JP3557271B2 - 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 - Google Patents
酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3557271B2 JP3557271B2 JP05824495A JP5824495A JP3557271B2 JP 3557271 B2 JP3557271 B2 JP 3557271B2 JP 05824495 A JP05824495 A JP 05824495A JP 5824495 A JP5824495 A JP 5824495A JP 3557271 B2 JP3557271 B2 JP 3557271B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- dna
- seq
- amino acid
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素をコードする新規なＤＮＡと、そのＤＮＡを含む組換えＤＮＡ並びに形質転換体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは、グルコース２分子が還元性基同士結合した二糖類であり、天然には細菌、真菌、藻類、昆虫などに微量存在する。トレハロースは分子中に還元性基を持たないので、アミノ酸類の存在下で加熱しても褐変反応を起こすことがなく、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできる利点がある。しかしながら、従来の製造方法では所望量を入手するのが難しく、実際に飲食物の甘味付けに使われることは殆ど無かった。
【０００３】
これまでの製造方法は、微生物の菌体を利用する方法と、糖質に複合酵素系を作用させる方法とに大別される。前者の方法は、特開昭５０−１５４４８５号公報などにも見られるように、細菌、酵母などの微生物を栄養培地で増殖させ、培養物中の菌体からトレハロースを採取するものである。一方、後者の方法は、特開昭５８−２１６６９５号公報などにも見られるように、基質にマルトースを使用し、これにマルトース・フォスフォリラーゼとトレハロース・フォスフォリラーゼからなる複合酵素系を作用させ、生成したトレハロースを系外に取出すものである。前者の方法は、微生物そのものの増殖は比較的容易なものの、トレハロースを菌体から採取するのに一連の繁雑な工程を要し、しかも、菌体に含まれるトレハロースが１５％（ｗ／ｗ）と僅少であるという問題があった。後者の方法は、トレハロースそのものの分離は比較的容易なものの、反応自体が２種類の酵素による平衡反応であり、しかも、その平衡が常時グルコース燐酸側に傾いていることから、基質を高濃度にして反応させ、トレハロースの収量を上げることが原理的に難しかった。
【０００４】
斯かる状況に鑑み、本発明者が、澱粉糖からトレハロース構造を有する糖質を生成する酵素につき鋭意検索したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６などの微生物が、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するという、従来未知の全く新規な酵素を産生することが判明した。この知見とあい前後して、この非還元性糖質は、同じくリゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６が産生する別の酵素により、ほぼ定量的にトレハロースとグルコース及び／又はマルトオリゴ糖に加水分解されることが判明した。これら酵素を併用することにより、澱粉を原料に所望量のトレハロースが比較的容易に得られることとなり、トレハロースに係わる前記課題は悉く解決されていくものと期待される。しかしながら、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１もアルスロバクター・スピーシーズＱ３６も当該酵素の産生能が充分でなく、トレハロースや末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を大規模に製造しようとすると、微生物を大量に培養しなければならないという問題がある。
【０００５】
一方、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には目覚しいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解明されていない酵素であっても、これをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培養することにより、比較的容易に所望量の酵素が取得できるようになった。斯かる状況に鑑み、両酵素をコードする遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明するのが急務となっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の目的は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素をコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００７】
この発明の別の目的は、そのＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる組換えＤＮＡを提供することにある。
【０００８】
この発明のさらに別の目的は、その組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記第一の課題を、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素をコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００１０】
この発明は、前記第二の課題を、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡにより解決するものである。
【００１１】
この発明は、前記第三の課題を、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００１２】
【作用】
この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して複製可能な組換えＤＮＡとし、この組換えＤＮＡを、本来、当該酵素を産生しないけれども、比較的容易に増殖させることのできる宿主に導入して形質転換体とすることにより、コードされた当該酵素の産生を発現する。
【００１３】
この発明の組換えＤＮＡは、本来、当該酵素を産生しないけれども、比較的容易に増殖させることのできる宿主に導入して形質転換体とし、この形質転換体を培養することにより、コードされた当該酵素の産生を発現する。
【００１４】
この発明の形質転換体は、培養すると、当該酵素を産生する。
【００１５】
以下、実験例、実施例等に基づきこの発明を説明すると、この発明は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する、従来未知の全く新規な酵素をコードするＤＮＡに関するものである。斯かる酵素はリゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６の培養物から得ることができ（以下、それぞれ「酵素Ｍ−１１」又は「酵素Ｑ３６」と云う。）、本発明者がカラムクロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこの酵素を単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質はポリペプチドであり、次のような理化学的性質を有することが判明した。
（１） 作用
グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する。
（２） 分子量
約７６，０００乃至８７，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
（３） 等電点
約３．６乃至４．６（等電点電気泳動）
（４） 至適温度
ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、３５乃至４０℃付近に至適温度を示す。
（５） 至適ｐＨ
４０℃で６０分間インキュベートすると、ｐＨ６．４乃至７．２付近に至適ｐＨを示す。
（６） 熱安定性
ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、３５乃至４０℃付近まで安定である。
（７） ｐＨ安定性
２５℃で１６時間インキュベートすると、ｐＨ５．５乃至１１．０付近まで安定である。
【００１６】
斯かる理化学的性質を有する酵素は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。なお、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１は岡山県岡山市の土壌から分離され、平成４年１２月２４日以降、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省、工業技術院、生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託番号『ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０』で寄託されている。一方、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６は岡山県総社市の土壌から分離されたものであり、平成５年６月３日以降、同センターに寄託番号『ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１６』で寄託されている。同じ出願人による特開平７−１４３８７６号公報（特願平５−３４９２１６号明細書）には、当該酵素の性質・性状とともに、両微生物の菌学的性質が詳細に開示されている。
【００１７】
本発明者が、高度に精製した酵素Ｍ−１１の部分アミノ酸配列を調べ、その部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにしてリゾビウム・スピーシーズＭ−１１の染色体ＤＮＡを鋭意検索した結果、配列表における配列番号３に示す塩基配列を有する２，３１６塩基対からなるＤＮＡ断片が得られた。そして、その塩基配列を解読したところ、酵素Ｍ−１１は、配列表における配列番号１に示すように、７７２個のアミノ酸により構成されていることが判明した。
【００１８】
一方、酵素Ｑ３６の部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにし、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６の染色体ＤＮＡを同様に検索したところ、配列表における配列番号４に示す塩基配列を有する２，３２５塩基対からなるＤＮＡ断片が得られた。この塩基配列を解読したところ、酵素Ｑ３６は７７５個のアミノ酸からなり、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００１９】
配列表における配列番号１乃至４に示す塩基配列及びアミノ酸配列を解明するに到った一連の工程を要約すると、次のようになる。
（１） 供与体微生物の培養物から当該酵素を分離し、高度に精製した。精製酵素をプロテアーゼにより部分加水分解後、加水分解物から２種類のペプチド断片を単離し、そのアミノ酸配列を決定した。
（２） 別途、供与体微生物の菌体より染色体ＤＮＡを分離し、精製後、制限酵素により部分的に切断して約３，０００乃至７，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。ＤＮＡリガーゼにより、このＤＮＡ断片を予め制限酵素で切断しておいたプラスミドベクターに連結し、組換えＤＮＡを作製した。
（３） 大腸菌に組換えＤＮＡを導入して形質転換体を作製し、前記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブとするコロニーハイブリダイゼーションにより当該酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体を選択した。
（４） 形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、プライマーとともにアニーリング後、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライマーを伸長し、得られた相補鎖ＤＮＡをジデオキシ・チェーン・ターミネータ法により分析して塩基配列を決定した。そして、その塩基配列から推定されるアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列とを比較し、その塩基配列が当該酵素をコードしていることを確認した。
【００２０】
供与体微生物の遺伝子がコードするアミノ酸配列は配列表における配列番号１又は２に示すとおりであるが、この発明のＤＮＡは、配列表における配列番号１又は２に示すとおりのアミノ酸配列をコードするものは無論のこと、これと相同的なアミノ酸配列を有するものをも包含するものとする。すなわち、組換えＤＮＡ技術の進歩により、斯界においては、酵素の作用を実質的に変えることなく、比較的容易にその構成アミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換できるようになった。また、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地の成分・組成、培養温度・ｐＨなどに依っては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の酵素作用は保持しているものの、配列表における配列番号１又は２のアミノ酸配列におけるＮ末端付近のアミノ酸の１個又は２個以上以上が欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した変異体の産生することがある。斯かる技術水準に鑑み、この発明でいう酵素とは、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列をそのまま具備するものは言うに及ばず、そのアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上が他のアミノ酸に置き換わるか、欠失若しくは付加した変異体であっても、それがグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するかぎり包含するものとする。
【００２１】
さらに、斯界においては、遺伝子コードの縮重により、コードするアミノ酸配列を変えることなく、ＤＮＡにおける塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換することができる。これにより、この発明のＤＮＡは、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列をそのまま有するもののみならず、それが配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を有する酵素若しくはその相同変異体をコードするものであるかぎり、遺伝子コードの縮重に基づき、塩基の１個又は２個以上が他の塩基に置き換わったものをも包含するものとする。
【００２２】
