TW202039568A - 人源化抗pd-1抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了一種抗程序性死亡受體-1(Programmed cell death protein-1，PD-1)的重組人源化單株抗體或其抗原結合片段，其可用於腫瘤或癌症免疫治療。本發明還提供了編碼所述抗體或其抗原結合片段的核酸序列、含有所述核酸序列的載體、藥物組合物和試劑盒。

Description

人源化抗PD-1抗體及其用途
本發明關於腫瘤或癌症免疫治療領域。具體而言，本發明提供了一種抗程序性死亡受體-1(Programmed cell death protein-1，PD-1)的重組人源化抗體，其可用於腫瘤或癌症免疫治療。本發明還提供了編碼所述抗體的核酸序列、含有所述核酸序列的載體、藥物組合物和試劑盒。
PD-1是由288個胺基酸構成，分子量約為50kDa的I型跨膜糖蛋白，為CD28家族成員之一，又名CD279。它的功能為調控細胞程序性死亡，主要表達於成熟的CD4+和CD8+T細胞表面，在天然殺傷T細胞、B細胞、單核細胞和一些樹突狀細胞上也有表達。
PD-1有兩個配體，分別是PD-L1(即B7-H1，又名CD274)和PD-L2(即B7-DC，又名CD273)，二者均是B7家族的跨膜蛋白分子。從含量和作用角度看，PD-L1為主要的PD-1配體。PD-L1廣泛表達於各種類型細胞表面，包括樹突狀細胞、B細胞和T細胞等造血細胞以及上皮和內皮細胞等非造血細胞。PD-L1也在腫瘤細胞表面呈現高表達，而且IFN-γ和TNF-α等炎性細胞因子能促進腫瘤細胞表面PD-L1的表達上調。PD-L2配體與PD-L1有很高的相似性，但其分佈相對局限，主要表達於巨噬細胞、樹突狀細胞和肥大細胞等免疫細胞表面，且表達量較低。PD-L2與PD-1結合的親和力更高，約為PD-L1的3倍。
PD-1通過與其配體相結合行使生物功能，可抑制T細胞受體介導的T細胞增殖、活化和細胞因子的分泌，從而抑制免疫反應的初始與效應階段，維持機體的免疫穩定，防止自身免疫性疾病的發生。當PD-1與其配體結合時，其胞質區免疫受體酪胺酸轉化基序(Immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM)結構域中的酪胺酸發生磷酸化。磷酸化的ITSM會募集SHP-2磷酸酶，通過去磷酸化作用抑制下游重要通路，阻斷磷脂醯肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)及其下游蛋白激酶B(PKB或Akt)的啟動，抑制糖代謝和細胞因子白細胞介素-2(IL-2)的產生及抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達，從而抑制T、B細胞的增殖、活化以及免疫球蛋白的分泌，抑制自身免疫反應。腫瘤細胞利用此免疫抑制機制，通過高表達PD-L1，使其與淋巴細胞表面的PD-1分子結合，逃避機體對它們的免疫識別和清除，從而實現免疫逃逸。
以PD-1為靶點的單株抗體研究是目前腫瘤或癌症免疫治療研究的熱點。這些單株抗體通過阻斷PD-1與其配體的結合，能夠增加腫瘤部位的T細胞和IFN-γ、IL-2的分泌量，減少髓系來源的抑制細胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC)的比例，改變腫瘤微環境，恢復和提高T細胞的免疫殺傷功能，從而抑制腫瘤的增長。目前，美國食品藥品管理局(FDA)已批准上市的PD-1抗體藥物包括美國百時美施貴寶公司(Bristol-Myers Squibb)的Opdivo(通用名Nivolumab)和美國默克公司的Keytruda(通用名Pembrolizumab)。Opdivo獲批用於黑色素瘤、非小細胞肺癌、頭頸鱗細胞癌、經典型霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、高微衛星不穩定性癌、晚期腎細胞癌和肝細胞癌的治療；Keytruda獲批用於黑色素瘤、非小細胞肺癌、頭頸鱗細胞癌、經典型霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、高微衛星不穩定性癌和胃癌的治療。另外，國內外進入臨床研究的PD-1靶點抗體藥物包括再生元/賽諾菲的REGN2810、君實的JS001、恆瑞的SHR-1210、百濟神州的BGB-A317、信達的IBI308和恆譽/藥明康德的GLS-010，還有更多此類和抗PD-L1抗體藥物處臨床前研究階段。
總之，以PD-1為靶點的單株抗體研究已經取得了一定的進展。然而，腫瘤或癌症免疫治療中仍然需要藥效更好、安全性更高、市場競爭力更強的優質單抗生物藥。
本發明中使用的術語的中文名稱及其對應的英文縮寫形式如表1所示。
表1：術語中英文對照表
中文名稱 英文名稱縮寫
樹突狀細胞 DCs
干擾素γ IFN-γ
轉化生長因子α TNF-α
免疫受體酪胺酸轉化基序 ITSM
含SH2結構域的蛋白酪胺酸磷酸酶-2 SHP-2
磷脂醯肌醇3激酶 PI3K
蛋白激酶B PKB
白細胞介素-2 IL-2
髓系來源的抑制細胞 MDSC
辣根過氧化物酶 HRP
互補決定區 CDR
異硫氰酸螢光素 FITC
抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 ADCC
補體依賴性細胞毒性 CDC
人外周血單核細胞 PBMC
重組人白細胞介素 rhIL-4
重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 rhGM-CSF
胎牛血清 FBS
牛血清白蛋白 BSA
本發明第一方面提供了一種分離的PD-1抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈可變區或其部分和/或重鏈可變區或其部分， 其中輕鏈可變區或其部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO：10的輕鏈CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO：11的輕鏈CDR2和胺基酸序列為SEQ ID NO：12的輕鏈CDR3；且 重鏈可變區或其部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO：13的重鏈CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO：14的重鏈CDR2和胺基酸序列為SEQ ID NO：15的重鏈CDR3。
在一個具體實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段包含、由以下組成或基本上由以下組成：與PD-1抗體輕鏈可變區序列SEQ ID NO：23具有至少90%，92%，95%，98%或100%序列同一性的胺基酸序列和與PD-1抗體重鏈可變區序列SEQ ID NO：22具有至少90%，92%，95%，98%或100%序列同一性的胺基酸序列。
在一個具體實施方案中，所述抗體進一步包含輕鏈恆定區和重鏈恆定區；在一個具體實施方案中，其中所述抗體進一步包含輕鏈恆定區和重鏈恆定區，較佳地所述輕鏈恆定區為胺基酸序列為與SEQ ID NO：25的kappa輕鏈恆定區具有至少90%，92%，95%，98%或100%序列同一性的胺基酸序列，和/或所述重鏈恆定區為與胺基酸序列為SEQ ID NO：24的IgG4重鏈恆定區具有至少90%，92%，95%，98%或100%序列同一性的胺基酸序列。在一個具體實施方案中，所述抗體為IgG抗體。在一個具體實施方案中，所述抗體為IgG4抗體。
在一個具體實施方案中，抗體或其抗原結合片段為單株抗體或其抗原結合片段。
在一個具體實施方案中，抗體或其抗原結合片段與重組人PD-1蛋白結合親和力KD 平均值為約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200 pM或更高，或者任意前述值作為端點構成的範圍，例如約20-200 pM，或約60-70 pM等，或其中的任意值，例如約64.8 pM或約108 pM等。該結合親和力KD 測定方法如本發明實施例部分所述。
在一個具體實施方案中，抗體或其抗原結合片段與含有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的PD-1蛋白分子或與SEQ ID NO：1具有至少90%，92%，95%，98%或100%序列同一性的胺基酸序列的蛋白分子特異性結合。
本發明第二方面提供一種分離的PD-1抗體或其抗原結合片段，其特異性結合選自PD-1蛋白胞外區60SESFV64、78KLAAFPEDRSQP89、128LAPKAQI134中至少一種的肽序列。
在一個具體實施方案中，提供了一種分離的抗體或其抗原結合片段，其特異性結合選自PD-1蛋白胞外區E61、K78、D85、P130中至少一種的胺基酸殘基。在一個具體實施方案中，抗原結合片段的形式為Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2 、Fd片段、Fd'片段、單鏈抗體分子或單域抗體；在一個具體實施方案中，單鏈抗體分子為scFv、di-scFv、tri-scFv、雙體抗體或scFab。
在又一具體實施方案中，上述方案中的抗體或其抗原結合片段與另一分子形成共價或非共價連接物或形成重組多靶點融合藥物從而生成改構藥物分子，所述另一分子選自小分子化合物和/或生物大分子。
本發明的第三方面提供了一種分離的核酸，其核苷酸序列編碼第一和第二方面的抗體和/或抗原結合片段。
本發明的第四方面提供了一種載體，其包含第三方面的核酸。
本發明的第五方面提供了一種分離的細胞，其表達第一方面和第二方面的抗體和/或抗原結合片段，和/或包含第三方面的核酸或第四方面的載體。
在一個具體實施方案中，所述細胞為原核細胞或真核細胞。
本發明的第六方面提供了一種產生第一方面和第二方面的抗體和/或抗原結合片段的方法，所述方法包括培養第五方面的細胞和純化所述抗體。
本發明的第七方面提供了第一方面和第二方面的抗體和/或抗原結合片段和/或改構藥物分子製備用於治療腫瘤或癌症的藥物的用途。
在一個具體實施方案中，所述腫瘤或癌症為結腸癌。
本發明的第八方面提供了第一方面的抗體和/或抗原結合片段和/或改構藥物分子用於治療腫瘤或癌症的用途。
在一個具體實施方案中，所述腫瘤或癌症為結腸癌。
本發明的第九方面提供了一種藥物組合物，其包含第一方面和第二方面的抗體和/或抗原結合片段和/或改構藥物分子。
本發明的第十方面提供了第九方面的藥物組合物與一種或多種治療活性化合物的藥物組合。
本發明的第十一方面提供了一種試劑盒，其包含第一方面和第二方面的抗體和/或抗原結合片段和/或改構藥物分子，或第九方面的藥物組合物或第十方面的藥物組合，較佳地，還進一步包含給藥的裝置。
本發明的第十二方面提供了一種治療腫瘤或癌症的方法，其包括向有需要的受試者施用治療有效量的第一方面和第二方面的分離的PD-1抗體或其抗原結合片段或改構藥物分子、或第九方面的藥物組合物、或第十方面的藥物組合、或第十一方面的試劑盒，由此治療所述腫瘤或癌症，較佳地其中所述腫瘤或癌症為結腸癌。
[定義]
除非另有說明，本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬的技術領域的普通技術人員通常理解的含義。為了本發明的目的，進一步定義以下術語。
當用於本文和所附申請專利範圍中時，單數形式“一”、“一種”、“另一”和“所述”包括複數指代對象，除非上下文明確地另有指示。
術語“抗體”意指免疫球蛋白分子，是指表現所需生物學活性的抗體的任何形式。包括但不限於單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體和多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，甚至包括抗體片段。典型地，全長抗體結構較佳包含4條多肽鏈，通常通過二硫鍵相互連接的2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈。每條重鏈包含重鏈可變區和重鏈恆定區。每條輕鏈包含輕鏈可變區和輕鏈恆定區。在此典型全長抗體結構外，其結構還包括其他衍生形式。
術語“可變區”指抗體重鏈或輕鏈中涉及抗體結合抗原的域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變區(分別為VH和VL)一般具有類似的結構，可進一步細分為穿插在更保守的區域(稱為框架區(FR))中的高變區(稱為互補決定區(CDR))。
術語“互補決定區”(CDR，例如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗體可變區的這樣一些胺基酸殘基，其存在對於抗原結合來說是必需的。每個可變區通常具有3個被鑒別為CDR1、CDR2和CDR3的CDR區域。每個互補決定區可包含來自如Kabat所定義的“互補決定區”的胺基酸殘基(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991))和/或來自“高變環”的那些殘基(Chothia and Lesk; J Mol Biol 196： 901-917 (1987))。
術語“構架”或“FR”殘基是如本文中所定義的CDR殘基之外的那些可變區殘基。
每個重鏈可變區和輕鏈可變區通常包含3個CDR和最多達4個FR，所述CDR和FR從胺基末端至羧基末端以例如以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
給定抗體的互補性決定區(CDR)和框架區(FR)可以使用Kabat體系標識(Kabat等： Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生和公眾服務部，PHS，NIH，NIH出版編號91-3242，1991)。
術語“恆定區”是指抗體的輕鏈和重鏈上的這樣一些胺基酸序列，不直接參與抗體與抗原的結合，但展現出多種效應子功能，例如抗體依賴性細胞毒性。
