP使用マニュアルの指示に従い組換えプラスミド
を切り出した。得られた３種の組換えプラスミドをEcoR
Iで切断すると、異なったバンドの他に３種の組換えプ
ラスミドに共通な4.2KbのDNA断片が見い出された。この
4.2KbのEcoR I断片約２μｇからApa I（東洋紡製）を用
いて2.5KbのApa I−EcoR I断片を切断した。生じたDNA
断片は低融点アガロースゲル中でのその大きさに応じて
分離され、2.5KbのApa I−EcoR I断片が単離された。
製λZAP使用マニュアルの指示に従い組換えプラスミド
を切り出した。得られた３種の組換えプラスミドをEcoR
Iで切断すると、異なったバンドの他に３種の組換えプ
ラスミドに共通な4.2KbのDNA断片が見い出された。この
4.2KbのEcoR I断片約２μｇからApa I（東洋紡製）を用
いて2.5KbのApa I−EcoR I断片を切断した。生じたDNA
断片は低融点アガロースゲル中でのその大きさに応じて
分離され、2.5KbのApa I−EcoR I断片が単離された。
低融点アガロースゲルからのDNA断片の単離はStryhl
K.の方法（Struhl K.,Biotechliques,3,452,1985）によ
り行なった。他のすべてのDNA断片の単離もこの方法で
行なった。
K.の方法（Struhl K.,Biotechliques,3,452,1985）によ
り行なった。他のすべてのDNA断片の単離もこの方法で
行なった。
プラスミドベクターBluescript KS（M13−）（STRATA
GENE製）約１μｇをApa I及びEcoR Iで切断して開環
し、これに前記調製した2.5KbのApa I−EcoR I断片約0.
5μｇを混合し、T4−DNAリガーゼ１ユニットで16℃、12
時間反応させてDNAを連結させ組換え体プラスミドpCNH2
を得た。この2.5KbのApa I−EcoR I断片は種々の制限酵
素により特徴付けられた（第２図参照）。
GENE製）約１μｇをApa I及びEcoR Iで切断して開環
し、これに前記調製した2.5KbのApa I−EcoR I断片約0.
5μｇを混合し、T4−DNAリガーゼ１ユニットで16℃、12
時間反応させてDNAを連結させ組換え体プラスミドpCNH2
を得た。この2.5KbのApa I−EcoR I断片は種々の制限酵
素により特徴付けられた（第２図参照）。
次に上記2.5KbのApa I−EcoR I断片約２μｇをAcc I
（東洋紡製）0.5ユニットで37℃、１時間制限的に反応
させ、1.5KbのAcc I−EcoR I断片を切断し、上記Struhl
K.の方法により1.5KbのAcc I−EcoR I断片を単離し
た。またプラスミドベクターpUC19（東洋紡製）約１μ
ｇをAcc I及びEcoR I断片で切断して開環し、これに前
記調製した1.5KbのAcc I−EcoR I断片約0.5μｇを混合
し、T4−DNAリガーゼ１ユニットで16℃、12時間反応さ
せてDNAを連結させ、組換えプラスミドpCNH521を得た
（第２図参照）。pCNH521は大腸菌中でラックプロモー
ター（Lac Promoter）の制御下、生物学的活性のクレア
チニン・アミドヒドロラーゼをコードする。
（東洋紡製）0.5ユニットで37℃、１時間制限的に反応
させ、1.5KbのAcc I−EcoR I断片を切断し、上記Struhl
K.の方法により1.5KbのAcc I−EcoR I断片を単離し
た。またプラスミドベクターpUC19（東洋紡製）約１μ
ｇをAcc I及びEcoR I断片で切断して開環し、これに前
記調製した1.5KbのAcc I−EcoR I断片約0.5μｇを混合
し、T4−DNAリガーゼ１ユニットで16℃、12時間反応さ
せてDNAを連結させ、組換えプラスミドpCNH521を得た
（第２図参照）。pCNH521は大腸菌中でラックプロモー
ター（Lac Promoter）の制御下、生物学的活性のクレア
チニン・アミドヒドロラーゼをコードする。
一方1.5KbのAcc I−EcoR I断片を各種制限酵素で切断
してM13mp18あるいはmp19ファージDNA（東洋紡製）に連
結した後常法に従い一本鎖DNAを調製した。得られた一
本鎖DNAについて、M13シークエンシングキット（M13 Se
quencing Kit,東洋紡製）を用いて、塩基配列の決定を
行なった。決定した塩基配列及びアミノ酸配列を第１図
に示した。
してM13mp18あるいはmp19ファージDNA（東洋紡製）に連
結した後常法に従い一本鎖DNAを調製した。得られた一
本鎖DNAについて、M13シークエンシングキット（M13 Se
quencing Kit,東洋紡製）を用いて、塩基配列の決定を
行なった。決定した塩基配列及びアミノ酸配列を第１図
に示した。
（３） クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードす
るDNAを含む組換えプラスミドを含有する形質転換体の
調製 上記クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする
遺伝子を含有するDNA配列を有する組換えプラスミドで
あるpCNH521を用い前記Molecular Cloning（Maniatis
T.et al.Cold Spring Harbor,1982）記載の方法により
E.coli JM109;（東洋紡製）（Gene,Vol.33（1985）103
