CN116036266A - 抗-pd-1抗体及其在制备治疗结肠癌患者的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗‑PD‑1抗体或其抗原结合片段在治疗结肠癌中的用途。为结肠癌的治疗提供了一种新的途径。
Description
技术领域
本发明属于抗体领域，具体的说，涉及一种抗-PD-1抗体及其在制备治疗结肠癌患者的药物中的用途。
背景技术
结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，结肠癌与人们食用红肉（如牛肉）有着很大的相关性。好发于直肠与乙状结肠交界处，以40～50岁年龄组发病率最高，男女之比为2～3：1。发病率占胃肠道肿瘤的第3位。结肠癌主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌。大体形态呈息肉状、溃疡型等。结肠癌可沿肠壁环行发展，沿肠管纵径上下蔓延或向肠壁深层浸润，除经***、血流转移和局部侵犯外，还可向腹腔内种植或沿缝线、切口面扩散转移。慢性结肠炎患者、结肠息肉患者、男性肥胖者等为易感人群。
目前，结肠癌采取以手术治疗为主，化疗、放疗为辅的综合治疗方式。然而，这些治疗方式引起的胃肠道紊乱、病灶转移、复发、感染和脱发等多种不良反应严重影响了患者的生存质量。
由于结肠癌早期没有特异性症状，临床诊断时半数以上患者已属中晚期，目前治疗仍主要以手术加化疗为主,但是结肠癌术后接受了辅助化疗的患者中仍有很大一部分因复发转移而死亡。人们对结肠癌的发病机制及诊断治疗方法的认识还远远不够全面、细致。随着医学的发展，近10年来，随着肿瘤免疫治疗研究不断深入，免疫学、分子生物学等学科不断发展，尤其是对肿瘤免疫逃逸、免疫耐受发生机制科学阐明，针对细胞免疫关键调节靶点PD-1/PD-L1、CTLA-4、LAG-3等开发的单克隆抗体取得突破性进展，并由此成为当今肿瘤免疫疗法中最重要的方法之一，具有巨大研究价值和发展潜力。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种抗-PD-1抗体及其在制备治疗结肠癌患者的药物中的用途。
为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
抗-PD-1抗体或其抗原结合片段在制备治疗结肠癌患者的药物中的用途，其中，所述抗体或其抗原结合片段包括：
重链可变区，其包括SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ IDNO:3所示的CDR3；和轻链可变区，其包括SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其是全人源单克隆抗体。
进一步的，所述抗体或其抗原结合片段，其中所述全人源单克隆抗体由转基因大鼠生产。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其阻断人PD-1与其配体结合，并且因此提供以下活性中的至少一个：
a)在CD4+ T细胞中诱导IL-2的产生；
b)在CD4+ T细胞中诱导IFNγ的产生；
c)诱导CD4+ T细胞的增殖；以及
d)逆转Treg抑制功能。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其是双功能抗体(diabody)、scFv、scFv二聚体、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv '、Fv片段、Fab、Fab '或F(ab ')2。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，所述双功能抗体是BsFv或ds双功能抗体(ds diabody)。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括免疫球蛋白恒定区。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括缀合物。
