CN116234559A

CN116234559A - 抗cd22单结构域抗体和治疗性构建体

Info

Publication number: CN116234559A
Application number: CN202180066191.XA
Authority: CN
Inventors: S·麦科姆; R·维拉特纳; M·阿巴比-加赫鲁迪; T·阮; C·吴
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 2020-07-29
Filing date: 2021-07-27
Publication date: 2023-06-06
Also published as: JP2023535485A; KR20230042090A; BR112023001452A2; CA3187472A1; IL300116A; WO2022020945A1; AU2021317073A1; US20230265185A1; EP4188952A1

Abstract

本文提供了抗CD22单结构域抗体(sdAb)，其通过用主要的人CD22同种型的细胞外结构域免疫美洲驼制备。通过构建生成的重链组库的文库，分离出对免疫原特异的VHH抗体。最初产生的27个示例抗体包括分别对应于SEQNO:1‑3、4‑6、7‑9、10‑12、13‑15、16‑18、19‑21、22‑24、25‑27、28‑30、31‑33、34‑36、37‑39、40‑42、43‑45、46‑48、49‑51、52‑54、55‑57、58‑60、61‑63、64‑66、67‑69、70‑72、73‑75、75‑78和79‑81的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及相关序列。还提供了包括任何一种sdAb的多价抗体，包括双特异性T‑细胞衔接器、双特异性杀伤细胞衔接器(BiKE)和三特异性杀伤细胞衔接器(TriKE)。还描述了用于CAR‑T疗法的嵌合抗原受体(CAR)，其包括任何一种上述的sdAb。还描述了这些分子在治疗癌症中的用途。

Description

抗CD22单结构域抗体和治疗性构建体

相关申请的交叉引用

本申请要求题目为“抗CD22单结构域抗体和治疗性构建体(ANTI-CD22 SINGLEDOMAIN ANTIBODIES AND THERAPEUTIC CONSTRUCTS)”并且于2020年7月29日提交的美国临时申请号63/058,203的优先权的权益，其内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开大体上涉及抗CD22抗体。更具体地，本公开涉及抗CD22单结构域抗体。

背景技术

癌症是主要的公共健康问题，并且是全世界第二大死亡原因。传统的癌症疗法已包括手术、放疗和化疗。这些对某些癌症的治疗还算成功，尤其是那些在早期诊断的癌症。然而，许多侵袭性癌症缺乏有效的疗法。最近的技术创新表明，免疫疗法(刺激或恢复患者自身的免疫***以对抗癌症)可潜在地提供针对包括侵袭性难以治疗癌症的许多癌症的有效和长期的应答。

免疫疗法在治疗血液癌症中具有惊人的成功，导致监管批准了许多形式的这些疗法；治疗性抗体(即多种批准的靶向CD20、CD30、CD33和CD52的单克隆抗体)、靶向CD22和CD33的抗体-药物缀合物，和如双特异性T-细胞衔接器的多价抗体(靶向B细胞上的CD19的兰妥莫单抗(Blinatumomab))。

还发现这种抗体用于治疗性构建体。

例如，双特异性T-细胞衔接器，以及并入单链可变片段(scFv)的双特异性和三特异性杀伤细胞衔接器(BiKE和TriKE)已经被开发来指导宿主的免疫***以靶向癌细胞。

已经产生嵌合抗原受体(CAR)构建体以将T-细胞激活的方面组合成单一蛋白质。这些分子将细胞外抗原识别结构域连接到细胞内信号传导结构域，当抗原被结合时其激活T-细胞。

嵌合抗原受体(CAR)修饰的免疫细胞疗法是癌症免疫疗法的一种新兴形式，由此来自特异性靶向癌细胞上的细胞表面蛋白的抗体的单个或多个抗原结合结构域与免疫细胞激活结构域组合以产生“装甲(armored)”免疫细胞，其寻找并且杀死携带靶向抗原的特定细胞。CAR修饰的T-细胞疗法(CAR-T)为遭受无法治愈的侵袭性形式的B细胞白血病和淋巴瘤的患者提供了前所未有的应答，导致FDA和加拿大***批准了靶向CD19的CAR-T细胞产品，例如司利弗明(Tisangenlecleucel)

和阿基仑赛(axicabtageneciloleucel)/>

用于治疗具有B细胞ALL的复发或难治性儿童和青年患者，具有复发或难治性大B细胞淋巴瘤的成人患者，复发或难治性大B细胞淋巴瘤包括未另有说明的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、高级别B细胞淋巴瘤和由滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL。虽然这些靶向CD19的CAR疗法具有重要的临床价值，但应答并不总是持久的，并且在CAR-T后复发仍然是一个问题，在近似三分之一的CAR-T后复发病例中，发生白血病细胞上的CD19抗原明显丢失。开发靶向CD19以外的白血病抗原的新CAR受体是活跃的研究领域，类似的B细胞限制性抗原比如CD22或CD20显示出作为CAR-T疗法可替代的靶的强大前景。此外，靶向CD22的CAR-T受体的信号传导特性的分子优化具有导致更好治疗应答率的巨大潜力，并且已经显示使用靶向不同B细胞限制性抗原的多种CAR疗法是改善治疗结果的有效策略。

例如，目前，具有复发和化疗难治性B细胞恶性肿瘤(一组疾病，包括各种形式的白血病和淋巴瘤)的患者是靶向CD19的CAR-T疗法的候选者。虽然应答统计取决于CAR-T疗法的具体临床应用变化，但平均超过一半的成年患者在靶向CD19的疗法后会复发。

因此，希望提供对与癌症相关的治疗靶具有亲和力的免疫原性分子。

发明内容

本公开的目的是避免或减轻先前方法的至少一个缺点。

在一个方面中，提供了特异性结合至人CD22的分离的单结构域抗体(sdAb)，sdAb包括：

a)CDR1氨基酸序列GX₁X₂X₃DX₄YX₅(SEQ ID NO:126)，其中：

X₁是F或V，

X₂是T或S，

X₃是L、F或S，

X₄是Y、D或S，和

X₅是V或A，

CDR2氨基酸序列X₆X₇X₈X₉X₁₀GX₁₁T(SEQ ID NO:127)，其中：

X₆是I或M，

X₇是T、R、G或S，

X₈是S或N，

X₉是D或S，

X₁₀是D或不存在，

X₁₁是V或A，和

CDR3氨基酸序列AVDKPFYDGGX₁₂X₁₃YTCPVDFX₁₄S(SEQ ID NO:128)，其中：

X₁₂是I、N、Y或S，

X₁₃是Q、Y、R或L，和

X₁₄是D或G；

b)CDR1氨基酸序列GSX₁F X₂X₃X₄ X₅V(SEQ ID NO:129)，其中：

X₁是I或T，

X₂是R或不存在，

X₃是R、S或I，

X₄是I、S或T，和

X₅是A、S或T，

CDR2氨基酸序列ITSX₆GX₇X₈(SEQ ID NO:130)，其中：

X₆是G、S或A，

X₇是E、D或S，

X₈是T或S，和

CDR3氨基酸序列NAX₉X₁₀GX₁₁X₁₂X₁₃X₁₄(SEQ ID NO:131)，其中：

X₉是K或Q，

X₁₀是W或Y，

X₁₁是Q、R或G，

X₁₂是Y、D或R，

X₁₃是E或S，和

X₁₄是Y、D或H；

c)CDR1氨基酸序列GRIX₁RSYV(SEQ ID NO:132)，其中：

X₁是F或S，

CDR2氨基酸序列IGX₂SDT(SEQ ID NO:133)，其中：

X₂是W或C，和

CDR3氨基酸序列AX₃X₄SPPYGPQRDEFX₅Y(SEQ ID NO:134)，其中：

X₃是A或E，

X₄是N或Y，和

X₅是G或D；

d)CDR1氨基酸序列G X₁TX₂SVYX₃(SEQ ID NO:135)，其中：

X₁是R或G，

X₂是S或F，和

X₃是G或T，

CDR2氨基酸序列X₄X₅X₆SX₇GX₈T(SEQ ID NO:136)，其中：

X₄是M或I，

X₅是S或R，

X₆是W或G，

X₇是G或不存在，和

X₈是P或G，

CDR3氨基酸序列AVRIRRTLX₉EPLTKETLYDY(SEQ ID NO:137)，其中：

X₉是L或V；

e)SEQ ID NO:49阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:50阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:51阐释的CDR3氨基酸序列；

f)SEQ ID NO:4阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:5阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:6阐释的CDR3氨基酸序列；

g)SEQ ID NO:7阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:8阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:9阐释的CDR3氨基酸序列；

h)SEQ ID NO:13阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:14阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:15阐释的CDR3氨基酸序列；

i)SEQ ID NO:16阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:17阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:18阐释的CDR3氨基酸序列；

j)SEQ ID NO:40阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:41阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:42阐释的CDR3氨基酸序列；

k)SEQ ID NO:55阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:56陈述的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:57阐释的CDR3氨基酸序列；

l)SEQ ID NO:64阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:65阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:66阐释的CDR3氨基酸序列；或

m)SEQ ID NO:70阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:71阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:72阐释的CDR3氨基酸序列。

在以上中：

组a)提供了由本文称为hCD221ug-80、hCD22100ng-2、hCD221ug-74、hCD22100ng-66、hCD221ug-6、hCD22pas-10、hCD22pass-33的抗体限定的共有序列，

组b)提供了由本文称为hCD221ug-77、hCD221ug-87、hCD221ug-75、hCD221ug-93、hCD22pas-82和hCD22pas-23的抗体限定的共有序列，

组c)提供了由本文称为hCD22pas-32、hCD221ug-14和hCD22pas-55的抗体限定的共有序列，

组d)提供了由本文称为hCD22pas-79和hCD22pas-72的抗体限定的共有序列，

组f)是由来自称为hCD22pas-16的抗体的CDR限定的，

组f)是由来自称为hCD221ug-10的抗体的CDR限定的，

组g)是由来自称为hCD221ug-13的抗体的CDR限定的，

组h)是由来自称为hCD221ug-36的抗体的CDR限定的，

组i)是由来自称为hCD221ug-61的抗体的CDR限定的，

组j)是由来自称为hCD22100ug-62的抗体的CDR限定的，

组k)是由来自称为hCD22pas-24的抗体的CDR限定的，

组l)是由来自称为hCD22pas-48的抗体的CDR限定的，和

组m)是由来自称为hCD22pas-64的抗体的CDR限定的。

在另一方面中，提供了特异性结合至人CD22的分离的VHH单结构域抗体(sdAb)，sdAb包括：

A)

SEQ ID NO:1阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2阐释的CDR2氨基酸序列和SEQID NO:3阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-6)，

SEQ ID NO:4阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:5阐释的CDR2氨基酸序列和SEQID NO:6阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-10)，

SEQ ID NO:7阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8阐释的CDR2氨基酸序列和SEQID NO:9阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-13)，

SEQ ID NO:10阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:12阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-14)，

SEQ ID NO:13阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:15阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-36)，

SEQ ID NO:16阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:17阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:18阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-61)，

SEQ ID NO:19阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:20阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:21阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-74)，

SEQ ID NO:22阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:23阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:24阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-75)，

SEQ ID NO:25阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:26阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:27阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-77)，

SEQ ID NO:28阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:29阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:30阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-80)，

SEQ ID NO:31阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:32阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:33阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-87)，

SEQ ID NO:34阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:35阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:36阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-93)，

SEQ ID NO:37阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:38阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:39阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22100ug-2)，

SEQ ID NO:40阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:41阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:42阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22100ug-62)，

SEQ ID NO:43阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:44阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:45阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22100ug-66)，

SEQ ID NO:46阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:47阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:48阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-10)，

SEQ ID NO:49阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:50阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:51阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-16)，

SEQ ID NO:52阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:53阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:54阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-23)，

SEQ ID NO:55阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:56陈述的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:57阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-24)，

SEQ ID NO:58阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:59阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:60阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-32)，

SEQ ID NO:61阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:62阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:63阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-33)，

SEQ ID NO:64阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:65阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:66阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-48)，

SEQ ID NO:67阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:68阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:69阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-55)，

SEQ ID NO:70阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:71阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:72阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-64)，

SEQ ID NO:73阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:74阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:75阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-72)，

SEQ ID NO:76阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:77阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:78阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-79)，或

SEQ ID NO:79阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:80阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:81阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-82)。

A)

SEQ ID NO:79阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:80阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:81阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-82)；或

B)

与部分A)i)至xxviii)的任何一个中限定的CDR1、CDR2和CDR3序列至少80％同一性的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

A)

SEQ ID NO:3阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:6阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:9阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:12阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:15阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:18阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:21阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:24阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:27阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:30阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:33阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:36阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:39阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:42阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:45阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:48阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:51阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:54阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:57阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:60阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:63阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:66阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:69阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:72阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:75阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:79阐释的CDR3氨基酸序列，或

SEQ ID NO:81阐释的CDR3氨基酸序列。

在一个实施方式中，分离的sdAb包括：

SEQ ID NO:1阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:3阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:4阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:6阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:7阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:9阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:10阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:12阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:13阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:15阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:16阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:18阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:19阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:21阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:22阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:24阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:25阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:27阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:28阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:30阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:31阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:33阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:34阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:36阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:37阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:39阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:40阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:42阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:43阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:45阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:46阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:48阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:49阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:51阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:52阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:54阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:55阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:57阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:58阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:60阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:61阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:63阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:64阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:66阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:67阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:69阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:70阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:72阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:73阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:75阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:76阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:78阐释的CDR3氨基酸序列，或

SEQ ID NO:79阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:81阐释的CDR3氨基酸序列。

在一个方面中，提供了与本文描述的分离的sdAb竞争特异性结合至CD22的VHH单结构域抗体(sdAb)。

在一个方面中，提供了包括本文限定的sdAb的重组多肽。

在进一步的方面中，本公开提供了连接至货物分子(cargo molecule)的本文限定的抗CD22 sdAb。

在方面中，提供了编码本文限定的sdAb、重组多肽或V_HH:F_c融合物的重组核酸分子。

在一个方面中，提供了包括本文限定的sdAb或包括这种sdAb的多肽；与可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起的组合物。

在一个方面中，提供了本文限定的sdAb或包括一种或多种本文限定的V_HH:F_c融合物的抗体用于治疗癌症或自身免疫性疾病的用途。

在一个方面中，提供了本文限定的sdAb或包括一种或多种本文限定的V_HH:F_c融合物的抗体用于制备治疗癌症或自身免疫性疾病的药物的用途。

在一个方面中，提供了本文限定的sdAb或包括一种或多种本文限定的V_HH:F_c融合物的抗体用于治疗癌症或自身免疫性疾病。

在一个方面中，提供了治疗受试者的癌症或自身免疫性疾病的方法，其包括向受试者施用本文限定的sdAb或包括一种或多种本文限定的V_HH:F_c融合物的抗体。

在一个方面中，提供了包括本文限定的sdAb的多价抗体。

在一个方面中，提供了多价抗体，其包括：第一抗原结合部分、包括来自人CD8的多肽铰链的氨基酸连接体和第二抗原结合部分。

在方面中，提供了编码本文限定的多价抗体的重组核酸分子。

在一个方面中，提供了包括本文限定的多价抗体；与可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起的组合物。

在一个方面中，提供了本文限定的多价抗体用于治疗癌症或自身免疫性疾病的用途。在一个实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤。

在一个方面中，提供了本文限定的多价抗体用于制备治疗癌症或自身免疫性疾病的药物的用途。

在一个方面中，提供了本文限定的多价抗体用于治疗癌症或自身免疫性疾病。在一个实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤。

在一个方面中，提供了治疗受试者的癌症或自身免疫性疾病的方法，其包括向受试者施用本文限定的多价抗体。

在一个方面中，提供了结合至人CD22的嵌合抗体受体(CAR)，包括本文限定的VHHsdAb。

在一个方面中，提供了编码本文限定的CAR的重组核酸分子。

在一个方面中，提供了包括本文限定的重组核酸分子的载体。

在一个方面中，提供了包括本文限定的重组体核酸的重组病毒颗粒。

在一个方面中，提供了包括本文限定的重组核酸分子的细胞。

在一个方面中，提供了本文描述的核酸、载体或病毒颗粒制备用于CAR-T的细胞的用途。

在一个方面中，提供了制备用于CAR-T的细胞的方法，其包括将T-细胞与本文描述的病毒颗粒接触。

在一个方面中，提供了制备用于CAR-T的细胞的方法，其包括将本文描述的核酸或载体引入T-细胞。

在一个方面中，提供了本文描述的CAR或工程化细胞用于治疗癌症或自身免疫性疾病的用途。

在一个方面中，提供了本文描述的CAR或工程化细胞用于制备治疗癌症或自身免疫性疾病的药物的用途。

在一个方面中，提供了本文描述的CAR或工程化细胞用于治疗癌症或自身免疫性疾病。

在一个方面中，提供了治疗受试者的癌症或自身免疫性疾病的方法，其包括向受试者施用本文限定的工程化细胞。

在结合附图阅读特定实施方式的以下描述后，本公开的其他方面和特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见。

附图说明

现在将参考附图仅通过示例的方式描述本公开的实施方式。

图1描绘了由位于染色体19q13.12上的CD22基因编码的人CD22分子的结构。

图2描绘了在非还原和还原条件下来自两个不同表达批次(batch)的IMAC-纯化的CD22细胞外结构域(CD22-ECD)的SDS-PAGE。

图3描绘了来自针对CD22-ECD的最终放血(final bleed)连同作为阴性对照的免疫前血清的美洲驼(llama)重链免疫应答。

图4A描绘了27个VHH的氨基酸序列比对的第一部分。在CDR之间具有可辨别的序列相似性的CDR序列VHH被加框。

图4B描述了27个VHH的序列比对的第二部分，是图4A的继续。

图5描绘了在TG1大肠杆菌中表达并且通过IMAC纯化的14种抗CD22 VHH抗体的SDS-PAGE。

图6描绘了生物素缀合的抗CD22 VHH与CD22表达的肿瘤细胞Raji(左图)、Ramos(中图)或通过CRISPR基因敲除被工程化为没有CD22表达的Ramos细胞(右图)的结合。

图7根据表5和6中的表位作图/binning结果描绘了实施例1中的sdAb与CD22胞外结构域的子结构域的感知结合(perceptive binding)相对于其细胞表面位置的示意表示。

图8描绘了CAR-Jurkat测定的结果，其中Jurkat细胞用不同的CD22-单结构域抗体CAR质粒瞬时地电穿孔并且单独培养或与CD22-阳性(Ramos)或CD22-阴性(Ramos-CD22ko)细胞系共培养。

图9描绘了CAR-T进补激活测定(tonic activation assay)的结果，其中原代供体血液来源的T-细胞用不同的CAR构建体转导并且检查靶非依赖性扩增。

图10描绘了使用以不同的CD22-单结构域抗体或对照(FMC63)CAR构建体转导的供体血液来源的T-细胞进行的CAR-T靶特异性激活测定的结果。

图11描绘了使用以本文描述的不同的CD22-单结构域抗体或对照(FMC63)CAR构建体转导的供体血液来源的T-细胞进行的CAR-T抗原特异性靶细胞生长抑制测定的结果。模拟是指没有暴露于类似处理条件的CAR表达的未修饰的供体来源的T-细胞。CAR-T细胞与CD22+靶细胞(左图-Raji、中图-Ramos靶)或与CD22阴性靶细胞(右图-Ramos-CD22ko靶)共培养，并且经活体荧光显微镜(live fluorescent microscopy)检查。

图12描绘了使用以如本文描述生成的不同CD22-单结构域抗体CAR构建体转导的供体血液来源的T-细胞进行的CAR-T靶特异性连续杀伤测定的结果。模拟是指没有暴露于类似处理条件的CAR表达的未修饰的供体来源的T-细胞。

图13描绘了从本文描述的2个独立供体生成的单结构域抗体靶向的CAR-T细胞与基准靶向CD22的scFv CAR的一致性分析和比较的结果。

图14描绘了使用放射性铬(⁵¹Cr)释放测定的直接肿瘤裂解测量的结果。

图15描绘了在不同效应子与靶比例下使用铬释放测定的直接CAR-T细胞诱导的肿瘤裂解的结果。

图16描绘了在以携带CD22的肿瘤细胞再刺激后使用CAR-T细胞的铬释放测定的直接肿瘤裂解测量的结果。

图17描绘了体内模型的实验方案的示意图。

图18描绘了用Ramos-Luc接种随后各种CAR-T细胞治疗的NSG小鼠的存活分析结果。

图19描绘了用Ramos-FLUC接种并且用各种CAR-T细胞治疗的小鼠中的肿瘤负荷结果。

图20描绘了Ramos-FLUC接种并且用各种CAR-T细胞治疗的小鼠外周血中肿瘤负荷、总CAR-T细胞群和循环CAR-T细胞群差异表型的结果。

图21描绘了CD22特异性单结构域抗体双特异性T-细胞衔接器蛋白的分子结构；具有在DNA构建体的5'端处的CD22-sdAb序列，随后是可以具有不同组成的连接体序列，随后是CD3特异性单链可变片段。

图22描绘了Jurkat细胞双特异性T-细胞衔接器激活活性测定的结果，其中将含有各种双特异性T-细胞衔接器分子的HEK293T上清液放置于含有Jurkat细胞和CD22阳性(Ramos)或CD22阴性(U87vIII)靶细胞的共培养物的上方。

图23描绘了使用原代人T-细胞与CD22阳性靶细胞(Ramos)共培养的双特异性T-细胞衔接器活性测定的结果。

图24描绘了用于CAR-T构建体体内研究的治疗和测试的时序图(diagramtiming)。

图25描绘了用于图24中描绘的治疗和测试的小鼠的存活率。

图26描绘了在用于图24的治疗和测试的小鼠内的外周血中计数的CAR-T细胞。

图27描绘了小鼠在第一次肿瘤攻击(tumor challenge)和CAR-T治疗后的存活率。

图28描述了小鼠在再次攻击(re-challenge)后的存活率。

图29描绘了攻击后肿瘤生长的图。

图30描绘了含有CD22特异性CAR分子的多结合结构域的分子结构。

图31描绘了CAR-Jurkat测定的结果，其中Jurkat细胞用不同的CAR质粒(包括单结合和多结合)瞬时地电穿孔。

图32描绘了使用已经用编码含有CAR构建体的多sdAb的慢病毒载体转导的原代人血液来源的T-细胞的类似CAR激活研究的结果。

图33描绘了CD22特异性CAR(左)、BCMA特异性CAR(右)或串联-CD22-BCMA-CAR分子(中间)的分子结构。

图34描绘了CAR-Jurkat测定的结果，其中Jurkat细胞用不同的CD22、BCMA或CD22/BCMA特异性CAR质粒瞬时地电穿孔并且单独培养或与BCMA+/CD22+(Ramos)、BCMAlow/CD22+(NALM6)或BCMA+/CD22-(Ramos-CD22ko)靶细胞系共培养，并且检查激活状态(CD69表达)。

详细描述

通常，本公开提供了通过用主要的人CD22同种型的细胞外结构域免疫美洲驼制备的抗CD22单结构域抗体(sdAb)。通过构建重链组库的文库，将对免疫原特异的VHH抗体结构域通过噬菌体淘选(phage panning)分离。最初产生的27个示例抗体包括分别对应于SEQNO:1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、16-18、19-21、22-24、25-27、28-30、31-33、34-36、37-39、40-42、43-45、46-48、49-51、52-54、55-57、58-60、61-63、64-66、67-69、70-72、73-75、75-78和79-81的CDR1、CDR2和CDR3序列，尽管描述和涵盖了具有相关序列的抗体。还提供了包括任何一种sdAb的多价抗体，其包括双特异性T-细胞衔接器、双特异性杀伤细胞衔接器(BiKE)和三特异性杀伤细胞衔接器(TriKE)。还描述了用于包括任何一种上述sdAb的CAR-T疗法的嵌合抗原受体(CAR)。

