JP7358478B2 - ヒト化抗ｐｄ－１抗体及びこの使用 - Google Patents

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Description

本発明は、腫瘍学又はがん免疫療法の分野に関する。詳細には、本発明では、腫瘍又はがん免疫療法において使用し得る、プログラム細胞死受容体1(PD-1)に対する組換えヒト化抗体を提供する。また、本発明は、この抗体をコードする核酸配列、この核酸配列を含むベクター、医薬組成物及びキットを提供する。
PD-1は、288アミノ酸からなり、分子量約50kDaを有するI型膜貫通糖タンパク質であって、CD28ファミリーのメンバーであり、CD279としても知られる。これは、プログラム細胞死の制御因子として機能し、成熟CD4+及びCD8+T細胞の表面上で主に発現するが、ナチュラルキラーT細胞、B細胞、単球及び一部の樹状細胞上でも発現する。
PD-1は、2つのリガンド、PD-L1(すなわち、CD274としても知られるB7-H1)及びPD-L2(すなわち、CD273としても知られるB7-DC)を有し、これは共にB7ファミリーの膜貫通タンパク質分子である。量及び作用に関しては、PD-L1は、主要なPD-1リガンドである。PD-L1は、造血細胞、例えば、樹状細胞、B細胞及びT細胞、並びに非造血細胞、例えば、上皮及び内皮細胞を含む種々の細胞型の表面上で広範に発現する。腫瘍細胞の表面上でのPD-L1の発現は高度であり、炎症性サイトカイン、例えば、IFN-γ及びTNF-αにより上方制御され得る。PD-L2リガンドは、PD-L1に対する高度な類似性を有すが、この分布は相対的に制限されており、免疫細胞、例えば、マクロファージ、樹状細胞及びマスト細胞の表面上で主に発現し、この発現は低度である。PD-L2は、PD-L1それの約3倍の高度な親和性でPD-1に結合する。
PD-1は、リガンドに結合して、T細胞受容体により媒介されるT細胞の増殖、活性化及びサイトカイン分泌を阻害し、これにより免疫応答の初期及びエフェクター相を抑制し、免疫安定性を維持して、自己免疫疾患の発症を予防することにより生物学的役割を果たす。PD-1がリガンドに結合すると、PD-1細胞質領域の1つのドメインである免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ(ITSM)内のチロシン残基は、リン酸化され、次いで、リン酸化ITSMは、SHP-2ホスファターゼを動員し、脱リン酸化による重要な下流経路の阻害、例えば、ホスホイノシチド3キナーゼ(PI3K)及びこの下流のプロテインキナーゼB(PKB又はAkt)の活性化の遮断、グルコース代謝の阻害、サイトカインインターロイキン2(IL-2)の産生、並びに抗アポトーシスタンパク質Bcl-xlの発現を生じ、これにより、T及びB細胞の増殖及び活性化、並びに免疫グロブリンの分泌を阻害し、結果として、自己免疫応答が抑制される。腫瘍細胞は、この免疫抑制機構を利用して、そこで高度に発現するPD-L1の結合によりリンパ球の表面上のPD-1分子への免疫回避を達成し、これらが生物により免疫認識及び排除されることから逃れる。
PD-1を標的とするモノクローナル抗体は、現在、腫瘍又はがん免疫療法研究における注目の話題である。PD-1のリガンドへの結合を遮断することにより、このようなモノクローナル抗体は、腫瘍部位におけるT細胞並びにIFN-γ及びIL-2の分泌を増加させ、骨髄由来抑制細胞(MDSC)の割合を減少させ、腫瘍微小環境を変化させ、T細胞の免疫殺傷機能を回復及び増強し、これにより腫瘍増殖を阻害することができる。現在、米国食品医薬品局(FDA)は、Bristol-Myers Squibb社のオプジーボ(一般的ニボルマブ)及びMerck &Co社のキイトルーダ(一般的ペムブロリズマブ)を含むPD-1抗体の販売承認を認可した。オプジーボは、メラノーマ、非小細胞肺がん、頭頸部扁平上皮癌、古典的ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、高度マイクロサテライト不安定性癌、進行性腎細胞癌及び肝細胞癌の治療のために認可されており、キイトルーダは、メラノーマ、非小細胞肺がん、頭頸部扁平上皮癌、古典的ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、高度マイクロサテライト不安定性及び胃がんの治療のために認可されている。加えて、臨床研究における国内及び国際的PD-1標的抗体は、Regeneron社/Sanofi社のREGN2810、Top Alliance社のJS001、Hengrui社のSHR-1210、Beigene社のBGB-A317、Cinda社のIBI308及びGloria社/ WuXiPharmaTech社のGLS-010、並びに前臨床研究における他の多くの抗PD-1及び抗PD-L1抗体医薬を含む。
米国特許第5,500,362号 米国特許第5,821,337号 米国特許第6,737,056号 米国特許第6,194,551号B1 国際公開第1999/51642号 米国特許第4,816,397号
Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991 Chothia及びLesk; J MolBiol 196: 901-917 (1987) Altschulら、1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410 Guyerら、Journal of Immunology 117: 587 (1976) Kimら、Journal of Immunology 24: 249 (1994) Gazzano-Santoroら、J. Immunol Methods 202: 163 (1996) Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989 Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., &Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) Colligan, Current Protocols in Immunology Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997- 2001), 例えばchapters 1, 4, 6, 8, 9, 10 Rapid PCR-cloning of full-length mouse immunoglobulin variable regions; Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction T JonesらBio/Technolgy 9(6):579,July 1991 Antibody Phage Display: Methods and Protocols, Philippa M. O'Brien and Robert Aitken (Eds), Humana Press, ISBN: 9780896037113
まとめると、PD-1を標的とするモノクローナル抗体についての研究は、いくらか進歩した。しかし、腫瘍学又はがん免疫療法における、より良い有効性、安全性、及び競合性を有するモノクローナル生物製剤の必要性が未だ存在する。
本発明において使用する技術的用語及びこれらに対応する略語は、Table1(表1)に示す。
Figure 0007358478000001
本発明の第1の態様では、軽鎖可変領域若しくはその部分及び/又は重鎖可変領域若しくはその部分を含む、単離PD-1抗体又はその抗原結合断片であって、
軽鎖可変領域又はその部分が、配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号12のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含み、
重鎖可変領域又はその部分が、配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号14のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む、単離PD-1抗体又はその抗原結合断片を提供する。
特定の実施形態では、この抗体又はその抗原結合断片は、配列番号23のPD-1抗体軽鎖可変領域配列に対する少なくとも90%、92%、95%、98%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号22のPD-1抗体重鎖可変領域配列に対する少なくとも90%、92%、95%、98%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になる。
特定の実施形態では、この抗体は、軽鎖定常領域及び重鎖定常領域を更に含み、特定の実施形態では、この抗体は、好ましくは、軽鎖定常領域が、配列番号25のアミノ酸配列のカッパ軽鎖定常領域に対する少なくとも90%、92%、95%、98%若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、及び/又は重鎖定常領域が、配列番号24のアミノ酸配列のIgG4重鎖定常領域に対する少なくとも90%、92%、95%、98%若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖定常領域及び重鎖定常領域を更に含む。特定の実施形態では、この抗体は、IgG抗体である。特定の一実施形態では、この抗体は、IgG4抗体である。
特定の一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。
特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200pM以上、又はエンドポイントとして前述の値による任意の範囲、例えば、約20～200pM若しくは約60～70pM等、又はこの任意の値、例えば、約64.8pM若しくは約108pM等の親和性KD平均値で組換えヒトPD-1タンパク質に結合する。結合親和性KDを判定するための方法は、本出願の実施例に記載のとおりである。
特定の一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号1のアミノ酸配列を含むPD-1タンパク質分子、又は配列番号1に対する少なくとも90%、92%、95%、98%若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質分子に特異的に結合する。
本発明の第2の態様では、PD-1タンパク質細胞外領域60SESFV64、78KLAAFPEDRSQP89、128LAPKAQI134の少なくとも1つから選択されるペプチド配列に特異的に結合する、単離PD-1抗体又はその抗原結合断片を提供する。
特定の実施形態では、PD-1タンパク質の細胞外領域E61、K78、D85、P130の少なくとも1つから選択されるアミノ酸残基に特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
特定の一実施形態では、抗原結合断片は、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fd断片、Fd'断片、一本鎖抗体分子、又は単一ドメイン抗体の形態であり、特定の一実施形態では、一本鎖抗体分子は、scFv、di-scFv、tri-scFv、ダイアボディ又はscFabである。
特定のさらなる実施形態では、上記の実施形態における抗体又はその抗原結合断片は、低分子化合物及び/又は生体高分子から選択される別の分子と共に、共有結合性若しくは非共有結合性コンジュゲート又は組換え多重標的融合薬物を形成し、これにより改変薬物分子を形成する。
本発明の第3の態様では、ヌクレオチド配列が、第1及び第2の態様の抗体及び/又は抗原結合断片をコードする、単離核酸を提供する。
本発明の第4の態様では、第3の態様の核酸を含むベクターを提供する。
本発明の第5の態様では、第1及び第2の態様の抗体及び/若しくは抗原結合断片を発現し、並びに/又は第3の態様の核酸若しくは第4の態様のベクターを含む、単離細胞を提供する。
特定の一実施形態では、この細胞は、原核又は真核細胞である。
本発明の第6の態様では、第1及び第2の態様の抗体及び/又は抗原結合断片を生成するための方法であって、第5の態様の細胞を培養する工程、及びこの抗体を精製する工程を含む、方法を提供する。
本発明の第7の態様では、腫瘍又はがんの治療のための医薬の調製のための、第1及び第2の態様の抗体及び/若しくは抗原結合断片並びに/又は改変薬物分子の使用を提供する。
特定の一実施形態では、この腫瘍又はがんは、結腸がんである。
本発明の第8の態様では、腫瘍又はがんの治療のための、第1の態様の抗体及び/若しくは抗原結合断片並びに/又は改変薬物分子の使用を提供する。
特定の一実施形態では、この腫瘍又はがんは、結腸がんである。
本発明の第9の態様では、第1及び第2の態様の抗体及び/若しくは抗原結合断片並びに/又は改変薬物分子を含む、医薬組成物を提供する。