根據其重鏈恆定區的胺基酸序列，完整的抗體可歸屬於IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五類抗體，其中IgG和IgA還可進一步分為亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。相應地，五類抗體的重鏈分別歸入α、 δ、ε、γ和μ鏈。根據其輕鏈恆定區的胺基酸序列，抗體的輕鏈可歸入κ和λ。。
“抗體的抗原結合片段”包含完整抗體分子的一部分，其保留母體抗體的至少某些結合特異性，通常包括至少部分母體抗體的抗原結合區或可變區(例如一個或多個 CDR)。抗原結合片段的實例包括但不限於Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2 、 Fd片段、Fd'片段、單鏈抗體分子(例如scFv，di-scFv或 tri-scFv、雙體抗體或scFab)、單域抗體。
“抗體片段”是保留母體抗體的至少某些生物學特性的非完整抗體分子，其實例除上述“抗原結合片段”所述及的那些之外，還包括但不限於Fc片段。
術語 “改構藥物分子”是指抗體或其片段，如抗原結合片段與另一分子形成共價或非共價連接物或形成重組多靶點融合藥物，另一分子選自小分子化合物或生物大分子。
術語“嵌合”抗體是指重鏈和/或輕鏈的一部分來源於特定來源或物種，而其餘部分來源於不同來源或物種的抗體。“人源化抗體”是“嵌合抗體”的子集。
術語“人源化抗體”或“人源化抗原結合片段”在本文中被定義為這樣的抗體或抗體片段：(i)來源於非人來源(例如，攜帶異源免疫系統的轉基因小鼠)且基於人種系序列的抗體；或(ii)可變區是非人來源而恆定區是人來源的嵌合抗體；或者(iii)CDR移植的，其中可變區的CDR來自非人來源，而可變區的一個或多個構架區為人來源的，並且恆定區(如果有的話)是人來源的。 “人源化”的目的是消除非人來源抗體在人體內的免疫原性，而同時最大可能地保留親和力。選擇與非人來源抗體構架序列最相似的人構架序列為模板進行人源化改造是有利的。在某些情況下，可能需要用非人構架中相應的殘基替換人類構架序列中的一個或多個胺基酸，以避免親和性的喪失。
“單株抗體”是指獲自基本上同質的抗體群體的抗體，即，所述包含單一抗體的群體除了可能以極少量存在的可能突變(例如天然突變)之外是相同的。因此，所述術語“單株”表明所述抗體的性質，即不是不相關抗體的混合物。與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑的每個單株抗體均針對抗原上的單獨一個決定簇。除了其特異性之外，單株抗體製劑的優點在於它們通常不會被其他抗體污染。所述術語“單株”不應被理解為需要通過任何特定的方法產生所述抗體。所述術語單株抗體具體地包括嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。
抗體“特異性結合”目的抗原例如腫瘤相關的多肽抗原靶(本文中，PD-1)，即以足夠的親和力結合所述抗原以使得所述抗體可用作治療劑，靶向表達所述抗原的細胞或組織，並且與其他蛋白質無顯著交叉反應或者與除了上文提到的抗原靶的同源體和變體(例如突變形式、剪接變體，或蛋白水解作用截短的形式)以外的蛋白質無顯著交叉反應。
術語“結合親和力”是指分子的單個結合位點與其結合伴侶之間非共價相互作用總和的強度。除非另有說明，用於本文時“結合親和力”是指固有的結合親和力，其反映結合對(例如抗體和抗原)的成員之間1：1的相互作用。“KD ”、“結合速率常數kon”和“解離速率常數koff”通常用於描述分子(例如抗體)與其結合伴侶(例如抗原)之間的親和力，即，配體結合特定蛋白的緊密程度。結合親和力受非共價分子間相互作用的影響，例如氫鍵，靜電相互作用，兩個分子之間的疏水和范德華力。另外，配體與其靶分子之間的結合親和力可能受到其他分子的存在的影響。親和力可通過本領域中已知的常規方法來分析，包括本文描述的ELISA。
術語“表位”包括能夠特異性結合至抗體或T細胞受體的任何蛋白質決定簇。表位決定簇通常由分子的化學活性表面基團(例如胺基酸或糖側鏈，或其組合)組成，並且通常具有特定三維結構特徵以及特定的電荷特徵。
“分離的”抗體是已經被鑒別並且從天然表達該抗體的細胞中分離的抗體。分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體以及通常通過至少一個純化步驟進行製備的抗體。
兩條多肽或核酸序列之間的“序列同一性”表示所述序列之間相同的殘基的數目占殘基總數的百分比。在計算同一性百分數時，將正在比較的序列以產生序列之間最大匹配的方式比對，通過特定演算法解決比對中的空位(如果存在的話)。確定兩個序列之間同一性的較佳電腦程式方法包括，但不限於，GCG套裝程式，包括GAP、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。上述程式可以公開地從國際生物技術資訊中心(NCBI)和其他來源得到。熟知的Smith Waterman演算法也可用於確定同一性。
術語“Fc受體”或“FcR”指與抗體Fc區結合的受體。較佳天然序列的人FcR，且較佳與IgG抗體結合的受體(γ受體)，其包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亞型，以及這些受體的變體。其它FcR均被包含在術語“FcR”中。該術語也包括新生兒受體(FcRn)，其負責將母體的IgG轉運至胎兒(Guyer等，免疫學雜誌117： 587(1976)和Kim等，免疫學雜誌24：249(1994))。
術語 “新生兒Fc受體”、簡稱“FcRn”，其結合IgG抗體Fc區。新生兒Fc受體(FcRn)在體內IgG類抗體的代謝命運中起重要作用。FcRn行使功能以從溶酶體降解途徑營救IgG，從而降低其在血清中的清除率並加長半衰期。因此，IgG體外FcRn結合性質/特徵指示它在血液循環中的體內藥代動力學性質。
術語“效應子功能”指可歸因於抗體的Fc區的那些生物學活性，其隨抗體同種型而不同。抗體效應子功能的實例包括：C1q結合和依賴補體的細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、依賴抗體的細胞毒性(ADCC)、依賴抗體的吞噬作用(ADCP)、細胞因子分泌、免疫複合物介導的抗原呈遞細胞對抗原的攝取、細胞表面受體(例如B細胞受體)的下調和B細胞啟動。
術語“效應細胞”指表達一種或多種FcR並行使效應子功能的白細胞。在一個方面，所述效應細胞至少表達FcγRIII並執行ADCC效應子功能。介導ADCC的人白細胞的實例包括外周血單核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞。效應細胞可以從天然來源，例如，血液中分離。效應細胞通常是與效應子階段相關聯的淋巴細胞，並發揮作用，以產生細胞因子(輔助T細胞)、殺死被病原體感染的細胞(細胞毒性T細胞)或分泌抗體(分化的B細胞)。
“免疫細胞”包括具有造血的起源並在免疫反應中起作用的細胞。免疫細胞包括：淋巴細胞，例如B細胞和T細胞；天然殺傷細胞；髓樣細胞，例如單核細胞、巨噬細胞、嗜曙紅細胞、肥大細胞、嗜堿細胞和粒細胞。
“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”是指一種細胞毒性形式，其中結合到在某些細胞毒性細胞(例如NK細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上存在的Fcγ受體上的分泌Ig使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合至承載抗原的靶細胞，隨後使用例如細胞毒素殺死所述靶細胞。為了評估目的抗體的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，例如記載於美國專利No.5,500,362或5,821,337或美國專利No.6,737,056(Presta)中的體外ADCC測定法、本發明的實施例中記載的方法。用於這類測定法的有用效應細胞包括PBMC和NK細胞。
“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”是指在補體的存在下靶細胞的裂解。經典補體途徑的活化由補體系統的第一組分(C1q)與(適當亞類的)抗體結合起始，其中該抗體與其相應抗原結合。為了評估補體活化，可進行CDC測定法，例如記載於Gazzano-Santoro et al., J. Immunol Methods 202： 163 (1996)中的CDC測定法、例如本發明的實施例中記載的方法、例如在美國專利No.6,194,551 Bl和WO1999/51642中記載的方法，其中描述了具有改變的Fc區胺基酸序列的多肽變體(具有變體Fc區的多肽)和具有增強或降低的C1q結合的多肽變體。
本發明的抗體的胺基酸序列和核苷酸序列
本發明首先採用重組人PD-1蛋白來免疫小鼠，然後通過噬菌體抗體庫篩選獲得與重組人PD-1特異性結合的高結合力抗體M944 scFv抗體殖株。之後採用PCR方法將編碼M944 scFv抗體的重鏈和輕鏈可變區的核苷酸序列分別與編碼小鼠IgG1重鏈恆定區和小鼠kappa輕鏈恆定區的核苷酸序列進行拼接，***瞬轉表達載體HEK-293，進行培養表達。採用蛋白A純化柱進行純化獲得高純度鼠抗體PD1-M944。ELISA測試表明，鼠抗體PD1-M944能夠很好地阻斷PD-1與其配體的結合。
然後，採用經典的人源化方式CDR移植方法，首選與鼠輕鏈或重鏈可變區最接近的人抗體輕鏈或重鏈可變區為模板，在一個實施方案中，選擇IGKV3-11*01為輕鏈可變區的人源模板，IGHV3-21*02 為重鏈可變區的人源模板，將鼠抗體輕鏈/重鏈的各3個CDR分別***到上述人源模板的相應位置，獲得人源化的輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)序列。由於鼠源框架區的關鍵位點對於支撐CDR的活性至關重要，因此將關鍵點回復突變為鼠抗體的序列。分別將輕鏈/重鏈訊號肽序列、回復突變的人源化抗體輕鏈/重鏈的可變區序列、人IgG4重鏈恆定區/人kappa輕鏈恆定區序列依次拼接，獲得人源化抗體PD1-H944的胺基酸序列和核苷酸序列。
[本發明的核酸]
本發明還涉及編碼本發明的抗體或其部分的核酸分子。這些核酸分子的序列包括但不限於SEQ ID NO：3-7和26-33。
本發明的核酸分子不限於本文公開的序列，還包括其變體。本發明中變體可以參照它們在雜交中的物理特性來描述。本領域技術人員會認識到利用核酸雜交技術，核酸可用於鑒別其互補物以及其等同物或同系物。還會認識到雜交可以以低於100%互補性發生。然而，考慮到條件的適當選擇，雜交技術可用於基於DNA序列與特定探針的結構相關性來區分所述DNA序列。對於這類條件的指導參見Sambrook et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989和Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds.(1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York：John Wiley and Sons。
[重組載體和表達]
本發明還提供了包含本發明的一個或多個核苷酸序列的重組構建體。本發明的重組構建體可與載體一起使用，所述載體例如質粒、噬粒、噬菌體或病毒載體，編碼本發明的抗體的核酸分子被***所述載體中。
本文提供的抗體可通過在宿主細胞中重組表達編碼輕鏈和重鏈或其部分的核苷酸序列來製備。為了以重組方法表達抗體，可用攜帶編碼輕鏈和/或重鏈或其部分的核苷酸序列的一個或多個重組表達載體轉染宿主細胞，以使得所述輕鏈和重鏈在所述宿主細胞中表達。標準重組DNA方法學被用於製備和/或獲得編碼重鏈和輕鏈的核酸、將這些核酸納入重組表達載體中並且將所述載體引入至宿主細胞中，例如Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)、 Ausubel, F. M. et al.(eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) 和Boss et al.的美國專利No. 4,816,397中記載的那些。
此外，可將編碼所述重鏈和/或輕鏈的可變區的核苷酸序列轉化為例如編碼全長抗體鏈、Fab片段或ScFv的核苷酸序列：例如可以將編碼輕鏈可變區或重鏈可變區的DNA片段可操作地連接(以使得所述兩個DNA片段編碼的胺基酸序列都在框架中)至編碼例如抗體恆定區或柔性接頭的另一DNA片段。人重鏈和輕鏈恆定區的序列是本領域中已知的(參見，例如Kabat, E. A., el al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)，包括這些區域的DNA片段可通過標準PCR擴增來獲得。
為了表達所述抗體，可使用標準重組DNA表達方法(參見，例如Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))。例如，可將編碼所需抗體的核苷酸序列***至表達載體中，隨後將所述表達載體轉染至合適的宿主細胞中。合適的宿主細胞為原核細胞和真核細胞。原核宿主細胞的實例為細菌，真核宿主細胞的實例為酵母、昆蟲或哺乳動物細胞。應理解，包括選擇調節序列的表達載體的設計受到多種因素的影響，例如宿主細胞的選擇、所需的蛋白質的表達水平以及表達是組成型的還是可誘導型的。
本發明的抗體可通過公知方法從重組細胞培養物回收和純化，所述公知方法包括但不限於，硫酸銨或乙醇沉澱、酸提取、蛋白A親和層析、蛋白G親和層析、陰離子或陽離子交換色譜法、磷酸纖維素色譜法、疏水相互作用色譜法、親和色譜法、羥磷灰石色譜法以及凝集素色譜法。高效液相色譜法(“HPLC”)也可用於純化。參見例如，Colligan, Current Protocols in Immunology, 或 Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各自以引用的方式全文納入本文。
