BR112021012299A2 - Anticorpo anti-pd1 humanizado e uso do mesmo - Google Patents

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Abstract

anticorpo anti-pd1 humanizado e uso do mesmo. a presente invenção refere-se ao fornecimento de um anticorpo monoclonal humanizado recombinante contra o receptor-1 de morte celular programada (pd-1), ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que pode ser usado em imunoterapia de tumor ou câncer. a invenção também fornece sequências de ácidos nucleicos que codificam o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, vetores que contêm as ditas sequências de ácidos nucleicos, composições farmacêuticas e kits.

Description

“ANTICORPO ANTI-PD1 HUMANIZADO E USO DO MESMO”
CAMPO DA TÉCNICA
[0001] A presente invenção refere-se ao campo de oncologia ou imunoterapia contra câncer. De modo específico, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado recombinante contra o receptor-1 de morte celular programada (PD-1), que pode ser usado em imunoterapia contra tumor ou contra câncer. A invenção também fornece sequências de ácidos nucleicos que codificam o dito anticorpo, vetores que contêm as ditas sequências de ácidos nucleicos, composições farmacêuticas e kits.
TECNOLOGIA ANTECEDENTES
[0002] A PD-1 é uma glicoproteína transmembrana do tipo I que consiste em 288 aminoácidos com um peso molecular de aproximadamente 50 kDa e é um membro da família CD28, também conhecido como CD279. Ela funciona como um regulador de morte celular programada e é expresso principalmente na superfície de células T CD4+ e T CD8+ maduras, porém também é expresso em células T, células B exterminadoras naturais, em monócitos e em algumas células dendríticas.
[0003] A PD-1 tem dois ligantes, PD-L1 (isto é, B7-H1, também conhecido como CD274) e PD-L2 (isto é, B7-DC, também conhecido como CD273), dentre os quais os dois são moléculas de proteína transmembranares da família B7. Em termos da quantidade e da ação, o PD-L1 é o principal ligante de PD-1. O PD-L1 é expresso amplamente na superfície de vários tipos celulares, incluindo células hematopoiéticas, tais como células dendríticas, células B e células T, assim como células não hematopoiéticas, tais como células epiteliais e endoteliais. A expressão do PD-L1 na superfície de células tumorais é mostrada alta, que pode ser regulada de maneira crescente por citocinas inflamatórias, tais como IFN-γ e TNF-α. O ligante PD-L2 tem alta semelhança com o PD- L1, porém sua distribuição é relativamente limitada, expressa principalmente na superfície de células imunes, tais como macrófagos, células dendríticas e mastócitos, e sua expressão é baixa. O PD-L2 se liga ao PD-1 com maior afinidade, aproximadamente três vezes maior que a do PD-L1.
[0004] O PD-1 exerce sua função biológica ligando-se a seus ligantes, inibindo-se proliferação de célula T mediada por receptor de célula T, ativação e secreção de citocina, desse modo, suprimindo as fases iniciais e efetoras da resposta imune, mantendo a estabilidade imune e prevenindo o desenvolvimento de doenças autoimunes. Quando a PD-1 se liga a seu ligante, os resíduos de tirosina dentro do imunorreceptor motivo interruptor com base em tirosina (ITSM), um domínio de região citoplasmática de PD-1, é fosforilado, então, o ITSM fosforilado recruta a SHP-2 fosfatase, o que resulta na inibição de importantes via a jusante através de defosforilação, tais como o bloqueio da ativação de fosfoinositida 3-quinase (PI3K) e sua proteína quinase B a jusante (PKB ou Akt), a inibição do metabolismo de glicose, a produção da citocina interleucina-2 (IL-2) e a expressão da proteína antiapoptótica Bcl-xl; então, inibe a proliferação e ativação de células T e B e a secreção de imunogoblulinas, como resultado, a resposta autoimune é suprimida. As células tumorais tomam vantagem desse mecanismo imunossupressor para obter o escape imune, por meio da ligação do PD-L1 altamente expresso nas mesmas em moléculas de PD-1 na superfície de linfócitos, elas conseguem não ser reconhecidas como imunes e de serem liberadas por organismo.
[0005] Anticorpos monoclonais que têm como alvo a PD-1 são atualmente uma discussão em destaque na pesquisa de imunoterapia de tumor ou câncer. Bloqueando-se a ligação da PD-1 ao seu ligante, esses anticorpos monoclonais podem aumentar a secreção de células T e IFN-γ e IL-2 em sítios tumorais, reduzir a proporção de células supressoras derivadas de Mieloide (MDSCs), alterar o microambiente tumoral, restaurar e intensificar a função de exterminação imunológica de células T e, então, inibir o crescimento do tumor. Atualmente, a Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos aprovou a autorização da comercialização de anticorpos PD-1, incluindo Opdivo (Nivolumab genérico) da Bristol-Myers Squibb e Keytruda (Pembrolizumab genérico) da Merck &Co. Opdivo é aprovado para tratamento contra melanoma, câncer de célula não pequena, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, linfoma de Hodgkin clássico, carcinoma urotelial, carcinoma de alta instabilidade de microssatélite, carcinoma de célula renal avançada e hepatocelular carcinoma; Keytruda é aprovado para o tratamento de melanoma, câncer de célula não pequena, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, linfoma de Hodgkin clássico, carcinoma urotelial, alta instabilidade de microssatélite e câncer gástrico. Além disso, anticorpos- alvo PD-1 domésticos e internacionais em pesquisa clínica incluem REGN2810 da Regeneron/Sanofi, JS001 da Top Alliance, SHR-1210 da Hengrui, BGB-A317 da Beigene, IBI308 da Cinda e GLS-010 da Gloria/ WuXiPharmaTech e muitos outros fármacos de anticorpo anti-PD-1 e anti-PD-L1 em pesquisa pré-clínica.
[0006] Em conclusão, a pesquisa em anticorpos monoclonais que têm como alvo PD-1 conseguiu progresso de alguma maneira. No entanto, ainda há uma necessidade de produtos biológicos monoclonais de melhor eficácia, segurança e competitivos em oncologia ou imunoterapia contra câncer.
CONTEÚDO DA INVENÇÃO
[0007] Os termos usados na presente invenção e suas abreviações correspondentes são mostrados na Tabela 1. TABELA 1: GLOSSÁRIO DE TERMOS Termo Abreviação Células Dendríticas DCs Interferon-gama IFN-γ Fator de crescimento transformador TNF-α alfa Imunorreceptor motivos inibidores ITSM com base em tirosina Proteína tirosina fosfatase-2 que SHP-2 contém o domínio estrutural SH2 fosfatidilinositol 3-quinase PI3K Proteína quinase B PKB Interleucina-2 IL-2 Células supressoras derivadas de MDSC Mieloide Peroxidase de rábano HRP Região determinante de CDR complementaridade Isotiocianato de Fluoresceína FITC Citotoxicidade mediada por células ADCC dependentes de anticorpo Citotoxicidade dependente de CDC complemento Células mononucleares de sangue PBMC periférico humanas Interleucina-4 humana recombinante rhIL-4
Fator estimulador de colônias de rhGM-CSF granulócitos e macrófagos humano recombinante Soro Bovino Fetal FBS Albumina Sérica Bovina BSA
[0008] Um primeiro aspecto da presente invenção fornece um anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia leve ou uma porção da mesma e/ou uma região variável de cadeia pesada ou uma porção da mesma;
[0009] em que a região variável de cadeia leve ou uma porção da mesma compreende uma CDR1 de cadeia leve que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, uma CDR2 de cadeia leve que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 e uma CDR3 de cadeia leve que uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; e
[0010] A região variável de cadeia pesada ou porção da mesma compreende CDR1 de cadeia pesada que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, CDR2 de cadeia pesada que tem sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 e CDR3 de cadeia pesada que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
[0011] Em uma modalidade específica, o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende, consiste ou consiste essencialmente em: uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 92%, 95%, 98% ou 100% identidade de sequência com a região variável de anticorpo PD-1 de sequência de cadeia leve da SEQ ID NO:23 e uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 92%, 95%, 98% ou 100% de identidade de sequência com a região variável de anticorpo PD-1 de sequência de cadeia pesada da
SEQ ID NO:22.
[0012] Em uma modalidade particular, o dito anticorpo compreende adicionalmente uma região constante de cadeia leve e uma região constante de cadeia pesada; em uma modalidade particular, em que o dito anticorpo compreende adicionalmente uma região constante de cadeia leve e uma região constante de cadeia pesada, preferencialmente, a dita região constante de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 92%, 95%, 98% ou 100% de identidade de sequência com a região constante de cadeia leve de kappa da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25 e/ou a dita região constante de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 92%, 95%, 98% ou 100% de identidade de sequência com a região constante de cadeia pesada de IgG4 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24. Em uma modalidade específica, o dito anticorpo é um anticorpo IgG. Em uma modalidade específica, o dito anticorpo é um anticorpo IgG4.
[0013] Em uma modalidade específica, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[0014] Em uma modalidade específica, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga à proteína PD-1 humana recombinante com uma afinidade média de KD de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 pM ou mais ou quaisquer faixas com os valores supracitados como desfechos, tais como aproximadamente 20- 200 pM, ou aproximadamente 60-70 pM etc., ou quaisquer valores nos mesmos, tais como aproximadamente 64,8 pM ou aproximadamente 108 pM etc. O método para determinar a afinidade de ligação KD é conforme descrito nos exemplos do presente pedido.
[0015] Em uma modalidade específica, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a uma molécula de proteína PD-1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 ou a uma molécula de proteína que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 92%, 95%, 98% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1.
[0016] Um segundo aspecto da invenção fornece um anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma sequência de peptídeos selecionados a partir de pelo menos uma dentre a região extra da proteína PD-1 60SESFV64, 78KLAAFPEDRSQP89, 128LAPKAQI134.
[0017] Em uma modalidade específica, é fornecido um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um resíduo de aminoácido selecionado a partir de pelo menos uma dentre as regiões extracelulares E61, K78, D85, P130 da proteína PD-1.
[0018] Em uma modalidade específica, o fragmento de ligação ao antígeno está na forma de um fragmento Fv, Fab, Fab′, Fab′-SH, F(ab′)2, fragmento Fd, fragmento Fd’, molécula de anticorpo de cadeia única ou anticorpo de domínio único; em uma modalidade específica, a molécula de anticorpo de cadeia única é um scFv, di-scFv, tri-scFv, diacorpo ou scFab.