本发明的有益效果：本发明提供了一种抗PD-1抗体，为结肠癌的治疗提供了一种新的途径。
附图说明
图1是本发明中hPD-1 KIMC38荷瘤鼠在受试药和对照药治疗中的体重变化曲线；
图2是本发明中hPD-1 KIMC38荷瘤鼠受试药和对照药治疗中的肿瘤体积变化曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例1：抗体杂交瘤的生成
1 .1免疫原的生成
合成编码PD-1和PD-L1的ECD的或二者全长的DNA并***表达载体pcDNA3 .3。大量制备质粒DNA并经测序验证***的DNA序列。PD-1ECD和PD-L1ECD的融合蛋白包含多种标记，包括人源Fc、小鼠Fc和His标记，所述融合蛋白通过将人PD-1ECD基因转染进入CHO-S或HEK293细胞制备。5天后，将从所述瞬时转染的细胞培养中收获的上清液用于 蛋白纯化。将所述融合蛋白纯化并定量以用于免疫和筛选。
1 .2建立稳定细胞系
为了获得用于抗体筛选和验证的工具，建立了PD-1和PD-L1转染细胞系。简言之，根据厂商说明书使用Lipofectamine 2000转染试剂盒将含有全长PD-1或PD-L1的pCND3 .3表达载体转染CHO-K1、293F或Ba/F3细胞。转染后48-72小时，在含有用于选择的杀稻瘟菌素(Blasticidin)或G418的培养基中培养所述转染细胞。一段时间后，会选择出在基因组DNA中稳定掺入了PD-1或PD-L1基因的细胞。同时，验证所述细胞是否具有目的基因PD-1和PD-L1的表达。一旦验证了所述表达，通过有限的稀释挑选目的单个克隆并放大到大容量。随后将建立的单克隆细胞系在含有低剂量抗生素杀稻瘟菌素(Blasticidin)或G418的培养基中维持。
1 .3抗体杂交瘤的建立
1 .3 .1免疫和细胞融合：使用8-1 0周龄 O M T-大鼠 (获自 O pen M o n o cl o na l Technology ,Inc .,Palo Alto ,US)用10μg TiterMax中的人源PD-1ECD蛋白在足垫上进行初次激发免疫，每3天用铝剂配置的PD-1ECD重复进行免疫。每2周对大鼠取血收集血清并通过 ELISA或FACS测试测定抗体滴度。当所述抗体滴度达到足够高时，对大鼠给予最后的不含佐 剂的激发(加入100μl 1XPBS替代)，按如下步骤进行细胞融合：将从免疫的OMT-大鼠的***中分离的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合(以1:1比例)。用5-10ml ECF溶液洗涤并悬浮细胞混合物。加入ECF溶液将浓度调整至2x106细胞/ml。在细胞电融合后，将融合室中的细胞悬液立即转移进入含有更多体积培养基的无菌管中。在37℃培养超过24小时后，将所述细胞悬液混合并移液入96孔板(0 .5x106细胞/板)。在37℃、5％CO2条件下培养细胞。当所述克隆足够大时，将100μl上清液从96孔板转移用于抗体筛选测试。
1 .3 .2杂交瘤上清液的第一轮和确认筛选：使用ELISA测试作为第一轮筛选方法以测试杂交瘤上清液与PD-1蛋白的结合。简言之，用1μg/ml的人源PD-1胞外结构域的可溶性蛋白在4℃包被平板过夜。在封闭和洗涤后，将所述杂交瘤上清液转移至所述包被的平板并在室温下孵育1小时。之后洗涤所述平板并随后用山羊抗大鼠IgG1HRP(Bethyl)和山羊抗大鼠IgG2b HRP(Bethyl)的二抗孵育45分钟。洗涤后，加入TMB底物并用2M HCl终止反应。使用 酶标仪(Molecular Device)读取450nm处的吸收光值。为了确认PD-1抗体与在细胞膜上表 达的构象PD-1分子的天然结合，在PD-1转染的CHO-S细胞系上进行FACS分析。以1x106细胞/ ml的浓度将表达PD-1的CHO-S细胞转移至96孔U形底平板(BD)。随后将所述杂交瘤上清液转 移至所述平板并在4℃下孵育1小时。用1XPBS/1％ BSA洗涤后，加入山羊抗大鼠 FITC(Jackson Immunoresearch Lab)二抗并在4℃下与细胞避光孵育1小时。之后洗涤所述细胞并在1XPBS/1％BSA中重悬或在4％***中固定所述细胞，并以流式细胞仪(BD)分析。使用相同方法进行抗体与母本CHO-S细胞系的结合。
