KR20210106514A - 인간화된 항-pd-1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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사이노셀테크 엘티디.
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Abstract

본 발명은 세포 예정사 수용체-1(programmed cell death receptor-1, PD-1)에 대한 재조합 인간화된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 이는 종양 또는 암 면역 치료법에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 함유하는 벡터, 약제학적 조성물 및 키트를 제공한다.

Description

인간화된 항-PD-1 항체 및 이의 용도
본 발명은 종양학(oncology) 또는 암 면역 치료법(cancer immunotherapy)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세포 예정사 수용체-1(programmed cell death receptor-1, PD-1)에 대한 재조합 인간화된 항체를 제공하며, 이는 종양 또는 암 면역 치료법에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 항체를 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 함유하는 벡터, 약제학적 조성물 및 키트를 제공한다.
PD-1은 약 50 kDa의 분자량을 갖는 288개의 아미노산으로 이루어진 유형 I 막투과 당단백질(glycoprotein)이고 CD279로도 알려진, CD28 패밀리의 구성원이다. 이는 세포 예정사의 조절제로 기능하고 주로 성숙 CD4+ 및 CD8+ T 세포 표면상에서 발현하며, 자연 살생 T 세포(natural killer T cells), B 세포, 단핵구(monocytes) 및 일부 수지상세포(dendritic cells) 상에서도 발현한다.
PD-1는 두 리간드, PD-L1 (즉, B7-H1, CD274로도 알려진) 및 PD-L2 (즉 B7-DC, CD273로도 알려진)를 가지며, 이들 모두 B7 패밀리의 막투과 단백질 분자이다. 양 및 작용의 관점에서, PD-L1 은 주요 PD-1 리간드이다. PD-L1은 수지상 세포, B 세포, 및 T 세포와 같은 조혈 세포(haematopoietic cell), 및 외피 세포(epithelial cell) 및 내피 세포(endothelial cell)와 같은 비-조혈 세포를 포함하는 다양한 세포 유형의 표면에서 널리 발현된다. 종양 세포 표면에서 PD-1의 발현은 높은 발현을 보여주며, IFN-γ 및 TNF-α과 같은 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)으로 상향-조절(up-regulated)될 수 있다. PD-L2 리간드는 PD-L1과 높은 유사성을 가지지만, 이의 분포(distribution)은 상대적으로 제한적이고, 대식세포(macrophage), 수지상 세포, 비만 세포(mast cell)와 같은 면역 세포의 표면에서 주로 발현되고, 이의 발현은 낮다. PD-L2는 PD-L1보다 약 3 배 높은 친화도(affinity)로 PD-1과 결합한다.
PD-1은 이의 리간드에 결합하여 이의 생물학적인 역할을 수행하며, T 세포 수용체-매개된 T 세포 증식, 활성화 및 사이토카인 분비를 보이고, 이로 인해 면역 반응의 초기 및 효과기(effector phase)를 억제하고, 면역 안정성을 유지시키고 자가면역 질병의 발전을 예방한다. PD-1가 이의 리간드에 결합할 때, PD-1 세포질 부위의 한 도메인(domain)인 면역 수용체 티로신-기반 스위치 모티프(immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITSM) 내에서 티로신 잔기가 인산화된 다음, 상기 인산화된 ITSM는 SHP-2 포스파타제(SHP-2 phosphatase)를 동원하여, 포스포이노시타이드 3-키타아제(phosphoinositide 3-kinase, PI3K) 및 이의 하류 단백질 키나아제 B(PKB 또는 Akt)의 활성 차단과 같은 탈인산화, 글루코스(glucose) 대사의 억제, 사이토카인 인터류킨-2(IL-2)의 생성 및 항-세포자연사 단백질 Bcl-xl의 발현을 통해 중요한 하류 경로의 억제를 야기하고; 따라서 T 세포와 B 세포의 분화와 활성화 및 면역글로빈(immunoglobin)의 분비를 억제하여, 결과적으로, 자가면역 반응이 억제된다. 종양 세포들은 림프구 표면의 PD-1 분자 내에서 높게 발현되는 PD-L1의 결합을 통한, 면역 탈출을 달성하기 위해 이러한 면역 억제 메커니즘을 이용하며, 이들은 면역 인식되는 것 및 유기체에 의해 제거되는 것을 회피한다.
PD-1 표적 단일클론 항체(Monoclonal antibody)는 현재 종양 또는 암 면역 치료법 연구에서 큰 화제이다. PD-1의 이의 리간드에 대한 결합을 차단하여, 본 단일클론 항체는 종양 부위에서 T 세포 및 IFN-γ 및 IL-2의 분비를 증가시킬 수 있고, 골수-유래 억제 세포들(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)의 비율을 감소시킬 수 있고, 종양 미세환경을 변경할 수 있고, T 세포의 면역 살생 기능을 회복 및 향상시킬 수 있고, 따라서 종양 성장을 억제할 수 있다. 최근, 미국 식품 의약국(FDA)은 Bristol-Myers Squibb의 옵디보(Opdivo)(제네릭 니볼루맙(Nivolumab)) 및 Merck & Co의 키트루다(Keytruda)(제네릭 펨브로리주맙(Pembrolizumab))을 포함하는 PD-1 항체의 시장 판매를 승인하였다. 옵디보는 흑색종(melanoma), 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 두경부 편평 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma), 전형적 호지킨 림프종(classic Hodgkin's lymphoma), 요로상피세포 암종(urothelial carcinoma), 고빈도 현미부수체 불안정성 암종(high microsatellite instability carcinoma), 진행된 신장 세포 암종(advanced renal cell carcinoma) 및 간세포성 암종(hepatocellular carcinoma) 치료를 위해 승인되었다; 키트루다는 흑색종, 비-소세포 폐암, 두경부 편평 세포 암종, 전형적 호지킨 림프종, 요로상피세포 암종, 고빈도 현미부수체 불안정성 암종 및 위암(gastric cancer)의 치료를 위해 승인되었다. 또한, 임상 연구에서 국내 및 국외 PD-1 표적 항체는 Regeneron/Sanofi의 REGN2810, Top Alliance의 JS001, Hengrui의 SHR-1210, Beigene의 BGB-A317, Cinda의 IBI308 및 Gloria/ WuXiPharmaTech의 GLS-010 , 및 전임상 연구(preclinical research)에서 많은 기타 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체 약물을 포함한다.
결론적으로, PD-1을 표적으로 하는 단일클론 항체에 대한 연구는 일부 진전을 이루었다. 하지만, 종양학 및 암 면역 치료법에서 더 나은 효율, 안정성 및 경쟁력 있는 단일클론 생물학적 제제(biologics)가 여전히 필요하다.
본 발명에서 사용되는 기술 용어들 및 이들의 대응하는 약어는 표 1에 나타난다.
[표 1]: 용어 설명
Figure pct00001
본 발명의 제1 측면은 분리된 경쇄 가변 부위 또는 이의 일부 및/또는 중쇄 가변 부위 또는 이의 일부를 포함하는 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며;
상기 경쇄 가변 부위 또는 이의 일부는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하고; 및
상기 중쇄 가변 부위 또는 이의 일부는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함한다.
특정 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하거나, 하기로 이루어지거나, 또는 하기로 필수적으로 이루어진다: 서열 번호 23의 PD-1 항체 경쇄 가변 부위 서열과 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 서열 번호 22의 PD-1 항체 중쇄 가변 부위 서열과 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
특정 양태에서, 상기 항체는 경쇄 불변 부위 및 중쇄 불변 부위를 더 포함한다; 특정 양태에서, 상기 항체는 경쇄 불변 부위 및 중쇄 불변 부위를 더 포함하며, 바람직하게는 상기 경쇄 불변 부위는 서열 번호 25의 카파 경쇄 불변 부위(kappa light chain constant region)와 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고/갖거나, 상기 중쇄 불변 부위는 서열 번호 24의 IgG4 중쇄 불변 부위와 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 양태에서, 상기 항체는 IgG 항체이다. 한 특정 양태에서, 상기 항체는 IgG4 항체이다.
한 특정 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
한 특정 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 재조합 인간 PD-1 단백질과 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 pM 또는 그 이상, 또는 전술한 값을 종점으로 하는 임의의 범위, 가령 약 20-200pM, 또는 약 60-70pM, 또는 약 60-70pM 등, 또는 그 사이의 임의의 값, 가령 약 64.8pM 또는 약 108pM 등의 KD 평균 친화도(affinity in KD average)로 결합한다. KD 결합 친화도(binding affinity KD)를 결정하기 위한 방법은 본 출원의 실시예에서 기술된 것과 같다.
한 특정 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 PD-1 단백질 분자 또는 서열 번호 1과 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질 분자에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 제2 측면은 하나 이상의 PD-1 단백질 세포외 영역 60SESFV64, 78KLAAFPEDRSQP89, 128LAPKAQI134로부터 선택된 펩티드 서열과 특이적으로 결합하는 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
특정 양태에서, 하나 이상의 PD-1 단백질 세포외 영역 E61, K78, D85, P130로부터 선택된 아미노산 잔기와 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
한 특정 양태에서, 상기 항원-결합 단편은 Fv, Fab, Fab′, Fab′-SH, F(ab′)2, Fd 단편, Fd′ 단편, 단쇄 항체 분자, 또는 단일 도메인 항체의 형태로 존재하며; 한 특정 양태에서, 상기 단쇄 항체 분자는 scFv, di-scFv, tri-scFv, 디아바디(diabody), 또는 scFab이다.
추가적인 특정 양태에서, 상기 양태들에서의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 추가의 분자와 공유결합 또는 비-공유결합 접합체(conjugate) 또는 재조합 다중-표적 약물 융합체(multi-target fusion drug)를 형성하며, 이로 인해 변형된 약물 분자를 형성하며, 상기 추가의 분자는 소분자 화합물 및/또는 생체고분자(biomacromolecule)로부터 선택된다.
본 발명의 제3 측면은 뉴클레오티드 서열이 제1 및 제2 측면의 항체 및/또는 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 발명의 제4 측면은 제3 측면의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 제5 측면은 제1 및 제2 측면의 항체 및/또는 항원-결합 단편을 발현하는 분리된 세포를 제공하고/하거나, 제3 측면 또는 제4 측면의 벡터의 핵산을 포함하는 분리된 세포를 제공한다.
한 특정 양태에서, 상기 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다.
본 발명의 제6 측면은 제1 및 제2 측면의 항체 및/또는 항원-결합 단편을 생성하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 제5 측면의 세포를 배양하는 것과 상기 항체를 정제하는 것을 포함한다.
본 발명의 제7 측면은 종양 또는 암의 치료용 약물의 제조를 위한 제1 및 제2 측면의 항체 및/또는 항원-결합 단편 및/또는 변형된 약물 분자의 용도를 제공한다
한 특정 양태에서, 상기 종양 또는 암은 결장암(colon cancer)이다.
본 발명의 제8 측면은 종양 또는 암 치료를 위한 제1 측면의 항체 및/또는 항원-결합 단편 및/또는 변형된 약물 분자의 용도를 제공한다.
한 특정 양태에서, 상기 종양 또는 암은 결장암이다.
본 발명의 제9 측면은 제1 및 제2 측면의 항체 및/또는 항원-결합 단편 및/또는 변형된 약물 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 제10측면은 제9 측면의 약제학적 조성물 및 하나 이상의 치료학적으로 유효한 화합물을 포함하는 약제학적 배합물(pharmaceutical combination)을 포함한다.
본 발명의 제11 측면은 제1 및 제2 측면의 항체 및/또는 항원-결합 단편 및/또는 변형된 약물 분자, 또는 제9 측면의 약제학적 조성물 또는 제11 측면의 약제학적 배합물을 포함하는 키트를 제공하며, 바람직하게는 투여 장치를 더 포함한다.
본 발명의 제12 측면은 종양 또는 암 치료 방법을 제공하며, 이는 제1 및 제2 측면의 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제9 측면의 약제학적 조성물, 또는 제10 측면의 약제학적 배합물, 또는 제11 측면의 키트의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 이로 인해 상기 종양 또는 암을 치료하며, 바람직하게는 상기 종양 또는 암은 결장암이다.
도 1: PD1-1 단백질에 대한 PD-L1 (A) 및 PD-L2 (B)의 결합에 대한 뮤린 항체 PD1-M944의 차단.
도 2: 재조합 인간 PD-1 단백질에 대한 인간화된 항체 PD1-H944의 결합의 ELISA 검출 (A, B, C, n=3).
도 3: 재조합 Jurkat/PD-1 세포에 대한 PD1-H944의 결합의 FACS 검출.
도 4: 재조합 인간 PD-1 단백질에 대한 PD1-H944(A1, B1, C1, n=3) 및 니볼루맙(A2, B2, C2, n=3)의 친화도에 대한 옥텟(Octet) 에세이.
도 5: 재조합 인간, 원숭이 및 마우스 PD-1 단백질에 대한 PD1-H944 (A), 니볼루맙 (B) 및 음성 대조군 (C)의 결합에 대한 ELISA.
도 6: 원숭이 PD-1 단백질 (A) 및 마우스 PD-1 단백질 (B)에 대한 다양한 농도의 PD1-H944 및 니볼루맙의 결합.
도 7: PD1-H944에 의한 재조합 인간 PD-1 단백질에 대한 인간 PD-L1 (A) 및 인간 PD-L2(B)의 결합에 대한 차단의 ELISA 검출.
도 8: PD1-H944에 의한 인간 Jurkat/PD-1 세포에 대한 인간 PD-L1의 결합에 대한 차단의 FACS 에세이.
도 9: 재조합 CD16a 단백질에 대한 PD1-H944의 결합의 ELISA.
도 10: 재조합 C1q 단백질에 대한 PD1-H944의 결합의 ELISA.
도 11: 재조합 FcRn 단백질에 대한 PD1-H944의 결합의 ELISA.
도 12: PD-1 항체에 의한 혼합 림프 에세이(12a, 12b, 12c는 3 공여자로부터의 CD4+ T 세포임)에서의 촉진된 IL-2 (상단) 및 IFN-γ (하단) 분비.
도 13: 재조합 인간 PD-1 리포터 유전자 세포 시스템에서의 PD1-H944의 활성화 기능.
도 14: 재조합 CD16a 리포터 유전자 시스템에 의해 검출된 PD1-H944의 ADCC 기능(14a 및 14b는 다른 에세이 배치에서의 결과; 14c 및 14d는 최고 항체 농도에서의 생물 발광 강도 값; **는 P<0.01을 나타냄).
도 15: CHO-PD-1 세포에 대한 PD1-H944의 CDC 효과.
도 16: 투여 이후 동물 체중 변화 경향.
도 17: 투여 이후 종양 부피 성장 경향.
도 18: 에세이 종료점에서의 종양 무게 플롯 (*P<0.05).
도 19: 투여 이후 동물 체중 경향에 대한 그래프.
도 20: 약물 투여 이후 종양 부피 성장 경향에 대한 그래프.