单结构域抗体&包括它们的多肽

单结构域抗体(sdAb)，也称为纳米抗体，是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。sdAb源自使用分子生物学技术在骆驼科物种(如骆驼(camel)、美洲驼、单峰骆驼(dromedary)、羊驼(alpaca)和原驼(guanaco))中发现的重链抗体，也称为V_HH片段(本文也称为“V_HH”或“VHH”)。其他示例包括源自软骨鱼，比如鲨鱼中发现的重链抗体的V_NAR片段。sdAb也已通过工程技术从常规免疫球蛋白G(IgG)的重链/轻链中生成。

V_HH分子比IgG分子小约10倍。这些单个多肽通常非常稳定，经常抵抗对常规抗体和抗体片段可能成问题的极端pH和温度条件。而且，V_HH趋向更能抵抗蛋白酶的作用。此外，V_HH的体外表达趋向产生高产量的适当折叠/功能性VHH。此外，在骆驼科物种中生成的重链抗体及其工程化片段(即VHH)可识别隐藏或隐蔽的表位，否则其无法得到通过使用抗体文库或通过免疫其他哺乳动物在体外生成的较大的常规抗体和抗体片段。

a)CDR1氨基酸序列GX₁X₂X₃DX₄YX₅(SEQ ID NO:126)，其中：

X₁是F或V，

X₂是T或S，

X₃是L、F或S，

X₄是Y、D或S，和

X₅是V或A，

CDR2氨基酸序列X₆X₇X₈X₉X₁₀GX₁₁T(SEQ ID NO:127)，其中：

X₆是I或M，

X₇是T、R、G或S，

X₈是S或N，

X₉是D或S，

X₁₀是D或不存在，

X₁₁是V或A，和

X₁₂是I、N、Y或S，

X₁₃是Q、Y、R或L，和

X₁₄是D或G；

b)CDR1氨基酸序列GSX₁F X₂X₃X₄ X₅V(SEQ ID NO:129)，其中：

X₁是I或T，

X₂是R或不存在，

X₃是R、S或I，

X₄是I、S或T，和

X₅是A、S或T，

CDR2氨基酸序列ITSX₆GX₇X₈(SEQ ID NO:130)，其中：

X₆是G、S或A，

X₇是E、D或S，

X₈是T或S，和

X₉是K或Q，

X₁₀是W或Y，

X₁₁是Q、R或G，

X₁₂是Y、D或R，

X₁₃是E或S，和

X₁₄是Y、D或H；

c)CDR1氨基酸序列GRIX₁RSYV(SEQ ID NO:132)，其中：

X₁是F或S，

CDR2氨基酸序列IGX₂SDT(SEQ ID NO:133)，其中：

X₂是W或C，和

CDR3氨基酸序列AX₃X₄SPPYGPQRDEFX₅Y(SEQ ID NO:134)，其中：

X₃是A或E，

X₄是N或Y，和

X₅是G或D；

d)CDR1氨基酸序列G X₁TX₂SVYX₃(SEQ ID NO:135)，其中：

X₁是R或G，

X₂是S或F，和

X₃是G或T，

CDR2氨基酸序列X₄X₅X₆SX₇GX₈T(SEQ ID NO:136)，其中：

X₄是M或I，

X₅是S或R，

X₆是W或G，

X₇是G或不存在，和

X₈是P或G，

CDR3氨基酸序列AVRIRRTLX₉EPLTKETLYDY(SEQ ID NO:137)，其中：

X₉是L或V；

e)SEQ ID NO:49阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:50阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:51阐释的CDR3氨基酸序列；

f)SEQ ID NO:4阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:5阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:6阐释的CDR3氨基酸序列；

g)SEQ ID NO:7阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:8阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:9阐释的CDR3氨基酸序列；

h)SEQ ID NO:13阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:14阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:15阐释的CDR3氨基酸序列；

i)SEQ ID NO:16阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:17阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:18阐释的CDR3氨基酸序列；

j)SEQ ID NO:40阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:41阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:42阐释的CDR3氨基酸序列；

k)SEQ ID NO:55阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:56陈述的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:57阐释的CDR3氨基酸序列；

l)SEQ ID NO:64阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:65阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:66阐释的CDR3氨基酸序列；或

m)SEQ ID NO:70阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:71阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:72阐释的CDR3氨基酸序列。

在以上中：

组f)是由来自称为hCD22pas-16的抗体的CDR限定的，

组f)是由来自称为hCD221ug-10的抗体的CDR限定的，

组g)是由来自称为hCD221ug-13的抗体的CDR限定的，

组h)是由来自称为hCD221ug-36的抗体的CDR限定的，

组i)是由来自称为hCD221ug-61的抗体的CDR限定的，

组j)是由来自称为hCD22100ug-62的抗体的CDR限定的，

组k)是由来自称为hCD22pas-24的抗体的CDR限定的，

组l)是由来自称为hCD22pas-48的抗体的CDR限定的，和

组m)是由来自称为hCD22pas-64的抗体的CDR限定的。

“CDR”或“互补决定区”是免疫球蛋白中可变链的一部分，其共同构成互补位，并且从而赋予抗体结合特异性和亲和力。如这里使用的，术语是指根据IMGT^TM(国际ImMunoGeneTics信息***)制定的标准或惯例在sdAb中映射的CDR。

本文描述的抗体已经对主要的人CD22-β同种型的重组细胞外结构域(ECD)产生。这种同种型的示例mRNA序列可在GenBank条目NM_001771.4中找到，其中编码蛋白质的氨基酸1-19对应于前导序列，并且氨基酸20-687对应于ECD(也参见UniProt条目P20273)。

A)

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:1阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-6)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:4阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:5阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:6阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-10)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:7阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:9阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-13)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:10阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:12阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-14)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:13阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:15阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-36)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:16阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:17阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:18阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-61)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:19阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:20阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:21阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-74)

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:22阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:23阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:24阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-75)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:25阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:26阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:27阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-77)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:28阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:29阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:30阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-80)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:31阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:32阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:33阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-87)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:34阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:35阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:36阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-93)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:37阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:38阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:39阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22100ug-2)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:40阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:41阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:42阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22100ug-62)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:43阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:44阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:45阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22100ug-66)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:46阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:47阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:48阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-10)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:49阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:50阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:51阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-16)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:52阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:53阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:54阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-23)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:55阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:56陈述的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:57阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-24)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:58阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:59阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:60阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-32)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:61阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:62阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:63阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-33)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:64阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:65阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:66阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-48)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:67阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:68阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:69阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-55)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:70阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:71阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:72阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-64)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:73阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:74阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:75阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-72)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:76阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:77阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:78阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-79)。

在一个实施方式中，抗体包括SEQ ID NO:79阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:80阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:81阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-82)。

A)

B)

在一个实施方式中，在B)中，CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列与部分A)i)至xxviii)的任何一个中限定的CDR1、CDR2和CDR3序列至少90％同一性。在一个实施方式中，在B)中，CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列与部分A)i)至xxviii)的任何一个中限定的CDR1、CDR2和CDR3序列至少95％同一性。在一个实施方式中，在B)中，CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列具有与部分A)i)至xxviii)的任何一个中限定的CDR1、CDR2和CDR3序列比较至多三个取代。在一个实施方式中，在B)中，CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列具有与部分A)i)至xxviii)的任何一个中限定的CDR1、CDR2和CDR3序列比较至多两个取代。在一个实施方式中，在B)中，CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列具有与部分A)i)至xxviii)的任何一个中限定的CDR1、CDR2和CDR3序列比较至多一个取代。在一些实施方式中，相对于A)阐释的序列的序列差异是保守序列取代。

本领域已知的的术语“保守氨基酸取代”被本文限定如下，括号中显示保守的可取代候选氨基酸：Ala(Gly，Ser)；Arg(Gly，Gln)；Asn(Gln；His)；Asp(Glu)；Cys(Ser)；Gln(Asn，Lys)；Glu(Asp)；Gly(Ala，Pro)；His(Asn；Gln)；Ile(Leu；Val)；Leu(Ile；Val)；Lys(Arg；Gln)；Met(Leu，Ile)；Phe(Met，Leu，Tyr)；Ser(Thr；Gly)；Thr(Ser；Val)；Trp(Tyr)；Tyr(Trp；Phe)；Val(Ile；Leu)。

根据某些实施方式的序列变体旨在涵盖其中结合亲和力和/或特异性相对于其源自的亲本分子基本上未改变的分子。这样的参数可以容易地测试，例如，使用本文描述的技术和本领域已知的技术。这种实施方式可涵盖序列取代、***或删除。

A)

SEQ ID NO:3阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:6阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:9阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:12阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:15阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:18阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:21阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:24阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:27阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:30阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:33阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:36阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:39阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:42阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:45阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:48阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:51阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:54阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:57阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:60阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:63阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:66阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:69阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:72阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:75阐释的CDR3氨基酸序列，

SEQ ID NO:79阐释的CDR3氨基酸序列，或

SEQ ID NO:81阐释的CDR3氨基酸序列。

认识到CDR3通常是结合V_HH sdAb的主要决定因素，应当理解，其他CDR可被诱变或以其他方式多样化，并且所得文库(或候选分子)筛选结合至CD22和/或与亲本分子交叉-竞争结合至CD22的抗体。这些实施方式尤其旨在涵盖以这种方式鉴定的分子。

在一个实施方式中，分离的sdAb包括：

这些实施方式尤其旨在涵盖这样的实施方式：其中分子在CDR2的诱变/多样化后回收，并且筛选结合至CD22和/或与来自它们限定的亲本分子交叉-竞争结合至CD22的变体分子。如以上，可以筛选文库或可测试单个候选分子。

在一个实施方式中，sdAb包括A)SEQ ID NO:85至112和120至125的任何一个的氨基酸序列，或B)在其全长之间与SEQ ID NO:82至108和120至125的任何一个至少80％同一性的氨基酸序列。在一个实施方式中，B)的氨基酸序列在其全长之间与A)的氨基酸序列之一至少85％同一性。在一个实施方式中，B)的氨基酸序列在其全长之间与A)的氨基酸序列之一至少90％同一性。在一个实施方式中，B)的氨基酸序列在其全长之间与A)的氨基酸序列之一至少95％同一性。在一个实施方式中，B)的氨基酸序列在其全长之间与A)的氨基酸序列之一至少98％同一性。在一个实施方式中，B)的氨基酸序列在其全长之间与A)的氨基酸序列之一至少98％同一性。在这些实施方式的一些中，相对于A)的序列的序列差异在CDR序列之外。

在一个实施方式中，sdAb包括A)SEQ ID NO:82至108和120至125的任何一个的氨基酸序列。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:82阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:83阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:84阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:85阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:86阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:87阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:88阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:89阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:90阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:91阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:92阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:93阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:94阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:95阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:96阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:97阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:98阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:99阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:100阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:101阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:102阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:103阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:104阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:105阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:106阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:107阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:108阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:120阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:121阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:122阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:123阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:124阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:125阐释的sdAb序列的CDR1、CDR2和CDR2。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:82。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:83。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:84。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:85。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:86。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:87。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:88。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:89。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:90。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:91。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:92。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:93。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:94。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:95。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:96。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:97。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:98。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:99。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:100。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:101。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:102。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:103。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:104。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:105。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:106。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:107。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:108。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:120。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:121。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:122。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:123。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:124。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:125。

在一个实施方式中，sdAb是骆驼科V_HHsdAb。

在一个实施方式中，sdAb是美洲驼V_HHsdAb

在一个实施方式中，sdAb是人源化骆驼科V_HH。

如本文使用的，术语“人源化”意思是突变，从而在人患者中施用后免疫原性较小或不存在。根据本发明，将多肽人源化包括通过在人共有序列中发现的它们的人对应物替换一个或多个骆驼科氨基酸而不使多肽失去其典型特征的步骤，，即人源化不显著影响所得多肽的抗原结合能力。可以使用本领域已知的各种技术来产生人源化抗体，包括但不限于CDR-移植、镶饰(veneering)或表面重修(resurfacing)、链转换(chain shuffling)等。

在一个实施方式中，sdAb对人CD22具有2.5x 10^-7nm或更小的亲和力。在一个实施方式中，sdAb对人CD22的具有3x 10^-8nm或更小的亲和力。在一个实施方式中，sdAb对人CD22的具有9.6x 10^-9nm或更小的亲和力。在一个实施方式中，sdAb对人CD22的具有9.3x 10^-10nm或更小的亲和力。在一个实施方式中，sdAb对人CD22的具有7x 10^-12nm或更小的亲和力。结合亲和力可以例如，根据本文描述的测定确定。

应当认识到，CD22包括七个Ig样结构域，在本文中从膜远端到膜近端编号为1至7(参见图7用于参考)。在一些实施方式中，sdAb展现出与这些Ig样结构域的一个或多个的选择性或优先结合。成熟的人CD22 ECD从UniProt条目P20273的氨基酸20延伸到687。在该子序列内，七个Ig样结构域通常对应于氨基酸1-119(1)、124-216(2)、223-302(3)、312-397(4)、400-481(5)、486-563(6)和574-657(7)的区域。在其他地方，通常本文命名为1至7的结构域分别是指IgL-V和IgL-1至IgL-6。为了简单，结构域在本文按从1(“第一”)至7(“第七”)的顺序编号。对于表位作图，七个片段含有相应的Ig样结构域作为bin 1至7，并且对应于氨基酸1-135(bin1)、111-230(bin2)、(211-317)(bin3)、303-405(bin4)、391-490(bin5)、476-575(bin6)和561-668(bin7)的区域。

在一个实施方式中，sdAb结合至人CD22的第一Ig样结构域。在一个这种特定的实施方式中，结合至第一Ig样结构域的sdAb包括SEQ ID NO:91(hCD221ug-80)。在一个实施方式中，sdAb结合至人CD22的第四Ig样结构域。在一个这种特定的实施方式中，结合至第四Ig样结构域的sdAb包括SEQ ID NO:84(hCD221ug-13)。在一个实施方式中，sdAb结合至人CD22的第六Ig样结构域。在一个这种特定的实施方式中，结合至第六Ig样结构域的sdAb包括SEQID NO:84(hCD221ug-13)、SEQ ID NO:91(hCD221ug-80)、SEQ ID NO:86(hCD221ug-36)或SEQ ID NO:105(hCD221pas-64)。在一个实施方式中，sdAb结合至人CD22的第七Ig样结构域。在一个这种特定的实施方式中，结合至第七Ig样结构域的sdAb包括SEQ ID NO:87(hCD221ug-61)、SEQ ID NO:83(hCD221ug-10)或SEQ ID NO:100(hCD22pas-24)。

在一个方面中，提供了与以上描述的分离的sdAb竞争特异性结合至CD22的VHH单结构域抗体(sdAb)。本发明的sdAb可通过包括结合测定的方法来鉴定，结合测定评估测试抗体是否能够与本发明的已知抗体交叉-竞争靶分子上的结合位点。例如，以上本文描述的抗体可用作参考抗体。进行竞争性结合测定的方法是本领域众所周知的。例如，它们可涉及在抗体可结合靶分子的条件下将本发明的已知抗体与靶分子接触在一起。然后，可使抗体/靶复合物与测试抗体接触，并且可评估测试抗体能够从抗体/靶复合物中置换本发明的抗体的程度。可替代的方法可涉及在允许抗体结合的条件下将测试抗体与靶分子接触，然后添加能够结合那个靶分子的本发明抗体并且评估本发明抗体能够从抗体/靶复合物中置换测试抗体的程度。这种抗体可通过生成对CD22新的sdAb并且筛选所得文库用于交叉-竞争来鉴定。可替代地，本文描述的一种抗体可用作多样化、文库生成和筛选的起点。进一步可替代方案可能涉及测试本文描述的抗体的个体变体。

在一个实施方式中，本文限定的sdAb是骆驼科sdAb。

在一个实施方式中，本文限定的sdAb是美洲驼sdAb。

在一个实施方式中，本文限定的sdAb是骆驼科sdAb的人源化形式。

表1列出了本文公开的各种sdAb的全长序列。CDR1、CDR2和CDR3序列是加下划线的。本文使用的CDR鉴定和编号根据IMGT^TM惯例。

表1：VHH序列

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表2提供了本文使用的抗体名称与VHH#以及CDR1、CDR2、CDR3和每个sdAb的全长序列的SEQ ID NO之间的对应关系。

表2：VHH序列ID编码

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重组多肽

在一个方面中，提供了包括本文限定的sdAb的重组多肽。在一个实施方式中，提供了包括一个或多个本文限定的sdAb的重组多肽。在一个实施方式中，提供包括两个或更多个本文限定的sdAb的重组多肽。在一个实施方式中，提供了包括两个或更多个本文限定的sdAb的重组多肽。

V_HH:F_c融合体

在一个实施方式中，提供了与人Fc融合的本文限定的sdAb(称为“V_HH:F_c融合体”)。例如，V_HH:F_c融合体可至少包括IgG、IgA或IgD同种型的CH2和CH3。V_HH:F_c融合体可至少包括IgM或IgE同种型的CH2、CH3和CH4。这种实施方式可用于激活更高阶重组分子中的免疫***。例如，根据一些实施方式，两个这种含有F_c的V_HH:F_c融合体可组装以形成重组单体抗体。在一些实施方式中，这种单体抗体能够激活免疫***。这种单体抗体可以为IgG、IgA、IgD、IgE或IgM同种型。在一个实施方式中，含有IgA F_c的V_HH:F_c融合体也可组装成重组二聚体(分泌型)形式。在一些实施方式中也设想了多聚体形式例如，五个IgM单体可组装以形成重组五聚体抗体。

在一些实施方式中，本文描述的多价抗体可为相同VHH:Fc融合体的组装。

在一些实施方式中，本文描述的多价抗体可为具有相同结合靶的不同VHH:Fc融合体的组装。例如，这些可结合至相同靶分子上的不同表位。示例可包括不同VHH:Fc融合体的组装，每个都包括不同的本文限定的抗CD22 sdAb。

在一些实施方式中，本文描述的多价抗体可为本文限定的VHH:Fc融合体(包括本文限定的抗CD22 sdAb)和包括涉及不同靶的互补位的另一VHH:Fc融合体的组装。

与货物分子的融合体

在进一步的方面中，本公开提供了与货物分子连接的本文限定的抗CD22 sdAb。货物分子可包括例如治疗性部分，比如例如细胞毒素剂、细胞抑制剂、抗癌剂或放射治疗剂。在本公开的特定的实施方式中，抗体药物缀合物可包括细胞毒素剂。本公开的另一特定的实施方式涉及包括放射治疗剂的抗体药物缀合物。

重组核酸分子

在方面中，提供了编码本文限定的sdAb、重组多肽或V_HH:F_c融合体的重组核酸分子。

组合物

在一个方面中，提供了组合物，其包括本文限定的sdAb或包括这种sdAb的多肽；与可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起。在一个实施方式中，组合物是药物组合物，并且赋形剂、稀释剂或载体是药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

用途和方法

在一个方面中，提供了本文限定的sdAb或包括一种或多种本文限定的V_HH:F_c融合体的抗体用于治疗癌症或自身免疫性疾病的用途。在一个实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤。在一个实施方式中，血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓增生异常综合征。在一个实施方式中，白血病是急性淋巴白血病(ALL)或慢性淋巴白血病(CLL)。在一个实施方式中，淋巴瘤选自由以下组成的组中：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是炎症性疾病。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是多发性硬化症。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是自身免疫性糖尿病。

在一个方面中，提供了本文限定的sdAb或包括一种或多种本文限定的V_HH:F_c融合体的抗体在制备用于治疗癌症或自身免疫性疾病的药物中的用途。在一个实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤。在一个实施方式中，血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓增生异常综合征。在一个实施方式中，白血病是急性淋巴白血病(ALL)或慢性淋巴白血病(CLL)。在一个实施方式中，淋巴瘤选自由以下组成的组中：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是炎症性疾病。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是多发性硬化症。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是自身免疫性糖尿病。

在一个方面中，提供了本文限定的sdAb或包括一种或多种本文限定的V_HH:F_c融合体的抗体用于治疗癌症或自身免疫性疾病。在一个实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤。在一个实施方式中，血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓增生异常综合征。在一个实施方式中，白血病是急性淋巴白血病(ALL)或慢性淋巴白血病(CLL)。在一个实施方式中，淋巴瘤选自由以下组成的组中：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是炎症性疾病。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是多发性硬化症。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是自身免疫性糖尿病。

在一个方面中，提供了治疗受试者的癌症或自身免疫性疾病的方法，其包括向受试者施用本文限定的sdAb或包括一种或多种本文限定的V_HH:F_c融合体的抗体。在一个实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤。在一个实施方式中，血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓增生异常综合征。在一个实施方式中，白血病是急性淋巴白血病(ALL)或慢性淋巴白血病(CLL)。在一个实施方式中，淋巴瘤选自由以下组成的组中多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是炎症性疾病。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是多发性硬化症。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是自身免疫性糖尿病。

多价抗体和相关的实施方式

在一个方面中，提供了包括以上限定的sdAb的多价抗体。

本文使用的“多价抗体”意思是包括多于一个可变区或互补位用于结合相同或不同靶分子内的一种或多种抗原的分子。

在一些实施方式中，互补位可结合至相同靶分子上的不同表位。在一些实施方式中，互补位可结合至不同靶分子。在这些实施方式中，多价抗体可称为双特异性、三特异性或多特异性，其取决于存在的不同特异性的互补位的数量。由于多价抗体包括本文限定的抗CD22 sdAb之一，多价抗体包括CD22结合亲和力。

例如，如以上解释的，在一些实施方式中，多价抗体可以是本文限定的V_HH:F_c融合体(包括本文限定的sdAb)和包括赋予不同特异性的不同互补位的另一V_HH:F_c融合体的组装。

在一个实施方式中，提供了包括以上限定的sdAb和第二抗原结合部分的双特异性抗体。在一些实施方式中，第二抗原结合部分可包括单克隆抗体、Fab以及F(ab′)₂、Fab′、scFv或sdAb，比如V_HH或V_NAR。

“抗原结合部分”意思是包括具有抗原结合活性的抗体或其抗原结合片段，包括其工程化抗体片段的多肽。

在一些实施方式中，第二抗原结合部分可结合至人血清白蛋白，例如，为了稳定/半衰期延长的目的。

在一个实施方式中，提供了包括以上限定的sdAb、第二结合部分和第三抗原结合部分的三特异性抗体。在一些实施方式中，第二抗原结合部分包括单克隆抗体、Fab和F(ab′)₂，以及Fab′、sdFv或sdAb，比如V_HH或V_NAR。在一些实施方式中，第三抗原结合部分独立地包括单克隆抗体、Fab和F(ab′)₂，以及Fab′、sdFv或sdAb，比如V_HH或V_NAR。

第二和/或第三抗原结合部分可结合至人血清白蛋白，例如，为了稳定/半衰期延长的目的。

在一些实施方式中，三特异性抗体可以是多特异性的并且抗体可包括一种或多种另外的抗原结合部分。在这种实施方式中，另外的抗原结合部分可以独立地是Fab和F(ab′)₂，以及Fab′、sdFv或sdAb，比如V_HH或V_NAR。

在一个实施方式中，多特异性抗体包括包含本文限定的sdAb的第一抗原结合部分，和第二抗原结合部分。在一个实施方式中，第二抗原结合部分特异性结合至免疫细胞的细胞表面标志物。

“细胞表面标志物”是在细胞表面表达的分子，其是特定于(或富集于)细胞类型的，并且能够被抗原结合部分结合或识别。

双特异性T-细胞衔接器

在一个实施方式中，多价抗体是双特异性T-细胞衔接器，其包括本文限定的sdAb和特异性结合至T-细胞的细胞表面标志物的第二抗原结合部分。在一个实施方式中，T-细胞标志物包括人CD3。

我们将认识到，人CD3是多亚单位抗原，其中各种亚单位可参与CD3激活。一个这种亚单位是CD3ε(参见，例如，GenBank NP_000724.1)。其他非限制性示例包括CD3γ(参见，例如，GenBank NP_000064.1)和δ(参见，例如，δ同种型A的GenBank NP_000723.1，以及例如，δ同种型B的GenBank NP_001035741.1)。