[0019] Em uma modalidade específica adicional, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo nas modalidades acima forma um conjugado covalente ou não covalente ou um fármaco de fusão recombinante de múltiplos alvos com outra molécula, desse modo, para formar uma molécula de fármaco modificada, sendo que a dita outra molécula é selecionada a partir de um pequeno composto de molécula e/ou uma biomacromolécula.
[0020] Um terceiro aspecto da invenção fornece um ácido nucleico isolado cuja sequência de nucleotídeos codifica o anticorpo e/ou fragmento de ligação a antígeno do primeiro e segundo aspectos.
[0021] Um quarto aspecto da presente invenção fornece um vetor que compreende o ácido nucleico do terceiro aspecto.
[0022] Um quinto aspecto da invenção fornece uma célula isolada que expressa o anticorpo e/ou fragmento de ligação ao antígeno do primeiro e segundo aspectos e/ou que compreende o ácido nucleico do terceiro aspecto ou o vetor do quarto aspecto.
[0023] Em uma modalidade específica, as ditas células são procariontes ou eucariontes.
[0024] Um sexto aspecto da presente invenção fornece um método para produzir o anticorpo e/ou fragmento de ligação ao antígeno do primeiro e segundo aspectos, sendo que o dito método compreende cultivar as células do quinto aspecto e purificar os ditos anticorpos.
[0025] Um sétimo aspecto da presente invenção fornece o uso do anticorpo e/ou do fragmento de ligação ao antígeno e/ou molécula de fármaco modificada do primeiro e segundo aspectos para a preparação de medicamentos para o tratamento contra tumor ou câncer.
[0026] Em uma modalidade específica, o dito tumor ou câncer é câncer de cólon.
[0027] Um oitavo aspecto da presente invenção fornece o use do anticorpo e/ou fragmento de ligação ao antígeno e/ou molécula de fármaco modificada do primeiro aspecto para o tratamento contra tumor ou câncer.
[0028] Em uma modalidade específica, o dito tumor ou câncer é câncer de cólon.
[0029] Um nono aspecto da invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo e/ou fragmento de ligação ao antígeno e/ou molécula de fármaco modificada do primeiro e segundo aspectos.
[0030] Um décimo aspecto da presente invenção fornece uma combinação farmacêutica que compreende a composição farmacêutica do nono aspecto e um ou mais compostos terapeuticamente ativos.
[0031] Um décimo primeiro aspecto da presente invenção fornece um kit que compreende o anticorpo e/ou fragmento de ligação ao antígeno e/ou molécula de fármaco modificada do primeiro e segundo aspectos ou a composição farmacêutica do nono aspecto ou a combinação farmacêutica do décimo aspecto, preferencialmente, que compreende adicionalmente um dispositivo para administração.
[0032] Um décimo segundo aspecto da presente invenção fornece um método de tratamento contra tumor ou câncer que compreende administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou molécula de fármaco modificada do primeiro e segundo aspectos, ou a composição farmacêutica do nono aspecto, ou uma combinação farmacêutica do décimo aspecto, ou o kit do décimo primeiro aspecto, desse modo, tratando o dito tumor ou câncer, preferencialmente, em que o dito tumor ou câncer é câncer de cólon.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0033] Figura 1: O bloqueio do anticorpo PD1- M944 de camundongo na ligação do PD-L1 (A) e do PD-L2 (B) à proteína PD-1.
[0034] Figura 2: Detecção por ELISA da ligação do anticorpo PD1-H944 humanizado à proteína PD-1 humana recombinante (A, B, C, n=3).
[0035] Figura 3: Detecção FACS da ligação do PD1-H944 a células Jurkat/PD-1 recombinantes.
[0036] Figura 4: Ensaio Octet para afinidade de PD1-H944 (A1, B1, C1, n=3) e de Nivolumab (A2, B2, C2, n=3) com relação à proteína PD-1 humana recombinante.
[0037] Figura 5: ELISA para a ligação de PD1- H944 (A), Nivolumab (B) e controle negativo (C) à proteína PD-1 recombinante humana, de macaco de camundongo.
[0038] Figura 6: Ligação de diferentes concentrações de PD1-H944 e Nivolumab à proteína PD-1 de macaco (A) e proteína PD-1 de camundongo (B).
[0039] Figura 7: Detecção por ELISA do bloqueio na ligação de PD-L1 humano (A) e PD-L2 humano (B) à proteína PD-1 humana recombinante por PD1-H944.
[0040] Figura 8: Ensaio FACS do bloqueio na ligação da PD-L1 humano a células Jurkat/PD-1 humanas por PD1-H944.
[0041] Figura 9: ELISA da ligação de PD1-H944 à proteína CD16a recombinante.
[0042] Figura 10: ELISA da ligação de PD1-H944 à proteína C1q recombinante.
[0043] Figura 11: ELISA da ligação de PD1-H944 à proteína FcRn humana.
[0044] Figura 12: Secreção de IL-2 (topo) promovida e de IFN-γ (fundo) em um ensaio de linfonodo misturado (A, B, C são células T CD4+ de 3 doadores) pelo anticorpo PD-1.
[0045] Figura 13: Função de ativação do PD1- H944 em um sistema celular de gene repórter de PD-1 humano recombinante.
[0046] Figura 14: Função de ADCC de PD1-H944 detectada pelo sistema de gene repórter CD16a recombinante (A e B são os resultados em diferentes lotes de ensaio; C e D são os valores de intensidade de bioluminescência na concentração de anticorpos mais alta; ** indica P<0,01).
[0047] Figura 15: Efeito de CDC de PD1-H944 em células CHO-PD-1.
[0048] Figura 16: Tendência de mudanças no peso corporal do animal após administração.
[0049] Figura 17: Tendência de crescimento de volume tumoral após administração.
[0050] Figura 18: Gráfico de peso tumoral no término do ensaio (*P<0,05).
[0051] Figura 19: Gráfico sobre a tendência de peso corporal animal após administração.
[0052] Figura 20: Gráfico sobre a tendência de crescimento de volume tumoral após administração de fármaco.
[0053] Figura 21: Gráfico do peso tumoral do desfecho do ensaio.
[0054] Figura 22: Modelagem de homologia de PD1-H944 encaixadas na estrutura cristalina da PD1.
[0055] Figura 23: Um modelo da proteína PD1 que mostra o sítio de mutação.
[0056] Figura 24: A ligação de mutantes proteína PD-1 a PD-L1, Nivolumab e PD1-H944.
[0057] Figuras 25A-C: Os sítios de aminoácido onde PD1-H944, PD-L1 e Nivolumab se ligam especificamente à PD-1.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÃO
[0058] Salvo quando declarado de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o significado igual ao normalmente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual a presente invenção pertence. Para efeito da presente invenção, os termos a seguir são definidos adicionalmente.
[0059] Quando usado no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um (1)”, “um/uma”, “outro(a)” e “dito(a)” incluem o plural, salvo quando o contexto indicar claramente de outro modo.
[0060] O termo “anticorpo” se refere uma molécula de imunoglobulina e se refere a qualquer forma de anticorpo que exibe a atividade biológica desejada. Este inclui, porém sem limitação, anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais e anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e, até mesmo, fragmentos de anticorpo. Tipicamente, estruturas de anticorpo de comprimento total compreendem, preferencialmente, quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), tipicamente interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada contém uma região variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve contém uma região variável de cadeia leve e uma região constante de cadeia leve. Além dessa estrutura de anticorpo de comprimento total típica, a estrutura também inclui outras formas derivadas.
[0061] O termo “região variável” se refere ao domínio na cadeia pesada ou leve de um anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve de anticorpos naturais (VH e VL, respectivamente) têm geralmente uma estrutura semelhante e podem ser subdivididos adicionalmente em regiões altamente variáveis (denominadas de regiões de decisão complementar (CDRs)) intercaladas com mais regiões conservadas (denominadas de regiões estruturantes (FRs)).
[0062] O termo “região determinante de complementaridade” (CDR, por exemplo, CDR1, CDR2 e CDR3) se refere a tais resíduos de aminoácido na região variável de um anticorpo cuja presença é necessária para ligação a antígeno. Cada região variável tem tipicamente três regiões de CDR identificadas como CDR1, CDR2 e CDR3. Cada região determinante de complementaridade pode conter resíduos de aminoácido de uma “região determinante de complementaridade”, conforme definido por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edição Public Health Service, National Institutes of Health,
Bethesda, MD. 1991) e/ou aqueles resíduos d “alça altamente variável” (Chothia e Lesk; J MolBiol 196: 901-917 (1987)).
[0063] O termo resíduos “estruturantes” ou “FR” se referem aos resíduos dentro da região variável diferente dos resíduos de CDR, conforme definido no presente documento.
[0064] Cada região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve contém tipicamente 3 CDRs e até 4 FRs, sendo que as ditas CDRs e FRs estão dispostas a partir da extremidade amino até a extremidade carboxila na seguinte ordem, por exemplo: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4.
[0065] A região determinante de complementaridade (CDR) e a região estruturante (FR) de um determinado anticorpo pode ser identificado com o uso do sistema Kabat (Kabat et al: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edição, US Department of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publicação nº 91-3242, 1991).
[0066] O termo “região constante” se refere a tais sequências de aminoácidos nas cadeias leve e pesada de um anticorpo que não estão diretamente envolvidas na ligação do anticorpo ao antígeno, porém exibem uma variedade de funções efetoras, tais como citotoxicidade dependente de anticorpo.
[0067] De acordo com a sequência de aminoácidos da região constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos intactos podem ser classificados em cinco classes de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM dentre os quais a IgG e IgA podem ser divididas adicionalmente em subclasses (isoformas), tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.
De modo correspondente, as cadeias pesadas das cinco classes dos anticorpos são classificadas em cadeias α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As cadeias leves dos anticorpos são classificadas em κ e λ de acordo com a sequência de aminoácidos de sua região constante de cadeia leve.