本発明の第10の態様では、第9の態様の医薬組成物及び治療的に活性の1つ又は複数の化合物を含む医薬組合せ物を提供する。
本発明の第11の態様では、第1及び第2の態様の抗体及び/若しくは抗原結合断片並びに/又は改変薬物分子、或いは第9の態様の医薬組成物又は第10の態様の医薬組合せ物を含み、好ましくは、投与のための装置を更に含む、キットを提供する。
本発明の第12の態様では、腫瘍又はがんを治療する方法であって、それを必要とする対象に、第1及び第2の態様の治療有効量の単離PD-1抗体若しくはその抗原結合断片、又は改変薬物分子、或いは第9の態様の医薬組成物、或いは第10の態様の医薬組合せ物、或いは第11の態様のキットを投与し、これにより腫瘍又はがんを治療する工程を含み、好ましくはこの腫瘍又はがんが結腸がんである、方法を提供する。
PD-L1(A)及びPD-L2(B)のPD-1タンパク質への結合に対するマウス抗体PD1-M944の遮断を示すグラフである。 ヒト化抗体PD1-H944の組換えヒトPD-1タンパク質への結合のELISA検出を示すグラフである(図2A、図2B、図2C、n=3)。 PD1-H944の組換えジャーカット/PD-1細胞への結合のFACS検出を示すグラフである。 PD1-H944(図4A1、図4B1、図4C1、n=3)及びニボルマブ(図4A2、図4B2、図4C2、n=3)の組換えヒトPD-1タンパク質に対する親和性についてのOctetアッセイを示すグラフである。 PD1-H944(図5A)、ニボルマブ(図5B)及び陰性対照(図5C)の組換えヒト、サル及びマウスPD-1タンパク質への結合についてのELISAを示すグラフである。 種々の濃度のPD1-H944及びニボルマブのサルPD-1タンパク質(図6A)及びマウスPD-1タンパク質(図6B)への結合を示すグラフである。 ヒトPD-L1(図7A)及びヒトPD-L2(図7B)の組換えヒトPD-1タンパク質への結合に対するPD1-H944による遮断のELISA検出を示すグラフである。 ヒトPD-L1のヒトジャーカット/PD-1細胞への結合に対するPD1-H944による遮断のFACSアッセイを示すグラフである。 PD1-H944の組換えCD16aタンパク質への結合のELISAを示すグラフである。 PD1-H944の組換えC1qタンパク質への結合のELISAを示すグラフである。 PD1-H944のヒトFcRnタンパク質への結合のELISAを示すグラフである。 PD-1抗体による混合リンパアッセイにおけるIL-2(上)及びIFN-γ(下)分泌の促進を示すグラフである(図12A、図12B、図12Cは3人のドナー由来のCD4+T細胞を示す)。 PD-1抗体による混合リンパアッセイにおけるIL-2(上)及びIFN-γ(下)分泌の促進を示すグラフである(図12A、図12B、図12Cは3人のドナー由来のCD4+T細胞を示す)。 PD-1抗体による混合リンパアッセイにおけるIL-2(上)及びIFN-γ(下)分泌の促進を示すグラフである(図12A、図12B、図12Cは3人のドナー由来のCD4+T細胞を示す)。 組換えヒトPD-1レポーター遺伝子細胞系におけるPD1-H944の活性化機能を示すグラフである。 組換えCD16aレポーター遺伝子系により検出されたPD1-H944のADCC機能を示すグラフである(図14Aは種々のアッセイバッチにおける結果である。**はP<0.01を示す)。 組換えCD16aレポーター遺伝子系により検出されたPD1-H944のADCC機能を示すグラフである(図14Bは種々のアッセイバッチにおける結果である。**はP<0.01を示す)。 組換えCD16aレポーター遺伝子系により検出されたPD1-H944のADCC機能を示すグラフである(図14Cは最高抗体濃度における生物発光強度値である。**はP<0.01を示す)。 組換えCD16aレポーター遺伝子系により検出されたPD1-H944のADCC機能を示すグラフである(図14Dは最高抗体濃度における生物発光強度値である。**はP<0.01を示す)。 CHO-PD-1細胞に対するPD1-H944のCDC作用を示すグラフである。 投与後の動物の体重における変化の傾向を示すグラフである。 投与後の腫瘍量増殖の傾向を示すグラフである。 アッセイ終了時の腫瘍質量のプロットである(*P<0.05)。 投与後の動物の体重の傾向に関するグラフである。 薬物投与後の腫瘍量増殖の傾向に関するグラフである。 アッセイのエンドポイントにおける腫瘍質量のグラフである。 PD1の結晶構造にドッキングしたPD1-H944の相同性モデリングを示す図である。 変異部位を示すPD1タンパク質のモデルを示す図である。 PD-1タンパク質変異体のPD-L1、ニボルマブ及びPD1-H944への結合を示すグラフである。 PD1-H944、PD-L1及びニボルマブがPD-1に特異的に結合するアミノ酸部位を示す図である。
定義
他に述べない限り、本明細書において使用するすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常、理解される意味を有する。本発明の目的のために、以下の用語を更に定義する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、「one」、「a/an」、「another(別の)」及び「said(この/前記)」の単数形は、文脈上明白に他に指示しない限り、対象を複数指定することを含む。
「抗体」の用語は、免疫グロブリン分子を指し、所望の生物学的活性を示す抗体の任意の形態を指す。これらは、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体及び多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、並びに抗体断片をも含むが、これらに限定されない。典型的には、完全長抗体構造は、好ましくは、ジスルフィド結合により典型的に相互接続する4つのポリペプチド鎖、2つの重(H)鎖及び2つの軽(L)鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む。この典型的な完全長抗体構造に加えて、この構造は、他の派生形態をも含む。
「可変領域」の用語は、抗体の抗原への結合に関与する、抗体の重又は軽鎖内のドメインを指す。自然抗体の重及び軽鎖の可変領域(それぞれVH及びVL)は、類似構造を一般に有し、高度可変領域(相補性決定領域(CDR)と呼ばれる)に更に細分され、更に保存された領域(フレームワーク領域(FR)と呼ばれる)が散在し得る。
「相補性決定領域」の用語(CDR、例えば、CDR1、CDR2及びCDR3)は、その存在が抗原結合に必要な、抗体の可変領域内のアミノ酸残基を指す。各可変領域は、CDR1、CDR2及びCDR3として同定される3つのCDR領域を典型的に有する。各相補性決定領域は、Kabatにより定義される「相補性決定領域」のアミノ酸残基(Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991)及び/又は「高度可変ループ」の残基(Chothia及びLesk; J MolBiol 196: 901-917 (1987))を含み得る。
「フレームワーク」又は「FR」残基の用語は、本明細書に定義するCDR残基ではなく可変領域内の残基である。
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のそれぞれは、3つのCDR及び最大4つのFRを典型的に含み、このCDR及びFRは、アミノ酸末端からカルボキシ末端までに、例えば、次の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4で配置する。
所与の抗体の相補性決定領域(CDR)及びフレームワーク領域(FR)は、Kabatの方式を使用して同定することができる(Kabatら: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, US Department of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91- 3242, 1991)。
「定常領域」の用語は、抗体の抗原への結合に直接には関与しないが、多様なエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害性を示す、抗体の軽及び重鎖内のアミノ酸配列を指す。
これらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列によれば、インタクトな抗体は、5つの抗体クラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMに分類することができ、このIgG及びIgAは、サブクラス(アイソフォーム)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2に更に分けることができる。したがって、抗体の5つのクラスの重鎖は、α、δ、ε、γ及びμ鎖にそれぞれ分類される。抗体の軽鎖は、これらの軽鎖定常領域のアミノ酸配列によりκ及びλに分類される。
「抗体の抗原結合断片」は、親抗体の少なくとも一部の結合特異性を保持するインタクトな抗体分子の部分を含み、親抗体の抗原結合領域又は可変領域の少なくとも一部分(例えば、1つ又は複数のCDR)を典型的に含む。抗原結合断片の例としては、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fd断片、Fd'断片、一本鎖抗体分子(例えば、scFv、di-scFv若しくはtri-scFv、ダイアボディ又はscFab)、単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
「抗体断片」は、親抗体の生物学的特性の少なくとも一部を保持するインタクトでない抗体分子であり、「抗原結合断片」として上記のものに加えてFc断片を含むが、これらに限定されない。
「改変薬物分子」の用語は、抗体又はこの断片、例えば、抗原結合断片が、低分子化合物又は生体高分子である別の分子と共有又は非共有結合することにより形成されるコンジュゲート又は組換え多重標的融合薬物を意味する。
「キメラ」抗体の用語は、重及び/又は軽鎖の部分が、特定のソース又は種に由来し、残りが、異なるソース又は種に由来する抗体を指す。「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットである。
「ヒト化抗体」又は「ヒト化抗原結合断片」の用語は、(i)非ヒトソース(例えば、異種免疫系を保有する遺伝子導入マウス)に由来し、ヒト生殖系列配列に基づく、又は(ii)可変領域が非ヒト起源であり、定常領域がヒト起源であるキメラ抗体である、又は(iii)可変領域のCDRが非ヒト起源であり、可変領域の1つ又は複数のフレームワーク領域がヒト起源であり、任意で、定常領域がヒト起源であるCDR移植である、抗体又は抗体断片として本明細書において定義する。「ヒト化」の目的は、ヒト体内における非ヒト起源の抗体の免疫原性を除去し、その上、最大限の親和性を保持することである。ヒト化のための鋳型として非ヒトソース抗体のフレームワーク配列に最も類似するヒトフレームワーク配列を選択することは有利である。一部の場合では、ヒトフレームワーク配列内の1つ又は複数のアミノ酸を非ヒト構築物内の対応する残基と置換して、親和性の低下を回避することが必要であり得る。
「モノクローナル抗体」の用語は、実質的に同種の抗体集団に由来する抗体、すなわち、非常に少量に存在し得る潜在的変異(例えば、自然変異)を除いて同一の集団に含まれる、ありとあらゆる単一抗体を指す。したがって、「モノクローナル」の用語は、問題の抗体の性質を示す。すなわち、無関係の抗体の混合物ではない。種々のエピトープに対する種々の抗体を通常含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤中の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一エピトープに対して生成される。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体製剤は、他の抗体が通常、夾雑しない利点を有する。「モノクローナル」の用語は、特定の任意の方法によるこの抗体の生成を必要とするものとして理解されるべきではない。モノクローナル抗体の用語は、詳細には、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体を含む。
抗体は、標的抗原、例えば、腫瘍関連ペプチド標的(この場合がPD-1)に「特異的に結合する」。すなわち、この抗体の治療薬としての使用を可能とするのに十分な親和性でこの抗原に結合して、この抗原を発現する細胞又は組織を標的とし、他のタンパク質と著しくは交差反応しないか、又は上記の標的タンパク質の相同体及びバリアント(例えば、変異形態、スプライスバリアント、又はタンパク質加水分解切断形態)を除くタンパク質と著しくは交差反応しない。