また、現在の組換えＤＮＡ技術に依るときには、一般に、５′末端からの塩基配列が決まれば、これに相補的な塩基配列は一義的に定まる。したがって、この発明のＤＮＡは、上記いずれかの塩基配列に相補的な塩基配列を有するものも包含するものとする。なお、この発明のＤＮＡが宿主中で実際に当該酵素の産生を発現するために、当該酵素又はその相同変異体をコードする塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換し得ることはいうまでもない。
【００２３】
この発明のＤＮＡは上記のごときものであるが、この発明のＤＮＡは、それが前記のごとき配列を有するかぎり、それが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の給源としては、例えば、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１６）、ブレビバクテリウム・ヘロボルム（ＡＴＣＣ１１８２２）、フラボバクテリウム・アクアチレ（ＩＦＯ３７７２）、ミクロコッカス・ルテウス（ＩＦＯ３０６４）、ミクロコッカス・ロゼウス（ＡＴＣＣ１８６）、クルトバクテリウム・シトレウム（ＩＦＯ１５２３１）、マイコバクテリウム・スメグマチス（ＡＴＣＣ１９４２０）及びテラバクター・ツメスセンス（ＩＦＯ１２９６０）を含むリゾビウム属、アルスロバクター属、ブレビバクテリウム属、フラボバクテリウム属、ミクロコッカス属、クルトバクテリウム属、マイコバクテリウム属、テラバクター属の微生物が挙げられ、これら微生物の菌体からはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に植菌し、好気的条件下で約１乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより、当該ＤＮＡを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。このとき、細胞壁溶解酵素にプロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵素を併用したり、菌体を超音波処理する際、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈澱、遠心分離、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理などの斯界における通常一般の方法を適用すれば目的のＤＮＡが得られる。
【００２４】
一方、この発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を分離し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。
【００２５】
さて、この発明は、本来、当該酵素を産生しないけれども、比較的容易に増殖させることのできる微生物や動植物の細胞に導入すると当該酵素の産生を発現する複製可能な組換えＤＮＡに係わるものでもある。斯かる組換えＤＮＡは、通常、前述のごときＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられ、このうち、この発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるにはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるにはｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを２種以上の宿主内で増殖させる場合に有用である。
【００２６】
斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、この発明のＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００２７】
この発明による組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主微生物に導入することができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を含む栄養培地で培養し、該澱粉糖より末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するものを選択すればよい。
【００２８】
斯くして得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体内外に当該酵素を産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖などの糖質が、また、窒素源としては、例えば、アンモニア若しくはアンモニウム塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に植菌し、栄養培地を温度２５乃至６５℃、ｐＨ２乃至８に保ちつつ、通気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至６日間培養すれば、当該酵素を含む培養物が得られる。この培養物は酵素剤としてそのまま使用可能ではあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより酵素を菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には酵素を精製するための通常一般の方法が採用でき、例えば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種若しくは２種以上を適宜組合せて適用すればよい。
【００２９】
前述のとおり、当該酵素は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するという、従来の酵素に見られない顕著な作用を有する。したがって、この発明の形質転換体が産生する酵素は、澱粉又はアミロペクチン、アミロースなどの澱粉質を酸及び／又はアミラーゼで処理して得られるマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースを始めとする、グルコース重合度３以上の一連のマルトオリゴ糖を含む澱粉加水分解物に作用させることにより、末端にトレハロース構造を有するα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロースなどの対応する非還元性糖質を収量良く、効率的に生成する。そして、これら非還元性糖質は、特開平７−２１３２８３号公報（特願平５−３４０３４３号）に開示されているトレハロース遊離酵素を作用させると、ほぼ定量的にトレハロースを生成する。
【００３０】
次に、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素の理化学的性質を解明すべく行なった一連の実験について説明する。
【００３１】
【実験例１ 精製酵素の調製】
【００３２】
【実験例１−１ 酵素Ｍ−１１の精製】
５００ｍｌ容三角フラスコにマルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）及び燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地（ｐＨ７．０）を１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅菌した。冷却後、三角フラスコ内の液体培地にリゾビウム・スピーシーズＭ−１１を植菌し、回転振盪下、２７℃で２４時間種培養した。別途、３０ｌ容ジャーファーメンタに上記と同組成の液体培地を２０ｌとり、滅菌後、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、液体培地をｐＨ６乃至８に保ちつつ、３０℃で２４時間通気撹拌培養した。
【００３３】
次に、上記で得た培養物約１８ｌを超高圧菌体破砕装置にとり、菌体を破砕後、遠心分離により採取した上清約１６ｌに硫酸アンモニウムを２０％飽和になるように加え、４℃で１時間静置後、遠心分離により沈澱部を除去した。得られた上清に６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で２４時間静置後、沈澱部を遠心分離により採取し、最少量の１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して２４時間透析後、遠心分離により不溶物を除去した。得られた上清を予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィー用カラム『ＤＥＡＥ−トヨパール』に負荷し、０Ｍから０．５Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液より酵素を含む画分を採取し、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１０時間透析後、遠心分離により不溶物を除去した。その後、上清を予め２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製疎水クロマトグラフィー用カラム『ブチルトヨパール』に負荷し、２Ｍから０Ｍに低下する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、カラムに５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液から酵素を含む画分を採取し、予め５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製ゲル濾過カラムクロマトグラフィー用カラム『トヨパールＨＷ−５５』に負荷し、カラムに５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液し、溶出液から酵素を含む画分を採取した。このようにして精製した酵素Ｍ−１１の比活性は約１９５単位／ｍｇ蛋白質であり、収量は培養物１ｌ当たり約２２０単位であった。
【００３４】
なお、この発明を通じて、酵素の活性は次の方法により測定した活性値（単位）で表示する。すなわち、マルトペンタオースを１．２５％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４ｍｌとり、これに酵素液を１ｍｌ加え、４０℃で６０分間インキュベートして反応させた後、反応液を１００℃で１０分間加熱して反応を停止させる。反応液を蒸留水で１０倍希釈した後、ソモギ・ネルソン法により還元力を測定する。当該酵素の１単位とは、上記条件下において、１分間にマルトペンタオース１μｍｏｌに相当する還元力を低下させる酵素の量と定義する。
【００３５】
【実験例１−２ 酵素Ｑ３６の精製】
実験例１−１と同様にアルスロバクター・スピーシーズＱ３６を培養し、培養物を処理したところ、比活性約２００単位／ｍｇ蛋白質の精製酵素Ｑ３６が、培養物１ｌ当たり、約２９５単位の収量で得られた。
【００３６】
【実験例２ 酵素の理化学的性質】
本実験例では、実験例１で得た精製酵素を試料に使い、当該酵素の理化学的性質を調べる。
【００３７】
【実験例２−１ 作用】
基質としてグルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース又はマルトヘプタオースを２０％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に実験例１で得た精製酵素Ｍ−１１又は精製酵素Ｑ３６を基質１ｇ当たり２単位加え、４０℃で４８時間反応させた。常法により反応物を脱塩した後、和光純薬製高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＷＢ−Ｔ−３３０』に負荷し、溶出液の糖濃度を東ソー製示差屈折計『ＲＩ−８０１２型』でモニターしながら、室温下にてカラムに蒸留水を０．５ｍｌ／分の流速で通液することにより、反応物に含まれる糖質を分離した。表１及び表２に、それぞれ、酵素Ｍ−１１及び酵素Ｑ３６を加えた場合の糖組成を示す。なお、表中の糖質Ｐ１乃至Ｐ５は、反応により生成した糖質をグルコース重合度の小さい順に命名したものである。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】
表１及び表２の結果から明らかなように、酵素Ｍ−１１及び酵素Ｑ３６は、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースなどのグルコース重合度が３以上の還元性澱粉糖からは新たな糖質を生成するけれども、グルコース重合度が３を下回るグルコースやマルトースからは新たな糖質を生成しない。また、反応により生成した糖質はそれぞれ糖質Ｐ１乃至Ｐ５のみであり、糖質Ｐ２乃至Ｐ５の含量は固形分当たり８５％以上と著しく高かった。
【００４１】
次に、糖質Ｐ１乃至Ｐ５を分離すべく、東京有機化学工業製強酸性カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６（Ｎａ＋型）』を内径２．０ｃｍ、長さ１ｍのジャケッ ト付きステンレス製カラム３本に充填し、これらカラムを直列に連結した。そして、カラム内の温度を５５℃に保ちつつ、カラムに糖質Ｐ１乃至Ｐ５のいずれかを含む前記反応物を別々に負荷した後、カラムに５５℃の蒸留水をＳＶ０．１３の流速で通液した。溶出液の糖組成を調べ、糖質Ｐ１乃至Ｐ５のいずれかを固形分で９７％以上含む画分を採取し、真空乾燥により粉末化した。このようにして精製した糖質Ｐ１乃至Ｐ５の還元力をソモギ・ネルソン法により調べたところ、いずれの糖質にも実質的な還元力は認められなかった。
【００４２】
さらに、糖質Ｐ１乃至Ｐ５を同定すべく、これら糖質のいずれかを５０ｍｇとり、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１ｍｌに溶解後、グルコアミラーゼを１単位加え、４０℃で６時間インキュベートした。表１及び表２に示す反応物の糖組成を高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ、それぞれ表３及び表４に示すように、全ての反応物からグルコースとトレハロースが検出された。同様にして、糖質Ｐ１乃至Ｐ５にβ−アミラーゼを作用させたところ、糖質Ｐ１及びＰ２がβ−アミラーゼの作用を受けなかったのに対して、糖質Ｐ３は１分子のマルトースと糖質Ｐ１を、糖質Ｐ４は１分子のマルトースと糖質Ｐ２を、また、糖質Ｐ５は２分子のマルトースと糖質Ｐ１を与えた。
【００４３】
【表３】
【００４４】
【表４】
【００４５】
表３及び表４の結果は、糖質Ｐ１乃至Ｐ５が１分子のトレハロースと１乃至５分子のグルコースにより構成されることを強く示唆している。また、グルコアミラーゼがマルトオリゴ糖におけるα−１，４結合及びα−１，６結合に特異的に切断することと、β−アミラーゼがマルトオリゴ糖におけるα−１，４結合をその末端よりマルトース単位で切断することから、糖質Ｐ１乃至Ｐ５は、グルコース又はグルコース重合度が２乃至５のマルトオリゴ糖の末端にトレハロース残基が１個結合した構造を有していると推定される。
【００４６】
以上の結果を総合的に判断すると、糖質Ｐ１乃至Ｐ５は、それぞれ、α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース又はα−マルトペンタオシルトレハロースと同定され、このことは、当該酵素にグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する作用のあることを裏付けている。
【００４７】
【実験例２−２ 分子量】