[0068] Um “fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo” compreende uma porção de uma molécula de anticorpo intacta que retém pelo menos parte da especificidade de ligação do anticorpo parental e inclui, tipicamente, pelo menos uma porção da região de ligação a antígeno ou região variável (por exemplo, uma ou mais CDRs) do anticorpo parental. Exemplos de fragmentos de ligação a antígeno incluem, porém sem limitação, Fv, Fab, Fab′, Fab′- SH, F(ab′)2, fragmentos Fd, fragmentos Fd’, moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv, di-scFv ou tri-scFv, diacorpo ou scFab), anticorpos de domínio único.
[0069] Um “fragmento de anticorpo” é uma molécula de anticorpo não intacta que retém pelo menos algumas das propriedades biológicas do anticorpo parental, incluindo, porém sem limitação, um fragmento Fc, além daqueles descritos acima como “fragmentos de ligação a antígeno”.
[0070] O termo “molécula de fármaco modificada” significa um conjugado ou um fármaco de fusão recombinante de múltiplos alvos formados pela conexão covalente ou não covalente de um anticorpo ou fragmento do mesmo, tal como um fragmento de ligação ao antígeno, a outra molécula que é um pequeno composto de molécula ou biomacromolécula.
[0071] O termo anticorpos “quiméricos” se refere a anticorpos nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie específica, e o restante é derivado de uma fonte ou espécie diferente. “Anticorpos humanizados” são um subconjunto de “anticorpos quiméricos”.
[0072] O termo “anticorpo humanizados” ou “fragmento de ligação ao antígeno humanizado” é definido no presente documento como um anticorpo ou fragmento de anticorpo que é: (i) derivado de uma fonte não humana (por exemplo, um camundongo transgênico que porta um sistema imune heterólogo) e com base em uma a sequência de linhagem germinativa humana; ou (ii) um anticorpo quimérico no qual a região variável é de origem não humana e a região constante é de origem humana; ou (iii) um transplante de CDR em que a CDR da região variável é de origem não humana e uma ou mais regiões estruturantes da região variável são de origem humana e a região constante, caso haja, é de origem humana. A meta da “Humanização” é elimina a imunogenicidade de anticorpos de origem não humana no corpo humano ao mesmo tempo que é mantida a melhor afinidade possível. É vantajoso selecionar a sequência estruturante humana que é a mais semelhante à sequência estruturante da fonte não humana anticorpo como o molde para humanização. Em alguns casos, pode ser necessário substituir um ou mais aminoácidos na sequência estruturante humana por resíduos correspondentes no construto não humano a fim de evitar perda de afinidade.
[0073] O termo “anticorpo monoclonal” se refere a um anticorpo derivado de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, isto é, todo a cada anticorpo compreendido na população é idêntico com exceção de possíveis mutações (por exemplo, mutações naturais) que podem estar presentes em quantidades muito pequenas. Portanto, o termo “monoclonal” indica a natureza do anticorpo em questão, isto é, não uma mistura de anticorpos não relacionados. Diferentemente de preparações de anticorpo policlonais, que normalmente compreendem anticorpos diferentes contra epítopos diferentes, cada anticorpo monoclonal, em uma preparação de anticorpo monoclonal, é direcionado a um único epítopo no antígeno. Além de sua especificidade, as preparações de anticorpo monoclonal têm a vantagem de que normalmente não são contaminados por outros anticorpos. O termo “monoclonal” deve ser entendido como sendo necessária a produção dos ditos anticorpos por qualquer método específico. O termo anticorpo monoclonal inclui especificamente anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos humanos.
[0074] O anticorpo “se liga especificamente” a um antígeno-alvo, tal como um alvo de antígeno de peptídeo associado a tumor (nesse caso, PD-1), isto é, se liga ao dito antígeno com afinidade suficiente para possibilitar que o dito anticorpo seja usado como um agente terapêutico, tenha como alvo uma célula ou tecido que expressa o dito antígeno e não necessariamente reage de maneira cruzada significativamente com outras proteínas ou não reage de maneira cruzada significativamente com proteínas diferentes de dos homólogos e das variantes das proteínas-alvo mencionadas acima (por exemplo, formas mutantes, variantes de splice ou formas truncadas de hidrólise de proteína).
[0075] O termo “afinidade de ligação” se refere à força da soma das interações não covalentes entre os sítios de ligação individuais de uma molécula e seus parceiros de ligação. Salvo quando declarado de outro modo, “a afinidade de ligação”, quando usada no presente documento, se refere à afinidade de ligação intrínseca, que reflete uma interação 1:1 entre os membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). “KD”, “constante de taxa de ligação kon” e “constante de taxa de dissociação koff” são usadas comumente para descrever a afinidade entre a molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Afinidade, isto é, o grau preciso no qual um ligante se liga a uma proteína específico. A afinidade de ligação é influenciada por interações intermoleculares não covalentes, tais como ligação de hidrogênio, interações eletrostáticas, hidrofóbicas e forças de van der Waals entre duas moléculas. Além disso, a afinidade de ligação entre um ligante e sua molécula-alvo pode ser influenciado pela presença de outras moléculas. Afinidade pode ser analisada por métodos convencionais conhecidos na técnica, incluindo o ELISA descrito no presente documento.
[0076] O termo “epítopo” inclui qualquer grupamento determinante de qualquer proteína que se liga especificamente a um anticorpo ou receptor de célula T. Os grupamentos determinantes de epítopos consistem tipicamente em grupos de superfície quimicamente ativos de uma molécula (por exemplo, cadeias laterais de aminoácido ou de açúcar ou uma combinação dos mesmos) e têm até mesmo recursos estruturais tridimensionais específicos assim como características de carga específicas.
[0077] Um anticorpo “isolado” é um anticorpo que foi identificado e isolado de uma célula que expressa naturalmente o anticorpo. Os anticorpos isolados incluem anticorpos in situ em células e anticorpos recombinantes que são preparados tipicamente por pelo menos uma etapa de purificação.
[0078] “Identidade de sequência” entre duas sequências de polipeptídeos ou de ácidos nucleicos indica o número de resíduos que são idênticos entre as ditas sequências como uma porcentagem do número total de resíduos. Durante o cálculo da identidade de porcentagem, as sequências que são alinhadas são pareadas de modo que produzam um pareamento máximo entre as sequências, em que as lacunas no pareamento (caso estejam presentes) são solucionadas por um algoritmo específico. Os métodos de programas de computador preferenciais para determinar a identidade entre duas sequências incluem, porém sem limitação, pacotes de programa de GCG que incluem GAP, BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410). Os procedimentos acima estão publicamente disponíveis junto ao Centro Internacional para Informações de Biotecnologia (NCBI) e outras fontes. O algoritmo de Smith Waterman bem conhecido também pode ser usado para determinar identidade.
[0079] O termo “receptor Fc” ou “FcR” se refere a um receptor que se liga à região de Fc de um anticorpo. Os FcRs humanos de sequências natural são preferenciais e, preferencialmente, receptores que se ligam a anticorpos de IgG (receptores gama), que incluem as isoformas FcγRI, FcγRII e FcγRIII, assim como variantes desses receptores. Todos os outros FcRs estão incluídos no termo “FcR”. O termo também inclui o receptor neonatal (FcRn), que é responsável pelo transporte de IgG maternal ao feto (Guyer et al, Journal of
Immunology 117: 587 (1976) e Kim et al, Journal of Immunology 24: 249 (1994)).
[0080] O termo “receptor neonatal Fc”, abreviado como “FcRn”, se liga à região Fc dos anticorpos de IgG. O receptor neonatal Fc (FcRn) exerce uma importante função no destino metabólico de anticorpos do tipo IgG in vivo. O FcRn funciona para resgatar a forma de IgG da via de degradação lisossomal, desse modo, reduzindo sua depuração no soro aumentando sua meia-vida. Portanto, as propriedades/características de FcRn in vitro de IgG são indicativas de suas propriedades farmacocinéticas in vivo na circulação.
[0081] O termo “função efetora” se refere àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam de isótipo para isótipo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem ligação a C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação ao receptor Fc, citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), secreção de citocina, absorção mediada por complexo imune de antígeno por células apresentadoras de antígeno, regulação decrescente de receptores em superfície celular (por exemplo, receptores de célula B) e ativação de célula B.
[0082] O termo “célula efetora” se refere a um leucócito que expressa um ou mais FcR e realiza funções efetoras. Em um aspecto, as ditas células efetoras expressam pelo menos o FcγRIII e realizam funções efetoras de ADCC. Os exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs),
células exterminadoras naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos. As células efetoras podem ser isoladas de fontes naturais, por exemplo, do sangue. As células efetoras são normalmente linfócitos associados à fase e função efetoras para produzir citocinas (células T auxiliares), células exterminadoras infectadas por patógenos (células T citotóxicas) ou anticorpos secretados (células B diferenciadas).
[0083] “Células imunes” incluem células que têm uma origem hematopoiética e exercem uma função na resposta imune. Células imunes incluem: linfócitos, tais como células B e células T; células exterminadoras naturais; e células mieloides, tais como monócitos, macrófagos, eosinófilos, mastócitos, basófilos e granulócitos.
[0084] “Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo” ou “ADCC” se referem a uma forma de citotoxicidade na qual a Ig secretada se liga a receptores de Fcγ apresentados em determinadas células citotóxicas (por exemplo, células NK, neutrófilos e macrófagos) e que permite que essas células citotóxicas efetoras se liguem especificamente a células-alvo portadoras de antígenos e, subsequentemente, exterminam as ditas células-alvo com o uso, por exemplo, de uma citotoxina. A fim de avaliar a atividade de ADCC do anticorpo-alvo, podem ser realizados ensaios ADCC in vitro, tais como, ensaios ADCC in vitro documentados na Patente n° U.S. 5.500.362 ou 5.821.337 ou na Patente n° U.S. 6.7376.056 (Presta), os métodos são documentados nas modalidades do presente pedido. As células efetoras úteis para uso em tais ensaios incluem PBMCs e células NK.
[0085] “Citotoxicidade dependente de complemento” ou “CDC” se refere à lise de células-alvo na presença do complemento. A ativação da via de complemento clássica é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a um anticorpo (da subclasse apropriada), na qual o anticorpo se liga a seu antígeno correspondente. A fim de avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC pode ser realizado, tal como o ensaio de CDC recitado em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol Methods 202: 163 (1996), por exemplo, o método documento nas modalidades do presente pedido, por exemplo, na Patente n° U.S. 6.194.551 Bl e no documento WO1999/51642, em que as variantes de polipeptídeo têm sequências de aminoácidos alteradas da região Fc (polipeptídeos que têm uma região Fc variante) e variantes de polipeptídeo que têm ligações intensificadas ou reduzidas são descritas.
A SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS E A SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO ANTICORPO DA INVENÇÃO
[0086] A presente invenção usou a proteína PD- 1 humana recombinante para imunizar camundongos e, em seguida, obteve um clone de anticorpo M944 scFv que se liga especificamente à PD-1 humana recombinante com alta afinidade por uma triagem de biblioteca de anticorpo-fago. Em seguida, as sequências de nucleotídeos que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo M944 scFv foram montadas por PCR com aquelas que codificam a região constante de cadeia pesada de IgG1 de camundongo, e a região constante de cadeia leve de kappa de camundongo, respectivamente, e a sequência montada resultante foram inseridas no vetor de expressão transiente HEK-293 cultivados para expressão. O anticorpo PD1-M944 de camundongo de alta pureza foi purificado com o uso de uma coluna de purificação de proteína A. O ELISA mostrou que o anticorpo PD1-M944 de camundongo pôde bloquear a ligação de PD-1 a seus ligante.
[0087] Em seguida, com o uso do método clássico para transplante de CDR humanizada, uma região variável de cadeia leve ou de cadeia pesada de anticorpo humano mais próxima da região variável de cadeia leve ou de cadeia pesada de camundongo foi eleita como o molde. Em uma modalidade, IGKV3-11*01 é eleito como o molde de humanização da região variável de cadeia leve, ao passo que IGHV3-21*02 foi eleito como a região variável de cadeia pesada. As sequências de região variável de cadeia leve humanizada (VL) e de região variável de cadeia pesada (VH) foram obtidas inserindo-se cada uma das três CDRs da cadeia leve/cadeia pesada de anticorpo de camundongo nas posições correspondentes dos moldes humanos acima. Uma vez que o sítio principal da região estruturante de camundongo é essencial para sustentar a atividade da CDR, o sítio principal foi submetido à mutação reversa para a sequência do anticorpo de camundongo. A sequência de aminoácidos e a sequência de nucleotídeos do anticorpo PD1-H944 humanizado foram obtidas submetendo-se a splicing sequencial a sequência de peptídeos sinal de cadeia leve/cadeia pesada, a sequência da região variável da cadeia leve/cadeia pesada do anticorpo humanizados submetidos à mutação reversa e a sequência da região constante de cadeia pesada de IgG4 humana/da região constante de cadeia leve de kappa humana, respectivamente.
ÁCIDOS NUCLEICOS DA PRESENTE INVENÇÃO
[0088] A presente invenção também se refere a moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos ou porções dos mesmos da presente invenção. As sequências dessas moléculas de ácido nucleico incluem, porém sem limitação, as SEQ ID NO: 3-7 e 26-33.
[0089] As moléculas de ácido nucleico da presente invenção não se limitam às sequências reveladas no presente documento, pois também incluem variantes das mesmas. As variantes da presente invenção podem ser descritas com referência às propriedades físicas na hibridização. Será reconhecido pelas pessoas versadas na técnica que, com o uso de técnicas de hibridização de ácido nucleico, ácidos nucleicos podem ser usados para identificar seus complementos assim como seus equivalentes ou homólogos. Será reconhecido, também, que a hibridização pode ocorrer em uma complementaridade menor que 100%. No entanto, dada a escolha apropriada das condições, as técnicas de hibridização podem ser usadas para distinguir as ditas sequências de DNA com base na relevância estrutural da sequência de DNA para uma sonda particular. Para orientação em tais condições, consultar Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edição Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989 e Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. edições (1995). Current Protocols in Molecular Biology. Nova Iorque: John Wiley e Sons.
VETORES E EXPRESSÃO RECOMBINANTE
[0090] A presente invenção também fornece construtos recombinantes que compreendem uma ou mais sequências de nucleotídeos da presente invenção. Os construtos recombinantes da invenção podem ser usados com vetores, sendo os ditos vetores, por exemplo, são vetores plasmídicos, de fagomídeos, de fagos ou virais, e as moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos da invenção são inseridas nos ditos vetores.
[0091] Os anticorpos fornecidos no presente documento podem ser preparados expressando-se de maneira recombinante as sequências de nucleotídeos que codificam as cadeias leve e pesada ou porções das mesmas em uma célula hospedeira. A fim de expressar de maneira recombinante o anticorpo, a célula hospedeira pode ser submetida à transfecção com um ou mais vetores de expressão recombinante que portam as sequências de nucleotídeos que codificam as cadeias leve e/ou pesada ou porções dois mesmos, de modo que as ditas cadeias leve e pesada sejam expressas na dita célula hospedeira. Metodologias de DNA recombinante padrão DNA são usadas para preparar e/ou obter ácidos nucleicos que codificam cadeias pesada e leve para incorporar esses ácidos nucleicos em vetores de expressão recombinante e introduzir os ditos vetores em células hospedeiras, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis (edições), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (edições) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) e aquelas documentados na Patente n° U.S.
4.816.397 de Boss et al.
[0092] Além disso, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da dita cadeia pesada e/ou leve pode ser convertida em uma sequência de nucleotídeos que codifica, por exemplo, uma cadeia de anticorpo de comprimento total, um fragmento Fab ou um ScFv: por exemplo, um fragmento de DNA que codifica uma região variável da cadeia leve ou uma região variável da cadeia pesada pode ser ligado de maneira operacional (de modo que as sequências de aminoácidos codificadas tanto pelos ditos fragmentos de DNA estão no quadro) a outro fragmento de DNA que codifica, por exemplo, uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. As sequências das regiões constantes de cadeia leve e pesada humanas são conhecidas na técnica (consultar, por exemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos, Publicação NIH n° 91-3242), e fragmentos de DNA que incluem essas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão.
[0093] A fim de expressas os anticorpos, métodos de expressão de DNA recombinante padrão podem ser usados (consultar, por exemplo, Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia. (1990)). Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo desejado pode ser inserida em um vetor de expressão, que é submetido subsequentemente à transfecção em uma célula hospedeira adequada. As células hospedeiras adequadas são células procariontes ou eucarionte. Exemplos de células hospedeiras procariontes são bactérias, e exemplos de células hospedeiras eucariontes são células de levedura, de insetos ou de mamíferos. Deve-se entender que o modelo de um vetor de expressão que inclui a seleção de uma sequência reguladora é determinado por um número de fatores, tais como a escolha de célula hospedeira, o nível de expressão da proteína desejada e se a expressão é constitutiva ou induzível.
[0094] Os anticorpos da presente invenção podem ser recuperados e purificados de culturas de células recombinantes por métodos bem conhecidos, sendo que os ditos métodos bem conhecidos incluem, porém sem limitação, sulfato de amônio ou precipitação de etanol, extração de ácido, cromatografia de afinidade com proteína A, cromatografia de afinidade com proteína G, cromatografia por troca aniônica ou catiônica, cromatografia de fosfato de celulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxiapatita e cromatografia de lectina. A cromatografia líquida de alto desempenho (“HPLC”) também pode ser usada para purificação. Consultar, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, ou Current Protocols in protein Science, John Wiley e Sons, NY, N.Y., (1997- 2001), por exemplo, capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10, dentre os quais cada um é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0095] Os anticorpos da presente invenção incluem produtos purificado naturalmente, produtos de métodos sintéticos químicos e produtos produzidos por técnicas recombinantes de hospedeiros procariontes e eucariontes, sendo que os ditos hospedeiros eucariontes incluem, por exemplo, células de levedura, de planta superiores, de insetos e de mamíferos. Os anticorpos da invenção podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Tais métodos são documentos em manuais laboratoriais padrão, por exemplo, Sambrook, acima, seções
17.37-17.42; Ausubel, acima, capítulos 10, 12, 13, 16, 18 e
20.
[0096] Desse modo, as modalidades da invenção também podem ser células hospedeiras que compreendem o dito vetor ou moléculas de ácido nucleico, em que as ditas células hospedeiras podem ser células hospedeiras eucariontes superiores, tais como células de mamífero, células hospedeiras eucariontes inferiores, tais como células de levedura, e podem ser células procariontes, tais como células bacterianas.
AS PROPRIEDADES E FUNÇÕES DAS FUNÇÕES DOS ANTICORPOS DA INVENÇÃO
[0097] Análises de propriedade e de função do dito anticorpo PD1-H944 foram realizadas. As análises mostraram que o anticorpo da presente invenção tem as seguintes vantagens: (1) tem capacidade para se ligar a PD- 1 humana com altas afinidade e especificidade e tem uma baixa taxa de dissociação, fornecendo, então, boa eficácia antitumoral; (2) tem capacidade para bloquear a ligação de PD-L1 a PD-1 mais completamente que o Nivolumab; (3) quando comparado a Nivolumab, se liga à PD-1 humana recombinante com mais sensibilidade e mais especificidade; comparavelmente, se liga de maneira cruzada à PD-1 de macaco recombinante, embora não se ligue à PD-1 de camundongo; (4) tem capacidade para bloquear a ligação de PD-1 humana recombinante a seus ligantes Pd-L1 e Pd-L2 com eficácia, (5) tem capacidade para reativar com eficácia as células T imunossuprimidas e ativar o sistema de células repórteres de PD-1 humana recombinante; (6) exibe um efeito supressivo de tumor excelente no modelo de camundongo de PD-1 humanizado portador de tumor de câncer de cólon MC38, muito melhor que aquele do Nivolumab (Sino Biological, Inc.) e em comparação àquele do Pembrolizumab (Sino Biological, Inc.); (7) exibe baixas atividades tanto de ADCC quanto de CDC, ao passo que sua atividade de ADCC é inferior àquela do Nivolumab.