本發明的抗體包括天然純化的產物、化學合成方法的產物和通過重組技術從原核及真核宿主產生的產物，所述真核宿主包括，例如酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞。本發明的抗體可以是糖基化的，或者可以是非糖基化的。這類方法記載於許多標準實驗室手冊中，例如上文的Sambrook，第17.37-17.42節；上文的Ausubel，第10、12、13、16、18和20章。
因此，本發明的實施方案還為包含所述載體或核酸分子的宿主細胞，其中所述宿主細胞可為高等真核宿主細胞例如哺乳動物細胞、低等真核宿主細胞例如酵母細胞，並可為原核細胞例如細菌細胞。
[本發明的抗體的特性和功能]
對所述PD1-H944抗體進行特性分析和功能分析。分析結果表明，本發明的抗體具備以下優勢：(1)能夠與人PD-1高親和力特異性結合，具有低解離速率，從而提供良好的抗腫瘤藥效；(2)與Nivolumab相比，能夠更完全地阻斷PD-L1與PD-1的結合；(3)與Nivolumab相比，與重組人PD-1的結合更靈敏、更具特異性；與重組猴PD-1有與Nivolumab類似的交叉結合，且均不結合鼠PD-1；(4)能夠有效阻斷重組人PD-1與其配體PD-L1和PD-L2的結合；(5)能夠有效地再啟動免疫抑制的T細胞，活化重組人PD-1報告基因細胞系統；(6)在嵌合PD-1小鼠的結腸癌MC38荷瘤小鼠模型中具有優異的抑瘤作用，遠好於Nivolumab(來源：北京義翹神州科技有限公司)，且與Pembrolizumab(來源：北京義翹神州科技有限公司)相當；(7)ADCC和CDC活性均很低，其中ADCC活性低於Nivolumab。
[用途]
本發明的抗體可用於治療多種腫瘤或癌症或製備治療多種腫瘤或癌症的藥物，其特異性針對異常表達的PD-1受體。所述腫瘤或癌症的非限制性實例包括結腸癌。
[藥物組合物]
可將本發明的抗體與至少一種其他試劑(例如穩定化合物)製備成藥物組合物，其包括本發明的抗體和一種或多種藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑。
[試劑盒]
本發明還涉及藥物包裝和包含一個或多個容器的試劑盒，所述容器裝有上文提到的本發明的藥物組合物。與這類容器相關的可以是管理藥物或生物製品的生產、使用或銷售的政府機構所規定的形式的提示，其反映被所述產品的生產、使用或銷售的機構批准用於人類給藥。
[製備和儲存]
本發明的藥物組合物可以以本領域中已知的方式製備，例如通過常規的混合、溶解、造粒、錠劑製備、研磨、乳化、包裹、包埋或凍幹方法。
在已經製備包含配製於可接受的載體中的本發明化合物的藥物組合物之後，可以將它們放置在適當的容器中並貼上標籤用於治療所標明的病症。這類標籤會包括給藥的量、頻率和方法。
[藥物組合]
上述包含本發明的抗體的藥物組合物還與一種或多種其他治療劑，例如抗腫瘤劑組合，其中所得組合不會引起不可接受的不利影響。
以下實施例用於示例性地說明本發明，而非對本發明進行限制。
[實施例]
實施例1：採用噬菌體抗體展示文庫篩選阻斷PD-1與PD-L1/PD-L2結合的鼠源抗體。
[1.1 小鼠免疫]
採用重組人PD-1蛋白(來源：北京義翹神州科技有限公司，Cat. 10377-H08H)來免疫小鼠。該人PD-1蛋白(UniProtKB Q15116)的胞外區胺基酸序列為Met 1-Gln167(SEQ ID NO：1)。
具體方法為：將重組人PD-1蛋白與弗氏佐劑混合，使用混合物進行五次免疫，每次免疫劑量為20 μg，皮下注射，免疫間隔依次為2周，3周，2周，3周。從第二次免疫起，每次免疫後七天經眼眶內眥靜脈叢採血。採用ELISA方法，包被重組人PD-1蛋白以檢測小鼠抗PD-1的血清效價。第五次免疫血清滴度達到8000倍稀釋，第五次免疫9周後使用25 μg重組人PD-1蛋白進行靜脈注射加強，4天之後處死小鼠，取小鼠的脾臟組織凍存於液氮中。
[1.2 噬菌體抗體庫篩選]
小鼠的脾組織用TriPure Isolation Reagent試劑(來源：Roche)進行RNA提取，用反轉錄試劑盒(來源：Invitrogen)進行反轉錄獲得cDNA，PCR擴增分別獲得編碼小鼠抗體的輕鏈和重鏈可變區序列的核苷酸序列，採用重疊延伸拼接PCR法將編碼小鼠抗體的輕鏈和重鏈可變區序列的核苷酸序列拼接成編碼scFv的核苷酸序列，輕重鏈可變區通過接頭(linker)：TCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTGGTGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC(SEQ ID NO：2)進行連接(參考文獻：Rapid PCR-cloning of full-length mouse immunoglobulin variable regions；Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction T Joneset.al Bio/Technolgy 9(6)：579 · July 1991)，再通過限制性內切酶Sfi I(來源：Fermentas)酶切連接到噬菌體載體pComb3x(來源：北京義翹神州科技有限公司)中，電轉化X-Blue感受態構建免疫小鼠的噬菌體展示scFv抗體庫。將重組人PD-1蛋白包被在ELISA板上，按照噬菌體抗體淘選的流程，篩選獲得抗PD-1陽性抗體富集的噬菌體文庫(參考文獻：Antibody Phage Display： Methods and Protocols, Philippa M. O’Brien and Robert Aitken(Eds), Humana Press,ISBN： 9780896037113)。從富集的文庫中挑取單株噬菌體進行表達，用ELISA方法檢測與重組人PD-1蛋白的結合，篩選獲得與重組人PD-1特異性結合的高結合力抗體M944 scFv抗體殖株，該殖株送測序公司測序獲得M944 scFv抗體的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。
[1.3 鼠抗體PD1-M944的生產]
採用PCR方法將M944 scFv抗體的重鏈和輕鏈可變區的核苷酸序列(SEQ ID NO：4/5) 分別與小鼠IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：6)和小鼠kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列進行拼接，分別用Hind III和Xba I(來源：Fermentas)酶切***瞬轉表達載體pSTEP2中(來源：北京義翹神州科技有限公司)，提質粒後轉染HEK-293細胞進行培養表達7天，培養上清採用蛋白A純化柱進行純化獲得高純度抗體。
[1.4 鼠抗體PD1-M944功能檢測]
(1)阻斷重組人PD-1與PD-L1的結合：將濃度為1 μg/mL的重組人PD-1蛋白包被於96孔板上，每孔100 μL，4℃包被過夜。次日洗板，室溫阻斷1小時後，同時加入100 μL 10 μg/mL的生物素化蛋白PD-L1-Fc-biotin(來源：北京義翹神州科技有限公司)與不同濃度(0.4 μg/mL、2 μg/mL和10 μg/mL)的PD1-M944或Nivolumab(來源：北京義翹神州科技有限公司)共同培養，洗板去除未結合抗體。加入抗生蛋白鏈菌素/HRP(來源：北京中杉金橋生物技術有限公司)培養後重複洗板，加入底物顯色液進行顯色，終止後檢測OD450 。結果顯示，重組PD-L1蛋白可有效結合包被的PD-1蛋白，加入不同濃度的PD1-M944或Nivolumab時均可有效地抑制重組PD-L1蛋白與PD-1的結合(圖1A)。該結果表明鼠抗體PD1-M944具有很好的阻斷PD-1與其配體PD-L1結合的功能。
(2)阻斷重組人PD-1與PD-L2的結合：將濃度為1 μg/mL的重組人PD-1蛋白包被於96孔板上，每孔100 μL，4℃包被過夜。次日洗板，室溫阻斷1小時後，同時加入100 μL 0.5 μg/mL的生物素化蛋白PD-L2-Fc-生物素(來源：北京義翹神州科技有限公司)，與不同濃度(0.5 μg/mL、2.5 μg/mL和12.5 μg/mL)的PD1-M944或Nivolumab(來源：北京義翹神州科技有限公司)共同培養，洗板去除未結合抗體，加入抗生蛋白鏈菌素/HRP(來源：北京中杉金橋生物技術有限公司)培養後重複洗板，加入底物顯色液進行顯色，終止後檢測OD450 。結果顯示，重組PD-L2蛋白可有效結合包被的PD-1蛋白，加入不同濃度的PD1-M944或Nivolumab時均可有效的抑制重組PD-L2與PD-1的結合(圖1B)。該結果表明鼠抗體PD1-M944具有很好的阻斷PD-1與其配體PD-L2結合的功能。
實施例2：人源化改造鼠抗體PD1-M944的序列以產生人源化抗體PD1-H944的序列。
[2.1 鼠抗體PD1-M944輕鏈及重鏈的各3個CDR的確定]
在實施例1.2中測定了M944 scFv抗體的核苷酸序列，據此核苷酸序列推導出PD1-M944 scFv抗體的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列，見SEQ ID NO：8/9。
參考Kabat編號方式確定鼠抗體PD1-M944輕鏈及重鏈各3個CDR的胺基酸序列，參見表1。上述的輕鏈及重鏈各3個CDR在後續步驟中被移植且保留在最終獲得的人源化抗體PD1-H944中，見實施例2.2和2.3。
表1： PD1-M944/ PD1-H944輕鏈及重鏈CDR序列
名稱 序列
LCDR1 ESVDSYGNSFMH(SEQ ID NO：10)
LCDR2 AASNQGSGVPA(SEQ ID NO：11)
LCDR3 QQSKEVPWT(SEQ ID NO：12)
HCDR1 GFTFSSYGMS(SEQ ID NO：13)
HCDR2 VATISGGGRDTYYSDSVKG(SEQ ID NO：14)
HCDR3 SRQYGTVWFFN(SEQ ID NO：15)
[2.2 將鼠抗體PD1-M944 人源化CDR移植]
鼠抗體人源化採用經典的人源化方式CDR移植方法，首選與鼠輕鏈或重鏈可變區最接近的人抗體輕鏈或重鏈可變區為模板，將鼠抗體輕鏈或重鏈的各3個CDR(表1)***到該人抗體的可變區中，獲得人源化的輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)序列。所用PD1-M944的輕鏈可變區的人源模板為IGKV3-11*01，該模板與PD1-M944輕鏈的同源性為73.48%，重鏈可變區的人源模板為IGHV3-21*02，該模板與PD1-M944重鏈的同源性為81.94%。
[2.3將人源化可變區序列的框架區回復突變]
由於鼠源框架區有關鍵點對於支撐CDR的活性至關重要，因此將關鍵點回復突變為鼠抗體的序列，其中輕鏈的第89位回復突變為M，第91位回復突變為F，重鏈的第44位回復突變為R，第78位回復突變為N。
經CDR人源化移植和框架區回復突變獲得人源化抗體PD1-H944，其重鏈和輕鏈胺基酸序列分別如SEQ ID NO：16/17所示；其含有訊號肽的形式的重鏈和輕鏈胺基酸序列分別如SEQ ID NO：18/19所示，分別包含依次連接的重鏈/輕鏈訊號肽序列(SEQ ID NO：20/21)；其人源化抗體重鏈/輕鏈的可變區序列(SEQ ID NO：22/23)；其人源化抗體的恆定區為人IgG4重鏈恆定區/人kappa輕鏈恆定區序列(SEQ ID NO：24/25)。
表2：鼠源和人源化抗體的胺基酸序列和核苷酸序列
編號 名稱 序列
SEQ ID NO：1 人PD-1蛋白(UniProtKB Q15116)胞外區胺基酸序列Met 1-Gln167 MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQ
SEQ ID NO：2 構建噬菌體抗體庫時所用鼠抗體scFv的Linker核苷酸序列 TCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTGGTGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC
SEQ ID NO：3 鼠抗體PD1-M944 scFv核苷酸序列 PD1-M944 輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：5)： GATATTGTGCTAACTCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAACCAAGGATCCGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCATCCTATGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA Linker(SEQ ID NO：2) TCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTGGTGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC PD1-M944 重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：4)： GAGGTGCAACTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTTCCTATGGCATGTCTTGGGTTCGTCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCGACCATTAGTGGTGGTGGTCGTGACACCTACTATTCAGACAGTGTGAAGGGGCGGTTCACCGTCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTTCCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAAGACACGGCCTTGTATTATTGTTCACGTCAATATGGTACGGTCTGGTTTTTTAACTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