ユー・ケー・レムリが『ネーチャー』、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じて精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、分子量約７６，０００乃至８７，０００ダルトンに相当する位置に単一バンドが観察された。なお、このときの分子量マーカは、ミオシン（２００，０００ダルトン）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，２５０ダルトン）、フォスフォリラーゼＢ（９７，４００ダルトン）、血清アルブミン（６６，２００ダルトン）及びオボアルブミン（４５，０００ダルトン）であった。
【００４８】
【実験例２−３ 等電点】
等電点電気泳動法により測定したところ、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、約３．６乃至４．６に等電点を示した。
【００４９】
【実験例２−４ 至適温度】
常法により、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図１又は図２に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、３５乃至４０℃付近に至適温度を示した。
【００５０】
【実験例２−５ 至適ｐＨ】
常法により、ｐＨの相違する５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、４０℃で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図３又は図４に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、ｐＨ６．４乃至７．２付近に至適ｐＨを示した。
【００５１】
【実験例２−６ 熱安定性】
常法により、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図５又は図６に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、３５乃至４０℃付近まで安定であった。
【００５２】
【実験例２−７ ｐＨ安定性】
常法により、ｐＨの相違する５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、２５℃で１６時間インキュベートする条件で試験したところ、図７又は図８に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、ｐＨ５．５乃至１１．０付近まで安定であった。
【００５３】
【実験例２−８ Ｎ末端アミノ酸配列】
常法により、アプライッド・バイオシステム製気相プロテイン・シーケンサ『４７０Ａ型』を使用して分析したところ、酵素Ｍ−１１は、Ｎ末端に配列表における配列番号７に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００５４】
同様に分析したところ、酵素Ｑ３６は、Ｎ末端に配列表における配列番号８に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００５５】
【実験例２−９ 部分アミノ酸配列】
実験例１−１で得た精製酵素Ｍ−１１を適量とり、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて酵素濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダーゼを１０μｇ加え、３０℃で２２時間インキュベートして酵素を部分加水分解した。加水分解物を、予め１６％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた資生堂製逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム『カプセルパックＣ１８』に負荷し、次いで、１６％（ｖ／ｖ）から６４％（ｖ／ｖ）に上昇するアセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約２８分後又は約４０分後に溶出したペプチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片Ａ」又は「ペプチド断片Ｂ」と云う。）を含む画分を別々に採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以後、実験例２−８と同様に分析したところ、ペプチド断片Ａ及びＢは、配列表における配列番号９及び１０に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００５６】
別途、実験例１−２で得た精製酵素Ｑ３６を上記と同様にして部分加水分解し、予め２４％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた日本ミリポア・リミテッド製逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム『マイクロボンダパックＣ１８』に負荷し、２４％（ｖ／ｖ）から４４％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約２２分後又は約４０分後に溶出したペプチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片Ｃ」又は「ペプチド断片Ｄ」と云う。）を含む画分を採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以後、上記と同様に分析したところ、ペプチド断片Ｃ及びＤは、配列表における配列番号１１及び１２に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００５７】
酵素Ｍ−１１と酵素Ｑ３６の理化学的性質は以上のとおりであるが、以下の実施例では、これら理化学的性質に基づき、この発明による複製可能な組換えＤＮＡと形質転換体を調製するとともに、そこに含まれている当該酵素をコードするＤＮＡを採取し、その塩基配列とアミノ酸配列を決定する。なお、これら実施例で用いる手法自体は斯界において公知のものであり、例えば、ジェー・サムブルック等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス発行などにも詳述されている。
【００５８】
【実施例１ リゾビウム・スピーシーズＭ−１１に由来するＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】
【００５９】
【実施例１−１ 染色体ＤＮＡの調製】
リゾビウム・スピーシーズＭ−１１をバクト・ニュートリエント・ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、２７℃で２４時間回転振盪培養した。遠心分離により培養物から菌体を分離し、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷冷後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈澱した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテアーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。その後、反応物にクロロフォルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈澱を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
【００６０】
【実施例１−２ 組換えＤＮＡ ｐＢＭＴ７と形質転換体ＢＭＴ７の調製】実施例１−１で得た精製染色体ＤＮＡ溶液を約１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩを約３５単位加え、３７℃で約２０分間反応させて染色体ＤＮＡを部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約３，０００乃至７，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）を１μｇとり、常法により制限酵素Ｂａｍ ＨＩを作用させて完全に切断した後、上記で得たＤＮＡ断片１０μｇとＴ４ ＤＮＡリガーゼを２単位加え、４℃で一夜静置することによりＤＮＡ断片をベクター断片に連結した。そして、得られた組換えＤＮＡに東洋紡績製コンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ』を３０μｌ加え、氷冷下に３０分間静置後、４２℃に加温し、ＳＯＣブロスを加えて３７℃で１時間インキュベートすることにより、組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。
【００６１】
次に、上記で得た形質転換体を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０μｇ／ｍｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培地上にナイロン膜を載置し、培地上に形成された約４，４００個のコロニーをナイロン膜に固定した。別途、常法により、配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列における第１７乃至２１番目のＰｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓで表される配列に基づき５′−ＣＣＮＧＡＲＴＧＧＧＡＲＡＡ−３′で表される塩基配列のプローブ１を化学合成し、同位体３２Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合が認められた９種類の形質転換体を選択した。
【００６２】
常法により、これら９種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、配列表における配列番号１０に示すアミノ酸配列における第１６乃至２０番目のＴｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｐで表される配列に基づき化学合成した５′−ＡＣＮＧＡＲＴＴＹＴＧＧＧＡ−３′で表される塩基配列のプローブ２をイー・エム・サザーン『ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー』、第９８巻、第５０３〜５１７頁（１９７５年）に記載されている方法に準じてハイブリダイズさせ、プローブ２と顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択した。以上のようにして選択した組換えＤＮＡと形質転換体を、それぞれ、『ｐＢＭＴ７』又は『ＢＭＴ７』と命名した。
【００６３】
上記で得た形質転換体ＢＭＴ７をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常一般のアルカリ法により組換えＤＮＡを菌体外に溶出させた。処理物を常法により精製し、分析したところ、組換えＤＮＡ ｐＢＭＴ７は約９，３００塩基対からなり、図９に示す制限酵素地図で表される構造を有していた。図９に示すように、酵素Ｍ−１１をコードする２，３１６塩基対からなるＤＮＡは、制限酵素Ｐｓｔ Ｉによる切断部位付近の下流に位置していることが判明した。
【００６４】
【実施例１−３ 形質転換体ＢＭＴ７による酵素の産生】
マルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地をｐＨ７．０に調整し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間加熱滅菌し、冷却後、実施例１−２で得た形質転換体ＢＭＴ７を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約３，０００単位の酵素が産生していた。
【００６５】
別途、対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株及びリゾビウム・スピーシーズＭ−１１をアンピシリン無含有の同じ液体培地に植菌し、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１の場合、培養温度を３０℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の活性を測定したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約１，５００単位と、形質転換体ＢＭＴ７と比較して有意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、当該酵素を全く産生しなかった。
【００６６】
その後、形質転換体ＢＭＴ７が産生した酵素を実験例１−１と同様に精製し、その性質・性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量値約７６，０００乃至８７，０００ダルトンを、また、等電点電気泳動で約３．６乃至４．６に等電点を示すなど、実験例２で得られた酵素Ｍ−１１のものと同様の理化学的性質を有することが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術によっても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有意に向上することを示唆している。
【００６７】
【実施例２ リゾビウム・スピーシーズＭ−１１に由来する相補鎖ＤＮＡの調製とその塩基配列、アミノ酸配列の決定】
実施例１−２で得た組換えＤＮＡ ｐＢＭＴ７を、常法に従って、各種制限酵素で分解し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）にサブクローニングして、塩基配列決定用ＤＮＡとした。これら塩基配列決定用ＤＮＡを２μｇとり、これに２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて変性させた後、適量の冷エタノールを加え、生成したテンプレートＤＮＡを含む沈澱を採取し、真空乾燥した。このテンプレートＤＮＡに化学合成した５′−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３′で表される塩基配列のプライマー１を５０ｐｍｏｌ／ｍｌと、２０ｍＭ塩化マグネシウムと５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１０μｌ加え、６５℃で２分間インキュベートしてアニーリングした後、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰをそれぞれ７．５μＭ含む水溶液を２μｌと、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（２ｍＣｉ／ｍｌ）を０．５μｌと、０．１Ｍジチオスレイトールを１μｌと、１．５単位／ｍｌのＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを２μｌ加え、２５℃で５分間インキュベートすることによりプライマー１を５′末端から３′末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを生成させた。
【００６８】