〜119）を形質転換してE.coli JM109（pCNH521）（FERM
P−10748）を調製した。本形質転換体はロックプロモ
ーターの誘導物質であるIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトピラノシド）（ナカライ・テスク製）存在
下、菌体内可溶性タンパク質の約40％までクレアチニン
・アミドヒドロラーゼを生産していた。
るDNAを含む組換えプラスミドを含有する形質転換体の
調製 上記クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする
遺伝子を含有するDNA配列を有する組換えプラスミドで
あるpCNH521を用い前記Molecular Cloning（Maniatis
T.et al.Cold Spring Harbor,1982）記載の方法により
E.coli JM109;（東洋紡製）（Gene,Vol.33（1985）103
〜119）を形質転換してE.coli JM109（pCNH521）（FERM
P−10748）を調製した。本形質転換体はロックプロモ
ーターの誘導物質であるIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトピラノシド）（ナカライ・テスク製）存在
下、菌体内可溶性タンパク質の約40％までクレアチニン
・アミドヒドロラーゼを生産していた。
次に各菌株によるクレアチニン・アミドヒドロラーゼ
の生産性について、以下の第１表に示す。なお、第１表
中、E.coli JM109（pCNH2）は、上記（２）で得られた
2.5KbのApa I−EcoR I断片を含む組換え体プラスミドpC
NH2でE.coli JM109を形質転換することにより得られた
形質転換体である。
の生産性について、以下の第１表に示す。なお、第１表
中、E.coli JM109（pCNH2）は、上記（２）で得られた
2.5KbのApa I−EcoR I断片を含む組換え体プラスミドpC
NH2でE.coli JM109を形質転換することにより得られた
形質転換体である。
クレアチニン・アミドヒドロラーゼの活性測定は0.1M
クレアチン溶液0.9mlに酵素液0.1mlを加え、37℃で10分
間反応の後Jaffe反応（Clin.Chem.1,55,1953）によりク
レアチニンの生成量を測定した。酵素活性は37℃で１分
間に１マイクロモルのクレアチニンを生成する酵素力価
を１ユニットとした。また培養はシュードモナス・プチ
ダPS−７株は前記Amino Acid;Nucleic Acid第35巻,37〜
46,1977記載の方法、E.coliはLB培地（トリプトン１
％、酵母エキス0.5％、食塩１％、アンピシリン50μg/m
l、pH7.4）にIPTGを0.2mM添加あるいは無添加で37℃、1
6時間培養して菌体内酵素活性を測定した。
クレアチン溶液0.9mlに酵素液0.1mlを加え、37℃で10分
間反応の後Jaffe反応（Clin.Chem.1,55,1953）によりク
レアチニンの生成量を測定した。酵素活性は37℃で１分
間に１マイクロモルのクレアチニンを生成する酵素力価
を１ユニットとした。また培養はシュードモナス・プチ
ダPS−７株は前記Amino Acid;Nucleic Acid第35巻,37〜
46,1977記載の方法、E.coliはLB培地（トリプトン１
％、酵母エキス0.5％、食塩１％、アンピシリン50μg/m
l、pH7.4）にIPTGを0.2mM添加あるいは無添加で37℃、1
6時間培養して菌体内酵素活性を測定した。
上記データよりE.coli JM109（pCNH521）においてク
レアチニン・アミドヒドロラーゼは、クレアチニンの誘
導なしにラックプロモーターの制御下高生産されている
いことが明らかである。
レアチニン・アミドヒドロラーゼは、クレアチニンの誘
導なしにラックプロモーターの制御下高生産されている
いことが明らかである。
（４） E.coli JM109（pCNH521）によるクレアチニン
・アミドヒドロラーゼの生産及び該酵素の精製 前記のLB培地（トリプトン１％、酵母エキス0.5％、
食塩１％、pH7.4）６を10−ジャーファメンターに
分注し、121℃、15分間オートクレーブを行い放冷後、5
0mg/mlアンピシリン（ナカライ・テスク製）,200mM IPT
Gを無菌的に6ml添加した。この培地に上記と同一組成の
培地で予め37℃で16時間振盪培養したE.coli JM109（pC
NH521）の培養液60mlを接種し、37℃で16時間通気撹拌
培養した。培養終了後のクレアチニン・アミドヒドロラ
ーゼ活性は15.7U/mlであった。培養液６を遠心分離に
て集菌し、50mM K−リン酸緩衝液pH7.5,200mlに懸濁
し、常法により超音波破砕した後、15,000rpmで20分間
遠心分離してクレアチニン・アミドヒドロラーゼの粗酵
素液を得た。
・アミドヒドロラーゼの生産及び該酵素の精製 前記のLB培地（トリプトン１％、酵母エキス0.5％、
食塩１％、pH7.4）６を10−ジャーファメンターに
分注し、121℃、15分間オートクレーブを行い放冷後、5
0mg/mlアンピシリン（ナカライ・テスク製）,200mM IPT
Gを無菌的に6ml添加した。この培地に上記と同一組成の
培地で予め37℃で16時間振盪培養したE.coli JM109（pC
NH521）の培養液60mlを接種し、37℃で16時間通気撹拌
培養した。培養終了後のクレアチニン・アミドヒドロラ