SEQ ID NO：4 鼠抗體PD1-M944 重鏈可變區核苷酸序列 GAGGTGCAACTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTTCCTATGGCATGTCTTGGGTTCGTCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCGACCATTAGTGGTGGTGGTCGTGACACCTACTATTCAGACAGTGTGAAGGGGCGGTTCACCGTCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTTCCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAAGACACGGCCTTGTATTATTGTTCACGTCAATATGGTACGGTCTGGTTTTTTAACTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
SEQ ID NO：5    鼠抗體PD1-M944 輕鏈可變區核苷酸序列 GATATTGTGCTAACTCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAACCAAGGATCCGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCATCCTATGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
SEQ ID NO：6 小鼠IgG1重鏈恆定區核苷酸序列 GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAA
SEQ ID NO：7 小鼠kappa輕鏈恆定區核苷酸序列 CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
SEQ ID NO：8 鼠抗體PD1-M944重鏈可變區胺基酸序列 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGRDTYYSDSVKGRFTVSRDNAKNNLFLQMSSLRSEDTALYYCSRQYGTVWFFNWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：9 鼠抗體PD1-M944輕鏈可變區胺基酸序列 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：10 鼠抗體PD1-M944/人源化抗體PD1-H944輕鏈CDR1胺基酸序列 ESVDSYGNSFMH
SEQ ID NO：11 鼠抗體PD1-M944/人源化抗體PD1-H944輕鏈CDR2胺基酸序列 AASNQGSGVPA
SEQ ID NO：12 鼠抗體PD1-M944/人源化抗體PD1-H944輕鏈CDR3胺基酸序列 QQSKEVPWT
SEQ ID NO：13 鼠抗體PD1-M944/人源化抗體PD1-H944重鏈CDR1胺基酸序列 GFTFSSYGMS
SEQ ID NO：14 鼠抗體PD1-M944/人源化抗體PD1-H944重鏈CDR2胺基酸序列 VATISGGGRDTYYSDSVKG
SEQ ID NO：15 鼠抗體PD1-M944/人源化抗體PD1-H944重鏈CDR3胺基酸序列 SRQYGTVWFFN
SEQ ID NO：16 人源化抗體PD1-H944重鏈胺基酸序列 重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：22)： EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRDTYYSDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMNSLRAEDTAVYYCSRQYGTVWFFNWGQGTLVTVSS重鏈恆定區胺基酸序列(SEQ ID NO：24)： ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：17 人源化抗體PD1-H944輕鏈胺基酸序列 輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：23)： EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYFCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK 輕鏈恆定區胺基酸序列(SEQ ID NO：25)： RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：18 含有訊號肽的人源化抗體PD1-H944重鏈胺基酸序列 重鏈訊號肽胺基酸序列(SEQ ID NO：20)： MGWSLILLFLVAVATRVLS 重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：22)： EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRDTYYSDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMNSLRAEDTAVYYCSRQYGTVWFFNWGQGTLVTVSS 重鏈恆定區胺基酸序列(SEQ ID NO：24)： ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：19 含有訊號肽的人源化抗體PD1-H944輕鏈胺基酸序列 輕鏈訊號肽胺基酸序列(SEQ ID NO：21)： MGWSCIILFLVATATGVHS 輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：23)： EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYFCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK 輕鏈恆定區胺基酸序列(SEQ ID NO：25)： RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：20 人源化抗體PD1-H944重鏈訊號肽胺基酸序列 MGWSLILLFLVAVATRVLS   
SEQ ID NO：21 人源化抗體PD1-H944輕鏈訊號肽胺基酸序列 MGWSCIILFLVATATGVHS
SEQ ID NO：22 人源化抗體PD1-H944重鏈可變區胺基酸序列    EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRDTYYSDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMNSLRAEDTAVYYCSRQYGTVWFFNWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：23 人源化抗體PD1-H944輕鏈可變區胺基酸序列    EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYFCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：24 人源化抗體PD1-H944重鏈恆定區胺基酸序列    ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：25 人源化抗體PD1-H944輕鏈恆定區胺基酸序列 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：26 含有訊號肽的人源化抗體PD1-H944重鏈核苷酸序列 重鏈訊號肽核苷酸序列(SEQ ID NO：28)： ATGGGCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCCTGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGTCT 重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：30：) GAGGTCCAACTTGTGGAGTCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCTGGAGGCTCCCTGAGACTGTCCTGTGCTGCCTCTGGCTTCACCTTCTCCTCCTATGGGATGAGTTGGGTGAGACAGGCTCCTGGGAAGAGATTGGAGTGGGTGGCTACCATCTCTGGAGGAGGCAGGGACACCTACTACTCTGACTCTGTGAAGGGCAGGTTCACAATCAGCAGGGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTCCAAATGAACTCCCTGAGGGCTGAGGACACAGCAGTCTACTACTGTAGCAGACAATATGGCACAGTGTGGTTCTTCAACTGGGGACAAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCT 重鏈恆定區核苷酸序列(SEQ ID NO：32)： GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATAA
SEQ ID NO：27 含有訊號肽的人源化抗體PD1-H944輕鏈核苷酸序列 輕鏈訊號肽核苷酸序列(SEQ ID NO：29)： ATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTGTTCCTGGTGGCTACAGCCACAGGAGTGCATTCT 輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：31)： GAGATTGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGTCCCTGAGCCCTGGAGAGAGGGCTACCCTGTCCTGTAGGGCATCTGAGTCTGTGGACTCCTATGGCAACTCCTTTATGCACTGGTATCAACAGAAGCCTGGACAACCACCAAGACTGCTGATTTATGCTGCCAGCAACCAGGGCTCTGGAGTGCCTGCCAGGTTCTCTGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCTTGGAACCTGAGGACTTTGCTATGTACTTCTGTCAACAGAGCAAGGAGGTGCCATGGACCTTTGGACAAGGCACCAAGGTGGAGATTAAG 輕鏈恆定區核苷酸序列(SEQ ID NO：33)： CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO：28 人源化抗體PD1-H944重鏈訊號肽核苷酸序列 ATGGGCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCCTGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGTCT
SEQ ID NO：29 人源化抗體PD1-H944輕鏈訊號肽核苷酸序列 ATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTGTTCCTGGTGGCTACAGCCACAGGAGTGCATTCT
SEQ ID NO：30 人源化抗體PD1-H944重鏈可變區核苷酸序列 GAGGTCCAACTTGTGGAGTCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCTGGAGGCTCCCTGAGACTGTCCTGTGCTGCCTCTGGCTTCACCTTCTCCTCCTATGGGATGAGTTGGGTGAGACAGGCTCCTGGGAAGAGATTGGAGTGGGTGGCTACCATCTCTGGAGGAGGCAGGGACACCTACTACTCTGACTCTGTGAAGGGCAGGTTCACAATCAGCAGGGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTCCAAATGAACTCCCTGAGGGCTGAGGACACAGCAGTCTACTACTGTAGCAGACAATATGGCACAGTGTGGTTCTTCAACTGGGGACAAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCT
SEQ ID NO：31 人源化抗體PD1-H944輕鏈可變區核苷酸序列：    GAGATTGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGTCCCTGAGCCCTGGAGAGAGGGCTACCCTGTCCTGTAGGGCATCTGAGTCTGTGGACTCCTATGGCAACTCCTTTATGCACTGGTATCAACAGAAGCCTGGACAACCACCAAGACTGCTGATTTATGCTGCCAGCAACCAGGGCTCTGGAGTGCCTGCCAGGTTCTCTGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCTTGGAACCTGAGGACTTTGCTATGTACTTCTGTCAACAGAGCAAGGAGGTGCCATGGACCTTTGGACAAGGCACCAAGGTGGAGATTAAG