도 21: 에세이 종점에서의 종양 무게의 그래프.
도 22: PD1 크리스탈 구조에 도킹된(docked) PD1-H944의 상동성 모델링.
도 23: 돌연변이 부위(mutation site)를 보여주는 PD1 단백질의 모델.
도 24: PD-L1, 니볼루맙, 및 PD1-H944에 대한 PD-1 단백질 변이체의 결합.
도 25의 A-C: PD1-H944, PD-L1 및 니볼루맙이 PD-1에 대해 특이적으로 결합한 아미노산 부위.
정의
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가진다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어가 추가로 정의된다.
본 명세서에서 또는 첨부된 청구범위에서 사용되는 경우, 단수 형태 "하나(one)", "한(a/an)", "또 다른(another)", "상기(said)"는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한, 물체의 복수의 지정을 포함한다.
용어 "항체(antibody)"는 면역 글로빈 분자를 지칭하고 바람직한 생물학적 활성을 보여주는 항체의 임의의 형태를 지칭한다. 이들은 제한 없이, 단일클론 항체(전장(full-length) 단일클론 항체 포함), 다중클론 항체 및 다중 특이적 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체), 및 심지어 항체 단편을 포함한다. 일반적으로, 전장 항체 구조는 바람직하게는 4개의 폴리펩티드 사슬, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하며, 일반적으로 이황화 결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다. 각 중쇄는 중쇄 가변 부위 및 중쇄 불변 부위를 함유한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 부위 및 경쇄 불변 부위를 함유한다. 이 통상적인 전장 항체 구조뿐만 아니라, 상기 전장 항체 구조는 다른 유도체 형태 또한 포함한다.
용어 "가변 부위(variable region)"는 항원에 대한 항체의 결합과 관련된 항체의 중쇄 또는 경쇄 도메인을 가리킨다. 자연 항체(natural antibody)의 중쇄 및 경쇄의 가변 부위(VH 및 VL 각각)는 일반적으로 유사한 구조를 가지고 보다 보존된 영역(프레임워크 부위(framework region, FR)로 일컬음)에 산재된 고도의 가변 부위(상보성 결정 부위(complementary decision region, CDR)로 일컬음)로 더 세분화될 수 있다.
용어 '상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)'(예를 들어, CDR1, CDR2 및 CDR3)는 항원에 결합하기 위해 그 존재가 필수적인 항체 가변 부위의 이러한 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 부위는 일반적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 나타나는 3개의 CDR 부위를 갖는다. 각 상보성 결정 부위는 Kabat이 정의한 "상보성 결정 부위"로부터의 아미노산 잔기(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991) 및/또는 "고-가변성 루프(high-variable loop)"로부터의 아미노산 잔기(Chothia and Lesk; J MolBiol 196: 901-917 (1987))를 함유할 수 있다.
용어 "프레임워크(framework) 또는 FR" 잔기는 본 명세서에서 정의한 CDR 잔기 외의 가변 부위 내 잔기이다.
각 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위는 일반적으로 3개의 CDR 및 최대 4개의 FR을 함유하고, 상기 CDR 및 FR은 아미노 말단부터 카복실 말단까지 하기 순서, 예를 들어: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 순서로 배열된다.
제공된 항체의 상보성 결정 부위(CDR) 및 프레임 워크 부위(FR)는 Kabat 시스템을 사용하여 식별될 수 있다(Kabat et al: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, US Department of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91- 3242, 1991).
용어 "불변 부위(constant region)"는 항원에 대한 항체의 결합과 직접적으로 관련되지 않지만 항체-의존성 세포 독성과 같은 다양한 이펙터 기능(effector function)을 나타내는 항체 경쇄 및 중쇄의 이러한 아미노산 서열을 지칭한다.
이들 중쇄의 불변 부위의 아미노산 서열에 따라, 온전 항체(intact antibody)는 5 종류의 항체로 분류될 수 있다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이때 IgG 및 IgA는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2와 같은 하위 분류(이소폼(isoform))로 더 나뉠 수 있다. 이에 따라, 5종류의 항체의 중쇄는 α, δ, ε, γ 및 μ 사슬로 각각 분류된다. 항체의 경쇄들은 이들의 경쇄 불변 부위의 아미노산 서열에 따라 κ 및 λ으로 분류된다.
"항체의 항체-결합 단편(antigen-binding fragment of an antibody)"은 모항체(parent antibody)의 결합 특이성의 적어도 일부를 보유하는 온전 항체 분자의 일부를 포함하고 일반적으로 모항체의 항원-결합 부위 또는 가변 부위의 적어도 일부(예를 들어, 하나 이상의 CDR)를 포함한다. 항원 결합 단편의 예시는 제한 없이, Fv, Fab, Fab′, Fab′-SH, F(ab′)2, Fd 단편, Fd′ 단편, 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv, di-scFv 또는 tri-scFv, 디아바디 또는 scFab), 단일 도메인 항체를 포함한다.
"항체 단편(antibody fragment)"은 모항체의 생물학적 특성의 적어도 일부를 보유하는 온전하지 않은(non-intact) 항체 분자이며, 제한 없이 Fc 단편, 및 상기 기술한 "항원-결합 단편"을 포함한다.
용어 "변형된 약물 분자(modified drug molecule)"는 항체 또는 이의 단편, 가령 항원-결합 단편을 소분자 화합물 또는 생체고분자인 추가의 분자에 공유결합 또는 비-공유결합으로 연결하여 형성된 접합체 또는 재조합 다중-표적 약물 융합체를 의미한다.
용어 "키메릭(chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래하고 나머지는 다른 공급원 또는 종으로부터 유래한 항체를 나타낸다. "인간화된 항체(humanized antibody)"는 "키메릭 항체"의 하위 집합이다.
용어 "인간화된 항체" 또는 "인간화된 항원-결합 단편"은 하기와 같은 항체 또는 항체 단편으로 본 명세서에서 정의된다: (i) 인간이 아닌 공급원으로부터 유래(예를 들어, 이종 면역 체계(heterologous immune system)를 갖는 형질전환 마우스)되고 인간 생식세포계열(germline) 서열 기반인 항체 또는 항체 단편; 또는 (ii) 인간이 아닌 기원의 가변 부위 및 인간 기원의 불변 부위를 갖는 키메릭 항체; 또는 (iii) 가변 부위의 CDR은 인간이 아닌 기원이고 가변 부위의 하나 이상의 프레임워크 부위는 인간 기원이고 불변 부위가 존재한다면, 인간 기원인 CDR 이식물(transplant). "인간화(Humanization)"의 목표는 가능한 가장 높은 친화도를 유지하면서, 인체 내 인간이 아닌 기원의 면역원성(immunogenicity)을 제거하는 것이다. 인간화의 주형으로서 인간이 아닌 공급원 항체의 프레임워크 서열과 가장 유사한 인간 프레임워크 서열을 선택하는 것이 유리하다. 일부 경우에서, 친화도의 손실을 피하기 위해 인간 프레임워크 서열에서의 하나 이상의 아미노산을 인간이 아닌 작제물(construct)의 대응하는 잔기로 교체하는 것이 필요할 수 있다.
용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 유래한 항체를 나타내며, 즉 매우 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이(예를 들어, 자연 돌연변이)를 제외하고 집단 내 포함된 모든 단일 항체가 동일하다. 용어 "단일클론"은 따라서 문제의 항체 특성을 나타내며, 즉 관련 없는 항체의 혼합물이 아니다. 주로 상이한 에피토프(epitope)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제에서 각 단일클론 항체는 항원의 단일 에피토프로 향한다. 이들의 특이성에 추가로, 단일클론 항체 제제는 일반적으로 다른 항체에 의해 오염되지 않는다는 이점을 갖는다. 용어 "단일클론"은 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성이 요구되는 것으로 이해되어서는 안 된다. 용어 단일클론 항체는 특히 키메릭 항체, 인간화된 항체 및 인간화된 항체를 포함한다.
항체는 종양-관련 펩티드 항원 표적(이 경우, PD-1)과 같은 표적 항원에 "특이적으로 결합하며", 즉 상기 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 타겟팅(targeting)하여, 치료제로 사용되는 것을 가능케 하는 충분한 친화도로 상기 항원과 결합하고, 기타 단백질과 크게 교차 반응(cross-react)하지 않거나, 전술한 표적 단백질의 유사체(homologue) 및 변이체(예를 들어, 돌연변이체 형태, 스플라이스(splice) 변이체, 또는 단백질 가수분해 절단 형태) 외의 단백질과 크게 교차 반응하지 않는다.
용어 "결합 친화도(binding affinity)"는 분자의 각 결합 부위와 분자의 결합 파트너 사이의 비-공유결합 상호작용을 합한 힘을 나타낸다. 달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "결합 친화도"는 고유한(intrinsic) 결합 친화도를 나타내며, 결합 쌍(예를 들어, 항체 및 항원) 구성원 사이의 1:1 상호작용을 반영한다. "KD", "결합 속도 상수 kon(binding rate constant kon)" 및 "해리 속도 상수 koff(dissociation rate constant koff)"는 분자(예를 들어, 항체)와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 친화도를 설명하기 위해 일반적으로 사용된다. 친화도, 즉 리간드가 특정 단백질에 결합하는 단단한 정도(tight degree)이다. 결합 친화도는 수소 결합, 정전기 상호작용, 두 분자 사이의 소수성 및 반데르발스(van der Waals) 힘과 같은 비-공유결합 분자간 상호작용에 영향을 받는다. 또한 리간드와 이의 표적 분자 사이의 결합 친화도는 다른 분자의 존재에 의해 영향을 받을 수 있다. 친화도는 본 명세서에서 기술된 ELISA를 포함한 당업계에 공지된 통상적인 방법으로 분석될 수 있다.
용어 "에피토프(epitope)"는 항체 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합하는 임의의 단백질 결정 클러스터(protein determinant cluster)를 나타낸다. 에피토프 결정 클러스터는 일반적으로 분자의 화학적으로 활성 있는 표면 군(예를 들어, 아미노산, 당 측쇄, 또는 이들의 조합)으로 이루어지고 종종 특정 3차원 구조 특성 및 특정 전하 특징을 가지고 있다.
"분리된(isolated)" 항체는 항체를 자연적으로 발현하는 세포로부터 식별되었고 분리되었던 항체이다. 분리된 항체는 재조합 세포에서의 그 위치(in situ) 항체와 일반적으로 하나 이상의 정제 단계로 제조된 항체를 포함한다.
두 펩티드 또는 핵산 서열 사이의 "서열 동일성(Sequence identity)"은 상기 서열 사이의 동일한 잔기의 개수를 총 잔기 개수의 백분율(percentage)로 나타낸다. 백분율 동일성(percentage identity)을 계산할 때, 정렬된 서열은 서열 간 최대 일치(match)를 생성하기 위한 방법으로 매칭되며, 일치의 갭(gap)(존재하면)은 특정 알고리즘으로 해결된다. 두 서열 간의 동일성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 제한 없이, GAP, BLASTP, BLASTN 및 FASTA를 포함하는 GCG 프로그램 패키지를 포함한다(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410). 상기 절차는 국립 생물 정보 센터(International Center for Biotechnology Information, NCBI) 및 다른 공급원으로부터 공개적으로 제공된다. 잘 알려진 Smith Waterman 알고리즘 또한 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "Fc 수용체 " 또는 "FcR"은 항체의 Fc 부위에 결합하는 수용체를 나타낸다. 자연 서열의 인간 FcR이 바람직하고, 바람직하게는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 이소폼, 및 이들 수용체의 변이체를 포함하는 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 수용체가 바람직하다. 모든 기타 FcR들은 "FcR"이라는 용어 속에 포함된다. 상기 용어는 또한 모체 IgG를 태아로 운반하는 역할을 하는 신생아 수용체(FcRn)을 포함한다(Guyer et al, Journal of Immunology 117: 587 (1976) and Kim et al, Journal of Immunology 24: 249 (1994)).
용어 "신생아 Fc 수용체 ", 약어로 "FcRn"은 IgG 항체의 Fc 부위에 결합한다. 신생아 Fc 수용체 (FcRn)는 생체 내(in vivo) IgG 형 항체의 대사 경로(metabolic fate)에서 중요한 역할을 한다. FcRn은 리소좀 분해 경로(lysosomal degradation pathway)로부터 IgG를 보호하는 기능을 하며, 이로 인해 혈청 내 클리어런스(clearance)을 줄이고 이의 반감기(half-life)를 연장한다. 따라서, IgG의 생체 밖(in vitro) FcRn 결합 특성/특징은 순환에서 이의 생체 내 약동학적(pharmacokinetic) 특성을 시사한다.
용어 "이펙터 기능(effector function)"은 항체의 Fc 부위로부터 기인하는 이러한 생물학적 활성을 나타내며, 이는 아이소타입(isotype)마다 상이하다. 항체 이펙터 기능의 예시는 C1q 결합 및 보체-의존성 세포 독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개된 세포 독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC), 항체-의존성 세포 식균 작용(antibody-dependent cellular phagocytosis, ADCP), 사이토카인 분비, 항원-제시 세포(antigen-presenting cell)에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수, 세포 표면 수용체 하향-조절(예를 들어, B 세포 수용체) 및 B 세포 활성화를 포함한다.
용어 "이펙터 세포(effector cell)"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구를 가리킨다. 한 측면에서, 상기 이펙터 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예시는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 자연 살생(NK) 세포, 단핵구(monocytes), 세포 독성 T 세포 및 호중구(neutrophils)를 포함한다. 이펙터 세포는 자연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 분리될 수 있다. 이펙터 세포는 일반적으로 이펙터 단계(effector phase)와 관련된 림프구이고 사이토카인을 생성하는 기능을 하거나(헬퍼 T 세포). 병원에 감염된 세포를 살생하거나(세포 독성 T 세포) 또는 항체를 분비한다(분화된 B 세포).
"면역 세포"는 조혈성 기원(haematopoietic origin)을 갖고 면역 반응에서 역할을 하는 세포를 포함한다. 면역 세포는: 림프구, 가령 B 세포 및 T 세포; 자연 살생 세포; 및 골수성 세포, 가령 단핵구, 대식세포, 호산구(eosinophil), 비만 세포, 호염기구(basophil) 및 과립구(granulocyte)를 포함한다.
"세포-의존성 세포-매개된 세포 독성" 또는 "ADCC"는 분비된 Ig가 특정 세포 독성 세포(예를 들어, NK 세포, 호중구 및 대식세포)에 제시된 Fcγ에 결합하고 이러한 세포 독성 이펙터 세포가 항원을 가지고 있는 표적 세포에 특이적으로 결합한 이후에 예를 들어, 세포 독소(cytotoxin)을 사용하여 상기 표적 세포를 살생하는 것을 가능케 하는 세포 독성의 형태를 지칭한다. 표적 항체의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 번호 제5,500,362호 또는 제5,821,337호 또는 제6,737,056호(Presta)에 문서화된 생체 외 ADCC 에세이와 같은 생체 외 ADCC 에세이가 수행될 수 있으며, 상기 방법은 본 출원의 양태에 문서화되어 있다. 이러한 에세이에서 사용하기에 유용한 이펙터 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다.