在一些实施方式中，T-细胞标志物包括CD3ε、CD3γ或CD3δ。在一个特定的实施方式中，T-细胞标志物包括CD3ε。

如本文使用的，术语“双特异性T-细胞衔接器”是指这样的重组双特异性蛋白，其具有来自两种不同抗体的两个连接的可变区，一个靶向T-细胞上的细胞表面分子(例如，CD3ε)，并且另一个靶向疾病细胞，通常是恶性细胞的表面上的抗原。例如，双特异性T-细胞衔接器可包括本文限定的sdAb和scFvs。双特异性T-细胞衔接器可包括本文限定的sdAb和第二VHH/sdAb。两个可变区通常通过短的柔性连接体比如GlySer连接体连接在一起。通过同时结合肿瘤抗原和T-细胞，双特异性T-细胞衔接器介导T-细胞应答和杀伤肿瘤细胞。通过双特异性T-细胞衔接器促进的T-细胞/靶细胞粘附与MHC单倍体无关。

在一个实施方式中，双特异性T-细胞衔接器在N-末端至C-末端方向包括：

-第一抗原结合部分，

-氨基酸连接体，和

-第二抗原结合部分。

在一个实施方式中，信号肽进一步包括至第一抗原结合部分的信号肽N-末端。

本文所指的“信号肽”允许新生蛋白被引导至内质网并且随后引导至细胞表面，在此其被表达。信号肽的核心可含有长段的疏水性氨基酸，其具有形成单个α螺旋的倾向。信号肽可以以短段的带正电荷的氨基酸开始，这有助于在易位期间加强多肽的适当的拓扑结构。在信号肽的端处通常有一段被信号肽酶识别和切割的氨基酸。信号肽酶可在易位期间或易位完成后切割以生成游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定的蛋白酶消化。信号肽可以在分子的氨基末端。

在一个实施方式中，信号肽是来自人CD28的信号肽。在一个实施方式中，来自人CD28的信号肽包括SEQ ID NO:110。在一个实施方式中，信号肽与SEQ ID NO:110至少80％同一性。在一个实施方式中，信号肽与SEQ ID NO:110至少90％同一性。在一个实施方式中，信号肽与SEQ ID NO:110至少95％同一性。在一个实施方式中，信号肽与SEQ ID NO:110至少98％同一性。

在上下文中，“氨基酸连接体”将被理解为合适长度、柔性和组成以允许双特异性T-细胞衔接器与两个靶适当功能衔接的序列。

氨基酸连接体可包括铰链。铰链可来自人CD8，例如SEQ ID NO:12阐释的。

在一个实施方式中，氨基酸连接体包括(以N-至C-末端方向)SEQ ID NO:111–SEQID NO:112–SEQ ID NO:118；或与SEQ ID NO:111–SEQ ID NO:112–SEQ ID NO:118至少80％同一性的序列。在一个实施方式中，氨基酸连接体包括与SEQ ID NO:111至少80％同一性的序列。在一个实施方式中，氨基酸连接体包括与SEQ ID NO:111至少90％同一性的序列。在一个实施方式中，氨基酸连接体包括与SEQ ID NO:111至少95％同一性的序列。在一个实施方式中，氨基酸连接体包括与SEQ ID NO:111至少98％同一性的序列。在一个实施方式中，氨基酸连接体包括与SEQ ID NO:112至少80％同一性的序列。在一个实施方式中，氨基酸连接体包括与SEQ ID NO:112至少90％同一性的序列。在一个实施方式中，氨基酸连接体包括与SEQ ID NO:112至少95％同一性的序列。在一个实施方式中，氨基酸连接体包括与SEQ IDNO:112至少98％同一性的序列。在一个实施方式中，氨基酸连接体包括与SEQ ID NO:118至少80％同一性的序列。在一个实施方式中，氨基酸连接体包括与SEQ ID NO:118至少90％同一性的序列。在一个实施方式中，氨基酸连接体包括与SEQ ID NO:118至少95％同一性的序列。在一个实施方式中，氨基酸连接体包括与SEQ ID NO:118至少98％同一性的序列。

在一个实施方式中，多价抗体由SEQ ID NO:119编码。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:1阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-6)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:4阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:5阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:6阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-10)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:7阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:9阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-13)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:10阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:12阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-14)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:13阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:15阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-36)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:16阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:17阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:18阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-61)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:19阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:20阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:21阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-74)

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:22阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:23阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:24阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-75)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:25阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:26阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:27阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-77)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:28阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:29阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:30阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-80)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:31阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:32阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:33阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-87)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:34阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:35阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:36阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-93)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:37阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:38阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:39阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22100ug-2)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:40阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:41阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:42阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22100ug-62)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:43阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:44阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:45阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22100ug-66)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:46阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:47阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:48阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-10)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:49阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:50阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:51阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-16)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:52阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:53阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:54阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-23)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:55阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:56陈述的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:57阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-24)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:58阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:59阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:60阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-32)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:61阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:62阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:63阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-33)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:64阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:65阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:66阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-48)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:67阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:68阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:69阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-55)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:70阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:71阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:72阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-64)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:73阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:74阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:75阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-72)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:76阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:77阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:78阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-79)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:79阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:80阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:81阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-82)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:82。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:83。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:84。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:85。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:86。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:87。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:88。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:89。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:90。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:91。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:92。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:93。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:94。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:95。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:96。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:97。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:98。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:99。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:100。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:101。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:102。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:103。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:104。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:105。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:106。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:107。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:108。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:120。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:121。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:122。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:123。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:124。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:125。

在一些实施方式中，BiKE是与以上描述的BiKE之一具有80％、90％、95％、98％或99％同一性的以上BiKE的序列变体。在一些实施方式中，变体保留与其衍生自的亲本分子基本上相同的结合特异性。在一些实施方式中，变体保留与其衍生自的亲本分子基本上相同的结合亲和力。

BiKE和TriKE

在一个实施方式中，多价抗体是双特异性杀伤细胞衔接器。

术语“BiKE”是指这样的重组双特异性蛋白，其具有来自两种不同抗体的两个连接的可变区，一个靶向自然杀伤(NK)细胞上的细胞表面分子(例如CD16)，另一种靶向疾病细胞，通常是恶性细胞的表面上的抗原。例如，BiKE可包括两个scFv、两个VHH或其组合。两者通常通过短的柔性连接体连接在一起。通过同时结合肿瘤抗原和NK细胞，BiKE介导NK细胞应答和杀伤肿瘤细胞。

在一个实施方式中，免疫细胞的细胞表面标志物包括自然杀伤(NK)细胞标志物。在一个实施方式中，NK细胞标志物包括人CD16。

在一个实施方式中，多价抗体是三特异性杀伤细胞衔接器(TriKE)。

术语“TriKE”表示已进一步修饰为包括另一功能的BiKE。该术语已用于涵盖各种方法。一种方法涉及***干预性免疫调节分子(修饰的人IL-15交联剂)以促进NK细胞激活、扩增和/或存活(Vallera等，IL-15Trispecific Killer Engagers(TriKEs)Make NaturalKiller Cells Specific to CD33+Targets While Also Inducing In Vivo Expansion,and Enhanced Function.Clinical Cancer Research.2012；22(14):3440-50)。其它TriKE方法是三特异性分子，其包括三个抗体可变区：一个靶向NK细胞受体，并且两个靶向肿瘤相关抗原(Gleason等，Bispecific and Trispecific Killer Cell Engagers DirectlyActivate Human NK Cells Through CD16 Signaling and Induce Cytotoxicity andCytokine Production.Mol Cancer Ther.2012；11(12):2674-84)。仍其它TriKE方法靶向两种NK细胞受体(例如CD16和NKp46)并且一种肿瘤相关抗原(Gauthier等，Multifunctional Natural Killer Cell Engagers Targeting NKp46TriggerProtective Tumor Immunity.Cell.2019；177(7):1701-13)。

在一个实施方式中，多价抗体进一步包括用于刺激NK细胞的激活、扩增和/或存活的细胞因子。在一个实施方式中，用于刺激NK细胞扩增的细胞因子是白细胞介素-15(IL15)、其变体或其功能片段。

在一个实施方式中，多价抗体进一步包括至少第三抗原结合部分，其结合至第二NK细胞标志物。在一个实施方式中，第二NK细胞标志物是人NKp46。

在一个实施方式中，多价抗体进一步包括至少第三抗原结合部分，其结合至肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，肿瘤相关抗原不同于人CD22。

在一个实施方式中，第三抗原结合部分包括V_HH、V_NAR或scVF。

在一个实施方式中，第二抗原结合部分包含V_HH。

在一个实施方式中，第三抗原结合部分结合至人血清白蛋白。在这种实施方式中，对人血清白蛋白的亲和力可有助于稳定/增加半衰期。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:55阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:56阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:57阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-24)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:70阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:71阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:72阐释的CDR3氨基酸序列，(hCD22pas-64)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:82。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:83。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:84。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:85。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:86。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:87。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:88。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:89。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:90。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:91。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:92。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:93。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:94。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:95。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:96。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:97。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:98。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:99。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:100。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:101。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:102。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:103。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:104。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:105。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:106。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:107。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:108。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:120。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:121。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:122。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:123。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:124。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:125。

在一些实施方式中，BiKE或TriKE是与其具有80％、90％、95％、98％或99％同一性的以上BiKE和TriKE之一的序列变体。在一些实施方式中，变体保留与其衍生自的亲本分子基本上相同的结合特异性。在一些实施方式中，变体保留与其衍生自的亲本分子基本上相同的结合亲和力。

在一个方面中，提供了多价抗体，其包括：第一抗原结合部分、包括来自人CD8的多肽铰链的氨基酸连接体和第二抗原结合部分。在一个实施方式中，来自人CD8的多肽铰链包括SEQ ID NO:112。在一个实施方式中，氨基酸连接体进一步包括在来自人CD8的多肽铰链的N-末端的至少一个G4S，和在来自人CD8的多肽铰链的C-末端的至少一个G4S。在一个实施方式中，氨基酸连接体的长度是至少为47个氨基酸，优选地长度是至少52个残基，优选地长度是至少57个残基，更优选地长度是至少62个残基，甚至更优选地长度是至少67个残基。在一个实施方式中，氨基酸连接体以N-末端至C-末端方向包括SEQ ID NO:111、112和118。在一个实施方式中，第一抗原结合部分特异性结合至人CD22。在一个实施方式中，第一抗原结合部分是V_HH、V_NAR或scVF。在一个实施方式中，第一抗原结合部分是一个本文描述的抗CD22sdAb。在一个实施方式中，第二抗原结合部分特异性结合至免疫细胞的细胞表面标志物。在一个实施方式中，免疫细胞的细胞表面标志物包括T-细胞标志物。在一个实施方式中，T-细胞标志物包括人CD3。在一个实施方式中，第二抗原结合部分是V_HH、V_NAR或scVF。

重组核酸分子

在方面中，提供了编码本文限定的多价抗体的重组核酸分子。在一个实施方式中，核酸是载体。

组合物

在一个方面中，提供了组合物，其包括本文限定的多价抗体；连同可接受的赋形剂、稀释剂或载体。在一个实施方式中，组合物包括本文限定的双特异性T-细胞衔接器。在一个实施方式中，组合物包括本文限定的BiKE。在一个实施方式中，组合物包括本文限定的TriKE。在一个实施方式中，组合物是药物组合物，并且赋形剂、稀释剂或载体是药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

用途和方法

在一个方面中，提供了本文所限定的多价抗体用于治疗癌症或自身免疫性疾病的用途。在一个实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤。在一个实施方式中，血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓增生异常综合征。在一个实施方式中，白血病是急性淋巴白血病(ALL)或慢性淋巴白血病(CLL)。在一个实施方式中，淋巴瘤选自由以下组成的组中：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是炎症性疾病。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是多发性硬化症。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是自身免疫性糖尿病。

在一个方面中，提供了本文限定的多价抗体在制备用于治疗癌症或自身免疫性疾病的药物中的用途。在一个实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤。在一个实施方式中，血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓增生异常综合征。在一个实施方式中，白血病是急性淋巴白血病(ALL)或慢性淋巴白血病(CLL)。在一个实施方式中，淋巴瘤选自由以下组成的组中：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是炎症性疾病。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是多发性硬化症。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是自身免疫性糖尿病。

在一个方面中，提供了本文限定的多价抗体用于治疗癌症或自身免疫性疾病。在一个实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤。在一个实施方式中，血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓增生异常综合征。在一个实施方式中，白血病是急性淋巴白血病(ALL)或慢性淋巴白血病(CLL)。在一个实施方式中，淋巴瘤选自由以下组成的组中：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是炎症性疾病。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是多发性硬化症。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是自身免疫性糖尿病。

在一个方面中，提供了治疗受试者的癌症或自身免疫性疾病的方法，其包括向受试者施用本文限定的多价抗体。在一个实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤。在一个实施方式中，血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓增生异常综合征。在一个实施方式中，白血病是急性淋巴白血病(ALL)或慢性淋巴白血病(CLL)。在一个实施方式中，淋巴瘤选自由以下组成的组中：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是炎症性疾病。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是多发性硬化症。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是自身免疫性糖尿病。

表3列出了根据某些方面和实施方式的本文描述的多价抗体和CAR的示例序列和模块。

表3：构建体序列和组分

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对于包括抗体hCD221ug36的示例CAR构建体(SEQ ID NO:138)：

–位置1-54对应于信号肽，

–位置55-396对应于抗体1ug36 ABD(但可替代地是任何其他本文描述的抗CD22sdAb)，

–位置397-606对应于(G4S)3-人CD8a铰链和限制疤痕(restriction scar)，

–位置607-702对应于人CD28跨膜结构域，和

–位置703-828对应于人41BB共刺激结构域，和

–位置829-1170对应于人CD3-ζ信号传导结构域。

为了实验和测试的目的，此后的构建体包括可选的框内P2A-GFP标志物。

对于包括抗体hCD221ug36的示例双特异性T-细胞衔接器构建体(SEQ ID NO:139)：

–位置1-72对应于信号肽和限制疤痕

–位置4-405位对应于抗体hCD221ug36(但可替选地是任何其他本文描述的抗CD22sdAb)

–位置406-633对应于(G4S)3-hCD8a-(G4S)连接体结构域(也含有模块化铰链的限制位点)

–位置633和634被CD3特异性鼠scFv的重链分开

–位置634-678对应于(G4S)3连接体，和

–位置678-679被对应于CD3特异性鼠scFv的轻链分开。

为了实验和测试的目的，此后的构建体包括位置679至699，其对应于6x His标签和终止密码子。

对于对应于表3中描绘的SEQ ID NO:120-125的示例抗体序列，应注意有序列差异，特别地朝向氨基末端。具体地，位置1、3和5分别是Q、Q、V(比较表3中的SEQ ID NO:120和121与表1和3中的VHH#22(SEQ ID NO:86)和VHH#11(SEQ ID NO:93))。不受理论的束缚，这些序列差异可有助于稳定性和/或蛋白酶抗性(参见Hussack G等，Protein EngineeringDesign&Selection.2014；27(6)；191-198)。因此，本文公开的实施方式多价抗体和CAR实施方式涵盖包括本文公开的任何一种sdAb的变体，其被修饰以分别在位置1、3和5包含Q、Q和V。

嵌合抗体受体和相关的实施方式

在一个方面中，提供了结合人CD22的嵌合抗体受体(CAR)，其包括本文限定的VHHsdAb。

“嵌合抗原受体”是工程化以赋予T-细胞靶向特定蛋白质的新能力的受体蛋白质。这些受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和T-细胞激活功能二者结合到单个受体中(参见Stoiber等，Limitations in the Design of Chimeric Antigen Receptors for CancerTherapy.Cells.2012；8(5):472和van der Stegen等，The pharmacology of second-generation chimeric antigen receptors.Nat Rev Drug Discov.2019；14(7):499-509)。

在一个实施方式中，CAR以N-末端到C-末端方向包括：

-包括权利要求1至27中任一项限定的sdAb的CD22结合结构域，

-多肽铰链，

-跨膜结构域，和

-包括共刺激结构域和信号传导结构域的细胞质结构域。

本文使用的术语“多肽铰链”通常意思是发挥将细胞外配体结合结构域连接至跨膜结构域的功能的任何寡肽或多肽。特别地，铰链区用于为细胞外配体结合结构域提供更大的柔性和可及性(accessibility)。铰链区可包括多达300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸且最优选地25至50个氨基酸。铰链区可源自全部或部分天然存在的分子，比如源自CD8、CD4或CD28的全部或部分细胞外区域，或源自抗体恒定区的全部或部分。可替代地，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。

在一个实施方式中，多肽铰链是CD8铰链结构域。在一个实施方式中，CD8铰链结构域包括SEQ ID NO:112。在一个实施方式中，CD8铰链结构域域与SEQ ID NO:112至少80％同一性。在一个实施方式中，铰链结构域与SEQ ID NO:112至少90％同一性。在一个实施方式中，铰链结构域与SEQ ID NO:112至少95％同一性。在一个实施方式中，铰链结构域与SEQID NO:112至少98％同一性。

术语“跨膜结构域”表示具有跨越细胞膜并且由此将CAR的细胞外部分(其包括CD22-结合部分)连接至负责信号传导的细胞内部分的能力的多肽。CAR常用的跨膜结构域源自CD4、CD8α、CD28和CD3ζ。

在一个实施方式中，跨膜结构域是CD28跨膜结构域。在一个实施方式中，CD28跨膜结构域包括SEQ ID NO:113。在一个实施方式中，跨膜结构域与SEQ ID NO:113至少80％同一性。在一个实施方式中，跨膜结构域与SEQ ID NO:113至少90％同一性。在一个实施方式中，跨膜结构域与SEQ ID NO:113至少95％同一性。在一个实施方式中，跨膜结构域与SEQID NO:113至少98％同一性。

术语“细胞质结构域”(也称为“信号转导结构域”)是指CAR的细胞内部分，其负责在细胞外配体结合结构域与靶结合后细胞内信号传导，导致免疫细胞和免疫应答的激活。换句话说，细胞质结构域负责激活至少一种免疫细胞的正常效应功能，其中CAR被表达。例如，T-细胞的效应功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞质结构域”是指转导效应信号并且指导细胞执行特定功能的蛋白质部分。除了信号传导结构域之外，这种细胞质结构域通常包括共刺激结构域。

术语“信号传导结构域”是指转导效应信号并且指导细胞以执行特定功能的蛋白质部分。用于CAR的信号转导结构域的示例可以是T-细胞受体和共受体的细胞质序列(其协调起作用来在抗原受体衔接(engagement)后启动信号转导)，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成的序列。信号转导结构域包括两个不同类型的细胞质信号传导序列，启动抗原依赖性初级激活的序列，和以抗原非依赖性方式起作用来提供次级或共刺激信号的序列。初级细胞质信号传导序列可包括信号传导基序，其称为免疫受体酪氨酸型激活基序或ITAM。ITAM是各种受体的细胞质内尾部中发现的定义明确的信号传导基序，作为yk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。本发明中使用的信号传导结构域的非限制性示例可以包括源自TCRζ、常见FcRγ(FCERIG)、FcγRlla、FcRβ(FcεRib)、FcRε、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、DAP10或DAP12的那些。在优选的实施方式中，CAR的信号传导转导结构域可包括CD3ζ信号传导结构域。

在一个实施方式中，信号传导结构域是CD3-ζ信号传导结构域。在一个实施方式中，CD3-ζ信号传导结构域包括SEQ ID NO:115。在一个实施方式中，信号传导结构域与SEQID NO:115至少80％同一性。在一个实施方式中，信号传导结构域与SEQ ID NO:115至少90％同一性。在一个实施方式中，信号传导结构域与SEQ ID NO:115至少95％同一性。在一个实施方式中，信号传导结构域与SEQ ID NO:115至少98％同一性。

术语“共刺激结构域”是指T-细胞上与共刺激配体特异性结合的同源结合伴侣，从而通过细胞介导共刺激应答，比如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。共刺激分子的示例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3；以及与CD83、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDlla、LFA-1、ITGAM、CDllb、ITGAX、CDllc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D特异性结合的配体；或其组合。

在一个实施方式中，共刺激结构域是4-1BB共刺激结构域。在一个实施方式中，4-1BB信号转导结构域包括SEQ ID NO:114。在一个实施方式中，共刺激结构域与SEQ ID NO:114至少80％同一性。在一个实施方式中，共刺激结构域与SEQ ID NO:114至少90％同一性。在一个实施方式中，共刺激结构域与SEQ ID NO:114至少95％同一性。在一个实施方式中，共刺激结构域与SEQ ID NO:114至少98％同一性。

在一个实施方式中，CAR进一步包括sdAb和多肽铰链之间的柔性氨基酸连接体。在一个实施方式中，氨基酸连接体包括SEQ ID NO:111。在一个实施方式中，氨基酸连接体与SEQ ID NO:111至少80％同一性。在一个实施方式中，氨基酸连接体与SEQ ID NO:111至少90％同一性。在一个实施方式中，氨基酸连接体与SEQ ID NO:111至少95％同一性。在一个实施方式中，氨基酸连接体与SEQ ID NO:111至少98％同一性。

在一个实施方式中，CAR进一步包括信号肽。

在一个实施方式中，信号肽是来自人CD28的信号肽。在一个实施方式中，信号肽包括SEQ ID NO:110。在一个实施方式中，信号肽与SEQ ID NO:110至少80％同一性。在一个实施方式中，信号肽与SEQ ID NO:110至少90％同一性。在一个实施方式中，信号肽与SEQ IDNO:110至少95％同一性。在一个实施方式中，信号肽与SEQ ID NO:110至少98％同一性。

在一个实施方式中，CAR通过SEQ ID NO:119编码。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:86(hCD221ug-36)、SEQ ID NO:83(hCD221ug-10)、SEQ ID NO:87(hCD221ug-61)、SEQ ID NO:82(hCD221ug-6)、SEQ ID NO:88(hCD221ug-74)、SEQ ID NO:85(hCD221ug-14)、SEQ ID NO:102(hCD22pas-33)或SEQ IDNO:84(hCD221ug-13)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:70阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:71阐释的CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:72阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-64)。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:82。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:83。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:84。在一个实施方式中，sdAb包括SEQ IDNO:85。在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:86。在一个实施方式中，sdAb包括SEQ IDNO:87。在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:88。在一个实施方式中，sdAb包括SEQ IDNO:89。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:90。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:91。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:92。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:93。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:94。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:95。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:96。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:97。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:98。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:99。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:100。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:101。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:102。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:103。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:104。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:105。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:106。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:107。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:108。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:120。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:121。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:122。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:123。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:124。

在一个实施方式中，sdAb包括SEQ ID NO:125。

在一个实施方式中，CAR进一步包括第二CD22结合结构域，其相对于第一CD22结合结构域位于N-末端或C-末端，并且可通过氨基酸连接体与第一CD22结合结构域间隔开。

在一个实施方式中，第二CD22结合结构域包括与第一CD22结合结构域的sdAb相同的sdAb。这些实施方式在本文中称为“双结合剂(double binders)”。例如，第一和第二CD22结合结构域都可包括抗体1ug36。

在另一实施方式中，第二CD22结合结构域包括与第一CD22结合结构域的sdAb不同的sdAb。这些实施方式在本文中称为“双互补位(bi-paratopic)”。在该实施方式中，第二CD22结合结构域的sdAb可结合至与通过第一CD22结合结构域的sdAb结合的CD22的不同的表位。例如，CAR可包括包含sdAb 1ug36的第一CD22结合结构域和包含sdAb 1ug74的第二CD22结合结构域。例如，1ug36可位于1ug74的N-末端(参见，例如，图30中的示意图)。“不同的表位”可替代地可以是与通过第一CD22结合结构域的sdAb结合的表位重叠的表位。可替代地，sdAb可结合至与通过第一CD22结合结构域的sdAb结合的表位相同的表位。

在一个实施方式中，CAR进一步包括结合至除CD22之外的靶分子的另外的结合结构域。这些实施方式在本文中称为“串联构建体”。另外的结合结构域可包括另外的sdAb。另外的结合结构域可位于相对于CD22结合结构域的N-末端或C-末端。另外的结合结构域可通过氨基酸连接体与CD22结合结构域分开。在一个实施方式中，由另外的结合结构域结合的靶分子由也CD22表达的靶细胞表达，从而提供对相同靶细胞具有双重亲和力的CAR。例如，除CD22之外的靶分子可以是B细胞成熟抗原(BCMA)。CD22结合结构域可包括，例如sdAb1ug36并且另外的结合结构域可包括抗BCMA sdAb(参见，例如图33中描述的示意图)。