ーゼ活性は15.7U/mlであった。培養液６を遠心分離に
て集菌し、50mM K−リン酸緩衝液pH7.5,200mlに懸濁
し、常法により超音波破砕した後、15,000rpmで20分間
遠心分離してクレアチニン・アミドヒドロラーゼの粗酵
素液を得た。
このようにして得た粗酵素液にポリエチレンイミンを
用いて除核酸処理を施した後、硫酸アンモニウムを用い
た塩析分画を行なった。塩析沈澱物を50mlの50mM K−リ
ン酸緩衝液、pH7.5に溶解し、50mM K−リン酸緩衝液、p
H7.5にて平衡化したDEAE−セファロース（ファルマシア
製）カラムクロマトグラフィーに供し、０〜0.5Mの食塩
濃度勾配溶出法により0.1〜0.3Mの食塩濃度範囲でクレ
アチニン・アミドヒドロラーゼ活性画分を得た。このク
レアチニン・アミドヒドロラーゼ活性画分を限外濾過機
にて濃縮した後、50mM K−リン酸緩衝液、pH7.5で平衡
化したセファデックスＧ−25（ファルマシア製）にてゲ
ル濾過した。最終的に常法に従い凍結乾燥することによ
り、純化されたクレアチニン・アミドヒドロラーゼ粉末
49000ユニットを得た。収率は52％であった。
用いて除核酸処理を施した後、硫酸アンモニウムを用い
た塩析分画を行なった。塩析沈澱物を50mlの50mM K−リ
ン酸緩衝液、pH7.5に溶解し、50mM K−リン酸緩衝液、p
H7.5にて平衡化したDEAE−セファロース（ファルマシア
製）カラムクロマトグラフィーに供し、０〜0.5Mの食塩
濃度勾配溶出法により0.1〜0.3Mの食塩濃度範囲でクレ
アチニン・アミドヒドロラーゼ活性画分を得た。このク
レアチニン・アミドヒドロラーゼ活性画分を限外濾過機
にて濃縮した後、50mM K−リン酸緩衝液、pH7.5で平衡
化したセファデックスＧ−25（ファルマシア製）にてゲ
ル濾過した。最終的に常法に従い凍結乾燥することによ
り、純化されたクレアチニン・アミドヒドロラーゼ粉末
49000ユニットを得た。収率は52％であった。
得られた酵素のpH活性を第３図、至適温度を第４図、
pH安定性を第５図及び熱安定性を第６図に示す。これら
クレアチニン・アミドヒドロラーゼの理化学的性質はDN
A供与体であるシュードモナス・プチダPS−７株の生産
するクレアチニン・アミドヒドロラーゼの理化学的性質
と全く同じであった。
pH安定性を第５図及び熱安定性を第６図に示す。これら
クレアチニン・アミドヒドロラーゼの理化学的性質はDN
A供与体であるシュードモナス・プチダPS−７株の生産
するクレアチニン・アミドヒドロラーゼの理化学的性質
と全く同じであった。
参考例 実施例における精製処理による酵素活性の評価は下表
の通りである。
の通りである。
〔発明の効果〕 本発明の形質転換体は、クレアチン、クレアチニン等
の高価な物質を培地に添加する必要なしに極めて優れた
クレアチニン・アミドヒドロラーゼ生産性を示し、本発
明により効率的、経済的にクレアチニン・アミドヒドロ
ラーゼを生産することが可能となった。
の高価な物質を培地に添加する必要なしに極めて優れた
クレアチニン・アミドヒドロラーゼ生産性を示し、本発
明により効率的、経済的にクレアチニン・アミドヒドロ
ラーゼを生産することが可能となった。
第１図はシュードモナス・プチダPS−７株のクレアチニ
ン・アミドヒドロラーゼをコードする遺伝子のDNA配列
及び対応するアミノ酸配列を示す。 第２図はシュードモナス・プチダPS−７株からの1.5Kb
DNA断片及びプラスミドpUC19よりのpCNH521構造経過を
示す。 第３図は実施例１のクレアチニン・アミドヒドロラーゼ
のpH活性を示す。図中pH5.5は50mM酢酸緩衝液、pH6.0〜
8.0は50mM K−リン酸緩衝液、pH8.5〜9.0は50mM炭酸緩
衝液を用いて行なった。 第４図は実施例１のクレアチニン・アミドヒドロラーゼ
の至適温度を示す。 第５図は実施例１のクレアチニン・アミドヒドロラーゼ
のpH安定性を示す。図中pH6.0〜8.0は50mM K−リン酸緩
衝液、pH8.5〜9.0は50mM炭酸緩衝液を用いて行なった。 第６図は実施例１のクレアチニン・アミドヒドロラーゼ
の熱安定性を示す。
ン・アミドヒドロラーゼをコードする遺伝子のDNA配列
及び対応するアミノ酸配列を示す。 第２図はシュードモナス・プチダPS−７株からの1.5Kb
DNA断片及びプラスミドpUC19よりのpCNH521構造経過を
示す。 第３図は実施例１のクレアチニン・アミドヒドロラーゼ
のpH活性を示す。図中pH5.5は50mM酢酸緩衝液、pH6.0〜
8.0は50mM K−リン酸緩衝液、pH8.5〜9.0は50mM炭酸緩
衝液を用いて行なった。 第４図は実施例１のクレアチニン・アミドヒドロラーゼ
の至適温度を示す。 第５図は実施例１のクレアチニン・アミドヒドロラーゼ
のpH安定性を示す。図中pH6.0〜8.0は50mM K−リン酸緩
衝液、pH8.5〜9.0は50mM炭酸緩衝液を用いて行なった。 第６図は実施例１のクレアチニン・アミドヒドロラーゼ