"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전형적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 구성 성분(C1q)을 항체(적절한 하위 분류의)에 결합함으로써 시작되며, 이때 항체는 이의 대응하는 항원에 결합한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol Methods 202: 163 (1996)에 인용된 CDC 분석, 예를 들어 본 출원의 양태에서 문서화된 방법, 예를 들어 미국 특허 번호 제6,194,551 B1 및 WO1999/51642의 CDC 분석이 실행될 수 있으며, 이때 폴리펩티드 변이체는 Fc 부위의 변경된 아미노산 서열을 가지고(변이 Fc 부위를 가지는 폴리펩티드) 향상된 또는 감소된 C1q 결합을 갖는 폴리펩티드 변이체가 기술된다.
본 발명의 항체의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열
본 발명은 재조합 인간 PD-1 단백질을 사용하여 마우스를 면역시킨 다음, 파지 항체 라이브러리 스크리닝(phage antibody library screening)을 통해 높은 친화도로 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 M944 scFv 항체 클론을 얻었다. M944 scFv 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 마우스 IgG1 중쇄 불변 부위 및 마우스 카파 경쇄 가변 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 PCR에 의해 조립되었고, 그 결과 얻어진 조립된 서열은 발현을 위해 배양된 일시적 발현(transient expression) 벡터 HEK-293에 삽입되었다. 고순도 뮤린 항체 PD1-M944는 단백질 A 정제 컬럼을 사용하여 정제되었다. ELISA는 뮤린 항체 PD1-M944가 리간드에 대한 PD-1의 결합을 차단할 수 있음을 보여주었다.
그런 다음, 인간화된 CDR 이식을 위한 전형적인 방법을 사용하여, 뮤린 경쇄 또는 중쇄 가변 부위에 가장 가까운 인간 항체 경쇄 또는 중쇄 부위가 주형(template)으로 선택되었다. 한 양태에서, IGKV3-11*01은 경쇄 가변 부위의 인간화 주형으로 선택된 반면, IGHV3-21*02은 중쇄 가변 부위의 인간화 주형으로 선택되었다. 인간화된 경쇄 가변 부위(VL) 및 중쇄 가변 부위(VH) 서열은 뮤린 항체 경쇄/중쇄의 CDR 3개 각각을 인간 주형의 대응하는 위치에 삽입하여 얻어진다. 뮤린 프레임워크 부위의 핵심 사이트(key site)는 CDR의 활성을 지지하는데 필수적이기 때문에, 핵심 사이트는 뮤린 항체의 서열로 복귀 돌연변이(reverse mutated)되었다. 경쇄/중쇄 신호 펩티드 서열, 복귀 돌연변이된 인간화된 항체의 경쇄/중쇄 가변 부위의 서열, 및 인간 IgG4 중쇄 불변 부위/인간 카파 경쇄 부위의 서열 각각을 순차적으로 스플라이싱(splicing)하여 인간화된 항체 PD1-H944의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열이 얻어졌다.
본 발명의 핵산
본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 핵산 분자의 서열은 제한 없이, 서열 번호 3-7 및 26-33을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 본 명세서에서 개시된 서열에 제한되지 않고, 이의 변이체 또한 포함한다. 본 발명의 변이체는 혼성화(hybridization)의 물리적 특성과 관련하여 설명될 수 있다. 핵산 혼성화 기술을 사용하여, 핵산들이 이들의 상보체 및 이들의 등가물(equivalents) 또는 유사체(homologues)를 식별하는데 사용될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다. 혼성화가 100% 미만의 상보성(complementarity)으로 발생할 수 있음 또한 인식될 것이다. 하지만, 적합한 조건의 선택이라는 조건 하에서, 혼성화 기술은 특정 프로브(probe)에 대한 DNA 서열의 구조적 관련성에 기초하여 상기 DNA 서열을 식별하는데 사용될 수 있다. 이러한 조건에 대한 지침으로 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989 and Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., &Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons. region/human kappa light chain constant region 각각 참고.
재조합 벡터 및 발현
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 작제물을 제공한다. 본 발명의 재조합 작제물은 벡터로 사용될 수 있으며, 예를 들어, 상기 벡터는 플라스미드, 파지미드(phagemid), 파지 또는 바이러스 벡터이고, 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자는 상기 벡터에 삽입된다.
본 명세서에서 제공된 항체는 숙주 세포에서 경쇄 및 중쇄 또는 이들의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 재조합적으로 발현하여 제조될 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현하기 위해, 숙주 세포는 경쇄 및/또는 중쇄 또는 이의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드를 갖는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질주입(transfection)될 수 있어서, 상기 경쇄 및 중쇄는 상기 숙주 세포에 발현될 수 있다. 표준 재조합 DNA 방법은 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 제조 및/또는 수득하고, 이러한 핵산을 재조합 발현 벡터에 통합하고, 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하는데 사용된다, 예를 들어 Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) 및 Boss et al.에 의해 문서화된 미국 특허 번호 제4,816,397호 참조.
또한, 상기 중쇄 및/또는 경쇄 가변 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 전장 항체 사슬, Fab 단편 또는 Scfv를 코딩하는 서열로 전환될 수 있다: 예를 들어, 경쇄 가변 부위 또는 중쇄 가변 부위를 코딩하는 DNA 단편은 예를 들어, 항체 불변 부위 또는 가요성 링커(flexible linker)를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 사용 가능하게 연결될 수 있다(두 상기 DNA 단편으로 코딩된 아미노산 서열이 프레임 내 있도록). 인간 중쇄 및 경쇄 불변 부위의 서열은 당업계에 공지되어 있고(예를 들어, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참고), 이러한 부위를 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭을 통해 수득할 수 있다.
항체를 발현하기 위해, 표준 재조합 DNA 발현 방법이 사용될 수 있다(예를 들어, Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 참고). 예를 들어, 원하는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 발현 벡터에 삽입될 수 있으며, 이는 그 후에 숙주 세포에 형질주입된다. 적합한 숙주 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포이다. 원핵 숙주 세포의 예시는 박테리아고 진핵 숙주 세포의 예시는 효모, 곤충 또는 포유류 세포이다. 조절 서열(regulatory sequence)의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계(design)는 가령 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 및 발현이 전신성(constitutive)인지 유도성(inducible)인지와 같은 여러 요인에 의해 결정되는 것임을 이해해야 한다.
본 발명의 항체는 잘 알려진 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있으며, 상기 잘 알려진 방법은 제한 없이, 암모늄 설페에트 또는 에탄올 침전, 산 추출물, 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 단백질 G 친화성 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 셀룰로오스 포스페이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피, 및 렉틴(lectin) 크로마토그래피를 포함한다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC") 또한 정제를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, Current Protocols in Immunology, 또는 Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997- 2001), 예를 들어 챕터 1, 4, 6, 8, 9, 10 참고, 이들 각각은 전문이 본 명세서에서 참조로 포함된다.
본 발명의 항체는 자연 정제된 제품, 원핵 및 진핵 숙주 세포로부터 재조합 기술로 생성된 방법 및 제품을 포함하며, 상기 진핵 숙주 세포는 예를 들어, 효모, 고등 식물, 곤충, 및 포유류 세포를 포함한다. 본 발명의 항체는 글리코실화(glycosylated)되거나 글리코실화되지 않을 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험 매뉴얼에 문서화되어 있다, 예를 들어 상기 Sambrook, 섹션 17.37-17.42; 상기 Ausubel, 챕터 10, 12, 13, 16, 18 및 20 참조.
따라서, 본 발명의 양태는 상기 벡터 또는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포일 수 있으며, 상기 숙주 세포는 포유류 세포와 같은 고등 진핵 숙주 세포, 효모 세포와 같은 저등 진핵 숙주 세포, 및 박테리아 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다.
본 발명의 항체의 성질 및 기능
PD1-H944 항체의 성질 및 기능 분석이 실행되었다. 상기 분석은 본 발명의 항체가 하기 이점을 갖는다는 것을 보여주었다: (1) 높은 친화도 및 특이성으로 인간 PD-1에 결합할 수 있고 낮은 해리 비율을 갖는 결과, 좋은 항 종양 효율을 제공함; (2) 니볼루맙보다 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 보다 완전하게 차단할 수 있음; (3) 니볼루맙과 비교할 때, 재조합 인간 PD-1과 더 민감하고 더 특이적으로 결합하고; 니볼루맙과 비교할 때, 재조합 원숭이 PD-1과 동등하게 교차 결합하는 반면, 둘 모두 뮤린 PD-1과 결합하지 않음; (4) 리간드 Pd-L1 및 Pd-L2에 대한 재조합 인간 PD-1의 결합을 효과적으로 차단할 수 있음; (5) 면역 억제된 T 세포를 효과적으로 재활성화하고 인간 PD-1 리포터 세포 시스템을 효과적으로 활성화할 수 있음; (6) MC38 결장암(colon cancer)을 보유하는 인간화된 PD-1 마우스 모델에서 니볼루맙(Sino Biological, lnc.)보다 훨씬 우수하고 펨브로리주맙(Sino Biological, lnc.)과 동등한, 뛰어난 종양-억제 효과를 보여줌; (7) ADCC 및 CDC 활성이 모두 낮은 반면, ADCC 활성은 니볼루맙보다 낮음.
용도
본 발명의 항체는 비정상적으로 발현된 PD-1 수용체를 특이적으로 타겟팅하는, 다양한 종양 또는 암을 치료하거나, 다양한 종양 또는 암을 치료하기 위한 약물을 제조하는데 사용될 수 있다. 상기 종양 또는 암의 비제한적인 예시는 결장암을 포함한다.
약제학적 조성물
본 발명의 항체는 본 발명의 항체 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제(diluents) 또는 부형제(excipients)를 포함하는 약제학적 조성물을 형성하기 위해 하나 이상의 기타 제제(예를 들어, 안정화 화합물(stabilizing compound))로 제조될 수 있다.
키트
본 발명은 또한 하나 이상의 용기(container)를 포함하는 약제학적 패키지 및 키트에 관한 것이며, 상기 용기는 전술한 본 발명의 약제학적 조성물을 함유한다. 이러한 용기와 관련하여 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 유통을 관장하는 정부 기관에서 규정한 형태의 규격이 있을 수 있으며, 이는 상기 제품이 제조, 사용 또는 유통되는 기관에 의한 인체 투여 승인을 반영한다.
제조 및 보관
본 발명의 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 방식, 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화(granulation), 향정(pastille; 香錠) 제조, 분쇄, 에멀션화(emulsification), 캡슐화(encapsulation), 포매(embedding; 包埋) 또는 동결건조(lyophilization) 방법에 의해 제조될 수 있다.
허용 가능한 담체로 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 미리 제조한 뒤, 적절한 용기에 옮겨질 수 있고 표시된 상태의 치료를 위해 라벨링될 수 있다. 이러한 라벨링에는 약물의 투여 용량, 투여 빈도, 및 투여 경로가 포함된다.
병용(combination)
상기 기술한 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 항신생물제(antineoplastic agent)와 같은 하나 이상의 다른 치료제와 병용되며, 그 결과 얻어진 병용물은 허용되지 않는 역효과를 유발하지 않는다.
하기 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위해 사용되는 것이지 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.
실시예
실시예 1: 파지 항체 디스플레이 라이브러리를 사용하여 PD-L1/PD-L2에 대한 PD-1의 결합을 차단하는 뮤린-유래 항체의 스크리닝
1.1 마우스의 면역 접종(Immunisation)
재조합 인간 PD-1 단백질(Sino Biological, Inc, Cat. 10377-H08H)을 마우스를 면역 접종하기 위해 사용하였다. 본 PD-1 단백질(UniProtKB Q15116)의 세포외 영역의 아미노산 서열은 Met1-Gln167 (서열 번호 1)이다.
재조합 인간 PD-1 단백질을 Freund 보조제(Freund's adjuvant)와 혼합하였고 2주, 3주, 2주 및 3주 간격으로 피하 투여한 혼합물을 각각 20 μg의 용량으로 5회 마우스를 면역 접종하기 위해 사용하였다. 제2 면역 접종 이후부터, 각 면역 접종 이후 7일에 눈의 내안각 혈관총(medial canthal plexus)을 통해 혈액을 수집하였다. 코팅된 재조합 인간 PD-1 단백질을 사용하여 ELISA로 마우스 항-PD-1 혈청가(serum titer)를 측정하였다. 5차 면역 접종 이후 혈청가는 8000배 희석에 도달했고, 5차 면역 접종 후 9주에 25 μg 재조합 인간 PD-1 단백질을 정맥 내 투여하자 마우스는 부스팅(boosted)되었다. 4일 후에, 마우스를 희생시킨 다음, 비장 조직을 액체 질소로 동결시켰다.
1.2 파지 - 디스플레이 라이브러리 스크리닝
TriPure Isolation Reagent (Roche)를 사용하여 마우스 비장 조직으로부터 RNA를 추출하였고, 역전사 키트 (Invitrogen)를 사용하여 역전사를 통해 cDNA를 수득했다. 중첩 연장 PCR(overlap extension PCR) 방법을 통해 뮤린 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 부위를 코딩하는 각 뉴클레오티드 서열은 증폭되었고 이들의 scFv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 조립되었으며, 이때 경쇄 및 중쇄 가변 부위를 코딩하는 각 뉴클레오티드 서열은 링커, TCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTGGTGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC(서열 번호 2) (참고: Rapid PCR-cloning of full-length mouse immunoglobulin variable regions; Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction T Joneset.al Bio/Technolgy 9(6):579,July 1991)를 통해 연결되었고, 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease) Sfi I(Fermentas)에 의해 파지 벡터 pComb3x(Sino Biological, inc.)에 효소적으로 연결된 다음, 면역화된 마우스를 위한 파지 디스플레이 scFv 항체 라이브러리를 구축하기 위해 컴피턴트 X-Blue(competent X-Blue)를 전기충격 형질전환(electrotransformed)하였다. 재조합 인간 PD-1 단백질을 ELISA 플레이트에 코팅하여, 파지 항체 패닝(phage antibody panning) 공정에 따라 항-PD-1 양성 항체-풍부 파지 라이브러리(positive antibody-enriched phage libraries)를 수득했다(참고: Antibody Phage Display: Methods and Protocols, Philippa M. O'Brien and Robert Aitken (Eds), Humana Press, ISBN: 9780896037113). 상기 항-PD-1 양성 항체-풍부 라이브러리로부터 단일클론 파지들을 선택하였고, 발현시킨 다음, ELISA로 이들의 재조합 인간 PD-1 단백질에 대한 결합을 테스트(tested)하였다. 재조합 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 고도로 결합성이 높은 항체 M944 scFV의 클론을 선택하였고 M944 scFv 항체(서열 번호 3)의 뉴클레오티드 서열을 시퀀싱 하기 위해 시퀀싱 회사에 의뢰하였다.