SEQ ID NO：32 人源化抗體PD1-H944重鏈恆定區核苷酸序列    GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATAA
SEQ ID NO：33 人源化抗體PD1-H944輕鏈恆定區核苷酸序列    CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO：34 鼠抗體PD1-M944 Scfv胺基酸序列 PD1-M944 輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：9)： DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK Linker(SEQ ID NO：35)： SSGGGGSGGGGGGSSRSS PD1-M944 重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：8)： EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGRDTYYSDSVKGRFTVSRDNAKNNLFLQMSSLRSEDTALYYCSRQYGTVWFFNWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：35 構建噬菌體抗體庫時所用鼠抗體scFv的Linker胺基酸序列 SSGGGGSGGGGGGSSRSS
實施例3：人源化抗體PD1-H944的生產。
將上述含有訊號肽的PD1-H944抗體的重/輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：26/27)PCR擴增後，其中包含依次連接的重鏈/輕鏈訊號肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：28/29)、人源化抗體重鏈/輕鏈可變區的核苷酸序列(SEQ ID NO：30/31)和人IgG4重鏈恆定區/人kappa輕鏈恆定區的核苷酸序列(SEQ ID NO：32/33)，分別通過限制性內切酶Hind III和Xba I(來源：Fermentas)雙酶切***商業載體pcDNA3(來源：Invitrogen)中，提質粒後pCDNA3輕鏈載體用Nru I+Nae I+Dra I三酶切回收1.8 kb條帶***CHO/dhfr系統的表達載體pSSE中，再將pCDNA3重鏈載體用Nru I+Nae I+Dra I(來源：Fermentas)三酶切回收2.5 kb***前一步構建好的pSSE(來源：北京義翹神州科技有限公司)輕鏈載體中獲得完整載體，該表達載體包含DNA擴增元件dhfr基因、NeoR抗性基因和抗體輕鏈和重鏈的表達元件的真核細胞表達載體。將該表達載體轉染至dhfr- DG44細胞中，經G418篩選獲得PD1-H944陽性細胞株，經MTX逐步加壓篩選獲得PD1-H944高表達細胞株，再經無血清培養馴化進行殖株篩選。每個步驟都採用ELISA檢測選取抗體高表達的殖株，並結合細胞生長的狀態和抗體藥物的關鍵品質屬性分析結果篩選獲得高表達細胞株。
採用無血清加料懸浮培養的方式培養PD1-H944生產CHO細胞株，獲得高純度和高品質的PD1-H944抗體。
實施例4：人源化抗體PD1-H944的特性分析。
[4.1 PD1-H944對人、小鼠和猴PD-1抗原結合親和力分析]
(1) PD1-H944與重組人PD-1蛋白的結合能力。
採用間接ELISA檢測PD1-H944與重組人PD-1蛋白的特異性結合。將不同濃度(0.16 ng/mL 、0.49 ng/mL、1.48 ng/mL、4.44 ng/mL、13.33 ng/mL、40 ng/mL、120 ng/mL、360 ng/mL、1080 ng/mL、3240 ng/mL和9720 ng/mL)的重組人PD-1蛋白包被於96孔板上，4℃包被過夜。次日洗板，室溫封閉1小時後，分別加入100 μL 2 μg/mL的PD1-H944、Nivolumab(來源：Bristol-Myers Squibb)和陰性對照抗體H7N9-R1-IgG4(來源：北京義翹神州科技有限公司)培養，洗板去除未結合抗體。加入山羊抗人IgG F(ab)2/HRP(來源：JACKSON)培養後重複洗板，加入底物顯色液進行顯色，檢測OD450 。結果顯示，PD1-H944和Nivolumab與重組人PD-1蛋白的特異性結合EC50 分別為31.5 ng/mL，R2=0.998和179.0 ng/mL，R2 =0.997。這說明PD1-H944結合重組人PD-1蛋白的能力明顯好於Nivolumab(圖2A-C)。
(2) PD1-H944與重組Jurkat/PD-1細胞的結合能力。
以對數生長期的重組人PD-1穩定表達細胞株Jurkat/PD-1(來源：神州細胞工程有限公司)為實驗材料，通過流式細胞儀檢測PD1-H944與重組Jurkat/PD-1細胞的結合能力。取5×105 個/管處於對數生長期的重組Jurkat/PD-1細胞，加入不同濃度(0.195 μg/mL、0.391 μg/mL、0.781 μg/mL、1.562 μg/mL、3.125 μg/mL、6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL)的PD1-H944、Nivolumab和陰性對照抗體H7N9-R1-IgG4，4℃混合培養後清洗，離心去除未結合抗體。加入山羊抗人IgG Fc-FITC(來源：北京義翹神州科技有限公司)檢測抗體在細胞上結合。結果顯示，PD1-H944與Jurkat/PD-1細胞特異性結合EC50=9.63 μg/mL，R2 = 1.000，Nivolumab與Jurkat/PD-1細胞特異性結合EC50=10.18 μg/mL，R2 = 0.994，陰性對照抗體H7N9-R1-IgG4與Jurkat/PD-1細胞無結合(圖3)。這說明PD1-H944與Jurkat/PD-1細胞表達的PD-1有良好的結合能力，並且其結合能力略好於Nivolumab。
(3) PD1-H944與重組人PD-1蛋白的結合親和力。
利用Octet生物分子相互作用分析系統測定多個濃度點的PD1-H944(0.90nM、1.79nM、3.66nM、7.24nM)、Nivolumab(0.51nM、1.02nM、2.05nM、4.10nM)與PD-1的親和力，以H7N9-R1-IgG4(13.30nM)為陰性對照抗體。結果顯示，PD1-H944與重組人PD-1蛋白結合親和力KD 平均值為64.8 pM，結合速率常數kon平均值為3.01E+05 M-1 s-1 ，解離速率常數koff平均值為1.95E-05 s-1 ；Nivolumab與PD-1蛋白結合親和力KD 平均值為74.1 pM，結合速率常數kon平均值為6.92E+05 M-1 s-1 ，解離速率常數koff平均值為5.12E-05 s-1 (圖4)。PD1-H944親和力強於Nivolumab的親和力，約為其親和力的1.14倍，並且PD1-H944具有更慢的解離速率，因此PD1-H944比Nivolumab具有更強的結合PD-1蛋白的能力。
(4) PD1-H944與重組猴、小鼠PD-1蛋白的結合能力。
採用間接ELISA檢測PD1-H944與重組猴、小鼠PD-1蛋白的特異性結合。將不同濃度(0.16 ng/mL 、0.49 ng/mL、1.48 ng/mL、4.44 ng/mL、13.33 ng/mL、40 ng/mL、120 ng/mL、360 ng/mL、1080 ng/mL、3240 ng/mL和9720 ng/mL)的重組人、猴和小鼠PD-1蛋白(來源：北京義翹神州科技有限公司)包被於96孔板上，每孔100 μL，4℃包被過夜。次日洗板，室溫封閉1小時後，分別加入100 μL 2 μg/mL的PD1-H944、Nivolumab和陰性對照抗體H7N9-R1-IgG4培養後洗板，加入檢測二抗-山羊抗人IgG F(ab)2/HRP，顯色，檢測OD450 ，每組3次平行檢測。結果顯示，PD1-H944能結合重組人PD-1蛋白和重組猴PD-1蛋白，抗原EC50分別為25.8 ng/mL(R2 =0.999)和32.7 ng/mL(R2 =0.997)，與重組小鼠PD-1蛋白無交叉結合(圖5A)；Nivolumab能結合重組人PD-1蛋白和重組猴PD-1蛋白，EC50分別為113.2 ng /mL(R2 =0.997)和80.2 ng/mL(R2 =0.997)，與小鼠PD-1蛋白無結合(圖5B)；陰性對照抗體與重組人PD-1蛋白、重組猴PD-1蛋白和重組小鼠PD-1蛋白均無結合(圖5C)。PD1-H944與猴PD-1的良好結合支持猴可用於該藥物安全性評價。
(5)PD1-H944與重組猴、小鼠PD-1蛋白的結合親和力。
利用Octet測定不同濃度梯度(參見圖6A-B)的PD1-H944、Nivolumab與生物素化的猴、小鼠PD-1蛋白(來源：北京義翹神州科技有限公司)的親和力，分析獲得KD 值。結果顯示，PD1-H944與重組猴PD-1蛋白的親和力KD 值為108 pM，Nivolumab與重組猴PD-1蛋白的親和力KD 值為131 pM，兩者親和力相近(圖6A)；PD1-H944與Nivolumab與重組小鼠PD-1蛋白均無結合(圖6B)。
4.2 PD1-H944阻斷人PD-1配體(PD-L1和PD-L2)與人PD-1蛋白的結合
將重組人PD-1蛋白包被於96孔板上，每孔100 μL，4℃包被過夜。次日洗板，室溫封閉1小時後，加入1 μg/mL的人PD-L1-生物素(來源：北京義翹神州科技有限公司)或2 μg/mL的人PD-L2-生物素(來源：北京義翹神州科技有限公司)，再加入不同濃度(0.003 μg/mL、0.008 μg/mL、0.025 μg/mL、0.074 μg/mL、0.222 μg/mL、0.667 μg/mL、2 μg/mL、6 μg/mL、18 μg/mL)的PD1-H944、Nivolumab或陰性對照抗體H7N9-R1-IgG4共同培養，加入抗生蛋白鏈菌素/HRP培養檢測OD450 ，每組2次平行檢測。結果顯示，生物素化的重組人PD-L1和PD-L2蛋白可有效結合包被的人PD-1蛋白，加入不同濃度的PD1-H944和Nivolumab均可有效的抑制重組人PD-L1蛋白(圖7A)和重組人PD-L2蛋白(圖7B)與人PD-1的結合。PD1-H944和Nivolumab對重組人PD-L1的半抑制濃度IC50分別為0.116 μg/mL(R2 =0.995)和0.129 μg/mL(R2 =0.997)，對重組人PD-L2的半抑制濃度IC50分別為0.446 μg/mL(R2 =0.994)和0.486 μg/mL(R2 =0.996)。PD1-H944對人PD-1與人PD-L1或人PD-L2結合的抑制能力與Nivolumab無明顯差異，陰性對照抗體無明顯抑制作用。
4.3 PD1-H944阻斷人PD-1配體(PD-L1)與人PD-1表達細胞的結合。
取5×105 個/管處於對數生長期的重組人PD-1穩定表達Jurkat/PD-1細胞，加入不同濃度(0.260 μg/mL、0.390 μg/mL、0.585 μg/mL、0.878 μg/mL、1.317 μg/mL、1.975 μg/mL、2.963 μg/mL、4.444 μg/mL、6.667 μg/mL或10.000 μg/mL)的PD1-H944、Nivolumab和陰性對照抗體H7N9-R1-IgG4，4℃混合培養。加入10 μL 0.4 μg/mL的B7H1-Fc-生物素(來源：北京義翹神州科技有限公司)，PBS清洗，離心去除未結合抗體。加入StreptavidinAlexa Fluor® 488 Conjugate(來源：Life Technologies)，4℃培養20分鐘，重複清洗並離心，加入200 μL PBS重懸細胞，在流式細胞儀上進行檢測。結果顯示，重組人PD-L1蛋白可有效結合Jurkat/PD-1細胞，加入不同濃度的PD1-H944和Nivolumab時，能有效抑制重組人PD-L1蛋白與Jurkat/PD-1細胞的結合(圖8)。PD1-H944和Nivolumab對重組人PD-L1蛋白的半抑制濃度IC50分別為1.78 μg/mL(R2 =0.994)和2.48 μg/mL(R2 =0.989)。PD1-H944對人PD-1和人PD-L1結合的抑制能力略好於Nivolumab，陰性對照抗體無明顯抑制作用。
[4.4 PD1-H944與CD16a的結合]
親和力受體CD16a(FcγRIIIa)蛋白是介導ADCC效應的主要Fc受體，其中含V158 SNP位點的受體為相對高親和力的受體。通過ELISA檢測PD1-H944與重組CD16a(V158)蛋白的結合，進而評估PD1-H944可能產生抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)效應的能力。
本實驗中所用的陽性對照PD1-H944-1-IgG1(o)為PD1-H944的可變區連接天然IgG1，陰性對照PD1-H944-1-IgG1為PD1-H944的可變區連接N297A突變IgG1，其N糖的缺失使Fc段失去了與CD16a結合的功能。將濃度為10 μg/mL的重組人PD-1蛋白包被於96孔板上，每孔100 μL，4℃包被過夜。次日洗板，室溫封閉1小時後，分別加入不同濃度(0.020 μg/mL、0.078 μg/mL、0.3125 μg/mL、1.25 μg/mL、5 μg/mL、20 μg/mL和80 μg/mL)(參見圖9)的PD1-H944、Nivolumab、陽性對照抗體PD1-H944-1-IgG1(o)(來源：北京義翹神州科技有限公司)和陰性對照抗體PD1-H944-1-IgG1(來源：北京義翹神州科技有限公司)，培養後洗板去除未結合抗體。將10 μg/mL的重組CD16a-AVI-His(V158)+BirA蛋白(來源：北京義翹神州科技有限公司)與1μg/mL的抗生蛋白鏈菌素/HRP共同培養後加入孔中，培養後顯色檢測OD450 。