在一些实施方式中，串联构建体可包括第三结合结构域，其仍靶向不同于CD22并且不同于由另外的结合结构域结合的分子的另一靶分子。这种构建体在本文中称为“多结合剂(multi-binders)”。

在一些实施方式中，CAR是与其具有80％、90％、95％、98％或99％同一性的以上CAR之一的序列变体。在一些实施方式中，变体保留与其衍生自的亲本分子基本上相同的结合特异性。在一些实施方式中，变体保留与其衍生自的亲本分子基本上相同的结合亲和力。

核酸和载体

在一个方面中，提供了编码本文限定的CAR的重组核酸分子。

在一个方面中，提供了包括本文限定的重组核酸分子的载体。在一个实施方式中，载体是病毒载体。在一个实施方式中，病毒载体是慢病毒载体。

病毒颗粒

在一个方面中，提供了包括本文限定的重组核酸的重组病毒颗粒。一个实施方式中，重组病毒颗粒是重组慢病毒颗粒。

细胞

在一个方面中，提供了在细胞表面膜表达本文限定的CAR的工程化细胞。在一个实施方式中，工程化细胞是免疫细胞。在一个实施方式中，免疫细胞是T淋巴细胞或源自T淋巴细胞。

用途和方法

“CAR-T”细胞疗法使用以CAR工程化的T-细胞用于癌症疗法。CAR-T免疫疗法的前提是修饰T-细胞以识别疾病细胞，通常是癌细胞，以便更有效地靶向和破坏它们。通常，T被基因改变以表达CAR，并且这些细胞被注入患者以攻击其肿瘤。CAR-T细胞可源自患者自身血液中的T-细胞(自体的)或源自另一健康供体的T-细胞(同种异体的)。

在一个方面中，提供了本文所述的核酸、载体或病毒颗粒用于制备用于CAR-T的细胞的用途。

在一个方面中，提供了制备用于CAR-T的细胞的方法，其包括使T-细胞与本文描述的病毒颗粒接触。在一个实施方式中，T-细胞来自供体。在一个实施方式中，T-细胞来自患者。

在一个方面中，提供了制备用于CAR-T的细胞的方法，其包括将本文描述的核酸或载体引入T-细胞中。在一个实施方式中，T-细胞来自供体。在一个实施方式中，T-细胞来自患者。

在一个方面中，提供了本文描述的CAR或工程化细胞用于治疗癌症或自身免疫性疾病的用途。在一个实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤。在一个实施方式中，血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓增生异常综合征。在一个实施方式中，白血病是急性淋巴白血病(ALL)或慢性淋巴白血病(CLL)。在一个实施方式中，淋巴瘤选自由以下组成的组中：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是炎症性疾病。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是多发性硬化症。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是自身免疫性糖尿病。

在一个实施方式中，方法进一步包括从患者或供体获得细胞并且引入编码CAR的重组核酸分子或载体的初始步骤，如本文描述的。

在一个实施方式中，方法进一步包括从患者或供体获得细胞并且使细胞与病毒颗粒接触的初始步骤，如本文描述的。

在一个方面中，提供了本文描述的CAR或工程化细胞用于制备治疗癌症或自身免疫性疾病的药物的用途。在一个实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤。在一个实施方式中，血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓增生异常综合征。在一个实施方式中，白血病是急性淋巴白血病(ALL)或慢性淋巴白血病(CLL)。在一个实施方式中，淋巴瘤选自由以下组成的组中：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是炎症性疾病。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是多发性硬化症。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是自身免疫性糖尿病。

在一个方面中，提供了本文描述的CAR或工程化细胞用于治疗癌症或自身免疫性疾病。在一个实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤。在一个实施方式中，血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓增生异常综合征。在一个实施方式中，白血病是急性淋巴白血病(ALL)或慢性淋巴白血病(CLL)。在一个实施方式中，淋巴瘤选自由以下组成的组中：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是炎症性疾病。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是多发性硬化症。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是自身免疫性糖尿病。

在一个方面中，提供了治疗受试者的癌症或自身免疫性疾病的方法，包括向受试者施用本文限定的工程化细胞。在一个实施方式中，血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓增生异常综合征。在一个实施方式中，白血病是急性淋巴白血病(ALL)或慢性淋巴白血病(CLL)。在一个实施方式中，淋巴瘤选自由以下组成的组中：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是炎症性疾病。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是多发性硬化症。在一个实施方式中，自身免疫性疾病是自身免疫性糖尿病。

实施例

以下实施例概述了本发明的实施方式和/或进行的与本发明相关的研究。尽管实施例是阐释性的，但本发明决不限于以下示例性实施方式。

实施例简介

之前使用靶向CD22的CAR-T的试验都已使用了基于小鼠单克隆抗体的单链可变片段(scFv)，这造成了结构域配对(VH:VL配对)的许多复杂性，比如表达水平、稳定性等。这可能最终限制了最终CAR-T构建体的生产力和效力。本文描述的方法利用骆驼单结构域抗体(纳米抗体)用于CAR靶向，作为scFv抗体结构域的可替代方案。2018年，以FDA批准的第一个二价纳米抗体已经很好地建立了骆驼单结构域抗体作为可溶性、稳定和模块化结构域在许多治疗应用中的适用性。因此，纳米抗体在CAR-T分子中呈现了极好的构成部分(buildingblock)，允许构建功能性CAR-T构建体的库，从而增加筛选更加有效的CAR-T细胞用于治疗非实体肿瘤细胞的机会。

此外，这些纳米抗体也可用于开发另外的安全且有效的免疫治疗方案，其包括但不限于裸抗体或药物偶联抗体疗法和双特异性免疫细胞衔接器。

本文描述的方法使用源自免疫化的美洲驼的单结构域抗体(sdAb)。这些sdAb序列特异性结合至在人B细胞和B细胞白血病上特异性表达的CD22抗原。使用sdAb序列，已经生成了将CD22特异性sdAb与T-细胞信号传导分子结合的新型嵌合受体序列(以41BB、CD28或其他共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域的形式)。除了嵌合抗原受体应用外，这些CD22靶向抗体可用于开发其他形式的免疫疗法，其包括但不限于双特异性/三特异性T或NK细胞衔接器应用、抗体-药物缀合物，或作为裸抗体。

实施例1：sdAb抗体产生

简介

源自骆驼重链可变结构域的单结构域抗体(sdAb)(也称为VHH或纳米抗体)特征上是稳定的，具有完全能够抗原结合的功能性N-末端结构域。除了它们的小尺寸外，sdAb由于它们与人VH3家族的高同源性，在微生物比如大肠杆菌中高表达水平，和在高温、极端pH和高盐浓度下显著的稳定性，因此在人中具有高亲和力、溶解度、低免疫原性。由于它们的卓越抗体工程化潜力，sdAb被认为是双特异性和多特异性治疗性试剂的理想构成部分。值得注意的示例包括FDA批准的第一个二价抗vWF纳米抗体(普拉西珠单抗(Caplacizumab)，2019)和10种其他以二价/多价或双特异性/多特异性形式的治疗性纳米抗体，迄今为止，Ablynx/Sanofi和其他生物制药公司已经使其进入临床前和临床开发。

sdAb也是生成嵌合抗原受体(CAR)的理想构成部分，常规IgG的癌症特异性抗原结合结构域(scFv、Fab)与免疫细胞激活结构域基因地融合，以生成寻找且杀伤携带靶向抗原的特异性细胞的“装甲”免疫T淋巴细胞(CAR-T)。在CAR-T构建体中应用sdA降低scFv/Fab片段的结构域复杂性，并且显著提高最终CAR-T构建体的生产力和效力。它还允许将另外的特异性(针对第二癌症生物标志物)添加到CAR-T构建体中(即，以生成双特异性CAR-T细胞)，因此，增加了筛选更加有效的CAR-T细胞用于治疗血液肿瘤的机会。同样地，这些sdAb是开发其他形式的免疫疗法的理想候选者，比如双特异性、三特异性和多特异性免疫细胞衔接器。

本研究旨在生成针对CD22胞外结构域的功能性骆驼sdAb，CD22是B细胞限制性白血病抗原，用于开发免疫疗法，包括但不限于CAR-T疗法、双特异性、三特异性和多特异性免疫衔接器疗法，具有适当的人IgG融合的裸治疗性抗体。这些疗法旨在用作癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病的治疗方式。呈现了使用这些sdAb序列开发具有有效抗肿瘤活性的CAR-T和双特异性免疫衔接器的示例。

材料和方法

CD22-ECD的克隆和表达

将编码人主要的CD22-β同种型的细胞外结构域的基因克隆到pTT5：NRC专有的哺乳动物表达载体中。NRC CHO-3E7细胞转染后，细胞在1L烧瓶中生长，并且含有C-末端6xHis标签的表达的蛋白质通过免疫亲和层析(IMAC)，随后通过尺寸排阻层析纯化，并且在SDS-PAGE上进行分析。

美洲驼免疫

用CD22抗原的重组ECD结构域免疫美洲驼。对于每次注射，将总体积0.5mL的100μg重组人CD22蛋白质与等体积的完全(第一次注射)和不完全弗氏佐剂(随后注射)混合，并且皮下注射。以近似两周的间隔进行五次注射，并且在第三次注射后和最后一次注射后7天收集血液。

RNA分离和PCR扩增

用QIAamp RNA血液迷你试剂盒(QIAGEN Sciences,Mississauga,ON)并且根据试剂盒说明，从免疫方案的第49天收集的近似1x 10⁷个淋巴细胞中分离总RNA。使用第一链cDNA合成试剂盒(Amersham Biosciences,USA)，将约5μg的总RNA用作具有用寡聚dT引物的第一链cDNA合成的模板。基于骆驼科和美洲驼免疫球蛋白数据库，设计了三个可变结构域有义引物(MJ1-3)和两个CH2结构域反义引物(CH2和CH2b3)(Baral TN等，2013)。第一次PCR用cDNA作为模板进行，并且常规(IgG1)和重链抗体(IgG2和IgG3)的可变区在两个分开的反应中用MJ1-3/CH2和MJ1-3/CH2b引物的组合进行扩增。PCR反应混合物含有以下成分：2μLcDNA、5pmol的MJ1-3引物混合物、5pmol的CH2或CH2b引物、5μL的10X反应缓冲液、3μL的2.5mM dNTP、2.5单位的TaqDNA聚合酶(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)和水至50μL的最终体积。PCR方案由以下组成：94℃ 3分钟的初始步骤，随后94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分钟的30个循环，以及72℃ 7分钟的最终延伸步骤。使扩增的PCR产物在2％琼脂糖凝胶上运行，并且由对应于常规的IgG1的约850bp和对应于重链抗体的约600bp(550-650bp)的两条主要条带组成。较小的条带从凝胶上切下，用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.)纯化，并且在第二个PCR反应中重新扩增，第二个PCR反应含有1μL的纯化的DNA模板；每个5pmol的MJ7，具有SfiI限制位点的VH有义引物，加下划线，(5’-CAT GTG TAGACT CGCGGC CCA GCC GGCCATGGC C-3’)，和MJ8，具有SfiI限制位点，加下划线，(5’-CATGTG TAG ATT CCT GGC CGG CCT GGC CTG AGG AGA CGG TGA CCT GG)；5uL的10X反应缓冲液；3uL的2.5mM dNTP；2.5单位的TaqDNA聚合酶(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)；和水，至50μL的最终体积。PCR方案由以下组成：94℃ 3分钟的初始步骤，随后94℃ 30秒、57℃ 30秒、72℃ 1分钟的30个循环，以及72℃ 7分钟的最后延伸步骤。对应于重链抗体的VHH片段的扩增PCR产物(约400-450bp)用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN Inc.)纯化，用SfiI(New England BioLabs)消化并且用相同的试剂盒重新纯化。

文库构建

在50℃，用SfiI消化30μg的pMED1(Arbabi-Ghahroudi等，2009)DNA过夜。为了最小化自连接(self-ligation)的机会，通过添加20单位的XhoI和PstI限制酶，在37℃继续消化另外2小时。对于文库构建，将10μg的噬菌粒DNA与1.75ug的VHH片段连接，并且使用LigaFastDNA连接***(Promega,Corp.,Madison,WI)且根据推荐方案在室温孵育2小时。将连接产物电穿孔至感受态大肠杆菌TG1细胞(Stratagene,Cedar Creek,TX)中。将转化的细菌细胞在SOC培养基中稀释，并且在37℃缓慢摇动孵育1小时。通过在LB-Amp上铺板等分试样来计算文库的大小。对来自96个菌落的VHH片段进行PCR扩增和测序以进行多样性分析。文库被等分并且储存在-80℃。

文库淘选和筛选

生物素化和被动吸收的两种策略被用于CD22免疫文库的淘选：

a)生物素化CD22 ECD淘选：

具有3.3x 10⁷大小的构建的LPAR1文库2被噬菌体回收，并且1.4x10⁹cfu/uL的噬菌体效价被用于淘选先前通过使用EZ-link sulfo-NHS-LC-生物素(Thermoscientific目录号21338)生物素化的CD22 ECD抗原。第1轮、第3轮用封闭缓冲液[例如Starter Block(Thermo Fisher目录号37559))并且第2轮、第4轮用无生物素酪蛋白交替进行四轮淘选。在Pierce^TM链霉亲和素涂覆的孔(第1轮、第3轮)(Thermoscientific目录号15501；批号TF252884)和Pierce^TM中性亲和素涂覆的孔(第2轮、第4轮)(Thermoscientific目录号15508；批号SK253835)之间交替进行淘选。在4℃，首先将两个孔和一个或两个微量离心管在适当的封闭缓冲液中孵育过夜。

在接下来一天，在室温，将文库输入噬菌体(～3x 10¹¹)添加至适当的封闭缓冲液的封闭的链霉亲和素孔之一1小时，然后转移到封闭的微量离心管中，并且与生物素化CD22抗原混合。在随后的几轮中，使用来自每轮扩增噬菌体的～3x 10¹¹的输入噬菌体。在第一轮中，使用1ug的生物素化CD22抗原。在随后的几轮中，使用1ug和100ng的抗原。在室温，孵育一小时后，将输入噬菌体/生物素化CD22混合物转移到其他封闭的链霉亲和素孔中，并且在室温孵育30分钟。随后是洗涤步骤{3x 300μL PBS-T(PBS+0.05％ Tween 20)(快速)；2x300μL PBS-T+(PBS+0.05％ Tween 20)(每次洗涤孵育5分钟)；3x 300μL PBS(快速)；2x300μL PBS(每次洗涤孵育5分钟)}并且用100μL的100mM TEA洗脱。然后从孔中除去噬菌体，并且在新试管中用50μL的1M Tris-HCl pH 7.4中和。在37℃、250rpm先前生长的3mL的指数生长的TG1大肠杆菌培养物，直到15mL Falcon管中2YT+2％葡萄糖的OD₆₀₀＝0.5，被洗脱的噬菌体感染。将100μL等分试样的未感染的TG1大肠杆菌细胞放在一边作为对照。在37℃，将洗脱的噬菌体不摇动孵育30分钟，并且然后将等分试样用于效价(10²至10⁸的稀释度)并且在32℃，在2YT板上铺板过夜。剩余的3mL的感染的TG1培养物使用M13KO7辅助噬菌体(～1x10¹⁰ cfu)进行过夜噬菌体扩增。

在接下来一天，计算洗脱的效价以确定下一轮的输入噬菌体的量。含有扩增噬菌体的细胞培养物以5000rpm离心30分钟，并且将上清液通过0.22uM过滤器单元(Millipore)过滤并且在20％ PEG/2.5M氯化钠(NaCl)中沉淀随后离心，并且在PBS(pH 7.5)中重新溶解。在先前生长的TG1大肠杆菌细胞中测定扩增噬菌体效价(10⁴至10¹²的稀释度)。4轮淘选后，分析来自噬菌体ELISA阳性菌落的序列，

b)CD22-ECD的被动淘选

相同的回收噬菌体用于针对CD22 ECD抗原的淘选。第1轮、第3轮用封闭缓冲液[例如Starter Block(Thermo Fisher目录号37559)并且第2轮、第4轮用4％牛奶PBS交替实施四轮淘选。CD22 ECD被动吸附到Nunc孔上的量在四轮淘选中从40ug减少到10ug(第1轮：40μg、第2轮：30μg、第3轮：20μg、第4轮：10μg)。首先在室温用适当的缓冲液封闭孔2小时，随后添加输入噬菌体(～3x 10¹¹)。在随后的几轮中，使用来自每轮的扩增噬菌体的约3x 10¹¹的输入噬菌体。温育随后是洗涤步骤。

{R1:5x PBS-T；2x PBS；R2：5x PBS-T；5x PBS；R3：7x PBS-T；5x PBS；和R4：10xPBS-T；10x PBS}。)}并且用100μL的100mM TEA洗脱。然后从孔中去除噬菌体，并且在新试管中用50μL的1M Tris-HCl pH7.4中和。在37℃、250rpm先前生长的2mL的指数生长的TG1大肠杆菌培养物，直到15mL Falcon管中2YT+2％葡萄糖的OD₆₀₀＝0.5，被用洗脱的噬菌体感染。将100μL等分试样的未感染的TG1大肠杆菌细胞放在一边作为对照。在37℃，将洗脱的噬菌体不摇动孵育30分钟，并且然后将等分试样用于效价(10²至10⁸的稀释度)并且在32℃，在2YT板上铺板过夜。使用M13KO7辅助噬菌体(～1x10¹⁰ cfu)进行过夜噬菌体扩增。在接下来一天，计算洗脱的效价以确定下一轮的输入噬菌体的量。含有扩增噬菌体的细胞培养物以5000rpm离心30分钟，并且上清液通过0.22uM过滤器单元(Millipore)过滤并且在20％PEG/2.5M NaCl中沉淀随后离心，并且在PBS(pH7.5)中重新溶解。在先前生长的TG1大肠杆菌细胞中测定扩增的噬菌体效价(10⁴至10¹²的稀释度)。4轮淘选后，分析来自噬菌体ELISA阳性菌落的序列。

结果

重组CD22-ECD用于免疫美洲驼并且通过ELISA监测和分析血清效价。如图3中显示的，CD22在美洲驼中引起强烈的重链免疫应答。血清中的重链免疫应答是通过使用两种单克隆抗体来测量的，这两种单克隆抗体分别特异性结合至美洲驼IgG2b的铰链-CH2边界和美洲驼IgG2c的Fc(Henry KA等，Llama Peripheral B-cell Populations ProducingConventional and Heavy Chain-Only IgG Subtypes Are PhenotypicallyIndistinguishable but Immunogenetically Distinct.Immunogenetics 2019Apr；71(4):307-320)。

美洲驼免疫球蛋白的重链组库通过基因特异性引物扩增并且克隆至噬菌粒载体(pMED1)中。构建了中等大小的文库(3.3x 10⁷)，并且通过发送96个菌落用于测序来分析其复杂性。测序数据显示文库具有高复杂性，因为所有的VHH序列都是全长的，没有重复序列。使用M13辅助噬菌体噬菌体回收文库，如其他地方描述的(Baral TN、MacKenzie R、ArbabiGhahroudi M.Single-domain antibodies and their utility.Curr ProtocImmunol.2013Nov 18；103:2.17.1-2.17.57)并且噬菌体抗体用于两个分开的淘选实验。在四轮淘选后，每个淘选策略的96个菌落生长并且被M13辅助噬菌体重复感染，如其他地方描述的(Baral TN等，2013)并且在ELISA中使用噬菌体。发送阳性菌落用于测序并且分析测序数据。使用OPIG软件(http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/newsabdab/sabpred/ anarci/)和IMGT编号(参见图4A和4B)比对序列。选择了27个独特的VHH序列用于基因合成并且克隆到表达载体(pMRO)中。

图1描绘了由位于染色体19q13.12上的CD22基因编码的人CD22分子的结构。CD22β是主要的同种型(具有7个结构域；847个氨基酸)。具有四个免疫受体基序的细胞质尾部(140个氨基酸)通过跨膜区域(18个氨基酸)连接到细胞外结构域(669个氨基酸)。

图2描绘了在非还原和还原条件下来自两个不同表达批次的IMAC-纯化的CD22细胞外结构域(CD22-ECD)的SDS-PAGE。纯化的蛋白质具有近似75kDa的预期分子量。

图3描绘了美洲驼重链免疫应答形成针对CD22-ECD的最后放血(8月3日)。作为对照，使用美洲驼免疫前血清。重链抗体的结合通过抗美洲驼mAb(内部NRC)，随后通过驴抗小鼠HRP检测。如显示的，存在强烈且特异性的抗CD22-ECD重链免疫应答。

讨论

在哺乳动物CHO***中成功地表达主要的人CD22同种型的细胞外结构域，并且在所有下游分析测定中重组CD22-ECD表现良好(数据未显示)。用重组CD22-ECD免疫美洲驼后，如使用重链特异性mAb通过ELISA确定的，生成了强烈的重链免疫应答。通过在重链组库上构建文库，分离对免疫原(CD22-ECD)特异的VHH结构域抗体。

实施例2：sdAb抗体特征

简介

在获得针对人CD22-ECD的阳性免疫应答后，进行对免疫美洲驼的重链组库的文库构建。在进行两种不同的淘选策略(其中使用生物素化和非生物素化的人CD22-ECD蛋白)后，随后通过噬菌体-ELISA筛选了超过200个单个菌落。对单个VHH克隆进行测序并且基于其CDR1-3序列进行分组，从而导致27个独特的VHH序列。将编码这些VHH的基因克隆到NRC细菌表达载体中，并且表征纯化的蛋白质。

材料和方法

可溶性V_HH的表达

将具有噬菌体ELISA OD₄₅₀>0.8的最重复的克隆的DNA序列发送用于基因合成至TWIST Bioscience，并且随后克隆到pMRO(pET28a衍生物，Novagen)表达载体中。用VHH构建体转化大肠杆菌TG1细胞，并且在2xYT培养基+具有0.1％葡萄糖的氨苄西林(100mg·mL-1)的0.25升培养物中生长各自克隆至0.8的OD₆₀₀。培养物用1mM IPTG诱导，并且在37℃，在旋转摇床上生长过夜。在通过SDS-PAGE和蛋白质印迹确认表达后，通过标准裂解方法从细菌细胞中提取重组VHH蛋白质，并且通过固定化金属亲和层析(IMAC)纯化并且进行定量，如其他地方描述的(Baral TN,Arbabi-Ghahroudi M.Expression of single-domainantibodies in bacterial systems.Methods Mol Biol.2012；911:257–75)。VHH蛋白质在Supdex 75尺寸排阻层析上运行，并且收集单体级分。

SPR分析

对于表面等离子体共振，在含有150mM NaCl、3mM EDTA的10mM HEPES，pH 7.4中，将21个选定的VHH分别穿过尺寸排阻柱superdex 75(GE Healthcare)，收集单体sdAb级分并且通过在280nm处测量吸光度(A280)来确定蛋白质浓度。用Biacore T200仪器(GEHealthcare)进行分析。在25℃，在含有150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20(GEHealthcare)的10mM HEPES，pH 7.4中进行所有测量。近似1919RU的重组单体CD22-ECD(在CD22-ECD的SEC纯化后获得)以5uL/min的流速被捕获在SA传感器芯片(GE Healthcare)上。以40μL/min的流速，使用SA表面作为参考，分别将各种浓度的单体VHH注入CD22-ECD表面上。通过用运行缓冲液洗涤来生成表面。使用BIAevaluation 4.1软件分析数据。

通过SPR的表位binning

除了获得结合动力学数据外，还对11个选定的VHH进行了Biacore共注射实验，以确定这些抗CD22 VHH是否可以结合CD22-ECD蛋白质表面上的独特或重叠表位。简而言之，将80μL的第一VHH在HBS-EP缓冲液中稀释至其KD值的5倍浓度，并且以40μL/min注入在1919RU的固定化CD22-ECD上。在注入第一VHH后，将缓冲液或第二VHH(80μL总体积，5x KD)以40μL/min注入已经被第一VHH饱和的CD22-ECD表面。在两个方向上(即每个VHH充当第一和第二VHH)，收集11个VHH的所有可能配对组合的数据，并且如以上描述的进行评估。