1.3 뮤린 항체 PD1-M944의 생성
M944 scFv 항체 (서열 번호 4/5)의 중쇄 및 경쇄 가변 부위의 뉴클레오티드 서열은 마우스 IgG1 중쇄 불변 부위 (서열 번호 6) 및 마우스 카파 경쇄 불변 부위 (서열 번호 7) 각각의 뉴클레오티드 서열과 함께 PCR에 의해 조립되었다. 그 결과 얻어진 뉴클레오티드 서열을 이후 Hind III 및 Xba I (Fermentas)으로 효소적으로 절단하였고 일시적 발현 벡터 pSTEP2(Sino Biological, Inc)에 삽입하였고, 플라스미드를 추출하여 HEK-293 세포에 7일 동안 형질주입하였다. 고 순도 항체를 위해 배양 상층액(culture supernatant)을 단백질 A 칼럼으로 정제하였다.
1.4 뮤린 항체 PD1-M944 기능 에세이
(1) PD-L1에 대한 재조합 인간 PD-1의 결합 차단: 1 μg/mL 농도의 재조합 인간 PD-1 단백질이 96-웰 플레이트에 웰 당 100 μL로 4℃에서 밤새 코팅되었다. 다음날 플레이트를 세척하였고 실온에서 1시간 동안 차단(blocked)시켰다. 100 μL의 10 μg/mL 비오틴화된 단백질 PD-L1-Fc-비오틴(SinoBiological, Inc.)을 다양한 농도(0.4 μg/mL, 2 μg/mL 및 10 μg/mL)의 PD1-M944 또는 니볼루맙(Sino Biological, Inc)과 함께 인큐베이팅(co-incubated)하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 플레이트를 세척하였다. 플레이트를 항생제 스트렙트아비딘/HRP(streptavidin/HRP) (Beijing Zhong Shan -Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd)과 함께 인큐베이팅한 다음, 반복적으로 세척하였고, 발색(color development)을 위해 기질 색소 생성 용액(substrate chromogenic solution)을 첨가하였다. 종결 후 OD450가 검출되었다. 본 결과는 재조합 PD-L1 단백질이 코팅된 PD-1 단백질에 효과적으로 결합할 수 있고, 다양한 농도(도 1의 A)의 PD-1M944 또는 니볼루맙의 첨가에 의해 PD-1에 대한 재조합 PD-L1 단백질의 결합이 효과적으로 억제되었음을 보여주었다. 본 결과는 뮤린 항체 PD1-M944가 리간드 PD-L1에 대한 PD-1의 결합을 차단하는 양호한 기능을 갖는 것을 나타낸다.
(2) PD-L2에 대한 재조합 인간 PD-1의 결합 차단: 1 μg/mL 농도의 재조합 인간 PD-1 단백질이 96-웰 플레이트에 웰 당 100 μL로 4℃에서 밤새 코팅되었고, 다음날 플레이트를 세척하고 실온에서 1시간동안 차단시켰다. 100 μL의 0.5 μg/mL 비오틴화된 단백질 PD-L2-Fc-비오틴(Sino Biological, Inc.)을 다양한 농도(0.5 μg/mL, 2.5 μg/mL 및 12.5 μg/mL)의 PD1-M944 또는 니볼루맙(Sino Biological, Inc.)과 함께 인큐베이팅하였다. 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 플레이트를 세척하였고, 항생제 스트렙트아비딘/HRP(Beijing Zhong Shan -Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd)과 함께 인큐베이팅 한 다음, 반복적으로 세척하였고, 발색을 위해 기질 색소 생성 용액을 첨가하였고, 종결 후 OD450가 검출되었다. 본 결과는 재조합 PD-L2 단백질이 코팅된 PD-1 단백질에 효과적으로 결합할 수 있고, PD-1에 대한 재조합 PD-L2 단백질의 결합은 다양한 농도(도 1의 B)의 PD1-M944 또는 니볼루맙의 첨가에 의해 효과적으로 억제되었음을 보여주었다. 본 결과는 뮤린 항체 PD1-M944가 리간드 PD-L2에 대한 PD-1의 결합을 차단하는 양호한 기능을 갖는 것을 나타낸다.
실시예 2: 인간화된 항체 PD1-H944의 서열을 생성하기 위한 뮤린 항체 PD1-M944 서열의 인간화
2.1 뮤린 항체 PD1-M944의 경쇄 및 중쇄 각각에 대한 3개의 CDR 결정
M944 scFv 항체의 뉴클레오티드 서열은 실시예 1.2에서 결정되었으며, 이로부터 PD1-M944 scFv 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이 추론되었다, 서열 번호 8/9 참고.
뮤린 항체 PD1-M944의 경쇄 및 중쇄 각각에 대한 3개의 CDR의 아미노산 서열은 카밧 넘버링 방식(Kabat numbering scheme)을 참조하여 결정되었다, 표 1 참고. 전술한 경쇄 및 중쇄 각각에 대한 3개의 CDR은 전위(transposed)된 다음, 후속 단계에서 최종 인간화된 항체 PD1-H944에 보존되었다, 실시예 2.2 및 2.3 참고
[표 1]: PD1-M944/PD1-H944 경쇄 및 중쇄 CDR 서열
Figure pct00002
2.2 뮤린 항체 PD1-M44의 인간화된 CDR 이식
CDR 이식의 전형적인 인간화 방법을 사용하여 뮤린 항체의 인간화를 실행하였다. 마우스 경쇄 또는 중쇄 가변 부위와 가장 밀접한 인간 항체 경쇄 또는 중쇄 가변 부위를 주형으로 선택하였고, 인간화된 경쇄 가변 부위(VL) 및 중쇄 가변 부위(VH) 서열을 수득하기 위해 각 마우스 경쇄 또는 중쇄로부터의 3개의 CDR(표 1)을 인간 항체의 가변 부위에 삽입하였다. PD1-M944의 경쇄 가변 부위의 인간 주형은 IGKV3-11*01이며, 이는 PD1-M944의 경쇄와 73.48%의 상동성을 갖고, 중쇄 가변 부위의 인간 주형은 IGHV3-21*02이며, 이는 PD1-M944의 중쇄와 81.94%의 상동성을 갖는다.
2.3 인간화된 가변 부위 서열의 프레임워크 부위 복귀 돌연변이(reverse- mutation)
뮤린 유래 프레임워크 부위의 핵심 사이트는 CDR 활성을 지지하는데 필수적이므로, 대응하는 사이트는 뮤린 항체의 서열에서 나타낸 사이트로 복귀 돌연변이되었으며, 이때 경쇄 내 위치 89는 M으로, 위치 91은 F로, 중쇄 내 위치 44은 R로, 위치 78은 N으로 복귀 돌연변이되었다.
CDR 인간화된 이식과 프레임워크 부위 복귀 돌연변이에 의해 인간화된 항체 PD1-H944를 수득했고, 이의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 서열 번호 16/17에 각각 제시되고; 신호 펩티드를 함유하는 형태의 이의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 서열 번호 18/19에 각각 제시되며, 이는 순차적으로 연결된 중쇄/경쇄 신호 펩티드의 아미노산 서열 (서열 번호 20/21); 인간화된 항체의 중쇄/경쇄 가변 부위의 아미노산 서열 (서열 번호 22/23); 및 각각 인간 IgG4 중쇄 불변 부위/인간 카파 경쇄 불변 부위 (서열 번호 24/25)인 인간화된 항체의 불변 부위의 아미노산 서열을 포함한다.
[표 2]: 뮤린 유래 및 인간화된 항체의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
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실시예 3: 인간화된 항체 PD1-H944의 생성
PCR 증폭 이후, 순차적으로 연결된 중쇄/경쇄 신호 펩티드(서열 번호28/29), 인간화된 항체의 중쇄/경쇄 가변 부위(서열 번호 30/31) 및 인간 IgG4 중쇄 불변 부위/인간 카파 경쇄 불변 부위(서열 번호 32/33) 각각을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는, 신호 펩티드 함유 PD1-H944 항체(서열 번호 26/27)를 코딩하는 각각의 상기 중쇄/경쇄 뉴클레오티드 서열은 제한 엔도뉴클레아제 Hind III 및 Xba I (Fermentas)로 이중 분해된 다음 상업용 벡터(commercial vector) pcDNA3(Invitrogen)에 삽입되었다. 플라스미드 추출 이후, pCDNA3 경쇄 벡터를 NruI+NaeI+Dra I로 삼중 분해하여 1.8 kb 단편을 수득한 다음, CHO/dhfr 시스템 발현 벡터 pSSE(Sino Biological, Inc)에 삽입하였고, 그 다음으로 pCDNA3 중쇄 벡터를 NruI+NaeI+Dra I(Fermentas)로 삼중 분해하여 2.5 kb 단편을 수득하였다. 또한 그 다음으로, 완전한 벡터를 수득하기 위해 이전 단계에서 구축된 pSSE (Sino Biological, Inc) 경쇄 벡터에 삽입하였다. 상기 발현 벡터는 DNA 증폭 인자 dhfr 유전자, NeoR 내성 유전자 및 항체 경쇄 및 중쇄 발현 인자를 함유하는 진핵세포 발현 벡터이다. 상기 발현 벡터를 dhfr-DG44 세포에 형질주입하였고, G418 스크리닝으로 PD1-H944 양성 세포 라인을 수득하였고, MTX 단계별 압력 스크리닝(MTX stepwise pressure screening)으로 PD1-H944 고 발현 세포 라인을 수득한 다음, 클론 스크리닝(clonal screening)을 위해 무 혈청(serum-free) 배양물에 도메스티케이팅(domesticated)하였다. 각 단계에서, 세포 성장 상태 및 항체 약물의 주요 품질 속성과 함께, ELISA 에세이 결과를 바탕으로 높은 항체 발현을 갖는 클론을 선발하였다.
고순도 및 고품질 PD1-H944 항체를 수득하기 위해 상기 PD1-H944 생성 CHO 세포 라인을 무 혈청 보충 현탁 배양물(serum-free supplement suspension culture)에서 배양하였다.
실시예 4: 인간화된 항체 PD1-H944의 특성화
4.1 인간, 마우스 및 원숭이 PD-1 항원에 대한 PD1-H944의 결합 친화도 에세이
(1) 재조합 인간 PD-1 단백질에 대한 PD1-H944의 결합 능력
재조합 인간 PD-1 단백질에 대한 PD1-H944의 특이적 결합을 검출하기 위해 간접 ELISA(indirect ELISA)를 사용하였다. 다양한 농도 (0.16 ng/mL, 0.49 ng/mL, 1.48 ng/mL, 4.44 ng/mL, 13.33 ng/mL, 40 ng/mL, 120 ng/mL, 360 ng/mL, 1080 ng/mL, 3240 ng/mL 및 9720 ng/mL)의 재조합 인간 PD-1 단백질이 96-웰 플레이트에 4℃에서 밤새 코팅되었다. 다음날에, 플레이트를 세척하고 실온에서 1시간동안 차단시켰다. 100 μL의 2 μg/mL PD1-H944, 니볼루맙(Bristol-Myers Squibb), 및 음성 대조군 항체 H7N9-R1-IgG4 (Sino Biological, Inc.) 각각을 인큐베이팅한 후, 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 플레이트를 세척한 다음, 염소 항-인간 IgG F(ab)2/HRP(anti-human IgG F(ab)2/HRP) (JACKSON)과 함께 인큐베이팅하고 반복적으로 세척하였고, 발색 및 OD450 검출을 위해 기질 색소 생성 용액을 첨가하였다. 재조합 인간 PD-1 단백질에 결합하는 PD-1-H944 및 니볼루맙의 EC50은 각각 31.5ng/mL, R2=0.998 및 179.0ng/mL, R2=0.997이었다. 이는 PD1-H944이 재조합 인간 PD-1 단백질에 니볼루맙보다 유의하게 더 잘 결합한다는 것을 나타낸다 (도 2의 A-C).
(2) 재조합 Jurka/PD-1 세포에 대한 PD1-H944의 결합 능력
재조합 인간 PD-1 안정 발현 세포 라인 Jurkat/PD-1 (SinoCellTech Ltd)을 실험 재료로 사용하여 재조합 Jurkat/PD-1 세포에 대한 PD1-H944의 결합 능력을 유세포 분석(flow cytometry)으로 측정하였다. 다양한 농도(0.195 μg/mL, 0.391 μg/mL, 0.781 μg/mL, 1.562 μg/mL, 3.125 μg/mL, 6.25 μg/mL, 12.5 μg/mL, 25 μg/mL ,50 μg/mL, 100 μg/mL 및 200 μg/mL)의 PD1-H944, 니볼루맙 및 음성 대조군 항체 H7N9-R1-IgG4를 대수 성장 단계(logarithmic growth phase)의 5Х105/튜브 재조합 Jurkat/PD-1 세포에 첨가하였고, 혼합하였고 4℃에서 인큐베이팅한 다음 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 원심분리하였다. 염소 항-인간 IgG Fc-FITC (Sino Biological, Inc.)를 첨가함으로써 상기 재조합 Jurkat/PD-1 세포에 대한 항체의 결합을 검출하였다. 본 결과는 Jurkat/PD-1 세포에 대해 PD1-H944가 9.63 μg/mL, R2=1.000의 EC50으로 특이적으로 결합하고, Jurkat/PD-1 세포에 대해 니볼루맙이 10.18 μg/mL, R2= 0.994의 EC50으로 특이적으로 결합하고, Jurkat/PD-1 세포에 대해 음성 대조군 항체 H7N9-R1- IgG4는 결합하지 않았음을 보여주었다(도 3). 이는 PD1-H944가 Jurkat/PD-1 세포에 의해 발현되는 PD-1에 결합하는 양호한 능력을 가지고 있고 이 결합능력은 니볼루맙보다 약간 더 우수함을 나타낸다.
(3) 재조합 인간 PD-1 단백질에 대한 PD1-H944의 결합 친화도
H7N9-R1-IgG4 (13.30nM)을 음성 대조군 항체로 하여, 옥텟 생체분자 상호작용 에세이 시스템(Octet Biomolecular Interaction Assay System)을 사용하여 PD-1에 대한 PD1-H944 (0.90nM, 1.79nM, 3.66nM, 7.24nM), 니볼루맙 (0.51nM, 1.02nM, 2.05nM, 4.10nM)의 친화도를 결정하였다. 본 결과는 재조합 인간 PD-1 단백질에 대한 PD1-H944의 평균 KD 결합 친화도가 64.8 pM, 평균 결합 속도 상수 kon가 3.01E+05 M-1s-1, 평균 해리 속도 상수 koff가 1.95E-05 s-1이었고; PD-1 단백질에 대한 니볼루맙의 평균 KD 결합 친화도가 74.1pM, 평균 결합 속도 상수 kon가 6.92E+05 M-1s-1, 평균 해리 상수 koff가 5.12E-05 s-1이었음을 보여주었다(도 4). PD1-H944는 니볼루맙보다 약 1.14배 더 강한 친화도를 가지고, PD1-H944는 더 낮은 해리 속도를 가지므로, PD1-H944는 니볼루맙보다 PD-1 단백질에 결합하는 더 강한 능력을 가진다.