結果顯示，陽性對照抗體與重組CD16a蛋白結合隨抗體濃度升高而增強。PD1-H944、Nivolumab和陰性對照抗體在檢測的各濃度條件下均與重組CD16a蛋白無結合(圖9)。這說明構建為IgG4亞型抗體的PD1-H944和Nivolumab都具有非常低的與CD16a結合的能力，預測PD1-H944沒有或具有非常低ADCC效應。
[4.5 PD1-H944與C1q的結合]
通過ELISA檢測PD1-H944與重組C1q蛋白的結合，進而評估PD1-H944可能產生補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)效應的能力。
以PD1-H944的可變區連接天然IgG1所得PD1-H944-1-IgG1(o)為陽性對照抗體(來源：北京義翹神州科技有限公司)，以H7N9-R1-IgG4(來源：北京義翹神州科技有限公司)為同型對照抗體。將不同濃度(20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL、0.313μg/mL、0.156 μg/mL和0.078 μg/mL)(參見圖10)的PD1-H944、Nivolumab、陽性對照抗體及同型對照抗體包被於96孔板上，每孔100 μL，4℃包被過夜。次日洗板，室溫封閉1小時後，分別加入100 μL的5 μg/mL重組C1q蛋白(來源：Quidel Corporation)，培養3小時洗板。加入100 μL按1：400倍稀釋的二抗-抗C1q/HRP(來源：Abcam)，培養1小時，顯色，檢測OD450 。
結果顯示，陽性對照抗體與重組C1q蛋白結合隨抗體濃度升高而增強。PD1-H944、Nivolumab和同型對照抗體與重組C1q蛋白結合能力相近，結合能力比IgG1型陽性對照明顯降低(圖10)。
[4.6 PD1-H944與FcRn的結合]
通過ELISA檢測PD1-H944與重組人Fc受體(FcRn)蛋白結合，進而評估PD1-H944在人體中的藥代動力學。
將濃度為10 μg/mL的抗生物素蛋白Avidin(來源：Thermo Fisher Scientific)包被於96孔板上，每孔100 μL，4℃包被過夜。次日洗板，室溫封閉1小時後，分別加入10 μg/mL的生物素化FCGRT-His+B2M-蛋白(來源：北京義翹神州科技有限公司)培養1小時，再加入不同濃度(0.123 μg/mL、0.37 μg/mL、1.11 μg/mL、3.33 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、90 μg/mL、270 μg/mL)(參見圖11)的PD1-H944、Nivolumab或同型對照抗體H7N9-R1-IgG4(來源：北京義翹神州科技有限公司)培養1小時，洗板後加入250ng/mL的山羊抗人IgG Fc/HRP(來源：北京義翹神州科技有限公司)。從抗體稀釋到二抗培養的過程都維持在pH 6.0條件下進行，檢測OD450 。
結果顯示，PD1-H944和Nivolumab能結合重組人FcRn蛋白，且結合能力隨濃度升高而增強；在高濃度(270 μg/mL)下，PD1-H944與重組人FcRn蛋白的結合約為Nivolumab的1.62倍(圖11)。根據該結果推測PD1-H944在人體中有較好的藥代動力學。
實施例5：人源化抗體PD1-H944的功能分析。
[5.1 PD1-H944刺激混合淋巴反應中CD4+T細胞的活化]
通過CD4+T淋巴細胞與DCs混合實驗檢測抗人PD-1抗體的中和活性。採用Ficoll密度梯度離心法分離人外周血單核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)，然後用貼壁黏附法獲得單核細胞，加入含有160 ng/mL rhIL-4(來源：北京義翹神州科技有限公司)和20 ng/mLrhGM-CSF(來源：R&D Systems)的1640細胞培養基(來源：GIBCO)(含10% FBS，100單位/mL青黴素，100 μg/mL鏈黴素)，置CO2 培養箱內培養至第三天半量換液。培養6天後，收集懸浮細胞，此細胞即為DCs。將DCs密度調整為2×106 個細胞/mL，加入終濃度為50 μg/mL的絲裂黴素，在37℃處理20分鐘，1640培養基洗滌三次後備用。
用CD4+T淋巴細胞分選試劑盒(來源： Miltenyi Biotec)從另一人外周血分離的PBMC中分選CD4+T淋巴細胞。本實驗的不同批次中，分別採用分別來自三位獻血者的CD4+T淋巴細胞。
將分選的CD4+T淋巴細胞與先前經50 μg/mL絲裂黴素處理的DCs按10：1的比例混合，105 /孔均勻接種於96孔板中，分別加入PD1-H944、Nivolumab、陰性對照抗體H7N9-R1-IgG4(來源：北京義翹神州科技有限公司)，另設混合淋巴細胞對照組，即不加抗體只有CD4+T淋巴細胞和DCs混合液的組，DCs細胞對照組，即只加DCs細胞不加抗體及CD4+T淋巴細胞組， CD4+T細胞對照組，即只加CD4+T細胞不加抗體及DCs細胞組，加相同體積的樣品稀釋劑1640培養基，各個抗體的終濃度梯度為1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL，於CO2 培養箱內37℃、5%CO2 培養5天。收集培養上清，ELISA檢測培養上清中IL-2及IFN-γ的表達水平。
結果顯示，在無DCs混合的CD4+T細胞培養上清中，無法檢測到IFN-γ及IL-2的分泌，而在混合淋巴細胞對照組中，CD4+T細胞和DCs混合後能明顯提高CD4+T細胞的IFN-γ及IL-2分泌量。當在混合淋巴細胞系統中加入抗PD-1的抗體後，能更明顯地促進CD4+T和DC混合淋巴反應中CD4+T細胞的活化，獲得了更高的IFN-γ及IL-2分泌量，陰性對照抗體則沒有該效果，而PD1-H944及Nivolumab均有明顯的效果，結果如圖12所示。該結果表明PD1-H944比Nivolumab具有更良好的功能活性，可以有效地再啟動免疫抑制的T細胞。
[5.2 PD1-H944刺激PD1下游IL2訊號通路的報告基因的活化]
本實驗以效應細胞Jurkat-NFAT-Luc2p-PD-1(來源：神州細胞工程有限公司)及靶細胞CHO-K1-PD-L1-CD3E(來源：神州細胞工程有限公司)為實驗材料，當兩種細胞共同培養時會使PD-1/PD-L1相互作用而抑制TCR訊號及NFAT-RE介導的生物發光，加入PD-1抗體後可阻斷PD-1/PD-L1相互作用從而釋放了這種抑制作用。通過檢測效應細胞的生物發光的強度(Bioluminescence，RLU)來測定PD1-H944在重組人PD-1報告基因細胞系統中的活化功能。
以2×104 /孔接種靶細胞CHO-K1-PD-L1-CD3E細胞於96孔板，在含有10% FBS的DMEM培養基中培養過夜，然後去掉上清。以40 μL/孔加入不同濃度(0.007 μg/mL、0.023μg/mL、0.082 μg/mL、0.286 μg/mL、1.000 μg/mL、3.499 μg/mL、12.245 μg/mL、42.857μg/mL、150μg/mL)(參見圖13)的PD1-H944、Nivolumab及陰性對照抗體H7N9-R1-IgG4(來源：北京義翹神州科技有限公司)隨後以40 μL/孔加入7.5×104 個效應細胞Jurkat-NFAT-Luc2p-PD-1，置於CO2 培養箱，37℃、5% CO2 條件下培養6小時。每個測定設3複孔，同時設靶細胞、效應細胞和陰性對照孔M。6小時作用結束，以20 μL/孔加入被動裂解5X緩衝液(來源：Promega)，然後將96孔板置於-80℃冰箱待檢。檢測時，將放置於-80℃冰箱的96孔板解凍至室溫，震板混勻後每孔取20 μL上清液轉移至96孔白底板，通過LB960-微孔板式發光檢測儀進行發光檢測。
結果顯示，PD1-H944及對照抗體Nivolumab均具有明顯活化重組人PD-1報告基因細胞系統的作用，如圖13所示。在0.007-150 μg/mL濃度範圍內，PD1-H944作用的EC50為0.49 μg/mL，Nivolumab為1.08 μg/mL。PD1-H944的EC50顯著低於Nivolumab，其活性是Nivolumab的2.21倍。陰性對照抗體在重組人PD-1報告基因細胞系統中無活化功能。
[5.3 PD1-H944不明顯刺激Fc受體CD16a通路的ADCC功能]
本實驗以效應細胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A(來源：神州細胞工程有限公司)和靶細胞CHO-PD-1(來源：神州細胞工程有限公司)為實驗材料，採用重組高活性CD16a(V158)報告基因系統方法測定PD1-H944介導的ADCC效應。其原理是當兩種細胞共同培養並同時加入PD1-H944時，PD1-H944的Fab段與靶細胞上過表達的PD-1結合，其Fc段可與有Fcγ受體CD16A的效應細胞結合，從而啟動效應細胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A並促進NFAT-RE介導的化學發光。
以2×104 /孔接種靶細胞CHO-PD-1細胞於96孔板，在含有10% FBS 的DMEM培養基中培養過夜後，去掉上清。用含0.1% BSA的RPMI 1640(無酚紅)培養基清洗兩遍，然後以40 μL/孔加入不同濃度(參見圖14A-B)的陽性對照抗體PD1-H944-1-IgG1(o)、PD1-H944、Nivolumab和陰性對照抗體H7N9-R1-IgG4(來源：北京義翹神州科技有限公司)，隨後以40 μL/孔加入1×106 個效應細胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A，置於CO2 培養箱，37℃、5% CO2 條件下作用4小時。每個測定設3複孔，同時設靶細胞、效應細胞和陰性對照抗體對照孔。4小時作用結束，以20 μL/孔加入被動裂解5X緩衝液(來源：Promega)，將96孔板置於-80℃冰箱待檢。檢測時，將放置-80℃冰箱的96孔板解凍至室溫，震板混勻後每孔取20 μL上清液轉移至96孔白底板，通過LB960-微孔板式發光檢測儀進行發光檢測。
結果顯示，在0.018-300 ng/mL濃度範圍內，陽性對照抗體PD1-H944-1-IgG1(o)具有明顯的介導ADCC的作用，Nivolumab有較弱的ADCC效應，PD1-H944有弱於Nivolumab的ADCC效應(p＜0.01)。圖14A和圖14B為不同次的實驗結果。圖14C和14D分別表示A和B中抗體最高濃度點(300 ng/mL)對應生物發光強度(RLU)。在該靈敏的ADCC功能實驗中，PD1-H944與CD16a結合所引發的細胞活化明顯低於Nivolumab，並且結果穩定。PD1-H944藥物的低ADCC活性對該抗體在臨床中的藥效和安全性都是很好的支持。
[5.4 PD1-H944不明顯啟動補體C1q通路的CDC功能]
PD1-H944與PD-1過表達的腫瘤細胞結合後，可啟動經典補體通路殺傷腫瘤細胞，導致腫瘤細胞的死亡。本試驗採用WST-8法對PD1-H944的CDC效應進行研究。
用含0.1% BSA 的RPMI 1640培養基重懸CHO-PD-1細胞(來源：神州細胞工程有限公司)，以5×104 /孔均勻接種於96孔板中，隨後以50 μL/孔加入不同濃度(參見圖15)的抗體，然後以50 μL/孔加入1：4稀釋的補體C1q(來源：One lambda)。其中抗體為陽性對照抗體PD1-H944-1-IgG1(o)(來源：北京義翹神州科技有限公司)、PD1-H944、Nivolumab和陰性對照抗體PD1-H944-1-IgG1(來源：北京義翹神州科技有限公司)，設置檢測空白孔B(無細胞)和陰性對照組M (接種細胞，不加抗體)。37℃作用3小時後，每孔加入15 μL的WST-8顯色液，顯色穩定後置酶標儀上於450 nm、630 nm處測定吸光度。結果以吸光度值OD450 -OD630 ，並減去檢測空白孔B的讀值來計算，殺傷率%=(陰性對照M組OD值－樣品OD值)/陰性對照M組OD值×100%。
結果顯示，PD1-H944、Nivolumab和陰性對照抗體對過表達PD-1的腫瘤細胞CHO-PD-1無CDC效應，而陽性對照抗體對CHO-PD-1具有一定的殺傷作用，其最大殺傷率達到82.1%，結果如圖15所示。CDC實驗也證實了PD1-H944對表達PD-1的靶細胞沒有CDC效應，該抗體具有良好的安全性。
[5.5 PD1-H944有效抑制人源化PD-1小鼠體內MC38結腸癌皮下移植瘤模型的生長]
(1) PD1-H944在人源化PD-1小鼠體內MC38結腸癌皮下移植瘤模型中的藥效學研究一。
將處於對數生長期的MC38細胞(舜冉上海生物科技有限公司)用於腫瘤接種，將PBS重懸的MC38細胞以5×105 個/0.1 mL接種於B-hPD-1人源化小鼠(百奧賽圖)(將C57BL/6小鼠PD-1基因的外顯子2部分片段用人PD-1基因組的相應部分替代而得到的小鼠)的右側脅肋部皮下，共接種47隻。當腫瘤體積約100 mm3 左右時分組給藥，根據個體腫瘤體積挑選小鼠入組，採用excel軟體將動物按瘤體積隨機分組分配到5個組中，每組8隻。其中第4、5組為與本發明無關的其他抗PD-1抗體，因此不呈現其相關資料。分組當天開始給藥，給藥途徑為腹腔注射(I.P.)，每3天給藥1次，連續給藥6次，末次給藥後10天處死小鼠，取瘤組織進行稱重。具體給藥方案見下表3。通過計算腫瘤生長抑制率(TGI(%))來評價藥物的抗腫瘤作用：TGI(%) ＜ 60%為無效；TGI(%) ≥ 60%，且經統計學處理治療組瘤體積顯著低於溶劑對照組(P＜0.05)為有效，即對腫瘤生長具有顯著抑制作用。TGI(%)的計算方法如下：
TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100，其中：
Ti：治療組在給藥第i天的腫瘤體積均值，
T0：治療組在給藥第0天的腫瘤體積均值，
Vi：溶劑對照組在給藥第i天的腫瘤體積均值，
V0：溶劑對照組在給藥第0天的腫瘤體積均值。
實驗結束後處死動物，稱瘤重，計算瘤重抑制率IRTW%，以IRTW%＞60%為有效性參考指標，計算公式如下：
瘤重抑制率IRTW(%)=(W溶劑對照組-W治療組)/W溶劑對照組×100，W為腫瘤重量。
表3：試驗分組及給藥
組別 動物數(隻) 受試藥物 劑量(mg/kg)a 給藥途徑 療程
1 8 溶劑對照 -- 腹腔注射 Q3d×6
2 8 Nivolumab 20 腹腔注射 Q3d×6
3 8 PD1-H944 20 腹腔注射 Q3d×6
註：a：給藥容積依實驗動物體重按10 μL/g計算。
所有實驗動物在給藥期間活動、進食等一般狀態良好，體重均有一定程度的上升，受試藥(組3)和對照藥(組2)給藥後動物體重無顯著性差異(P＞0.05)。所有動物體重變化情況見圖16及表4。
表4. PD1-H944對MC38結腸癌移植B-hPD-1人源化小鼠體重的影響
組別 動物數(隻)c 體重(g)a 給藥25天後體重變化(g)
給藥前 首次給藥25天後 Pb
組1：溶劑對照 8 19.9±0.4 23.7±0.5 -- +3.8
組2：Nivolumab 20mg/kg 8 19.8±0.8 21.8±1.1 0.105 +2.0
組3：PD1-H944 20mg/kg 8 20.0±0.6 22.3±0.6 0.074 +2.3
a：均數±標準誤；
b：治療組體重與溶劑對照組體重在給藥25天後統計學比較，t檢驗；
c：組2實驗終點為7隻小鼠。
試驗中的各組腫瘤體積結果見表5和圖17。
表5：PD1-H944對MC38結腸癌移植B-hPD-1人源化小鼠腫瘤體積的影響
天數 溶劑對照    Nivolumab    PD1-H944
腫瘤體積(mm3 ) N    腫瘤體積(mm3 ) N TGI(%)    腫瘤體積(mm3 ) N TGI (%)
6 104±7 8    104±7 8 /    103±7 8 /
8 215±23 8    181±21 8 30.4    170±19 8 39.5
12 367±59 8    333±39 8 13.0    202±26*Ψ 8 62.3
15 618±84 8 432±58 8 36.1    195±33**ΨΨ 8 82.2
19 802±118 8    648±85 8 22.0    189±40**ΨΨ 8 87.7
22 1009±143 8 870±152 8 15.4    182±40**ΨΨ 8 91.3
26 1363±252 8    1310±221 8 4.3    162±47**ΨΨ 8 95.3
28 1745±339 8 1608±240 8 8.3    156±45**ΨΨ 8 96.8
31 2171±430 8    1802±228 7 17.8    171±51**ΨΨ 8 96.7
註：與溶劑對照組比較，*P＜0.05， **P＜0.01；與Nivolumab組比較，ΨP＜0.05，ΨΨP＜0.01；
天數：細胞接種後天數
首次給藥25天後，對所有動物實施安樂死，剝取腫瘤稱重照相。各組腫瘤重量進行統計比較，結果總結在表6和圖18。
表6：PD1-H944對MC38結腸癌移植B-hPD-1人源化小鼠腫瘤重量的影響
組別 動物數(隻) 瘤重(g) 瘤重抑制率IRTW (%)
組1：溶劑對照 8 1.719±0.310 --
組2：Nivolumab 7 1.492±0.274 13.2
組3：PD1-H944 8 0.044±0.017**ΨΨ 97.4
註：與溶劑對照組比較，*P＜0.05， **P＜0.01；與Nivolumab組比較，ΨP＜0.05，ΨΨP＜0.01
與腫瘤體積結果相同，Nivolumab對該模型的腫瘤抑制不明顯，而PD1-H944組平均瘤重為0.044±0.017克，其瘤重抑制率(IRTW)達到97.4%。經過資料分析，PD1-H944組腫瘤與溶劑對照組比較有顯著不同(P＜0.05)，證明PD1-H944有明顯抗腫瘤藥效。
實驗結束時，溶劑對照組平均腫瘤體積為2171±430 mm3 ，瘤重為1.719±0.310 g，陽性對照組Nivolumab (20 mg/kg) 平均腫瘤體積為1802±228 mm3 ，TGI為17.8%，瘤重為1.492±0.274 g，瘤重抑制率IRTW為13.2%，與溶劑對照組的腫瘤體積相比無顯著差異(P=0.480)。而PD1-H944的平均腫瘤體積為171±51mm3 ，TGI%為96.7%，瘤重為0.044±0.017 g，瘤重抑制率IRTW為97.4%，與溶劑對照組的腫瘤體積相比有明顯差異(P＜0.05)，表明供試抗體PD1-H944結合PD-1表位在該模型上是有效的，在20 mg/kg劑量水平下對MC38結腸癌皮下移植瘤有明顯的抑制作用。
(2) PD1-H944在人源化PD-1小鼠體內MC38結腸癌皮下移植瘤模型中的藥效學研究二。
將處於對數生長期的MC38細胞(舜冉上海生物科技有限公司)用於腫瘤接種，將PBS重懸的MC38細胞以5×105 個/0.1 mL接種於B-hPD-1人源化小鼠(百奧賽圖)的右側脅肋部皮下，共接種80隻。當腫瘤體積約150 mm3 左右時分組給藥，根據個體腫瘤體積挑選小鼠入組，採用excel軟體將動物按瘤體積隨機分組分配到8個組中，每組8隻。其中第3、4、7、8組為與本發明無關的其他抗PD-1抗體，因此不呈現其相關資料。分組當天開始給藥，給藥途徑為腹腔注射(I.P.)，每3天給藥1次，連續給藥6次，末次給藥後10天處死小鼠，取瘤組織進行稱重。具體給藥方案見下表7。
表7：試驗分組及給藥
組別 動物數(隻) 受試藥物 劑量(mg/kg)a 給藥途徑 療程
1 8 溶劑對照 -- 腹腔注射 Q3d×6
2 8 Pembrolizumabb 20 腹腔注射 Q3d×6
5 8 PD1-H944 8 腹腔注射 Q3d×6
6 8 PD1-H944 2 腹腔注射 Q3d×6
註：a：給藥容積依實驗動物體重按10 μL/g計算；
b： Pembrolizumab來源：北京義翹神州科技有限公司，下同。
通過計算腫瘤生長抑制率(TGI(%))來評價藥物的抗腫瘤作用：TGI(%) ＜ 60%為無效；TGI(%) ≥ 60%，且經統計學處理治療組瘤體積顯著低於溶劑對照組(P＜0.05)為有效，即對腫瘤生長具有顯著抑制作用。TGI(%)的計算方法如下：
TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100，其中：
Ti：治療組在給藥第i天的腫瘤體積均值，
T0：治療組在給藥第0天的腫瘤體積均值，
Vi：溶劑對照組在給藥第i天的腫瘤體積均值，
V0：溶劑對照組在給藥第0天的腫瘤體積均值。
實驗結束後處死動物，稱瘤重，計算瘤重抑制率IRTW%，以IRTW%＞60%為有效性參考指標，計算公式如下：
瘤重抑制率IRTW(%)=(W溶劑對照組 -W治療組 )/W溶劑對照組 ×100，W為腫瘤重量。
所有實驗動物在給藥期間活動、進食等一般狀態良好，體重均有一定程度的上升，受試藥和對照藥給藥後動物體重無顯著性差異(P＞0.05)。見表8和圖19。
表8：PD1-H944對MC38結腸癌移植B-hPD-1人源化小鼠體重的影響
組別 動物數(隻) 體重(g)a 給藥23天後體重變化(g)
給藥前 首次給藥23天後 Pb
組1：溶劑對照 8 27.3±0.5 29.5±0.4 -- +2.2
組2： Pembrolizumab20mg/kg 8 27.6±0.6 28.2±0.5 0.062 +0.6
組5：PD1-H944 8mg/kg 8 28.1±0.6 28.9±0.6 0.421 +0.8
組6：PD1-H944 2mg/kg 8 27.3±0.5 28.4±0.4 0.070 +1.1
註：a：均數±標準誤；
b：治療組體重與溶劑對照組體重在給藥23天後統計學比較，t檢驗。
實驗中，各組腫瘤體積見表9和圖20。
表9：PD1-H944對MC38結腸癌移植B-hPD-1人源化小鼠腫瘤體積的影響(均數±標準誤)
天數 溶劑對照組    Pembrolizumab 20 mg/kg組    PD1-H944 8 mg/kg組    PD1-H944 2 mg/kg組
     腫瘤體積(mm3 ) N    腫瘤體積(mm3 ) N TGI(%)    腫瘤體積(mm3 ) N TGI(%)    腫瘤體積(mm3 ) N TGI(%)
6 148±11 8    152±14 8 /    148±15 8 /    146±12 8 /
8 274±29 8    248±20 8 23.6    308±22 8 -26.3    312±24 8 -31.2
11 782±129 8    334±33** 8 71.2    415±61* 8 57.9    454±31* 8 51.4
16 1052±148 8    309±103** 8 82.6    428±88** 8 69.0    429±47** 8 68.7
19 1597±286 8    263±134** 8 92.3    448±111** 8 79.3    509±91** 8 75.0
21 1783±339 8    213±110** 8 96.3    441±95** 8 82.1    435±88** 8 82.3
26 2712±590 8    212±149** 8 97.7    350±111** 8 92.1    470±120** 8 87.3
29 3405±624 8    248±176** 8 97.0    484±82** 8 89.7    626±150** 8 85.3
註：與溶劑對照組比較，*P＜0.05， **P＜0.01；
天數：細胞接種後天數；N：參加統計的該組動物數。
首次給藥24天後，對所有動物實施安樂死，剝取腫瘤稱重照相。各組腫瘤重量進行統計比較，結果總結在表10和圖21。
表10：PD1-H944對MC38結腸癌移植B-hPD-1人源化小鼠腫瘤重量的影響(均數±標準誤)
組別 動物數(隻) 瘤重(g) 瘤重抑制率IRTW (%)
溶劑對照組 8 2.888±0.426 --
Pembrolizumab 20mg/kg組 8 0.186±0.158** 93.5
PD1-H944 8mg/kg組 8 0.352±0.106** 87.8
PD1-H944 2mg/kg組 8 0.441±0.129** 84.7
註：與溶劑對照組比較，*P＜0.05， **P ＜0.01。
實驗結果表明：
溶劑對照組：分組後腫瘤體積持續增長，試驗結束時的平均腫瘤體積是3405±624 mm3 。
陽性對照組：Pembrolizumab以20 mg/kg給藥後，與溶劑對照組相比，瘤體積增長緩慢，給藥第5天開始瘤體積即表現出顯著差異(P＜0.05)；試驗結束時TGI為97.0%，瘤重抑制率為93.5%，與溶劑對照組相比P＜0.05。這表明Pembrolizumab在此藥效模型上抑瘤作用明顯，說明該模型可用於Keytruda結合PD-1表位的抗體藥物的藥效評價。
PD1-H944 8 mg/kg組：PD1-H944以8 mg/kg給藥後，與溶劑對照組相比，瘤體積增長緩慢，給藥第5天開始瘤體積即表現出顯著差異(P＜0.05)；試驗結束時TGI為89.7%，瘤重抑制率為87.8 %，與溶劑對照組相比P＜0.05。
PD1-H944 2 mg/kg組：PD1-H944以2 mg/kg給藥後，與溶劑對照組相比，瘤體積增長緩慢，給藥第5天開始瘤體積即表現出顯著差異(P＜0.05)；試驗結束時TGI為85.3%，瘤重抑制率為84.7 %，與溶劑對照組相比P＜0.05。這再次表明供試PD1-H944結合PD-1表位的抗體在該模型上是有效的，對MC38結腸癌皮下移植瘤有明顯的抑瘤作用並呈現一定的劑量相關性。PD1-H944及Pembrolizumab在本實驗的抗腫瘤藥效結果在瘤重上也得到證實。
本次試驗結果顯示，腹腔給予小鼠PD1-H944 8 mg/kg或2 mg/kg，每3天給藥1次，連續給藥6次，均能顯著抑制PD-1人源化小鼠MC38移植瘤的生長(P＜0.05)，並且給藥組動物表徵和體重均與模型組無差異。考慮模型設計對不同表位抗體的偏好性，本實驗並不評價PD1-H944與Pembrolizumab的藥效差異。
體內藥效學研究採用人源化PD-1的C57BL/6小鼠體內MC38結腸癌皮下移植瘤模型為動物模型，研究了PD1-H944單用對人源化PD-1小鼠MC38結腸癌皮下移植瘤的抗瘤作用。B-hPD-1人源化小鼠是在C57BL/6小鼠背景上對小鼠PD-1基因進行人源化改造，使該小鼠適用於抗人PD-1抗體藥物的體內藥效評估。該模型對不同表位PD-1抗體的藥效有一定的選擇性，Pembrolizumab在該模型研究中有明顯的腫瘤抑制效果。研究結果顯示，PD1-H944 單用(2、8、20mg/kg，每3天給藥1次，連續給藥6次)可顯著抑制MC38移植瘤的生長，總結資料見表11和12。
表11：PD1-H944對MC38結腸癌移植B-hPD-1人源化小鼠的抗瘤作用
分組n=7-8 給藥期限和頻率 給藥途徑 實驗結束時
腫瘤體積抑制率TGI(%) 瘤重抑制率IRTW (%)
溶劑對照組 3天/次×6次，停藥後觀察10天 腹腔注射 0.0 0.0
Nivolumab 20mg/kg 17.8 13.2
PD1-H944 20mg/kg 96.7 97.4
表12：不同劑量PD1-H944對人源化PD-1小鼠結腸癌移植瘤的抗腫瘤作用
分組n=7-8 給藥期限和頻率 給藥途徑 實驗結束時
腫瘤體積抑制率TGI(%) 瘤重抑制率IRTW(%)
溶劑對照組 3天/次×6次，停藥後觀察9天 腹腔注射 0.0 0.0
Pembrolizumab 20mg/kg 97.0 93.5
PD1-H944 2mg/kg 85.3 84.7
PD1-H944 8mg/kg 89.7 87.8