使用酵母表面展示的表位作图

使用酵母表面展示，hCD22胞外结构域(ECD)及其衍生片段被表达并且共价展示在酵母细胞表面(Feldhaus等，2003,Nat.Biotechnol.第21卷,163-170)。YSD载体(pPNL6)来自美国太平洋西北国家实验室(The Pacific Northwest National Laboratory,USA)。七个hCD22片段，命名为Bin1至7，具有覆盖整个hCD22-ECD(668aa)的重叠端(15-25aa)，与全长hCD22-ECD一起被克隆并且表达为在酵母细胞表面上的融合蛋白(Aga2-HA(hAXL)-MYC。展示的hCD22片段用于绘制与实施例1的抗hCD22 sdAb结合的hCD22的结构域。sdAb(生物素化的)与酵母细胞上的CD22片段的结合是使用用HRP-缀合的链酶亲和素探测的全酵母细胞ELISA进行。通过用抗MYC抗体，随后用HRP缀合的二抗探测，测量展示的融合蛋白的相对量，并且用于标准化sdAb的结合信号。根据制造商的条件，用底物TMB(四甲基联苯胺)测定HRP活性，并且在OD₄₅₀处读取。为了确定表位的性质，线性与构象的具有展示的CD22片段的酵母细胞在80℃加热30分钟，然后在用抗体标记之前在冰上冷却20分钟。

评估sdCD22 VHH的靶特异性

生物素化的VHH用于通过流式细胞术评估sdCD22 Ab的靶特异性。CD22表达的人伯基特淋巴瘤细胞系Raji和Ramos以及使用CRISPR基因敲除的CD22表达缺失的Ramos细胞与7.5-0.06μg/mL的5倍稀释的生物素标记的sdCD22 VHH一起孵育。靶向CD22的VHH与细胞表面CD22的结合使用荧光团缀合的链霉亲和素通过流式细胞术检测。

结果

通过TWIST Bioscience(USA)进行基因合成和亚克隆，并且质粒DNA转化为TG1大肠杆菌用于蛋白质表达。pMRO载体中组氨酸标签和生物素化信号序列的存在允许通过IMAC柱轻松纯化以及在VHH C-末端特异性添加生物素部分。单一生物素添加促进在未来的表位作图测定中检测VHH。在SDS-PAGE上运行IMAC纯化的VHH蛋白质(图5；仅显示14个VHH)。如显示的，VHH抗体显示约15-17kDa的预期分子量。

纯化的蛋白质的聚集状态通过尺寸排阻层析检查并且如预期的那样所有都是非聚集单体(数据未显示)。单个VHH蛋白质的反应性也通过ELISA确认，其中与HRP缀合的兔抗His₆抗体用于检测结合至固定化CD22-ECD的VHH(数据未显示)。

所有21个VHH的单体级分用于SPR实验，其中将人CD22-ECD固定到CM5葡聚糖芯片上，并且将各种VHH浓度(0.6-400nM)穿过传感器芯片。SPR分析揭示了所有21个VHH特异性结合CD22-ECD，平衡常数范围从hCD22pas-64的250nM至hCD221ug-14的6pM。所有收集的数据都符合1:1结合模型。

对于抗-CD22 VHH的表位binning，在两个方向上用成对的VHH进行共注射SPR实验以确定抗体是否可同时地结合CD22-ECD。如果在共注射任何两个VHH时应答增加，这将表明第一个VHH的结合(在饱和浓度下)不阻碍第二个VHH的结合，因此，这些抗体识别独立的表位。然而，如果在共同注射两个VHH时应答存在微小变化，这将表明两个VHH不能同时地结合至相同区域，因此，它们识别重叠/相同的表位。对11个抗CD22VHH进行了共注射SPR实验，并且如表5中显示的确定了7个结合。剩余的10个VHH在它们的CDR区域与11个VHH具有高序列相似性，这些VHH通过SPR来进行bin。因此，将10个VHH放置入具有如表5中显示的最接近氨基酸相似性的bin中。

图4A和4B描绘了27个VHH的氨基酸序列的比对。

表1(以上)描述了27个VHH的氨基酸序列。CDR(加下划线)和框架区根据IMGT编号***(www.IMGT.com)进行编号。

表2(以上)提供了VHH名称、编号和SEQ ID NO之间的对应关系。

图5描绘了在TG1大肠杆菌中表达并且通过IMAC纯化的14种抗CD22 VHH抗体的SDS-PAGE。纯化的蛋白质显示出15-17kDa的预期分子量，并且所有蛋白质样品都没有降解的迹象。

表4描绘了文中描述的所有27个VHH的测量亲和力。亲和力数据范围从pM(hCD221ug-14的6pM)至高nM(hCD22pass-64的250nM)。

表4：通过表面等离子体共振(SPR)的sdCD22VHH的亲和力

/>

表5描述了通过共注射SPR实验进行表位binning。共注射两个方向的VHH对，并且测量11个抗CD22 VHH的应答单元的增加。如显示的，用1至4个成员鉴定7个bin。剩余的10个VHH与通过SPR进行bin的11个VHH具有高氨基酸序列相似性，并且因此被放置入各自的bin中。

表5：通过SPR竞争结合的binning

VHH#	名称	binning的选择	Bin
				VHH#6	hCD22pas-10		bin 6
VHH#7	hCD22pas-33		bin 6
				VHH#3	hCD221ug-74		bin 6
VHH#1	hCD221ug-80		bin 6
				VHH#5	hCD22100ng-64		bin 6
VHH#4	hCD22100ng-66	hCD22100ng-66	bin 6
				VHH#2	hCD22100ng-2		bin 6
VHH#15	hCD22pas-32		bin 5
				VHH#16	hCD221ug-14	hCD221ug-14	bin 5
VHH#3	hCD221ug-77		bin 3
				VHH#9	hCD221ug-87		bin 3
VHH#10	hCD221ug-75	hCD221ug-75	bin 3
				VHH#11	hCD221ug-93		bin 3
VHH#18	hCD22pas-79	hCD22pas-79	bin 3
				VHH#20	hCD22pas-16	hCD22pas-16	bin 2
VHH#25	hCD22pas-64	hCD22pas-64	bin 7
				VHH#26	hCD22pas-24	hCD22pas-24	bin 4
VHH#21	hCD221ug-13	hCD221ug-13	bin 1
				VHH#14	hCD221ug-61	hCD221ug-61	bin 3
VHH#22	hCD221ug-36	hCD221ug-36	bin 2
				VHH#23	hCD221ug-10	hCD221ug-10	bin 3

图6描绘了生物素缀合的抗-CD22 VHH与CD22表达的肿瘤细胞Raji(左图)、Ramos(中间图)或通过CRISPR基因敲除被工程化为没有CD22表达的Ramos细胞(右图)的结合。9个VHH序列的代表性图被包括在细胞结合分析中，其显示与CD22阳性Raji和Ramos细胞的不同程度的剂量依赖性结合。在所有情况下，当在CD22阴性Ramos细胞上测试时，结合强度显著降低或消除。

表6描绘了使用细胞ELISA将实施例1中呈现的CD22 sdAb针对酵母表面展示的hCD22胞外结构域片段的物理binning。展示的CD22片段定义为具有指示的成熟CD22覆盖范围(根据编号的氨基酸残基上)的物理Bin。在250nM的每个sdAb(生物素化的)与酵母细胞表面上特定CD22片段的结合通过链霉亲和素缀合的HRP酶促活性揭示。突出显示造成OD₄₅₀高于0.25的孔，表明显著的抗体-抗原相互作用。除hCd22_1ug-14外测试的所有sdAb都被分配至特定的Bin。hCD221ug-13和hCD221ug-80都可被分配至两个Bin，表明这些sdAb识别由CD22上的不止一个位置共享的表位。

表6：使用酵母表面展示文库的Binning CD22sdAb

表7描述了CD22 sdAb的表位性质的评估以确定sdAb的表位是否是连续的(线性的)或非连续的(构象的)。在酵母细胞上表达和展示CD22结构域的各种片段，并且用描述的天然(ND)或热变性(D)YSD细胞使用表6中描述的细胞ELISA测定分析与sdAb的结合。每个sdAb与天然和变性的CD22片段的结合测量为OD₄₅₀，并且计算变性CD22与未变性CD22的结合比，比≥0.5指示线性(L)，比<0.5指示构象(C)表位。

表7：来自实施例1的sdAb的表位性质的评估

图7描绘了根据表5和6中的表位作图/Binning结果，实施例1中的sdAb与CD22胞外结构域的子结构域的感知结合相对于其细胞表面位置的示意表示。如在表6中相同的限定和编码每个子结构域/Bin，并且表示为椭圆形，其中Bin-1位于相对于质膜的远端，Bin-7位于相对于质膜的近端。sdAb(由特定形状和名称表示)与子结构域/Bin的结合由其结合的子结构域/Bin的邻近度(vicinity)表示。

讨论

在大肠杆菌中表达抗CD22-ECD VHH，并且蛋白质被纯化和生物素化。抗体显示出通过尺寸排阻层析确定的非聚集和单体行为。21个VHH的结合动力学由SPR确定，并且抗体显示出特异性结合至人CD22-ECD，亲和力范围从低到高纳摩尔，除了一个VHH具有6皮摩尔的亲和力。这种多样化的亲和力允许我们研究亲和力对CAR-T构建体生产力的影响。SPR对11个VHH的表位binning表明一些VHH与重叠的表位结合，而其他VHH与独特的表位结合。这通过使用人CD22胞外结构域片段的酵母表面展示文库和通过使用细胞ELISA对抗体的表位binning来确认。除1ug-14外测试的所有sdCD22 Abs被分配至特定的Bin。1ug-13和1ug-80都可被分配至两个bin，表明这些sdAb识别由CD22上的不止一个位置共享的表位。这些表位binning信息将用于设计含有多个sdCD22 VHH序列的双互补位治疗剂。

实施例3：CAR-T体外测试

简介

在鉴定了以上描述的新型CD22结合单结构域抗体(sdAb)序列后，期望在可用于将人T-细胞应答重定向至携带特定表面抗原的细胞的嵌合抗原受体(CAR)分子的背景下测试它们的活性。因此，使用先前描述的高通量技术(Bloemberg等，2020)生成了新型CD22-sdAb靶向的CAR构建体，并且通过以下描述的各种测定测试了它们的相对T-细胞激活活性。

材料和方法

将单结构域抗体抗原结合序列转移到含有限制位点的模块化CAR质粒骨架[SEQID No:119]以允许有效重组，其中可用新型CD22抗原结合结构域(ABD)序列去除并且置换抗原结合结构域。使用的具体CAR设计如下：人CD28信号肽[SEQ ID NO:110]、VHH抗体(ABD)[SEQ ID NO:82至108]中的任何一个、柔性连接体结构域[SEQ ID NO:111]、人CD8铰链结构域[SEQ ID No:112]、人CD28跨膜结构域[SEQ ID No:113]、人4-1BB共刺激结构域[SEQ IDNo:114]和人CD3-ζ信号传导结构域[SEQ ID No:115]。还使用源自先前证明的CD19特异性CAR序列的序列生成对照构建体，其中ABD是FMC63-scFv序列[SEQ ID NO:117]或CD22特异性CAR序列，其中ABD是M971-scFv序列[SEQ ID NO:116]。

然后，与Bloemberg等，2020中描述类似地在永生化人T-细胞系(Jurkat)中测试了新型靶向CD22的CAR构建体的活性。简而言之，将质粒电穿孔至Jurkat T细胞中并且允许恢复数小时。然后，将Jurkat-CAR细胞以不同剂量与展示出人CD22的不同表达水平的靶细胞系混合。具有高CD22表达的靶细胞系(Ramos)被用于该研究以确认Jurkat细胞中的CAR激活活性。其中使用CRISPR基因组编辑以去除CD22表达的细胞也用于确认新型CAR构建体对人CD22抗原的特异性。然后，将表达CAR的Jurkat细胞和靶细胞共培养物在标准哺乳动物细胞培养条件下孵育过夜，以允许CAR激活发生。为了定量CAR介导的Jurkat细胞激活，使用特异性抗体染色和流式细胞术测量CD69的表达。使用GFP标志物的表达来门控表达CAR的细胞，使用CD69表面标志物确定的T-细胞激活水平。当将细胞与CD22表达的Ramos细胞而非CD22敲除细胞共培养时，CD69标志物在表达各种CD22-sdAb靶向的CAR构建体的各种Jurkat细胞中显著升高(图8)。

在该CAR-J测试后，选择了几种CD22-CAR构建体用于在原代人T-细胞中进行测试。为实现这一点，通过CAR质粒与慢病毒包装细胞系的共转染制备慢病毒。使用超速离心收集且浓缩细胞上清液中的慢病毒颗粒。然后，使用磁珠分离从供体血液样品中分离原代人T-细胞，并且使用抗CD3和抗CD28珠进行多克隆激活。然后，用含有各种靶向CD22的CAR构建体的浓缩慢病毒以多重感染超过10转导激活的人T-细胞。在病毒转导后，使用GFP标志物的流式细胞术分析确认细胞表达CAR。然后，在检查CAR活性之前，将病毒转导的T-细胞(CAR-T细胞)扩增9天。

为了检查病毒转导的CAR-T细胞中的CAR活性，利用了许多测定。首先，将细胞在没有另外刺激的情况下在受控细胞培养条件下放置，并且使用

S3设备(Sartorius，USA)经活体显微镜检查另外6天内非特异性细胞扩增。使用自动细胞计数确定总细胞计数。当置于多克隆激活后第9天和第15天之间未刺激条件下，用各种CD22-sdAb靶向的CAR构建体稳定转导的原代人T-细胞未显示出显著的细胞扩增(图9)。这些结果表明，测试的CD22-sdAb靶向的CAR构建体不赋予原代人T-细胞靶非依赖性进补T-细胞激活。

在此之后，测试原代CAR-T细胞的抗原特异性激活以及响应具有CD22表达和不具有CD22表达的细胞的靶细胞杀伤。将CAR-T细胞与各种表达红色荧光蛋白标签Nuclight-Lenti(Sartorius，USA)的靶细胞共培养，并且使用IncuCyte S3活体显微镜设备监测6天。检查GFP标记的CAR-T细胞的数量，两个CAR构建体(1ug36和1ug10)显示出响应CD22+细胞系(Raji、Ramos)，但不响应CD22敲除细胞(Ramos-CD22ko)的GFP+细胞明显扩增，表明抗原特异性激活和扩增(图10)。检查与最活跃的CD22-CAR构建体(1ug36)共培养中Nuclight标记的靶细胞的数量，在CD22+靶细胞中鉴定出CD22+靶细胞生长的明显抑制，对CD22敲除细胞没有或低的影响(图11)。基于这些结果，选择先导分子(1ug36)进行进一步测试。

接下来，进行实验以证明新型CD22-sdAb靶向的原代CAR-T细胞的连续杀伤能力。如以上描述的，使用慢病毒转导从供体血液来源的T-细胞生成CAR-T细胞，并且在细胞培养物中扩增9天。然后，将CAR-T细胞与荧光标记的Ramos细胞共培养，并且检查靶细胞生长。与以上描述类似地，先导构建体显示出对测试的那些构建体最有效的靶细胞抑制(图12顶部)。共培养1周后，用新鲜的Ramos靶细胞再次攻击CAR-T细胞，并且检查它们继续杀伤靶细胞的能力(图12底部)。同样，在测试的那些构建体中，1ug36-CAR构建体显示出最明显的靶细胞生长抑制，并且因此被选择用于进一步分析。

为了以新型CD22-sdAb靶向的CAR构建体研究供体内部和供体间变异性，如以上描述从两个不同的供体血液样品中生成另外的CAR-T细胞。在该实验中，还将新型CAR-T构建体与基准CD22靶向的CAR比较，其中先前展示的CAR构建体由类似于用于测试本文描述的新型sdAb构建体的CAR构建体内人CD22特异性单链可变片段[SEQ ID NO.116]组成。然后，将CAR-T细胞与CD22表达的靶细胞(Raji)共培养，并且检查肿瘤细胞生长抑制(图13顶部)和CAR-T细胞扩增(图13底部)。结果表明，先导CAR构建体在不同供体之间对基准CAR应答显示出一致且相似的应答。

接下来，检查来自2个供体的CD22-sdAb靶向的CAR-T细胞的CD22表达(Raji)和CD22阴性(MCF7)靶细胞的特异性裂解。在标准细胞培养条件，将如以上描述生成的各种CAR-T细胞与负载放射性铬的靶细胞共培养4.5小时。共培养后，去除细胞上清液并且使用闪烁计数器计算铬含量。实验使用源自2个供体的CAR-T细胞以单个效应子与靶的比率用各种CAR构建体进行(图14)，或者用以上鉴定的先导CD22-sdAbCAR构建体以不同的效应子与靶比率进行(图15)。结果表明由用新型CD22-sdAbCAR构建体转导的CAR-T细胞诱导的特异性靶细胞裂解。

最后，评估了CD22-sdAb靶向的CAR-T细胞被CD22表达的肿瘤细胞(Ramos)再刺激的能力。如以上描述生成包括先导1ug36-CAR构建体的各种CAR-T细胞，并且在第9天扩增期至第17天增殖静止期培养。然后，用照射的CD22表达的Ramos细胞刺激CAR-T细胞另外5天，接着评估它们对负载铬的CD22表达(Raji)和CD22阴性(MCF7)靶细胞的细胞毒性潜力。在以各种效应子与靶比率共培养4.5小时后，使用闪烁计数器定量释放的铬(图16)。结果表明，用携带CD22的Ramos细胞重新刺激静息的靶向CD22的CAR-T细胞，包括先导1ug36-CAR构建体，导致对CD22表达的Raji靶细胞的特异性裂解活性保持在与scFvCAR基准相似的水平。

结果

图8描绘了CAR-Jurkat测定的结果，其中Jurkat细胞用不同的CAR质粒瞬时地电穿孔并且单独培养或与CD22阳性(Ramos)或CD22阴性(Ramos-CD22ko)细胞系共培养。使用人CD69特异性抗体染色和流式细胞术测量T-细胞激活水平。图表描绘了在单个实验中以一式两份，与没有靶细胞(空心条)、Ramos靶细胞(实心条)或Ramos-CD22ko细胞(灰色条)一起培养进行的每个28个单结构域抗体靶向的CAR构建体的CD69染色的平均荧光强度。误差条显示一式两份孔的平均值的标准误差。结果表明，近似一半(15/28)的测试的新型CAR构建体具有抗原特异性应答。

图9描绘了CAR-T进补激活测定的结果，其中原代供体血液来源的T-细胞用不同的CAR构建体转导并且检查靶非依赖性扩增。模拟是指在没有任何表达CAR的慢病毒的情况下暴露于类似治疗条件的供体来源的T-细胞。如方法中描述的，在多克隆激活后第9天和第15天之间经活体显微镜检查CAR-T细胞在细胞培养物中的增殖。图表描绘了使用自动细胞计数确定的细胞数量相对于开始该测定的细胞数量的倍数变化。结果表明，在测试的那些CAR构建体中缺乏抗原非依赖性T-细胞扩增。

图10描绘了使用以不同的CD22-单结构域抗体或对照(FMC63)CAR构建体转导的供体血液来源的T-细胞进行的CAR-T靶特异性激活测定的结果。模拟是指暴露于类似的治疗条件的没有CAR表达的未修饰的供体来源的T-细胞。如以上描述的，在多克隆激活后第9天和第15天之间，经活体荧光显微镜检查CAR-T细胞在与CD22+靶细胞(左图–Raji，中间图–Ramos靶)或与CD22-阴性靶细胞(右图-Ramos-CD22ko靶)共培养中的增殖。图表描绘了使用自动计数确定的绿色荧光蛋白标记的CAR表达细胞的倍数扩增。结果表明，CAR-T细胞响应于CD22表达的靶细胞的特异性扩增，其中1ug36-BBz CAR构建体相对于其他测试构建体显示出最大的活性。

图11描绘了CAR-T抗原特异性靶细胞生长抑制测定的结果，该测定使用用以上描述生成的不同的CD22-单结构域抗体或对照(FMC63)CAR构建体转导的供体血液来源的T-细胞进行。模拟是指暴露于类似治疗条件的没有CAR表达的未修饰的供体来源的T-细胞。将CAR-T细胞与CD22+靶细胞(左图-Raji，中间图-Ramos靶)或用CD22阴性靶细胞(右图-Ramos-CD22ko靶)共培养，并且经活体荧光显微镜检查。图表描绘了使用自动计数确定的红色荧光蛋白(Nuclight)标记的靶细胞的倍数扩增。结果表明，CAR-T特异性抑制CD22表达的靶细胞的生长，其中1ug36-BBz CAR构建体相对于其他测试的构建体显示出最大的活性。

图12描绘了CAR-T靶特异性连续杀伤测定的结果，该测定使用用以上描述生成的不同CD22-单结构域抗体CAR构建体转导的供体血液来源的T细胞进行。模拟是指暴露于类似治疗条件的没有CAR表达的未修饰的供体来源的T-细胞。将CAR-T或模拟-T细胞与CD22+靶细胞(上图-Ramos靶)共培养。初始攻击后6天，在新鲜培养基中细胞被分成五分之一，并且用另外的CD22+靶细胞攻击(下图–Ramos靶)。图表描绘了使用自动计数确定的红色荧光蛋白(Nuclight)标记的靶细胞的倍数扩增。结果表明，CAR-T特异性连续抑制CD22表达的靶细胞的生长，其中1ug36-BBz CAR构建体相对于其他测试构建体显示出最大的活性。

图13描绘了与由以上描述的2个独立供体生成的单结构域抗体靶向的CAR-T细胞的基准靶向CD22的scFv CAR的一致性分析和比较的结果。模拟是指在没有任何表达CAR的慢病毒的情况下暴露于类似治疗条件的供体来源的T-细胞。以一式两份孔将CAR-T细胞与CD22+靶细胞(Raji)共培养，并且经活体荧光显微镜检查。图表描绘了使用自动计数确定的红色荧光蛋白(Nuclight)标记的靶细胞(顶部图表)或绿色荧光蛋白标记的CAR细胞(底部图表)的倍数扩增。结果表明，与基准CD22-scFvCAR相似，CAR-T特异性抑制CD22+靶细胞生长和靶诱导CAR-T细胞扩增的供体内部和供体间一致性。

图14描绘了使用放射性铬(⁵¹Cr)释放测定的直接肿瘤裂解测量的结果。如以上描述的，生成了各种CD22单结构域抗体和对照CAR-T细胞。模拟是指在没有任何表达CAR的慢病毒的情况下暴露于类似治疗条件的供体来源的T细胞。在慢病毒转导后第9天，将CAR-T细胞与负载有放射性铬的CD22阳性(Raji)或CD22阴性(MCF7)靶细胞共培养。图表描绘了基于铬释放至上清液的定量，在单个效应子与靶比率下靶细胞的相对裂解。误差条描述了一式两份孔的测量值的标准偏差。结果表明，与基准CD22-scFvCAR相比，先导CD22-sdAbCAR分子的相当的直接裂解。

图15描绘了使用铬释放测定在不同效应子与靶比率下直接CAR-T细胞诱导的肿瘤裂解的结果。如以上描述生成CD22-CAR构建体1ug36连同scFv基准、M971和CD19 CAR构建FMC-63CAR-T细胞。模拟是指在没有任何表达CAR的慢病毒的情况下暴露于类似治疗条件的供体来源的T-细胞。CAR-T细胞扩增9天后，将细胞与铬负载的CD22阳性Raji或CD22阴性MCF7靶细胞以递减的效应子与靶细胞比率共培养4.5小时。基于使用闪烁计数器测量的释放的铬来计算特异性裂解。结果表明，1ug36-CAR-T细胞以剂量依赖性方式特异性裂解CD22表达的Raji靶，水平与scFV基准相似。当这些CAR构建体与CD22或CD19阴性MCF-7肿瘤细胞共培养时，未观察到相对于背景的靶细胞杀伤(模拟对照)。