次に、上記で得た相補鎖ＤＮＡを含む反応物を四等分し、それぞれにｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰのいずれかを８μＭと８０μＭ ｄＮＴＰを含む５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を２．５μｌ加え、３７℃で５分間インキュベートして反応させた後、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー及び０．０５％（ｗ／ｖ）キシレンシアノールを含む９５％（ｖ／ｖ）水性ホルムアミド溶液を４μｌ加えて反応を停止させた。反応物を沸騰水浴中で３分間加熱後、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上にとり、約２，０００Ｖの定電圧を印加しながら電気泳動してＤＮＡ断片を分離し、次いで、常法によりゲルを固定し、乾燥させた後、オートラジオグラフィーした。
【００６９】
ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号５に示す２，９３６塩基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表における配列番号５に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と配列表における配列番号７、９又は１０に示す酵素Ｍ−１１のＮ末端アミノ酸配列、部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号７のＮ末端アミノ酸配列は配列表における配列番号５における第１乃至２０番目の配列に、また、配列番号９又は１０の部分アミノ酸配列は配列表における配列番号５における第４８６乃至５０６番目又は第６０６乃至６２６番目の配列に一致した。これは、酵素Ｍ−１１が配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有するものであり、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１においては、酵素Ｍ−１１が配列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。
【００７０】
【実施例３ アルスロバクター・スピーシーズＱ３６に由来するＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】
【００７１】
【実施例３−１ 染色体ＤＮＡの調製】
実施例１−１と同様にしてアルスロバクター・スピーシーズＱ３６から染色体ＤＮＡを分離・精製し、濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【００７２】
【実施例３−２ 組換えＤＮＡ ｐＢＱＴ１３と形質転換体ＢＱＴ１３の調製】
実施例３−１で得た精製染色体ＤＮＡ溶液を実施例１−２と同様に部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約３，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用し、このＤＮＡ断片を実施例１−２と同様に制限酵素Ｂａｍ ＨＩによるベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）の消化物に連結し、得られた組換えＤＮＡを大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株に導入した。得られた形質転換体を実施例１−２と同様に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを含む寒天平板培地で培養し、生成した約４，５００個のコロニーをナイロン膜上に固定する一方、配列表における配列番号１２に示すアミノ酸配列における第１１乃至１６番目のＰｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｓｐで表される配列に基づき５′−ＴＴＹＧＡＹＧＴＮＧＡＹＴＧＧＧＡ−３′で表される塩基配列のプローブ３を化学合成し、同位体３２Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合が認められた８種類の形質転換体を選択した。
【００７３】
実施例１−２と同様にして、これら８種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、配列表における配列番号１１に示すアミノ酸配列における第１６乃至２０番目のＴｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｐで表される配列に基づき化学合成した５′−ＡＣＮＧＡＲＴＴＹＴＧＧＧＡ−３′で表される塩基配列のプローブ４をハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択した。以上のようにして選択した組換えＤＮＡと形質転換体を、それぞれ、『ｐＢＱＴ１３』又は『ＢＱＴ１３』と命名した。
【００７４】
その後、この形質転換体ＢＱＴ１３をアンピシリンを含むＬ−ブロス培地で実施例１−２と同様に培養し、培養物より採取した菌体から組換えＤＮＡを溶出させ、精製し、分析したところ、組換えＤＮＡ ｐＢＱＴ１３は約７，２００残基対からなり、図１０に示す制限酵素地図で表される構造を有していた。図１０に示すように、酵素Ｑ３６をコードする２，３２５塩基対からなるＤＮＡは、制限酵素Ｘｍｎ Ｉによる切断部位付近の下流に位置していることが判明した。
【００７５】
【実施例３−３ 形質転換体ＢＱＴ１３による酵素の産生】
マルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地をｐＨ７．０に調整し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間加熱滅菌し、冷却後、実施例３−２で得た形質転換体ＢＱＴ１３を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約２，４５０単位の酵素が産生していた。
【００７６】
別途、対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株及びアルスロバクター・スピーシーズＱ３６をアンピシリン無含有の同じ組成の液体培地に植菌し、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６の場合、培養温度を３０℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の活性を測定したところ、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約１，２００単位と、形質転換体ＢＱＴ１３と比較して有意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、当該酵素を産生しなかった。
【００７７】
その後、形質転換体ＢＱＴ１３が産生した酵素を実験例１−１と同様に精製し、その性質・性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量約７６，０００乃至８７，０００ダルトンを、また、等電点電気泳動で約３．６乃至４．６に等電点を示すなど、実験例２で得られた酵素Ｑ３６のものと同様の理化学的性質を有することが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術によっても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有意に向上することを示唆している。
【００７８】
【実施例４ アルスロバクター・スピーシーズＱ３６に由来する相補鎖ＤＮＡの調製とその塩基配列、アミノ酸配列の決定】
実施例３−２で得た組換えＤＮＡ ｐＢＱＴ１３を実施例２と同様に処理してテンプレートＤＮＡとし、これをプライマー１とともにアニーリング後、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライマー１を５′末端から３′末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを生成させた。実施例２と同様に、この相補鎖ＤＮＡにジデオキシ・チェーン・ターミネータ法を適用し、ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号６に示す３，０７３塩基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表における配列番号６に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と配列表における配列番号８、１１又は１２に示すＮ末端アミノ酸配列、部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号８に示すＮ末端アミノ酸配列は配列表における配列番号６における第１乃至２０番目の配列に、また、配列番号１１又は１２の部分アミノ酸配列は配列表における配列番号６における第６０６乃至６２５番目又は第１１０乃至１２９番目の配列に一致した。これは、酵素Ｑ３６が配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有するものであり、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６においては、酵素Ｑ３６が配列表における配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。
【００７９】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する、従来未知の全く新規な酵素の発見に基づくものである。この発明は、組換えＤＮＡ技術により斯かる酵素を大規模且つ効率的に生産する道を拓くものである。しかも、この発明による形質転換体が産生する酵素は、全アミノ酸配列までが明らかにされた酵素であり、食品等への配合使用を前提とするトレハロースや末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質の製造に安心して使用し得るものである。
【００８０】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する意義のある発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な発明であると言える。
【００８１】
【配列表】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【図面の簡単な説明】
【図１】酵素Ｍ−１１の至適温度を示す図である。
【図２】酵素Ｑ３６の至適温度を示す図である。
【図３】酵素Ｍ−１１の至適ｐＨを示す図である。
【図４】酵素Ｑ３６の至適ｐＨを示す図である。
【図５】酵素Ｍ−１１の熱安定性を示す図である。
【図６】酵素Ｑ３６の熱安定性を示す図である。
【図７】酵素Ｍ−１１のｐＨ安定性を示す図である。
【図８】酵素Ｑ３６のｐＨ安定性を示す図である。
【図９】この発明による組換えＤＮＡであるｐＢＭＴ７の制限酵素地図である。なお、図中、太線表示部は、酵素Ｍ−１１をコードするＤＮＡを示す。
【図１０】この発明による組換えＤＮＡであるｐＢＱＴ１３の制限酵素地図である。なお、図中、太線表示部は、酵素Ｑ３６をコードするＤＮＡを示す。
【産業上の利用分野】
この発明は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素をコードする新規なＤＮＡと、そのＤＮＡを含む組換えＤＮＡ並びに形質転換体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは、グルコース２分子が還元性基同士結合した二糖類であり、天然には細菌、真菌、藻類、昆虫などに微量存在する。トレハロースは分子中に還元性基を持たないので、アミノ酸類の存在下で加熱しても褐変反応を起こすことがなく、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできる利点がある。しかしながら、従来の製造方法では所望量を入手するのが難しく、実際に飲食物の甘味付けに使われることは殆ど無かった。
【０００３】
これまでの製造方法は、微生物の菌体を利用する方法と、糖質に複合酵素系を作用させる方法とに大別される。前者の方法は、特開昭５０−１５４４８５号公報などにも見られるように、細菌、酵母などの微生物を栄養培地で増殖させ、培養物中の菌体からトレハロースを採取するものである。一方、後者の方法は、特開昭５８−２１６６９５号公報などにも見られるように、基質にマルトースを使用し、これにマルトース・フォスフォリラーゼとトレハロース・フォスフォリラーゼからなる複合酵素系を作用させ、生成したトレハロースを系外に取出すものである。前者の方法は、微生物そのものの増殖は比較的容易なものの、トレハロースを菌体から採取するのに一連の繁雑な工程を要し、しかも、菌体に含まれるトレハロースが１５％（ｗ／ｗ）と僅少であるという問題があった。後者の方法は、トレハロースそのものの分離は比較的容易なものの、反応自体が２種類の酵素による平衡反応であり、しかも、その平衡が常時グルコース燐酸側に傾いていることから、基質を高濃度にして反応させ、トレハロースの収量を上げることが原理的に難しかった。
【０００４】
斯かる状況に鑑み、本発明者が、澱粉糖からトレハロース構造を有する糖質を生成する酵素につき鋭意検索したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６などの微生物が、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するという、従来未知の全く新規な酵素を産生することが判明した。この知見とあい前後して、この非還元性糖質は、同じくリゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６が産生する別の酵素により、ほぼ定量的にトレハロースとグルコース及び／又はマルトオリゴ糖に加水分解されることが判明した。これら酵素を併用することにより、澱粉を原料に所望量のトレハロースが比較的容易に得られることとなり、トレハロースに係わる前記課題は悉く解決されていくものと期待される。しかしながら、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１もアルスロバクター・スピーシーズＱ３６も当該酵素の産生能が充分でなく、トレハロースや末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を大規模に製造しようとすると、微生物を大量に培養しなければならないという問題がある。
【０００５】
一方、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には目覚しいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解明されていない酵素であっても、これをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培養することにより、比較的容易に所望量の酵素が取得できるようになった。斯かる状況に鑑み、両酵素をコードする遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明するのが急務となっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の目的は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素をコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００７】