(4) 재조합 원숭이 및 마우스 PD-1 단백질에 대한 PD1-H944의 결합 능력
재조합 원숭이 및 마우스 PD-1 단백질에 대한 PD1-H944의 특이적 결합을 검출하기 위해 간접 ELISA를 사용하였다. 다양한 농도(0.16 ng/mL, 0.49 ng/mL, 1.48 ng/mL, 4.44 ng/mL, 13.33 ng/mL, 40 ng/mL, 120 ng/mL, 360 ng/mL, 1080 ng/mL, 3240 ng/mL 및 9720 ng/mL)의 재조합 인간, 원숭이 및 마우스 PD-1 단백질(Sino Biological, Inc.)이 96-웰 플레이트에 웰 당 100 μL 로 4℃에서 밤새 코팅되었고 다음날 세척한 다음 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 100 μL의 PD1-H944, 니볼루맙 및 음성 대조군 항체 H7N9-R1-IgG4(모두 2 μg/mL인)을 인큐베이팅한 후, 플레이트를 세척하였고, 발색을 위해 2차 항체, 염소 항-인간 IgG F(ab)2/HRP을 첨가하였고, OD450 가 검출되었다. 에세이는 3중선(triplet)을 보였다. 본 결과는 재조합 인간 PD-1 단백질 및 재조합 원숭이 PD-1 단백질에 대해 PD1-H944가 각각 25.8 ng/mL (R2=0.999) 및 32.7 ng/mL (R2=0.997)의 항원성 EC50으로 결합할 수 있었던 반면, 재조합 마우스 PD-1 단백질에 대해서는 결합하지 않았고(도 5의 A); 재조합 인간 PD-1 단백질 및 재조합 원숭이 PD-1 단백질에 대해 니볼루맙은 각각 113.2 ng/mL (R2=0.997) 및 80.2 ng/mL (R2=0.997)의 EC50으로 결합할 수 있었고, 마우스 PD-1 단백질에 결합하지 않았고(도 5의 B); 재조합 인간 PD-1 단백질, 재조합 원숭이 PD-1 단백질 또는 재조합 마우스 PD-1 단백질에 대해 음성 대조군 항체는 결합하지 않았음(도 5의 C)를 보여주었다. 원숭이 PD-1에 대한 PD1-H944의 양호한 결합은 이 약물의 안전 평가를 위한 원숭이의 사용을 지지한다.
(5) 재조합 원숭이 및 마우스 PD-1 단백질에 대한 PD1-H944의 결합 친화도
옥텟을 사용하여 비오틴화된 원숭이 및 마우스 PD-1 단백질(Sino Biological, Inc.)에 대한 다양한 농도 구배(도 6의 A-B 참고)의 PD1-H944 및 니볼루맙의 친화도를 측정하였고 KD 값을 얻기 위해 분석하였다. 본 결과는 재조합 원숭이 PD-1 단백질에 대한 PD1-H944의 KD 친화도 값이 108 pM이었고 재조합 원숭이 PD-1 단백질에 대한 니볼루맙의 KD 친화도 값이 131 pM이었음 보여주었으며, 이는 비등하였다(도 6의 A). 재조합 원숭이 PD-1 단백질에 대해 PD1-H944 및 니볼루맙 모두 결합하지 않았다(도 6의 B).
4.2 PD1-H944가 인간 PD-1 단백질에 대한 인간 PD-1 리간드(PD-L1 및 PD-L2)의 결합을 차단함
재조합 인간 PD-1 단백질이 96-웰 플레이트에 웰 당 100 μL 로 4℃에서 밤새 코팅되었다. 다음날에 플레이트를 세척하였고 1 μg/mL의 인간 PD-L1-비오틴(Sino Biological, Inc.) 또는 2 μg/mL의 인간 PD-L2-비오틴(Sino Biological, Inc.)을 첨가하기 전에 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 그 다음으로, 다양한 농도(0.003 μg/mL, 0.008 μg/mL, 0.025 μg/mL, 0.074 μg/mL, 0.222 μg/mL, 0.667 μg/mL, 2 μg/mL, 6 μg/mL, 18 μg/mL)의 PD1-H944, 니볼루맙 또는 음성 대조군 항체 H7N9-R1-IgG4를 첨가, 인큐베이팅하였고, 항생제 스트렙트아비딘/HRP를 첨가, 인큐베이팅한 다음, OD450가 검출되었다. 각 그룹마다, 테스트는 이중선으로 실행되었다. 본 결과는 코팅된 인간 PD-1 단백질에 대해 비오틴화된 재조합 인간 PD-L1 및 PD-L2 단백질이 효과적으로 결합할 수 있었고, 다양한 농도의 PD1-H944 및 니볼루맙 모두 인간 PD-1에 대한 재조합 인간 PD-L1 단백질(도 7의 A) 및 재조합 인간 PD-L2 단백질(도 7의 B)의 결합을 효과적으로 억제하였음을 보여주었다. PD1-H944 및 니볼루맙은 각각 0.116 μg/mL (R2=0.995) 및 0.129 μg/mL (R2=0.997)의 IC50으로 재조합 인간 PD-L1을 억제하였고, 각각 0.446 μg/mL (R2=0.994) 및 0.486 μg/mL (R2=0.996)의 IC50으로 재조합 인간 PD-L2를 억제하였다. 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2에 대한 인간 PD-1의 결합을 억제하는 PD1-H944의 능력은 니볼루맙과 유의하게 다르지 않았고, 음성 대조군 항체에 대해 유의한 억제가 관찰되지 않았다.
4.3 PD1-H944가 인간 PD-1 발현 세포에 대한 인간 PD-1 리간드(PD-L1)의 결합을 차단함
대수 성장 단계의 Jurkat/PD-1 세포를 안정적으로 발현하는 재조합 인간 PD-1의 5 Х 105 세포/튜브에 다양한 농도(0.260 μg/mL, 0.390 μg/mL, 0.585 μg/mL, 0.878 μg/mL, 1.317 μg/mL, 1.975 μg/mL, 2.963 μg/mL, 4.444 μg/mL, 6.667 μg/mL 또는 10.000 μg/mL)의 PD1-H944, 니볼루맙 및 음성 대조군 항체 H7N9-R1-IgG4를 첨가하였고 4℃에서 인큐베이팅하였다. 10 μL의 0.4 μg/mL B7H1-Fc-비오틴((Sino Biological, Inc.)을 첨가하였고, PBS로 세척한 다음, 원심분리로 결합하지 않은 항체를 제거하였다. 스트렙트아비딘 Alexa Fluor® 488 접합체 (Life Technologies)를 첨가하였고 20분 동안 4℃에서 인큐베이팅하였고, 반복적으로 세척하였고 원심분리하였고, 유세포 분석 검출을 위해 200 μL의 PBS를 세포를 재현탁시키기 위해 첨가하였다. 본 결과는 Jurkat/PD-1 세포에 대해 재조합 인간 PD-L1 단백질이 효과적으로 결합할 수 있었고, Jurkat/PD-1 세포에 대한 재조합 인간 PD-L1 단백질의 결합이 다양한 농도의 PD1-H944 및 니볼루맙을 첨가하였을 때 효과적으로 억제되었음을 보여주었다(도 8). 억제 농도 IC50은 각각 1.78 μg/mL (R2=0.994) 및 2.48 μg/mL (R2=0.989)이었다. PD1-H944는 인간 PD-1의 결합을 억제하였고 인간 PD-L1은 니볼루맙보다 약간 더 우수했고, 음성 대조군 항체에 대해서는 유의한 억제가 관찰되지 않았다.
4.4 CD16a에 대한 PD1-H944의 결합
친화성 수용체(affinity receptor) CD16a (FcγRIIIa) 단백질은 ADCC의 효과를 매개하는 주요 Fc 수용체이며, 이때 V158 SNP 부위를 함유하는 CD16a가 상대적으로 높은 친화도를 갖는다. 재조합 CD16a (V158) 단백질에 대한 PD1-H944의 결합을 ELISA로 측정하여 항체 의존성 세포-매개된 독성(ADCC) 효과와 관련된 PD1-H944의 잠재성을 평가하였다.
본 에세이에 사용된 양성 대조군 PD1-H944-1-IgG1 (o)은 자연 IgG1에 연결된 PD1-H944의 가변 부위이고, 음성 대조군 PD1-H944-1-IgG1은 N-글리코시드(N-glycoside) 결실 때문에 Fc 단편이 CD16a에 결합하는 능력이 사라진, N297A 돌연변이체 IgG1에 연결된 PD1-H944의 가변부위이다. 재조합 인간 PD-1 단백질 (10 μg/mL, 100 μL/웰)이 96-웰 플레이트에 4℃에서 밤새 코팅되었고, 다음날 세척하였고 1시간 동안 실온에서 차단시켰다. 다양한 농도(0.020 μg/mL, 0.078 μg/mL, 0.3125 μg/mL, 1.25 μg/mL, 5 μg/mL, 20 μg/mL 및 80 μg/mL)의 PD1-H944, 니볼루맙, 양성 대조군 항체 PD1-H944-1-IgG1(o)(Sino Biological, Inc.) 및 음성 대조군 항체 PD1-H944-1-IgG1 (Sino Biological, Inc.)를 첨가하였고 (도 9 참고), 인큐베이션 이후 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 플레이트를 세척하였다. 1 μg/mL의 스트렙트아비딘/HRP의 인큐베이션 후에 10 μg/mL의 재조합 CD16a-AVI-His (V158)+BirA 단백질 (Sino Biological, Inc.)을 웰에 첨가하였고, 인큐베이션 이후 발색에 의해 OD450가 검출되었다.
본 결과는 항체 농도에 따라 재조합 CD16a 단백질에 대한 양성 대조군 항체의 결합이 증가하였음을 보여주었다. 어떠한 테스트된 농도에서도 PD1-H944, 니볼루맙 및 음성 대조군 항체는 재조합 CD16a 단백질에 대해 결합하지 않았다(도 9). 이는 IgG4 아형(subtype) 항체로 구축된 PD1-H944 및 니볼루맙 모두 CD16a에 결합하는 능력이 매우 낮음을 시사하며, PD1-H944는 ADCC 효과가 없거나 매우 낮은 것으로 예측한다.
4.5 C1q에 대한 PD1-H944의 결합
재조합 C1q 단백질에 대한 PD1-H499의 결합을 ELISA로 측정하였으며, 이를 통해 보체-의존성 세포 독성(CDC) 효과에 대한 PD1-H944의 잠재성을 평가하였다.
자연 IgG1에 PD1-H944의 가변 부위를 연결시켜 수득한 PD1-H944-1-IgG1(o)을 양성 대조군 항체(Sino Biological, Inc.)로 사용하였고 H7N9-R1-IgG4(Sino Biological, Inc.)을 아형 대조군 항체로 사용하였다. 다양한 농도 (20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 2.5 μg/mL, 1.25 μg/mL, 0.625 μg/mL, 0.313 μg/mL, 0.156 μg/mL 및 0.078 μg/mL) (도 10 참고)의 PD1-H944, 니볼루맙, 양성 대조군 항체 및 아형 대조군 항체가 96-웰 플레이트에 웰 당 100 μL로 4℃에서 밤새 코팅되었다. 다음날에, 플레이트를 세척하였고, 1시간동안 실온에서 차단시킨 다음, 100 μL의 5 μg/mL 재조합 C1q 단백질 (Quidel Corporation)을 각각에 첨가하였고 플레이트들을 3시간 동안 인큐베이팅하였다. 1:400 배 희석한 100 μL의 2차 항체 항-C1q/HRP (Abcam)를 첨가하였고, 1시간 동안 인큐베이팅한 다음, 발색되었고 0D450가 검출되었다.
본 결과는 항체 농도에 따라 재조합 C1q 단백질에 대한 양성 대조군 항체의 결합이 증가하였음을 보여주었다. PD1-H944, 니볼루맙 및 아형 대조군 항체는 재조합 C1q 단백질과 비등한 결합 능력을 가지고 있었고, IgG1-유형 양성 대조군보다 유의하게 낮은 결합 능력을 가지고 있었다(도 10).
4.6 FcRn에 대한 PD1-H944의 결합
재조합 인간 Fc 수용체 (FcRn) 단백질에 대한 PD1-H944의 결합을 ELISA로 측정하였고 그리하여 인간에서 PD1-H944의 약동학을 측정하였다.
10 μg/mL 농도의 항-바이오틴 단백질 아비딘(Thermo Fisher Scientific)이 96-웰 플레이트에 웰 당 100 μL로 코팅되었고 4℃에서 밤새 인큐베이팅된 다음, 다음날에 세척하였고, 1시간 동안 실온에서 차단시키고, 10 μg/mL의 비오틴화된 FCGRT-His+B2M 단백질(Sino Biological, Inc.)과 함께 1시간 동안 인큐베이팅한 다음, 다양한 농도(0.123 μg/mL, 0.37 μg/mL, 1.11 μg/mL, 3.33 μg/mL, 10 μg/mL, 30 μg/mL, 90 μg/mL, 270 μg/mL)의 PD1-H944, 니볼루맙 또는 아형 대조군 항체 H7N9-R1-IgG4(Sino Biological, Inc.)를 각각에 첨가하였고(도 11 참고), 1시간 동안 인큐베이팅하였고, 세척하였고 250 ng/mL의 염소 항-인간 IgG Fc/HRP (Sino Biological Inc.)를 첨가하였다. 항체 희석부터 2차 항체 인큐베이션까지의 과정을 pH 6.0으로 유지시켰고, OD450가 검출되었다.
본 결과는 재조합 인간 FcRn 단백질에 대해 PD1-H499 및 니볼루맙이 결합할 수 있고, 농도에 따라 결합 능력이 증가하였음을 보여주었다; 높은 농도에서 (270 μg/mL), 재조합 인간 FcRn 단백질에 대한 PD1-H944의 결합은 니볼루맙의 결합의 대략 1.62배였다(도 11). 이러한 결과를 바탕으로, PD1-H944가 인간에서 양호한 약동학을 가진다는 가설을 세웠다.
실시예 5: 인간화된 항체 PD1-H944의 기능 분석
5.1 PD1-H944에 의해 자극된 혼합된 림프구 반응에서의 CD4+ T 세포의 활성화
DC들과 CD4+ T 림프구의 혼합 에세이(mixing assay)로 항-인간 PD-1 항체의 중화 활성(neutralizing activity)을 검출하였다. Ficoll 농도 구배 원심분리로 인간 말초 혈액 단핵 세포들(PBMCs)을 분리한 다음, 부착 배양(adhesion culture) 방법으로 단핵 세포를 수득하였고, 160 ng/mL rhIL-4 (Sino Biological, Inc.) 및 20 ng/mL rhGM-CSF (R&D Systems)을 함유하는 1640 세포 배양 매질 (GIBCO) (10% FBS, 100 단위/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin) 함유)을 실험 결과 얻어진 단핵 세포에 첨가하였고 CO2 인큐베이터에 3일까지 인큐베이팅한 후, 절반 부피의 배양 매질을 교체하였다. 인큐베이션 6일 후, DC들로 알려진 현탁 세포를 수집하였다. DC들의 농도를 2 x 106 세포/mL로 조정하였고, 최종 농도 50 μg/mL의 미토마이신(mitomycin)을 첨가하였고, 20분간 37℃에서 처리하고, 추가 단계를 위해 1640 매질로 3번 세척하였다.