1 .3 .3杂交瘤亚克隆：一旦通过第一轮和确认筛选验证了特异性结合和阻断，可以使用所述阳性杂交瘤细胞系进行亚克隆。简言之，对于每个杂交瘤细胞系，将细胞进行计数并在克隆培养基中稀释至5细胞/孔、1细胞/孔和0 .5细胞/孔。将200μl/孔铺板入96孔板，一个平板为5细胞/孔，一个平板为1细胞/孔和四个平板为0 .5细胞/孔。将所有平板置于37℃、 5％CO2。孵育直至所有细胞系可以通过ELISA测试进行检查。
实施例2：抗体杂交瘤细胞测序和全人源抗体表征
2 .1抗体杂交瘤细胞测序：用Trizol试剂从单克隆杂交瘤细胞中分离RNA。用以下方案扩增PD-1抗体的VH和VL：简言之，首先如本申请描述的使用反转录酶将RNA反转录成cDNA，反应***(20μl)：
取10μl的PCR反应产物进行与pMD18-T载体的连接反应。用10μl的连接产物转化Top10感受态细胞并将所述混合物转移至按照标准方案预热的2-YT+Cab平板上，孵育过夜。使用M13-48和M13-47引物通过PCR检查阳性克隆，随后进行测序。
2 .2全人源抗体分子构建：按上文的表述将PD-1抗体的VH和VL进行扩增。所述PCR反应产物通过PCR clean-up试剂盒进行纯化并用限制性酶Pme I和BssH II在37℃消化VL和pCI载体2小时。将所述反应产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳并按照厂商说明书进行凝胶提取。用以下步骤连接经消化的VL和pCI载体：
在16℃下孵育所述混合物30分钟。用10μl反应产物进行转化和克隆增长。使用确认的克隆进行质粒pCI-VL DNA的提取。随后将所述pCI-VL载体和VH片段用Xbal和Sal I进行消化并用T4DNA连接酶在16℃下连接纯化的经消化的VH和载体30分钟。一旦经测序验证***的VL和VH的序列，使用包含全人源PD-1抗体的整个IgG的表达载体进行瞬时转染和建立稳定细胞系。
实施例3：全人源抗体的表征
3.1表面等离子体共振(SPR)测定的全动力学结合亲和性：通过SPR法使用ProteOnXPR36(Bio-Rad)对抗体与PD-1的亲和性和结合动力学进行表征。将蛋白A蛋白(Sigma)通过胺偶联固定于GLM传感芯片上(Bio-Rad)。使纯化的抗体流过传 感器芯片并被蛋白A捕获。将芯片旋转90°并用电泳缓冲液洗涤(1XPBS/0.01％ Tween20,Bio-Rad)直至基线稳定。使5个浓度的人PD-1和电泳缓冲液以流速100μL/min流经所述抗体流动单元，先为结合相流动240s，随后解离相600s。在每次运行后用pH 1.7的H3PO4再生所述芯片。使用ProteOn软件将结合和解离曲线拟 合至1:1的Langmiur结合模型。
3.2流式细胞仪(FACS)测定的PD-1抗体与细胞表面PD-1分子的结合亲和性：经FACS分析测试抗体与细胞表面PD-1的结合亲和性。以5x105细胞/ml的浓 度将表达PD-1的CHO-S细胞转移至96孔U形底平板(BD)。待测抗体用洗涤 缓冲液以1:2系列稀释(1XPBS/1％BSA)并在4℃下孵育1小时。加入二抗山羊抗-人IgG Fc FITC(3.0摩尔FITC每摩尔IgG，(Jackson Immunoresearch Lab))并在4℃下避光孵育1小时。随后洗涤一次细胞并在1XPBS/1％BSA中重悬，使用流式细胞术(BD)分析。基于被定量的小珠(QuantumTM MESF Kit(Bangs Laboratories,Inc.))， 将荧光强度转换为每个细胞上结合的分子。使用GraphpadPrism5计算KD。