この発明の別の目的は、そのＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる組換えＤＮＡを提供することにある。
【０００８】
この発明のさらに別の目的は、その組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記第一の課題を、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素をコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００１０】
この発明は、前記第二の課題を、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡにより解決するものである。
【００１１】
この発明は、前記第三の課題を、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００１２】
【作用】
この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して複製可能な組換えＤＮＡとし、この組換えＤＮＡを、本来、当該酵素を産生しないけれども、比較的容易に増殖させることのできる宿主に導入して形質転換体とすることにより、コードされた当該酵素の産生を発現する。
【００１３】
この発明の組換えＤＮＡは、本来、当該酵素を産生しないけれども、比較的容易に増殖させることのできる宿主に導入して形質転換体とし、この形質転換体を培養することにより、コードされた当該酵素の産生を発現する。
【００１４】
この発明の形質転換体は、培養すると、当該酵素を産生する。
【００１５】
以下、実験例、実施例等に基づきこの発明を説明すると、この発明は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する、従来未知の全く新規な酵素をコードするＤＮＡに関するものである。斯かる酵素はリゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６の培養物から得ることができ（以下、それぞれ「酵素Ｍ−１１」又は「酵素Ｑ３６」と云う。）、本発明者がカラムクロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこの酵素を単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質はポリペプチドであり、次のような理化学的性質を有することが判明した。
（１） 作用
グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する。
（２） 分子量
約７６，０００乃至８７，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
（３） 等電点
約３．６乃至４．６（等電点電気泳動）
（４） 至適温度
ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、３５乃至４０℃付近に至適温度を示す。
（５） 至適ｐＨ
４０℃で６０分間インキュベートすると、ｐＨ６．４乃至７．２付近に至適ｐＨを示す。
（６） 熱安定性
ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、３５乃至４０℃付近まで安定である。
（７） ｐＨ安定性
２５℃で１６時間インキュベートすると、ｐＨ５．５乃至１１．０付近まで安定である。
【００１６】
斯かる理化学的性質を有する酵素は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。なお、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１は岡山県岡山市の土壌から分離され、平成４年１２月２４日以降、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省、工業技術院、生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託番号『ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０』で寄託されている。一方、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６は岡山県総社市の土壌から分離されたものであり、平成５年６月３日以降、同センターに寄託番号『ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１６』で寄託されている。同じ出願人による特開平７−１４３８７６号公報（特願平５−３４９２１６号明細書）には、当該酵素の性質・性状とともに、両微生物の菌学的性質が詳細に開示されている。
【００１７】
本発明者が、高度に精製した酵素Ｍ−１１の部分アミノ酸配列を調べ、その部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにしてリゾビウム・スピーシーズＭ−１１の染色体ＤＮＡを鋭意検索した結果、配列表における配列番号３に示す塩基配列を有する２，３１６塩基対からなるＤＮＡ断片が得られた。そして、その塩基配列を解読したところ、酵素Ｍ−１１は、配列表における配列番号１に示すように、７７２個のアミノ酸により構成されていることが判明した。
【００１８】
一方、酵素Ｑ３６の部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにし、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６の染色体ＤＮＡを同様に検索したところ、配列表における配列番号４に示す塩基配列を有する２，３２５塩基対からなるＤＮＡ断片が得られた。この塩基配列を解読したところ、酵素Ｑ３６は７７５個のアミノ酸からなり、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００１９】
配列表における配列番号１乃至４に示す塩基配列及びアミノ酸配列を解明するに到った一連の工程を要約すると、次のようになる。
（１） 供与体微生物の培養物から当該酵素を分離し、高度に精製した。精製酵素をプロテアーゼにより部分加水分解後、加水分解物から２種類のペプチド断片を単離し、そのアミノ酸配列を決定した。
（２） 別途、供与体微生物の菌体より染色体ＤＮＡを分離し、精製後、制限酵素により部分的に切断して約３，０００乃至７，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。ＤＮＡリガーゼにより、このＤＮＡ断片を予め制限酵素で切断しておいたプラスミドベクターに連結し、組換えＤＮＡを作製した。
（３） 大腸菌に組換えＤＮＡを導入して形質転換体を作製し、前記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブとするコロニーハイブリダイゼーションにより当該酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体を選択した。
（４） 形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、プライマーとともにアニーリング後、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライマーを伸長し、得られた相補鎖ＤＮＡをジデオキシ・チェーン・ターミネータ法により分析して塩基配列を決定した。そして、その塩基配列から推定されるアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列とを比較し、その塩基配列が当該酵素をコードしていることを確認した。
【００２０】
供与体微生物の遺伝子がコードするアミノ酸配列は配列表における配列番号１又は２に示すとおりであるが、この発明のＤＮＡは、配列表における配列番号１又は２に示すとおりのアミノ酸配列をコードするものは無論のこと、これと相同的なアミノ酸配列を有するものをも包含するものとする。すなわち、組換えＤＮＡ技術の進歩により、斯界においては、酵素の作用を実質的に変えることなく、比較的容易にその構成アミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換できるようになった。また、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地の成分・組成、培養温度・ｐＨなどに依っては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の酵素作用は保持しているものの、配列表における配列番号１又は２のアミノ酸配列におけるＮ末端付近のアミノ酸の１個又は２個以上以上が欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した変異体の産生することがある。斯かる技術水準に鑑み、この発明でいう酵素とは、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列をそのまま具備するものは言うに及ばず、そのアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上が他のアミノ酸に置き換わるか、欠失若しくは付加した変異体であっても、それがグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するかぎり包含するものとする。
【００２１】
さらに、斯界においては、遺伝子コードの縮重により、コードするアミノ酸配列を変えることなく、ＤＮＡにおける塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換することができる。これにより、この発明のＤＮＡは、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列をそのまま有するもののみならず、それが配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を有する酵素若しくはその相同変異体をコードするものであるかぎり、遺伝子コードの縮重に基づき、塩基の１個又は２個以上が他の塩基に置き換わったものをも包含するものとする。
【００２２】
また、現在の組換えＤＮＡ技術に依るときには、一般に、５′末端からの塩基配列が決まれば、これに相補的な塩基配列は一義的に定まる。したがって、この発明のＤＮＡは、上記いずれかの塩基配列に相補的な塩基配列を有するものも包含するものとする。なお、この発明のＤＮＡが宿主中で実際に当該酵素の産生を発現するために、当該酵素又はその相同変異体をコードする塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換し得ることはいうまでもない。
【００２３】
この発明のＤＮＡは上記のごときものであるが、この発明のＤＮＡは、それが前記のごとき配列を有するかぎり、それが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の給源としては、例えば、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１６）、ブレビバクテリウム・ヘロボルム（ＡＴＣＣ１１８２２）、フラボバクテリウム・アクアチレ（ＩＦＯ３７７２）、ミクロコッカス・ルテウス（ＩＦＯ３０６４）、ミクロコッカス・ロゼウス（ＡＴＣＣ１８６）、クルトバクテリウム・シトレウム（ＩＦＯ１５２３１）、マイコバクテリウム・スメグマチス（ＡＴＣＣ１９４２０）及びテラバクター・ツメスセンス（ＩＦＯ１２９６０）を含むリゾビウム属、アルスロバクター属、ブレビバクテリウム属、フラボバクテリウム属、ミクロコッカス属、クルトバクテリウム属、マイコバクテリウム属、テラバクター属の微生物が挙げられ、これら微生物の菌体からはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に植菌し、好気的条件下で約１乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより、当該ＤＮＡを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。このとき、細胞壁溶解酵素にプロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵素を併用したり、菌体を超音波処理する際、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈澱、遠心分離、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理などの斯界における通常一般の方法を適用すれば目的のＤＮＡが得られる。
【００２４】
一方、この発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を分離し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。
【００２５】
さて、この発明は、本来、当該酵素を産生しないけれども、比較的容易に増殖させることのできる微生物や動植物の細胞に導入すると当該酵素の産生を発現する複製可能な組換えＤＮＡに係わるものでもある。斯かる組換えＤＮＡは、通常、前述のごときＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられ、このうち、この発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるにはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるにはｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを２種以上の宿主内で増殖させる場合に有用である。
【００２６】
斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、この発明のＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００２７】
この発明による組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主微生物に導入することができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を含む栄養培地で培養し、該澱粉糖より末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するものを選択すればよい。
【００２８】
斯くして得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体内外に当該酵素を産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖などの糖質が、また、窒素源としては、例えば、アンモニア若しくはアンモニウム塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に植菌し、栄養培地を温度２５乃至６５℃、ｐＨ２乃至８に保ちつつ、通気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至６日間培養すれば、当該酵素を含む培養物が得られる。この培養物は酵素剤としてそのまま使用可能ではあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより酵素を菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には酵素を精製するための通常一般の方法が採用でき、例えば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種若しくは２種以上を適宜組合せて適用すればよい。