實施例6  PD1-H944特異性結合的胺基酸位點的鑒定。
實施例4.2的資料表明，PD1-H944與PD-L1(參見圖7A)或 PD-L2(參見圖7B)有效競爭與PD-1蛋白的結合，證明了PD1-H944與配體PD-L1或 PD-L2在PD-1的結合表位存在重疊交叉。
[分子模擬預測PD1-H944構象表位]
為了深入瞭解PD1-H944與PD-1蛋白介面相互作用，本實施例對PD1-H944和PD-1蛋白進行ZDOCK對接。基於PD1-H944與配體PD-L1在PD-1蛋白結合表位有重疊交叉這一事實，利用DS 4.0 (Accelrys Software Inc.)中的Antidody model程式對PD1-H944進行同源建模，最終模型經過拉氏圖驗證結構的合理性。PD-1蛋白三維結構從PDB資料庫中提取(PDB ID：4ZQK)，經過Protein Preparation程式初始化。PD1-H944模型和PD-1結構通過ZDOCK程式對接結合模式，打分函數前十位進行RDOCK優化，最優的模型經Protein Interface Analysis程式進一步分析(參見圖22)。對接模型介面作用顯示PD1-H944與PD-1蛋白主要結合的肽序列為CC'及FG片層(參見表13)。
表13 分子模擬預測PD1-H944與PD-1蛋白主要結合的肽序列(底線)
位置 序列
CC'片層 60 SESFV 64 78 K LAAFPEDRSQP 89
FG片層 128 LAPKAQI 134
[6.2 PD-1蛋白突變體驗證PD1-H944結合表位]
為了進一步確認PD1-H944的功能表位，根據表13中預測的PD1-H944與PD-1蛋白主要結合的肽序列，製備一系列丙胺酸突變的PD-1蛋白突變體，結合ELISA測定分析。為了驗證模型的準確性，本研究同時選擇了幾個實施例6.1模型之外的位點(參見表14)，這些突變位點大致分為五個空間構象表位(參見圖23)。
表14. 重組PD-1蛋白胞外區突變體設計
分佈 突變位點
N-loop D29A\R30A、R30A
CC'片層 E61A、N66A、K78A、D85A、D85A\S87A
FG片層 P130A、P130A \K131A、E136A\ R139A
根據實施例4.2的方法，ELISA測定表14中各突變體與PD1-H944的結合，與未突變的PD-1蛋白相比，突變體結合有不同程度的降低。以PD-1蛋白突變體類型為橫坐標，結合率為縱坐標，利用Excel 2007進行資料分析並作圖[結合率=OD(PD-1蛋白突變體)/OD(PD-1蛋白)×100%)]。結果表明，配體PD-L1結合PD-1蛋白的主要結合位點位於PD-1蛋白的CC'及FG片層上的Site 2、Site 3、Site 4、Site 5，該結果與其複合物晶體吻合(PDB ID：4ZQK)；陽性對照Nivolumab與PD-1蛋白的結合位點主要位於其N-loop及FG片層的Site 1和Site 4上，該結果也與其複合物晶體的分析結果吻合(PDB ID：5WT9)；PD1-H944與PD-1蛋白的主要結合位點是E61、K78 、D85、P130位於Site 3和Site 4上，該結果也與上述例中對接模型分析結果基本吻合(參見圖24及表15)，結果驗證了PD1-H944與PD-1蛋白對接模型的準確性。
表15：PD-L1、Nivolumab和PD1-H944 與PD-1各突變體的結合
   N loop CC’片層 FG片層   
   Site 1 Site 2 Site 3 Site 4 Site 5    PD-1
   D29A R30A R30A N66A K78A D85A D85A S87A E61A P130A P130A K131A E136A R139A
PD-L1 + + - - - +/- + - - - +
Nivolumab - +/- + +/- + + +/- - - + +
PD1-H944 + + + +/- - - - - - + +
註：+：表示結合率＞85%，非敏感結合位點；+/-：表示50%＜結合率≤85%，部分敏感結合位點；-：表示結合率≤50%，敏感結合位點
PD1-H944與PD-1蛋白對接模型顯示，PD1-H944與配體PD-L1的 PD-1蛋白結合表位重疊。這一事實支持PD1-H944通過直接的空間位阻發揮作用這一觀點。同時，PD1-H944也與Nivolumab存在表位交叉，而且具有更大的阻斷配體PD-L1結合表位區域(參見圖25A-C)。因此PD1-H944在腫瘤治療可能具有更優秀的治療效果。
無。
圖1：鼠抗體PD1-M944阻斷PD-L1(A)和PD-L2(B)與PD-1蛋白的結合。
圖2：ELISA檢測人源化抗體PD1-H944與重組人PD-1蛋白的結合(A，B，C，n=3)。
圖3：FACS檢測PD1-H944與重組Jurkat/PD-1細胞的結合。
圖4：Octet檢測PD1-H944(A1、B1、C1，n=3)和Nivolumab(A2、B2、C2，n=3)與重組人PD-1蛋白的親和力。
圖5：ELISA檢測PD1-H944(A)、Nivolumab(B)和陰性對照(C)與重組人、猴、小鼠PD-1蛋白的結合。
圖6：不同濃度的PD1-H944和Nivolumab與猴PD-1蛋白(A)和小鼠PD-1蛋白(B)的結合。
圖7：ELISA檢測PD1-H944阻斷人PD-L1(A)和人PD-L2(B)與重組人PD-1蛋白的結合。
圖8：FACS檢測PD1-H944阻斷人PD-L1與人Jurkat/PD-1細胞的結合。
圖9：ELISA檢測PD1-H944與重組CD16a蛋白的結合。
圖10：ELISA檢測PD1-H944與重組C1q蛋白的結合。
圖11：ELISA檢測PD1-H944與人FcRn蛋白的結合。
圖12：混合淋巴實驗中PD-1抗體促進IL-2(上)及IFN-γ(下)分泌(A，B，C為3位獻血者的CD4+T細胞)。
圖13：PD1-H944在重組人PD-1報告基因細胞系統中的活化功能。
圖14：重組CD16a報告基因系統檢測PD1-H944的ADCC功能(A、B為不同次實驗結果；C、D為抗體濃度最高點的生物發光強度數值；**表示P＜0.01)。
圖15：PD1-H944對CHO-PD-1細胞的CDC效應。
圖16：給藥後動物體重變化趨勢圖。
圖17：給藥後腫瘤體積增長趨勢圖。
圖18：實驗結束時腫瘤重量圖(*P＜0.05)。
圖19：給藥後動物體重變化趨勢圖。
圖20：給藥後的腫瘤體積增長趨勢圖。
圖21：實驗終點腫瘤重量圖。
圖22：PD1-H944的同源建模與PD1的晶體結構對接。
圖23：顯示了突變位點的PD1蛋白模型。
圖24：顯示了PD-1蛋白突變體與PD-L1、Nivolumab以及PD1-H944的結合。
圖25A-C：顯示了PD1-H944、PD-L1以及Nivolumab與PD-1的特異性結合的胺基酸位點。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020

Claims (23)

  1. 一種分離的PD-1抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈可變區或其部分和/或重鏈可變區或其部分， 其中所述輕鏈可變區或其部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO：10的輕鏈CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO：11的輕鏈CDR2和胺基酸序列為SEQ ID NO：12的輕鏈CDR3；且 所述重鏈可變區或其部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO：13的重鏈CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO：14的重鏈CDR2和胺基酸序列為SEQ ID NO：15的重鏈CDR3。
  2. 如請求項1所述之分離的PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含、由以下組成或基本上由以下組成：與PD-1抗體輕鏈可變區序列SEQ ID NO：23具有至少90%，92%，95%，98%或100%序列同一性的胺基酸序列，和/或與PD-1抗體重鏈可變區序列SEQ ID NO：22具有至少90%，92%，95%，98%或100%序列同一性的胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2所述之分離的PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體進一步包含輕鏈恆定區和重鏈恆定區，較佳地所述輕鏈恆定區為胺基酸序列為與SEQ ID NO：25的kappa輕鏈恆定區具有至少90%，92%，95%，98%或100%序列同一性的胺基酸序列，和/或所述重鏈恆定區為與胺基酸序列為SEQ ID NO：24的IgG4重鏈恆定區具有至少90%，92%，95%，98%或100%序列同一性的胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之分離的PD-1抗體或其抗原結合片段，其為IgG抗體，較佳為IgG4抗體。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之分離的PD-1抗體或其抗原結合片段，其為單株抗體。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之分離的PD-1抗體或其抗原結合片段，其與重組人PD-1蛋白的結合親和力KD 平均值為20-200 pM，較佳60-70 pM，更佳64.8 pM。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之分離的PD-1抗體或其抗原結合片段，其與含有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的PD-1蛋白分子或與SEQ ID NO：1具有至少90%，92%，95%，98%或100%序列同一性的胺基酸序列的蛋白分子特異性結合。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其特異性結合選自PD-1蛋白胞外區60SESFV64、78KLAAFPEDRSQP89、128LAPKAQI134中至少一種的肽序列； 較佳地，其特異性結合選自PD-1蛋白胞外區E61、K78、D85、P130中至少一種的胺基酸殘基。
  9. 一種分離的PD-1抗體或其抗原結合片段，其特異性結合選自PD-1蛋白胞外區60SESFV64、78KLAAFPEDRSQP89、128LAPKAQI134中至少一種的肽序列； 較佳地，其特異性結合選自PD-1蛋白胞外區E61、K78、D85、P130中至少一種的胺基酸殘基。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之分離的PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗原結合片段的形式為Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2 、Fd片段、Fd'片段、單鏈抗體分子或單域抗體；其中所述單鏈抗體分子較佳為scFv、di-scFv、tri-scFv、雙體抗體或scFab。
  11. 一種改構藥物分子，其為如請求項1至10中任一項的分離的PD-1抗體或其抗原結合片段與另一分子形成的共價或非共價連接物或形成的重組多靶點融合藥物，所述另一分子選自小分子化合物和/或生物大分子。
  12. 一種分離的核酸，其包含、由以下組成或基本上由以下組成：編碼如請求項1至10中任一項的分離的PD-1抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列，較佳地，所述分離的核酸包含、由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO：26和/或SEQ ID NO：27的核苷酸序列。
  13. 一種載體，其包含如請求項12的分離的核酸。
  14. 一種分離的細胞，其包含如請求項12的分離的核酸；和/或包含如請求項13的載體。
  15. 一種產生如請求項1至10中任一項的分離的PD-1抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括培養如請求項14的分離的細胞；和純化所述分離的PD-1抗體或其抗原結合片段。
  16. 一種如請求項1至10中任一項的分離的PD-1抗體或其抗原結合片段或如請求項11的改構藥物分子在製備用於治療腫瘤或癌症的藥物的用途。
  17. 如請求項16所述之用途，其中所述腫瘤或癌症為結腸癌。
  18. 一種如請求項1至10中任一項的分離的PD-1抗體或其抗原結合片段或如請求項11的改構藥物分子用於治療腫瘤或癌症的用途。
  19. 如請求項18所述之用途，其中所述腫瘤或癌症為結腸癌。
  20. 一種藥物組合物，其包含如請求項1至10中任一項的分離的PD-1抗體或其抗原結合片段或如請求項11的改構藥物分子。
  21. 一種藥物組合，其包含如請求項20的藥物組合物與一種或多種其它治療劑。
  22. 一種試劑盒，其包含如請求項1至10中任一項的分離的PD-1抗體或其抗原結合片段、如請求項11的改構藥物分子、如請求項20的藥物組合物或如請求項21的藥物組合，較佳地，還進一步包含給藥的裝置。
  23. 一種治療腫瘤或癌症的方法，其包括向有需要的受試者施用治療有效量的如請求項1至10中任一項的分離的PD-1抗體或其抗原結合片段、或如請求項11的改構藥物分子、或如請求項20的藥物組合物、或如請求項21的藥物組合、或如請求項22的試劑盒，由此治療所述腫瘤或癌症，較佳地其中所述腫瘤或癌症為結腸癌。
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