「結合親和性」の用語は、分子の個々の結合部位及びこの結合パートナーとの間の非共有相互作用の和の強度を指す。他に述べない限り、「結合親和性」は、本明細書において使用する場合、結合対のメンバー間(例えば、抗体及び抗原)の1:1の相互作用を反映する内因的結合親和性を指す。「KD」、「結合速度定数Kon」及び「解離速度定数Koff」は、分子(例えば、抗体)及びこの結合パートナー(例えば、抗原)との間の親和性を記載するために一般に使用される。親和性は、すなわち、リガンドが特定のタンパク質に結合する密着度である。結合親和性は、2分子間の分子間非共有相互作用、例えば、水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用及びファンデルワールス力に影響される。加えて、リガンド及びこの標的分子との間の結合親和性は、他の分子の存在により影響され得る。親和性は、本明細書に記載するELISAを含む、当技術分野において公知の従来の方法により解析することができる。
「エピトープ」の用語は、抗体又はT細胞受容体に特異的に結合する任意のタンパク質決定クラスターを含む。エピトープ決定クラスターは、分子の化学的に活性な表面基(例えば、アミノ酸若しくは糖側鎖、又はこの組合せ)から典型的になり、特異的な三次元構造的特徴並びに特異的電荷特性を有することが多い。
「単離」抗体は、抗体を天然に発現する細胞から同定及び単離されている抗体である。単離抗体は、組換え細胞におけるin situでの抗体、及び少なくとも1つの精製工程により典型的に調製する抗体を含む。
2つのポリペプチド又は核酸配列間の「配列同一性」は、この配列間で同一の残基数を残基の総数の百分率として示す。パーセント同一性を算出する場合、アラインメントされた配列は、配列間で最大限の適合を生じさせるように適合させ、適合におけるギャップ(存在すれば)を特定のアルゴリズムにより解決する。2つの配列間の同一性を判定するための好ましいコンピュータプログラム方法については、GAP、BLASTP、BLASTN及びFASTAを含むGCGプログラムパッケージが挙げられるが、これに限定されない(Altschulら、1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410)。上記の手順は、米国立生物工学情報センター(NCBI)及び他のソースから公的に入手可能である。また、周知のSmith Watermanアルゴリズムを使用して同一性を判定することができる。
「Fc受容体」又は「FcR」の用語は、抗体のFc領域に結合する受容体を指す。天然配列のヒトFcR、好ましくは、IgG抗体に結合する受容体(ガンマ受容体)が好ましく、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIアイソフォーム、並びにこのような受容体のバリアントを含む。他のすべてのFcRを「FcR」の用語に含む。また、この用語は、新生児受容体(FcRn)を含み、これは、母体IgGの胎児への輸送の原因となる(Guyerら、Journal of Immunology 117: 587 (1976)及びKimら、Journal of Immunology 24: 249 (1994))。
「新生児Fc受容体」の用語は、「FcRn」と略され、これはIgG抗体のFc領域に結合する。新生児Fc受容体(FcRn)は、IgG様抗体の代謝的運命においてin vivoで重要な役割を果たす。FcRnは、リソソーム分解経路からIgGをレスキューするように機能し、これにより血清におけるこのクリアランスが低下して半減期が延長する。したがって、IgGのin vitroでのFcRn結合特性/特徴は、循環器におけるin vivoでの薬物動態特性を意味する。
「エフェクター機能」の用語は、生物学的活性が、抗体のFc領域に起因し得るものを指し、これは、アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例としては、C1q結合及び補体依存性細胞傷害性(CDC)、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)、抗体依存性細胞食作用(ADCP)、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による抗原の免疫複合体媒介取込み、細胞表面受容体下方制御(例えば、B細胞受容体)及びB細胞活性化が挙げられる。
「エフェクター細胞」の用語は、1つ又は複数のFcRを発現し、エフェクター機能を果たす白血球を指す。一態様では、このエフェクター細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を果たす。ADCCを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞傷害性T細胞及び好中球が挙げられる。エフェクター細胞は、天然ソース、例えば、血液から単離することができる。エフェクター細胞は、通常、エフェクター相と関連するリンパ球であり、サイトカインを生成し(ヘルパーT細胞)、病原体に感染した細胞を殺傷し(細胞傷害性T細胞)、又は抗体を分泌する(分化B細胞)ように機能する。
「免疫細胞」は、造血性の起源を有し、免疫応答における役割を果たす細胞を含む。免疫細胞は、リンパ球、例えば、B細胞及びT細胞、ナチュラルキラー細胞、並びに骨髄細胞、例えば、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球を含む。
「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」又は「ADCC」は、分泌されたIgが、特定の細胞傷害性細胞(例えば、NK細胞、好中球及びマクロファージ)上に提示されたFcγ受容体に結合して、このような細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原を有する標的細胞に特異的に結合した後、例えば、細胞毒を使用して、この標的細胞を殺傷可能とする細胞傷害性の形態を指す。標的抗体のADCC活性を評価するために、in vitroでのADCCアッセイ、例えば、米国特許第5,500,362号若しくは第5,821,337号又は米国特許第6,737,056号(Presta)に記述されているin vitroでのADCCアッセイを実施することができ、この方法は、本出願の実施形態において記述する。このようなアッセイにおける使用のための有用なエフェクター細胞は、PBMC及びNK細胞を含む。
「補体依存性細胞傷害性」又は「CDC」は、補体存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、補体系の第1の成分(C1q)の(適切なサブクラスの)抗体への結合により開始し、これにより抗体は、この対応する抗原に結合する。補体活性化を評価するために、CDCアッセイ、例えば、Gazzano-Santoroら、J. Immunol Methods 202: 163 (1996)に列挙するCDCアッセイ、例えば、本出願の実施形態、例えば、米国特許第6,194,551号B1及び国際公開第1999/51642号に記述されている方法を実施することができ、ここでは、Fc領域のアミノ酸配列を改変したポリペプチドバリアント(変異Fc領域を有するポリペプチド)及びC1q結合を増強又は低減させたポリペプチドバリアントを記載している。
本発明の抗体のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列
本発明では、組換えヒトPD-1タンパク質を使用してマウスを免疫し、次いで、組換えヒトPD-1に高親和性で特異的に結合するM944 scFv抗体クローンをファージ抗体ライブラリースクリーニングにより得た。次いで、M944 scFv抗体の重及び軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を、マウスIgG1重鎖定常領域及びマウスカッパ軽鎖定常領域をそれぞれコードするヌクレオチド配列を用いたPCRにより構築し、生じる構築した配列を、一過性発現ベクターに挿入し、HEK-293上で培養して発現させた。高純度マウス抗体PD1-M944を、プロテインA精製カラムを使用して精製した。ELISAにより、マウス抗体PD1-M944がPD-1のリガンドへの結合を遮断可能であったことが示された。
次いで、ヒト化CDR移植のための古典的方法を使用して、マウス軽鎖又は重鎖可変領域に最も近いヒト抗体軽鎖又は重鎖可変領域を鋳型として選択した。実施形態では、IGKV3-11*01を選択して軽鎖可変領域のヒト化鋳型とし、一方、IGHV3-21*02を選択して重鎖可変領域のヒト化鋳型とする。ヒト化軽鎖可変領域(VL)及び重鎖可変領域(VH)配列は、マウス抗体軽鎖/重鎖の3つのCDRのそれぞれを上記ヒト鋳型の対応する位置に挿入することにより得た。マウスフレームワーク領域の鍵となる部位がCDR活性の支持に必須であるため、鍵となる部位は、マウス抗体の配列に復帰変異させた。ヒト化抗体PD1-H944のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、軽鎖/重鎖シグナルペプチド配列、復帰変異ヒト化抗体の軽鎖/重鎖の可変領域の配列、及びヒトIgG4重鎖定常領域/ヒトカッパ軽鎖定常領域の配列をそれぞれ逐次的にスプライシングすることにより得た。
本発明の核酸
また、本発明は、本発明の抗体又はその部分をコードする核酸分子に関する。このような核酸分子の配列は、配列番号3～7及び26～33を含むが、これらに限定されない。
本発明の核酸分子は、本明細書に開示の配列に限定されないが、このバリアントをも含む。本発明におけるバリアントは、ハイブリダイゼーションにおけるこれらの物理的特性に関して記載し得る。核酸ハイブリダイゼーション技術を使用して、核酸をこれらの補体並びに等価物又は相同体の同定に使用可能であることが当業者により理解される。また、ハイブリダイゼーションが100%未満の相補性で生じ得ることが理解される。しかし、条件の適切な選択を前提として、特定のプローブに対するDNA配列の構造的関連性に基づき、このDNA配列を識別するためにハイブリダイゼーション技術を使用することができる。このような条件のガイダンスについては、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989及びAusubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., &Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sonsを参照されたい。
組換えベクター及び発現
また、本発明では、1つ又は複数の本発明のヌクレオチド配列を含む組換え構築物を提供する。本発明の組換え構築物は、ベクターと共に使用することができ、このベクターは、例えば、プラスミド、ファージミド、ファージ又はウイルスベクターであり、本発明の抗体をコードする核酸分子をこのベクターに挿入する。
本明細書において提供する抗体は、軽及び重鎖又はこれらの部分をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞において組換えによって発現させることにより調製することができる。抗体を組換えにより発現させるために、宿主細胞に、軽及び/若しくは重鎖又はこれらの部分をコードするヌクレオチド配列を保有する1つ又は複数の組換え発現ベクターをトランスフェクトして、この軽及び重鎖をこの宿主細胞において発現させ得る。標準的組換えDNA方法を使用し、重及び軽鎖をコードする核酸を調製及び/又は入手して、このような核酸を組換え発現ベクターに組み込み、このベクターを宿主細胞に導入する。例えば、Sambrook, Fritsch及びManiatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)、Ausubel, F. M.ら(eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)並びにBossらによる米国特許第4,816,397号に記述されているものを参照されたい。
その上、この重及び/又は軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を、例えば、完全長抗体鎖、Fab断片又はscFvをコードするヌクレオチド配列に変換してもよく、例えば、軽鎖の可変領域又は重鎖の可変領域をコードするDNA断片を、例えば、抗体定常領域又は可動性リンカーをコードする別のDNA断片に動作可能にライゲーションし得る(この両DNA断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームとなるように)。ヒト重及び軽鎖定常領域の配列は、当技術分野において公知であり(例えば、Kabat, E. A.ら(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照)、このような領域を含むDNA断片は、標準的PCR増幅により得ることができる。