CD4+ T 림프구 분류 키트(MiltenyiBiotec)를 사용하여 또 다른 사람의 말초 혈액에서 분리된 PBMC로부터 CD4+ T 림프구를 분류하였다. 세 혈액 공여자 각각으로부터의 CD4+ T 림프구를 본 에세이의 각 배치에 사용하였다.
분류된 CD4+ T 림프구를 50 μg/mL 미토마이신으로 10:1 비율로 미리 처리된 DC와 혼합하였고, 105 세포/웰을 PD1-H944, 니볼루맙, 및 음성 대조군 항체 H7N9-R1-IgG4 (Sino Biological, Inc.)가 있는 96-웰 플레이트에 각각 고르게 접종하였고, 또 다른 혼합된 림프구 대조군, 즉 항체 없이 CD4+ T 림프구 및 DC들 혼합물만으로 이루어진 군; DC 세포 대조군, 즉 항체 및 CD4+ T 림프구 없이 DC 세포로만 이루어진 군; CD4+ T 세포 대조군, 즉 항체 및 DC 세포 없이 CD4+ T 세포로만 이루어진 군은 샘플 희석제 1640 매질의 동일한 부피로, 각 항체의 최종 농도 구배가 1 μg /mL, 0.1μg/mL, 0.01μg/mL이었고, 5일간 37℃에서 5% CO2로 CO2 인큐베이터에서 인큐베이팅하였다. 배양 상층액을 수집하였고 배양 상층액 내 IL-2 및 IFN-γ 발현 수준을 ELISA로 측정하였다.
본 결과는 IFN-γ 및 IL-2 분비는 DC 혼합 없이 CD4+ T 세포 배양물의 상층액에서 검출될 수 없었던 반면, 혼합된 림프구 대조군에서는, CD4+ T 세포 및 DC들의 혼합은 CD4+ T 세포의 IFN-γ 및 IL-2 분비를 유의하게 증가시켰음을 보여주었다. 항-PD-1 항체를 혼합된 림프구 시스템에 첨가하였을 때, CD4+ T 및 DC들의 혼합된 림프구 반응에서 CD4+ T 세포의 활성화는 높은 IFN-γ 및 IL-2 분비로 유의하게 촉진되었다. 오히려 유의한 효과를 가진 PD1-H944 및 니볼루맙 모두와 대조적으로, 음성 대조군 항체는 이러한 효과를 보이지 않았다. 본 결과는 도 12에서 나타내며, PD1-H944가 니볼루맙보다 더 나은 기능 활성을 갖고 면역 억제된 T 세포를 효과적으로 재활성화 할 수 있음을 시사한다.
5.2 PD1 하류의 IL2 신호 전달 경로에서 PD1-H944은 리포터 유전자의 활성화를 자극함
본 에세이에서, 이펙터 세포 Jurkat-NFAT-Luc2p-PD-1 (SinoCellTech Ltd) 및 표적 세포 CHO-K1-PD-L1-CD3E (SinoCellTech Ltd)를 실험 재료로 사용하였다. 상기 두 세포의 공동-배양(co-culture) 결과 생성된 PD-1/PD-L1 상호작용은 TCR 신호 및 NFAT-RE-매개된 생물발광(bioluminescence)을 억제하였으며, PD-1 항체의 첨가는 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단시켰고, 그 결과 상기 억제를 풀어주었다. 이펙터 세포 내 생물 발광(RLU)의 강도를 측정함으로써 재조합 인간 PD-1 리포터 세포 시스템 내 PD1-H944의 활성화 기능을 결정하였다.
표적 세포 CHO-K1-PD-L1-CD3E 세포를 2Х 104/웰으로 96-웰 플레이트 내 접종하였고 10% FBS를 함유하는 DMEM 매질에 밤새 배양한 다음, 상층액을 제거하였다. 다양한 농도(0.007 μg/mL, 0.023 μg/mL, 0.082 μg/mL, 0.286 μg/mL, 1.000 μg/mL, 3.499 μg/mL, 12.245 μg/mL, 42.857 μg/mL, 150μg/mL)의 PD1-H944, 니볼루맙 및 음성 대조군 항체 H7N9-R1-IgG4 (Sino Biological, Inc.)를 40 μL/웰으로 첨가하였다(도 13 참고). 40 μL/웰으로 7.5 Х 104 이펙터 세포 Jurkat-NFAT-Luc2p-PD-1를 이후에 첨가하였고 6시간 동안 CO2 인큐베이터에서 인큐베이팅하였다. 각 에세이는 표적 세포, 이펙터 세포 및 음성 대조군 M에 대해 3중선으로 실행되었다. 6시간 인큐베이션 이후, 패시브 용해 5X 완충액(passive lysis 5X buffer) (Promega)을 20 μL/웰으로 첨가한 다음, 추가 검출을 위해 96-웰 플레이트를 -80℃ 냉장고에 두었다. 본 에세이를 위해, 상기 96-웰 플레이트를 -80℃에 두었다. 실온으로 해동하고, 진탕한 다음 LB960-마이크로플레이트 루미놀 에세이(LB960-Microplate Luminol Assay)에 의한 발광 검출을 위하여 웰 당 20 μL의 상층액을 96-웰 흰색 바닥 플레이트에 옮겼다.
본 결과는 도 13에서 나타난 것과 같이, PD1-H944 및 대조군 항체 니볼루맙 모두 재조합 인간 PD-1 리포터 유전자 세포 시스템의 유의한 활성화를 가졌음을 보여주었다. 농도 범위 0.007-150 μg/mL에서, PD1-H944의 EC50는 0.49 μg/mL이었고 니볼루맙의 EC50은 1.08 μg/mL이었다. PD1-H944은 니볼루맙보다 유의하게 낮은 EC50을 가졌으며, 이의 활성은 니볼루맙의 활성의 2.21배이었다. 음성 대조군 항체는 재조합 인간 PD-1 리포터 유전자 세포 시스템에서 활성화 기능을 가지지 않았다.
5.3 PD1-H944는 Fc 수용체 CD16a 경로의 ADCC 기능을 유의하게 자극하지 않음
본 에세이에서, 재조합 고 활성의 CD16a (V158) 리포터 유전자 시스템 방법에 의한 PD1-H944-매개된 ADCC 효과를 측정하기 위해 이펙터 세포 Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A (SinoCellTech Ltd) 및 표적 세포 CHO-PD-1 (SinoCellTech Ltd)를 실험 재료로 사용하였다. 본 메커니즘은 두 세포를 공동-배양하고 PD1-H944를 동시에 첨가할 때, PD1-H944의 Fab 단편이 PD-1 과발현 표적 세포에 결합하고, 그리하여 이의 Fc 단편이 Fcγ 수용체 CD16A를 갖는 이펙터 세포에 결합하게 하여, 결과적으로 이펙터 세포 Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A를 활성화하고 NFAT-RE-매개된 화학발광을 촉진하는 메커니즘이다.
표적 CHO-PD-1 세포를 2 Х104/웰으로 96-웰 플레이트 내 접종하였고 10% FBS를 함유하는 DMEM 매질에 밤새 배양한 다음, 상층액을 제거하였다. 0.1% BSA를 함유하는 RPMI 1640 (페놀 레드가 없는) 매질로 플레이트를 2번 세척한 다음, 양성 대조군 항체 PD1-H944-1-IgG1(o), PD1-H944, 니볼루맙 및 음성 대조군 항체 H7N9-R1-IgG4(Sino Biological, Inc.)를 다양한 농도(도 14a-b 참고)로 40 μL/웰으로 첨가하였고, 40 μL/웰으로 1Х106 이펙터 세포 Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A을 첨가하였고, 4시간 동안 37℃에서 5% CO2로 CO2 인큐베이터에 두었다. 각 에세이는 표적 세포, 이펙터 세포 및 음성 대조군에 대해 삼중선으로 실행되었다. 4시간이 지난 시점에서, 20 μL/웰으로 패시브 용해 5X 완충액 (Promega)을 첨가하였고 96-웰 플레이트를 테스팅(testing)을 위해 -80℃ 냉장고에 두었다. 본 에세이를 위해, 96-웰 플레이트를 실온까지 해동하고 진탕한 다음, LB960-마이크로플레이트 루미날 에세이에 의한 발광 검출을 위해 웰 당 20 μL의 상층액을 96-웰 흰색 플레이트에 옮겼다.
본 결과는 양성 대조군 항체 PD1-H944-1-IgG1(o)가 유의한 ADCC 매개된 효과를 갖고, 니볼루맙이 보다 약한 ADDCC 효과를 갖는 반면 PD1-H944는 0.018-3000 ng/mL 농도 범위에서 (p<0.01) 니볼루맙보다 더 약한 ADCC 효과를 가졌음을 보여주었다(p<0.01). 도 14a 및 도 14b는 에세이의 다양한 배치에서의 결과를 보여준다. 도 14c 및 14d는 14a 및 14b 각각에서의 최고 항체 농도점 (300ng/mL)과 비등한 생물 발광 강도 (RLU)를 나타낸다. 본 민감한 ADCC 기능 에세이에서, CD16a에 결합하는 PD1-H944에 의해 유발되는 세포 활성화는 니볼루맙의 세포 활성화보다 유의하게 낮았고 본 결과는 반복 가능하였다. PD1-H944 약물의 낮은 ADCC 활성은 임상에서 본 항체의 효능 및 안정성에 대한 좋은 근거이다.
5.4 PD1-H944는 보체 C1q 경로의 CDC 기능을 유의하게 활성화하지 않음
PD-1 과발현 종양 세포에 대한 결합 이후, PD1-H944는 종양 세포를 사멸하기 위한 전형적인 보체 경로를 활성화하여, 이의 사멸을 초래할 수 있다. 본 에세이에서, WST-8 방법을 사용하여 PH1-H944의 CDC 효과를 조사하였다.
0.1% BSA를 함유하는 RPMI 1640 매질(SinoCellTech Ltd)에 CHO-PD-1 세포를 재현탁시켰고 5 Х 104/웰으로 96-웰 플레이트에 균일하게 접종한 다음, 50 μL/웰으로 다양한 농도(도 15)의 항체들을 첨가하였고 50 μL/웰(1 람다)으로 1:4 희석한 보체 C1q를 첨가하였다. 상기 항체들은 양성 대조군 항체 PD1-H944-1-IgG1(o) (Sino Biological, Inc.), PD1-H944, 니볼루맙 및 음성 대조군 항체 PD1-H944-1-IgG1 (Sino Biological, Inc.)이며, 분석 블랭크 웰(blank well) B(세포 없음) 및 음성 대조군 M(세포가 존재하지만 항체는 없음)을 포함한다. 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 15 μL의 WST-8 발색 용액을 각 웰에 첨가하였고 발색이 안정화된 후에 ELISA 분석기(ELISA Analyzer)에서 흡광도가 450nm 및 630nm으로 측정되었다. 본 결과는 블랭크 웰의 값을 뺀 흡광도 값 OD450-OD630으로 계산되었다. % 사멸 = (음성 대조군 M의 OD - 샘플의 OD)/음성 대조군 M의 OD Х 100%.
본 결과는 PD1-H944, 니볼루맙 및 음성 대조군 항체가 CHO-PD-1, 종양 세포 과 발현 PD-1에 대해 CDC 효과를 갖지 않았던 반면, 양성 대조군 항체는 CHO-PD-1에 대해 최대 사멸 비율 82.1%으로 사멸 효과를 가졌음을 보여주었으며, 상기 결과는 도 15에서 나타난다. CDC 에세이는 또한 PD1-H944가 PD-1 발현 표적세포에 CDC 효과를 갖지 않았음을 확인시켰으며 항체의 양호한 안정성을 입증하였다.
5.5 PD1-H944는 생체 내 인간화된 PD-1 마우스에서 MC38 결장암(colon cancer) 피하 이식 종양 모델의 성장을 효과적으로 억제함
(1) MC38 결장암 피하 이식 종양을 가진 인간화된 PD-1 마우스 모델에서의 PD1-H944의 약물동력학(Pharmacodynamics) 연구 I
종양 접종을 위해 대수 성장 단계의 MC38 세포 (Sun Ran Shanghai Biotechnology Co., Ltd.)를 사용하였다. PBS에 재현탁된 MC38 세포를 5 Х 105 세포/0.1 mL으로 B-hPD-1 인간화된 마우스 (Biocytogen) (C57BL/6 마우스의 PD-1 유전자의 엑손 2의 부분을 인간 PD-1 유전체의 대응하는 부분으로 교체하여 수득함)에 마우스의 측면 흉부의 오른쪽 방향으로 피하 접종하였으며, 총 47마리의 마우스에 접종하였다. 종양 부피가 약 100 mm3으로 성장하였을 때, 개별 종양 부피에 따라 마우스를 선택하였고, 엑셀 소프트웨어를 이용하여 5 그룹으로, 각 그룹에 8 동물을 무작위 배치하였다. 그룹 4 및 5에 본 출원과 관련 없는 다른 항-PD-1 항체를 접종하였기 때문에, 이들의 데이터는 본 명세서에서 나타나지 않는다. 그룹화 당일에 투여를 시작하였다. 복강 내 주사(intraperitoneal injection, I.P.)로 마우스에 투여하였고, 3일 마다 6회 연속 투여하였고, 최종 투여 이후 10일에 희생시킨 다음 무게를 재기 위해 종양 조직을 제거하였다. 본 구체적인 투여 요법은 하기 표 3에 나타났다. 종양 성장 억제 비율 TGI (%)을 계산함으로써 본 약물의 항-종양 효과를 평가하였다. TGI (%) < 60%은 효과가 없는 것으로 간주되었고; TGI (%) ≥ 60%이고 처리군의 종양 부피가 용매 대조군보다 통계학적으로 유의하게 낮은 것은 효과가 있는 것으로 간주되었으며, 즉 종양 성장에 유의한 억제 효과를 가졌다. TGI (%)를 하기와 같이 계산하였다.
TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] Х 100, 이때
Ti: i일에서 처리군 내 평균 종양 부피.
T0: 0일에서 처리군 내 평균 종양 부피.
Vi: i일에서 용매 대조군의 평균 종양 부피.
V0: 0일에서 용매 대조군의 평균 종양 부피
상기 동물들을 에세이 종료점에 희생시켰고, 종양 무게를 잰 다음, 종양 무게 억제 비율 IRTW%을 계산하였으며, IRTW%> 60%을 유효성의 참조 지표로 하여, 하기와 같이 계산하였다.