の熱安定性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/86 (Ｃ１２Ｎ 9/86 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 愛水 重典 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績 株式会社敦賀酵素工場内 (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙ ｏ），86（1979），Ｐ．1109−1117 (54)【発明の名称】 クレアチニン・アミドヒドロラ―ゼをコ―ドする遺伝子を含有するＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を 有する組換えベクタ―及び該組換えベクタ―を有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミド ヒドロラ―ゼの製造方法
Claims (5)
- 【請求項１】以下のアミノ酸配列を有するクレアチニン
・アミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を有するDNA
断片。 - 【請求項２】以下のDNA配列を有する請求項１記載のDNA
断片。 - 【請求項３】請求項１〜２いずれかの項記載のDNA断片
を有する組み換えベクター。 - 【請求項４】請求項３記載の組み換えベクターを有する
大腸菌。 - 【請求項５】請求項４記載の大腸菌を培地に培養し、ク
レアチニン・アミドヒドロラーゼを蓄積せしめ、該クレ
アチニン・アミドヒドロラーゼを採取することを特徴と
するクレアチニン・アミドヒドロラーゼの製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1152182A JP2527035B2 (ja) | 1989-06-16 | 1989-06-16 | クレアチニン・アミドヒドロラ―ゼをコ―ドする遺伝子を含有するｄｎａ断片、該ｄｎａ断片を有する組換えベクタ―及び該組換えベクタ―を有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラ―ゼの製造方法 |
| DE69018130T DE69018130T2 (de) | 1989-06-16 | 1990-06-14 | DNA-Fragment, das ein für Kreatininamidohydrolase kodierendes Gen enthält. |
| EP90111266A EP0402929B1 (en) | 1989-06-16 | 1990-06-14 | A dna fragment containing a gene encoding creatinine amidohydrolase |
| US07/908,620 US5627065A (en) | 1989-06-16 | 1992-06-29 | DNA fragment containing a gene encoding creatinine amidohydrolase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1152182A JP2527035B2 (ja) | 1989-06-16 | 1989-06-16 | クレアチニン・アミドヒドロラ―ゼをコ―ドする遺伝子を含有するｄｎａ断片、該ｄｎａ断片を有する組換えベクタ―及び該組換えベクタ―を有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラ―ゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0319690A JPH0319690A (ja) | 1991-01-28 |
| JP2527035B2 true JP2527035B2 (ja) | 1996-08-21 |
Family
ID=15534848
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1152182A Expired - Fee Related JP2527035B2 (ja) | 1989-06-16 | 1989-06-16 | クレアチニン・アミドヒドロラ―ゼをコ―ドする遺伝子を含有するｄｎａ断片、該ｄｎａ断片を有する組換えベクタ―及び該組換えベクタ―を有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラ―ゼの製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5627065A (ja) |
| EP (1) | EP0402929B1 (ja) |
| JP (1) | JP2527035B2 (ja) |
| DE (1) | DE69018130T2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007125824A1 (ja) | 2006-04-25 | 2007-11-08 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 基質との親和性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体、および、クレアチニン測定用試薬組成物 |
| WO2009041409A1 (ja) | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | クレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体 |