USOS
[0098] Os anticorpos da presente invenção podem ser usados para tratar uma variedade de tumores ou cânceres ou preparar medicamentos para o tratamento contra uma variedade de tumores ou cânceres, tendo como alvo especificamente receptores de PD-1 expressos de maneira anormal. Exemplos não limitativos dos ditos tumores ou cânceres incluem câncer de cólon.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[0099] Os anticorpos da invenção podem ser preparados com pelo menos um outro agente (por exemplo, um composto estabilizante) para formar composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo da invenção e um ou mais carreadores ou diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
KITS
[0100] A presente invenção também se refere a embalagens farmacêuticas e a kits que compreendem um ou mais recipientes, sendo que os ditos recipientes contêm as composições farmacêuticas supracitadas da presente invenção. Associadas a tais recipientes podem estar as especificações na forma prescritas pelo órgão que governa a fabricação, uso ou distribuição do fármaco ou produto biológico, o que reflete aprovação para administração humana pelo órgão no qual o dito produto é fabricado, usado ou distribuído.
PREPARAÇÃO E ARMAZENAMENTO
[0101] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser preparadas da maneira conhecida na técnica, por exemplo, por métodos convencionais de mistura, dissolução, granulação, preparação de pastilha, trituração, emulsificação, encapsulação, incorporação ou liofilização.
[0102] Após serem preparadas, as composições farmacêuticas que compreendem os compostos da presente invenção formuladas em um carreador aceitável podem ser colocadas em recipientes apropriados e rotuladas para o tratamento contra a afecção indicada. Tal rotulação indica a quantidade, frequência e rotas de administração do fármaco.
COMBINAÇÕES
[0103] As composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos da presente invenção descritos acima também são combinadas com um ou mais outros agentes terapêuticos, tais como agentes antineoplásticos, em que a combinação resultante não causa efeitos adversos inaceitáveis.
[0104] Os exemplos a seguir são usados para ilustrar a invenção de maneira exemplificativa e não devem limitar a invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: TRIAGEM PARA ANTICORPOS DERIVADOS DE CAMUNDONGOS QUE BLOQUEIAM A LIGAÇÃO DE PD-1 AO PD-L1/PD-L2 COM O USO DE UMA BIBLIOTECA DE EXIBIÇÃO DE ANTICORPO-FAGO
1.1 IMUNIZAÇÃO DOS CAMUNDONGOS
[0105] A proteína PD-1 humana recombinante (Sino Biological, Inc, Cat. 10377-H08H) foi usada para imunizar os camundongos. A sequência de aminoácidos da região extracelular dessa proteína PD-1 humana (UniProtKB Q15116)
é Met1-Gln167 (SEQ ID NO: 1).
[0106] A proteína PD-1 humana recombinante foi misturada com adjuvante de Freund, e a mistura que foi administrada por via subcutânea nos intervalos de 2 semanas, 3 semanas, 2 semanas e 3 semanas foi usada para imunizar camundongos 5 vezes a uma dose de 20 μg, cada. Da segunda imunização em diante, o sangue foi coletado sete ditas após cada imunização por meio do plexo do canto medial do olho. A titulação sérica da anti-PD-1 de camundongo foi medida por ELISA com o uso da proteína PD-1 humana recombinante revestida. A titulação sérica atingiu diluição de 8000 vezes após a quinta imunização, e os camundongos foram reforçados por via intravenosa com 25 μg da proteína PD-1 humana recombinante 9 semanas após a quinta imunização. 4 dias depois, os camundongos foram executados, e o baço foi congelado em nitrogênio líquido.
1.2 TRIAGEM DE BIBLIOTECA DE EXIBIÇÃO DE FAGO
[0107] O RNA foi extraído do tecido de baço de camundongo com o uso do Reagente de Isolamento Tripure (Roche), e o cDNA foi obtido por transcrição reversa com o uso de um kit de transcrição reversa (Invitrogen). As sequências de nucleotídeos respectivas que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo de camundongo foram amplificadas e montadas na sequência de nucleotídeos que codificam o scFv da mesma por meio do método de PCR de extensão de sobreposição, em que as sequências de nucleotídeos respectivas que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e pesada foram ligadas por meio de um ligante, TCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTGGTGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC(SEQ ID NO:2) (Ref: Rapid PCR-cloning of full-length mouse immunoglobulin variable regions; Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction T Joneset.al Bio/Technolgy 9(6):579, julho de 1991), em seguida, ligadas de maneira enzimática no vetor de fago pComb3x (Sino Biological, Inc.) pela endonuclease de restrição Sfi I (Fermentas) e, em seguida, eletrotransformaram o X-Blue competente para construir uma biblioteca de anticorpo scFv de exibição de fago para camundongos imunizados. Revestindo-se a proteína PD-1 humana recombinante em placas de ELISA, uma biblioteca de fago enriquecida com anticorpo positivo anti-PD-1 foi obtida seguindo o processo de panning de anticorpo de fago (Ref: Antibody Phage Display: Methods and Protocols, Philippa M. O’Brien and Robert Aitken (Edições), Humana Press, ISBN: 9780896037113). Fagos monoclonais foram selecionados a partir da biblioteca enriquecida, expressos e, em seguida, foi testada a ligação dos mesmos à proteína PD-1 humana recombinante por ELISA. Um clone do anticorpo M944 scFv de alta capacidade de ligação que se liga especificamente à PD- 1 humana recombinante foi eleito e comissionado para uma empresa de sequenciamento para sequenciar a sequência de nucleotídeos do anticorpo M944 scFv (SEQ ID NO:3).
1.3 PRODUÇÃO DO ANTICORPO PD1-M944 DE CAMUNDONGO
[0108] As sequências de nucleotídeos das regiões variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo M944 scFv (SEQ ID NO: 4/5) foram montadas com as sequências de nucleotídeos da região constante de cadeia pesada de IgG1 de camundongo (SEQ ID NO: 6) e a região constante de cadeia leve de kappa de camundongo (SEQ ID NO: 7), respectivamente, por PCR. Em seguida, as sequências de nucleotídeos resultantes foram cortadas de maneira enzimática por Hind III e Xba I (Fermentas)e inseridas no vetor de expressão transiente pSTEP2 (Sino Biological, Inc), e os plasmídeos foram extraídos e transferidos em células HEK-293 durante 7 dias. O sobrenadante de cultura foi purificado com coluna de proteína A para anticorpo de alta pureza.
1.4 ENSAIO FUNCIONAL DE ANTICORPO PD1-M944 DE CAMUNDONGO
[0109] (1) Bloqueio da ligação de PD-1 humana recombinante ao PD-L1: A proteína PD-1 humana recombinante em uma concentração de 1 μg/ml foi revestida em uma placa com 96 poços a 100 μl por poço de um dia para o outro a 4 °C. As placas foram lavadas no dia seguinte e bloqueadas à temperatura ambiente durante 1 hora. 100 μl de 10 μg/ml da proteína PD-L1-Fc-biotina biotinilada (SinoBiological, Inc.) foram coincubados com diferentes concentrações (0,4 μg/ml, 2 μg/ml e 10 μg/ml) de PD1-M944 ou Nivolumab (Sino Biological, Inc). As placas foram lavadas para remover anticorpos não ligados. As placas foram incubadas com estreptavidina/HRP antibiótica (Beijing Zhong Shan -Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd) e, em seguida, lavadas várias vezes, e a solução cromatográfica de substrato foi adicionada para desenvolvimento de cor. A OD450 foi detectada após o término. Os resultados mostraram que a proteína PD- L1 recombinante pode se ligar com eficácia à proteína PD-1 revestida, e a ligação da proteína PD-L1 recombinante à PD- 1 foi inibida com eficácia pela adição de diferentes concentrações de PD1-M944 ou Nivolumab (Figura 1A). Esse resultado indica que o anticorpo PD1-M944 de camundongo tem uma boa função de bloquear a ligação da PD-1 a seu ligante PD-L1.
[0110] (2) Bloqueio da ligação de PD-1 humana recombinante ao PD-L2: A proteína PD-1 humana recombinante a uma concentração de 1 μg/ml foi revestida em uma placa com 96 poços a 100 μl por poço, de um dia para o outro a 4 °C, de um dia para o outro, lavada no dia seguinte e bloqueada à temperatura ambiente durante 1 hora. 100 μl de 0,5 μg/ml da proteína PD-L2-Fc-biotina biotinilada (Sino Biological, Inc.) foi coincubada com diferentes concentrações (0,5 μg/ml, 2,5 μg/ml e 12,5 μg/ml) de PD1-M944 ou Nivolumab (Sino Biological, Inc.). As placas foram lavadas para remover anticorpos, incubados com estreptavidina/HRP antibiótica (Beijing Zhong Shan-Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd), lavada várias vezes, e a solução cromatográfica de substrato foi adicionada para desenvolvimento de cor, e a OD450 foi detectada após o término. Os resultados mostraram que a proteína PD-L2 recombinante pode se ligar com eficácia à proteína PD-1 revestida, e a ligação da proteína PD-L2 recombinante à PD-1 foi inibida com eficácia pela adição de diferentes concentrações de PD1-M944 ou Nivolumab (Figura 1B). Esse resultado indica que o anticorpo PD1-M944 de camundongo tem uma boa função de bloquear a ligação da PD-1 a seu ligante PD-L2. EXEMPLO 2: HUMANIZAÇÃO DA SEQUÊNCIA DO ANTICORPO PD1-M944 DE CAMUNDONGO PARA PRODUZIR A SEQUÊNCIA DO ANTICORPO PD1- H944 HUMANIZADO
2.1 DETERMINAÇÃO DAS 3 CDRS PARA CADA UMA DAS CADEIAS LEVE E PESADA DO ANTICORPO PD1-M944 DE CAMUNDONGO
[0111] A sequência de nucleotídeos do anticorpo M944 scFv foi determinada no Exemplo 1.2, do qual as sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve e pesada do PD1-anticorpo M944 scFv foram deduzidas, consultar as SEQ ID NOs: 8/9.