图16描绘了在用携带CD22的肿瘤细胞再刺激后使用CAR-T细胞的铬释放测定的直接肿瘤裂解测量结果。如以上描述的，生成了各种CD22单结构域抗体和对照CAR-T细胞。模拟是指在没有任何表达CAR的慢病毒的情况下暴露于类似治疗条件的供体来源的T-细胞。培养CAR-T细胞直到增殖停滞(第17天)，并且然后用照射的CD22表达的Ramos细胞刺激以诱导靶特异性激活。共培养5天后，将激活的CAR-T细胞与负载有放射性铬的CD22阳性(Raji)或CD22阴性(MCF7)靶细胞以递减的效应子与靶比率混合。图表描绘了基于铬释放到上清液的定量的靶细胞的相对裂解。结果表明，相对于基准CD22-scFv CAR，具有特定CD22抗原的静息CAR-T细胞的有效再激活和先导CD22-sdAbCAR分子的相当的剂量依赖性Raji肿瘤裂解(CD22阳性)。

讨论

总的来说，这些结果例证了CD22特异性单结构域结合剂可生成强抗原驱动的T-细胞激活信号传导，这可驱动靶细胞杀伤和连续杀伤、长期肿瘤细胞生长抑制、CAR-T扩增和直接靶细胞裂解。虽然本文提供的示例性数据中鉴定了先导分子，但可用另外的CD22特异性单结构域抗体序列进行分子优化，以生成高度功能性CAR分子。此外，将多个CD22特异性单结构域抗体序列组合在单个分子中可以是增加靶特异性CAR激活活性的有效策略。

实施例4：CAR-T体内测试

简介

为进一步确认CD22结合单结构域CAR-T细胞的体外抗肿瘤作用，通过在输注CD22结合单结构域CAR-T细胞之前，将表达萤火虫荧光素酶的Ramos肿瘤细胞作为报告基因静脉内接种到NOD/SCID/IL2r-γ-链^空(null)(NSG)小鼠中，建立了异种移植模型。

材料和方法

对于体内研究，通过用编码萤火虫荧光素酶(FLUC)的慢病毒载体稳定转导野生型肿瘤系，随后使用嘌呤霉素抗性作为选择标志物选择荧光素酶阳性细胞生成表达荧光素酶的细胞系。将Ramos-FLUC保持在补充有10％热灭活胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的RPMI 1640中。所有细胞培养试剂购自Gibco。确认细胞系不存在支原体污染PCR。

6-8周龄的雌性NOD/SCID/IL2Ry^-/-(NSG)小鼠获得自杰克逊实验室(JacksonLaboratories)，并且在加拿大国家研究委员会的动物资源组饲养。在一定条件下，小鼠被安置在隔离***中无病原体的独立通风笼中。动物已经获得经过认证的啮齿动物饮食，并且经水瓶提供灭菌水。NSG小鼠缺乏成熟的T-细胞、B细胞和自然杀伤细胞；因此，它们比nu/nu小鼠更好用于研究。八周龄的NSG小鼠经尾静脉静脉内注射5x10⁴ Ramos-FLUC细胞的100μL HBSS。在肿瘤细胞注射后第4天，小鼠经眼眶后静脉内注射CD22靶向的单结构域CAR-T细胞、CD19靶向的CAR-T细胞，其中靶向结构域类似于临床上验证的CD19 CAR构建体Kymriah和Yescarta或没有CAR表达的模拟CAR-T细胞。通过生物荧光(IVIS成像仪；PerkinElmer)监测小鼠的肿瘤生长，并且每周一次收集血液以监测循环CAR-T细胞和肿瘤细胞。每天监测小鼠的疾病迹象，并且如果它们达到预先指定的人道终点，包括但不限于研究中心动物护理委员会(Animal Care Committee of the Research Center)批准的后肢麻痹、呼吸窘迫或20％体重减轻，则立即处死。

将来自小鼠的血液样品在PBS/0.1％ BSA中洗涤并且重悬浮于50μl BrilliantBuffer(BD Biosciences,USA)。使用以下针对下述抗体荧光团缀合物(均来自BDBiosciences,USA，除非另有说明)染色细胞：hCD45-APC-H7、hCD45RA-BV650、hCD45RO-PE-CF594、hCD27-BUV737、hCCR7-PE、hCD4-BUV395和hCD8-PerCP-Cy5.5。

CD45是在所有造血细胞上表达的调节src家族激酶的蛋白质酪氨酸磷酸酶。因此，使用抗人CD45抗体检测小鼠的人造血细胞。CD45可以通过包括细胞外结构域的外显子的可替代剪接表达为几种同种型之一；各种同种型的表达指示T细胞分化状态。CD45RA在幼稚T-细胞以及CD4和CD8二者的效应细胞上表达。抗原经历后，中央和效应记忆T-细胞获得CD45RO表达并且失去CD45RA表达。因此，使用针对人CD45RA和CD45RO的抗体来区分幼稚和记忆T细胞群体。可以通过添加第二标志物来实现中央和效应记忆群体之间以及幼稚和效应群体之间的区分。有几种标志物已用于该目的，并且这些标志物倾向于在分化途径的略微不同阶段标记这些群体，这种分化途径被认为发生在T-细胞中，因为它们从中央记忆细胞改变为效应记忆细胞。趋化因子受体CCR7在这两个群体之间区分，并且因此在该研究中为该目，使用了针对人CCR7的抗体。用质粒中并入的GFP检测CAR表达。为了评估耗尽，应用了直接针对hPD-1-BV421的抗体(BioLegend,USA)。用针对hCD25-PE-Cy7和hCD69-BV786的荧光标记的抗体检测T细胞激活。对于体内研究，使用小鼠CD45-BV711门控小鼠细胞，并且经抗人CD19-BUV496抗体使用人CD19表达鉴定白血病细胞。在4℃黑暗中，样品孵育30分钟。然后，通过添加RBC裂解缓冲液(Sigma-Aldrich,USA)裂解血液。将样品短暂地混合以重悬浮细胞并且在室温孵育10分钟。然后，将细胞在PBS/0.1％ BSA中洗涤并且重悬浮于PBS/0.1％ BSA中。在BD Fortessa细胞计数器(BD Biosciences)上获取数据。UltraComp^TMeBeads(eBiosciences,USA)用于补偿。使用FlowJo软件(FloJ,USA)进行分析。

使用IVIS Lumina III成像***(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)进行体内生物发光成像以监测小鼠的肿瘤生长。在重复的基础上，使用异氟烷(3.0％诱导和减少至2.0％维持)麻醉小鼠并且去除毛发。在时间0，给小鼠皮下注射150mg/kg Redi-Ject D-Luciferin(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)。然后，在维持麻醉下将动物转移到成像***，并且在D-荧光素后20min使用开放式过滤器成像，以允许D-荧光素均匀分布且达到信号趋于平稳。为了计算来自图像的荧光素酶基因表达的相对量，利用Living Image Software(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)来计算总辐射率(radiance)，表示为在全身感兴趣区域(ROI)中每秒每平方厘米每球面度的光子数(p/s/cm2/sr)。

结果

图17描绘了该体内模型的实验方案的示意图。为了评估异种模型中CD22结合单结构域CAR-T的活性，在第0天，使8周龄的NOD/SCID小鼠静脉内接种50,000个Ramos-FLUC细胞，并且随后在第4天通过眼眶后注射1x10⁷ CD22靶向的单结构域-CAR-T(1ug13或1ug36)、FMC63-CAR-T(靶向CD19的CAR-T，使用与临床上验证的CAR构建体中使用相同的抗原结合结构域)或不具有CAR表达的模拟T-细胞进行治疗。通过生物发光体内成像成像小鼠，并且每周从小鼠收集血液。

图18描绘了接种Ramos-Luc随后各种CAR-T细胞治疗的NSG小鼠的存活分析结果。模拟是指在没有任何表达CAR的慢病毒的情况下暴露于类似治疗条件的供体来源的T-细胞。如以上描述的设置动物实验。图表描绘了研究中小鼠的存活天数。结果表明，与用FMC63和模拟T细胞治疗的小鼠相比，在用靶向CD22的单结构域抗体1ug13和1ug36 CAR-T细胞治疗的小鼠中观察到的存活延长。

图19描绘了接种Ramos-FLUC并且用各种CAR-T细胞治疗的小鼠中的肿瘤负荷结果。通过使用IVIS Lumina III定量生物发光来监测小鼠的肿瘤负荷。图表描绘了在注射肿瘤细胞后第18天每个治疗组(黑圈)内个体动物的总通量(光子/秒)和每组的平均总通量(水平条；来自所有组的小鼠存活的最终实验时间点。与接受模拟T细胞的小鼠相比，用1ug36 CAR-T细胞或FMC63 CAR-T细胞治疗的小鼠的肿瘤负荷显著降低(分别为p<0.001和p＝0.0004)。

图20描绘了接种Ramos-FLUC并且用各种CAR-T细胞治疗的小鼠外周血中肿瘤负荷、总CAR-T细胞群和循环CAR-T细胞群差异表型的结果。在肿瘤细胞攻击后第23天收集血液，裂解红细胞并且用如以上描述的各种荧光缀合的抗体染色剩余细胞。左图描绘了经流式细胞术分析的每100万个总血细胞事件中人CD19+白血病细胞的数量。中间图描述了通过流式细胞术分析的每100万个血细胞中检测到的CD45+/GFP+CAR-T细胞的数量。右图描绘了基于T细胞表面标志物CD45RA和CCR7表达的模拟T-细胞组中门控的CAR-T细胞或非门控的CD45+细胞的分化状态。总的来说，结果表明，用1ug36-sdAb靶向的CAR-T细胞治疗的小鼠的白血病负担总体减少，用CAR-T治疗的所有组中CAR-T细胞扩增以及在治疗小鼠中显示出明显的扩增，以及有利于用sdCD22 CAR-T细胞治疗的组中更多的中央记忆T细胞的平衡的分化特征。

讨论

NSG小鼠被广泛用于研究人免疫***与癌症之间的相互作用，一种在人免疫细胞和人肿瘤的背景下评估免疫治疗的实用平台。总的来说，这些结果清楚地表明了在体内靶向CD22的单结构域CAR修饰的T-细胞的抗白血病活性，与体外相似，并且表明了靶向CD22的单结构域CAR-T细胞的功效与CD19(FMC63)-CAR-T细胞类似或更好，其已经在临床上表现出临床应答。

实施例5：双特异性T-细胞衔接器构建体

简介

与嵌合抗原受体技术类似，新型抗原结合元件也可连接至CD3衔接抗体元件，以生成可同时结合T细胞和细胞靶分子的可溶性分子，从而导致抗原特异性T细胞激活信号。这种类型的分子，称为双特异性T细胞衔接器，以兰妥莫单抗(Blinatumomab)为例，其中单个分子同时衔接人CD19和人CD3；用作CD19表达的B细胞家族恶性肿瘤的治疗。为了评估本文生成的人CD22特异性单结构域抗体是否可用于这种双特异性T细胞衔接器分子，生成了这样的分子：其中分子的一端包括CD22特异性单结构域抗体序列，另一端包括CD3衔接器分子。然后，筛选这些新型双特异性T细胞衔接器，用于非特异性和抗原特异性诱导T细胞激活和T细胞杀伤靶细胞。

材料和方法

将单结构域抗体抗原结合序列转移到质粒骨架内的模块化双特异性T细胞衔接器DNA序列[SEQ ID NO:119]；使用的DNA序列含有限制位点以允许有效重组，其中抗原结合结构域可用新型CD22-抗原结合结构域(ABD)序列替换。使用的特定双特异性T细胞衔接器设计如下：人CD28信号肽[SEQ ID NO:110]、VHH抗体(ABD)(SEQ ID NO:82至108中的任何一个)、柔性连接体结构域[SEQ ID NO:111]、人CD8铰链结构域[SEQ ID NO:112]、短柔性连接体结构域[SEQ ID NO:118]以及CD3特异性单链可变片段序列。提供了CD22-CD3双特异性T-细胞衔接器分子模型(图21)。使用金门组装(golden gate assembly)生成构建体，并且在进行下游测试之前使用Sanger测序进行确认。

为了生成纯化的蛋白质形式的双特异性T细胞衔接器分子，使用聚乙烯亚胺经由标准方法将含有各种构建体的质粒DNA转染到HEK293T细胞中。将转染的细胞放置于细胞培养物中，并且在几天内收集上清液。然后，通过将上清液直接放置在单独Jurkat细胞上或与CD22阳性(Ramos)或CD22阴性(U87vIII)靶细胞共培养并且在标准条件下孵育过夜，测试上清液的双特异性T细胞衔接器活性。然后，使用针对人CD69标志物的抗体染色和流式细胞术分析检查Jurkat细胞的T细胞激活(图24)。结果表明，当在溶液中递送时，CD22-sdAb靶向的双特异性T细胞衔接器可诱导靶依赖性T细胞激活，不同构建体之间具有不同的活性。

为了测试这些结果是否扩增到在原代人T细胞中诱导特异性抗肿瘤应答，将含有以上生成的上清液的新型双特异性T细胞衔接器用于以原代T细胞的测定中。具体地，T细胞从人供体血液中分离，并且多克隆扩增10天。多克隆扩增后，在含有各种双特异性T细胞衔接器的上清液或对照上清液(模拟)存在的情况下，将T细胞与表达CD22表达的靶细胞(Ramos)的稳定荧光蛋白质(Nuclight；Sartorius,USA)共培养。然后，使用IncuCyte(Sartorius,USA)活体显微镜设备监测共培养物的靶细胞生长。使用荧光标记的靶细胞的自动细胞计数，在3天内定量靶细胞的相对生长(图25)。结果表明，含有双特异性T细胞衔接器分子的CD22-sdAb可以针对CD22表达的靶细胞重新靶向溶细胞人T细胞应答。

结果

图21描绘了CD22特异性单结构域抗体双特异性T细胞衔接器蛋白的分子结构；在DNA构建体的5’端具有CD22-sdAb序列，随后是可以具有不同组成的连接体序列，随后是CD3特异性单链可变片段。

图22描绘了Jurkat细胞双特异性T细胞衔接器激活活性测定的结果，其中将含有各种双特异性T细胞衔接器分子的HEK293T上清液放置于含有Jurkat细胞和CD22阳性(Ramos)或CD22阴性(U87vIII)靶细胞的共培养物上方。图表描绘了通过流式细胞术测量的Jurkat细胞的平均CD69特异性抗体染色。误差条表示2个重复(duplicate)共培养孔的平均值的标准误差。结果表明，在存在新型CD22-sdAb双特异性T细胞衔接器分子的情况下，CD22抗原特异性激活T-细胞。

图23描绘了使用与CD22阳性靶细胞(Ramos)共培养的原代人T细胞的双特异性T细胞衔接器活性测定结果。如以上描述的，在含有上清液的对照(模拟)或CD22特异性双特异性T细胞衔接器存在的情况下，将供体血液来源的T细胞与荧光标记的靶细胞共培养，并且在3天内经活体荧光显微镜每小时检查。图表描绘了使用自动细胞计数确定的荧光标记的靶细胞的倍数生长。误差条表示2个重复共培养孔的平均值的标准误差。结果表明，在存在CD22-sdAb靶向的双特异性T细胞衔接器分子的情况下T细胞介导的肿瘤生长抑制。

值得注意，这种具有包括SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112(人CD8铰链结构域)和SEQ ID NO:118的扩增连接体的构建体展示出比仅包括较短的G4S连接体的类似构建体更高的活性(数据未显示)。

讨论

总的来说，这些结果例证了当在双特异性T细胞衔接器分子中结合时，CD22特异性单结构域结合剂可以生成强抗原驱动的T细胞激活信号传导。表明CD22-sdAb靶向的双特异性T细胞衔接器分子驱动靶特异性T-细胞激活并通过原代人T-细胞直接进行靶细胞杀伤。虽然为2个CD22特异性单结构域抗体提供了示例性数据，但该数据表明另外的高亲和力CD22结合剂可能具有相似的活性。此外，可以进行分子优化以进一步增加双特异性T细胞衔接器分子的功能。此外，将多个CD22特异性单结构域抗体序列组合在单个分子中可以是增加靶特异性激活活性的有效策略。

实施例6：CAR-T构建体的体内研究

对接种1x10⁵ Ramos-Luc肿瘤细胞，随后用2.5x10⁶ sdCD22(1ug13或1ug36)或基准scFvCD22 CAR-T细胞治疗的NSG小鼠研究了循环CAR-T细胞的存活分析和测量。模拟是指在没有任何表达CAR的慢病毒的情况下暴露于类似治疗条件的供体来源的T-细胞。没有Tx小鼠接受赋形剂(vehicle)(汉克平衡盐溶液)。

图24是治疗和测试的图。

图25描绘了小鼠的存活率。

图26描绘了在小鼠外周血中计数的CAR-T细胞。

结果表明，与模拟T细胞治疗的或未治疗的那些小鼠相比，在用CD22-CAR-T细胞治疗的小鼠中观察到CAR-T细胞的存活率和持久性(persistence)延长。与基准scFvCAR-T或sdCD22-1ug13 CAR-T相比，用sdCD22-1ug36 CAR-T细胞治疗的小鼠显示出循环CAR-T细胞的存活率和增殖/持久性增强。

还研究了接种0.5x10⁵ Ramos-Luc肿瘤细胞，随后用不同剂量的sdCD22-1ug36CAR-T或基准scFvCD22-m971CAR-T细胞治疗的NSG小鼠的存活分析和肿瘤生长动力学。模拟是指在没有任何表达CAR的慢病毒的情况下暴露于类似处理条件的供体来源的T细胞。没有Tx小鼠接受赋形剂(汉克平衡盐溶液)。

图27描绘了在第一次肿瘤攻击和CAR-T治疗后小鼠的存活率。相对于接受模拟T细胞或赋形剂对照的小鼠，用CAR-T治疗的小鼠的存活时间具有剂量依赖性增加。超过50％的用最高剂量的CAR-T细胞治疗的小鼠长期存活，并且在用0.5x10⁵ Ramos-Luc肿瘤细胞第一次肿瘤攻击后第88天再次攻击，并且监测存活和肿瘤生长。

图28描述了在再次攻击后小鼠的存活率。未治疗(赋形剂对照)的动物全部死于疾病，而所有(sdCD22-1ug36)或大多数(基准scFvCD22-m971)的CAR-T治疗的小鼠在第二次肿瘤攻击中存活。

图29描绘了攻击后肿瘤生长的图。未治疗的对照小鼠都出现肿瘤，而用CAR-T治疗的小鼠能够拒绝再次攻击，表明了CAR-T细胞的长期持久性以及抗肿瘤应答的持续性(durability)。

实施例7：双互补位和多互补位CAR构建体

图30描绘了含有多结合剂结构域的CD22特异性CAR分子的分子结构，其含有(左)N-末端CD22-sdAb序列，随后连接体序列，该连接体序列之后(中间)可以是相同的sdAb结合剂序列或(右)不同的sdAb结合剂序列的另一个拷贝。这可导致更高亲和力和/或更高活性的CAR分子。

图31描绘了CAR-Jurkat测定的结果，其中Jurkat细胞用不同的CAR质粒(编码单结合剂和多结合剂)瞬时地电穿孔并且单独培养或与CD22阳性(Ramos)靶细胞系共培养。

图32描绘了使用已经用编码含有多sdAb的CAR构建体的慢病毒载体转导的原代人血源性T细胞的类似CAR激活研究的结果。这些数据表明，含有多CD22 sdAb的CAR分子可以显示出对CD22表达的靶细胞更高的分子应答性。

图33描绘了CD22特异性CAR(左)、BCMA特异性CAR(右)或串联-CD22-BCMA-CAR分子(中间)的分子结构。串联构建体将含有N-末端CD22-sdAb序列，随后连接序列，该连接序列可以是另一抗原特异性sdAb，比如本文显示的靶向BCMA的连接序列。

图34描绘了CAR-Jurkat测定的结果，其中Jurkat细胞用不同的CD22、BCMA或CD22/BCMA特异性CAR质粒瞬时地电穿孔，并且单独培养或与BCMA+/CD22+(Ramos)、BCMAlow/CD22+(NALM6)或BCMA+/CD22-(Ramos-CD22ko)靶细胞系共培养，并且检查激活状态(CD69表达)。这些数据表明，含有多CD22 sdAb的CAR分子可以维持对两种靶抗原的应答性，并且增强对低抗原靶细胞的应答性。

实施例的讨论

这是单结构域抗体在CD22靶向的CAR-T治疗中应用的首次证明。相对于通常用于CAR构建体的抗原识别域的单链可变片段抗体，单结构域抗体提供显著优势，包括显著更小的尺寸、与人抗体序列更高的同源性、增强的模块化以及靶向不可接近scFvs的表位的能力。本发明后续可与CD20、CD19或BCMA靶向的单结构域抗体组合，以生成靶向多种B细胞特异性抗原的单个CAR构建体。

在前面的描述中，为了解释的目的，陈述了许多细节以提供对实施方式的透彻理解。然而，对于本领域的技术人员来说显而易见的是不需要这些具体细节。

以上描述的实施方式仅旨在作为示例。本领域技术人员可以对特定实施方式进行改变、修改和变化。权利要求的范围不应受本文陈述的特定实施方式的限制，而应以与整个说明书一致的方式来解释。

参考文献

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本文提及的所有参考文献均通过引用以其整体明确并入。

表8：序列的表

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序列表

<110> 加拿大国家研究委员会

<120> 抗CD22单结构域抗体和治疗性构建体

<130> PAT 108623W-90

<140> 还未收到

<141> 2021-07-26

<150> 63/058,203

<151> 2020-07-29

<160> 139

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

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<400> 2

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-6 CDR3

<400> 3

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

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1 5

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<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<220>

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1 5

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<211> 8

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<213> 人工序列

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<223> hCD221ug-61 CDR3

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<211> 8

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<213> 人工序列

<220>

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<400> 20

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1 5

<210> 21

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-74 CDR3

<400> 21

Ala Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Tyr Arg Tyr Thr Cys Pro

1 5 10 15

Val Asp Phe Gly Ser

20

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 23

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-75 CDR3

<400> 24

Asn Ala Lys Tyr Gly Arg Asp Glu Tyr

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 25

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<211> 7

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<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-77 CDR2

<400> 26

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<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-77 CDR3

<400> 27

Asn Ala Lys Trp Gly Gln Tyr Glu Tyr

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-80 CDR2

<400> 29

Ile Thr Ser Asp Gly Val Thr

1 5

<210> 30

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-80 CDR3

<400> 30

Ala Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Ile Gln Tyr Thr Cys Pro

1 5 10 15

Val Asp Phe Asp Ser

20

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-87 CDR1

<400> 31

Gly Ser Ile Phe Arg Ile Ala Val

1 5

<210> 32

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-87 CDR2

<400> 32

Ile Thr Ser Gly Gly Glu Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-87 CDR3