【００２９】
前述のとおり、当該酵素は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するという、従来の酵素に見られない顕著な作用を有する。したがって、この発明の形質転換体が産生する酵素は、澱粉又はアミロペクチン、アミロースなどの澱粉質を酸及び／又はアミラーゼで処理して得られるマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースを始めとする、グルコース重合度３以上の一連のマルトオリゴ糖を含む澱粉加水分解物に作用させることにより、末端にトレハロース構造を有するα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロースなどの対応する非還元性糖質を収量良く、効率的に生成する。そして、これら非還元性糖質は、特開平７−２１３２８３号公報（特願平５−３４０３４３号）に開示されているトレハロース遊離酵素を作用させると、ほぼ定量的にトレハロースを生成する。
【００３０】
次に、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素の理化学的性質を解明すべく行なった一連の実験について説明する。
【００３１】
【実験例１ 精製酵素の調製】
【００３２】
【実験例１−１ 酵素Ｍ−１１の精製】
５００ｍｌ容三角フラスコにマルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）及び燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地（ｐＨ７．０）を１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅菌した。冷却後、三角フラスコ内の液体培地にリゾビウム・スピーシーズＭ−１１を植菌し、回転振盪下、２７℃で２４時間種培養した。別途、３０ｌ容ジャーファーメンタに上記と同組成の液体培地を２０ｌとり、滅菌後、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、液体培地をｐＨ６乃至８に保ちつつ、３０℃で２４時間通気撹拌培養した。
【００３３】
次に、上記で得た培養物約１８ｌを超高圧菌体破砕装置にとり、菌体を破砕後、遠心分離により採取した上清約１６ｌに硫酸アンモニウムを２０％飽和になるように加え、４℃で１時間静置後、遠心分離により沈澱部を除去した。得られた上清に６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で２４時間静置後、沈澱部を遠心分離により採取し、最少量の１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して２４時間透析後、遠心分離により不溶物を除去した。得られた上清を予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィー用カラム『ＤＥＡＥ−トヨパール』に負荷し、０Ｍから０．５Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液より酵素を含む画分を採取し、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１０時間透析後、遠心分離により不溶物を除去した。その後、上清を予め２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製疎水クロマトグラフィー用カラム『ブチルトヨパール』に負荷し、２Ｍから０Ｍに低下する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、カラムに５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液から酵素を含む画分を採取し、予め５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製ゲル濾過カラムクロマトグラフィー用カラム『トヨパールＨＷ−５５』に負荷し、カラムに５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液し、溶出液から酵素を含む画分を採取した。このようにして精製した酵素Ｍ−１１の比活性は約１９５単位／ｍｇ蛋白質であり、収量は培養物１ｌ当たり約２２０単位であった。
【００３４】
なお、この発明を通じて、酵素の活性は次の方法により測定した活性値（単位）で表示する。すなわち、マルトペンタオースを１．２５％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４ｍｌとり、これに酵素液を１ｍｌ加え、４０℃で６０分間インキュベートして反応させた後、反応液を１００℃で１０分間加熱して反応を停止させる。反応液を蒸留水で１０倍希釈した後、ソモギ・ネルソン法により還元力を測定する。当該酵素の１単位とは、上記条件下において、１分間にマルトペンタオース１μｍｏｌに相当する還元力を低下させる酵素の量と定義する。
【００３５】
【実験例１−２ 酵素Ｑ３６の精製】
実験例１−１と同様にアルスロバクター・スピーシーズＱ３６を培養し、培養物を処理したところ、比活性約２００単位／ｍｇ蛋白質の精製酵素Ｑ３６が、培養物１ｌ当たり、約２９５単位の収量で得られた。
【００３６】
【実験例２ 酵素の理化学的性質】
本実験例では、実験例１で得た精製酵素を試料に使い、当該酵素の理化学的性質を調べる。
【００３７】
【実験例２−１ 作用】
基質としてグルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース又はマルトヘプタオースを２０％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に実験例１で得た精製酵素Ｍ−１１又は精製酵素Ｑ３６を基質１ｇ当たり２単位加え、４０℃で４８時間反応させた。常法により反応物を脱塩した後、和光純薬製高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＷＢ−Ｔ−３３０』に負荷し、溶出液の糖濃度を東ソー製示差屈折計『ＲＩ−８０１２型』でモニターしながら、室温下にてカラムに蒸留水を０．５ｍｌ／分の流速で通液することにより、反応物に含まれる糖質を分離した。表１及び表２に、それぞれ、酵素Ｍ−１１及び酵素Ｑ３６を加えた場合の糖組成を示す。なお、表中の糖質Ｐ１乃至Ｐ５は、反応により生成した糖質をグルコース重合度の小さい順に命名したものである。
【００３８】
【表１】
【表２】
表１及び表２の結果から明らかなように、酵素Ｍ−１１及び酵素Ｑ３６は、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースなどのグルコース重合度が３以上の還元性澱粉糖からは新たな糖質を生成するけれども、グルコース重合度が３を下回るグルコースやマルトースからは新たな糖質を生成しない。また、反応により生成した糖質はそれぞれ糖質Ｐ１乃至Ｐ５のみであり、糖質Ｐ２乃至Ｐ５の含量は固形分当たり８５％以上と著しく高かった。
【００４１】
次に、糖質Ｐ１乃至Ｐ５を分離すべく、東京有機化学工業製強酸性カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６（Ｎａ＋型）』を内径２．０ｃｍ、長さ１ｍのジャケッ ト付きステンレス製カラム３本に充填し、これらカラムを直列に連結した。そして、カラム内の温度を５５℃に保ちつつ、カラムに糖質Ｐ１乃至Ｐ５のいずれかを含む前記反応物を別々に負荷した後、カラムに５５℃の蒸留水をＳＶ０．１３の流速で通液した。溶出液の糖組成を調べ、糖質Ｐ１乃至Ｐ５のいずれかを固形分で９７％以上含む画分を採取し、真空乾燥により粉末化した。このようにして精製した糖質Ｐ１乃至Ｐ５の還元力をソモギ・ネルソン法により調べたところ、いずれの糖質にも実質的な還元力は認められなかった。
【００４２】
さらに、糖質Ｐ１乃至Ｐ５を同定すべく、これら糖質のいずれかを５０ｍｇとり、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１ｍｌに溶解後、グルコアミラーゼを１単位加え、４０℃で６時間インキュベートした。表１及び表２に示す反応物の糖組成を高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ、それぞれ表３及び表４に示すように、全ての反応物からグルコースとトレハロースが検出された。同様にして、糖質Ｐ１乃至Ｐ５にβ−アミラーゼを作用させたところ、糖質Ｐ１及びＰ２がβ−アミラーゼの作用を受けなかったのに対して、糖質Ｐ３は１分子のマルトースと糖質Ｐ１を、糖質Ｐ４は１分子のマルトースと糖質Ｐ２を、また、糖質Ｐ５は２分子のマルトースと糖質Ｐ１を与えた。
【００４３】
【表３】
【表４】
表３及び表４の結果は、糖質Ｐ１乃至Ｐ５が１分子のトレハロースと１乃至５分子のグルコースにより構成されることを強く示唆している。また、グルコアミラーゼがマルトオリゴ糖におけるα−１，４結合及びα−１，６結合に特異的に切断することと、β−アミラーゼがマルトオリゴ糖におけるα−１，４結合をその末端よりマルトース単位で切断することから、糖質Ｐ１乃至Ｐ５は、グルコース又はグルコース重合度が２乃至５のマルトオリゴ糖の末端にトレハロース残基が１個結合した構造を有していると推定される。
【００４６】
以上の結果を総合的に判断すると、糖質Ｐ１乃至Ｐ５は、それぞれ、α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース又はα−マルトペンタオシルトレハロースと同定され、このことは、当該酵素にグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する作用のあることを裏付けている。
【００４７】
【実験例２−２ 分子量】
ユー・ケー・レムリが『ネーチャー』、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じて精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、分子量約７６，０００乃至８７，０００ダルトンに相当する位置に単一バンドが観察された。なお、このときの分子量マーカは、ミオシン（２００，０００ダルトン）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，２５０ダルトン）、フォスフォリラーゼＢ（９７，４００ダルトン）、血清アルブミン（６６，２００ダルトン）及びオボアルブミン（４５，０００ダルトン）であった。
【００４８】
【実験例２−３ 等電点】
等電点電気泳動法により測定したところ、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、約３．６乃至４．６に等電点を示した。
【００４９】
【実験例２−４ 至適温度】
常法により、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図１又は図２に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、３５乃至４０℃付近に至適温度を示した。
【００５０】
【実験例２−５ 至適ｐＨ】
常法により、ｐＨの相違する５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、４０℃で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図３又は図４に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、ｐＨ６．４乃至７．２付近に至適ｐＨを示した。
【００５１】
【実験例２−６ 熱安定性】
常法により、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図５又は図６に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、３５乃至４０℃付近まで安定であった。
【００５２】
【実験例２−７ ｐＨ安定性】
常法により、ｐＨの相違する５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、２５℃で１６時間インキュベートする条件で試験したところ、図７又は図８に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、ｐＨ５．５乃至１１．０付近まで安定であった。
【００５３】
【実験例２−８ Ｎ末端アミノ酸配列】
常法により、アプライッド・バイオシステム製気相プロテイン・シーケンサ『４７０Ａ型』を使用して分析したところ、酵素Ｍ−１１は、Ｎ末端に配列表における配列番号７に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００５４】
同様に分析したところ、酵素Ｑ３６は、Ｎ末端に配列表における配列番号８に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００５５】
【実験例２−９ 部分アミノ酸配列】
実験例１−１で得た精製酵素Ｍ−１１を適量とり、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて酵素濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダーゼを１０μｇ加え、３０℃で２２時間インキュベートして酵素を部分加水分解した。加水分解物を、予め１６％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた資生堂製逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム『カプセルパックＣ１８』に負荷し、次いで、１６％（ｖ／ｖ）から６４％（ｖ／ｖ）に上昇するアセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約２８分後又は約４０分後に溶出したペプチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片Ａ」又は「ペプチド断片Ｂ」と云う。）を含む画分を別々に採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以後、実験例２−８と同様に分析したところ、ペプチド断片Ａ及びＢは、配列表における配列番号９及び１０に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００５６】
別途、実験例１−２で得た精製酵素Ｑ３６を上記と同様にして部分加水分解し、予め２４％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた日本ミリポア・リミテッド製逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム『マイクロボンダパックＣ１８』に負荷し、２４％（ｖ／ｖ）から４４％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約２２分後又は約４０分後に溶出したペプチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片Ｃ」又は「ペプチド断片Ｄ」と云う。）を含む画分を採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以後、上記と同様に分析したところ、ペプチド断片Ｃ及びＤは、配列表における配列番号１１及び１２に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００５７】