[0112] As sequências de aminoácidos das 3 CDRs de cada uma das cadeias leve e pesada do anticorpo PD1-M944 de camundongo foram determinadas com referência ao esquema de numeração Kabat, consultar a Tabela 1. As 3 CDRs de cada uma das cadeias leve e pesada mencionadas acima foram transpostas e retidas no anticorpo PD1-H944 humanizado final nas etapas subsequentes, consultar os Exemplos 2.2 e 2.3. TABELA 1: SEQUÊNCIAS DE CDR DE CADEIA LEVE E CADEIA PESADA PD1-M944/ PD1-H944 Nome Sequências LCDR1 ESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO:10) LCDR2 AASNQGSGVPA (SEQ ID NO:11) LCDR3 QQSKEVPWT (SEQ ID NO:12) HCDR1 GFTFSSYGMS (SEQ ID NO:13) HCDR2 VATISGGGRDTYYSDSVKG (SEQ ID NO:14) HCDR3 SRQYGTVWFFN (SEQ ID NO:15)
2.2 TRANSPLANTE DE CDR IMUNIZADA DO ANTICORPO PD1-M944 DE
CAMUNDONGO
[0113] A humanização do anticorpo de camundongo foi realizada com o uso do método clássico de humanização de transplante de CDR. A região variável de cadeia pesada ou leve de anticorpo humano, que está mais próxima da região variável de cadeia pesada ou leve de camundongo, foi eleita como o molde, e três CDRs (Tabela 1) de cada uma dentre as cadeias leve ou pesada de camundongo foi inserida na região variável do anticorpo humano a fim de obter as sequências de região variável de cadeia leve humanizada (VL) e de região variável de cadeia pesada (VH). O molde humano para a região variável de cadeia leve do PD1-M944 é IGKV3-11*01, que é
73,48% homólogo à cadeia leve do PD1-M944, e o molde humano para a região variável de cadeia pesada é IGHV3-21*02, que é 81,94% homólogo à cadeia pesada do PD1-M944.
2.3 MUTAÇÃO REVERSA DE REGIÃO ESTRUTURANTE DA SEQUÊNCIA DE
REGIÃO VARIÁVEL HUMANIZADA
[0114] Visto que sítios principais na região estruturante derivada de camundongo são essenciais para sustentar a atividade de CDR, os sítios correspondentes foram submetidos à mutação reversa para aqueles mostrados na sequência do anticorpo de camundongo, em que a posição 89 na cadeia leve foi submetida à mutação reversa para M e a posição 91 para F, na cadeia pesada, a position 44 para R e s posição 78 para N.
[0115] O anticorpo PD1-H944 humanizado foi obtido por transplante humanizado de CDR e mutação reversa de região estruturante e suas sequências de aminoácidos de cadeia pesada e leve são mostradas na SEQ ID NO:16/17, respectivamente; suas sequências de aminoácidos de cadeia pesada e leve na forma que contém o peptídeo sinal são mostradas na SEQ ID NO:18/19, respectivamente, que compreende sequências de peptídeos sinais de cadeia pesada/cadeia leve ligados sequencialmente (SEQ ID NO:20/21); a região variável da cadeia pesada/cadeia leve da sequência de anticorpos humanizados (SEQ ID NO:22/23); e a sequência da região constante de anticorpo humanizado que é a região constante de cadeia pesada de IgG4 humana/região constante de cadeia leve de kappa humana respectivamente (SEQ ID NOs:24/25). TABELA 2: AS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS E SEQUÊNCIAS DE
NUCLEOTÍDEOS DOS ANTICORPOS DERIVADOS DE CAMUNDONGO
HUMANIZADOS n os Nome Sequências SEQ ID NO:1 Sequência de MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSP aminoácidos Met DRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSF 1-Gln167 da SNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPE região DRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVR extracelular da ARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRA proteína PD-1 ELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQ humana (UniProtKB Q15116) SEQ ID NO:2 Sequência de TCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTG nucleotídeos GTGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC ligantes do anticorpo scFv de camundongo usada na construção da biblioteca de anticorpo-fago SEQ ID NO:3 Sequência de Sequência de nucleotídeos da nucleotídeos do região variável de cadeia anticorpo PD1- leve do PD1-M944（SEQ ID NO:5 M944 Scfv de camundongo ）：
GATATTGTGCTAACTCAATCTCCAGCTT CTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGC CACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGT GTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGC ACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCC ACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCC AACCAAGGATCCGGGGTCCCTGCCAGGT TTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTT CAGCCTCAACATCCATCCTATGGAGGAG GATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGC AAAGTAAGGAGGTTCCGTGGACGTTCGG
TGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA Ligante (SEQ ID NO:2）
TCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTGG
TGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada do PD1-M944（SEQ ID NO:4）：
GAGGTGCAACTGGTGGAATCTGGGGGAG GCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAA ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACT TTCAGTTCCTATGGCATGTCTTGGGTTC GTCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTG GGTCGCGACCATTAGTGGTGGTGGTCGT GACACCTACTATTCAGACAGTGTGAAGG GGCGGTTCACCGTCTCCAGAGACAATGC CAAGAACAACCTGTTCCTGCAAATGAGC AGTCTGAGGTCTGAAGACACGGCCTTGT ATTATTGTTCACGTCAATATGGTACGGT CTGGTTTTTTAACTGGGGCCAGGGGACT
CTGGTCACTGTCTCTGCA SEQ ID NO:4 Sequência de GAGGTGCAACTGGTGGAATCTGGGGGAG nucleotídeos da GCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAA região variável ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACT de cadeia pesada TTCAGTTCCTATGGCATGTCTTGGGTTC do anticorpo GTCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTG PD1-M944 de GGTCGCGACCATTAGTGGTGGTGGTCGT camundongo GACACCTACTATTCAGACAGTGTGAAGG
GGCGGTTCACCGTCTCCAGAGACAATGC CAAGAACAACCTGTTCCTGCAAATGAGC AGTCTGAGGTCTGAAGACACGGCCTTGT ATTATTGTTCACGTCAATATGGTACGGT CTGGTTTTTTAACTGGGGCCAGGGGACT
CTGGTCACTGTCTCTGCA SEQ ID NO:5 Sequência de GATATTGTGCTAACTCAATCTCCAGCTT nucleotídeos da CTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGC região variável CACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGT de cadeia leve GTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGC do anticorpo ACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCC PD1-M944 de ACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCC camundongo AACCAAGGATCCGGGGTCCCTGCCAGGT
TTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTT CAGCCTCAACATCCATCCTATGGAGGAG GATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGC AAAGTAAGGAGGTTCCGTGGACGTTCGG
TGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA SEQ ID NO:6 Sequência de GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATC nucleotídeos da CACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAAC região TAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTG constante de GTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGA cadeia pesada de CAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTC IgG1 de CAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTC camundongo CTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCA
GCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTG GCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTT GCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGG ACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGG TTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCA GAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCC CAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTAC TCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTG GTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGG TCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGT GGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCC CGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCC GCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCA CCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTC AAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCC CTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA AACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAG GTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGC AGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGAC CTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAA GACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATG GGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACAC TCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCT TACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGC AGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATAC TTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGC CTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCC
TCTCCCACTCTCCTGGTAAA SEQ ID NO:7 Sequência de CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCA nucleotídeos da TCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAAC região ATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTC constante da TTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCA cadeia leve de ATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGA kappa de ACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGG camundongo ACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCT
ACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGAC CAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGC TATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACAT CAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAA
CAGGAATGAGTGT SEQ ID NO:8 Sequência de EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFT aminoácidos da FSSYGMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGR região variável DTYYSDSVKGRFTVSRDNAKNNLFLQMS de cadeia pesada SLRSEDTALYYCSRQYGTVWFFNWGQGT do anticorpo LVTVSA PD1-M944 de camundongo SEQ ID NO:9 Sequência de DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASES aminoácidos da VDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYAAS região variável NQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEE de cadeia leve DDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK do anticorpo PD1-M944 de camundongo SEQ ID Sequência de ESVDSYGNSFMH NO:10 aminoácidos da
CDR1 de cadeia leve do anticorpo PD1- M944 de camundongo/anti corpo PD1-H944 humanizado SEQ ID Sequência de AASNQGSGVPA NO:11 aminoácidos da CDR2 de cadeia leve do anticorpo PD1- M944 de camundongo/anti corpo PD1-H944 humanizado SEQ ID Sequência de QQSKEVPWT NO:12 aminoácidos da CDR3 de cadeia leve do anticorpo PD1- M944 de camundongo/anti corpo PD1-H944 humanizado SEQ ID Sequência de GFTFSSYGMS NO:13 aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada do anticorpo PD1- M944 de camundongo/anti corpo PD1-H944 humanizado SEQ ID Sequência de VATISGGGRDTYYSDSVKG NO:14 aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada do anticorpo PD1- M944 de camundongo/anti corpo PD1-H944 humanizado SEQ ID Sequência de SRQYGTVWFFN NO:15 aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada do anticorpo PD1-
M944 de camundongo/anti corpo PD1-H944 humanizado SEQ ID Sequência de Sequência de aminoácidos da NO:16 aminoácidos da região variável de cadeia cadeia pesada do pesada（SEQ ID NO:22）： anticorpo PD1-
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTF H944 humanizado
SSYGMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRDT YYSDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMNSLR AEDTAVYYCSRQYGTVWFFNWGQGTLVTV
SS Sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada（SEQ ID NO:24）：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCN VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAP EFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM
HEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID Sequência de Sequência de aminoácidos da NO:17 aminoácidos da região variável de cadeia cadeia leve do leve（SEQ ID NO:23）： anticorpo PD1-
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASES H944 humanizado
VDSYGNSFMHWYQQKPGQPPRLLIYAAS NQGSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP
EDFAMYFCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK Sequência de aminoácidos da região constante de cadeia leve（SEQ ID NO:25）：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV
YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Sequência de Sequência de aminoácidos do NO:18 aminoácidos da peptídeo sinal de cadeia cadeia pesada do pesada（SEQ ID NO:20）： anticorpo PD1-
MGWSLILLFLVAVATRVLS H944 humanizado Sequência de aminoácidos da que contém o região variável de cadeia peptídeo sinal pesada（SEQ ID NO:22）：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSSYGMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGR DTYYSDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMN SLRAEDTAVYYCSRQYGTVWFFNWGQGT
LVTVSS Sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada（SEQ ID NO:24）：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCN VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAP EFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM
HEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID Sequência de Sequência de aminoácidos do NO:19 aminoácidos da peptídeo sinal de cadeia leve cadeia leve do （SEQ ID NO:21）： anticorpo PD1-
MGWSCIILFLVATATGVHS H944 humanizado Sequência de aminoácidos da que contém o região variável de cadeia peptídeo sinal leve（SEQ ID NO:23）：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASES VDSYGNSFMHWYQQKPGQPPRLLIYAAS NQGSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP
EDFAMYFCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK Sequência de aminoácidos da região constante de cadeia leve（SEQ ID NO:25）：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV
YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Sequência de MGWSLILLFLVAVATRVLS NO:20 aminoácidos do peptídeo sinal de cadeia pesada do anticorpo PD1-H944 humanizado SEQ ID Sequência de MGWSCIILFLVATATGVHS
NO:21 aminoácidos do peptídeo sinal de cadeia leve do anticorpo PD1-H944 humanizado SEQ ID Sequência de EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT NO:22 aminoácidos da FSSYGMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGR região variável DTYYSDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMN de cadeia pesada SLRAEDTAVYYCSRQYGTVWFFNWGQGT do anticorpo LVTVSS PD1-H944 humanizado SEQ ID Sequência de EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASES NO:23 aminoácidos da VDSYGNSFMHWYQQKPGQPPRLLIYAAS região variável NQGSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP de cadeia leve EDFAMYFCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK do anticorpo PD1-H944 humanizado SEQ ID Sequência de ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL NO:24 aminoácidos da VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV região LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCN constante de VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAP cadeia pesada do EFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT anticorpo PD1- CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK H944 humanizado TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG
KEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM
HEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID Sequência de RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL NO:25 aminoácidos da LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV região TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV constante de YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC cadeia leve do anticorpo PD1- H944 humanizado SEQ ID Sequência de Sequência de nucleotídeos do NO:26 nucleotídeos da peptídeo sinal de cadeia cadeia pesada de pesada（SEQ ID NO:28）： anticorpo PD1-
ATGGGCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCC H944 humanizado
TGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGTC que contém o
T peptídeo sinal Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada（SEQ ID NO:30：）
GAGGTCCAACTTGTGGAGTCTGGAGGAG GACTGGTGAAGCCTGGAGGCTCCCTGAG ACTGTCCTGTGCTGCCTCTGGCTTCACC TTCTCCTCCTATGGGATGAGTTGGGTGA GACAGGCTCCTGGGAAGAGATTGGAGTG GGTGGCTACCATCTCTGGAGGAGGCAGG GACACCTACTACTCTGACTCTGTGAAGG GCAGGTTCACAATCAGCAGGGACAATGC CAAGAACAACCTGTACCTCCAAATGAAC TCCCTGAGGGCTGAGGACACAGCAGTCT ACTACTGTAGCAGACAATATGGCACAGT GTGGTTCTTCAACTGGGGACAAGGCACC
CTGGTGACAGTGTCCTCT Sequência de nucleotídeos da região constante de cadeia pesada（SEQ ID NO:32）：
GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CGCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTC CGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTG GTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGAC CAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCA GCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG CTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAAC GTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGG TGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGG TCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCT GAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCC TGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCT CATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACG TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAG ACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGT GGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACA GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAAC CATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA GAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT CCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG AAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTA CAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC GACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGC TAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGA GGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATG CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACAC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAA
ATAA SEQ ID Sequência de Sequência de nucleotídeos do NO:27 nucleotídeos da peptídeo sinal de cadeia leve cadeia leve de （SEQ ID NO:29）： anticorpo PD1-
ATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTGTTCC H944 humanizado
TGGTGGCTACAGCCACAGGAGTGCATTC que contém o
T peptídeo sinal Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve（SEQ ID NO:31）：
GAGATTGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCA CCCTGTCCCTGAGCCCTGGAGAGAGGGC TACCCTGTCCTGTAGGGCATCTGAGTCT GTGGACTCCTATGGCAACTCCTTTATGC ACTGGTATCAACAGAAGCCTGGACAACC ACCAAGACTGCTGATTTATGCTGCCAGC AACCAGGGCTCTGGAGTGCCTGCCAGGT TCTCTGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTT CACCCTGACCATCTCCTCCTTGGAACCT GAGGACTTTGCTATGTACTTCTGTCAAC AGAGCAAGGAGGTGCCATGGACCTTTGG
ACAAGGCACCAAGGTGGAGATTAAG Sequência de nucleotídeos da região constante de cadeia leve （SEQ ID NO:33）：
CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCA TCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTG CTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCA AAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCT CCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTC ACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCT ACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAG CAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAA
CAGGGGAGAGTGTTAG SEQ ID Sequência de ATGGGCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCC NO:28 nucleotídeos do TGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGTC peptídeo sinal T de cadeia pesada do anticorpo PD1-H944 humanizado
SEQ ID Sequência de ATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTGTTCC NO:29 nucleotídeos do TGGTGGCTACAGCCACAGGAGTGCATTC peptídeo sinal T de cadeia leve de anticorpo PD1-H944 humanizado SEQ ID Sequência de GAGGTCCAACTTGTGGAGTCTGGAGGAG NO:30 nucleotídeos da GACTGGTGAAGCCTGGAGGCTCCCTGAG região variável ACTGTCCTGTGCTGCCTCTGGCTTCACC de cadeia pesada TTCTCCTCCTATGGGATGAGTTGGGTGA do anticorpo GACAGGCTCCTGGGAAGAGATTGGAGTG PD1-H944 GGTGGCTACCATCTCTGGAGGAGGCAGG humanizado GACACCTACTACTCTGACTCTGTGAAGG
GCAGGTTCACAATCAGCAGGGACAATGC CAAGAACAACCTGTACCTCCAAATGAAC TCCCTGAGGGCTGAGGACACAGCAGTCT ACTACTGTAGCAGACAATATGGCACAGT GTGGTTCTTCAACTGGGGACAAGGCACC
CTGGTGACAGTGTCCTCT SEQ ID Sequência de GAGATTGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCA NO:31 nucleotídeos da CCCTGTCCCTGAGCCCTGGAGAGAGGGC região variável TACCCTGTCCTGTAGGGCATCTGAGTCT de cadeia leve GTGGACTCCTATGGCAACTCCTTTATGC do anticorpo ACTGGTATCAACAGAAGCCTGGACAACC PD1-H944 ACCAAGACTGCTGATTTATGCTGCCAGC humanizado AACCAGGGCTCTGGAGTGCCTGCCAGGT
TCTCTGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTT CACCCTGACCATCTCCTCCTTGGAACCT GAGGACTTTGCTATGTACTTCTGTCAAC AGAGCAAGGAGGTGCCATGGACCTTTGG
ACAAGGCACCAAGGTGGAGATTAAG SEQ ID Sequência de GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC NO:32 nucleotídeos da CGCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTC região CGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTG constante de GTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA cadeia pesada do CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGAC anticorpo PD1- CAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC H944 humanizado CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCA
GCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG CTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAAC GTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGG TGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGG TCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCT GAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCC TGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCT CATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACG TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAG ACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGT GGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACA GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAAC CATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA GAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT CCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG AAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTA CAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC GACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGC TAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGA GGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATG CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACAC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAA
ATAA SEQ ID Sequência de CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCA NO:33 nucleotídeos da TCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA região ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTG constante de CTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCA cadeia leve do AAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCT anticorpo PD1- CCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTC H944 humanizado ACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCT
ACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAG CAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAA
CAGGGGAGAGTGTTAG SEQ ID Sequência de Sequência de aminoácidos da NO:34 aminoácidos do região variável de cadeia anticorpo PD1- leve do PD1-M944 （SEQ ID M944 Scfv de camundongo NO:9）：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASES VDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYAAS NQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEE
DDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK Ligante （SEQ ID NO:35）：
SSGGGGSGGGGGGSSRSS Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do PD1-M944 （SEQ ID
NO:8）：
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFT FSSYGMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGR DTYYSDSVKGRFTVSRDNAKNNLFLQMS SLRSEDTALYYCSRQYGTVWFFNWGQGT
LVTVSA SEQ ID Sequência de SSGGGGSGGGGGGSSRSS NO:35 aminoácidos ligantes do anticorpo scFv de camundongo usado na construção da biblioteca de anticorpo-fago EXEMPLO 3: PRODUÇÃO DO ANTICORPO PD1-H944 HUMANIZADO
[0116] Após a amplificação de PCR, as respectivas sequências de nucleotídeos de cadeia pesada/leve acima que codificam o peptídeo sinal que contém o anticorpo PD1-H944 (SEQ ID NO:26/27), que contém a sequência de nucleotídeos que codifica para o peptídeo sinal de cadeia leve/pesada ligado sequencialmente (SEQ ID NO:28/29), a região variável de cadeia leve/pesada do anticorpo humanizado (SEQ ID NO:30/31) e a região constante de cadeia pesada de IgG4 humana/região constante de cadeia leve de kappa humana (SEQ ID NO:32/33), respectivamente, foram digeridas duplamente com endonucleases de restrição Hind III e Xba I (Fermentas), em seguida, inseridas no vetor comercial pcDNA3 (Invitrogen). Após a extração do plasmídeo, um fragmento de 1,8 kb foi obtido por digestão tripla do vetor de cadeia leve pCDNA3 com NruI+NaeI+Dra I, em seguida, inserida no vetor de expressão pSSE do sistema CHO/dhfr (Sino Biological, Inc), em seguida, um fragmento de 2,5 kb foi obtido por digestão tripla do vetor de cadeia pesada de pCDNA3 com NruI+NaeI+Dra I (Fermentas). Em seguida, também foi inserido no vetor pSSE (Sino Biological, Inc) de cadeia leve construído na etapa anterior para obter o vetor completo. O vetor de expressão é um vetor de expressão eucarionte que contém o gene dhfr de elemento de amplificação de DNA, o gene de resistência NeoR e os elementos de expressão das cadeias leve e pesada de anticorpo. O vetor de expressão foi transferido nas células dhfr-DG44, PD1-H944 linhagens celulares positivas foi obtido por triagem de G418, linhagens celulares de alta expressão PD1-H944 foram obtidas por triagem de pressão gradual MTX e, em seguida, domesticado em cultura livre de soro para triagem clonal. Em cada etapa, o clone com alta expressão de anticorpo foi selecionado com base nos resultados do ensaio ELISA, junto da situação de proliferação celular e nos atributos de qualidade principais do fármaco de anticorpo.