抗体を発現させるために、標準的組換えDNA発現方法を使用することができる(例えば、Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)を参照)。例えば、所望の抗体をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入した後、これを適する宿主細胞にトランスフェクトすることができる。適する宿主細胞は、原核及び真核細胞である。原核宿主細胞の例は、細菌であり、真核宿主細胞の例は、酵母、昆虫又は哺乳動物細胞である。制御配列の選択を含む発現ベクターのデザインは、多数の因子、例えば、宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル、及び発現が構成的又は誘導的であるかどうかにより決定することが理解されるべきである。
本発明の抗体は、周知の方法により組換え細胞培養物から回収及び精製することができ、この周知の方法は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、プロテインA親和性クロマトグラフィー、プロテインG親和性クロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない。また、高性能液体クロマトグラフィー(「HPLC」)を精製に使用することができる。例えば、Colligan, Current Protocols in Immunology、又はCurrent Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997- 2001)、例えばchapters 1, 4, 6, 8, 9, 10を参照されたく、この全体は参照により本明細書に組み込む。
本発明の抗体は、原核及び真核宿主からの、天然精製産物、化学合成方法による産物、及び組換え技術により生成された産物を含み、この真核宿主は、例えば、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む。本発明の抗体は、グリコシル化され得るか、又はグリコシル化されなくてもよい。このような方法は、多くの標準的手引書、例えば、上記のSambrook, sections 17.37-17.42、上記のAusubel, chapters 10, 12, 13, 16, 18及び20に記述されている。
したがって、本発明の実施形態はまた、このベクター又は核酸分子を含む宿主細胞であり得、この宿主細胞は、高等真核宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、下等真核宿主細胞、例えば、酵母細胞であってもよく、原核細胞、例えば、細菌細胞であってもよい。
本発明の抗体の特性及び機能
このPD1-H944抗体の特性及び機能解析を実施した。解析では、本発明の抗体が、次の利点を有することが示された。(1)ヒトPD-1に高親和性及び特異性で結合することができ解離速度が低いため、良好な抗腫瘍有効性がもたらされる。(2)ニボルマブよりも完全にPD-L1のPD-1への結合を遮断することができる。(3)ニボルマブと比較した場合、より感受性かつより特異性に組換えヒトPD-1に結合し、マウスPD-1には同様に結合しないが、組換えサルPD-1には同等に交差結合する。(4)組換えヒトPD-1のリガンドPd-L1及びPd-L2への結合を有効に遮断可能である。(5)免疫抑制されたT細胞を有効に再活性化、及び組換えヒトPD-1受容体細胞系を活性化可能である。(6)MC38結腸がん担がんヒト化PD-1マウスモデルにおいて、ニボルマブ(Sino Biological, Inc.社)のそれよりも遥かに良好かつペムブロリズマブ(Sino Biological, Inc.社)のそれと同等に、優れた腫瘍抑制作用を示す。(7)低いADCC及びCDCの両活性を示し、その上、ADCC活性は、ニボルマブのそれよりも低い。
使用
本発明の抗体を使用し、異常発現するPD-1受容体を特異的に標的として、多様な腫瘍若しくはがんを治療するか又は多様な腫瘍若しくはがんの治療のための医薬を調製することができる。この腫瘍又はがんの非限定的な例としては、結腸がんが挙げられる。
医薬組成物
本発明の抗体は、少なくとも1つの他の薬剤(例えば、安定化化合物)を用いて調製し、本発明の抗体及び1つ又は複数の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物を形成し得る。
キット
また、本発明は、1つ又は複数の容器を含む、医薬パッケージ及びキットに関し、この容器は、前述の本発明の医薬組成物を含む。このような容器に付随するものは、薬物又は生物製剤の製造、使用又は流通を管理する政府機関により指定された形態の、この製剤を製造、使用又は流通させる代理店によるヒト投与の認可を反映する仕様書であり得る。
調製及び保存
本発明の医薬組成物は、当技術分野において公知の方法、例えば、従来の混合、溶解、造粒、錠剤調製、粉砕、乳化、封入、包埋又は凍結乾燥方法により調製することができる。
許容される担体中に製剤化した本発明の化合物を含む医薬組成物を既に調製すると、これらを適切な容器に静置し、ラベルを貼って治療症状を指示し得る。このようなラベリングには、薬物の量、頻度及び投与経路を含む。
組合せ物
また、上記の本発明の抗体を含む医薬組成物は、1つ又は複数の他の治療薬、例えば、抗悪性腫瘍薬と組み合わせ、この場合、生じる組合せ物により許容不可能な有害作用は発生しない。
以下の実施例は、本発明を模範として例示するために使用し、本発明を制限することは意図しない。
(実施例1)
ファージ抗体提示ライブラリーを使用した、マウス由来抗体によるPD-L1/PD-L2へのPD-1結合の遮断についてのスクリーニング
1.1 マウスの免疫
組換えヒトPD-1タンパク質(Sino Biological, Inc社、Cat. 10377-H08H)を使用してマウスを免疫した。このヒトPD-1タンパク質(UniProtKB Q15116)の細胞外領域のアミノ酸配列は、Met1-Gln167(配列番号1)である。
組換えヒトPD-1タンパク質をフロイントアジュバントと混合し、この混合物を用量各20μgで5回のマウスの免疫に使用して、2週間、3週間、2週間及び3週間の間隔で皮下に投与した。2回目の免疫以降、各免疫後に眼の内眼角神経叢を介して血液を7日採取した。マウス抗PD-1の血清力価を、組換えヒトPD-1タンパク質をコーティングしたELISAにより測定した。血清力価は、5回目の免疫後に8000倍の希釈度に達し、5回目の免疫後9週間にマウスを組換えヒトPD-1タンパク質25μgで静脈内に追加免疫した。4日後、マウスを犠死させ、脾臓組織を液体窒素で凍結させた。
1.2 ファージ提示ライブラリーのスクリーニング
TriPure Isolation Reagent (Roche社)を使用してRNAをマウス脾臓組織から抽出し、逆転写キット(Invitrogen社)を使用した逆転写によりcDNAを得た。マウス抗体の軽及び重鎖可変領域をコードする各ヌクレオチド配列を増幅し、このscFvをコードするヌクレオチド配列をオーバーラップ伸長PCR方法により構築した。この場合、軽及び重鎖可変領域をコードする各ヌクレオチド配列を、リンカーTCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTGGTGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC(配列番号2)を介して結合させ(参照: Rapid PCR-cloning of full-length mouse immunoglobulin variable regions; Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction T JonesらBio/Technolgy 9(6):579,July 1991)、次いで、制限エンドヌクレアーゼSfi I(Fermentas社)によりファージベクターpComb3x(Sino Biological, Inc.社)に酵素的にライゲーションし、次いで、コンピテントX-Blueに電気的形質転換を行って免疫マウスのファージ提示scFv抗体ライブラリーを構築した。組換えヒトPD-1タンパク質をELISAプレート上にコーティングすることにより、ファージ抗体パニングのプロセス後に抗PD-1陽性抗体濃縮ファージライブラリーを得た(参照: Antibody Phage Display: Methods and Protocols, Philippa M. O'Brien and Robert Aitken (Eds), Humana Press, ISBN: 9780896037113)。モノクローナルファージを濃縮ライブラリーから選択して発現させ、次いで、これらの組換えヒトPD-1タンパク質への結合をELISAにより試験した。組換えヒトPD-1に特異的に結合する、高度に結合する抗体M944 scFvのクローンを選択し、シーケンシングを行う会社に委託してM944 scFv抗体のヌクレオチド配列を配列決定した(配列番号3)。
1.3 マウス抗体PD1-M944の生成
M944 scFv抗体の重及び軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号4/5)を、それぞれマウスIgG1重鎖定常領域のヌクレオチド配列(配列番号6)及びマウスカッパ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列(配列番号7)を用いてPCRにより構築した。次いで、生じるヌクレオチド配列をHind III及びXba I(Fermentas社)により酵素的に切断して一過性発現ベクターpSTEP2(Sino Biological, Inc社)に挿入し、プラスミドを抽出してHEK-293細胞に7日間トランスフェクトした。培養上清をプロテインAカラムにより精製して高純度抗体を得た。
1.4 マウス抗体PD1-M944機能アッセイ
(1)組換えヒトPD-1のPD-L1への結合の遮断:組換えヒトPD-1タンパク質を1μg/mLの濃度で1ウェルあたり100μLの96ウェルプレート上に一晩4℃でコーティングした。翌日プレートを洗浄し、室温で1時間ブロッキングした。10μg/mLのビオチン化タンパク質PD-L1-Fc-ビオチン(SinoBiological, Inc.社)100μLを種々の濃度(0.4μg/mL、2μg/mL及び10μg/mL)のPD1-M944又はニボルマブ(Sino Biological, Inc社)と同時インキュベートした。プレートを洗浄して非結合抗体を除去した。プレートを抗生物質ストレプトアビジン/HRP(Beijing Zhong Shan -Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd社)とインキュベートし、次いで、繰り返し洗浄し、基質発色溶液を加えて発色させた。終結後にOD450を検出した。結果は、組換えPD-L1タンパク質が、コーティングしたPD-1タンパク質に有効に結合可能であり、組換えPD-L1タンパク質のPD-1への結合が、種々の濃度のPD1-M944又はニボルマブの追加により有効に阻害されたことを示した(図1A)。この結果は、マウス抗体PD1-M944が、PD-1のリガンドPD-L1への結合を遮断する良好な機能を有することを示した。
(2)組換えヒトPD-1のPD-L2への結合の遮断: 1μg/mLの濃度の組換えヒトPD-1タンパク質1ウェルあたり100μLを96ウェルプレート上に一晩4℃でコーティングし、翌日、洗浄して室温で1時間ブロッキングした。0.5μg/mLのビオチン化タンパク質PD-L2-Fc-ビオチン(Sino Biological, Inc.社)100μLを、種々の濃度(0.5μg/mL、2.5μg/mL及び12.5μg/mL)のPD1-M944又はニボルマブ(Sino Biological, Inc.社)と同時インキュベートした。プレートを洗浄して非結合抗体を除去し、抗生物質ストレプトアビジン/HRP(Beijing Zhong Shan -Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd社)とインキュベートし、繰り返し洗浄して、基質発色溶液を加えて発色させ、終結後にOD450を検出した。結果は、組換えPD-L2タンパク質が、コーティングしたPD-1タンパク質に有効に結合可能であり、組換えPD-L2タンパク質のPD-1への結合が、種々の濃度のPD1-M944又はニボルマブの追加により有効に阻害されたことを示した(図1B)。この結果は、マウス抗体PD1-M944が、PD-1のリガンドPD-L2への結合を遮断する良好な機能を有することを示した。
(実施例2)
マウス抗体PD1-M944の配列のヒト化してヒト化抗体PD1-H944の配列を生成する
2.1 マウス抗体PD1-M944の軽及び重鎖のそれぞれについての3つのCDRの判定
M944 scFv抗体のヌクレオチド配列を実施例1.2において判定し、これによりPD1-M944 scFv抗体の重及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を推定した。配列番号8/9を参照されたい。