酵素Ｍ−１１と酵素Ｑ３６の理化学的性質は以上のとおりであるが、以下の実施例では、これら理化学的性質に基づき、この発明による複製可能な組換えＤＮＡと形質転換体を調製するとともに、そこに含まれている当該酵素をコードするＤＮＡを採取し、その塩基配列とアミノ酸配列を決定する。なお、これら実施例で用いる手法自体は斯界において公知のものであり、例えば、ジェー・サムブルック等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス発行などにも詳述されている。
【００５８】
【実施例１ リゾビウム・スピーシーズＭ−１１に由来するＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】
【００５９】
【実施例１−１ 染色体ＤＮＡの調製】
リゾビウム・スピーシーズＭ−１１をバクト・ニュートリエント・ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、２７℃で２４時間回転振盪培養した。遠心分離により培養物から菌体を分離し、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷冷後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈澱した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテアーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。その後、反応物にクロロフォルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈澱を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
【００６０】
【実施例１−２ 組換えＤＮＡ ｐＢＭＴ７と形質転換体ＢＭＴ７の調製】実施例１−１で得た精製染色体ＤＮＡ溶液を約１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩを約３５単位加え、３７℃で約２０分間反応させて染色体ＤＮＡを部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約３，０００乃至７，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）を１μｇとり、常法により制限酵素Ｂａｍ ＨＩを作用させて完全に切断した後、上記で得たＤＮＡ断片１０μｇとＴ４ ＤＮＡリガーゼを２単位加え、４℃で一夜静置することによりＤＮＡ断片をベクター断片に連結した。そして、得られた組換えＤＮＡに東洋紡績製コンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ』を３０μｌ加え、氷冷下に３０分間静置後、４２℃に加温し、ＳＯＣブロスを加えて３７℃で１時間インキュベートすることにより、組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。
【００６１】
次に、上記で得た形質転換体を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０μｇ／ｍｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培地上にナイロン膜を載置し、培地上に形成された約４，４００個のコロニーをナイロン膜に固定した。別途、常法により、配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列における第１７乃至２１番目のＰｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓで表される配列に基づき５′−ＣＣＮＧＡＲＴＧＧＧＡＲＡＡ−３′で表される塩基配列のプローブ１を化学合成し、同位体３２Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合が認められた９種類の形質転換体を選択した。
【００６２】
常法により、これら９種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、配列表における配列番号１０に示すアミノ酸配列における第１６乃至２０番目のＴｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｐで表される配列に基づき化学合成した５′−ＡＣＮＧＡＲＴＴＹＴＧＧＧＡ−３′で表される塩基配列のプローブ２をイー・エム・サザーン『ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー』、第９８巻、第５０３〜５１７頁（１９７５年）に記載されている方法に準じてハイブリダイズさせ、プローブ２と顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択した。以上のようにして選択した組換えＤＮＡと形質転換体を、それぞれ、『ｐＢＭＴ７』又は『ＢＭＴ７』と命名した。
【００６３】
上記で得た形質転換体ＢＭＴ７をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常一般のアルカリ法により組換えＤＮＡを菌体外に溶出させた。処理物を常法により精製し、分析したところ、組換えＤＮＡ ｐＢＭＴ７は約９，３００塩基対からなり、図９に示す制限酵素地図で表される構造を有していた。図９に示すように、酵素Ｍ−１１をコードする２，３１６塩基対からなるＤＮＡは、制限酵素Ｐｓｔ Ｉによる切断部位付近の下流に位置していることが判明した。
【００６４】
【実施例１−３ 形質転換体ＢＭＴ７による酵素の産生】
マルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地をｐＨ７．０に調整し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間加熱滅菌し、冷却後、実施例１−２で得た形質転換体ＢＭＴ７を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約３，０００単位の酵素が産生していた。
【００６５】
別途、対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株及びリゾビウム・スピーシーズＭ−１１をアンピシリン無含有の同じ液体培地に植菌し、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１の場合、培養温度を３０℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の活性を測定したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約１，５００単位と、形質転換体ＢＭＴ７と比較して有意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、当該酵素を全く産生しなかった。
【００６６】
その後、形質転換体ＢＭＴ７が産生した酵素を実験例１−１と同様に精製し、その性質・性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量値約７６，０００乃至８７，０００ダルトンを、また、等電点電気泳動で約３．６乃至４．６に等電点を示すなど、実験例２で得られた酵素Ｍ−１１のものと同様の理化学的性質を有することが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術によっても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有意に向上することを示唆している。
【００６７】
【実施例２ リゾビウム・スピーシーズＭ−１１に由来する相補鎖ＤＮＡの調製とその塩基配列、アミノ酸配列の決定】
実施例１−２で得た組換えＤＮＡ ｐＢＭＴ７を、常法に従って、各種制限酵素で分解し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）にサブクローニングして、塩基配列決定用ＤＮＡとした。これら塩基配列決定用ＤＮＡを２μｇとり、これに２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて変性させた後、適量の冷エタノールを加え、生成したテンプレートＤＮＡを含む沈澱を採取し、真空乾燥した。このテンプレートＤＮＡに化学合成した５′−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３′で表される塩基配列のプライマー１を５０ｐｍｏｌ／ｍｌと、２０ｍＭ塩化マグネシウムと５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１０μｌ加え、６５℃で２分間インキュベートしてアニーリングした後、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰをそれぞれ７．５μＭ含む水溶液を２μｌと、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（２ｍＣｉ／ｍｌ）を０．５μｌと、０．１Ｍジチオスレイトールを１μｌと、１．５単位／ｍｌのＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを２μｌ加え、２５℃で５分間インキュベートすることによりプライマー１を５′末端から３′末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを生成させた。
【００６８】
次に、上記で得た相補鎖ＤＮＡを含む反応物を四等分し、それぞれにｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰのいずれかを８μＭと８０μＭ ｄＮＴＰを含む５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を２．５μｌ加え、３７℃で５分間インキュベートして反応させた後、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー及び０．０５％（ｗ／ｖ）キシレンシアノールを含む９５％（ｖ／ｖ）水性ホルムアミド溶液を４μｌ加えて反応を停止させた。反応物を沸騰水浴中で３分間加熱後、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上にとり、約２，０００Ｖの定電圧を印加しながら電気泳動してＤＮＡ断片を分離し、次いで、常法によりゲルを固定し、乾燥させた後、オートラジオグラフィーした。
【００６９】
ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号５に示す２，９３６塩基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表における配列番号５に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と配列表における配列番号７、９又は１０に示す酵素Ｍ−１１のＮ末端アミノ酸配列、部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号７のＮ末端アミノ酸配列は配列表における配列番号５における第１乃至２０番目の配列に、また、配列番号９又は１０の部分アミノ酸配列は配列表における配列番号５における第４８６乃至５０６番目又は第６０６乃至６２６番目の配列に一致した。これは、酵素Ｍ−１１が配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有するものであり、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１においては、酵素Ｍ−１１が配列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。
【００７０】
【実施例３ アルスロバクター・スピーシーズＱ３６に由来するＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】
【００７１】
【実施例３−１ 染色体ＤＮＡの調製】
実施例１−１と同様にしてアルスロバクター・スピーシーズＱ３６から染色体ＤＮＡを分離・精製し、濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【００７２】
【実施例３−２ 組換えＤＮＡ ｐＢＱＴ１３と形質転換体ＢＱＴ１３の調製】
実施例３−１で得た精製染色体ＤＮＡ溶液を実施例１−２と同様に部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約３，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用し、このＤＮＡ断片を実施例１−２と同様に制限酵素Ｂａｍ ＨＩによるベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）の消化物に連結し、得られた組換えＤＮＡを大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株に導入した。得られた形質転換体を実施例１−２と同様に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを含む寒天平板培地で培養し、生成した約４，５００個のコロニーをナイロン膜上に固定する一方、配列表における配列番号１２に示すアミノ酸配列における第１１乃至１６番目のＰｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｓｐで表される配列に基づき５′−ＴＴＹＧＡＹＧＴＮＧＡＹＴＧＧＧＡ−３′で表される塩基配列のプローブ３を化学合成し、同位体３２Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合が認められた８種類の形質転換体を選択した。
【００７３】
実施例１−２と同様にして、これら８種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、配列表における配列番号１１に示すアミノ酸配列における第１６乃至２０番目のＴｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｐで表される配列に基づき化学合成した５′−ＡＣＮＧＡＲＴＴＹＴＧＧＧＡ−３′で表される塩基配列のプローブ４をハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択した。以上のようにして選択した組換えＤＮＡと形質転換体を、それぞれ、『ｐＢＱＴ１３』又は『ＢＱＴ１３』と命名した。
【００７４】
その後、この形質転換体ＢＱＴ１３をアンピシリンを含むＬ−ブロス培地で実施例１−２と同様に培養し、培養物より採取した菌体から組換えＤＮＡを溶出させ、精製し、分析したところ、組換えＤＮＡ ｐＢＱＴ１３は約７，２００残基対からなり、図１０に示す制限酵素地図で表される構造を有していた。図１０に示すように、酵素Ｑ３６をコードする２，３２５塩基対からなるＤＮＡは、制限酵素Ｘｍｎ Ｉによる切断部位付近の下流に位置していることが判明した。