3.3人PD-1抗体对T细胞增殖的作用。使用同种异体反应测试PD-1抗体对T淋巴细胞增殖的作用。在96孔U底形组织培养板中在包含10％FCS和抗生素的200μl RPMI 1640中进行原代树突细胞(DC)-刺激的MLR。将DC与1X105的同种异体总CD4+T细胞以1:10和1:100的DC:T细胞的比例混合。在存在或不存 在中和mAb的条件下进行培养：人PD-1抗体和基准抗体A和B的使用浓度为10 μg/ml。孵育测试5天，在最后16小时过程中加入1uCi/孔的[3H]胸苷。通过闪烁计数测定[3H]胸苷的掺入，用三复孔的平均[3H]胸苷掺入(每分钟计数)表示增殖反应。仅有DC的计数常规为<1000cpm。显示的结果是进行了最少5次试验的代表性的示例。
人树突细胞(DC)和以上同种异体MLR中使用的CD4+T、CD8+T和总细胞以如 下步骤从PBMC中生成：通过使用人单核细胞浓缩试剂盒(human monocyte enrichment cocktailkit)根据厂商(StemCell Meylan)的说明书经负性筛选从PBMC中纯化人单核细胞。简言之，使用Ficoll-Paque梯度从健康的供体血液中分离 PBMC。用PBS洗涤细胞两次，随后在分离缓冲液中以1X108细胞/ml重悬，并用单核细胞浓缩Ab混合物在4℃下孵育30分钟。收集通过MACS柱的未标记的单核细胞。为生成iDC，将单核细胞在含有10％FCS和抗生素的RPMI 1640的培养基中与GM-CSF(PeproTech,Rocky Hill,NJ；800U/ml)和IL-4(PeproTech；500U/ml)培养，细胞浓度为2X106细胞/ml。每天用含有GM-CSF和IL-4的培养基置换一半 的培养基。在第5天用LPS(026:B6；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO；1μg/ml)额外刺激iDC 24小时以生成成熟DC。通过根据厂商说明书(Stemsep)将PBMC与人 CD4+T、CD8+T和总T细胞浓缩混合物和磁性胶体孵育进行负性选择，纯化CD4+T、CD8+T和总T细胞。
在PD-1抗体1.7.3hAb、1.49.9hAb、1.103.11hAb、1.139.15hAb和1.153.7hAb存在或不存在的情况下，用同种异体DC刺激人CD4+T细胞。经[3H]胸苷的掺入 评估CD4+T细胞的增殖。1.7.3hAb、1.49.9hAb、1.103.11hAb、1.139.15 hAb和1.153.7hAb提高了浓度依赖的T细胞增殖。
3.4体外人源PD-1抗体对细胞因子IFNγ分泌的作用：为了评估人源PD-1 抗体对细胞因子IFNγ的产生的阻断作用，我们在同种异体-MLR中进行了IFNγ的产生的实验。简言之，根据厂商的说明书用CD4+T细胞浓缩试剂盒(CD4+T cell enrichment cocktail kit)经负性筛选将人源CD4+T细胞从PBMC中纯化出来。在 GM-CSF和IL-4中培养5天的单核细胞中生成未成熟DC，并用LPS以1μg/ml刺激过夜，分化成成熟的DC。将CD4+T细胞和iDC/mDC以10:1和100:1的T:DC比例混合。在存在或不存在人源PD-1抗体和基准抗体的情况下进行培养。5天后， 收集每个培养物的上清液测定细胞因子IFNγ。上清液中的IFNγ水平通过ELISA 测试测定。简言之，用在包被缓冲液中稀释的抗人IFNγmAb包被Maxisorp平板(0.75μg/ml；即稀释为1/1360)，50μl/孔(即对一个满的96孔板加入3.7μl的抗体至 5ml的包被缓冲液中)并在4℃孵育过夜。加入200μl/孔的封闭缓冲液2小时，以封闭多余的蛋白结合能力。准备重组IFNγ稀释液作为标准液，用完全培养基从8000pg/ml进行两倍稀释直至125pg/ml，加上只有完全培养基的情况。洗涤平板， 加入标准液和测试上清液(100μl/孔)，孵育2-4小时。加入在封闭缓冲液中的生物 素化抗-IFNγmAb(1/1333)，之后加入额外亲和素过氧化物酶。加入TMB底物进行所述反应，用2M HCl终止反应。在450nm测定吸光值。
结果显示，存在或不存在1.7.3hAb、1.49.9hAb、1.103.11hAb、1.139.15hAb 和1.153.7hAb抗体的情况下，用同种异体DC刺激人CD4+T细胞。用ELISA测定IFNγ水平。结果显示全人源PD-1抗体以剂量依赖的方式增加IFNγ的分泌。