マウス抗体PD1-M944の軽及び重鎖のそれぞれの3つのCDRのアミノ酸配列は、Kabat付番スキームを参照して判定した。Table1(表2)を参照されたい。上述の軽及び重鎖のそれぞれの3つのCDRは、後続工程の最終的ヒト化抗体PD1-H944において転位させて保持した。実施例2.2及び2.3を参照されたい。
Figure 0007358478000002
2.2 マウス抗体PD1-M944のヒト化CDR移植
CDR移植の古典的ヒト化方法を使用してマウス抗体のヒト化を実施した。マウス軽又は重鎖可変領域に最も近い、ヒト抗体軽又は重鎖可変領域を鋳型として選択し、マウス軽又は重鎖のそれぞれ由来の3つのCDR(Table1(表2))をヒト抗体の可変領域に挿入して、ヒト化軽鎖可変領域(VL)及び重鎖可変領域(VH)配列を得た。PD1-M944の軽鎖可変領域のヒト鋳型は、PD1-M944の軽鎖に対して73.48%相同なIGKV3-11*01であり、重鎖可変領域のヒト鋳型は、PD1-M944の重鎖に対して81.94%相同なIGHV3-21*02である。
2.3 ヒト化可変領域配列のフレームワーク領域復帰変異
CDR活性の支持に必須の、マウス由来フレームワーク領域内の鍵となる部位として、対応する部位をマウス抗体の配列に示す部位に復帰変異させ、この場合、軽鎖では89番目をMに、91番目をFに復帰変異させ、重鎖では44番目をRに、78番目をNに復帰変異させた。
ヒト化抗体PD1-H944をCDRのヒト化移植及びフレームワーク領域の復帰変異により得た。この重及び軽鎖アミノ酸配列は、配列番号16/17にそれぞれ示す。シグナルペプチドを含む形態のこの重及び軽鎖アミノ酸配列は、配列番号18/19にそれぞれ示して、逐次的に結合した重/軽鎖シグナルペプチド配列(配列番号20/21)、ヒト化抗体配列の重鎖/軽鎖の可変領域(配列番号22/23)、及びそれぞれヒトIgG4重鎖定常領域/ヒトカッパ軽鎖定常領域であるヒト化抗体の定常領域の配列(配列番号24/25)を比較する。
Figure 0007358478000003
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(実施例3)
ヒト化抗体PD1-H944の生成
PCR増幅後、逐次的に結合した重/軽鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(配列番号28/29)を含む、PD1-H944抗体を含むシグナルペプチドをコードする上記の各重/軽鎖ヌクレオチド配列(配列番号26/27)、ヒト化抗体の重/軽鎖可変領域(配列番号30/31)、及びヒトIgG4重鎖定常領域/ヒトカッパ軽鎖定常領域(配列番号32/33)をそれぞれ、制限エンドヌクレアーゼHind III及びXba I(Fermentas社)により二重分解し、次いで、市販のベクターpcDNA3(Invitrogen社)に挿入した。プラスミド抽出の後、pCDNA3軽鎖ベクターのNruI+NaeI+Dra I(Fermentas社)による三重分解により断片1.8kbを得、次いで、CHO/dhfr系発現ベクターpSSE(Sino Biological, Inc社)に挿入し、次いで、pCDNA3重鎖ベクターのNruI+NaeI+Dra I(Fermentas社)による三重分解により断片2.5kbを得た。次いで、これまでの工程において構築したpSSE(Sino Biological, Inc社)軽鎖ベクターにも挿入して、完全なベクターを得た。発現ベクターは、DNA増幅エレメントdhfr遺伝子、NeoR耐性遺伝子、及び抗体軽及び重鎖の発現エレメントを含む、真核細胞発現ベクターである。発現ベクターをdhfr-DG44細胞にトランスフェクトし、PD1-H944陽性細胞系をG418スクリーニングにより得、PD1-H944高発現細胞系をMTX段階圧力スクリーニングにより得、次いで、無血清培養による環境に適応させてクローンスクリーニングを行った。各工程では、抗体を高発現するクローンを、ELISAアッセイの結果と共に細胞増殖状態及び抗体医薬の鍵となる品質特性に基づいて選択した。
PD1-H944産生CHO細胞系を無血清補充懸濁培養により培養して、高い純度及び品質のPD1-H944抗体を得た。
(実施例4)
ヒト化抗体PD1-H944の特性決定
4.1 PD1-H944のヒト、マウス及びサルPD-1抗原への結合親和性アッセイ
(1)PD1-H944の組換えヒトPD-1タンパク質への結合能
間接ELISAを使用して、PD1-H944の組換えヒトPD-1タンパク質への特異的結合を検出した。種々の濃度(0.16ng/mL、0.49ng/mL、1.48ng/mL、4.44ng/mL、13.33ng/mL、40ng/mL、120ng/mL、360ng/mL、1080ng/mL、3240ng/mL及び9720ng/mL)の組換えヒトPD-1タンパク質を96ウェルプレート上に一晩4℃でコーティングした。翌日プレートを洗浄し、室温で1時間ブロッキングした。それぞれ2μg/mLのPD1-H944、ニボルマブ(Bristol-Myers Squibb社)及び陰性対照抗体H7N9-R1-IgG4(Sino Biological, Inc.社)100μLによるインキュベーション後、プレートを洗浄して非結合抗体を除去し、次いで、ヤギ抗ヒトIgG F(ab)2/HRP(JACKSON社)によりインキュベートして繰り返し洗浄し、基質発色溶液を加えて発色させてOD450を検出した。PD-1-H944及びニボルマブの組換えヒトPD-1タンパク質への結合のEC50は、それぞれ31.5ng/mL、R2=0.998及び179.0ng/mL、R2=0.997であった。これは、PD1-H944が組換えヒトPD-1タンパク質に、ニボルマブよりも有意に良好に結合することを示す(図2A～図2C)。
(2)PD1-H944の組換えジャーカット/PD-1細胞への結合能
PD1-H944の組換えジャーカット/PD-1細胞への結合能を、組換えヒトPD-1安定発現細胞系ジャーカット/PD-1(SinoCellTech Ltd社)を実験材料として使用したフローサイトメトリーにより測定した。PD1-H944、ニボルマブ及び陰性対照抗体H7N9-R1-IgG4を種々の濃度(0.195μg/mL、0.391μg/mL、0.781μg/mL、1.562μg/mL、3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL及び200μg/mL)で、対数増殖期の組換えジャーカット/PD-1細胞5×105/チューブに加え、混合及び4℃でインキュベートし、次いで、洗浄及び遠心分離して非結合抗体を除去した。抗体の細胞への結合を、ヤギ抗ヒトIgG Fc-FITC(Sino Biological, Inc.社)を加えることにより検出した。結果は、PD1-H944はジャーカット/PD-1細胞にEC50of9.63μg/mL、R2=1.000で特異的に結合し、ニボルマブはジャーカット/PD-1細胞にEC50of10.18μg/mL、R2=0.994で特異的に結合し、陰性対照抗体H7N9-R1-IgG4はジャーカット/PD-1細胞に結合しなかったことを示した(図3)。これは、PD1-H944が、ジャーカット/PD-1細胞により発現したPD-1に結合する良好な能力を有し、この結合能が、ニボルマブのそれよりもわずかに良好であることを示す。
(3)PD1-H944の組換えヒトPD-1タンパク質への結合親和性
PD1-H944(0.90nM、1.79nM、3.66nM、7.24nM)、ニボルマブ(0.51nM、1.02nM、2.05nM、4.10nM)のPD-1に対する親和性をOctet Biomolecular Interaction Assay Systemを使用して陰性対照抗体としてのH7N9-R1-IgG4(13.30nM)と共に判定した。結果は、PD1-H944の組換えヒトPD-1タンパク質に対する平均KD結合親和性が64.8pM、平均結合速度定数konが3.01E+05 M-1s-1、平均解離速度定数koffが1.95E-05 s-1であり、ニボルマブのPD-1タンパク質に対する平均KD結合親和性が74.1pM、平均結合速度定数konが6.92E+05 M-1s-1、平均解離速度定数koffが5.12E-05 s-1であったことを示した(図4)。PD1-H944はニボルマブよりも強力な親和性を有し、これはニボルマブの親和性の約1.14倍であり、PD1-H944は低い解離速度を有するため、PD1-H944は、ニボルマブよりも強力なPD-1タンパク質への結合能を有する。
(4)PD1-H944の組換えサル及びマウスPD-1タンパク質への結合能
間接ELISAを使用して、PD1-H944の組換えサル及びマウスPD-1タンパク質への特異的結合を検出した。種々の濃度(0.16ng/mL、0.49ng/mL、1.48ng/mL、4.44ng/mL、13.33ng/mL、40ng/mL、120ng/mL、360ng/mL、1080ng/mL、3240ng/mL及び9720ng/mL)の組換えヒト、サル及びマウスPD-1タンパク質(Sino Biological, Inc.社)1ウェルあたり100μLを96ウェルプレート上に一晩4℃でコーティングし、翌日、洗浄して室温で1時間ブロッキングした。PD1-H944、ニボルマブ及び陰性対照抗体H7N9-R1-IgG4(すべて2μg/mL)100μLによるインキュベーション後、プレートを洗浄し、二次抗体のヤギ抗ヒトIgG F(ab)2/HRPを加えて発色させ、OD450を検出した。アッセイは、三つ組で行った。結果は、PD1-H944が、組換えヒトPD-1タンパク質及び組換えサルPD-1タンパク質に、それぞれ抗原EC50が25.8ng/mL(R2=0.999)及び32.7ng/mL(R2=0.997)で結合可能であり、その上、組換えマウスPD-1タンパク質に交差結合せず(図5A)、ニボルマブが、組換えヒトPD-1タンパク質及び組換えサルPD-1タンパク質に、それぞれEC50が113.2ng/mL(R2=0.997)及び80.2ng/mL(R2=0.997)で結合可能であり、その上、マウスPD-1タンパク質には結合せず(図5B)、陰性対照抗体が、組換えヒトPD-1タンパク質、組換えサルPD-1タンパク質又は組換えマウスPD-1タンパク質に結合しなかったことを示した(図5C)。PD1-H944のサルPD-1への良好な結合は、この薬物の安全性評価のためのサルの使用を支持する。
(5)PD1-H944の組換えサル及びマウスPD-1タンパク質への結合親和性
種々の濃度勾配のPD1-H944及びニボルマブのビオチン化サル及びマウスPD-1タンパク質(Sino Biological, Inc.社)に対する親和性(図6A～図6Bを参照)を、Octetを使用して測定し、解析してKD値を得た。結果は、組換えサルPD-1タンパク質によるPD1-H944の親和性KD値が108pMであり、組換えサルPD-1タンパク質によるニボルマブの親和性KD値が131pMであり、これらが同等であったことを示した(図6A)。PD1-H944及びニボルマブの両方は、組換えマウスPD-1タンパク質に結合しなかった(図6B)。
4.2 PD1-M944はヒトPD-1リガンド(PD-L1及びPD-L2)のヒトPD-1タンパク質への結合を遮断する
組換えヒトPD-1タンパク質1ウェルあたり100μLを96ウェルプレート上にコーティングし、一晩4℃で放置した。翌日プレートを洗浄し、室温で1時間ブロッキングした後、1μg/mLのヒトPD-L1-ビオチン(Sino Biological, Inc.社)又は2μg/mLのヒトPD-L2-ビオチン(Sino Biological, Inc.社)を加えた。次いで、種々の濃度(0.003μg/mL、0.008μg/mL、0.025μg/mL、0.074μg/mL、0.222μg/mL、0.667μg/mL、2μg/mL、6μg/mL、18μg/mL)のPD1-H944、ニボルマブ又は陰性対照抗体H7N9-R1-IgG4を加え、インキュベートし、抗生物質ストレプトアビジン/HRPを加え、インキュベートし、OD450を検出した。各郡では、二つ組で試験を実施する。結果は、ビオチン化組換えヒトPD-L1及びPD-L2タンパク質が、コーティングしたヒトPD-1タンパク質に有効に結合可能であり、種々の濃度のPD1-H944及びニボルマブの両追加により、組換えヒトPD-L1タンパク質(図7A)及び組換えヒトPD-L2タンパク質(図7B)のヒトPD-1への結合が有効に阻害されたことを示した。PD1-H944及びニボルマブは、組換えヒトPD-L1をIC50がそれぞれ0.116μg/mL(R2=0.995)及び0.129μg/mL(R2=0.997)で、組換えヒトPD-L2をIC50がそれぞれ0.446μg/mL(R2=0.994)及び0.486μg/mL(R2=0.996)で阻害した。ヒトPD-1のヒトPD-L1又はヒトPD-L2への結合を阻害するPD1-M944の能力は、ニボルマブの能力との有意差はなく、陰性対照抗体では、有意な阻害は観察されなかった。