| JP2009077681A (ja) * | 2007-09-27 | 2009-04-16 | Toyobo Co Ltd | キレート剤耐性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体 |
| JP2009077680A (ja) * | 2007-09-27 | 2009-04-16 | Toyobo Co Ltd | クレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を向上させる方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7198785B2 (en) * | 2003-12-09 | 2007-04-03 | Brown University | Systems and methods related to degradation of uremic toxins |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2122294C3 (de) * | 1971-05-05 | 1979-08-16 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase |
| DE2122298C3 (de) * | 1971-05-05 | 1979-02-22 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase |
| US4652639A (en) * | 1982-05-06 | 1987-03-24 | Amgen | Manufacture and expression of structural genes |
| DE3500184A1 (de) * | 1985-01-04 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Mikroorganismus und plasmid fuer konstitutive creatinamidinohydrolase-bildung sowie verfahren zur herstellung derselben |
| JPS6437292A (en) * | 1987-08-04 | 1989-02-07 | Toyo Jozo Kk | Dna having genetic information of creatinase and use thereof |
-
1989
- 1989-06-16 JP JP1152182A patent/JP2527035B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-06-14 EP EP90111266A patent/EP0402929B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-14 DE DE69018130T patent/DE69018130T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-06-29 US US07/908,620 patent/US5627065A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），８６（１９７９），Ｐ．１１０９−１１１７ |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007125824A1 (ja) | 2006-04-25 | 2007-11-08 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 基質との親和性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体、および、クレアチニン測定用試薬組成物 |
| WO2009041409A1 (ja) | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | クレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体 |
| JP2009077681A (ja) * | 2007-09-27 | 2009-04-16 | Toyobo Co Ltd | キレート剤耐性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体 |
| JP2009077680A (ja) * | 2007-09-27 | 2009-04-16 | Toyobo Co Ltd | クレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を向上させる方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69018130T2 (de) | 1995-09-14 |
| JPH0319690A (ja) | 1991-01-28 |
| EP0402929A1 (en) | 1990-12-19 |
| US5627065A (en) | 1997-05-06 |
| EP0402929B1 (en) | 1995-03-29 |
| DE69018130D1 (de) | 1995-05-04 |
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