종양 무게의 억제 비율 IRTW (%) = (W 용매 대조군 - W 처리군)/W 용매 대조군 Х 100, W는 종양 무게.
[표 3]: 그룹 및 투여 요법
Figure pct00018
참고: 투여 부피는 실험 동물의 체중을 기준으로 10 μL/g으로 계산되었다.
모든 테스트 동물(test animal)들은 투여 기간 동안 활동성(activity) 및 먹이 섭취(feeding) 관점에서 일반적으로 양호한 상태였으며, 이들의 체중은 어느 정도 증가하였다. 테스트 약물(test drug)을 투여한 동물(그룹 3) 및 대조군 약물을 투여한 동물(그룹 2)의 체중에는 유의한 차이를 보이지 않았다(P>0.05). 모든 동물의 체중 변화는 도 16 및 표 4에 나타난다.
[표 4]: MC38 결장암 이식 B-hPD-1 인간화된 마우스의 체중에 대한 PD1-H944의 효과
Figure pct00019
a: 평균 ± 표준 오차.
b: 투여 이후 25일에 처리군 체중과 용매 대조군 체중의 통계학적 비교, t-검정.
c: 그룹 2는 실험 종료점에 7마리의 마우스를 갖음.
시험에서 각 그룹의 종양 부피 결과는 표 5 및 도 17에서 나타난다.
[표 5]: MC38 결장암 이식된 B-hPD-1 인간화된 마우스의 종양 부피에 대한 PD1-H944의 효과
Figure pct00020
참고: 용매 대조군과 비교시, *P<0.05, **P<0.01; 니볼루맙 그룹과 비교시, PΨ<0.05, PΨΨ<0.01
일수(days): 세포 접종 이후 일수
제1 투여 이후 25일에, 모든 동물을 안락사 시켰고 모든 종양을 제거하였고, 무게를 잰 다음, 사진을 찍었다. 종양 무게를 그룹 간에 통계적으로 비교하였고 그 결과는 표 6 및 도 18에서 요약된다.
[표 6]: MC38 결장암(colon cancer) 이식된 B-hPD-1 인간화된 마우스에서 종양 무게에 대한 PD1-H944의 효과
Figure pct00021
참고: 용매 대조군과 비교시, *P<0.05, **P<0.01; 니볼루맙 그룹과 비교시, PΨ<0.05, PΨΨ<0.01
종양 부피 결과와 일치하여, 니볼루맙은 본 모델에서 종양을 유의하게 억제하지 않았던 반면, PD1-H944 그룹의 평균 종양 무게는 0.044 ± 0.017 g이었다. 이의 종양 무게 억제 비율 (IRTW)은 97.4%에 도달하였다. 데이터 분석은 PD1-H944 그룹의 종양이 용매 대조군의 종양과 유의하게 달랐음(P<0.05)을 보여주었으며, PD1-H944의 유의한 항-종양 효능을 입증한다.
에세이 종료점에서, 용매 대조군의 평균 종양 부피는 2171±430 mm3 이었고 종양 무게는 1.719±0.310 g이었다. 양성 대조군 니볼루맙 (20 mg/kg)의 평균 종양 부피는 1802±228 mm3이었고, TGI%는 17.8%이며 종양 무게는 1.492±0.274 g이었다. 종양 무게 억제 비율 IRTW은 13.2%이었고, 이는 용매 대조군의 종양 부피와 유의하게 다르지 않았다 (P=0.480). 대조적으로, PD1-H944의 평균 종양 부피는 171±51 mm3, TGI%는 96.7%이었고, 종양 무게는 0.044±0.017 g이었으며 종양 무게 억제 비율 IRTW은 97.4%로 용매 대조군의 종양 부피와 비교하여 유의하게 달랐으며 (P<0.05), 이는 공여자 항체 PD-1 에피토프에 결합된 공여자 항체 PD1-H944가 효과적이었고 20 mg/kg 투여 수준에서 MC38 결장암 피하 이식편 종양의 유의한 억제를 보여주었음을 나타낸다.
(2) MC38 결장암 피하 이식 종양을 가진 인간화된 PD-1 마우스의 약물동력학 연구 II
종양 접종을 위해 대수 성장 단계의 MC38 세포 (Sun Ran Shanghai Biotechnology Co., Ltd.)를 사용하였다. PBS에 재현탁된 MC38 세포를 5 Х 105 세포/0.1 mL으로 B-hPD-1 인간화된 마우스 (Biocytogen) (C57BL/6 마우스의 PD-1 유전자의 엑손 2의 부분을 인간 PD-1 유전체의 대응하는 부분으로 교체하여 수득함)에 접종하였다. 총 80마리의 마우스를 측면 흉부의 오른쪽 방향으로 피하 접종하였다. 종양 부피가 100 mm3으로 성장하였을 때, 개별 종양 부피에 따라 마우스를 선택하였고, 엑셀 소프트웨어를 이용하여 8 그룹으로, 각 그룹에 8 동물을 무작위 배치하였다. 그룹 3, 4, 7 및 8에 본 출원과 관련 없는 다른 항-PD-1 항체를 접종하였기 때문에, 이들의 데이터는 본 명세서에서 나타나지 않았다. 그룹화 당일에 투여를 시작하였다. 복강 내 주사(I.P.)로 마우스에 투여하였고, 3일 마다 6회 연속 투여하였고, 최종 투여 이후 10일에 희생시켰고 무게를 재기 위해 종양 조직을 제거하였다. 이 구체적인 투여 요법은 하기 표 7에 나타났다.
[표 7]: 시험 그룹 및 투여
Figure pct00022
참고: a: 투여 부피는 동물의 체중을 기준으로 10 μL/g으로 계산되었다;
b: 펨브로리주맙: Sino Biological, Inc.
종양 성장 억제 비율 TGI(%)을 계산하여 본 약물의 항-종양 효과를 평가하였다. TGI(%) < 60%은 효과가 없는 것으로 간주되었고; TGI(%) ≥ 60%이고 처리군의 종양 부피가 용매 대조군의 종양 부피보다 통계학적으로 낮은 것은(p<0.05) 효과가 있는 것으로 간주되었으며, 즉 종양 성장에 유의한 억제 효과를 가졌다. TGI(%)를 하기와 같이 계산하였다.
TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] Х 100, 이때
Ti: i일에서 처리군의 평균 종양 부피.
T0: 0일에서 처리군의 평균 종양 부피.
Vi: i일에서 용매 대조군의 평균 종양 부피.
V0: 0일에서 용매 대조군의 평균 종양 부피.
에세이 종료점에 모든 동물을 희생시켰고, 종양 무게를 잰 다음 종양 무게 억제 비율 IRTW%을 계산하였으며 IRTW% > 60%을 유효성의 참조 지표로 하여, 하기 공식을 사용하여 계산하였다.
종양 무게 억제 비율 IRTW (%) = (W 용매 대조군 - W 처리군)/W 용매 대조군 Х100, W은 종양 무게.
모든 테스트 동물들은 투여 기간 동안 활동성 및 먹이 섭취 관점에서 일반적으로 양호한 상태였으며, 이들의 체중은 어느 정도 증가하였다. 테스트 약물 및 대조군 약물의 투여 이후 동물의 체중에는 유의한 차이가 없었다 (P>0.05) (표 8 및 도 19).
[표 8]: MC38 결장암 이식된 B-hPD-1 인간화된 마우스에서 체중에 대한 PD1-H944의 효과
Figure pct00023
참고: a: 평균 ± 표준 오차.
b: 투여 이후 23일에 처리군 체중과 용매 대조군 체중의 통계학적 비교, t-검정.
이 에세이에서 각 그룹의 종양 부피는 표 9 및 도 20에서 나타났다
[표 9]: MC38 결장암 이식된 B-hPD-1 인간화된 마우스에서 종양 부피에 대한 PD1-H944의 효과(평균± 표준 오차)
Figure pct00024
참고: 용매 대조군과 비교시, *P<0.05, **P<0.01 일수: 세포 접종 이후 일수; N: 통계에 포함된 그룹에서의 동물 개체수
제1 접종 이후 24일에, 모든 동물을 안락사 시켰고 종양을 제거하였고, 무게를 잰 다음 사진을 찍었다. 종양 무게를 그룹 간에 통계적으로 비교하였고 그 결과는 표 10 및 도 21에서 요약된다.
[표 10]: MC38 결장암 이식된 B-hPD-1 인간화된 마우스에서 종양 무게에 대한 PD1-H944의 효과(평균 ± 표준 오차)
Figure pct00025
참고: 용매 대조군과 비교시, *P < 0.05, **P < 0.01.용매 대조군의 경우: 종양 부피가 그룹화 이후에도 계속 증가하였고 시험 종료점에서 평균 종양 부피는 3405 ± 624 mm3이었다.
양성 대조군의 경우: 20 mg/kg으로 펨브로리주맙을 투여한 이후, 종양 부피가 용매 대조군에 비해 느리게 증가하였고, 투여 5일차의 종양 부피에서 유의한 차이가 있었고(P<0.05); 본 시험 종료점에서 TGI%은 97.0%이었고 종양 무게 억제 비율은 93.5%이었으며, 용매 대조군과 비교시, P<0.05이었다. 효능 모델에서 펨브로리주맙은 명백한 종양 억제를 보여주었으며, 본 모델이 키트루다 에피토프 결합 항체의 효능 평가에 사용될 수 있음을 나타낸다.
PD1-H944 8mg/kg 그룹의 경우: 8 mg/kg으로 PD1-H944을 투여한 이후, 종양 부피는 용매 대조군에 비해 느리게 증가하였고, 투여 5일차의 종양 부피에서 유의한 차이를 보였고 (P<0.05); 본 시험 종료점에서 TGI%는 89.7%이었고, 종양 무게 억제 비율은 87.8%이었으며, 용매 대조군과 비교시, P<0.05이었다.
PD1-H944 2mg/kg 그룹의 경우: 2 mg/kg으로 PD1-H944을 투여한 이후, 종양 부피는 용매 대조군에 비해 느리게 증가하였고, 투여 5일차의 종양 부피에서 유의한 차이를 보였고 (P<0.05); 본 시험 종료점에서 TGI%는 85.3%이었고, 종양 무게 억제 비율은 84.7%이었으며, 용매 대조군과 비교시, P<0.05이었다. 이는 PD-1 에피토프에 결합하는 적용된 PD1-H944가 본 모델에서 효과적이며, 투여용량 상관관계를 보이는 MC38 결장암 피하 이식편 종양에 대한 유의한 종양-억제 효과를 나타냄을 다시 시사한다. 본 에세이에서의 PD1-H944 및 펨브로리주맙의 항-종양 효능을 종양 무게 관점에서 또한 확인하였다.
본 에세이에서의 결과는 3일 마다 6회의 연속적인 투여의 PD1-H944 8mg / kg 또는 2mg / kg의 복강 내 투여가 PD-1 인간화된 마우스에서 MC38 이식 종양의 성장을 유의하게 억제하였음을 보여주었고(P<0.05), 투여 그룹의 동물 특성화 및 체중은 본 모델 그룹의 특성화 및 체중과 다르지 않았다. 항체의 다양한 에피토프를 위한 본 모델 설계의 선호도(preference)를 고려할 때, 본 에세이는 PD1-H944와 펨프로리주맙 사이의 효능 차이를 평가하지 않았다.
본 생체 내 약물동력학 연구는 동물 모델로서 인간화된 PD-1 C57BL/6 마우스에서 피하 이식된 MC38 결장암에 대한 PD1-H944 단독의 항-종양 효과를 조사하였다. B-hPD-1 인간화된 마우스는 PD-1 유전자가 인간화되어 있는 C57BL/6 마우스이며, 인간 PD-1 항체 약물의 효능의 생체 내 평가에 본 마우스를 적합하게 한다. 본 모델은 PD-1 항체의 다양한 에피토프의 효능에 대해 선택적이었고, 펨브로리주맙은 본 모델에서 유의한 종양 억제를 보여주었다. 본 결과는 PD1-H944 단독으로(2, 8 및 20 mg/kg을 3일 마다 6회 연속적 투여로 투여하였음) MC38 이식 종양의 성장을 유의하게 억제하였음을 보여주었고 요약 데이터는 표 11 및 12에 나타났다.
[표 11]: PD1-H944의 MC38 결장암 이식된 B-hPD-1 인간화된 마우스에 대한 항종양 효과
Figure pct00026
[표 12]: 결장암 이식 종양을 갖는 인간화된 PD-1 마우스에 대한 다양한 투여 용량의 PD1-H944의 항종양 효과
Figure pct00027
실시예 6 PD1-H944에 의해 특이적으로 결합하는 아미노산 부위의 식별
실시예 4.2의 데이터는 PD1-H944가 PD-1 단백질에 결합하는데 PD-L1(도 7의 A) 또는 PD-L2(도 7의 B)와 효과적으로 경쟁함을 보여주며, PD1-H944에 의해 타겟팅된 PD-1 상의 결합 에피토프와 PD-L1 또는 PD-L2 리간드에 의해 타겟팅된 PD-1 상의 결합 에피토프 사이의 중첩을 입증한다.
6.1 PD1-H944의 구조적 에피토프(conformational epitope)를 예측하기위한 분자 시뮬레이션(molecular simulation)
PD1-H944-PD-1 단백질 인터페이스(interface) 사이의 상호작용을 조사하기 위해, 본 실시예에서 PD1-H944 및 PD-1 단백질의 ZDOCK 도킹을 실행하였다. PD1-H944에 의해 타겟팅된 PD-1 단백질 결합 에피토프가 리간드 PD-L1에 의해 타겟팅된 PD-1 단백질 결합 에피토프와 중첩한다는 사실을 바탕으로, DS 4.0의 항체 모델 프로그램(Accelrys Software Inc.)을 사용하여 PD1-H944에 대한 상동성 모델링을 실행하였고, 최종 모델 작제물 유효성(final model construct validity)을 라마찬드란 맵(Ramachandran map)으로 테스트하였다. PD-1 단백질 3차원 구조를 PDB 데이터베이스 (PDB ID: 4ZQK)에서 다운받았고 단백질 제조 프로그램(Protein Preparation program)으로 초기화하였다. PD1-H944 모델과 PD-1 구조의 결합 모델을 ZDOCK 프로그램으로 도킹하였다. 점수에 있어 상위 10개를 다시 RDOCK 최적화하였다. 단백질 인터페이스 분석 프로그램(Protein Interface Analysis program)으로 본 최적 모델을 추가로 분석하였다 (도 22). 도킹 모델 인터페이스 상호작용은 PD1-H944에 의해 PD-1 단백질에 결합된 주요 펩티드 서열이 CC'및 FG 시트임을 보여주었다(표 13).