4.3 PD1-H944はヒトPD-1リガンド(PD-L1)のヒトPD-1発現細胞への結合を遮断する
組換えヒトPD-1を安定に発現する対数増殖期のジャーカット/PD-1細胞5×105細胞/チューブに種々の濃度(0.260μg/mL、0.390μg/mL、0.585μg/mL、0.878μg/mL、1.317μg/mL、1.975μg/mL、2.963μg/mL、4.444μg/mL、6.667μg/mL又は10.000μg/mL)のPD1-H944、ニボルマブ及び陰性対照抗体H7N9-R1-IgG4を加え、4℃でインキュベートした。0.4μg/mLのB7H1-Fc-ビオチン(Sino Biological, Inc.社)10μLを加え、PBSで洗浄し、非結合抗体を遠心分離により除去した。ストレプトアビジンAlexa Fluor(登録商標)488コンジュゲート(Life Technologies社)を加え、4℃で20分間インキュベートし、繰り返し洗浄して遠心分離し、PBSを200μL加えて細胞を再懸濁しフローサイトメーター上で検出した。結果は、組換えヒトPD-L1タンパク質が、ジャーカット/PD-1細胞に有効に結合可能であり、種々の濃度のPD1-H944及びニボルマブを加えた場合、組換えヒトPD-L1タンパク質のジャーカット/PD-1細胞への結合が、有効に阻害されたことを示した(図8)。阻害濃度IC50は、それぞれ1.78μg/mL(R2=0.994)及び2.48μg/mL(R2=0.989)であった。PD1-H944は、ヒトPD-1及びヒトPD-L1の結合をニボルマブよりもわずかに良好に阻害し、陰性対照抗体では、有意な阻害は観察されなかった。
4.4 PD1-H944のCD16aへの結合
親和性受容体CD16a(FcγRIIIa)タンパク質は、ADCCの作用を媒介する主要なFc受容体であり、V158 SNP部位を含むこのCD16aは、相対的に高い親和性を有する。PD1-H944の組換えCD16a(V158)タンパク質への結合をELISAにより測定して、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)作用に関するPD1-H944の潜在力を評価した。
このアッセイにおいて使用する陽性対照PD1-H944-1-IgG1(o)は、天然IgG1に結合するPD1-H944の可変領域であり、陰性対照PD1-H944-1-IgG1は、N-グリコシド欠失のためFc断片のCD16aへの結合能が欠乏したN297A変異IgG1に結合するPD1-H944の可変領域である。組換えヒトPD-1タンパク質(10μg/mL、100μL/ウェル)を96ウェルプレート上に一晩4℃でコーティングし、翌日、洗浄して、室温で1時間ブロッキングした。種々の濃度(0.020μg/mL、0.078μg/mL、0.3125μg/mL、1.25μg/mL、5μg/mL、20μg/mL及び80μg/mL)のPD1-H944、ニボルマブ、陽性対照抗体PD1-M944-1-IgG1(o)(Sino Biological, Inc.社)及び陰性対照抗体PD1-H944-1-IgG1(Sino Biological, Inc.社)を加え(図9を参照)、プレートを洗浄して、インキュベーション後に非結合抗体を除去した。1μg/mLのストレプトアビジン/HRPによるインキュベーション後に10μg/mLの組換えCD16a-AVI-His(V158)+BirAタンパク質(Sino Biological, Inc.社)をウェルに加え、インキュベーション後の発色によりOD450を検出した。
結果は、陽性対照抗体の組換えCD16aタンパク質への結合が、抗体濃度と共に向上したことを示した。PD1-H944、ニボルマブ及び陰性対照抗体は、いかなる試験濃度においても組換えCD16aタンパク質に結合しなかった(図9)。これは、IgG4亜型抗体として構築したPD1-H944及びニボルマブの両方が、CD16aへの非常に低い結合能を有し、PD1-H944が、ADCC作用を有しないか又はこのADCC作用が非常に低いことが予想されることを示唆する。
4.5 PD1-H944のC1qへの結合
PD1-H944の組換えC1qタンパク質への結合をELISAにより測定し、これにより補体依存性細胞傷害性(CDC)作用に関するPD1-H944の潜在力を評価した。
PD1-H944の可変領域を天然IgG1に結合させることにより得たPD1-H944-1-IgG1(o)を陽性対照抗体(Sino Biological, Inc.社)として使用し、H7N9-R1-IgG4(Sino Biological, Inc.社)をアイソタイプ対照抗体として使用した。種々の濃度(20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.313μg/mL、0.156μg/mL及び0.078μg/mL)(図10を参照)のPD1-H944、ニボルマブ、陽性対照抗体及びアイソタイプ対照抗体1ウェルあたり100μLを96ウェルプレート上に一晩4℃でコーティングした。翌日、プレートを洗浄、室温で1時間ブロッキングし、5μg/mLの組換えC1qタンパク質(Quidel Corporation社)100μLをそれぞれに加え、プレートを3時間インキュベートした。希釈倍率1:400の二次抗体抗C1q/HRP(Abcam社)100μLを加え、1時間インキュベートし、発色させて、OD450を検出した。
結果は、陽性対照抗体の組換えC1qタンパク質への結合が、抗体濃度と共に向上したことを示した。PD1-H944、ニボルマブ及びアイソタイプ対照抗体は、同等の組換えC1qタンパク質への結合能を有し、IgG1型陽性対照よりも有意に低い結合能を有した(図10)。
4.6 PD1-H944のFcRnへの結合
PD1-H944の組換えヒトFc受容体(FcRn)タンパク質への結合をELISAにより測定し、これによりヒトにおけるPD1-H944の薬物動態を評価した。
濃度10μg/mLの抗ビオチンタンパク質であるアビジン(Thermo Fisher Scientific社)1ウェルあたり100μLを96ウェルプレート上にコーティングし、一晩4℃でインキュベートし、翌日、洗浄し、室温で1時間ブロッキングし、10μg/mLのビオチン化FCGRT-His+B2Mタンパク質(Sino Biological, Inc.社)により1時間インキュベートし、次いで、種々の濃度(0.123μg/mL、0.37μg/mL、1.11μg/mL、3.33μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、90μg/mL、270μg/mL)のPD1-H944、ニボルマブ又はアイソタイプ対照抗体H7N9-R1-IgG4(Sino Biological, Inc.社)をそれぞれ加え(図11を参照)、洗浄して250ng/mLのヤギ抗ヒトIgG Fc/HRP(Sino Biological, Inc.社)を加えた。抗体希釈から二次抗体インキュベーションまでのプロセスではpH6.0に維持し、OD450を測定した。
結果は、PD1-H944及びニボルマブが、組換えヒトFcRnタンパク質に結合可能であり、結合能が、濃度と共に向上して、高濃度(270μg/mL)では、PD1-H944の組換えヒトFcRnタンパク質への結合は、ニボルマブの結合の約1.62倍であったことを示した(図11)。この結果に基づいて、PD1-H944が、ヒトにおいて良好な薬物動態を有すると仮定する。
(実施例5)
ヒト化抗体PD1-H944の機能解析
5.1 PD1-H944により刺激された混合リンパ球応答によるCD4+T細胞の活性化
抗ヒトPD-1抗体の中和活性を、DCを用いたCD4+Tリンパ球の混合アッセイにより検出した。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)をフィコール密度勾配遠心分離により単離し、次いで、単核細胞を接着培養方法により得、160ng/mLのrhIL-4(Sino Biological, Inc.社)及び20ng/mLのrhGM-CSF(R&D Systems社)を含む1640細胞培養培地(GIBCO社)(10%のFBS、100単位/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシンを含む)を生じる単核細胞に加え、CO2インキュベーター内で3日目までインキュベートし、次いで、培養培地の半量を交換した。6日のインキュベーション後、懸濁する細胞を採取した。これは、DCであることがわかる。DCの密度を2×106細胞/mLに調整し、最終濃度50μg/mLのマイトマイシンを加え、37℃で20分間処理し、1640培地で3回洗浄して、さらなる工程を行った。
CD4+Tリンパ球は、CD4+Tリンパ球選別キット(MiltenyiBiotec社)を使用して、別人の末梢血から単離したPBMCから選別した。3人の各血液ドナー由来のCD4+Tリンパ球を、このアッセイの各バッチにおいて使用した。
選別したCD4+Tリンパ球を、これまでに50μg/mLのマイトマイシンで処理したDCと10:1の比率で混合し、96ウェルプレート内の105細胞/ウェルにPD1-H944、ニボルマブ、及び陰性対照抗体H7N9-R1-IgG4(Sino Biological, Inc.社)をそれぞれ均等に播種し、これらとは別に、リンパ球対照群、すなわち、抗体を有しないCD4+Tリンパ球及びDCのみの混合物を有する群、DC細胞対照群、すなわち、抗体を有しないDC細胞のみ及びCD4+Tリンパ球を有する群、CD4+T細胞対照群、すなわち、抗体を有しないCD4+T細胞のみ及びDC細胞を有する群を同一量の試料希釈1640培地と混合し、各抗体の最終濃度勾配を1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mLとして、37℃及び5%CO2のCO2インキュベーター内で5日間インキュベートした。培養上清を採取し、培養上清におけるIL-2及びIFN-γの発現レベルをELISAにより測定した。
結果は、IFN-γ及びIL-2分泌が、DCを混合しないCD4+T細胞培養物の上清において検出されなかった可能性があり、一方、混合リンパ球対照群では、CD4+T細胞及びDCを混合することによりCD4+T細胞のIFN-γ及びIL-2分泌が有意に増加したことを示した。抗PD-1抗体を混合リンパ球系に加えた場合、CD4+T及びDCの混合リンパ球応答によるCD4+T細胞の活性化により、IFN-γ及びIL-2分泌の増加が更に促進された。有意な作用を有したPD1-H944及びニボルマブの両方とはかなり対照的に、陰性対照抗体は、この作用を示さなかった。結果は、図12に示し、PD1-H944が、ニボルマブのそれよりも良好な機能活性を有し、免疫抑制されたT細胞を有効に再活性化し得ることを示唆する。
5.2 PD1-H944はPD1の下流のIL2シグナル伝達経路においてレポーター遺伝子の活性化を刺激する
このアッセイでは、エフェクター細胞ジャーカット-NFAT-Luc2p-PD-1(SinoCellTech Ltd社)及び標的細胞CHO-K1-PD-L1-CD3E(SinoCellTech Ltd社)を実験材料として使用した。このような2つの細胞の同時培養により生じたPD-1/PD-L1相互作用により、TCRシグナル伝達及びNFAT-REにより媒介される生物発光が阻害される。PD-1抗体を加えると、PD-1/PD-L1相互作用が遮断され、これによりこの阻害が解除された。組換えヒトPD-1受容体細胞系におけるPD1-H944の活性化機能を、エフェクター細胞における生物発光(RLU)の強度を測定することにより判定した。
標的細胞CHO-K1-PD-L1-CD3E細胞を2×104/ウェルで96ウェルプレート内に播種し、10%のFBSを含むDMEM培地中で一晩培養し、次いで、上清を除去した。種々の濃度(0.007μg/mL、0.023μg/mL、0.082μg/mL、0.286μg/mL、1.000μg/mL、3.499μg/mL、12.245μg/mL、42.857μg/mL、150μg/mL)のPD1-H944、ニボルマブ及び陰性対照抗体H7N9-R1-IgG4(Sino Biological, Inc.社)を40μL/ウェルで加えた(図13を参照)。その後、7.5×104のエフェクター細胞ジャーカット-NFAT-Luc2p-PD-1を40μL/ウェルで加え、CO2インキュベーター内で6時間インキュベートした。各アッセイは、標的細胞、エフェクター細胞及び陰性対照Mについて三つ組で実施した。6時間のインキュベーション後、受動的溶解5×緩衝液(Promega社)を20μL/ウェルで加え、次いで、96ウェルプレートを-80℃の冷蔵庫内に静置して、さらなる検出を行った。このアッセイでは、96ウェルプレートは、-80℃で静置した。室温に解凍、振盪し、1ウェルあたり上清20μLを96ウェルの白色底プレートに移して、LB960マイクロプレートルミノールアッセイにより発光検出を行った。
結果は、図13に示すように、PD1-H944及び対照抗体ニボルマブの両方が、組換えヒトPD-1受容体遺伝子細胞系を有意に活性化したことを示した。0.007～150μg/mLの濃度範囲では、PD1-H944のEC50 fは0.49μg/mLであり、ニボルマブのそれは1.08μg/mLであった。PD1-H944のEC50は、ニボルマブのそれよりも有意に低かった。この活性は、ニボルマブの活性の2.21倍である。陰性対照抗体は、組換えヒトPD-1受容体遺伝子細胞系において活性化機能を有しなかった。
5.3 PD1-H944はFc受容体CD16a経路のADCC機能を有意には刺激しない
このアッセイでは、エフェクター細胞ジャーカット-NFAT-Luc2p-CD16A(SinoCellTech Ltd社)及び標的細胞CHO-PD-1(SinoCellTech Ltd社)をアッセイ材料として使用して、組換え高度活性CD16a(V158)受容体遺伝子系方法によりPD1-H944媒介ADCC作用を測定した。この機構は、2つの細胞を同時培養してPD1-H944を同時に加える場合、PD1-H944のFab断片がPD-1高発現標的細胞に結合し、これによりこのFc断片を、Fcγ受容体CD16Aを保有するエフェクター細胞に結合させ、結果的にエフェクター細胞ジャーカット-NFAT-Luc2p-CD16Aを活性化してNFAT-REにより媒介される化学発光を促進するものである。
標的CHO-PD-1細胞を2×104/ウェルで96ウェルプレート内に播種し、10%のFBSを含むDMEM培地中で一晩培養し、上清を除去した。プレートを0.1%のBSAを含むRPMI 1640(無フェノールレッド)培地で2回洗浄し、次いで、種々の濃度(図14A～図14Bを参照)の陽性対照抗体PD1-H944-1-IgG1(o)、PD1-H944、ニボルマブ及び陰性対照抗体H7N9-R1-IgG4(Sino Biological, Inc.社)を40μL/ウェルで加え、1×106のエフェクター細胞ジャーカット-NFAT-Luc2p-CD16Aを40μL/ウェルで加え、37℃及び5%CO2のCO2インキュベーター内に4時間静置した。各アッセイは、標的細胞、エフェクター細胞及び陰性対照について三つ組で実施した。4時間の終わりに、20μL/ウェルの受動的溶解5×緩衝液(Promega社)を加え、96ウェルプレートを-80℃の冷蔵庫内に静置して試験した。このアッセイでは、96ウェルプレートを室温に解凍、振盪し、1ウェルあたり上清20μLを96ウェルの白色プレートに移して、LB960マイクロプレートルミノールアッセイにより発光検出を行った。
結果は、0.018～300ng/mLの濃度範囲において、陽性対照抗体PD1-H944-1-IgG1(o)が有意なADCC媒介作用を有し、ニボルマブが弱いADCC作用を有し、その上、PD1-H944がニボルマブよりも弱いADCC作用を有したことを示した(p＜0.01)。図14A及び図14Bは、アッセイの種々のバッチの結果を示す。図14C及び図14Dは、図14A及び図14Bにおける最も高い抗体濃度点(300ng/mL)に対応する生物発光強度(RLU)をそれぞれ示す。この感受性ADCC機能アッセイでは、PD1-H944のCD16aへの結合により引き起こされた細胞活性化は、ニボルマブのそれよりも有意に低く、結果は、反復可能であった。PD1-H944薬物の低いADCC活性は、この抗体の臨床における有効性及び安全性のための良好な支持となる。
5.4 PD1-H944は補体C1q経路のCDC機能を有意には活性化しない
PD-1高発現腫瘍細胞への結合の後、PD1-H944は、古典的補体経路を活性化して腫瘍細胞を殺傷し、この細胞死を生じ得る。このアッセイでは、PD1-H944のCDC作用を、WST-8方法を使用して検討した。
CHO-PD-1細胞を、0.1%のBSA(SinoCellTech Ltd社)を含むRPMI1640培地中に再懸濁し、5×104/ウェルで96ウェルプレートに均一に播種した後、種々の濃度(図15)の抗体を50μL/ウェルで、次いで、1:4希釈の補体C1q(One lambda社)を50μL/ウェルで加えた。抗体は、陽性対照抗体PD1-H944-1-IgG1(o)( Sino Biological, Inc.社)、PD1-H944、ニボルマブ及び陰性対照抗体PD1-H944-1-IgG1(Sino Biological, Inc.社)であり、アッセイブランクウェルB(無細胞)及び陰性対照M(細胞を有するが無抗体)と共に試験した。37℃で3時間のインキュベーション後、WST-8発色溶液15μLを各ウェルに加え、発色安定後にELISA解析装置上で450nm及び630nmの吸光度を測定した。結果は、吸光度値OD450-OD630を使用して算出し、ブランクウェルの値を引いた。%殺傷=(陰性対照MのOD-試料のOD)/陰性対照MのOD×100%。
結果は、PD1-H944、ニボルマブ及び陰性対照抗体が、PD-1を高発現する腫瘍細胞であるCHO-PD-1に対するCDC作用を有せず、一方、陽性対照抗体が、CHO-PD-1に対する殺傷作用を有し、最大殺傷率は82.1%であったことを示した。結果は、図15に示す。また、CDCアッセイでは、PD1-H944が、PD-1発現標的細胞に対するCDC作用を有しなかったことが確認され、抗体の良好な安全性を実証した。
5.5 PD1-H944はin vivoでヒト化PD-1マウスにおけるMC38結腸がん皮下移植腫瘍モデルの増殖を有効に阻害する
(1)MC38結腸がん皮下移植腫瘍を有するヒト化PD-1マウスモデルにおけるPD1-H944の薬力学試験I
対数増殖期のMC38細胞(Sun Ran Shanghai Biotechnology Co., Ltd.社)を腫瘍播種に使用した。PBS中に再懸濁したMC38細胞を5×105細胞/0.1mLでB-hPD-1ヒト化マウス(Biocytogen社)(C57BL/6マウスのPD-1遺伝子のエクソン2の部分をヒトPD-1ゲノムの対応する部分と置換することにより得た)においてマウス胸郭右側面の皮下に播種した。合計47マウスであった。腫瘍量が約100mm3に増えると、個々の腫瘍量に応じてマウスを選択し、エクセルソフトウェアを使用して5つの群にランダムに割り当てた。各郡は8匹であった。4群及び5群は、この適用には無関係の他の抗PD-1抗体を投与したため、これらのデータは本明細書には提示しない。投与は、群化した日に開始した。マウスには、腹腔内注射(I.P.)により3日毎に1回、6回連続で投与し、最終投与後10日で犠死させ、腫瘍組織を摘出して秤量した。特定の投与計画は、以下のTable3(表4)に示した。薬物の抗腫瘍作用を、腫瘍増殖阻害率TGI(%)を算出することにより評価した。TGI(%)<60%は無効であると考え、TGI(%)≧60%であり、溶媒対照群の腫瘍量よりも統計学的に有意に低かった(P<0.05)処置群の腫瘍量は、有効である、すなわち、腫瘍増殖に対する有意な阻害作用を有すると考えた。TGI(%)は、次のように算出した。
TGI(%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100、式中
Ti:i日目の処置群における平均腫瘍量。
T0:0日目の処置群における平均腫瘍量。
Vi:i日目の溶媒対照群の平均腫瘍量。
V0:0日目の溶媒対照群の平均腫瘍量。
動物をアッセイ終了時に犠死させ、腫瘍量を秤量して腫瘍質量阻害率IRTW%を算出し、IRTW%>60%を有効性の参照指数として、以下のように算出した。
腫瘍質量の阻害率IRTW(%)=(W溶媒対照-W処置群)/W溶媒対照×100、Wは腫瘍質量である。
Figure 0007358478000019
すべての試験動物は、投与期間は活動及び採餌に関して良好な全身状態であり、体重は、ある程度増加した。試験薬(3群)及び対照薬(2群)の投与後の動物の体重において有意差は存在しなかった(P>0.05)。すべての動物の体重における変化は、図16及びTable4(表5)に示す。
Figure 0007358478000020
試験における各郡についての腫瘍量結果は、Table5(表6)及び図17に示す。
Figure 0007358478000021
初回投与後25日に、すべての動物を安楽死させ、腫瘍を採取し、秤量して撮影した。腫瘍質量を群間で統計比較し、結果をTable6(表7)及び図18に要約した。
Figure 0007358478000022
腫瘍量結果と一致して、ニボルマブは、このモデルにおいて腫瘍を有意には阻害せず、その上、PD1-H944群の平均腫瘍質量は0.044±0.017gであった。この腫瘍質量阻害率(IRTW)は97.4%に達した。データ解析により、PD1-H944群の腫瘍が、溶媒対照の腫瘍とは有意に異なることが示され(P<0.05)、PD1-H944の有意な抗腫瘍有効性を実証した。
アッセイ終了時には、溶媒対照群の平均腫瘍量は217±430mm3であり、腫瘍質量は1.719±0.310gであった。陽性対照群ニボルマブ(20mg/kg)の平均腫瘍量は1802±228mm3、TGI%は17.8%、腫瘍質量は1.492±0.274gであった。腫瘍質量の阻害率IRTWは13.2%であり、これにより溶媒対照群の腫瘍量との有意差はなかった(P=0.480)。対照的に、PD1-H944の平均腫瘍量は171±51mm3、TGI%は96.7%、腫瘍質量は0.044±0.017g、腫瘍質量の阻害率IRTWは97.4%であり、これにより、溶媒対照の腫瘍量と比較して有意差が存在し(P<0.05)、PD-1エピトープに結合したドナー抗体PD1-H944が有効であり、MC38結腸がん皮下移植腫瘍の有意な阻害を用量レベル20mg/kgで示したことを指示した。
(2)MC38結腸がん皮下移植腫瘍を有するヒト化PD-1マウスにおけるPD1-H944の薬力学試験II
対数増殖期のMC38細胞(Sun Ran Shanghai Biotechnology Co., Ltd.社)を腫瘍播種に使用した。PBS中に再懸濁したMC38細胞を5×105細胞/0.1mLでB-hPD-1ヒト化マウス(Biocytogen社)(C57BL/6マウスのPD-1遺伝子のエクソン2の部分をヒトPD-1ゲノムの対応する部分と置換することにより得たマウス)に播種した。合計80マウスの胸郭右側面の皮下に播種した。腫瘍量が約100mm3に増えると、個々の腫瘍量に応じてマウスを選択し、エクセルソフトウェアを使用して8つの群にランダムに割り当てた。各郡は8匹であった。3群、4群、7群及び8群は、この適用には無関係の他の抗PD-1抗体を投与したため、これらのデータは本明細書には提示しない。投与は、群化した日に開始した。マウスには、腹腔内注射(I.P.)により3日毎に1回、6回連続で投与し、最終投与後10日で犠死させ、腫瘍組織を摘出して秤量した。特定の投与計画は、以下のTable7(表8)に示す。
Figure 0007358478000023
薬物の抗腫瘍作用を、腫瘍増殖阻害率TGI(%)を算出することにより評価した。TGI(%)<60%は無効であると考え、TGI(%)≧60%であり、溶媒対照群の腫瘍量よりも統計学的に低かった(P<0.05)処置群の腫瘍量は、有効である、すなわち、腫瘍増殖に対する有意な阻害作用を有すると考えた。TGI(%)は、次のように算出した。
TGI(%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100、式中
Ti:i日目の処置群における平均腫瘍量。
T0:0日目の処置群における平均腫瘍量。
Vi:i日目の溶媒対照群の平均腫瘍量。
V0:0日目の溶媒対照群の平均腫瘍量。
動物をアッセイ終了時に犠死させ、腫瘍を秤量して腫瘍質量阻害率IRTW%を算出し、IRTW%>60%を有効性の参照指数として、以下の式を使用して算出した。
腫瘍質量の阻害率IRTW(%)=(W溶媒対照-W処置群)/W溶媒対照×100、Wは腫瘍質量である。
すべての試験動物は、薬の投与期間は活動及び採餌に関して良好な全身状態であり、体重は、ある程度増加した。試験薬及び対照薬の投与後の動物の体重において有意差は存在しなかった(P>0.05)(Table8(表9)及び図19)。
Figure 0007358478000024
アッセイにおける各群の腫瘍量は、Table9(表10)及び図20に示す。
Figure 0007358478000025
初回投与後24日に、すべての動物を安楽死させ、腫瘍を採取し、秤量して撮影した。腫瘍質量を群間で統計比較し、結果をTable10(表11)及び図21に要約する。
Figure 0007358478000026
溶媒対照群では、腫瘍量は群化後、増え続け、試験終了時の平均腫瘍量は3405±624mm3であった。
陽性対照群では、20mg/kgのペムブロリズマブ投与後、腫瘍量は、溶媒対照群と比較して緩徐に増加し、投与5日目から腫瘍量において有意差を有した(P<0.05)。試験終了時のTGI%は97.0%、腫瘍質量の阻害率は93.5%であった。溶媒対照群と比較してP<0.05である。ペムブロリズマブは、この有効性モデルにおいて明らかな腫瘍阻害を示し、このモデルが、キイトルーダエピトープ結合抗体医薬の有効性評価に使用可能であることを示した。
PD1-H944 8mg/kg群では、8mg/kgのPD1-H944投与後、腫瘍量は、溶媒対照群と比較して緩徐に増加し、腫瘍量は、投与5日目から有意差を示した(P<0.05)。試験終了時のTGI%は89.7%、腫瘍質量の阻害率は87.8%であった。溶媒対照群と比較してP<0.05である。