<400> 33

Asn Ala Lys Trp Gly Arg Asp Glu Tyr

1 5

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-93 CDR1

<400> 34

Gly Ser Thr Phe Ser Ser Ser Val

1 5

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-93 CDR2

<400> 35

Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-93 CDR3

<400> 36

Asn Ala Gln Tyr Gly Arg Arg Ser Asp

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22100ng-2 CDR1

<400> 37

Gly Val Thr Phe Asp Tyr Tyr Val

1 5

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22100ng-2 CDR2

<400> 38

Met Arg Asn Ser Asp Gly Val Thr

1 5

<210> 39

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22100ng-2 CDR3

<400> 39

Ala Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Asn Tyr Tyr Thr Cys Pro

1 5 10 15

Val Asp Phe Asp Ser

20

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22100ng-62 CDR1

<400> 40

Gly Ser Ile Ser Ser Ile Asn Ala

1 5

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22100ng-62 CDR2

<400> 41

Ile Thr Thr Ala Gly Asn Thr

1 5

<210> 42

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22100ng-62 CDR3

<400> 42

Ala Gly Lys Leu Tyr Val Asn Lys Glu Tyr Thr Tyr

1 5 10

<210> 43

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22100ng-66 CDR1

<400> 43

Gly Phe Ser Leu Asp Tyr Tyr Val

1 5

<210> 44

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22100ng-66 CDR2

<400> 44

Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ala Thr

1 5

<210> 45

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22100ng-66 CDR3

<400> 45

Ala Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Tyr Thr Cys Pro

1 5 10 15

Val Asp Phe Gly Ser

20

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-10 CDR1

<400> 46

Gly Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr Ala

1 5

<210> 47

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-10 CDR2

<400> 47

Ile Ser Ser Ser Asp Gly Val Thr

1 5

<210> 48

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-10 CDR3

<400> 48

Ala Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr Thr Cys Pro

1 5 10 15

Val Asp Phe Asp Ser

20

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-16 CDR1

<400> 49

Gly Ser Thr Phe Ser Leu Lys Ala

1 5

<210> 50

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-16 CDR2

<400> 50

Ile Asn Ser Asp Gly Ser Tyr Thr

1 5

<210> 51

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-16 CDR3

<400> 51

Asn Thr Met Pro Pro Trp Pro

1 5

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-23 CDR1

<400> 52

Gly Ser Ile Phe Arg Ile Thr Ala Val

1 5

<210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-23 CDR2

<400> 53

Ile Thr Ser Ala Gly Glu Thr

1 5

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-23 CDR3

<400> 54

Asn Ala Lys Trp Gly Gln Tyr Glu His

1 5

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-24 CDR1

<400> 55

Gly Ile Thr Ser Ser Ile Asn Ser

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-24 CDR2

<400> 56

Ile Gly Arg Gly Gly Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 57

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-24 CDR3

<400> 57

Leu Glu Val Thr Thr Asp Leu Ser Ser Tyr

1 5 10

<210> 58

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-32 CDR1

<400> 58

Gly Arg Ile Phe Arg Ser Tyr Val

1 5

<210> 59

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-32 CDR2

<400> 59

Ile Gly Trp Ser Asp Thr

1 5

<210> 60

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-32 CDR3

<400> 60

Ala Ala Asn Ser Pro Pro Tyr Gly Pro Gln Arg Asp Glu Phe Gly Tyr

1 5 10 15

<210> 61

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-33 CDR1

<400> 61

Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr Val

1 5

<210> 62

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-33 CDR2

<400> 62

Ile Ser Ser Ser Asp Gly Val Thr

1 5

<210> 63

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-33 CDR3

<400> 63

Ala Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr Thr Cys Pro

1 5 10 15

Val Asp Phe Asp Ser

20

<210> 64

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-48 CDR1

<400> 64

Gly Ser Ile Phe Arg Ile Ala Val

1 5

<210> 65

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-48 CDR2

<400> 65

Ile Thr Ile Ala Gly Glu Thr

1 5

<210> 66

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-48 CDR3

<400> 66

Tyr Ala Asn Gly Gly Arg Asp Glu Tyr

1 5

<210> 67

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-55 CDR1

<400> 67

Gly Arg Ile Ser Arg Ser Tyr Val

1 5

<210> 68

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-55 CDR2

<400> 68

Ile Gly Cys Ser Asp Thr

1 5

<210> 69

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-55 CDR3

<400> 69

Ala Glu Tyr Ser Pro Pro Tyr Gly Pro Gln Arg Asp Glu Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 70

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-64 CDR1

<400> 70

Gly Ser Thr Phe Ser Leu Asn Thr

1 5

<210> 71

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-64 CDR2

<400> 71

Ala Ser Ser Asp Gly Tyr Thr

1 5

<210> 72

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-64 CDR3

<400> 72

Thr Trp Gly Thr Gly Arg Phe Ala Asp Tyr Ile Tyr

1 5 10

<210> 73

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-72 CDR1

<400> 73

Gly Gly Thr Phe Ser Val Tyr Thr

1 5

<210> 74

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-72 CDR2

<400> 74

Ile Arg Gly Ser Gly Gly Thr

1 5

<210> 75

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-72 CDR3

<400> 75

Ala Val Arg Ile Arg Arg Thr Leu Val Glu Pro Leu Thr Lys Glu Thr

1 5 10 15

Leu Tyr Asp Tyr

20

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-79 CDR1

<400> 76

Gly Arg Thr Ser Ser Val Tyr Gly

1 5

<210> 77

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-79 CDR2

<400> 77

Met Ser Trp Ser Gly Gly Pro Thr

1 5

<210> 78

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-79 CDR3

<400> 78

Ala Val Arg Ile Arg Arg Thr Leu Leu Glu Pro Leu Thr Lys Glu Thr

1 5 10 15

Leu Tyr Asp Tyr

20

<210> 79

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-82 CDR1

<400> 79

Gly Ser Ile Phe Arg Ile Thr Val

1 5

<210> 80

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-82 CDR2

<400> 80

Ile Thr Ser Gly Gly Asp Ser

1 5

<210> 81

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-82 CDR3

<400> 81

Asn Ala Lys Trp Gly Gly Asp Glu Tyr

1 5

<210> 82

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-6 VHH

<400> 82

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Tyr Tyr Tyr Thr Cys Pro

100 105 110

Val Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 83

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-10 VHH

<400> 83

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Ser Cys Thr Ala Ser Glu Ser Thr Phe Ser Ile Met

20 25 30

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Met Val Ala

35 40 45

Val Ile Asn Ser Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala Glu Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Leu Ala Lys Lys Thr Val Ser Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 84

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-13 VHH

<400> 84

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Phe Ser Ser Val

20 25 30

Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Trp Ser Ser Pro Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Gly Arg Thr Gly Arg Gly Thr Ser Ala Asp Thr Asp Glu Tyr

100 105 110

Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 85

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-14 VHH

<400> 85

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Ile Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Val Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Arg Ile Gly Trp Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

85 90 95

Asn Ser Pro Pro Tyr Gly Pro Gln Arg Asp Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 86

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-36 VHH

<400> 86

Glu Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Arg Ala

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val

35 40 45

Ala Val Val Asn Ser Asp Ser Ser Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp

85 90 95

Ser Pro Gly Phe Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 87

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-61 VHH

<400> 87

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Met Ser Ser Phe Ser Gln Tyr

20 25 30

Val Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ser Tyr Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ile Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Gln Tyr Gly Ser Thr Phe Ile Arg Asn His Trp Asp Asp Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 88

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-74 VHH

<400> 88

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val

35 40 45

Ser Cys Met Gly Ser Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Tyr Arg Tyr Thr Cys Pro

100 105 110

Val Asp Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 89

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-75 VHH

<400> 89

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ile Ala

20 25 30

Val Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Val Ile Thr Ser Gly Gly Asp Thr His Tyr Ala Ala Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Lys Tyr Gly Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 90

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-77 VHH

<400> 90

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Asp Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ile Ala

20 25 30

Val Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Val Ile Thr Ser Gly Gly Glu Thr His Tyr Ala Ala Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Gln Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 91

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-80 VHH

<400> 91

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Phe Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Val Met Val Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val

35 40 45

Ser Cys Ile Thr Ser Asp Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Arg Val Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Ile Gln Tyr Thr Cys Pro Val

100 105 110

Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Ala Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 92

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-87 VHH

<400> 92

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Asp Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ile Ala

20 25 30

Val Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Val Ile Thr Ser Gly Gly Glu Thr His Tyr Ala Ala Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 93

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-93 VHH

<400> 93

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Val Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Val Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asn Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Gln Tyr Gly Arg Arg Ser Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 94

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22100ng-2 VHH

<400> 94

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Val Thr Phe Asp Tyr Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val

35 40 45

Ser Cys Met Arg Asn Ser Asp Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Asn Tyr Tyr Thr Cys Pro

100 105 110

Val Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 95

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22100ng-62 VHH

<400> 95

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Ser Ile Asn

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ile Ile Thr Thr Ala Gly Asn Thr Arg Tyr Gly Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Lys Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Gly Lys Leu Tyr Val Asn Lys Glu Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 96

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22100ng-66 VHH

<400> 96

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Tyr Thr Cys Pro

100 105 110

Val Asp Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 97

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-10 VHH

<400> 97

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr Thr Cys Pro

100 105 110

Val Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 98

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-16 VHH

<400> 98

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Leu Lys

20 25 30

Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Arg Val

35 40 45

Gly Val Ile Asn Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Thr Asp Ala Ala Ser Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Thr Met Pro Pro Trp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 99

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-23 VHH

<400> 99

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ile Thr

20 25 30

Ala Val Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu

35 40 45

Val Ala Val Ile Thr Ser Ala Gly Glu Thr His Tyr Ala Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Lys Trp Gly Gln Tyr Glu His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Gly

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 100

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-24 VHH

<400> 100

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Ile Thr Ser Ser Ile Asn

20 25 30

Ser Met Gly Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ser Ile Gly Arg Gly Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Gly Lys Gly Arg Phe Leu Ile Ser Arg Asp Asn Asn Lys Asn Ile Leu

65 70 75 80

Phe Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr

85 90 95

Cys Leu Glu Val Thr Thr Asp Leu Ser Ser Tyr Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 101

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-32 VHH

<400> 101

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Ile Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Val Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Arg Ile Gly Trp Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

85 90 95

Asn Ser Pro Pro Tyr Gly Pro Gln Arg Asp Glu Phe Gly Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 102

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-33 VHH

<400> 102

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr Thr Cys Pro Val

100 105 110

Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 103

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-48 VHH

<400> 103

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ala Val Arg Leu Ser Cys Ala Asp Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ile Ala

20 25 30

Val Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Val Ile Thr Ile Ala Gly Glu Thr His Tyr Ala Tyr Ser Val Lys

50 55 60

Gly Gln Phe Thr Ile Ser Arg Tyr Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr

85 90 95

Ala Asn Gly Gly Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 104

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-55 VHH

<400> 104

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ser Tyr

20 25 30

Val Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Arg Ile Gly Cys Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Asp Asn Thr Val Asp Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Glu

85 90 95

Tyr Ser Pro Pro Tyr Gly Pro Gln Arg Asp Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 105

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-64 VHH

<400> 105

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Leu Asn

20 25 30

Thr Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gln Arg Glu Tyr Val

35 40 45

Ala Ala Ala Ser Ser Asp Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Arg

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Trp Gly Thr Gly Arg Phe Ala Asp Tyr Ile Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 106

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-72 VHH

<400> 106

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Val Tyr

20 25 30

Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Arg Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Val Arg Ile Arg Arg Thr Leu Val Glu Pro Leu Thr Lys Glu Thr Leu

100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 107

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-79 VHH

<400> 107

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Arg Thr Ser Ser Val Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Met Ser Trp Ser Gly Gly Pro Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Gly Ser Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Arg Ile Arg Arg Thr Leu Leu Glu Pro Leu Thr Lys Glu Thr

100 105 110

Leu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 108

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-82 VHH

<400> 108

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ile Thr

20 25 30

Val Met Asn Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Ser

35 40 45

Gly Val Ile Thr Ser Gly Gly Asp Ser His Tyr Ala Ala Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Tyr Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Asp Tyr Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Gly Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr His Asp Thr

100 105 110

Gly Ser Ser

115

<210> 109

<211> 1675

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CAR构建体

<220>

<221> 混合_特征

<222> (62)..(63)

<223> 这些位置之间***的VHH sdAb

<400> 109

atgctcaggc tgctcttggc tctcaactta ttcccttcaa ttcaagtaac aggagggtct 60

tcgaagactt cctttgcgag acgacggtgg cgggggatca ggtggtggag gtagcggggg 120

agggggctca ggcggtacaa ctacgcctgc acctcgccca ccgaccccag caccaaccat 180

cgcttcacag cctttgagcc tgcgaccaga ggcatgtcgc cctgctgcgg gcggtgccgt 240

tcatactcgc ggacttgatt ttgcgtgtga cgtcgtctcg ccttctaagc ccttttgggt 300

gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat 360

tattttctgg gtgaggaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt 420

tatgcgacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga 480

agaagaagga ggatgtgaac tgctgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc 540

gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta 600

cgatgttttg gacaagcgac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgcagagaag 660

gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta 720

cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca 780

gggactcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc 840

tcgcgctagc gccacgaact tctctctgtt aaagcaagca ggcgacgtgg aagaaaaccc 900

cggtcccatg gtgagcaagg gcgaggagga caacatggcc agcctgcccg ccacccacga 960

gctgcacatc ttcggcagca tcaacggcgt ggacttcgac atggtgggcc agggcaccgg 1020

caaccccaac gacggctacg aggagctgaa cctgaagagc accaagggcg acctgcagtt 1080

cagcccctgg attctggtgc cccacatcgg ctacggcttc caccagtacc tgccctaccc 1140

cgacggcatg agccccttcc aggccgccat ggtggacggc agcggctacc aggtgcacag 1200

gaccatgcag ttcgaggacg gcgccagcct gaccgtgaac tacaggtaca cctacgaggg 1260

cagccacatc aagggcgagg cccaggtgaa gggcaccggc ttccccgccg acggccccgt 1320

gatgaccaac agcctgaccg ccgccgactg gtgcaggagc aaaaagacct accccaacga 1380

caagaccatc atcagcacct tcaagtggag ctacaccacc ggcaacggca agaggtacag 1440

gagcaccgcc aggaccacct acaccttcgc caagcccatg gccgccaact acctgaagaa 1500

ccagcccatg tacgtgttca gaaagaccga gctgaagcac agcaagaccg agctgaactt 1560

caaggagtgg cagaaggcct tcaccgacgt gatgggcatg gacgagctgt acaagcccaa 1620

gaagaagagg aaggtggagg acccccccgc cgccaagagg gtgaagctgg actaa 1675

<210> 110

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人CD28信号肽

<400> 110

Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val

1 5 10 15

Thr Gly

<210> 111

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成柔性连接体

<400> 111

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly

<210> 112

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人CD8铰链结构域

<400> 112

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 113

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人CD28跨膜结构域

<400> 113

Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala

1 5 10 15

Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg

20 25 30

<210> 114

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人4-1BB共刺激结构域

<400> 114

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 115

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人CD3ζ 信号传导结构域

<400> 115

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

1 5 10 15

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

20 25 30

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

35 40 45

Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

50 55 60

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

65 70 75 80

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

85 90 95

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

100 105 110

Pro Arg

<210> 116

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> M971 scFV

<400> 116

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

130 135 140

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser

145 150 155 160

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu

165 170 175

Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

180 185 190

Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

195 200 205

Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro

210 215 220

Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 117

<211> 267

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMC63 scFV

<400> 117

Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr

1 5 10 15

Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu

165 170 175

Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser

195 200 205

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

210 215 220

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

260 265

<210> 118

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 短的柔性连接体

<400> 118

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 119

<211> 858

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 示例性双特异性T-细胞衔接器构建体

<220>

<221> 混合_特征

<222> (72)..(73)

<223> 这些位置之间***的VHH sdAb

<400> 119

atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtaca 60

ggagggtctt cggaagactt ccttggagga ggcggaagtc aagtgcagtt gcaacaacca 120

ggtgccgagc ttgggaaacc gggtaccagc gttaaactct cttgcaaagc atccggttat 180

acctttactt cttactggat ccattgggtc aaacaacgcc caggccaggg tctcgaatgg 240

gtgggcaaca tcaacccaaa cagcggctct atcaattata acgaaaagtt taagaataaa 300

gcaactctca cggtggataa gagcagctca accgcttata tgcaattgag tactttgacc 360

agtgaagatt tcgctgtgta ttattgcacg cgcgatacat ccggacagta ttatttcgat 420

tattggggcc aggggacaac cctgacagtg tctagcggcg gtggtgggtc aggcggcggt 480

gggagcggag gaggtggaag cgatatcgta atgagtcaat cccctagcag cttggcggta 540

agtgctgggg aacgcgttac aatgtcctgt aagagctctc aatctttgct gaattccagg 600

actaggaaga attatctggc ctggtatcaa caaaagcccg gacaaagtcc aaagctcctg 660

atttattggg ctagcaccag agagtcagga gtaccagacc ggtttactgg aagcgggtca 720

ggaaccgact ttaccctgac aatatccagc gtccaagcag aagatcttgc cgtgtactat 780

tgtattcagt cctaccactt gcgcactttt ggggggggaa caaaactcga gataaagcac 840

caccaccacc accactag 858

<210> 120

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-36克隆的区段

<400> 120

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Arg Ala

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val

35 40 45

Ala Val Val Asn Ser Asp Ser Ser Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp

85 90 95

Ser Pro Gly Phe Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 121

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-93克隆的区段

<400> 121

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Met Ser Ser Phe Ser Gln Tyr

20 25 30

Val Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ser Ala Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ile Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Gln Tyr Gly Ser Thr Phe Ile Arg Lys Pro Tyr Asp Thr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 122

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-10克隆的区段

<400> 122

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Ser Cys Thr Ala Ser Glu Ser Thr Phe Ser Ile Met

20 25 30

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Met Val Ala

35 40 45

Val Ile Asn Ser Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala Glu Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Leu Ala Lys Lys Thr Val Ser Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 123

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug-61克隆的区段

<400> 123

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Met Ser Ser Phe Ser Gln Tyr

20 25 30

Val Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ser Tyr Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ile Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Gln Tyr Gly Ser Thr Phe Ile Arg Asn His Trp Asp Asp Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 124

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD22pas-16克隆的区段

<400> 124

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Leu Lys

20 25 30

Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Arg Val

35 40 45

Gly Val Ile Asn Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Thr Asp Ala Ala Ser Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Thr Met Pro Pro Trp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 125

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug80

<400> 125

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Phe Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val

35 40 45

Ser Cys Ile Thr Ser Asp Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Arg Val Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Ile Gln Tyr Thr Cys Pro Val

100 105 110

Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 126

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1组 CDR1 共有

<220>

<221> 混合_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是F或V

<220>

<221> 混合_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是T或S

<220>

<221> 混合_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是L、F或S

<220>

<221> 混合_特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是Y、D或S

<220>

<221> 混合_特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是V或A

<400> 126

Gly Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Tyr Xaa

1 5

<210> 127

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1组 CDR2 共有

<220>

<221> 混合_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是I或M

<220>

<221> 混合_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是T、R或G

<220>

<221> 混合_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是S或N

<220>

<221> 混合_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是D或S

<220>

<221> 混合_特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是D或不存在

<220>

<221> 混合_特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是V或A

<400> 127

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Thr

1 5

<210> 128

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1组 CDR3 共有

<220>

<221> 混合_特征

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是I、N、Y或S

<220>

<221> 混合_特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是Q、Y、R或L

<220>

<221> 混合_特征

<222> (20)..(20)

<223> Xaa是D或G

<400> 128

Ala Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Xaa Xaa Tyr Thr Cys Pro

1 5 10 15

Val Asp Phe Xaa Ser

20

<210> 129

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2组 CDR1 共有

<220>

<221> 混合_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是I或T

<220>

<221> 混合_特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是R或不存在

<220>

<221> 混合_特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是R、S或I

<220>

<221> 混合_特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是I、S或T

<220>

<221> 混合_特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是A、S或T

<400> 129

Gly Ser Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Val

1 5

<210> 130

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2组 CDR2 共有

<220>

<221> 混合_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以为任何自然存在的氨基酸

<220>

<221> 混合_特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是G、S或A

<220>

<221> 混合_特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以为任何自然存在的氨基酸

<220>

<221> 混合_特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa E、D或S

<220>

<221> 混合_特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是T或S

<400> 130

Ile Thr Ser Xaa Gly Xaa Xaa

1 5

<210> 131

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2组 CDR3 共有

<220>

<221> 混合_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是K或Q

<220>

<221> 混合_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是W或Y

<220>

<221> 混合_特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是Q、R或G

<220>

<221> 混合_特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Y、D或R

<220>

<221> 混合_特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是E或S

<220>

<221> 混合_特征

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是Y、D或H

<400> 131

Asn Ala Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 132

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3组 CDR1 共有

<220>

<221> 混合_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是F或S

<400> 132

Gly Arg Ile Xaa Arg Ser Tyr Val

1 5

<210> 133

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3组 CDR2 共有

<220>

<221> 混合_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是W或C

<400> 133

Ile Gly Xaa Ser Asp Thr

1 5

<210> 134

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3组 CDR3 共有

<220>

<221> 混合_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是A或E

<220>

<221> 混合_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是N或Y

<220>

<221> 混合_特征

<222> (15)..(15)

<223> Xaa是G或D

<400> 134

Ala Xaa Xaa Ser Pro Pro Tyr Gly Pro Gln Arg Asp Glu Phe Xaa Tyr

1 5 10 15

<210> 135

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4组 CDR1 共有

<220>

<221> 混合_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是R或G

<220>

<221> 混合_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是S或F

<220>

<221> 混合_特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是G或T

<400> 135

Gly Xaa Thr Xaa Ser Val Tyr Xaa

1 5

<210> 136

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4组 CDR2 共有

<220>

<221> 混合_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是M或I

<220>

<221> 混合_特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是S或R

<220>

<221> 混合_特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是W或G

<220>

<221> 混合_特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是G或不存在

<220>

<221> 混合_特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是P或G

<400> 136

Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Gly Xaa Thr

1 5

<210> 137

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4组 CDR3 共有

<220>

<221> 混合_特征

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是L或V

<400> 137

Ala Val Arg Ile Arg Arg Thr Leu Xaa Glu Pro Leu Thr Lys Glu Thr

1 5 10 15

Leu Tyr Asp Tyr

20

<210> 138

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug36示例性CAR

<400> 138

atgctcaggc tgctcttggc tctcaactta ttcccttcaa ttcaagtaac aggacaggta 60

cagctggtgg agtctggggg aggcttggtg caggctgggg ggtctctgag agtctcctgt 120

gaagcctctg gaatcacgtt cagtcgcgcg gccatgggct ggtaccgcca gcgtccaggc 180

aaggagcgcg aacgagtcgc agttgttaat agtgatagca gtacaatata tgcagactcc 240

gtgaagggcc ggttcaccat ctccagagac aatgccaaga acacagtgta tctgcaaatg 300

aacagcctgg aacctgagga cacggccgtc tattactgtt ggtccccagg gttcgggtcc 360

tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtt tcctcacctt tgcgagacga cggtggcggg 420

ggatcaggtg gtggaggtag cgggggaggg ggctcaggcg gtacaactac gcctgcacct 480

cgcccaccga ccccagcacc aaccatcgct tcacagcctt tgagcctgcg accagaggca 540

tgtcgccctg ctgcgggcgg tgccgttcat actcgcggac ttgattttgc gtgtgacgtc 600

gtctcgcctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat 660

agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggaaacgggg cagaaagaaa 720

ctcctgtata tattcaaaca accatttatg cgaccagtac aaactactca agaggaagat 780

ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgct gagagtgaag 840

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 900

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agcgacgtgg ccgggaccct 960

gagatggggg gaaagccgca gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1020

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1080

ggcaaggggc acgatggcct ttaccaggga ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1140

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1170

<210> 139

<211> 699

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD221ug36示例性双特异性T-细胞衔接器

<400> 139

atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtaca 60

ggacaggtac agctggtgga gtctggggga ggcttggtgc aggctggggg gtctctgaga 120

gtctcctgtg aagcctctgg aatcacgttc agtcgcgcgg ccatgggctg gtaccgccag 180

cgtccaggca aggagcgcga acgagtcgca gttgttaata gtgatagcag tacaatatat 240

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca atgccaagaa cacagtgtat 300

ctgcaaatga acagcctgga acctgaggac acggccgtct attactgttg gtccccaggg 360

ttcgggtcct actggggcca ggggacccag gtcaccgttt cctcaccttt gcgagacgac 420

ggtggcgggg gatcaggtgg tggaggtagc gggggagggg gctcaggcgg tacaactacg 480

cctgcacctc gcccaccgac cccagcacca accatcgctt cacagccttt gagcctgcga 540

ccagaggcat gtcgccctgc tgcgggcggt gccgttcata ctcgcggact tgattttgcg 600

tgtgacgtcg tctcgcttgg aggaggcgga agtggcggtg gtgggtcagg cggcggtggg 660

agcggaggag gtggaagcca ccaccaccac caccactag 699

Claims

1.一种特异性结合至人CD22的分离的单结构域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：

a)CDR1氨基酸序列GX₁X₂X₃DX₄YX₅(SEQ ID NO:126)，其中：

X₁是F或V，

X₂是T或S，

X₃是L、F或S，

X₄是Y、D或S，和

X₅是V或A，

CDR2氨基酸序列X₆X₇X₈X₉X₁₀GX₁₁T(SEQ ID NO:127)，其中：

X₆是I或M，

X₇是T、R、G或S，

X₈是S或N，

X₉是D或S，

X₁₀是D或不存在，

X₁₁是V或A，和

CDR3氨基酸序列AVDKPFYDGGX₁₂X₁₃YTCPVDFX₁₄S(SEQ IDNO:128)，其中：

X₁₂是I、N、Y或S，

X₁₃是Q、Y、R或L，和

X₁₄是D或G；

b)CDR1氨基酸序列GSX₁F X₂X₃X₄ X₅V(SEQ ID NO:129)，其中：

X₁是I或T，

X₂是R或不存在，

X₃是R、S或I，

X₄是I、S或T，和

X₅是A、S或T，

CDR2氨基酸序列ITSX₆GX₇X₈(SEQ ID NO:130)，其中：

X₆是G、S或A，

X₇是E、D或S，

X₈是T或S，和

X₉是K或Q，

X₁₀是W或Y，

X₁₁是Q、R或G，

X₁₂是Y、D或R，

X₁₃是E或S，和

X₁₄是Y、D或H；

c)CDR1氨基酸序列GRIX₁RSYV(SEQ ID NO:132)，其中：

X₁是F或S，

CDR2氨基酸序列IGX₂SDT(SEQ ID NO:133)，其中：

X₂是W或C，和

CDR3氨基酸序列AX₃X₄SPPYGPQRDEFX₅Y(SEQ ID NO:134)，其中：

X₃是A或E，

X₄是N或Y，和

X₅是G或D；

d)CDR1氨基酸序列G X₁TX₂SVYX₃(SEQ ID NO:135)，其中：

X₁是R或G，

X₂是S或F，和

X₃是G或T，

CDR2氨基酸序列X₄X₅X₆SX₇GX₈T(SEQ ID NO:136)，其中：

X₄是M或I，

X₅是S或R，

X₆是W或G，

X₇是G或不存在，和

X₈是P或G，

CDR3氨基酸序列AVRIRRTLX₉EPLTKETLYDY(SEQ ID NO:137)，其中：

X₉是L或V；

e)SEQ ID NO:49阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:50阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:51阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-16)；

f)SEQ ID NO:4阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:5阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:6阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-10)；

g)SEQ ID NO:7阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:8阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:9阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-13)；

h)SEQ ID NO:13阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:14阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:15阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-36)；

i)SEQ ID NO:16阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:17阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:18阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-61)；

j)SEQ ID NO:40阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:41阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:42阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22100ug-62)；

k)SEQ ID NO:55阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:56陈述的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:57阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-24)；

l)SEQ ID NO:64阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:65阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:66阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-48)；或

m)SEQ ID NO:70阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:71阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:72阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-64)。

2.一种特异性结合至人CD22的分离的单结构域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：

A)

i)SEQ ID NO:1阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ IDNO:3阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-6)，

ii)SEQ ID NO:4阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:5阐释的CDR2氨基酸序列和SEQID NO:6阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-10)，

iii)SEQ ID NO:7阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8阐释的CDR2氨基酸序列和SEQID NO:9阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-13)，

iv)SEQ ID NO:10阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11阐释的CDR2氨基酸序列和SEQID NO:12阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-14)，

v)SEQ ID NO:13阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14阐释的CDR2氨基酸序列和SEQID NO:15阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-36)，

vi)SEQ ID NO:16阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:17阐释的CDR2氨基酸序列和SEQID NO:18阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-61)，

vii)SEQ ID NO:19阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:20阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:21阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-74)，

viii)SEQ ID NO:22阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:23阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:24阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-75)，

ix)SEQ ID NO:25阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:26阐释的CDR2氨基酸序列和SEQID NO:27阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-77)，

x)SEQ ID NO:28阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:29阐释的CDR2氨基酸序列和SEQID NO:30阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-80)，

xi)SEQ ID NO:31阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:32阐释的CDR2氨基酸序列和SEQID NO:33阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-87)，

xii)SEQ ID NO:34阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:35阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:36阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-93)，

xiii)SEQ ID NO:37阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:38阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:39阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22100ug-2)，

xiv)SEQ ID NO:40阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:41阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:42阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22100ug-62)，

xv)SEQ ID NO:43阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:44阐释的CDR2氨基酸序列和SEQID NO:45阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22100ug-66)，

xvi)SEQ ID NO:46阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:47阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:48阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-10)，

xvii)SEQ ID NO:49阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:50阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:51阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-16)，

xviii)SEQ ID NO:52阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:53阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:54阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-23)，

xix)SEQ ID NO:55阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:56陈述的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:57阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-24)，

xx)SEQ ID NO:58阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:59阐释的CDR2氨基酸序列和SEQID NO:60阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-32)，

xxi)SEQ ID NO:61阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:62阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:63阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-33)，

xxii)SEQ ID NO:64阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:65阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:66阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-48)，

xxiii)SEQ ID NO:67阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:68阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:69阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-55)，

xxiv)SEQ ID NO:70阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:71阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:72阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-64)，

xxv)SEQ ID NO:73阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:74阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:75阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-72)，

xxvi)SEQ ID NO:76阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:77阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:78阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-79)，或

xxvii)SEQ ID NO:79阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:80阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:81阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-82)。

3.一种特异性结合至人CD22的分离的单结构域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：

A)

xxvii)SEQ ID NO:79阐释的CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:80阐释的CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:81阐释的CDR3氨基酸序列(hCD22pas-82)；或

B)

4.一种特异性结合至人CD22的分离的单结构域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：

A)

i)SEQ ID NO:3阐释的CDR3氨基酸序列，

ii)SEQ ID NO:6阐释的CDR3氨基酸序列，

iii)SEQ ID NO:9阐释的CDR3氨基酸序列，

iv)SEQ ID NO:12阐释的CDR3氨基酸序列，

v)SEQ ID NO:15阐释的CDR3氨基酸序列，

vi)SEQ ID NO:18阐释的CDR3氨基酸序列，

vii)SEQ ID NO:21阐释的CDR3氨基酸序列，

viii)SEQ ID NO:24阐释的CDR3氨基酸序列，

ix)SEQ ID NO:27阐释的CDR3氨基酸序列，

x)SEQ ID NO:30阐释的CDR3氨基酸序列，

xi)SEQ ID NO:33阐释的CDR3氨基酸序列，

xii)SEQ ID NO:36阐释的CDR3氨基酸序列，

xiii)SEQ ID NO:39阐释的CDR3氨基酸序列，

xiv)SEQ ID NO:42阐释的CDR3氨基酸序列，

xv)SEQ ID NO:45阐释的CDR3氨基酸序列，

xvi)SEQ ID NO:48阐释的CDR3氨基酸序列，

xvii)SEQ ID NO:51阐释的CDR3氨基酸序列，

xviii)SEQ ID NO:54阐释的CDR3氨基酸序列，

xix)SEQ ID NO:57阐释的CDR3氨基酸序列，

xx)SEQ ID NO:60阐释的CDR3氨基酸序列，

xxi)SEQ ID NO:63阐释的CDR3氨基酸序列，

xxii)SEQ ID NO:66阐释的CDR3氨基酸序列，

xxiii)SEQ ID NO:69阐释的CDR3氨基酸序列，

xxiv)SEQ ID NO:72阐释的CDR3氨基酸序列，

xxv)SEQ ID NO:75阐释的CDR3氨基酸序列，

xxvi)SEQ ID NO:79阐释的CDR3氨基酸序列，或

xxvii)SEQ ID NO:81阐释的CDR3氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的分离的单结构域抗体(sdAb)，其包括：

A)

i)SEQ ID NO:1阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:3阐释的CDR3氨基酸序列，

ii)SEQ ID NO:4阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:6阐释的CDR3氨基酸序列，

iii)SEQ ID NO:7阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:9阐释的CDR3氨基酸序列，

iv)SEQ ID NO:10阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:12阐释的CDR3氨基酸序列，

v)SEQ ID NO:13阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:15阐释的CDR3氨基酸序列，

vi)SEQ ID NO:16阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:18阐释的CDR3氨基酸序列，

vii)SEQ ID NO:19阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:21阐释的CDR3氨基酸序列，

viii)SEQ ID NO:22阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:24阐释的CDR3氨基酸序列，

ix)SEQ ID NO:25阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:27阐释的CDR3氨基酸序列，

x)SEQ ID NO:28阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:30阐释的CDR3氨基酸序列，

xi)SEQ ID NO:31阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:33阐释的CDR3氨基酸序列，

xii)SEQ ID NO:34阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:36阐释的CDR3氨基酸序列，

xiii)SEQ ID NO:37阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:39阐释的CDR3氨基酸序列，

xiv)SEQ ID NO:40阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:42阐释的CDR3氨基酸序列，

xv)SEQ ID NO:43阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:45阐释的CDR3氨基酸序列，

xvi)SEQ ID NO:46阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:48阐释的CDR3氨基酸序列，

xvii)SEQ ID NO:49阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:51阐释的CDR3氨基酸序列，

xviii)SEQ ID NO:52阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:54阐释的CDR3氨基酸序列，

xix)SEQ ID NO:55阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:57阐释的CDR3氨基酸序列，

xx)SEQ ID NO:58阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:60阐释的CDR3氨基酸序列，

xxi)SEQ ID NO:61阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:63阐释的CDR3氨基酸序列，

xxii)SEQ ID NO:64阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:66阐释的CDR3氨基酸序列，

xxiii)SEQ ID NO:67阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:69阐释的CDR3氨基酸序列，

xxiv)SEQ ID NO:70阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:72阐释的CDR3氨基酸序列，

xxv)SEQ ID NO:73阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:75阐释的CDR3氨基酸序列，

xxvi)SEQ ID NO:76阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:78阐释的CDR3氨基酸序列，或

xxvii)SEQ ID NO:79阐释的CDR1氨基酸序列和SEQ ID NO:81阐释的CDR3氨基酸序列。

6.根据权利要求2或3所述的分离的sdAb，包括A)SEQ ID NO:85至112和120至125的任何一个的氨基酸序列，或B)在其全长之间与SEQ ID NO:82至108和120至125的任何一个至少80％同一性的氨基酸序列。

7.根据权利要求1或2所述的分离的sdAb，包括A)SEQ ID NO:82至108和120至125的任何一个的氨基酸序列。

8.根据权利要求1至5任一项所述的分离的sdAb，其是骆驼科sdAb。

9.根据权利要求8所述的分离的sdAb，其是美洲驼sdAb。

10.根据权利要求1至5任一项所述的分离的sdAb，其是人源化的。

11.根据权利要求1至10任一项所述的分离的sdAb，其对人CD22具有2.5x 10^-7nm或更小的亲和力。

12.根据权利要求1至10任一项所述的分离的sdAb，其对人CD22具有3x 10^-8nm或更小的亲和力。

13.根据权利要求1至10任一项所述的分离的sdAb，其对人CD22具有9.6x 10^-9nm或更小的亲和力。

14.根据权利要求1至10任一项所述的分离的sdAb，其对人CD22具有9.3x 10^-10nm或更小的亲和力。

15.根据权利要求1至10任一项所述的分离的sdAb，其对人CD22具有7x 10^-12nm或更小的亲和力。

16.根据权利要求1至15任一项所述的分离的sdAb，其结合至人CD22的第一Ig样结构域。

17.根据权利要求16所述的分离的sdAb，其中抗体包括SEQ ID NO:91(hCD221ug-80)。

18.根据权利要求1至15任一项所述的分离的sdAb，其结合至人CD22的第四Ig样结构域。

19.根据权利要求18所述的分离的sdAb，其中抗体包括SEQ ID NO:84(hCD221ug-13)。

20.根据权利要求1至15任一项所述的分离的sdAb，其结合至人CD22的第六Ig样结构域。

21.根据权利要求20所述的分离的sdAb，其中抗体包括SEQ ID NO:84(hCD221ug-13)、SEQ ID NO:91(hCD221ug-80)、SEQ ID NO:86(hCD221ug-36)或SEQ ID NO:105(hCD221pas-64)。

22.根据权利要求1至15任一项所述的分离的sdAb，其结合至人CD22的第七Ig样结构域。

23.根据权利要求22所述的分离的sdAb，其中抗体包括SEQ ID NO:87(hCD221ug-61)、SEQ ID NO:83(hCD221ug-10)或SEQ ID NO:100(hCD22pas-24)。

24.一种单结构域抗体(sdAb)，其与权利要求3或7中限定的分离的sdAb竞争特异性结合至CD22。

25.根据权利要求24所述的sdAb，其是骆驼科sdAb。

26.根据权利要求25所述的sdAb，其是美洲驼sdAb。

27.根据权利要求24至26任一项所述的sdAb，其是人源化的。

28.一种重组多肽，其包括一种或多种权利要求1至27任一项限定的sdAb。

29.一种多价抗体，其包括：

第一抗原结合部分，其包括权利要求1至27任一项限定的sdAb，和

第二抗原结合部分。

30.根据权利要求29所述的多价抗体，其中第二抗原结合部分特异性结合至免疫细胞的细胞表面标志物。

31.根据权利要求30所述的多价抗体，其中所述免疫细胞的细胞表面标志物包括T-细胞标志物。

32.根据权利要求31所述的多价抗体，其中所述T-细胞标志物包括人CD3。

33.根据权利要求29至32任一项所述的多价抗体，其以N-末端至C-末端方向包括：

-第一抗原结合部分，

-氨基酸连接体，和

-第二抗原结合部分。

34.根据权利要求33所述的多价抗体，其进一步包括N-末端信号肽。

35.根据权利要求34所述的多价抗体，其中信号肽是来自人CD28的信号肽，其优选地包括SEQ ID NO:110。

36.根据权利要求33至35任一项所述的多价抗体，其中所述氨基酸连接体包括来自人CD8的多肽铰链。

37.根据权利要求36所述的多价抗体，其中来自人CD8的多肽铰链包括SEQ ID NO:112。

38.根据权利要求36或37所述的多价抗体，其中所述氨基酸连接体以N-末端至C-末端方向包括SEQ ID NO:111、112和118。

39.根据权利要求33至38任一项所述的多价抗体，其由SEQ ID NO:119编码。

40.根据权利要求30所述的多价抗体，其中免疫细胞标志物的细胞表面标志物包括自然杀伤(NK)细胞标志物。

41.根据权利要求40所述的多价抗体，其中NK细胞标志物包括人CD16。

42.根据权利要求40或41所述的多价抗体，其进一步包括用于刺激NK细胞的激活、扩增和/或存活的细胞因子。

43.根据权利要求42所述的多价抗体，其中用于刺激NK细胞的扩增的细胞因子是白细胞介素-15(IL15)。

44.根据权利要求40至43任一项所述的多价抗体，其进一步包括结合至第二NK细胞标志物的第三抗原结合部分。

45.根据权利要求44所述的多价抗体，其中第二NK细胞标志物是人NKp46。

46.根据权利要求40至43任一项所述的多价抗体，其进一步包括至少第三抗原结合部分，其结合至肿瘤相关抗原，优选地其中所述肿瘤相关抗原不同于人CD22。

47.根据权利要求29至39任一项所述的多价抗体，进一步包括至少第三抗原结合部分，其结合至肿瘤相关抗原，优选地其中所述肿瘤相关抗原不同于人CD22。

48.根据权利要求46或47任一项所述的多价抗体，其中第三抗原结合部分包括V_HH、V_NAR或scVF。

49.根据权利要求29至47任一项所述的多价抗体，其中第二抗原结合部分包括V_HH、V_NAR或scVF。

50.根据权利要求29至49任一项所述的多价抗体，其包括结合至人血清白蛋白的抗原结合部分。

51.根据权利要求31至39所述的多价抗体，其是双特异性T-细胞衔接器。

52.根据权利要求40或41所述的多价抗体，其是双特异性杀伤细胞衔接器(BiKE)。

53.根据权利要求42至48任一项所述的多价抗体，其是三特异性杀伤细胞衔接器(TriKE)。

54.根据权利要求29至53任一项所述的多价抗体，其中sdAb包括：

SEQ ID NO:13阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:14阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:15阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug36)；或

SEQ ID NO:7阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:8阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:9阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug13)。

55.根据权利要求29至53任一项所述的多价抗体，其中sdAb包括SEQ ID NO:86(hCD221ug36)或SEQ ID NO:84(hCD221ug13)。

56.一种重组核酸分子，其编码权利要求28所述的重组多肽或权利要求29至55任一项所述的多价抗体。

57.权利要求29至55任一项限定的多价抗体用于治疗癌症或自身免疫性疾病的用途。

58.一种治疗受试者的癌症或自身免疫性疾病的方法，其包括向受试者施用权利要求29至55任一项限定的多价抗体。

59.一种结合至人CD22的嵌合抗体受体(CAR)，其包括权利要求1至27任一项限定的VHHsdAb。

60.根据权利要求59所述的CAR，其以N-末端至C-末端方向包括：

-CD22结合结构域，其包括权利要求1至27任一项限定的sdAb，

-多肽铰链，

-跨膜结构域，和

-细胞质结构域，其包括信号传导结构域，优选地其中所述细胞质结构域进一步包括共刺激结构域。

61.根据权利要求60所述的CAR，其中所述多肽铰链是CD8铰链结构域。

62.根据权利要求61所述的CAR，其中所述CD8铰链结构域包括SEQ IDNO:112。

63.根据权利要求60至62任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域。

64.根据权利要求63所述的CAR，其中所述CD28跨膜结构域包括SEQ ID NO:113。

65.根据权利要求60至64任一项所述的CAR，其中所述信号传导结构域是CD3-ζ信号传导结构域。

66.根据权利要求65所述的CAR，其中所述CD3-ζ信号传导结构域包括SEQ ID NO:115。

67.根据权利要求60至66任一项所述的CAR，其中所述共刺激结构域是4-1BB共刺激结构域。

68.根据权利要求67所述的CAR，其中所述4-1BB信号转导结构域包括SEQ ID NO:114。

69.根据权利要求60至68任一项所述的CAR，其进一步包括sdAb和多肽铰链之间的柔性氨基酸连接体。

70.根据权利要求69所述的CAR，其中所述柔性氨基酸连接体包括SEQ ID NO:111。

71.根据权利要求59至70任一项所述的CAR，其进一步包括信号肽。

72.根据权利要求71所述的CAR，其中所述信号肽是来自人CD28的信号肽，优选地其中来自人CD28的信号肽包括SEQ ID NO:110。

73.根据权利要求59至72任一项所述的CAR，其由SEQ ID NO:119编码。

74.根据权利要求58至72任一项所述的CAR，其中sdAb包括SEQ IDNO:86(hCD221ug-36)、SEQ ID NO:83(hCD221ug-10)、SEQ ID NO:87(hCD221ug-61)、SEQ ID NO:82(hCD221ug-6)、SEQ ID NO:88(hCD221ug-74)、SEQ ID NO:85(hCD221ug-14)SEQ ID NO:102(hCD22pas-33)或SEQ ID NO:84(hCD221ug-13)。

75.根据权利要求59至72任一项所述的CAR，其中VHH sdAb包括：

SEQ ID NO:4阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:5阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:6阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-10)。

76.根据权利要求59至72任一项所述的CAR，其中VHH sdAb包括：

SEQ ID NO:13阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:14阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:15阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-36)。

77.根据权利要求59至72任一项所述的CAR，其中VHH sdAb包括：

SEQ ID NO:19阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:20阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:21阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-74)。

78.根据权利要求59至72任一项所述的CAR，其中VHH sdAb包括：

SEQ ID NO:61阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:62阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:63阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221pas-33)。

79.根据权利要求59至72任一项所述的CAR，其中VHH sdAb包括：

SEQ ID NO:1阐释的CDR1氨基酸序列，

SEQ ID NO:2阐释的CDR2氨基酸序列，和

SEQ ID NO:3阐释的CDR3氨基酸序列(hCD221ug-6)。

80.根据权利要求59至79任一项所述的CAR，其进一步包括相对于CD22结合结构域位于N-末端或C-末端的另外的结合结构域，并且通过氨基酸连接体连接至CD22结合结构域。

81.根据权利要求80所述的CAR，其中另外的结合结构域结合至CD22。

82.根据权利要求81所述的CAR，其中另外的结合结构域包括与CD22结合结构域的sdAb不同的第二sdAb。

83.根据权利要求82所述的CAR，其中与CD22结合结构域的sdAb相比，第二sdAb结合至CD22的不同表位。

84.根据权利要求81所述的CAR，其中另外的结合结构域包括第二sdAb，所述第二sdAb包括CD22结合结构域的相同的CDR1、CDR2和CDR3sdAb，优选地其中第二sdAb与CD22结合结构域的sdAb相同。

85.根据权利要求80所述的CAR，其中所述另外的结合结构域结合至不同于CD22的分子。

86.根据权利要求80所述的CAR，其中所述另外的结合结构域包括第二sdAb。

87.根据权利要求85或86所述的CAR，其中不同于CD22的分子和CD22由相同靶细胞表达。

88.一种重组核酸分子，其编码权利要求59至87任一项限定的CAR。

89.一种载体，其包括权利要求88限定的重组核酸分子。

90.根据权利要求89所述的载体，其是病毒载体。

91.根据权利要求90所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

92.一种重组病毒颗粒，其包括权利要求88所述的重组核酸分子。

93.根据权利要求92所述的重组病毒颗粒，其是重组体慢病毒颗粒。

94.一种细胞，其包括权利要求88所述的重组核酸分子。

95.一种工程化细胞，其在细胞表面膜表达权利要求59至87任一项限定的CAR。

96.根据权利要求95所述的工程化细胞，其是免疫细胞。

97.根据权利要求96所述的工程化细胞，其中所述免疫细胞源自T-淋巴细胞。

98.权利要求95至97任一项所述的工程化细胞用于治疗癌症或自身免疫性疾病的用途。

99.根据权利要求57或98所述的用途，其中癌症是血液恶性肿瘤。

100.根据权利要求99所述的用途，其中所述血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓增生异常综合征。

101.根据权利要求100所述的用途，其中所述白血病选自由以下组成的组中：急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴白血病(ALL)和慢性淋巴白血病(CLL)。

102.根据权利要求100所述的用途，其中所述淋巴瘤选自由以下组成的组中：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤。

103.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用权利要求92至97任一项限定的工程化细胞。

104.根据权利要求58或103所述的方法，其中癌症是血液恶性肿瘤。

105.权利要求104所述的方法，其中所述血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓增生异常综合征。

106.权利要求105所述的方法，其中所述白血病是急性淋巴白血病(ALL)或慢性淋巴白血病(CLL)。

107.权利要求105所述的方法，其中淋巴瘤选自由以下组成的组中：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤。

108.一种多价抗体，其包括：

-第一抗原结合部分，

-氨基酸连接体，其包括来自人CD8的多肽铰链，和

-第二抗原结合部分。

109.根据权利要求108所述的多价抗体，其中来自人CD8的多肽铰链包括SEQ ID NO:112。

110.根据权利要求108或109所述的多价抗体，其中所述氨基酸连接体进一步包括在来自人CD8的多肽铰链的N-末端的至少一个G4S，和在来自人CD8的多肽铰链的C-末端的至少一个G4S。

111.权利要求108至110任一项所述的多价抗体，其中氨基酸连接体的长度是至少47个残基、优选地长度是至少52个残基、优选地长度是至少57个残基、更优选地长度是至少62个残基、甚至更优选地长度是至少67个残基。

112.权利要求108至111任一项所述的多价抗体，其中氨基酸连接体以N-末端至C-末端方向包括SEQ ID NO:111、112和118。

113.权利要求108至112任一项所述的多价抗体，其中第一抗原结合部分特异性结合至人CD22。

114.根据权利要求113所述的多价抗体，其中第一抗原结合部分是V_HH、V_NAR或scVF。

115.根据权利要求108至111任一项所述的多价抗体，其中第一抗原结合部分是权利要求1至27任一项限定的sdAb。

116.根据权利要求108至115任一项所述的多价抗体，其中第二抗原结合部分特异性结合至免疫细胞的细胞表面标志物。

117.根据权利要求116所述的多价抗体，其中所述免疫细胞的细胞表面标志物包括T-细胞标志物。

118.根据权利要求117所述的多价抗体，其中T-细胞标志物包括人CD3。

119.根据权利要求108至118任一项所述的多价抗体，其中第二抗原结合部分是V_HH、V_NAR或scVF。