3.5体外人源PD-1对白介素2(IL-2)的产生的作用：将CD4+T细胞和iDC/mDC以10:1和100:1的T:DC比例混合。在存在或不存在人源PD-1抗体和基准抗体的情况下进行培养。5天后，收集每个培养物的上清液测定细胞因子。上清液中的IL-2水平通过ELISA测试测定。
结果显示了在存在或不存在本申请的抗体或对照抗体的情况下，用同种异体DC刺激人CD4+T细胞。用ELISA测定IL-2水平。结果显示全人源PD-1抗体以剂量依赖的方式增加IFNγ的分泌。所述结果显示抗PD-1抗体以剂量依赖的方式增加IL-2的分泌。
3.6人源PD-1抗体通过自体抗原特异性免疫反应对细胞增殖和细胞因子的生产的作用：在本测定中，T细胞和DC细胞来自相同供体。简言之，从PBMC中纯化CD4+T细胞并在CMVpp65肽和低剂量的IL-2(20U/ml)中培养，同时，从在GM-CSF和IL-4中的相同供体的PBMC中培养的单核细胞中生成DC。5天后，用将用CMV pp65肽处理的CD4+T细胞与DC共培养，所述DC在存在或不存在人源PD-1抗体和基准抗体(作为对照)的条件下脉冲式加入pp65肽。
在第5天，从每个培养物中取100μl的上清液用于测定细胞因子IFNγ和IL-2。通过ELISA测试检测IFNγ和IL-2的产生的水平。针对脉冲式加入CMV pp65肽的DC的特异性T细胞增殖通过[3H]胸苷的掺入测定。
结果显示，PD-1抗体提高了由装载了CMV pp65肽的自体DC所刺激的浓度依赖的CMV+-CD4+T细胞的增殖。
3.7人源PD-1抗体对调节性T细胞(Tregs)抑制功能的作用：Tregs是T细胞的一个亚群，其是关键的免疫调节子，在维持自体耐受中起到关键作用。
CD4+CD25+调节性T细胞与肿瘤相关，因为在多种癌症病人中发现了增加的Tregs数量，且其与较差的预后相关。为了直接评估人源PD-1抗体对免疫抑制响应的作用，我们进行了Tregs实验。使用特异性抗-CD25微珠(Miltenyi Biotec,Auburn,CA) 和阳性或负性选择，分别分离CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞。开始时，根据厂商说明书(Stemsep)，使用人CD4+T细胞浓缩混合物和磁性胶体孵育PBMC，经负性选择纯化CD4+T细胞。之后在MACS缓冲液中重悬CD4+T细胞，在冰上与CD25+微珠孵育30分钟，洗涤并装柱。从流出溶液中收集不与柱结合的CD4+CD25-T细胞，并在使用前洗涤。随后从所述柱中恢复CD4+CD25+T细胞并在使用前洗涤。在存在或不存在10μg/ml浓度的人源PD-1抗体的条件下，将Tregs与CD4+CD25-T 细胞和DC(Treg:Teff比例为1:1)培养。不用抗体或使用同种型抗体作为阴性对照。 在第5天取所述培养物的上清液用于ELISA检测细胞因子，通过以1uCi/孔的浓度 加入[3H]胸苷并进一步培养18小时，检测细胞增殖。[3H]胸苷的掺入通过闪烁计数。结果显示所述PD-1抗体去除了Treg抑制性功能并恢复了响应的T细胞增殖和IFNγ分泌。
3.8ADCC/CDC测定：为了使健康的PD-1+细胞不需要的毒性降到最低，对选择的抗PD-1全人源抗体进行确认不含ADCC和CDC功能。
3.9ADCC：使用表达高水平细胞表面PD-1的活化T细胞作为靶细胞并用不同浓度的全人源抗体在96孔板中预孵育30分钟，随后以50:1的效应/靶细胞比例加入IL-2激活的PBMC(作为天然杀伤(NK)细胞源使用，即效应细胞)。在 37℃、5％CO2的温箱中孵育所述平板6小时。经细胞毒性检测试剂盒(Roche)测定靶细胞裂解。通过Molecular DevicesSpectraMax M5e酶标仪测定光密度。结果显示，测试的全人源抗PD-1抗体不介导ADCC。