【００７５】
【実施例３−３ 形質転換体ＢＱＴ１３による酵素の産生】
マルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地をｐＨ７．０に調整し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間加熱滅菌し、冷却後、実施例３−２で得た形質転換体ＢＱＴ１３を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約２，４５０単位の酵素が産生していた。
【００７６】
別途、対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株及びアルスロバクター・スピーシーズＱ３６をアンピシリン無含有の同じ組成の液体培地に植菌し、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６の場合、培養温度を３０℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の活性を測定したところ、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約１，２００単位と、形質転換体ＢＱＴ１３と比較して有意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、当該酵素を産生しなかった。
【００７７】
その後、形質転換体ＢＱＴ１３が産生した酵素を実験例１−１と同様に精製し、その性質・性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量約７６，０００乃至８７，０００ダルトンを、また、等電点電気泳動で約３．６乃至４．６に等電点を示すなど、実験例２で得られた酵素Ｑ３６のものと同様の理化学的性質を有することが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術によっても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有意に向上することを示唆している。
【００７８】
【実施例４ アルスロバクター・スピーシーズＱ３６に由来する相補鎖ＤＮＡの調製とその塩基配列、アミノ酸配列の決定】
実施例３−２で得た組換えＤＮＡ ｐＢＱＴ１３を実施例２と同様に処理してテンプレートＤＮＡとし、これをプライマー１とともにアニーリング後、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライマー１を５′末端から３′末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを生成させた。実施例２と同様に、この相補鎖ＤＮＡにジデオキシ・チェーン・ターミネータ法を適用し、ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号６に示す３，０７３塩基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表における配列番号６に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と配列表における配列番号８、１１又は１２に示すＮ末端アミノ酸配列、部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号８に示すＮ末端アミノ酸配列は配列表における配列番号６における第１乃至２０番目の配列に、また、配列番号１１又は１２の部分アミノ酸配列は配列表における配列番号６における第６０６乃至６２５番目又は第１１０乃至１２９番目の配列に一致した。これは、酵素Ｑ３６が配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有するものであり、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６においては、酵素Ｑ３６が配列表における配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。
【００７９】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する、従来未知の全く新規な酵素の発見に基づくものである。この発明は、組換えＤＮＡ技術により斯かる酵素を大規模且つ効率的に生産する道を拓くものである。しかも、この発明による形質転換体が産生する酵素は、全アミノ酸配列までが明らかにされた酵素であり、食品等への配合使用を前提とするトレハロースや末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質の製造に安心して使用し得るものである。
【００８０】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する意義のある発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な発明であると言える。
【００８１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】酵素Ｍ−１１の至適温度を示す図である。
【図２】酵素Ｑ３６の至適温度を示す図である。
【図３】酵素Ｍ−１１の至適ｐＨを示す図である。
【図４】酵素Ｑ３６の至適ｐＨを示す図である。
【図５】酵素Ｍ−１１の熱安定性を示す図である。
【図６】酵素Ｑ３６の熱安定性を示す図である。
【図７】酵素Ｍ−１１のｐＨ安定性を示す図である。
【図８】酵素Ｑ３６のｐＨ安定性を示す図である。
【図９】この発明による組換えＤＮＡであるｐＢＭＴ７の制限酵素地図である。なお、図中、太線表示部は、酵素Ｍ−１１をコードするＤＮＡを示す。
【図１０】この発明による組換えＤＮＡであるｐＢＱＴ１３の制限酵素地図である。なお、図中、太線表示部は、酵素Ｑ３６をコードするＤＮＡを示す。
Claims (11)
- グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成し、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列か、又はその酵素活性を保持する範囲で配列表における配列番号１又は２のアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上が他のアミノ酸に置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡ。
- 酵素が下記の理化学的性質を有する請求項１に記載のＤＮＡ。
（１）分子量
約７６，０００乃至８７，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
（２）等電点
約３．６乃至４．６（等電点電気泳動） - ＤＮＡが配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列か、コードする酵素の酵素活性を保持する範囲で配列表における配列番号３又は４の塩基配列における塩基の１個又は２個以上が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
- 遺伝子コードの縮重に基づき、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換した請求項１乃至３のいずれかに記載のＤＮＡ。
- 配列表における配列番号５又は６に示す塩基配列を有する請求項１乃至４のいずれかに記載のＤＮＡ。
- リゾビウム属又はアルスロバクター属の微生物に由来する請求項１乃至５のいずれかに記載のＤＮＡ。
- 請求項１乃至６のいずれかに記載のＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
- 自律複製可能なベクターがプラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）である請求項７に記載の複製可能な組換えＤＮＡ。
- 請求項７又は８に記載の複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体。
- 宿主が大腸菌である請求項９に記載の形質転換体。
- グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素をコードする請求項１乃至６のいずれかに記載のＤＮＡを含んでなる、ＤＮＡ断片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05824495A JP3557271B2 (ja) | 1994-02-23 | 1995-02-23 | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-47956 | 1994-02-23 | ||
| JP4795694 | 1994-02-23 | ||
| JP6-90728 | 1994-04-06 | ||
| JP9072894 | 1994-04-06 | ||
| JP05824495A JP3557271B2 (ja) | 1994-02-23 | 1995-02-23 | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07322880A JPH07322880A (ja) | 1995-12-12 |
| JP3557271B2 true JP3557271B2 (ja) | 2004-08-25 |
Family
ID=27293142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05824495A Expired - Lifetime JP3557271B2 (ja) | 1994-02-23 | 1995-02-23 | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3557271B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MY178624A (en) | 2011-09-21 | 2020-10-19 | Hayashibara Co | Process for producing a particulate composition comprising crystalline alpha, alpha-trehalose di-hydrate |
-
1995
- 1995-02-23 JP JP05824495A patent/JP3557271B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07322880A (ja) | 1995-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3557289B2 (ja) | 非還元性糖質からトレハロースを遊離する組換え型耐熱性酵素 | |
| KR100374449B1 (ko) | 효소를인코우드하는디엔에이(dna),재조합디엔에이(dna)와효소,형질전환체및이들의제조방법과용도 | |
| JP3557288B2 (ja) | 還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する組換え型耐熱性酵素 | |
| US5773282A (en) | Recombinant thermostable enzyme for converting maltose into trehalose from Thermus aquaticus | |
| US5871994A (en) | DNA encoding enzyme, recombinant DNA and enzyme, transformant, and their preparation and uses | |
| JP2003523203A (ja) | Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の細菌単離体およびそれから単離されたイソマルツロース・シンターゼ遺伝子 | |
| JP3559609B2 (ja) | 組換え型酵素とその製造方法並びに用途 | |
| JP3557272B2 (ja) | 組換え型酵素とその製造方法並びに用途 | |
| JP3650632B2 (ja) | マルトースをトレハロースに変換する組換え型酵素 | |
| JP3557271B2 (ja) | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 | |
| JP3557276B2 (ja) | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 | |
| KR0133727B1 (ko) | 이소아밀라아제 활성을 지닌 폴리펩티드 및 그 제조방법 | |
| WO2005003343A1 (ja) | 新規微生物、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ並びにその製造方法 | |
| CA2159551C (en) | Recombinant thermostable enzyme for converting maltose into trehalose | |
| JPH10262683A (ja) | 組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼをコードする 遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクタ ーを含む形質転換体とその産生物 | |
| JPH10327887A (ja) | 組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体とその産生物 | |
| US5763228A (en) | Recombinant enzyme for converting maltose into trehalose from pimelobacter sp. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20031202 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040202 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040203 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040330 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040511 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040517 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110521 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120521 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130521 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130521 Year of fee payment: 9 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |