TW201522373A - 抗ｃｄ５２之抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供抗人類CD52抗體及其抗原結合片段；亦提供用於製造該等抗體與片段之單離核酸、重組載體與宿主細胞。該等抗體與片段可用於治療應用，以治療例如自體免疫疾病、癌症及移植排斥。

Description

抗CD52之抗體
本發明概括而言係有關抗體，更具體而言係有關對人類CD52具結合特異性之抗體。
CD52係於各種正常及惡性類淋巴細胞(例如，T細胞與B細胞)中大量發現之醣基化，多醣磷脂醯肌醇(GPI)錨定細胞之表面蛋白(500,000個分子/細胞)。參見，例如，Hale et al.,J Biol Regul Homeost Agents 15：386-391(2001)；Huh et al.,Blood 92：Abstract 4199(1998)；Elsner et al.,Blood 88：4684-4693(1996)；Gilleece et al.,Blood 82：807-812(1993)；Rodig et al.,Clin Cancer Res 12：7174-7179(2006)；Ginaldi et al.,Leuk Res 22：185-191(1998)。CD52於例如單核細胞、巨噬細胞、與樹突細胞等髓樣細胞上低量表現，於成熟自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球、與造血幹細胞上被發現表現少(同上)。總之，CD52存在至少95%所有人類周邊血液淋巴細胞與單核細胞/巨噬細胞中(Hale G,et al.,“The CAMPATH-1 antigen(CD52),”Tissue Antigens,35：178-327(1990))。CD52亦由副睪與輸精管中之上皮細胞所產生，於通過生殖道期間由***獲得(Hale et al.,2001,supra；Domagala et al.,Med Sci Monit 7：325-331(2001))。CD52之確切生物功能仍不清楚，惟若干證據暗示其可能涉及T細胞遷移及共刺激(Rowan et al.,Int Immunol 7：69-77(1995)；Masuyama et al.,J Exp Med 189：979-989(1999)；Watanabe et al.,Clin Immunol 120：247-259(2006))。
數種抗CD52單株抗體已被開發。Campath-1H®(亦為所謂阿侖滋單抗(alemtuzumab)、Campath®、MabCampath®)係擬人化抗人類CD52單株抗體，具有強效之活體外細胞毒性效應(抗體依賴性細胞傳介之細胞毒性(ADCC)與補體依賴性細胞毒性(CDC))。阿侖滋單抗識別由成熟CD52蛋白羧端四個胺基酸與帶負電荷之GPI錨定部分構成之抗原決定區。另外的抗人類CD52單株抗體也已產生。然而，於貯存及特定pH與溫度條件下，若干彼等抗體之結合親和力降低。因此，業界對於具有降低傾向經歷此變化之抗CD52抗體存在需求。
發明概述
本發明之特徵為經改造而隨著時間及於高pH與溫度條件下仍保持結合親和力之抗人類CD52抗體。本文中之「抗體」與「免疫球蛋白」可互換使用。亦提供包含編碼抗CD52抗體輕鏈或重鏈之序列之單離核酸、重組載體與宿主細胞，及製備抗CD52抗體之方法。
Ab26為具有SEQ ID NO：3減去訊息序列之重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO：4減去訊息序列之輕鏈胺基酸序列之擬人化抗人類CD52單株抗體。Ab26於貯存期間會隨時間降低CD52之結合親和力與效價。申請人等意外發現於輕鏈CDR1位置11具特定單一胺基酸置換之Ab26變異體(例如，單株抗體Ab21、Ab16、與Ab20)，相較於Ab26，不僅保留或超越Ab26之人類CD52結合親和力，亦展示顯著增進之穩定性。例如Ab21、Ab16、與Ab20之該等變異抗體，相較於Ab26，已展示於活體外及活體內可相較或增進之生物效價。彼等變異體可用於治療及診斷應用。
於若干具體實例中，本發明之抗人類CD52抗體或抗原結合片段包含重鏈變異區與輕鏈變異區，其中該重鏈變異區包含：SEQ ID NO：7之重鏈CDR1、SEQ ID NO：8之重鏈CDR2、與SEQ ID NO：9之重鏈CDR3，及其中該輕鏈變異區包含：SEQ ID NO：86之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：34之輕鏈CDR2、與SEQ ID NO：35之輕鏈CDR3。於進一步具體實例 中，SEQ ID NO：86中之殘基11可為K、R、Q、H、S、Y、A、D、E、F、I、L、M、N、T、或V。於一具體實例中，SEQ ID NO：86中之殘基11係K。於另一具體實例中，SEQ ID NO：86中之殘基11係R。於又另一具體實例中，SEQ ID NO：86中之殘基11係Q。
於若干具體實例中，抗CD52抗體或片段之重鏈變異區包含SEQ ID NO：59。於另外具體實例中，抗CD52抗體或片段之輕鏈變異區包含選自包括SEQ ID NOs：68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、與83之組群之序列。舉例而言，本發明抗體或片段之重鏈與輕鏈分別可包含：a)SEQ ID NOs：59與68；b)SEQ ID NOs：59與69；c)SEQ ID NOs：59與70；d)SEQ ID NOs：59與71；e)SEQ ID NOs：59與72；f)SEQ ID NOs：59與73；g)SEQ ID NOs：59與74；h)SEQ ID NOs：59與75；i)SEQ ID NOs：59與76；j)SEQ ID NOs：59與77；k)SEQ ID NOs：59與78；l)SEQ ID NOs：59與79；m)SEQ ID NOs：59與80；n)SEQ ID NOs：59與81；o)SEQ ID NOs：59與82；或p)SEQ ID NOs：59與83。
於若干具體實例中，抗體或片段包含無訊息序列之SEQ ID NO：3重鏈胺基酸序列。於另外具體實例中，抗體或片段包含選自包括SEQ ID NOs：43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、與58之組群之輕鏈胺基酸序列。舉例而言，抗體或片段可包含(a)無訊息序列之SEQ ID NO：3重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：49之輕鏈胺基酸序列；(b)無訊息序列之SEQ ID NO：3重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：53之輕鏈胺基酸序列；或(c)無訊息序列之SEQ ID NO：3重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：54之輕鏈胺基酸序列。
於若干具體實例中，本發明抗體為免疫球蛋白G(IgG)。於另外具體實例中，抗體包含人類Fc區(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4 Fc區)。本發明亦涵蓋本發明任何抗體之抗原結合片段，其中該片段係選自包括scFv片段、Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、微型抗体、二聚抗體(diabody)、三聚抗體(triabody)、與四聚抗體(tetrabody)之組群。
於若干具體實例中，本發明抗體係單株抗體。於進一步具體實例中，抗體與抗原結合片段係擬人化。本發明抗體或片段重鏈C端之離胺酸可視需要被切割。
本發明亦有關包含編碼抗體之重鏈或其抗原結合片段、或輕鏈或其抗原結合片段、或二者，之核苷酸序列之單離核酸分子。於若干具體實例中，單離之核酸分子包含SEQ ID NO：95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、或134之核苷酸序列。本發明亦涵蓋包含該核酸分子之重組載體(例如，表現載體)。於若干具體實例中，本發明涵蓋包含該載體之單離宿主細胞。
本發明亦涵蓋產生本文敘述之抗CD52抗體或片段或該抗體或片段之重鏈或輕鏈之單離細胞株。於若干具體實例中，本發明係有關製造抗人類CD52抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包括(1)適於該抗體或片段表現之條件下供養(maintaining)本文敘述之宿主細胞或細胞株；及(2)回收該抗體或片段。
本發明涵蓋包含本文敘述之抗體或抗原結合片段與醫藥上可接受之載體或載劑之組成物。
本發明係有關用於治療有其需要之病患之方法，該方法包括投予該病患有效量之本文敘述之抗體或抗原結合片段。於若干具體實例中，本發明涵蓋用於治療有其需要病患之自體免疫疾病(例如，多發性硬化症)之方法，該方法包括投予該病患本文敘述之抗體或抗原結合片段。於若干具體實例中，本發明涵蓋用於治療有其需要病患之癌症(例如，慢性淋巴球性白血病)之方法，該方法包括投予該病患本文敘述之抗體或抗原結合片段。本發明亦有關抑制有其需要病患之血管生成之方法，該方法包括投予該病患本文敘述之抗體或抗原結合片段。
於若干具體實例中，本發明係有關使用本文敘述之抗體或抗原結合片段治療有其需要病患之自體免疫疾病(例如，多發性硬化症)，或製備其治療藥劑之用途。本發明亦係有關使用本文敘述之抗體或抗原結 合片段治療有其需要病患之癌症(例如，慢性淋巴球性白血病)，或製備其治療藥劑之用途。本發明進一步係有關使用本文敘述之抗體或抗原結合片段治療有其需要病患之過度血管生成，或製備用於抑制血管生成之藥劑之用途。
本專利或申請檔案含有至少一個彩色繪圖。於請求及支付必要費用下，辦事處(the Office)將提供具彩色繪圖之本專利或專利申請公告案之副本。
圖1描繪抗CD52抗體之快速親和力篩選結果。上圖(upper panel)為製備抗體之流程圖。中圖(middle panel graph)及下方表格顯示BIACORETM結合分析及Octe)表現量測定之結果。
圖2描述純化抗CD52抗體之特性實驗結果。上圖係顯示抗CD52抗體重鏈與輕鏈分離之SDS-PAGE凝膠照片。分子量標記示於標示之泳道(M)。下方曲線圖及表格顯示BIACORETM結合分析之結果。
圖3描述顯示於CHO細胞中生產製備Ab24與Ab10抗體之SDS-PAGE凝膠照片。該等凝膠亦顯示對照之抗CD52(CTL)抗體及Ab1抗體。箭頭指出100kD物種及LC裁剪(clipping)處。
圖4描述顯示存在右側圖示具「只有重鏈」二聚體之Ab24與Ab10抗體中之100kD物種之SDS-PAGE凝膠照片；亦顯示N端定序結果。
圖5描述另外之抗CD52抗體之特性實驗結果。表格及曲線圖顯示BIACORETM結合分析及Octet表現量測定之結果。「KGN」係指具有SEQ ID NO：3重鏈序列與SEQ ID NO：2輕鏈序列之抗CD52抗體。
圖6描述純化抗CD52抗體之CD52結合特性實驗結果。左圖為顯示野生型(CTL)及其他抗體之重鏈與輕鏈之SDS-PAGE凝膠照片。分子量標記示於標示之泳道(M)。右側曲線圖顯示BIACORETM結合分析之結果。
圖7為描述對照抗之CD52抗體及抗體Ab21、Ab16、與Ab20之CDC分析結果圖形。
圖8描述於人類CD52基因轉殖小鼠中，對照抗之CD52(CTL)抗體及抗體Ab21、Ab16、與Ab20之CD52+細胞消減活性分析結果。左側曲線圖顯示血液試樣之結果。右側曲線圖顯示脾臟試樣之結果。
圖9顯示野生型人類CD52蛋白之胺基酸序列[基因庫(Genbank)登錄編號AAH00644.1)(SEQ ID NO：1)]。
圖10顯示抗體Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、與KGN(SEQ ID NO：3)之全長重鏈胺基酸序列，及抗體Ab26(SEQ ID NO：4)之全長輕鏈胺基酸序列。粗斜體字為訊息序列，下面劃線為CDR。
圖11顯示抗體Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、與KGN(SEQ ID NO：5)之全長重鏈核酸序列，及抗體Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、與KGN之全長輕鏈核酸序列。下面劃線為訊息序列，粗體字為開放閱讀框架。
圖12顯示抗體Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、與Ab25之H-CDR1(SEQ ID NO：7)、H-CDR2(SEQ ID NO：8)、H-CDR3(SEQ ID NO：9)、L-CDR2(SEQ ID NO：34)、及L-CDR3(SEQ ID NO：35)之胺基酸序列。
圖13顯示抗體Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、與Ab26之L-CDR1之胺基酸序列。
圖14顯示抗體Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、與Ab25之全長輕鏈胺基酸序列；下面劃線為CDR。
圖15顯示抗體Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、與Ab25之重鏈與輕鏈變異功能區胺基酸序列；下面劃線為CDR。
圖16顯示抗體Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、與KGN之重鏈變異功能區與輕鏈變異功能區之核酸序列。
圖17描述以HEK293細胞純化之Ab1抗體之特性實驗結果。曲線圖及表格顯示BIACORETM分析測定Ab1及兩種Ab26製劑(CTL1與CTL2)對CD52胜肽之親和力結果。上方右圖係顯示兩種Ab26製劑(CTL1與CTL2)及Ab1抗體之重鏈(HC)與輕鏈(LC)之還原性SDS-PAGE凝膠照片。
圖18描述以CHO細胞純化之Ab1抗體之特性實驗結果。曲線圖顯示BIACORETM分析測定Ab1抗體(下圖)及Ab26抗體(CTL)(上圖)對CD52胜肽之親和力結果。
圖19為描述Ab1抗體與Ab26抗體(對照)之CDC分析結果之曲線圖。結果以為最終濃度(單位為毫克/毫升)函數之相對螢光單位(RFU)表示。
圖20描述抗CD52抗體之穩定性篩選結果。上方左側曲線圖顯示，於45℃與pH 7.2下，就Ab26(CTL)與變異抗體而言，KD(nM)為時間(週)之函數。上方右側曲線圖顯示，於45℃與pH 7.2下，就Ab26(CTL)及變異抗體而言，相對於T0之親和力為時間(週)之函數。
圖21描述於三成分緩衝液中培育，對抗CD52抗體穩定性影響之測試實驗結果。上方左側曲線圖顯示，兩種Ab26製劑(CTL1與CTL2) 及變異抗體，於37℃與pH 7.5下，第0週、第2週、與第4週之KD(nM)。上方右側曲線圖顯示，Ab26(CTL)及變異抗體，於45℃與pH 7.4下，第0週、第2週、與第4週之KD(nM)。
圖22描述Ab26(CTL)、Ab21、Ab16、與Ab20於45℃培育後，粒徑排阻層析法(SEC)-HPLC分析之結果。
本發明係根據申請人等發現，特定抗CD52抗體於貯存期間或於特定pH與溫度條件下，隨時間喪失穩定性並展示降低之結合親和力。申請人等已產生於親源抗體之輕鏈CDR1(L-CDR1)中，單一位置(位置11)包含胺基酸置換之變異抗體；並已發現若干彼等變異抗體相較於親源抗體，不僅展示類似或增進之抗原結合特性與生物活性(包括活體內效價)，亦展示增強之穩定性。
本發明包含抗人類CD52抗體、該等抗體之抗原結合片段(亦即，部分)、該等抗體之輕鏈、該等抗體之重鏈、及彼等輕鏈或重鏈之片段。本發明係有關成熟抗體或其鏈(例如，醣基化抗體)，以及未成熟或前驅物抗體蛋白。本發明亦有關編碼彼等未成熟或成熟蛋白二者之核酸分子(例如，載體)，包含此類核酸之宿主細胞，生產未成熟與成熟蛋白之方法，及使用該抗體之方法。
本發明之抗體與抗原結合部分可用以治療有其需要之對象(例如，人類病患)之各種由具CD52之細胞傳介或引起之疾病與症狀，例如特定免疫傳介之疾病(IMD)徵兆。作用機制可能為抗CD52抗體藉由引起細胞死亡而消減彼等細胞(例如，淋巴細胞或癌性CD52+細胞)。舉例而言，該等抗體可經由淋巴細胞消減[一種經由降低循環性淋巴細胞族群(例如，T細胞及/或B細胞)導致淋巴球減少症，獲得之免疫抑制類型]，以治療自體免疫疾病[例如，多發性硬化症(MS)、類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡、血管炎、肌炎、與韋格納氏疾病(Wegener’s disease)]。本發明抗體亦可用以治療癌症，例如，白血病(例如，慢性淋巴球性白血病)與淋巴瘤(例 如，非霍奇金氏淋巴瘤)；或用於組織移植[例如，實質器官移植(例如，腎臟移植)與幹細胞移植]。本發明抗體亦可用以充實造血幹細胞，例如，於擬體內之應用[參見，例如，Lim et al.,J.Hematology & Oncology 1：19(2008)]。
本發明抗體之抗原結合性質
本發明抗體具有(或選擇性)結合於人類CD52或其部分之結合特異性(例如，抗原決定區特異性)。彼等抗體特異性地結合於CD52分子，且不會特異地結合於非CD52分子。舉例而言，抗CD52抗體與CD52間之特異性結合，可利用流式細胞測量術經由測量該抗體結合於CD52+細胞之EC50予以決定。特異性結合可以小於10微克/毫升之EC50表示(例如，利用流式細胞測量術之測定)。本文敘述之抗體可對人類CD52或其片段具有結合特異性。結合分析可使用單離或重組人類CD52、衍生自人類CD52之胜肽、或表現人類CD52之細胞(例如，人類T及/或B細胞、表現編碼人類CD52或此類細胞細胞膜區分核酸之重組宿主細胞)進行。此外，該等抗體可對一或多種人類CD52形式(例如，醣基化人類CD52、去醣基化人類CD52、無醣基人類CD52、與對偶基因變異體)具有結合特異性。於一具體實例中，該等抗體對天然存在、內源性或野生型人類CD52具有結合特異性。野生型人類CD52之胺基酸序列載於圖9(SEQ ID NO：1)中。
「抗原結合親和力」為此項技藝之術語，說明結合交互作用之強度，一般係指抗體對其抗原之整體結合強度。於若干具體實例中，本發明抗體結合於人類CD52之親和力，以例如，(1)1x10-7M或更小之KD[KD=Koff(kd)/Kon(ka)]表示；較佳為1x10-8M或更小；更佳為1x10-9M或更小；有利地為1x10-10M或更小；及最佳為1x10-11M或1x10-12。例如，該KD之範圍為100nM至1pM(亦即，1x10-7至1x10-12M)、50nM至1pM、5nM至1pM、或1nM至1pM。期望之抗原結合親和力亦可如利用表面電漿共振所測定，以5x10-1s-1或更小之Koff速率常數表示；較佳為1x10-2s-1或更小；有利地為1x10-3s-1或更小；更佳為1x104s-1或更小；又更佳為1x10-5s-1或更小；及最佳為1x10-6s-1或更小。舉例而言，該Koff速率常數之範圍可為 5x10-1s-1至1x10-7s-1、1x10-2s-1至1x10-6s-1、或5x10-3s-1至1x10-5s-1。於特定分析或設定中，期望之抗原結合強度亦可以不超過10微克/毫升之EC50(例如，0.1-10微克/毫升之EC50)表示。
本發明抗體包括結合於CD52上之抗原決定區(其與被抗體Ab26或本文例示之任何其變異體結合之CD52抗原決定區相同或部分重疊)者。抗原決定區結合可使用例如競爭性結合分析之各種技術容易地予以確定。本文所用之「抗原決定區」包括能特異性結合於抗體之任何蛋白質決定區。抗原決定區通常由具化學活性之表面分子群組(例如，胺基酸及/或碳水化合物或糖側鏈)組成，通常具有特定之立體結構特徵，以及特定之電荷特徵。抗原決定區可為「線性」或「構形」。於線性抗原決定區中，蛋白質與交互作用分子(例如，抗體)間之所有交互作用位點係沿著該蛋白質之一級胺基酸序列呈線性存在。於構形抗原決定區中，於一級多肽序列中彼此分開之交互作用之位點遍及蛋白質上之胺基酸殘基各處存在。
於一具體實例中，欲確定測試抗體是否結合於本發明特定抗CD52抗體之相同或部分重疊之抗原決定區，可於飽和條件下，使本發明之抗CD52抗體結合於CD52，然後測定測試抗體結合於CD52之能力。若測試抗體能如抗CD52參考抗體同時結合於CD52，則可推論該測試抗體結合於與抗CD52參考抗體不同之抗原決定區。然而，若該測試抗體不能同時結合於CD52，則可推論該測試抗體結合於與抗CD52參考抗體所結合之抗原決定區相同或部分重疊之抗原決定區，或與參考抗體所結合之抗原決定區緊鄰之抗原決定區。此實驗可使用ELISA、RIA、BIACORETM、或流式細胞測量術進行。欲測試抗CD52抗體是否與另一抗CD52抗體交叉競爭，可從兩個方向使用上述競爭方法，亦即，確定參考抗體是否封阻該測試抗體，反之亦然。
抗原決定區分級(binning)亦可用於描述本發明抗體之特性。「分級」一詞係指根據其抗原結合特徵，將抗體分組之方法。根據其交叉競爭用於「分級」抗體之高通量方法見述於國際專利申請公告案No.WO 03/48731。「抗原決定區分級」可經由使未標識之抗CD52抗體形式「A」 與對應於CD52序列之合成胜肽或CD52+細胞結合，進行探討。接著，添加已標識之第二抗CD52抗體「B」，然後評估相對於對照試樣(其中細胞或合成胜肽未事先暴露於抗CD52抗體「A」)之可結合之標識抗體量。替代地，抗CD52抗體「A」與「B」可使用不同螢光染料或可檢測之化學藥劑標識，然後使用能檢測該等標識之裝置測量可同時吸引CD52抗原的兩種標識抗體量，或利用流式細胞測量術測量同時吸引CD52+細胞的兩種抗體之量。BIACORETM與Octet技術賦予以能探討未標識抗體形式之競爭性結合。由於若干抗體之化學修飾可能損害結合活性，因此未標識抗體形式之使用符合所需。亦參見見述於Jia et al.,J.Immunol.Methods 288：91-98(2004)中用於進行抗原決定區分級之技術。
於若干具體實例中，本發明抗體以類似或優於抗體Ab26之親和力結合人類CD52。於特定具體實例中，本發明抗體具有與抗體Ab26相同或類似之抗原決定區特異性及生物功能(例如，消減淋巴細胞功能)。於一具體實例中，本發明抗體結合於包含人類CD52之QTSS胺基酸殘基之抗原決定區。
本發明抗體與抗原結合片段之結構
天然存在之抗體具有共同之核心結構，其中兩個完全相同之輕鏈(約24kD)與兩個完全相同之重鏈(約55或70kD)形成四聚體。各鏈之胺基端部分為所謂變異(V)區，可與各鏈剩餘部分之多個保守恆定(C)區區分。輕鏈之變異區(亦稱VL功能區)中，為所謂J區之C端部分。重鏈之變異區(亦稱VH功能區)中，除J區外，尚有D區。抗體中大部分之胺基酸序列變異係局限於直接參與抗原結合之所謂高度變異區或互補決定區(CDR)之V區中三個分開位置。從胺基端開始，彼等區域分別為所謂CDR1、CDR2與CDR3。該等CDR被更保守之架構區(FRs)固定於適當位置。從胺基端開始，彼等區域分別為所謂FR1、FR2、FR3與FR4。CDR區與FR區之位置及編號系統已由Kabat等人界定；參見，Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,U.S.Government Printing Office(1991)；Chothia & Lesk,Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins,J.Mol.Biol.,196：901-917(1987)；及IMGT®編號系統[The International ImMunoGeneTics Iinformation System®；Lefranc,M.-P.,The Immunologist 7,132-136(1999)]。可進行目視檢查及序列分析以確認CDR邊界。就本發明而言，係使用Kabat系統與IMGT系統二者界定CDR序列；亦即，當由此二系統界定之CDR序列不能完全重疊時，由兩個系統界定序列之所有殘基都包括在內。
本發明之特徵在於親源抗體Ab26之變異體。Ab26之重鏈與輕鏈胺基酸及核酸之序列分別示於圖10及11。Ab26包含無訊息序列之SEQ ID NO：3重鏈胺基酸序列及無訊息序列SEQ ID NO：4之輕鏈胺基酸序列。
於本發明若干具體實例中，本發明抗體之CDR，於成熟Ab26蛋白質輕鏈CDR1胺基序列之殘基34處，與Ab26不同。若干彼等變化大幅增進該變異抗體之穩定性，而不影響其抗原結合之特性。若殘基34之突變降低變異抗體兩個抗原之結合親和力，則可於抗體序列(例如，L-CDR1、L-CDR2、L-CDR2、H-CDR1、H-CDR2、或H-CDR3)中製造一或多個追加突變以恢復親和力。於若干具體實例中，殘基34係從G變成K、R、Q、H、S、Y、A、D、E、F、I、L、M、N、T、或V。於本發明之若干具體實例中，抗CD52抗體之L-CDR1序列係選自包括SEQ ID NOs：24、29、28、22、30、33、18、19、20、21、23、25、26、27、31、與32之組群。
茲將本文具體說明之抗體CDR序列，按照其SEQ ID NO.列於下文表1中。
於若干具體實例中，本發明抗體係擬人化抗體。本文所用之「抗CD52擬人化抗體」一詞係指包含非人類來源[亦為所謂供體抗體(donor antibody)(例如，鼠類抗CD52抗體)]之一或多個輕鏈CDR(CDR1、CDR2與CDR3)及/或一或多個重鏈CDR(CDR1、CDR2與CDR3)之抗體；及為人類來源抗體之至少一部分(例如，衍生自人類來源之輕鏈及/或重鏈之架構區或架構與恆定區)之抗CD52抗體。舉例而言，擬人化抗體係有或無架構改變之CDR移植抗體。於若干具體實例中，擬人化抗體為去免疫抗體。參見，例如，Carr U.S.Pat.7,264,806，有關已經修飾以減少潛在T細胞抗原決定區數量，從而降低該抗體投予人類後引發免疫反應傾向之去免疫抗體。
可進行架構區之改變，例如人類來源之架構區殘基以供體抗體對應位置之殘基予以置換者；參見，Queen U.S.Pat.5,530,101。亦可進行架構區之包括一或多個胺基酸之缺失、嵌入與置換之一或多個突變。若需要，則擬人化抗體中可包括架構突變，及可使用任何適當方法挑選突 變位點，例如見述於WO 98/06248與U.S.Pat.6,407,213中者，其全部揭示內容併入本文以資參考。於若干情況下，親源架構中毗鄰一或多個CDR之一或多個胺基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個毗鄰胺基酸)亦可包含於擬人化抗體中，以增強抗原結合親和力。視需要，可於架構區中之一或多個殘基處產生回復突變，以增進擬人化抗體之CD52結合親和力。
本發明抗體可藉由一或多個殘基之加成、缺失或置換(例如，保守性置換)而與抗體Ab26不同，例如，與親源序列之差異高達1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個殘基。
舉例而言，本發明包括具有包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：68之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：69之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：70之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：71之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：72之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：73之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：74之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：75之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：76之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：77之一或多個CDR(例如， 所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：78之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：79之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：80之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：81之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：82之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈；包含SEQ ID NO：59之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之重鏈與包含SEQ ID NO：83之一或多個CDR(例如，所有三個CDR)之輕鏈之抗體。
於一具體實例中，本發明抗體具有對人類CD52之結合特異性，及包含重鏈(H)-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、輕鏈(L)-CDR1、L-CDR2、與L-CDR3，其胺基酸序列分別為：a)SEQ ID NOs：7、8、9、18、34、與35；b)SEQ ID NOs：7、8、9、19、34、與35；c)SEQ ID NOs：7、8、9、20、34、與35；d)SEQ ID NOs：7、8、9、21、34、與35；e)SEQ ID NOs：7、8、9、22、34、與35；f)SEQ ID NOs：7、8、9、23、34、與35；g)SEQ ID NOs：7、8、9、24、34、與35；h)SEQ ID NOs：7、8、9、25、34、與35；i)SEQ ID NOs：7、8、9、26、34、與35；j)SEQ ID NOs：7、8、9、27、34、與35；k)SEQ ID NOs：7、8、9、28、34、與35；l)SEQ ID NOs：7、8、9、29、34、與35；m)SEQ ID NOs：7、8、9、30、34、與35；n)SEQ ID NOs：7、8、9、31、34、與35；o)SEQ ID NOs：7、8、9、32、34、與35；或p)SEQ ID NOs：7、8、9、33、34、與35。
於若干具體實例中，本發明抗體包含SEQ ID NO：86(KSSQSLLYSNXKTYLN)之L-CDR1，其中X係天然存在胺基酸(例如，D、E、K、R、H、Y、C、N、Q、S、T、A、V、L、I、M、P、F、或W)或非標準(例如，非天然)胺基酸。
本發明亦有關本文敘述抗體之抗體輕鏈。於一具體實例中，該抗體輕鏈包含選自包括SEQ ID NOs：18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、與33之組群之L-CDR1。舉例而言，該抗體具有L-CDR1、L-CDR2、與L-CDR3，其胺基酸序列分別為：a)SEQ ID NOs：18、34、與35；b)SEQ ID NOs：19、34、與35；c)SEQ ID NOs：20、34、與35；d)SEQ ID NOs：21、34、與35；e)SEQ ID NOs：22、34、與35；f)SEQ ID NOs：23、34、與35；g)SEQ ID NOs：24、34、與35；h)SEQ ID NOs：25、34、與35；i)SEQ ID NOs：26、34、與35；j)SEQ ID NOs：27、34、與35；k)SEQ ID NOs：28、34、與35；l)SEQ ID NOs：29、34、與35；m)SEQ ID NOs：30、34、與35；n)SEQ ID NOs：31、34、與35；o)SEQ ID NOs：32、34、與35；或p)SEQ ID NOs：33、34、與35。
表2列出本文具體說明之抗體之全長重鏈與輕鏈及變異功能區胺基酸序列，以及編碼該等重鏈與輕鏈及變異功能區之核苷酸序列之序列識別符(SEQ ID NOs)。
於一具體實例中，本發明抗體包含由SEQ ID NO：68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、或83組成之變異功能區(VL)序列之輕鏈。於另一具體實例中，該抗體包含其胺基酸序列含有或係由SEQ ID NO：43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、或58組成之輕鏈。
於若干具體實例中，本發明抗體包含VH與VL，其胺基酸序列分別包含或由：a)SEQ ID NOs：59與68；b)SEQ ID NOs：59與69；c)SEQ ID NOs：59與70；d)SEQ ID NOs：59與71；e)SEQ ID NOs：59與72；f)SEQ ID NOs：59與73；g)SEQ ID NOs：59與74；h)SEQ ID NOs：59與75；i)SEQ ID NOs：59與76；j)SEQ ID NOs：59與77；k)SEQ ID NOs：59與78；l)SEQ ID NOs：59與79；m)SEQ ID NOs：59與80；n)SEQ ID NOs：59與81；o)SEQ ID NOs：59與82；或p)SEQ ID NOs：59與83組成。
於一具體實例中，本發明抗體包含重鏈(HC)與輕鏈(LC)，其胺基酸序列分別包含或由：a)SEQ ID NOs：3與43；b)SEQ ID NOs：3與44；c)SEQ ID NOs：3與45；d)SEQ ID NOs：3與46；e)SEQ ID NOs：3與47；f)SEQ ID NOs：3與48；g)SEQ ID NOs：3與49；h)SEQ ID NOs：3與50；i)SEQ ID NOs：3與51；j)SEQ ID NOs：3與52；k)SEQ ID NOs：3與53；l)SEQ ID NOs：3與54；m)SEQ ID NOs：3與55；n)SEQ ID NOs：3與56；o)SEQ ID NOs：3與57；或p)SEQ ID NOs：3與58組成；若存在時，各序列有或無訊息序列。
本文亦提供整個抗體之部分，例如，該等抗體之輕鏈或重鏈，或輕鏈及/或重鏈之部分。整個抗體之部分包括整個抗體之抗原結合部分。本文中「抗原結合片段」與「抗原結合部分」等詞可互換使用。舉 例而言，抗體之抗原結合片段包括單鏈抗體、Fv片段、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd片段、單鏈Fv分子(scFv)、scFv-Fc融合體、雙重特異性單鏈Fv二聚體、微型抗體、二聚抗體、三聚抗體、四聚抗體、刪除功能區抗體及單功能區抗體(dAbs)。參見，例如，Nature Biotechnology 22(9)：1161-1165(2004))。亦於本發明範圍內之抗原結合分子包含VH及/或VL。於VH之情形下，該分子亦可包含一或多個CH1區、絞鏈區、CH2區與CH3區。
可利用酵素切割或重組技術生產抗體之部分或片段。例如，可使用木瓜酶或胃蛋白酶切割，分別產生Fab或F(ab’)2片段。亦可使用已於天然終止位點之上游引入一或多個終止密碼子之抗體基因，製造呈各種截短形式之抗體。舉例而言，可設計編碼F(ab’)2片段重鏈之重組建構體，以包含編碼重鏈CH1功能區與絞鏈區之DNA序列。抗原結合片段保留其親源抗體之結合特異性。較佳之抗原結合片段具有對野生型人類CD52之結合特異性。可使用PCR突變方法改變現存DNA序列以建構編碼擬人化變異區之核酸(例如，DNA)序列[參見，例如，Kamman,M.,et al.,Nucl.Acids Res.17：5404(1989)]。編碼新CDRs之PCR引子可雜交至根據相同或非常類似人類變異區之事先擬人化之變異區之DNA模板[Sato,K.,et al.,Cancer Research 53：851-856(1993)]。若無可作為模板用之類似DNA序列，則可以合成之寡核苷酸建構包含編碼變異區序列的序列之核酸[參見，例如，Kolbinger,F.,Protein Engineering 8：971-980(1993)]。核酸中亦可併入編碼訊息胜肽之序列(例如，合成中，於嵌入載體中後)。若無可用之訊息胜肽序列(例如，通常不存在)，則可使用另一抗體之訊息胜肽序列[參見，例如，Kettleborough,C.A.,Protein Engineering 4：773-783(1991)]。使用彼等方法、本文敘述之方法或其他適當方法，可容易地製造變異體。除非另行指示，否則本發明抗體製造與使用之討論亦適用於彼等抗體之抗原結合片段。
本發明之抗體可為任何同型或亞型，包括IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)、IgM、IgA(例如，IgA1與IgA2)、IgD與IgE。該等抗體可包含衍生自人類κ或λ輕鏈之輕鏈。
於另一態樣中，本發明提供如本文敘述之抗體或其部分之變異體，其中該變異體特異性地結合於人類CD52，惟與參考抗體或其部分有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸置換之不同(例如，於CDR區、FR區、或恆定功能區中)。舉例而言，該變異抗體與參考抗體之重鏈、重鏈變異功能區、輕鏈、或輕鏈變異功能區，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%相同。
多肽之序列相似性或相同性通常使用序列分析軟體測定。蛋白質分析軟體使用指定各種置換、缺失與其他修飾(包括保守性胺基酸置換)之相似性衡量比較相似序列。舉例而言，GCG含有例如「Gap」與「Bestfit」等程式，可使用系統內定參數以測定密切相關多肽(例如得自不同生物物種或野生型蛋白與其變異蛋白間之同源多肽)間之序列同源性或序列相同性。參見，例如，GCG Version 6.1。亦可使用系統內定或建議參數之FASTA(GCG Version 6.1中之程式)比較多肽序列；FASTA(例如，FASTA2與FASTA3)提供查詢與搜尋序列間最佳部分重疊區域之排比及序列相同性百分比[Pearson,Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson,Methods Mol.Biol.132：185-219(2000)]。比較本發明序列與含有得自不同生物之大量序列資料庫之另一較佳演算法為電腦程式BLAST，尤其是使用系統內定參數之blastp或tblastn。參見，例如，Altschul et al.,J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997)，彼等併入本文以資參考。
本文所用之「胺基酸」係以其全名、其對應之三字母代碼、或其對應之單字母代碼表示，如下表所示：
根據本發明，可進行之一類型胺基酸置換為改變抗體中可能對另一殘基(例如，惟不限於，丙胺酸或絲胺酸)具化學反應性之一或多個半胱胺酸。於一具體實例中，有非典型(non-canonical)半胱胺酸之置換。該置換可於變異功能區之CDR或架構區中或於抗體之恆定功能區中進行。於若干具體實例中，該半胱胺酸係典型的。可進行之另一類型胺基酸 置換為移除抗體中之潛在蛋白分解位點。此類位點可能存在變異功能區之CDR或架構區中或抗體之恆定功能區中。半胱胺酸殘基之置換及蛋白分解位點之移除可降低抗體產物中之異質性風險，因此增加其同質性。另一類型胺基酸置換為經由改變一或兩個殘基，以消除形成潛在脫醯胺化位點之天冬醯胺-甘胺酸對。於本發明另一態樣中，使用見述於例如國際專利申請公告案WO 98/52976與WO 00/34317中之技術，可將抗體去免疫化以降低其免疫原性。
可於根據本發明之一變異體中進行之另一類型胺基酸置換為保守性胺基酸置換。「保守性胺基酸置換」乃其中胺基酸殘基被具相似化學性質(例如，電荷或疏水性)側鏈R基團之另一胺基酸殘基置換者。一般而言，保守性胺基酸置換不會實質上改變蛋白質之功能性。於二或多個胺基酸序列之保守性置換彼此不同之情形下，可向上調整序列相同性百分比或相似度以校正該置換之保守性。進行此調整之方法為熟習此項技藝人士所悉知。參見，例如，Pearson,Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。
具相似化學性質側鏈之胺基酸組群之實例包括1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸與異白胺酸；2)脂族-羥基側鏈：絲胺酸與蘇胺酸；3)含醯胺之側鏈：天冬醯胺與麩醯胺；4)芳族側鏈：***酸、酪胺酸、與色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸、與組胺酸；6)酸性側鏈：天冬胺酸與麩胺酸、及7)含硫側鏈：半胱胺酸與甲硫胺酸。較佳之保守性胺基酸置換組群為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、***酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸、及天冬醯胺-麩醯胺。替代地，保守性替換乃於Gonnet et al.,Science 256：1443-45(1992)中揭示之PAM250似對數矩陣中具正值之任何變化。"適度保守性"替換乃於PAM250似對數矩陣中具非負值之任何變化。
於特定具體實例中，針對本發明抗體或抗原結合部分之胺基酸置換乃為：(1)降低蛋白分解敏感性；(2)降低氧化作用敏感性；(3)改變結合親和力以形成蛋白質複合物，例如，增強抗體之ADCC與CDC活性；(4)賦予或修飾此等類似物之其他物理化學或功能性質，惟仍保留對人 類CD52之特異結合；(5)移除C端離胺酸；及(6)加入或移除醣基化位點者。於若干具體實例中，本發明抗CD52抗體重鏈之C端離胺酸不存在[Lewis et al.,Anal.Chem,66(5)：585-595(1994)]。
於一態樣中，本發明提供新型及新穎之多肽，其為本發明抗體之輕(或重)鏈，或為該輕(或重)鏈之含變異功能區部分。此類多肽由於可夥同相反之重(或輕)抗體鏈形成CD52結合分子而有用。一旦選定本發明抗體之初始VL或VH功能區，即可進行「混合及匹配」實驗，其中係從包含初始選定VL或VH區段之不同配對中，針對CD52結合進行篩選，選出較佳VL/VH配對組合。可使用一界定之變異功能區序列，經由篩選變異功能區庫之功能***變異功能區譜，以建造針對CD52之功能性抗體。參見，例如，Clackson et al.,Nature,352：624-628(1991)；Portolano et al.,J.Immunol.,150：880-887(1993)；Beiboer et al.,J.Mol.Biol.,296：833-849(2000)；Klimka et al.,British Journal of Cancer,.83：252-260(2000)。
就診斷或分析而言(如，成像以容許，例如，監測治療)，抗體(例如，其抗原結合片段)可包含可檢測之標記。適當可檢測標記及用於標記抗體或其抗原結合片段之方法為此項技藝中悉知。適當可檢測標記包括，舉例而言，放射性同位素(例如，銦-111、鎝-99m或碘-131)；正電子發射標記(例如，氟-19)；順磁性離子[例如，釓(III)、錳(II)]；抗原決定區標記(標籤)；親和力標記(例如，生物素、抗生物素蛋白)；自旋標記；酵素；螢光基團或化學發光基團。不使用標記時，可利用表面電漿共振、ELISA、FACS、或其他適當方法，測定複合物形成(例如，擬人化抗體與人類CD52間)。
用於本發明之抗CD52抗體與抗原結合片段亦可經由，例如，化學反應或基因修飾，共軛接合於增進抗體藥物動力學(例如，半衰期)之其他成分(moieties)(例如，聚乙二醇化成分)。於若干具體實例中，用於本發明之抗CD52抗體與抗原結合片段可經由，例如，化學共軛接合或基因修飾，連接於適當細胞介素(例如，附加細胞介素之編碼序列至抗體編碼序列之框架中，從而產生抗體：細胞介素融合蛋白)。
本發明亦有關免疫共軛接合物，其中本發明抗體或抗原結合片段係偶聯於另一治療劑，例如生物活性化合物(如，細胞介素、超級抗原、細胞毒性劑及毒素)。舉例而言，抗體或片段可偶聯於植物或細菌起源分子(或其衍生物)、介白素-2抗體、或白喉毒素抗體。
本發明抗體之穩定性
本發明抗體於貯存中穩定。相較於Ab26展示之穩定性，本發明抗體可具增強之穩定性。穩定性可於貯存一段時間後，利用測量抗體對CD52之結合親和力被顯示。欲證明穩定性，可於37℃或45℃及pH 7.0、7.5、或8.0下，培育抗體。可使抗體於含10mM琥珀酸鹽、10mM組胺酸、與10mM磷酸鈉、pH 7.5之緩衝液中培育。增強之穩定性可延長至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少5週、至少6週、至少7週、至少8週、至少9週、或至少10週。
核酸與重組載體
本發明亦係有關包含編碼本發明抗體、抗原結合片段、輕鏈、重鏈、或變異功能區等序列之單離及/或重組(包括，例如，實質上純)核酸分子。
於本文中稱為「單離」或「純化」之核酸係已從其來源之基因體DNA或細胞RNA分離出來之核酸(例如，呈存在細胞中或例如資料庫中之核酸混合物)，及包括利用本文敘述之方法或其他適當方法得到之核酸，包括實質上純之核酸、利用化學合成、組合生物與化學方法製造之核酸、及單離之重組核酸[參見例如，Daugherty,B.L.et al.,Nucleic Acids Res.,19(9)：2471-2476(1991)；Lewis,A.P.and J.S.Crowe,Gene,101：297-302(1991)]。
於本文中稱為「重組體」之核酸係已利用重組DNA方法(包括利用依賴人工重組方法，例如聚合酶連鎖反應(PCR)及/或使用限制酶選殖入載體中等程序產生之核酸)製造之核酸。「重組」核酸亦為經由細胞天然機制發生，惟於引入容許並使期望重組案例成為可能所設計之核酸至細胞後所挑選之重組案例所產生者。
更具體而言，本發明亦有關包含編碼對人類CD52具結合特異性之抗體、或該抗體之重鏈或輕鏈、或重鏈變異區、或輕鏈變異區之核苷酸序列之單離及/或重組核酸。
於若干具體實例中，核酸分子包含選自包括SEQ ID NOs：95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、或110之組群之核苷酸序列，其編碼抗CD52抗體之VL胺基酸序列。於若干具體實例中，核酸分子編碼SEQ ID NO：68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、或83之VL胺基酸序列。於若干具體實例中，核酸分子編碼與抗CD52參考抗體(例如，Ab26)之VL胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同之VL胺基酸序列。編碼Ab26之VL胺基酸序列之核苷酸序列可為SEQ ID NO：85。於若干具體實例中，核酸分子編碼包含相較於抗CD52參考抗體(例如，Ab26)之VL胺基酸序列，有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個突變之VL胺基酸序列；該等突變可位於CDR或FR中。
於若干具體實例中，核酸分子包含選自包括SEQ ID NOs：119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、或134之組群之核苷酸序列，其編碼抗CD52抗體之有或無訊息序列之輕鏈胺基酸序列。於若干具體實例中，核酸分子編碼SEQ ID NO：43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、或58之有或無訊息序列之輕鏈胺基酸序列。於若干具體實例中，核酸分子編碼之輕鏈胺基酸序列與抗CD52參考抗體(例如，Ab26)之輕鏈胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同。編碼Ab26之輕鏈胺基酸序列之核苷酸序列可為有或無訊息序列之SEQ ID NO：6。於若干具體實例中，核酸分子編碼包含相較於抗CD52參考抗體(例如，Ab26)之輕鏈胺基酸序列，有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個突變之輕鏈胺基酸序列；該等突變可位於CDR、FR、或恆定功能區中。
於若干具體實例中，核酸分子包含編碼抗CD52抗體之VH胺基酸序列之核苷酸序列。舉例而言，此核苷酸序列可為SEQ ID NO：84。於若干具體實例中，核酸分子編碼之VH胺基酸序列與抗CD52參考抗體(例如，Ab26)之VH胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同。編碼Ab26之VH胺基酸序列之核苷酸序列可為SEQ ID NO：84。於若干具體實例中，核酸分子編碼包含相較於抗CD52參考抗體(例如，Ab26)之VH胺基酸序列，有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個突變之VH胺基酸序列；該等突變可位於CDR或FR中。
於若干具體實例中，核酸分子包含編碼抗CD52抗體之有或無訊息序列之重鏈胺基酸序列之核苷酸序列。舉例而言，此核苷酸序列可為有或無訊息序列之SEQ ID NO：5。於若干具體實例中，核酸分子編碼之重鏈胺基酸序列與抗CD52參考抗體(例如，Ab26)之重鏈胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同。編碼Ab26之重鏈胺基酸序列之核苷酸序列可為有或無訊息序列之SEQ ID NO：5。於若干具體實例中，該核酸分子編碼包含相較於抗CD52參考抗體(例如，Ab26)之重鏈胺基酸序列，有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個突變之重鏈胺基酸序列；該等突變可位於CDR、FR、或恆定功能區中。
本發明核酸可用於生產對人類CD52具結合特異性之擬人化抗體。舉例而言，可將編碼本發明擬人化抗體之核酸[如，DNA(例如cDNA)、或RNA]或一或多個核酸併入適當建構體(如，重組載體)中，以供進一步序列操縱或於適當宿主細胞中生產經編碼之抗體。
本發明亦提供適用於表現對人類CD52具結合特異性之擬人化抗體之建構體或載體(例如，表現載體)。有多種載體可利用，包括於宿主細胞中維持單套或多套之載體，或成為整合至宿主細胞染色體中之載體。可將該等建構體或載體引入適當宿主細胞中，然後可培養生產及保持表現本發明擬人化抗體之細胞。可使用單一載體或多重載體表現對人類CD52具結合特異性之擬人化抗體。
適當表現載體(例如，哺乳動物細胞表現載體)亦可包含一些成分，包括，惟不限於下述一或多者：複製起始點；可選擇之標記基因；一或多個表現調控元件，例如轉錄調控元件(如，啟動子、增強子、終止子)，及/或一或多個轉譯訊息；用於靶定膜或分泌之訊息序列或前導序列。於建構體或載體中，訊息胜肽序列可由該建構體或載體或其他來源提供。舉例而言，可使用抗體之轉錄及/或轉譯訊息以引導表現。
於適當宿主細胞中，可提供用於表現之啟動子。啟動子可為構成性或誘導性。舉例而言，啟動子可操作地連接於編碼擬人化抗體或抗體鏈之核酸，俾使其引導編碼多肽之表現。有多種適當啟動子可供原核(例如，大腸桿菌之lac、tac、T3、T7啟動子)及真核[例如，酵母酒精去氫酶(ADH1)、SV40、CMV]宿主利用。熟習此項技藝人士具有挑選用於表現本發明抗CD52抗體或其部分之適當啟動子之能力。
此外，載體(例如，表現載體)一般包含用於挑選攜帶該載體之宿主細胞之可選擇標記，於可複製載體之情形下，為複製起始點。編碼賦予抗生素或藥物抗性產物之基因為常見之可選擇標記，可用於原核細胞(例如，β-內醯胺酶基因[安比西林(ampicillin)抗性]、Tet基因(四環黴素抗性)及真核細胞(例如，新黴素[G418或建那黴素(geneticin)]、gpt(黴酚酸)、安比西林、或潮黴素抗性基因)。二氫葉酸還原酶標記基因容許於各種宿主中以胺甲喋呤挑選。編碼宿主之營養缺陷標記基因產物之基因(例如，LEU2、URA3、HIS3)常於酵母中作為可選擇標記用。亦涵蓋使用病毒(例如，桿狀病毒)或噬菌體載體，及能整合入宿主細胞基因體內之載體(例如，反轉錄病毒載體)。
本發明因此係有關編碼本發明之擬人化抗體、擬人化輕鏈、擬人化重鏈之單離核酸分子。本發明亦有關編碼抗體及其鏈之抗原結合部分之單離核酸分子。由本發明核酸編碼之多肽序列敘述於上文及下述實施例中。
於若干具體實例中，本發明之核酸或載體編碼本發明之重鏈(或其抗原結合部分)或輕鏈(或其抗原結合部分)。於其他具體實例中， 本發明之核酸或載體編碼本發明之重鏈與輕鏈(或其抗原結合部分)二者。可使用含有重鏈編碼核酸以及輕鏈編碼核酸或編碼重鏈與輕鏈二者之單一核酸之宿主細胞製造包含重鏈與輕鏈(或抗體之抗原結合部分)之抗體。重鏈編碼核酸與輕鏈編碼核酸可置於分開之表現載體中；彼等亦可於相同或不同表現調控下，置於單一表現載體中。參見，例如，Cabilly U.S.Pat.6,331,415；Fang U.S.Pat.7,662,623。
生產具有對人類CD52特異性之抗體之方法
本發明另一態樣係有關製造本發明抗人類CD52抗體之方法。本發明抗體，舉例而言，可利用編碼該抗體之一或多個重組核酸於適當宿主細胞中之表現予以生產。該宿主細胞可使用任何適當方法產生。舉例而言，可將本文敘述之表現建構體(如，一或多個載體，例如，哺乳動物細胞表現載體)引入適當宿主細胞中，然後將所得細胞於適於建構體或載體表現之條件下供養(例如，於培養物中、動物中、植物中)。適當之宿主細胞可為原核細胞，包括細菌細胞(例如大腸桿菌(例如，DH5αTM株(Invitrogen,Carlsbad,Calif.))、枯草桿菌(B.subtilis)及/或其他適當細菌)；真核細胞，例如真菌或酵母細胞(例如，巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、麴菌屬(Aspergillus sp.)、啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、紅麵包黴(Neurospora crassa)，或其他低等真核細胞)，及較高等之真核生物細胞，例如得自昆蟲(例如，果蠅施耐德(Schnieder)S2細胞、Sf9昆蟲細胞(WO 94/26087(O’Connor)、TN5B1-4(HIGH 5)昆蟲細胞(Invitrogen)、哺乳動物(如，COS細胞，例如，COS-1(ATCC登錄編號CRL-1650)與COS-7(ATCC登錄編號CRL-1651))、CHO(例如，ATCC登錄編號CRL-9096)、CHO DG44(Urlaub,G.and Chasin,L A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77(7)：4216-4220(1980))、293(ATCC登錄編號CRL-1573)、HeLa(ATCC登錄編號CCL-2)、CV1(ATCC登錄編號CCL-70)、WOP(Dailey,L.,et al.,J.Virol.,54：739-749(1985))、3T3、293T(Pear,W.S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90：8392-8396(1993))、NS0細胞、SP2/0細胞、HuT 78細胞等)，或植物(例如，菸草、青萍(浮萍)、與 藻類)。(參見，例如，Ausubel,F.M.et al.,eds.Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc.(1993))。於若干具體實例中，宿主細胞不為多細胞生物(例如，植物或動物)之一部分，例如，其為單離之宿主細胞或細胞培養物一部分。
本發明亦有關包含本發明核酸[如，載體(例如，表現載體)]之細胞。舉例而言，編碼擬人化抗體(該抗體具有對人類CD52之結合特異性)之重鏈與輕鏈之核酸(亦即，一或多個核酸)或包含此類核酸之建構體(亦即，一或多個建構體，例如，一或多個載體)，於該核酸係(或已)可操作地連接於一或多個表現調控元件下，可利用適於所選定宿主細胞之方法(例如，轉形、轉染、電穿孔、感染)，引入適當宿主細胞中(例如，於載體中、經由細胞之進程產生之建構體中、整合至宿主細胞基因體中)。於適於表現之條件下(例如，於誘導物、補充適當鹽類、生長因子、抗生素、營養補充物等之適當培養基存在下)供養宿主細胞，從而生產編碼多肽。需要時，舉例而言，可從宿主細胞、培養基、或乳液中單離該編碼蛋白質(例如，擬人化抗體、小鼠抗體、嵌合抗體)。此過程涵蓋於基因轉殖動物或植物(例如，菸草)之宿主細胞(例如，乳腺細胞)中之表現。(參見例如，WO 92/03918)。
可製造其中抗體部分(例如，抗原結合片段、抗體鏈)連接於融合蛋白質N端位置、C端位置或內部位置之非抗體成分(亦即，不出現於天然存在抗體中之成分)之融合蛋白質。舉例而言，若干具體實例可利用於適當表現載體[例如，pET載體(如，pET-15b，Novagen)、噬菌體載體(如，pCANTAB 5 E，Pharmacia)、或其他載體(如，pRIT2T蛋白質A融合載體，Pharmacia)]中嵌入編碼抗體序列之核酸予以製造。將所得建構體引入適當宿主細胞中表現。表現後，若干融合蛋白質可利用適當親和性基質，從細胞溶解物中單離或純化[參見，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,F.M.et al.,Eds.,Vol.2,Suppl.26,pp.16.4.1-16.7.8(1991)]。
本發明係有關包含編碼本文所提供抗體(例如，抗體、輕鏈或重鏈、輕鏈變異區或重鏈變異區)之重組核酸之宿主細胞。本發明亦有關包含編碼抗體或其鏈之抗原結合部分之重組核酸之宿主細胞。於若干具體實例中，宿主細胞包含本文提及之本發明之重組載體(例如，表現載體、哺乳動物細胞表現載體)。
本發明亦有關製備本發明抗體或抗體多肽鏈之方法。於一具體實例中，該方法包括於適於表現抗體或多肽鏈之條件下，供養本文敘述之本發明宿主細胞(例如，包含編碼抗體或多肽鏈(例如，本發明之輕鏈與重鏈、僅輕鏈、或僅重鏈)之一或多個單離核酸之宿主細胞)。舉例而言，宿主細胞可培養於基質上或懸浮液中。於若干具體實例中，該方法進一步包括純化或單離抗體或多肽鏈之步驟。
可使用偶聯於DYNABEADS M-270胺(Dynal)之CD52，根據廠商之建議進行挑選。替代地，使用生物素化之CD52之挑選，可使用一級胺特殊試劑琥珀醯亞胺基-6-(生物素胺基)己酸酯，遵循廠商使用說明書(EZ link NHS LC Biotin,Pierce)製備。
得自挑選之產品(outputs)可呈周質(periplasmic)製劑，根據測量scFv或IgG競爭結合於CD52能力之競爭分析，以高通量篩選測試。
能於高通量篩選中競爭之試樣可如Vaughan et al.(1996)及Osburn et al.(1996)中所述進行DNA定序。接著使選殖株表現並純化scFv或IgG及使用例如抗體依賴性細胞傳介之細胞毒性(ADCC)分析與補體依賴性細胞毒性(CDC)分析等分析法評估其結合CD52、中和CD52或其組合之能力。然後可如WO 01/66754實例3中所述，製備純化scFv製劑。純化scFv或IgG製劑之蛋白質濃度可使用BCA方法(Pierce)測定。類似方法可用於篩選固定抗體重鏈或輕鏈(或VH或VL)之最適夥伴(相對鏈)。
本發明抗體可呈純化或單離形式[如，已與其來源(如，細胞上清液，例如於資料庫中抗體混合物之混合物中)之分子(如，胜肽)分離]；及包括利用本文敘述之方法或其他適當方法得到之抗體。單離抗體 包括本質上純(實質上純)之抗體，及利用化學合成、重組技術與其組合製造之抗體。
含毒素成分或毒素之抗體
本發明亦有關包含毒素成分或毒素之抗體。適當之毒素成分包含毒素(例如，界面活性毒素、細胞毒素)。毒素成分或毒素可使用任何適當方法連接或共軛接合於抗體。舉例而言，毒素成分或毒素可直接或經由適當連接子共價結合於抗體。適當連接子可包括不可切割或可切割之連接子，例如，pH可切割連接子或包含細胞酵素切割位點之連接子。此類可切割連接子可用於製備抗體內在化後可釋出毒素成分或毒素之抗體。
多種方法可用於連接或共軛接合毒素成分或毒素至抗體。所挑選之特定方法係取決於毒素成分或毒素及欲連接或共軛接合之抗體。需要時，可使用含末端官能基之連接子以連接抗體與毒素成分或毒素。通常，共軛接合可藉由含反應性官能基之毒素成分或毒素(或經修飾以含有反應性官能基)與連接子或直接與抗體反應而完成。共價鍵之形成係藉由含(或經修飾而含)化學成分或官能基之毒素成分或毒素，可於適當條件下與第二個化學基團反應從而形成共價鍵。需要時，可使用任何適當方法，添加適當反應性化學基團於抗體或連接子。[參見，例如，Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press：San Diego,Calif.(1996)]。許多適當之反應性化學基團組合為此項技藝中已知，舉例而言，胺基可與親電子基團[例如，甲苯磺酸根、甲磺酸根、鹵素、N-羥基琥珀醯亞胺基酯(NHS)等]反應。硫醇類可與順丁烯二醯亞胺、碘乙醯基、丙烯醯基、吡啶基二硫化物、5-硫醇基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇基)等反應。醛官能基可偶聯至含胺或醯肼之分子，及疊氮基團可與三價磷基反應以形成胺基磷酸酯或磷醯亞胺等鍵結。引入活化基團至分子中之適當方法為此項技藝中已知[參見例如，Hermanson,G。T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press：San Diego,Calif.(1996)]。
適當之毒素成分與毒素包括，例如，美登醇(maytansinoid)、紫杉烷、卡奇黴素(calicheamicin)、多卡黴素(duocarmycin)、 或其衍生物。美登醇可為，例如，美登木醇(maytansinol)或美登木醇類似物。美登木醇類似物之實例包括具有經修飾之芳族環及於其他位置經修飾者。美登木醇與美登木醇類似物見述於，例如，美國專利案5,208,020與6,333,410中，其內容均併入本文以資參考。美登木醇可使用，例如，3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺酯[亦為所謂4-(2-吡啶二硫代)戊酸N-琥珀醯亞胺酯(或SPP)]、4-琥珀醯亞胺基-氧羰基-a-(2-吡啶二硫代)-甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶二硫代)丁酸N-琥珀醯亞胺酯(SDPB)、2-亞胺基四氫噻吩(iminothiolane)、或S-乙醯基琥珀酸酐偶聯至抗體與抗體片段。紫杉烷可為，例如，紫杉醇、剋癌易(taxotere)、或新穎紫杉烷(參見，例如，WO 01/38318)。卡奇黴素可為，例如，溴複合物卡奇黴素、碘複合物卡奇黴素、或其類似物與模擬物。溴複合物卡奇黴素包括I1-BR、I2-BR、I3-BR、I4-BR、J1-BR、J2-BR與K1-BR。碘複合物卡奇黴素包括I1-I、I2-I、I3-I、J1-I、J2-I、L1-I與K1-BR。卡奇黴素及其突變體、類似物與模擬物見述於，例如，美國專利案4,970,198、5,264,586、5,550,246、5,712,374、與5,714,586中，各者內容均併入本文以資參考。多卡黴素類似物見述於，例如，美國專利案5,070,092、5,187,186、5,641,780、5,641,780、4,923,990、與5,101,038中，各者內容均併入本文以資參考。
其他毒素之實例包括，惟不限於，抗代謝物、烷化劑、蒽環類、抗生素、與抗有絲***劑。毒素亦可為界面活性毒素(例如為自由基產生劑之毒素)，或含放射性核種之成分。毒素可為，例如，得自細菌源或植物蛋白質之蛋白質、多肽或胜肽。
經設計用以對負責產生特定標靶蛋白質之mRNA約束、禁止、促進降解或阻止生成之核酸反義化合物亦可作為毒素之用。反義化合物包括反義RNA或DNA、單或雙股、寡核苷酸、或其類似物，其可特異性地與獨特之mRNA種類雜交，防止mRNA種類之轉錄及/或RNA處理及/或編碼多肽之轉譯，從而造成各個編碼多肽之量減少。Ching,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10006-10010(1989)；Broder,et al.,Ann.Int.Med.113：604-618(1990)；Loreau,et al.,FEBS Letters 274：53-56(1990)。
毒素亦可為光敏感劑。適當之光敏感劑包括紫質系物料例如蔔吩姆鈉(porfimer sodium)、綠紫質、二氫卟吩(chlorin)E6、血紫質衍生物本身、酞青素、初紫紅素(etiopurpurins)、德紫質(texaphrin)等。毒素可為結合細胞內標靶之抗體或抗體片段。此類抗體或抗體片段可被導引至界定之次細胞區室或標靶。
治療方法及組成物
醫藥組成物包含治療有效量之一或多個抗體及視需要之醫藥上可接受之載劑。醫藥上可接受之載劑包括，例如，水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽液、葡萄糖、甘油、乙醇等、以及其組合物。醫藥上可接受之載劑可進一步包含少量輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑、或緩衝液，以增強融合蛋白質之櫥存期限或有效性。組成物可調配以提供給藥後活性成分之快速、持續、或延後釋放。適當之醫藥組成物及其製備方法為此項技藝中悉知。參見，例如，Remington(2005),THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY,A.Gennaro,et al.,eds.,21st ed.,Mack Publishing Co.。醫藥組成物可進一步包含免疫抑制/免疫調節及/或抗發炎之製劑。於需要此類治療之病患中，治療免疫疾病之方法可包括投予病患有效治療量之醫藥組成物。舉例而言，於自體免疫、移植排斥、或過敏反應期間，拮抗CD40傳介之T細胞活化可抑制不為所欲之T細胞反應發生。抑制CD40傳介之T細胞活化可緩和彼等疾病之進展及/或嚴重性。
本文所用之「病患」意指動物，例如，哺乳動物，包括人類。病患可能被診斷有免疫疾病或癌症。「治療」係指涉及減輕徵候、疾患、症狀、或疾病之進展或嚴重性之過程。「免疫疾病」係指任何與個體免疫反應(包括細胞性及/或體液性免疫反應)之形成關聯之疾病。免疫疾病之實例包括，惟不限於，發炎、過敏、自體免疫疾病、或與移植相關之疾病。自體免疫疾病可選自包括全身性紅斑性狼瘡、多發性硬化症、類風濕性關節炎、糖尿病、牛皮癬、硬皮症、動脈粥狀硬化症、發炎性腸道疾病、與潰瘍性結腸炎之組群。
本發明抗體可用於免疫抑制與免疫切除。該等抗體靶定表現CD52之細胞(例如，T與B細胞)，於有其需要之對象中降低(或如本文所用之「消減」)其總數。淋巴細胞之消減可用於治療多種疾病與症狀，例如發炎、自體免疫疾病、與癌症[例如，淋巴細胞(B細胞或者T細胞)惡性腫瘤]。參見，例如，Reiff,A.,Hematology,10(2)：79-93(2005)。可用本發明抗體或抗原結合部分治療之疾病與症狀之實例包括，惟不限於，多發性硬化症、紅斑性狼瘡、類風濕性關節炎、移植物抗宿主病(GVHD)、發炎性腸道疾病、血管炎、貝塞特氏(Behcet’s)疾病、韋格納肉芽腫、蕭格倫(Sjogren’s)症候群、葡萄膜炎、牛皮癬、硬皮症、多發性肌炎、第一型(自體免疫型)糖尿病、自體免疫血細胞減少症(例如，自體免疫嗜中性白血球減少症、輸血依賴性頑固PRCA、白血病及淋巴瘤例如有巨瘤症(bulky disease)之非霍奇金氏淋巴瘤與B細胞慢性淋巴球性白血病(CLL)。抗體亦可預防性投予，以預防炎症之發病，或自體免疫疾病或癌症之復發。舉例而言，本發明抗體可以呈調理療法之一部分投予，為病患之移植(例如，幹細胞移植、同種異體T細胞之自體輸注、或實質器官移植)作準備。於若干具體實例中，本發明抗體及抗原結合部分係用於製造治療免疫疾病或癌症之藥劑。
可使用任何適當方法或途徑投予抗體多肽或醫藥組成物。視欲治療之疾病或症狀而定，給藥途徑包括，例如，非經腸(例如，靜脈內、動脈內、肌內、脊髓腔內、腹膜內、皮下注射)、口服(例如，飲食)、局部(locally)、局部(topical)、吸入(例如，支氣管內、鼻內或口腔吸入、鼻腔滴入)、或經直腸。投予抗體多肽之有效治療劑量視許多因素而定，包括，例如，被治療免疫疾病之類型與嚴重性、組合物治療之使用、抗體多肽或醫藥組成物之給藥途徑、及病患體重。抗體有效治療量之非限制性範圍，相對於病患體重，為0.1-20毫克/公斤；於一態樣中，為1-10毫克/公斤。抗體多肽之劑量可根據於疾病狀況活體外及/或活體內模式中之CD52拮抗作用所需抗體多肽之量進一步引導。
本發明抗體可於健康照護提供者認為合適之任何時間點，以單一單位劑量或多次劑量投予。其劑量可利用此項技藝中已知之方法決定，及可視，例如，個體之年齡、敏感性、耐受性及整體健康狀態而定。抗體或其部分可經數小時(例如，3、4、5、或6小時)之輸注進行投予。抗體或其部分可以各種適當之療法進行投予，例如，繼續2、3、4、5、或6天一或多個週期，其間間隔3個月或3個月以上(例如，12或24個月)。任一週期所投予抗CD52抗體之總劑量可為10至60毫克。於一具體實例中，本發明之抗體或其部分係使用與Campath-1H®相同之給藥療法投予。
本發明抗體可單獨或連同另一製劑(例如，免疫抑制劑)組合治療投予個體(例如，人類)。該抗體可於附加製劑給藥前、一起或之後投予。於若干具體實例中，附加製劑為，例如，抗發炎化合物如柳氮磺胺吡啶、另一非類固醇類抗發炎化合物、或類固醇類抗發炎化合物。於若干具體實例中，附加製劑為另一消減淋巴細胞抗體，例如另一抗CD52抗體、抗CD20抗體、抗BAFF抗體、抗BAFF-R抗體等。於若干具體實例中，附加製劑為，例如，細胞介素(例如，IL-7)、抗細胞介素受體抗體、或可溶性受體，其偏離、操縱、及/或加強由抗CD52抗體傳介之淋巴細胞消減後發生之再組成程序[參見，例如，Sportes et al.,“Cytokine Therapies：Ann.N.Y.Acad.Sci.1182：28-38(2009)]。於另一具體實例中，合成之胜肽模擬物可與本發明抗體一起投予。
由於本發明抗體靶定CD52表現細胞，因此該等抗體亦可用於消減T細胞與B細胞以外之CD52+細胞類型。舉例而言，研究已顯示，血管白血球(VLC)與Tie2+單核細胞(表現高量CD52之髓樣細胞)促進腫瘤血管生成及促成對抗VEGF療法之腫瘤抗性。Pulaski et al.,J.Translational Med.7：49(2009)。本發明之抗CD52抗體因而可經由靶定VLC與Tie2+單核細胞而抑制腫瘤血管生成。為此目的，抗CD52抗體可全身性或局部地於新血管形成之位點(例如腫瘤位點)投予。抗CD52抗體療法可與標準照護癌症治療(例如化學療法、外科手術、或放射)或與另一標靶療法(例如抗VEGF抗體療法)一起使用。抗CD52抗體療法可用於治療，例如，乳癌、肺癌、 神經膠質瘤、結腸直腸癌、及抗VEGF抗體之任何其他徵兆。抗CD52抗體療法亦可用於其他新血管形成症狀，包括非致癌之新血管形成症狀。
研究已顯示，阿侖滋單抗之淋巴細胞消減係經由嗜中性白血球與NK細胞傳介(Hu et al.,Immunology 128：260-270(2009))。因此，於組合治療之具體實例中，可於抗CD52抗體療法之前、期間、或之後，投予病患刺激嗜中性白血球與NK細胞之製劑，以增強抗體療法。刺激嗜中性白血球及/或NK細胞包括，惟不限於，(1)增加其***速率；(2)增加其對應於抗CD52抗體同型之Fc受體(例如，FcγRIIIa與FcγRIIIb、FcγRII、FcγRI、及FcαRI)之細胞表面表現；(3)動員及增加循環之細胞數；(4)吸收細胞至標靶位點(例如，腫瘤、發炎、或損害組織之位點)；(5)及增強其細胞毒性活性。刺激嗜中性白血球及/或NK細胞製劑之實例包括，例如，顆粒細胞單核細胞群落刺激因子(GM-CSF)[例如，LEUKINE®或沙格司亭(sargramostim)與莫拉司亭(molgramostim)]；顆粒細胞群落刺激因子(G-CSF)[例如，NEUPOGEN®或非格司亭(filgrastim)、聚乙二醇化非格司亭、與來格司亭(lenograstim)]；干擾素-γ(例如，ACTIMMUNE®)；CXC趨化素受體4(CXCR4)拮抗劑[例如，MOZOBILTM或普樂沙福(plerixafor)]；及CXC趨化素受體2(CXCR2)促效劑。病患之嗜中性白血球數可定期監測，以確保最佳治療功效。病患之嗜中性白血球數亦可於開始抗CD52抗體治療前測量。刺激劑之量可根據病患之嗜中性白血球數調整。若病患具有比正常更低之嗜中性白血球數，則可使用較高劑量之刺激劑。於嗜中性白血球減少期間，其可能係由於使用抗CD52抗體治療所引起，亦可投予較高劑量之嗜中性白血球刺激劑以最大化抗CD52抗體之效果。
由於嗜中性白血球及/或NK刺激增進抗CD52抗體療法之功效，因此組合治療之此具體實例容許於病患中使用較少抗體而同時保持類似之治療功效。於同時保持治療功效下使用較少抗CD52抗體有助於降低抗CD52抗體之副作用，包括病患對所投予抗體之免疫反應以及形成次級自體免疫(抗CD52抗體治療期間或之後產生之自體免疫)。組合療法之此 具體實例亦可用於腫瘤科安置(setting)，例如，在病患具有嗜中性白血球減少症時。
於組合治療之另一具體實例中，可使用調節型T細胞之刺激劑加強抗CD52抗體療法。頃已證實，相較於其他CD4+ T細胞比較，抗CD52抗體消減CD4+CD25+FoxP3+調節型T細胞到少很多之程度。調節型T細胞(亦為所謂「Treg」或抑制型T細胞)係能經由接觸依賴性或無關接觸(例如，產生細胞介素)之機制抑制其他類淋巴細胞增殖及/或功能之細胞。已有數種類型調節型T細胞被敘述，包括γδ T細胞、天然殺手T(NKT)細胞、CD8+T細胞、CD4+ T細胞、及雙陰性CD4-CD8-T細胞。參見，例如，Bach et al.,Immunol.3：189-98(2003)。CD4+CD25+FoxP3+調節型T細胞已被稱為「天然存在」之調節型T細胞；其表現CD4、CD25與叉頭家族轉錄因子FoxP3[叉頭盒p3蛋白(forkhead box p3)]。因此，於組合治療之此具體實例中，可於抗CD52抗體療法之前、期間或之後，投予刺激CD4+CD25+FoxP3+調節型T細胞之製劑，以於淋巴細胞消減後扭曲(skew)免疫系統之組成。該製劑可，例如，活化彼等T細胞、穩定及/或擴大該等細胞之族群、動員及增加細胞之循環、及/或吸收細胞至標靶位點。此類製劑之實例為雷帕黴素(rapamycin)；活性或潛伏之TGF-β(例如，TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、與TGF-β5)；IL-10；IL-4；IFN-α；維生素D(例如，維生素D3)；***(dexamethasone)；及黴酚酸酯(mycophenolate mofetil)[參見，例如，Barrat et al.,J.Exp.Med.195：603-616(2002)；Gregori et al.,J Immunol.167：1945-1953(2001)；Battaglia et al.,Blood 105：4743-4748(2005)；Battaglia et al.,J.Immunol.177：8338-8347(2006)]。
本發明中，用於治療疾病之抗CD52抗體之有效量為幫助治療對象達到一或多個期望臨床指標(clinical endpoint)之量。例如，就紅斑性狼瘡而言(其症狀包括全身性紅斑性狼瘡、狼瘡性腎炎、皮膚性紅斑性狼瘡、CNS紅斑性狼瘡、心血管症狀、肺部症狀、肝臟症狀、血液症狀、胃腸症狀、肌肉骨骼症狀、新生兒紅斑性狼瘡、兒童全身性紅斑性狼瘡、藥物引起之紅斑性狼瘡、抗磷脂質症候群、及導致紅斑性狼瘡症狀之補體 缺陷症候群；參見，例如，Robert G.Lahita,Editor,Systemic Lupus Erythematosus,4th Ed.,Elsevier Academic Press,2004)，可經由監測受影響之器官系統(例如，狼瘡性腎炎之血尿及/或蛋白尿)，及/或使用提供跨越數個器官系統疾病嚴重性複合分數(例如，BILAG、SLAM、SLEDAI、ECLAM)之疾病活性指數，測量臨床指標。參見，例如，Mandl et al.,“Monitoring patients with systemic lupus erythematosus”in Systemic Lupus Erythematosus,4th edition,pp.619-631,R.G.Lahita,Editor,Elsevier Academic Press,(2004)。
本發明抗體或其部分可用於治療先前已以Campath-1H®治療，並對Campath-1H®形成中和抗體之個體(例如，Campath-1H®頑固型個體)。舉例而言，可治療先前已以Campath-1H®治療(例如，以一或多個Campath-1H®治療療程)並對Campath-1H®形成中和抗體，降低進一步Campath-1H®治療功效之具自體免疫疾病(例如，多發性硬化症、紅斑性狼瘡、血管炎)及/或癌症[例如，白血病(如，慢性淋巴球性白血病)、淋巴瘤(例如，非霍奇金氏淋巴瘤)]之個體。於另一具體實例中，可用本文敘述之其他擬人化抗體之一者治療已成為難以本文敘述之特定擬人化抗體治療之個體。
舉例而言，本發明之抗體或其部分為治療多發性硬化症(MS)之有效治療劑。MS包括復發緩解型、續發進展型、原發進展型、及進展復發型多發性硬化症[Lublin et al.,Neurology 46(4),907-11(1996)]，係利用，例如，症狀史及於例如核磁共振造影(MRI)、脊椎穿刺、誘發電位測試、與血液試樣之實驗室分析等檢測幫助下之神經系統檢查，進行診斷。於MS中，治療之目標乃欲降低復發之風險、頻率、及/或嚴重性，預防或降低由疾病進展引起之失能，及促進組織修復。因此，幫助達到與一或多個彼等目標一致的臨床指標之抗CD52抗體量為抗體之有效治療量。舉例而言，本發明之抗CD52抗體或其部分可被指示用於治療MS復發型，以減緩或逆轉身體失能之累積及降低臨床急性發作之頻率。該抗體或其部分可於臨床試驗中測試其於降低復發風險及臨床上顯著失能進展風險之 功效。該抗體或其部分可投予具有活性復發或瀕臨形成復發風險中之病患，或經歷進行性功能退化之病患。參見例如，美國專利公告案2008/0267954，其全部揭示內容併入本文以資參考。
本發明之方法與組成物可用於治療對先前之MS修飾療法反應欠佳之MS病患。該MS病患可為復發緩解型(RRMS)病患，其先前已接受MS修飾療法，例如，干擾素β-1a(如，AVONEX®與REBIF®)、干擾素β-1b(如，BETASERON®與EXTAVIA®)、乙酸格拉默(glatiramer acetate)(如，COPAXONE®)、米托蒽醌(mitoxantrone)(如，NOVANTRONE®)、那他珠單抗(natalizumab)(如，TYSABRI®)、芬戈莫德(fingolimod)(如，GILENYA®)、及特立氟胺(teriflunomide)(如，AUBAGIOTM)。於一具體實例中，先前之MS修飾療法並非阿侖滋單抗(如，CAMPATH、MABCAMPATH、或LEMTRADATM)或另外之抗CD52抗體。該先前治療病患可能於正在治療或治療後不久(例如，一年之內)具有MS復發或更新(renewd)之MS活性。更新之MS活性可包括得自MS之新或惡化之神經徵候、病患EDSS評分增加(Kurtzke,Neurology 1983；33：1444-52)、病患多發性硬化症功能複合量表(MSFC)評分減少[Cutter et al.,Brain 1999；122(Pt 5)：871-82]、新或增大之腦或脊髓損傷、腦容積縮小、及/或經由光同調斷層掃瞄(OCT)確定之神經退化。例如，當病患以干擾素β或格拉默治療時，可能已至少具有一個先前之復發。病患亦可能具有至少一種下述特徵：於開始第一個週期抗CD52抗體治療之前10年或少於10年，症狀發作；於開始第一個週期抗CD52抗體治療之前兩年內至少發作兩次；於用干擾素β或格拉默治療至少6個月後，至少有一次復發；擴展失能狀態量表(EDSS)評分5.0或更低；及腦與脊髓之核磁共振造影(MRI)異常。
於一具體實例中，本發明抗體或其部分係投予具有自體免疫疾病[例如，多發性硬化症(MS)]之MS病患，其給藥方案包含投予第一個週期抗體，隨後為至少一個另一週期之抗體，其中各治療週期包含以連續天數施用1至5個劑量，及其中各治療週期係與下一週期至少間隔1至24個月(例如，12個月)。舉例而言，於一具體實例中，具有多發性硬化症之 病患以包含5個抗體日劑量之第一個週期抗體治療，隨後為至少一個另一週期之抗體治療，其中該治療發生於第一個週期之後一年，及包含以連續天數施用3個抗體劑量。於一具體實例中，抗CD52抗體係於第一個治療週期中，以12毫克/天，5個連續天數投予具有多發性硬化症之病患；一年後，於第二個治療週期中，以12毫克/天，三個連續天數投予該病患抗CD52抗體。於一具體實例中，抗CD52抗體係於第一個治療週期中，於5個連續天數期間，以60毫克之總劑量投予具有多發性硬化症之病患；於一年後，於第二個治療週期中，於3個連續天數期間，以36毫克之總劑量投予該病患抗CD52抗體。
於本發明之方法與組成物中，「年」不一定要正好等於365天或12個月。舉例而言，抗CD52抗體之第二個週期不一定要於投予抗CD52抗體第一個週期之後正好365天或12個月投予。第二個週期可於第一個週期開始後365天加或減長達6個月、加或減長達5個月、加或減長達4個月、加或減長達3個月、加或減長達2個月、加或減長達1個月、加或減長達4週、加或減長達3週、加或減長達2週、或加或減長達1週開始。
於另一具體實例中，具MS之病患僅於一旦觀察到更新MS活性之證據時才再治療(參見，例如，WO 2008/031626，其全部揭示內容均併入本文以資參考)。於若干具體實例中，若具有更嚴重形式之MS或更進展形式之其他自體免疫疾病[例如血管炎；參見，例如，Walsh et al.,Ann Rheum Dis 67：1322-1327(2008)]之病患，於其最後治療過程後經歷提早復發或顯示更新之MS活性，則可能需要投予更頻繁之治療過程(例如，每4個月、每6個月)。更新MS活性之證據可使用臨床醫師可用之任何方法，根據治療之臨床醫師之專業判斷而確定。現今，有多種技術可提供臨床醫師以診斷更新MS活性，包括，惟不限於，臨床方法(神經系統失能之復發或進展)或腦或脊髓之核磁共振造影(MRI)。如開業醫師所悉知，經由MRI檢測之疾病活性可由T1(增強或未增強)或T2加權影像上大腦或脊髓新損傷之出現或由此類損傷量之增加來指示。
由於MS診斷方法正持續發展，預期未來可能有更多檢測更新MS活性之方法(例如，磁化轉化比率或MR光譜術)。用於檢測更新MS活性之特定診斷方法不受限於本發明申請專利範圍。於特定具體實例中，在治療週期後之固定時間間隔進行重複之MRI，以確定任何特定病患是否需要再治療及此類病患再治療之最適時間點。通常，一般期盼於臨床上疾病再顯現前進行再治療。
本發明之方法與組成物可與其他MS修飾療法組合使用。MS修飾療法之非限制性實例包括干擾素β-1a(例如，AVONEX®與REBIF®)、干擾素β-1b(例如，BETASERON®與EXTAVIA®)、醋酸格拉默(例如，COPAXONE®)、米托蒽醌(例如，NOVANTRONE®)、那他珠單抗(例如，TYSABRI®)、芬戈莫德(例如，GILENYA®)、及特立氟胺(例如，AUBAGIO®)。
於若干具體實例中，本發明之方法與組成物可與廣義或非特定治療或療法[例如，類固醇類(如，皮質類固醇類)或達伐吡啶(dalfampridine)(如，AMPYRA®)]組合使用。
於一態樣中，可於輸注抗CD52抗體之前、期間、或之後，投予熟習此項技藝人士悉知之能有效處理輸注相關副作用之藥物。此類藥物包括皮質類固醇類(例如，甲基去氫皮質醇)、乙醯胺酚、與抗組織胺類[例如，雙苯羥基胺(diphenhydramine)]。於若干具體實例中，病患於以本發明抗體治療週期期間，於1、2、3、4、或5個連續天，以靜脈注射接受1克/天之甲基去氫皮質醇。
於本發明之一具體實例中，病患可同時接受作為預防疱疹用之藥物。舉例而言，病患可於本發明抗體給藥期間及之後28天，每天兩次接受200毫克之無環鳥糞核苷(acyclovir)(例如，ZOVIRAX®)。
配方將根據所選定之給藥途徑而不同(例如，溶液、乳液)。包含欲投予之抗體或抗原結合片段之適當組成物可於生理上可接受之載體或載劑中製備。該組成物可包含多次劑量或為單一單位劑量之組成物。就溶液或乳液而言，適當載劑包括，例如，包含鹽水與緩衝介質之水性或 酒精性/水溶液、乳液或懸浮液。非經腸載體可包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖與氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發油。靜脈內載體可包括各種添加劑、防腐劑、或流體、營養物或電解質補充劑(一般參見，Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th Edition,Mack Publishing Co.,PA,1985)。就吸入而言，可將化合物溶解並裝填至給藥用之適當分配器中[例如，噴霧器(atomizer)、噴霧器(nebulizer)或加壓之氣溶膠分配器]。
診斷方法與組成物
本發明抗體亦可用於研究與診斷上應用之各種程序。舉例而言，其可用於檢測、單離、及/或純化人類CD52或其變異體[如，利用親和力純化或其他適當方法，例如，用於懸浮液中之細胞(如淋巴細胞)之流式細胞測量術]，及研究人類CD52結構(如，構形)與功能。本發明之抗體可用於活體外應用。
本發明抗體可用於診斷應用(如，活體外、擬體內)。舉例而言，本發明之擬人化抗體可用於檢測及/或測量試樣中之人類CD52量(如，於組織或體液中--例如攜帶人類CD52之發炎性滲出液、血液、血清、腸液、組織--表現人類CD52之細胞)。試樣(如，組織及/或體液)可得自個體，及可使用本文敘述之抗體以適當免疫方法檢測及/或測量人類CD52之表現；包括例如流式細胞測量術(如，用於例如淋巴細胞之懸浮液中之細胞)，及包括化學發光分析、放射性免疫分析、與免疫組織學之酵素免疫分析法(ELISA)等方法。本發明涵蓋包含本文敘述之抗CD52抗體之套組(如，診斷套組)。
於一具體實例中，係提供檢測試樣中之人類CD52之方法，該方法包括在適於抗體與人類CD52特異性結合之條件下，使試樣與本發明抗體接觸，及檢測所形成之抗體CD52複合物。於此方法之應用中，本文敘述之抗體可用於分析正常vs.發炎組織(如，得自人類)對人類CD52之反應性及/或表現(如，免疫組織學上)，以檢測例如炎性腸道疾病(IBD)、自體免疫疾病(例如多發性硬化症與紅斑性狼瘡)、癌症(如非霍奇金氏淋巴瘤與慢性淋巴球性白血病)、或其他症狀與人類CD52(如，於受影響組織 中)增加表現間之關係。因此，本發明抗體容許評估人類CD52於正常及發炎組織中存在之免疫方法，從而可於疾病(如，發炎性疾病)之治療中，評估疾病之存在、疾病之進展及/或抗人類CD52療法之功效。
此外，該等抗體可用於檢驗以消減抗CD52治療抗體治療後之組織，以衡量消減之功效如何以及確定CD52之表現是否有任何向下調控[Rawstrom et al.,Br.J.Heam.,107：148-153(1999)]。
除非另行界定，否則本文所用之所有技術與科學術語具有與一般熟習本發明所屬技藝者通常了解之相同意義。於下文敘述例示之方法與材料，惟與本文所述類似或等同之方法與材料亦可用於實施或測試本發明。本文述及之所有出版物及其他參考文獻全部內容均併入本文以資參考。於衝突之情形下，以本說明書(包括界定)為準。本文中雖然引用一些文件，惟此引用並不構成承認任何彼等文件形成此項技藝中一般普遍知識之一部分。於整個說明書及具體實例中，「包含」一詞將被理解為意指包括所述整數或整數群組惟不排除任何其他整數或整數群組。材料、方法、及實例僅供說明用途而不擬構成局限。下述實例意欲說明本發明之方法與材料。此項技藝中通常遇到之所述條件之適當修飾及改變對熟習此項技藝而言為顯而易見並隸屬本發明精神與範圍之內。於本文中，「抗體」與「免疫球蛋白」等詞互換使用；「抗原結合片段」與「抗原結合部分」等詞亦互換使用。
實施例
下述實例意欲說明本發明之方法與材料。此項技藝中通常遇到之所述條件之適當修飾及改變對熟習此項技藝而言為顯而易見並隸屬本發明精神與範圍之內。
實例1：抗體Ab1之表現及特性分析
抗體Ab1係經由改變Ab26輕鏈中之殘基33(於L-CDR1之內)為Asp，而衍生自Ab26。此外，刪除Ab26輕鏈前33個胺基酸殘基，產 生變異抗體(Del33抗體)。將輕鏈骨架中之該變異體輕鏈DNA合成於DNA2.0之pDONR221進入(Entry)載體中，然後利用高通量(Gateway)選殖，次選殖入HEK293表現載體pCEP4(-E+I)Dest中。接著進行大規模DNA製備以供HEK293-EBNA細胞轉染。所有變異體與親源Ab26對照輕鏈及親源Ab26重鏈以1：1比例共轉染。
為了純化，乃使用1毫升HiTrap蛋白質A管柱(GE)及多通道幫浦裝置，以160-300毫升之轉染培養液純化Ab26、Del33、與Ab1抗體。利用超微量分光光度計(NanoDrop)測量所收集區分之A280。合併含大部分蛋白質之區分#1與#2，緩衝液換成50mM磷酸鈉、150mM氯化鈉，pH 6.0，並使用10kD截留管柱之Amicon-4進行濃縮。蛋白質純化產率摘述於表3。
Del33突變體未高量表現或純化，很可能係由於連接於缺失之錯誤折疊問題。Ab1與Ab26成功地純化至同質性，以供進一步特性分析。前15個胺基酸之N端定序證實所有三個試樣具預期之序列。
Ab26與Ab1亦於CHO細胞中表現並於蛋白質A管柱上純化。利用BIACORETM描繪該等抗體對CD52胜肽之親和力特性。HEK293細胞產生的抗體之結果示於圖17與表4，CHO細胞產生的抗體之結果示於圖18與表5。
CD52 BIACORETM結合分析如下述進行：將低量之CD52胜肽模擬抗原決定區[CGQNDTSQTSSPSAD(SEQ ID NO：87)]，經由硫醇基化學使用N端Cys固定於CM5晶片上。將於HBS-EP電泳緩衝液中調製之數個濃度之抗CD52抗體(1至20奈莫耳)注射於表面，以監測結合。使用Scrubber2軟體進行動力學分析。
相較於Ab26，抗體Ab1展示親和力大於400倍之下降。Ab1抗體於1-10nM濃度下未觀察到明顯之結合訊息，然而Ab26展現高結合親和力(圖17)。為了盡力得到變異體結合親和力喪失之定量測量，乃使用較高濃度之Ab1(高達1900nM)。從CHO產生的Ab1得到之1250nM KD與HEK293產生之Ab1者(1480nM)一致。親和力之減少反映於動力學結合上，既降低結合速率(on-rate)又增加解離速率(off-rate)。
利用測量經由補體依賴型細胞毒性之細胞死滅，進行CDC效力分析，以評估親和力降低是否影響效應物功能。所有變異體與對照之抗體物料於純黑96槽盤上，在分析培養液(不含酚紅之IMDM培養基+0.1% BSA)中，從2毫克/毫升至0.002毫克/毫升進行1：2之系列稀釋。測試貯存濃度2毫克/毫升之純淨物料。於所有槽添加正常人血清補體(Quidel Corporation)至最終濃度為5%(v/v)。接著添加菲佛氏(Pfeiffer)b-淋巴細胞(ATCC)至最終濃度為0.6 x 106個細胞/毫升。相同培養盤上包括負細胞分解對照(分析培養液+細胞)、正細胞分解對照[分析培養液+細胞+2%(w/v)Triton X-100]、與正劑量反應對照(4毫克/毫升對照物料)。反應於濕化之37℃，5% CO2培養箱中培育1小時。然後，於所有槽中添加50微升預熱之alamarBlue®檢測試劑(Life Technologies)，隨後於減光下培育4小時。使用螢光微量盤讀取計(激發：530nm，發射：590，阻隔：570nm)測量alamarBlue®之相對減少量。使用Softmax Pro,v.5.3(Molecular Devices)產 生擬合四參數模式之劑量反應曲線。結果示於圖19。如所預期，Ab26(對照)展示濃度依賴性之細胞死滅。於CHO細胞中產生之抗體Ab1於所測試之濃度範圍中展示少量可檢測之CDC活性。彼等實驗建議單一胺基酸置換可能對Ab26之生物功能具有顯著影響。
實例2：抗CD52抗體之CD52結合親和力分析
抗體Ab4、Ab3、Ab24、Ab10、Ab12、與Ab25(見表1與2)係於HEK293細胞中表現。如下述，合成輕鏈DNA，次選殖，並於HEK293細胞中短暫表現。將輕鏈骨架中之該DNA分子合成於DNA2.0之pDONR221進入載體中，然後利用高通量選殖，次選殖入HEK293表現載體pCEP4(-E+I)Dest中。將表現輕鏈之載體與表現Ab26重鏈之載體共轉染入HEK293細胞中。使用Ab26 DNA作為轉染對照。使用蛋白質A感測器經由Octet針對蛋白質表現量及使用CD52胜肽晶片經由BIACORETM針對CD52結合親和力篩選條件培養基。結果示於圖1。
Ab24與Ab10抗體展示強烈之CD52結合親和力。Ab4與Ab3展示較弱之CD52結合親和力。為證實此發現，使用蛋白質A管柱純化Ab4與Ab3以供進一步特性分析。Ab26抗體(CTL)、得自兩個轉染之Ab26抗體(CTL1與CTL2)、Ab1、Ab4、Ab3、Ab10、Ab24、Ab12、與Ab25之SDS-PAGE凝膠及BIACORETM CD52胜肽結合結果示於圖2。
純化抗體之結果證實初始培養基之篩選數據。Ab4與Ab3展示較弱之CD52結合親和力。
實例3：Ab24與Ab10抗體之大規模製備及特性分析
於CHO K1細胞中大規模生產Ab24與Ab10抗體，以測定其CD52之結合與抑制特性。於兩個抗體中觀察到輕鏈裁剪；及於非還原性(NR)凝膠上觀察到150kD以下之色帶(於此稱為「100kD物種」)(圖3)。
經由最適化組織培養條件及省略培養基於4℃之貯存步驟，可使輕鏈裁剪問題最小化。儘管有彼等改進，似乎仍有少量100kD物 種(在150KD下面)產生(圖3)。進一步鑑定此二抗體。利用SEC-HPLC，分別於Ab24與Ab10之兩個大規模製劑中發現9-12%與18-20%之100kD物種。完整之質譜測定實驗確認該抗體之序列。低分子量物種之N端定序顯示僅存在重鏈之N端序列。當收集100kD物種並於SDS-PAGE凝膠上分析時，僅觀察到重鏈。彼等結果顯示該等100kD物種僅包含重鏈(圖4)。
實例4：其他抗CD52抗體之製備與篩選
將抗體Ab2、Ab6、Ab7、Ab5、Ab13、Ab15、Ab17、Ab18、Ab19、Ab23、Ab22、Ab11、Ab20、Ab16、Ab21、與Ab14(參見表1與2)之表現載體轉染入HEK293細胞中。利用Octet以蛋白質A感測器分析條件培養基時，所有抗體表現>0.2微克/毫升(圖5，上圖)。然後使用此等培養基試樣之BIACORETM CD52親和力篩選以鑑定領先之候選者(圖5，中圖及下圖)。
抗體Ab2、Ab6、Ab7、與Ab5對CD52之結合親和力低。數個其他抗體展示較高之CD52結合親和力。彼等抗體包括Ab22、Ab20、Ab21、Ab14、Ab14、與Ab11。使抗體Ab22、Ab20、Ab21、Ab14、Ab14、與Ab11進行進一步研究。
將彼等六個抗體(Ab22、Ab20、Ab21、Ab14、Ab14、與Ab11)擴大規模至一個TripleFlask/抗體短暫表現(此培養瓶具有三個同方向之生長表面，以提供500平方公分之總培養面積)。使用1毫升HiTrap蛋白質A親和力管柱(GE Healthcare)，以160毫升條件培養基純化該等抗體。還原性SDS-PAGE凝膠顯示成功之純化及合理之抗體純度(圖6)。為了以BIACORETM進行CD52結合比較，乃使純化試樣於HBS-EP中稀釋至60與7.5nM，並注射於CD52胜肽#741晶片上面(7.5nM之結果示於圖6)。該BIACORETM結合分析證實初始培養基篩選結果，亦即彼等抗體緊密結合於CD52胜肽。動力學結合實驗指示下述親和力排行：(Ab16、Ab21)>Ab26>(Ab20、Ab11、Ab14、Ab22)>(Ab24、Ab10)Ab16與Ab21顯示具有比Ab26高之親和力。
實例5：抗CD52抗體之穩定性分析
為了確定抗CD52抗體變異體之穩定性是否已受到影響，乃使用高溫條件比較並篩選抗CD52抗體變異體。使用Ab26與自HEK293細胞純化之選定變異體進行初始篩選。於PBS(pH 7.2)中將蛋白質(85微克)稀釋至約0.4毫克/毫升，於45℃培育4週。利用BIACORETM測量其對CD52胜肽之結合親和力。於HBS-EP中將第2週及第4週取出之1微克各變異體系列稀釋至7.5、2.5、與0.8nM，並注射於CD52胜肽#741晶片上面。使用Scrubber軟體計算初步結合常數並示於圖20(Ab26標識為「CTL」)。
結果表示，Ab21、Ab16與Ab20抗體在4週培育期間保留顯著之CD52結合親和力，暗示彼等較抗體Ab26更穩定。對照之下，Ab10與Ab22抗體在培育期間喪失其對抗原之大部分結合親和力。
為了確認培育實驗中得到的結果，乃產生變異體之新製劑，與Ab26抗體於37℃或45℃下，在「三成分」緩衝液(10mM琥珀酸鹽、10mM組胺酸、10mM磷酸鈉，pH 7.5)中一起培育4週。該「三成分」緩衝液通常用於抗體之可製造性試驗中。培育物料用量列於表6。Ab21、Ab16與Ab20抗體亦於相同緩衝液中，45℃，進行培育。於第2週與第4週(T2與T4)取出等分試樣，利用BIACORETM評估其對CD52胜肽之親和力。各試樣於HBS-EP中稀釋至7.5、3.75、與1.875nM，並注射於CD52胜肽#741晶片上面達3分鐘，隨後於緩衝液中解離3分鐘。表觀KD’s示於圖21。
結果顯示，於37℃與45℃培育4週後，Ab21、Ab16與Ab20抗體之結合親和力保持不變或僅略為下降，而Ab26(CTL、CTL1、與CTL2)則隨時間喪失結合親和力。於45℃培育4週後，Ab26(CTL)之KD從4.3nM變化至1230nM，表示與CD52之結合下降。此顯示彼等突變體於L-CDR1位點確實隨時間對不穩定性更具抗性。
欲證明Ab21、Ab16與Ab20抗體之結構完整性，乃利用SEC-HPLC評估於PBS(pH 7.2)中稀釋至約0.4毫克/毫升並於45℃培育4週之變異體之聚集與斷裂。於移動相(40mM磷酸鈉、500mM氯化鈉，pH 6.0)中，稀釋5微克之蛋白質至總體積為100微升，然後於0.5毫升/分鐘下，注入TSK Gel G3000 SWxl管柱上，為時35分鐘。於Ab21、Ab16、Ab20、與Ab26(CTL)中，無明顯之聚集及有限之斷裂被檢測出(圖22)。因此，Ab26親和力之喪失可能不是由於結構完整性之喪失所引起。
實例6：抗CD52抗體於活體外效力分析(CDC效力)之生物活性
於CDC分析中，評估三個抗CD52抗體(Ab21、Ab20與Ab16)。使用此分析法測量該等抗體於補體存在下，分解菲佛氏B-淋巴細胞之能力。抗體係於相同培養盤上單次分析(singlicate)並與Ab26(對照)進行定性比較(參見，圖7)。
結果顯示Ab21與Ab16之效力可與Ab26相較或更為增進。Ab20於此試驗中具略低之效力。
實例7：抗CD52抗體於HuCD52基因轉殖小鼠中之生物活性
亦於huCD52基因轉殖小鼠中進行3個抗CD52抗體(Ab21、Ab20與Ab16)之活體內評估。針對HuCD52基因轉殖小鼠靜脈注射1毫克/公斤之Ab26、Ab21、Ab20或Ab16(5隻動物/組)。注射後第3天，利用流式細胞測量術分析血液與脾臟之淋巴細胞消減。利用流式細胞測量術分析之血液與脾臟中之淋巴細胞消減程度示於圖8(Ab26標識為「CTL」)。
結果顯示，由抗體Ab21、Ab20與Ab16於血液與脾臟中所誘發之淋巴細胞消減似乎與抗體Ab26相近或更為增進。綜上所述，彼等數據證實該等抗CD52抗體具活體內生物活性。
表7列出本文使用之SEQ ID NOs。
<110> 健臻公司(GENZYME CORPORATION)
<120> 抗CD52之抗體
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<150> 61/794,576
<151> 2013-03-15
<160> 136
<170> PatentIn version 3.5
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<210> 39
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 39
<210> 40
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 40
<210> 41
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 42
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列說明：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<223> 人工序列說明：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 59
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 65
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 69
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 70
<210> 71
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 71
<210> 72
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 72
<210> 73
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 73
<210> 74
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 74
<210> 75
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 75
<210> 76
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 76
<210> 77
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 77
<210> 78
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 78
<210> 79
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 79
<210> 80
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 80
<210> 81
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 81
<210> 82
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 82
<210> 83
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 83
<210> 84
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 84
<210> 85
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 85
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Gly以外之任何胺基酸
<400> 86
<210> 87
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 87
<210> 88
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 88
<210> 89
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 89
<210> 90
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 90
<210> 91
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 91
<210> 92
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 92
<210> 93
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 93
<210> 94
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 94
<210> 95
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 95
<210> 96
<211> 333
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 99
<210> 100
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 100
<210> 101
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 101
<210> 102
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 102
<210> 103
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 103
<210> 104
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 104
<210> 105
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 105
<210> 106
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 106
<210> 107
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 107
<210> 108
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 108
<210> 109
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 109
<210> 110
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 110
<210> 111
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 111
<210> 112
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 112
<210> 113
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 113
<210> 114
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 114
<210> 115
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 115
<210> 116
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 116
<210> 117
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 117
<210> 118
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 118
<210> 119
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 119
<210> 120
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 120
<210> 121
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 121
<210> 122
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 122
<210> 123
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 123
<210> 124
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 124
<210> 125
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 125
<210> 126
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 126
<210> 127
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 127
<210> 128
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 128
<210> 129
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 129
<210> 130
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 130
<210> 131
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 131
<210> 132
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 132
<210> 133
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 133
<210> 134
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 134
<210> 135
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 135
<210> 136
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Lys,Arg,Gln,His,Ser,Tyr,Ala,Asp,Glu,Phe,Ile, Leu,Met,Asn,Thr或Val
<400> 136

Claims (42)

  1. 一種抗人類CD52之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈變異區與輕鏈變異區，其中該重鏈變異區包含：(a)SEQ ID NO：7之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO：8之重鏈CDR2；與(c)SEQ ID NO：9之重鏈CDR3；其中該輕鏈變異區包含：(a)SEQ ID NO：86之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO：34之重鏈CDR2；與(c)SEQ ID NO：35之重鏈CDR3。
  2. 根據請求項1之抗體或片段，其中該抗體或片段相對於包含無訊息序列之SEQ ID NO：3重鏈胺基酸序列與無訊息序列之SEQ ID NO：4輕鏈胺基酸序列抗體，顯示增加之穩定性。
  3. 根據請求項1之抗體或片段，其中SEQ ID NO：86之殘基11係K、R、Q、H、S、Y、A、D、E、F、I、L、M、N、T、或V。
  4. 根據請求項1之抗體或片段，其中SEQ ID NO：86之殘基11係K。
  5. 根據請求項1之抗體或片段，其中SEQ ID NO：86之殘基11係R。
  6. 根據請求項1之抗體或片段，其中SEQ ID NO：86之殘基11係Q。
  7. 根據請求項1至6中任一項之抗體或片段，其中該重鏈變異區包含SEQ ID NO：59。
  8. 根據請求項1至6中任一項之抗體或片段，其中該輕鏈變異區包含選自包括SEQ ID NOs：68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、與83之組群之序列。
  9. 根據請求項1至6中任一項之抗體或片段，其中該重鏈與輕鏈變異區分別包含：a)SEQ ID NOs：59與68；b)SEQ ID NOs：59與69； c)SEQ ID NOs：59與70；d)SEQ ID NOs：59與71；e)SEQ ID NOs：59與72；f) SEQ ID NOs：59與73；g)SEQ ID NOs：59與74；h)SEQ ID NOs：59與75；i)SEQ ID NOs：59與76；j)SEQ ID NOs：59與77；k)SEQ ID NOs：59與78；l)SEQ ID NOs：59與79；m)SEQ ID NOs：59與80；n)SEQ ID NOs：59與81；o)SEQ ID NOs：59與82；或p)SEQ ID NOs：59與83。
  10. 根據請求項1至6中任一項之抗體或片段，其包含無訊息序列之SEQ ID NO：3重鏈。
  11. 根據請求項1至6中任一項之抗體或片段，其包含選自包括SEQ ID NOs：43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、與58之組群之輕鏈。
  12. 一種抗體，其包含：(a)無訊息序列之SEQ ID NO：3重鏈胺基酸序列，及SEQ ID NO：49輕鏈胺基酸序列，(b)無訊息序列之SEQ ID NO：3重鏈胺基酸序列，及SEQ ID NO：53輕鏈胺基酸序列，或(c)無訊息序列之SEQ ID NO：3重鏈胺基酸序列，及SEQ ID NO：54輕鏈胺基酸序列。
  13. 根據請求項1至9中任一項之抗體，其為免疫球蛋白G(IgG)。
  14. 根據請求項1至11中任一項之片段，其中該片段係選自包括scFv片段、Fab片段、Fv片段、F(ab')2片段、微型抗体、二聚抗體、三聚抗體、與四聚抗體之組群。
  15. 根據請求項1至9中任一項之抗體或片段，其中該抗體包含人類Fc區。
  16. 根據請求項15之抗體或片段，其中該人類Fc區係人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4 Fc區。
  17. 根據請求項15之抗體或片段，其中該人類Fc區係人類IgG1 Fc區。
  18. 根據請求項15之抗體或片段，其中該人類Fc區係人類IgG2 Fc區。
  19. 根據請求項15之抗體或片段，其中該人類Fc區係人類IgG3 Fc區。
  20. 根據請求項15之抗體或片段，其中該人類Fc區係人類IgG4 Fc區。
  21. 根據請求項1至20中任一項之抗體或片段，其中該抗體係單株抗體。
  22. 根據請求項1至21中任一項之抗體或片段，其中該抗體係擬人化抗體。
  23. 根據請求項1至22中任一項之抗體或片段，其中重鏈C端之離胺酸被切割。
  24. 一種單離之核酸分子，其包含編碼根據請求項1至23中任一項之抗體或片段之重鏈或其抗原結合片段、或輕鏈或其抗原結合片段、或二者之核苷酸序列。
  25. 根據請求項24之單離核酸分子，其包含SEQ ID NO：95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、或134之核苷酸序列。
  26. 一種重組載體，其包含請求項24之核酸分子。
  27. 根據請求項26之載體，其中該載體係表現載體。
  28. 一種單離之宿主細胞，其包含根據請求項26或27之載體。
  29. 一種單離之細胞株，其生產根據請求項1至23中任一項之抗體或片段或抗體或片段之重鏈或輕鏈。
  30. 一種製造抗人類CD52抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包括(1)於適於表現抗體或片段之條件下，供養根據請求項28之宿主細胞或根據請求項29之細胞株；(2)回收該抗體或片段。
  31. 一種組成物，其包含根據請求項1至23中任一項之抗體或抗原結合片段與醫藥上可接受之載體或載劑。
  32. 一種用於治療有其需要之病患之方法，該方法包括投予該病患有效量之根據請求項1至23中任一項之抗體或抗原結合片段。
  33. 一種用於治療有其需要病患之自體免疫疾病之方法，該方法包括投予該病患根據請求項1至23中任一項之抗體或抗原結合片段。
  34. 根據請求項33之方法，其中自體免疫疾病係多發性硬化症。
  35. 一種用於治療有其需要病患之癌症之方法，該方法包括投予該病患根據請求項1至23中任一項之抗體或抗原結合片段。
  36. 根據請求項35之方法，其中癌症係慢性淋巴球性白血病。
  37. 一種抑制有其需要病患之血管生成之方法，該方法包括投予該病患根據請求項1至23中任一項之抗體或抗原結合片段。
  38. 一種使用根據請求項1至23中任一項之抗體或抗原結合片段製備用於治療所需病患之自體免疫疾病之藥劑之用途。
  39. 根據請求項38之用途，其中自體免疫疾病係多發性硬化症。
  40. 一種使用根據請求項1至23中任一項之抗體或抗原結合片段製備用於治療所需病患之癌症之藥劑之用途。
  41. 根據請求項40之用途，其中癌症係慢性淋巴球性白血病。
  42. 一種使用根據請求項1至23中任一項之抗體或抗原結合片段製備用於抑制所需病患之血管生成之藥劑之用途。
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