[표 13]: 분자 시뮬레이션으로 예측한 PD-1 단백질에 결합하는 PD1-H944의 주요 펩티드 서열
Figure pct00028
6.2 PD-1 단백질 돌연변이체에 의해 테스트된 PD1-H944 결합 에피토프의 검증
PD1-H944의 기능성 에피토프를 추가로 확인하기 위해, 표 13에서 PD-1 단백질에 결합하는 주요 부위(main site)로 예측되는 단백질 서열을 바탕으로, 일련의 알라닌(alanine) 돌연변이된 PD-1 단백질 돌연변이체를 제조하였고 ELISA 에세이로 분석하였다. 본 모델의 정확성을 검증하기 위해, 실시예 6.1의 모델 외의 여러 부위 또한 본 연구를 위해 선택하였고(표 14), 상기 돌연변이 부위를 5개의 공간적 구조의 에피토프로 크게 그룹화하였다(도 23).
[표 14]: 재조합 PD-1 단백질의 세포외 영역에서의 돌연변이체의 설계
Figure pct00029
실시예 4.2의 방법에 따라 ELISA로 PD1-H944에 대한 표 14의 각 돌연변이체의 결합을 결정하였다. 돌연변이체는 돌연변이되지 않은 PD-1 단백질과 비교하여 결합이 감소하는 정도가 달랐다. 데이터를 분석하였고 수평 좌표를 PD-1 단백질 돌연변이체 프로파일로 하고 수직 좌표를 결합 비율 [결합 비율 = OD (PD-1 단백질 돌연변이체)/OD (PD-1 단백질)Х100%)]로 하여 엑셀 2007을 이용하여 플롯팅하였다. 본 결과는 리간드 PD-L1에 대한 PD-1 단백질의 주요 결합 부위가 PD-1 단백질의 CC' 및 FG 시트 상의 부위 2, 부위 3, 부위 4 및 부위 5이었음을 보여주었으며, 이는 결정 복합체(crystals complex) (PDB ID: 4ZQK)의 분석과 일치하였다. PD-1 단백질에 결합하는 양성 대조군 니볼루맙의 결합 부위는 주로 N-루프 및 FG 시트의 부위 1 및 부위 4 상에 위치하였고, 본 결과는 또한 이의 결정 복합체 (PDB ID: 5WT9)의 분석과 일치하였다; PD-1 단백질에 결합하는 PD1-H944의 주요 결합 부위는 부위 3 및 부위 4 상의 E61, K78, D85 및 P130이다. 본 결과는 또한 상기 실시예의 도킹 모델의 결과와 일치하였고(도 24 및 표 15), PD1-H944 및 PD-1 단백질 사이의 도킹 모델의 정확성을 검증하였다.
[표 15]: PD-L1, 니볼루맙 및 PD1-H944의 각 PD-1 돌연변이체에 대한 결합
Figure pct00030
참고:+: 결합 비율>85%을 나타내며, 민감한 결합 부위 없음; +/-: 85%≥결합 비율 >50%을 나타내며, 부분적으로 민감한 결합 부위;-:은 결합 비율 <50%을 나타내며, 민감한 결합 부위
PD1-H944과 PD-1 단백질 사이의 도킹 모델은 PD1-H944에 의해 타겟팅된PD-1 단백질의 결합 에피토프가 PD-L1에 의해 타겟팅된 PD-1 단백질의 결합 에피토프와 중첩함을 보여준다. 이러한 사실은 PD1-H944가 직접적인 공간 입체 장애(direct space steric hindrance)를 통해 작용한다는 생각을 뒷받침한다. 한편, PD1-H944 및 니볼루맙 모두에 의해 타겟팅된 에피토프 사이의 중첩은 PD1-H944가 PD-L1의 에피토프에 대한 결합을 차단하는 더 큰 부위를 가지고 있음을 시사하였다(도 25의 A-C). 따라서 PD1-H944는 종양 치료에서 뛰어난 치료 효능을 가질 수 있다.
<110> SinoCellTech Ltd. <120> Humanized anti-pd-1 antibody and the use thereof <130> FP1180486P <160> 35 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 167 <212> PRT <213> Human being(Homo sapiens) <400> 1 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 165 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Mouse(Mus musculus) <400> 2 tctagtggtg gcggtggttc gggcggtggt ggaggtggta gttctagatc ttcc 54 <210> 3 <211> 741 <212> DNA <213> Mouse(Mus musculus) <400> 3 gatattgtgc taactcaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 120 cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaatctagtg gtggcggtgg ttcgggcggt 360 ggtggaggtg gtagttctag atcttccgag gtgcaactgg tggaatctgg gggaggctta 420 gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc tgtgcagcct ctggattcac tttcagttcc 480 tatggcatgt cttgggttcg tcagactccg gagaagaggc tggagtgggt cgcgaccatt 540 agtggtggtg gtcgtgacac ctactattca gacagtgtga aggggcggtt caccgtctcc 600 agagacaatg ccaagaacaa cctgttcctg caaatgagca gtctgaggtc tgaagacacg 660 gccttgtatt attgttcacg tcaatatggt acggtctggt tttttaactg gggccagggg 720 actctggtca ctgtctctgc a 741 <210> 4 <211> 354 <212> DNA <213> Mouse(Mus musculus) <400> 4 gaggtgcaac tggtggaatc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt tcctatggca tgtcttgggt tcgtcagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcgacc attagtggtg gtggtcgtga cacctactat 180 tcagacagtg tgaaggggcg gttcaccgtc tccagagaca atgccaagaa caacctgttc 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaagac acggccttgt attattgttc acgtcaatat 300 ggtacggtct ggttttttaa ctggggccag gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 5 <211> 333 <212> DNA <213> Mouse(Mus musculus) <400> 5 gatattgtgc taactcaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 120 cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 6 <211> 972 <212> DNA <213> Mouse(Mus musculus) <400> 6 gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60 tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120 tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180 ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 240 acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300 gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360 cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420 gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480 gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540 agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600 aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660 aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720 agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780 aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840 tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900 acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960 tctcctggta aa 972 <210> 7 <211> 321 <212> DNA <213> Mouse(Mus musculus) <400> 7 cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60 ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120 tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180 agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 240 cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300 agcttcaaca ggaatgagtg t 321 <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> Mouse(Mus musculus) <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Gln Tyr Gly Thr Val Trp Phe Phe Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 9 <211> 111 <212> PRT <213> Mouse(Mus musculus) <400> 9 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Mouse(Mus musculus) <400> 10 Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Mouse(Mus musculus) <400> 11 Ala Ala Ser Asn Gln 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290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 17 <211> 218 <212> PRT <213> Human being(Homo sapiens) <400> 17 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile 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sapiens) <400> 26 atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgtctgag 60 gtccaacttg tggagtctgg aggaggactg gtgaagcctg gaggctccct gagactgtcc 120 tgtgctgcct ctggcttcac cttctcctcc tatgggatga gttgggtgag acaggctcct 180 gggaagagat tggagtgggt ggctaccatc tctggaggag gcagggacac ctactactct 240 gactctgtga agggcaggtt cacaatcagc agggacaatg ccaagaacaa cctgtacctc 300 caaatgaact ccctgagggc tgaggacaca gcagtctact actgtagcag acaatatggc 360 acagtgtggt tcttcaactg gggacaaggc accctggtga cagtgtcctc tgctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc gctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 720 cccccatgcc caccctgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 780 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggaaagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1380 tctctgggta aataa 1395 <210> 27 <211> 714 <212> DNA <213> Human being(Homo sapiens) <400> 27 atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcattctgag 60 attgtgctga cccagagccc tgccaccctg tccctgagcc ctggagagag ggctaccctg 120 tcctgtaggg catctgagtc tgtggactcc tatggcaact cctttatgca ctggtatcaa 180 cagaagcctg gacaaccacc aagactgctg atttatgctg ccagcaacca gggctctgga 240 gtgcctgcca ggttctctgg ctctggctct ggcacagact tcaccctgac catctcctcc 300 ttggaacctg aggactttgc tatgtacttc tgtcaacaga gcaaggaggt gccatggacc 360 tttggacaag gcaccaaggt ggagattaag cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420 ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600 accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 660 catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttag 714 <210> 28 <211> 57 <212> DNA <213> Human being(Homo sapiens) <400> 28 atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgtct 57 <210> 29 <211> 57 <212> DNA <213> Human being(Homo sapiens) <400> 29 atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcattct 57 <210> 30 <211> 354 <212> DNA <213> Human being(Homo sapiens) <400> 30 gaggtccaac ttgtggagtc tggaggagga ctggtgaagc ctggaggctc cctgagactg 60 tcctgtgctg cctctggctt caccttctcc tcctatggga tgagttgggt gagacaggct 120 cctgggaaga gattggagtg ggtggctacc atctctggag gaggcaggga cacctactac 180 tctgactctg tgaagggcag gttcacaatc agcagggaca atgccaagaa caacctgtac 240 ctccaaatga actccctgag ggctgaggac acagcagtct actactgtag cagacaatat 300 ggcacagtgt ggttcttcaa ctggggacaa ggcaccctgg tgacagtgtc ctct 354 <210> 31 <211> 333 <212> DNA <213> Human being(Homo sapiens) <400> 31 gagattgtgc tgacccagag ccctgccacc ctgtccctga gccctggaga gagggctacc 60 ctgtcctgta gggcatctga gtctgtggac tcctatggca actcctttat gcactggtat 120 caacagaagc ctggacaacc accaagactg ctgatttatg ctgccagcaa ccagggctct 180 ggagtgcctg ccaggttctc tggctctggc tctggcacag acttcaccct gaccatctcc 240 tccttggaac ctgaggactt tgctatgtac ttctgtcaac agagcaagga ggtgccatgg 300 acctttggac aaggcaccaa ggtggagatt aag 333 <210> 32 <211> 984 <212> DNA <213> Human being(Homo sapiens) <400> 32 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccg ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 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Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser 115 120 125 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly 130 135 140 Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser 145 150 155 160 Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp 165 170 175 Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser 180 185 190 Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu 195 200 205 Phe Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 210 215 220 Cys Ser Arg Gln Tyr Gly Thr Val Trp Phe Phe Asn Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 245 <210> 35 <211> 18 <212> PRT <213> Mouse(Mus musculus) <400> 35 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg 1 5 10 15 Ser Ser

Claims (23)

  1. 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 가변 부위 또는 이의 일부 및/또는 중쇄 가변 부위 또는 이의 일부를 포함하며;
    상기 경쇄 가변 부위 또는 이의 일부는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하고;
    상기 중쇄 가변 부위 또는 이의 일부는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는, 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하거나, 하기로 이루어지거나, 또는 하기로 필수적으로 이루어지는, 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편: 서열 번호 23의 PD-1 항체 경쇄 가변 부위 서열과 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는 서열 번호 22의 PD-1 항체 중쇄 가변 부위 서열과 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 경쇄 불변 부위 및 중쇄 불변 부위를 더 포함하며, 바람직하게는 상기 경쇄 불변 부위는 서열 번호 25의 카파 경쇄 불변 부위(kappa light chain constant region)와 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고/갖거나, 상기 중쇄 불변 부위는 서열 번호 24의 IgG4 중쇄 불변 부위와 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 분리된 PD-1 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 PD-1 항체는 IgG 항체, 바람직하게는 IgG4 항체인, 분리된 PD-1 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 PD-1 항체는 단일클론 항체(monoclonal antibody)인, 분리된 PD-1 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 재조합 인간 PD-1 단백질과 20-200pM, 바람직하게는 평균 60-70pM, 더욱 바람직하게는 평균 64.8pM의 KD 평균 친화도(affinity in KD average)로 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 PD-1 단백질 분자 또는 서열 번호 1과 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질 분자에 특이적으로 결합하는, 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 하나 이상의 PD-1 단백질 세포외 영역인 60SESFV64, 78KLAAFPEDRSQP89, 128LAPKAQI134로부터 선택된 펩티드 서열과 특이적으로 결합하며;
    바람직하게는, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 하나 이상의 PD-1 단백질 세포외 영역인 E61, K78, D85, P130로부터 선택된 아미노산 잔기와 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하나 이상의 PD-1 단백질 세포외 영역인 60SESFV64, 78KLAAFPEDRSQP89, 128LAPKAQI134로부터 선택된 펩티드 서열과 특이적으로 결합하며;
    바람직하게는, 상기 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하나 이상의 PD-1 단백질 세포외 영역인 E61, K78, D85, P130로부터 선택된 아미노산 잔기와 특이적으로 결합하는, 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 Fv, Fab, Fab′, Fab′-SH, F(ab′)2, Fd 단편, Fd′ 단편, 단쇄 항체 분자, 또는 단일 도메인 항체의 형태로 존재하며; 상기 단쇄 항체 분자는 바람직하게는 scFv, di-scFv, tri-scFv, 디아바디(diabody), 또는 scFab인, 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 변형된 약물 분자로서, 상기 변형된 약물 분자는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 추가의 분자에 의해 형성된 공유결합 또는 비-공유결합 접합체(conjugate) 또는 재조합 다중-표적 약물 융합체(multi-target fusion drug)이며, 상기 추가의 분자는 소분자 화합물 및/또는 생체고분자(biomacromolecule)로부터 선택된 것인, 변형된 약물 분자.
  12. 분리된 핵산으로서, 상기 분리된 핵산은: 제1항 내지 제10항 중 어느 항의 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 상기 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 또는 상기 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지며, 바람직하게는 상기 분리된 핵산은 서열 번호 26 및/또는 27의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 상기 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 또는 상기 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지는, 분리된 핵산.
  13. 벡터로서, 제12항의 분리된 핵산을 포함하는, 벡터.
  14. 분리된 세포로서, 상기 분리된 세포는 제12항의 분리된 핵산을 포함하고/하거나 제13항의 벡터를 포함하는, 분리된 세포.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 제14항의 분리된 세포를 배양하는 것 및 상기 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 정제하는 것을 포함하는, 방법.
  16. 종양 또는 암의 치료용 약물의 제조에 있어서 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제11항의 변형된 약물 분자의 용도.
  17. 제16항에 있어서, 상기 종양 또는 암은 결장암(colon cancer)인 것인, 용도.
  18. 종양 또는 암의 치료를 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제11항의 변형된 약물 분자의 용도.
  19. 제18항에 있어서, 상기 종양 또는 암은 결장암인 것인, 용도.
  20. 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 제1항 내지 10항의 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제11항의 변형된 약물 분자를 포함하는, 약제학적 조성물.
  21. 약제학적 배합물로서, 제20항의 약제학적 조성물과 하나 이상의 다른 치료제를 포함하는, 약제학적 배합물.
  22. 키트로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제11항의 변형된 약물 분자, 제20항의 약제학적 조성물 또는 제21항의 약제학적 배합물을 포함하며, 바람직하게는 투여 장치를 더 포함하는 것인, 키트.
  23. 종양 또는 암 치료 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분리된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제11항의 변형된 약물 분자, 또는 제20항의 약제학적 조성물, 또는 제21항의 약제학적 배합물, 또는 제22항의 키트의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 이로 인해 종양 또는 암을 치료하며, 바람직하게는 상기 종양 또는 암은 결장암인 것인, 치료 방법.

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