PD1-H944 2mg/kg群では、2mg/kgのPD1-H944投与後、腫瘍量は、溶媒対照群と比較して緩徐に増加し、5日目から腫瘍量において有意差を有した(p<0.05)。試験終了時のTGI%は85.3%、腫瘍質量の阻害率は84.7%であった。溶媒対照群と比較してP<0.05である。これはやはり、PD-1エピトープに結合する対象のPD1-H944抗体が、このモデルにおいて有効であり、用量相関を示すMC38結腸がん皮下移植腫瘍に対して有意な腫瘍抑制作用を提示することを示唆する。このアッセイにおけるPD1-H944及びペムブロリズマブの抗腫瘍有効性がまた、腫瘍質量に関して確認された。
このアッセイの結果は、PD1-H944 8mg/kg又は2mg/kgを3日毎に6回連続で腹腔内投与することにより、PD-1ヒト化マウスにおけるMC38移植腫瘍の増殖が有意に阻害され(P<0.05)、投与群の動物特性決定及び体重が、モデル群の結果とは異ならなかったことを示した。種々の抗体エピトープのためのモデルデザインの優先度を考慮して、このアッセイでは、PD1-H944及びペムブロリズマブとの間の有効性の差を評価しなかった。
in vivoでの薬力学試験では、動物モデルとしてヒト化PD-1 C57BL/6マウスにおける皮下移植MC38結腸がんに対するPD1-H944単独の抗腫瘍作用を検討した。B-hPD-1ヒト化マウスは、PD-1遺伝子をヒト化して、抗ヒトPD-1抗体医薬の有効性のin vivoでの評価のためにマウスを安定させたC57BL/6マウスである。このモデルは、PD-1抗体の種々のエピトープの有効性に対して選択されたものであり、ペムブロリズマブは、このモデルにおいて有意な腫瘍阻害を示した。結果は、PD1-H944単独(2、8及び20mg/kgを3日毎に6回連続)により、MC38移植腫瘍の増殖が有意に阻害されたことを示した。要約データは、Table11(表12)及びTable12(表13)に示す。
Figure 0007358478000027
Figure 0007358478000028
(実施例6)
PD1-H944により特異的に結合したアミノ酸部位の同定
実施例4.2からのデータは、PD1-H944が、PD-1タンパク質への結合に関してPD-L1(図7A)又はPD-L2(図7B)と有効に競合し、PD1-H944により標的とされるPD-1上の結合するエピトープ及びPD-L1又はPD-L2リガンドにより標的とされるPD-1上の結合するエピトープとの間のオーバーラップを実証することを示す。
6.1 PD1-H944エピトープを立体構造的に予想する分子シミュレーション
PD1-H944-PD-1タンパク質界面間の相互作用を検討するために、この実施例では、PD1-H944及びPD-1タンパク質のZDOCKドッキングを実施した。PD1-H944により標的とされるPD-1タンパク質結合エピトープが、リガンドPD-L1により標的とされるPD-1タンパク質結合エピトープとオーバーラップすることに基づいて、PD1-H944の相同性モデリングをDS4.0(Accelrys Software Inc.社)による抗体モデルプログラムを使用して実施し、最終モデル構築物の妥当性をラマチャンドランマップにより試験した。PD-1タンパク質三次元構造をPDBデータベースからダウンロードし(PDB ID:4ZQK)、Protein Preparationプログラムにより初期化した。PD1-H944モデルの結合モデル及びPD-1構造をZDOCKプログラムによりドッキングさせた。次いで、点数化したトップテンをRDOCKにより最適化した。最良のモデルをProtein Interface Analysisプログラムにより更に解析した(図22)。ドッキングモデル界面相互作用により、PD1-H944によりPD-1タンパク質に結合した主要なペプチド配列がCC'及びFGシートであったことが示された(Table13(表14))。
Figure 0007358478000029
6.2 PD-1タンパク質変異体により試験したPD1-H944結合エピトープの検証
PD1-H944の機能性エピトープを更に確認するために、PD1-H944のPD-1タンパク質への結合の主要な部位であると予想されたTable13(表14)のペプチド配列に基づいて、一連のアラニン変異PD-1タンパク質変異体を調製してELISAアッセイにより解析した。モデルの正確性を検証するために、実施例6.1のモデル以外のいくつかの部位をまた、この試験のために選択し(Table14(表15))、このような変異部位を、5つのエピトープに大まかに空間立体構造的に群化した(図23)。
Figure 0007358478000030
Table14(表15)の各変異体のPD1-H944への結合を、実施例4.2の方法に従ってELISAにより判定した。変異体では、非変異PD-1タンパク質と比較して、結合の減少度が異なる。データを解析し、PD-1タンパク質変異体プロファイルを水平座標として、結合率を垂直座標として[結合率=OD(PD-1タンパク質変異体)/OD(PD-1タンパク質)×100%]、エクセル2007を使用してプロットした。結果は、PD-1タンパク質のリガンドPD-L1に対する主要な結合部位が、PD-1タンパク質のCC'及びFGシート上の部位2、部位3、部位4及び部位5であったことを示し、これらは、結晶複合体(PDB ID:4ZQK)と一致した。PD-1タンパク質に結合する陽性対照ニボルマブの結合部位は、Nループ及びFGシートの部位1及び部位4上に主に位置し、この結果も、この複合体結晶(PDB ID:5WT9)の解析と一致した。PD-1タンパク質に結合するPD1-H944の主要な結合部位は、部位3及び部位4上のE61、K78、D85及びP130であった。結果はまた、上記例のドッキングモデルの結果と一致し(図24及びTable15)、PD1-H944及びPD-1タンパク質との間のドッキングモデルの正確性が検証された。
Figure 0007358478000031
PD1-H944及びPD-1タンパク質との間のドッキングモデルは、PD1-H944により標的とされるPD-1タンパク質上の結合エピトープが、リガンドPD-L1により標的とされる結合エピトープとオーバーラップすることを示す。このことは、PD1-H944が、直接的空間立体障害により作用するという考えを支持する。一方、PD1-H944及びニボルマブの両方により標的とされるエピトープ間のオーバーラップは、PD1-H944が、PD-L1のエピトープへの結合を遮断するための大型の領域を有することを示唆した(図25A～図25C)。したがって、PD1-H944は、腫瘍学的治療において優れた治療有効性を有し得る。

Claims (27)

  1. 軽鎖可変領域若しくはその部分及び重鎖可変領域若しくはその部分を含む、単離PD-1抗体又はその抗原結合断片であって、
    前記軽鎖可変領域又はその部分が、配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号12のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含み、
    前記重鎖可変領域又はその部分が、配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号14のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む、単離PD-1抗体又はその抗原結合断片。
  2. 配列番号23のPD-1抗体軽鎖可変領域配列に対する少なくとも90%、92%、95%、98%若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号22のPD-1抗体重鎖可変領域配列に対する少なくとも90%、92%、95%、98%若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はこれらからなる、請求項1に記載の単離PD-1抗体又はその抗原結合断片。
  3. 軽鎖定常領域及び重鎖定常領域を更に含む、請求項1又は2に記載の単離PD-1抗体。
  4. 前記軽鎖定常領域が、配列番号25のカッパ軽鎖定常領域に対する少なくとも90%、92%、95%、98%若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、及び前記重鎖定常領域が、配列番号24のIgG4重鎖定常領域に対する少なくとも90%、92%、95%、98%若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項3に記載の単離PD-1抗体。
  5. IgG抗体である、請求項1から4のいずれか一項に記載の単離PD-1抗体。
  6. IgG4抗体である、請求項5に記載の単離PD-1抗体。
  7. モノクローナル抗体である、請求項1から6のいずれか一項に記載の単離PD-1抗体。
  8. KD平均値で20～200pMの親和性で組換えヒトPD-1タンパク質に結合する、請求項1から7のいずれか一項に記載の単離PD-1抗体又はその抗原結合断片。
  9. KD平均値で60～70pMの親和性で組換えヒトPD-1タンパク質に結合する、請求項8の単離PD-1抗体又はその抗原結合断片。
  10. KD平均値で64.8pMの親和性で組換えヒトPD-1タンパク質に結合する、請求項9に記載の単離PD-1抗体又はその抗原結合断片。
  11. 配列番号1のアミノ酸配列を含むPD-1タンパク質分子、又は配列番号1に対する少なくとも90%、92%、95%、98%若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質分子に特異的に結合する、請求項1から10のいずれか一項に記載の単離PD-1抗体又はその抗原結合断片。
  12. PD-1タンパク質細胞外領域60SESFV64、78KLAAFPEDRSQP89、128LAPKAQI134の少なくとも1つから選択されるペプチド配列に特異的に結合する、請求項1から11のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  13. PD-1タンパク質細胞外領域E61、K78、D85及びP130の少なくとも1つから選択されるアミノ酸残基に特異的に結合する、請求項12に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  14. 前記抗原結合断片が、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fd断片、Fd'断片、又は一本鎖抗体分子の形態である、請求項1から13のいずれか一項に記載の単離PD-1抗体又はその抗原結合断片。
  15. 前記一本鎖抗体分子が、scFv、di-scFv、tri-scFv、ダイアボディ又はscFabである、請求項14に記載の単離PD-1抗体又はその抗原結合断片。
  16. 請求項1から15のいずれか一項に記載の単離PD-1抗体又はその抗原結合断片と、低分子化合物及び/又は生体高分子から選択される別の分子とにより形成される、共有結合性若しくは非共有結合性コンジュゲート又は組換え多重標的融合薬物である、改変薬物分子。
  17. 請求項1から15のいずれか一項に記載の単離PD-1抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むか、又はこれからなる、単離核酸。
  18. 配列番号26及び27のヌクレオチド配列を含むか、これらからなる、請求項17に記載の単離核酸。
  19. 請求項17又は18に記載の単離核酸を含むベクター。
  20. 請求項17又は18に記載の単離核酸を含み、及び/又は請求項19に記載のベクターを含む、単離細胞。
  21. 請求項1から15のいずれか一項に記載の単離PD-1抗体又はその抗原結合断片を生成する方法であって、請求項20に記載の単離細胞を培養する工程、及び前記単離PD-1抗体又はその抗原結合断片を精製する工程を含む、方法。
  22. 腫瘍又はがんの治療のための医薬の調製における、請求項1から15のいずれか一項に記載の単離PD-1抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項16に記載の改変薬物分子の使用。
  23. 前記腫瘍又はがんが、結腸がんである、請求項22に記載の使用。
  24. 請求項1から15のいずれか一項に記載の単離PD-1抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項16に記載の改変薬物分子を含む、医薬組成物。
  25. 請求項24に記載の医薬組成物を1つ又は複数の他の治療薬と共に含む医薬組合せ物。
  26. 請求項1から15のいずれか一項に記載の単離PD-1抗体若しくはその抗原結合断片、請求項16に記載の改変薬物分子、請求項24に記載の医薬組成物、又は請求項25に記載の医薬組合せ物を含む、キット。
  27. 投与のための装置を更に含む、請求項26に記載のキット。
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