CDC：将靶细胞(活化T细胞)、稀释的人血清补体(Quidel-A112)和不同浓度的全人源PD-1抗体在96孔板中混合。在37℃、5％CO2的温箱中孵育所述平板4小时。经CellTiterglo(Promega-G7573)测定靶细胞裂解。Rituxan(Roche)和 人B淋巴细胞细Raji(CD20阳性)作为阳性对照。数据显示PD-1抗体不介导CDC。
实施例4：抗PD-1抗体注射液在hPD1 KI小鼠结肠癌MC38模型中的药物疗效研究
目的：临床前验证在hPD-1 KI小鼠中使用抗PD-1抗体注射液治疗小鼠结肠癌MC38肿瘤模型的药效。
方法：使用hPD-1 KI鼠，受试小鼠右侧皮下接种MC38肿瘤细胞（1×106/只），建立肿瘤模型。肿瘤平均体积达到150 mm3时随机分组（Isotype control、GLS-010注射液低、高浓度组、Keytruda组，每组8只）、给药（BIW×3，i.p.）。每周2次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V = 0.5a × b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。抑瘤疗效采用T-C (天)、T/C (%)和TGI（%）评价。
结果：
1）动物体重：各组小鼠体重平稳，无明显体重降低，见图1。
2）肿瘤体积：试验药物组肿瘤体积明显减小，详见附图2和表1。
表1.抗-PD-1抗体在hPD-1KI MC38荷瘤鼠中的抑瘤效果
注释：a.数据以“平均值±标准误差”表示；
b.基于第10天数据的TGI、T/C结果及P值见括号内数值；
c.利用单因素方差分析(one-way ANOVA)方法进行各治疗组肿瘤体积间的显著性差异分析；第2-3组与第1组相比在统计学上均有显著性差异(P<0.05)，第2-4组之间无显著性差异(P>0.05)。
结论：抗PD-1抗体注射液（10 mg/kg和20 mg/kg）在hPD-1KI小鼠MC38肿瘤模型中显示有统计学显著意义的抗肿瘤作用；与阳性对照Keytruda相比，更低和等同剂量的抗PD-1抗体与之无统计学显著差异。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.抗-PD-1抗体或其抗原结合片段在制备治疗结肠癌患者的药物中的用途，其中，所述抗体或其抗原结合片段包括：
重链可变区，其包括SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3；和轻链可变区，其包括SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述用途，所述的抗体或其抗原结合片段，其是全人源单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的用途，所述抗体或其抗原结合片段，其中所述全人源单克隆抗体由转基因大鼠生产。
4.根据权利要求1所述用途，所述的抗体或其抗原结合片段，其阻断人PD-1与其配体结合，并且因此提供以下活性中的至少一个：
a)在CD4+ T细胞中诱导IL-2的产生；
b)在CD4+ T细胞中诱导IFNγ的产生；
c)诱导CD4+ T细胞的增殖；以及
d)逆转Treg抑制功能。
5.根据权利要求1所述用途，所述的抗体或其抗原结合片段，其是双功能抗体(diabody)、scFv、scFv二聚体、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv '、Fv片段、Fab、Fab '或F(ab ')2。
6.根据权利要求1所述用途，所述的抗体或其抗原结合片段，所述双功能抗体是BsFv或ds双功能抗体(ds diabody)。
7.根据权利要求1所述用途，所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括免疫球蛋白恒定区。
8.根据权利要求1所述用途，所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括缀合物。
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