[0117] A linhagem celular de CHO que produz PD1- H944 foi cultivada na cultura de suspensão de suplemento livre de soro para obter o anticorpo PD1-H944 de alta pureza e qualidade. EXEMPLO 4: CARACTERIZAÇÃO DO ANTICORPO PD1-H944 HUMANIZADO
4.1 ENSAIO DA AFINIDADE DE LIGAÇÃO DO PD1-H944 A ANTÍGENO PD-1 HUMANO, DE CAMUNDONGO E DE MACACO (1) CAPACIDADE DE LIGAÇÃO DO PD1-H944 À PROTEÍNA PD-1
HUMANA RECOMBINANTE
[0118] Uma ELISA indireta foi usada para detectar a ligação específica do PD1-H944 à proteína PD-1 humana recombinante. Concentrações diferentes (0,16 ng/ml, 0,49 ng/ml, 1,48 ng/ml, 4,44 ng/ml, 13,33 ng/ml, 40 ng/ml, 120 ng/ml, 360 ng/ml, 1080 ng/ml, 3240 ng/ml e 9720 ng/ml) da proteína PD-1 humana recombinante foram revestidas em placas com 96 poços de um dia para o outro a 4 °C. No dia seguinte, as placas foram lavadas e bloqueadas à temperatura ambiente durante 1 hora. Após a incubação com 100 μl de 2 μg/ml de PD1-H944, Nivolumab (Bristol-Myers Squibb) e anticorpo H7N9-R1-IgG4 de controle negativo (Sino Biological, Inc.) respectivamente, as placas foram lavadas para remover anticorpo não ligado, em seguida, incubadas com IgG F(ab)2/HRP anti-humana de cabra (JACKSON) e lavada repetidamente, e a solução cromatográfica de substrato foi adicionada para desenvolvimento de cor e detecção de OD450. A EC50 do PD-1-H944 e do Nivolumab que se ligam à proteína PD-1 humana recombinante foi 31,5 ng/ml, R2=0,998 e 179,0 ng/ml, R2=0,997, respectivamente. Isso indica que o PD1-H944 se liga à proteína PD-1 humana recombinante significativamente melhor que o Nivolumab (Figura 2A-C). (2) CAPACIDADE DE LIGAÇÃO DO PD1-H944 ÀS CÉLULAS RECOMBINANTES JURKAT/PD-1
[0119] A capacidade de ligação do PD1-H944 às células recombinantes Jurkat/PD-1 foi medida por citometria de fluxo com o uso da linhagem celular Jurkat/PD-1 de expressão estável recombinante de PD-1 humana (SinoCellTech Ltd) como o material experimental. O PD1-H944, Nivolumab e o anticorpo H7N9-R1-IgG4 de controle negativo em diferentes concentrações (0,195 μg/ml, 0,391 μg/ml, 0,781 μg/ml, 1,562 μg/ml, 3,125 μg/ml, 6,25 μg/ml, 12,5 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml e 200 μg/ml) foram adicionados a 5×105 células/tubo de células Jurkat/PD-1 recombinantes em fase de proliferação logarítmica, misturados e incubados a 4 °C e, em seguida, lavados e centrifugados para remover anticorpo ligado. A ligação do anticorpo às células foi detectada adicionando-se IgG Fc-FITC anti-humano de cabra (Sino Biological, Inc.). Os resultados mostraram que o PD1-H944 se ligou especificamente às células Jurkat/PD-1 com Ec50 de 9,63 μg/ml, R2=1,000, o Nivolumab especificado se ligou às células Jurkat/PD-1 com EC50 de 10,18 μg/ml, R2= 0,994 e o anticorpo H7N9-R1-IgG4 de controle negativo não se ligou às células Jurkat/PD-1 (Figura 3). Isso indica que o PD1-H944 tem uma boa estabilidade para se ligar à PD-1 expressa por células Jurkat/PD-1 e que sua capacidade de ligação é levemente melhor que o Nivolumab. (3) AFINIDADE DE LIGAÇÃO DO PD1-H944 À PROTEÍNA PD-1 HUMANA
RECOMBINANTE
[0120] A afinidade do PD1-H944 (0,90 nM, 1,79 nM, 3,66 nM, 7,24 nM), Nivolumab (0,51 nM, 1,02 nM, 2,05 nM, 4,10 nM) à PD-1 foi determinada com o uso do Sistema de Ensaio de Interação Biomolecular Octect, com H7N9-R1-IgG4 (13,30 nM) como o anticorpo de controle negativo. Os resultados mostraram que a afinidade de ligação de KD média do PD1-H944 à proteína PD-1 humana recombinante foi 64,8 pM, a constante de taxa de associação média kon foi 3,01E+05 M- 1s-1 , e a constante de taxa de dissociação média koff foi 1,95E-05 s-1; a afinidade de ligação de KD média do Nivolumab à proteína PD-1 foi 74,1 pM, com uma constante de taxa de ligação média kon de 6,92E+05 M-1s-1 e uma constante de taxa de dissociação média koff de 5,12E-05 s-1(Figura 4). O PD1- H944 tem uma afinidade maior que o Nivolumab, que é aproximadamente 1,14 vez aquela do Nivolumab, e o PD1-H944 tem uma taxa de dissociação inferior, então, o PD1-H944 tem capacidade para se ligar à proteína PD-1 maior que o Nivolumab.
(4) CAPACIDADE DE LIGAÇÃO DO PD1-H944 À PROTEÍNA PD-1
RECOMBINANTE DE MACACO E DE CAMUNDONGO
[0121] Um ELISA indireto foi usado para detectar a ligação específica do PD1-H944 à proteína PD-1 recombinante de macaco e de camundongo. As proteínas PD-1 recombinantes humana, de macaco e de camundongo (Sino Biological, Inc.) com diferentes concentrações (0,16 ng/ml, 0,49 ng/ml, 1,48 ng/ml, 4,44 ng/ml, 13,33 ng/ml, 40 ng/ml, 120 ng/ml, 360 ng/ml, 1080 ng/ml, 3240 ng/ml e 9720 ng/ml) foram revestidas em placas com 96 poços, 100 μl por poço, revestidas de um dia para o outro a 4 °C–, lavadas no dia seguinte e bloqueadas à temperatura ambiente durante 1 hora. Após a incubação com 100 μl do PD1-H944, do Nivolumab e do anticorpo H7N9-R1-IgG4 de controle negativo (todos em 2 μg/ml), as placas foram lavadas, e o anticorpo secundário, IgG F(ab)2/HRP anti-humano de cabra, foi adicionado para desenvolvimento de cor, a OD450 foi detectada, e o ensaio foi em tripleto. Os resultados mostraram que o PD1-H944 pôde se ligar à proteína PD-1 humana recombinante e à proteína PD-1 recombinante de macaco com EC50 antigênica de 25,8 ng/ml (R2=0,999) e 32,7 ng/ml (R2=0,997), respectivamente, ao passo que não se ligam de maneira cruzada à proteína PD-1 de camundongo recombinante (Figura 5A); o Nivolumab pôde se ligar à proteína PD-1 humana recombinante e à proteína PD-1 recombinante de macaco com EC50 de 113,2 ng/ml (R2=0,997) e 80,2 ng/ml (R2=0,997), respectivamente e não se ligou à proteína PD-1 de camundongo (Figura 5B); o anticorpo de controle negativo não se ligou à proteína PD-1 humana recombinante, à proteína PD-1 recombinante de macaco ou à proteína PD-1 de camundongo recombinante (Figura 5C). A boa ligação do PD1-H944 à PD-1 de macaco sustenta o uso de macacos para a avaliação de segurança desse fármaco. (5) AFINIDADE DE LIGAÇÃO DO PD1-H944 À PROTEÍNA PD-1
RECOMBINANTE DE MACACO E DE CAMUNDONGO
[0122] A afinidade do PD1-H944 e do Nivolumab a proteínas PD-1 de macaco e de camundongo biotiniladas (Sino Biological, Inc.) em diferentes gradientes de concentração (consultar a Figura 6A-B) foi medida com o uso de Octet e analisada para obter os valores de KD. Os resultados mostraram que o valor de KD de afinidade do PD1-H944 com a proteína PD-1 recombinante de macaco foi 108 pM, e o valor de KD de afinidade de Nivolumab com a proteína PD-1 recombinante de macaco foi 131 pM, que foram comparáveis (Figura 6A). Tanto o Both PD1-H944 quanto o Nivolumab não se ligaram à proteína PD-1 de camundongo recombinante (Figura 6B).
4.2 O PD1-H944 BLOQUEIA A LIGAÇÃO DE LIGANTES DE PD-1 HUMANA (PD-L1 E PD-L2) À PROTEÍNA PD-1 HUMANA
[0123] A proteína PD-1 humana recombinante foi revestida em uma placa com 96 poços a 100 μl por poço e deixada de um dia para o outro a 4 °C. A placa foi lavada no dia seguinte e bloqueada à temperatura ambiente durante 1 hora antes de 1 μg/ml de PD-L1 humano-biotina (Sino Biological, Inc.) ou 2 μg/ml de PD-L2 humano-biotina (Sino Biological, Inc.) serem adicionados. Em seguida, o PD1-H944, o Nivolumab ou o anticorpo H7N9-R1-IgG4 de controle negativo em diferentes concentrações (0,003 μg/ml, 0,008 μg/ml, 0,025 μg/ ml, 0,074 μg/ml, 0,222 μg/ml, 0,667 μg/ml, 2 μg/ml, 6 μg/ml, 18 μg/ml) foram adicionados, incubados, a estreptavidina/HRP antibiótica foi adicionada, incubada, e a OD450 foi detectada. Para cada grupo, o teste é realizado em dupleto. Os resultados mostraram que as proteínas PD-L1 e PD-L2 humanas recombinantes biotiniladas puderam se ligar com eficácia à proteína PD-1 revestida humana, e a adição de diferentes concentrações de PD1-H944 e Nivolumab inibiu com eficácia a ligação tanto da proteína PD-L1 humana recombinante (Figura 7A) quanto da proteína PD-L2 humana recombinante Figura 7B) à PD-1 humana. O PD1-H944 e o Nivolumab inibiram a PD-L1 humana recombinante a IC50 de 0,116 μg/ml (R2=0,995) e 0,129 μg/ml (R2=0,997), respectivamente, e a PD-L2 humana recombinante a IC50 de 0,446 μg/ml (R2=0,994) e 0,486 μg/ml (R2=0,996), respectivamente. A capacidade que o PD1-H944 tem para inibir a ligação da PD-1 humana ao PD-L1 humano ou à PD-L2 humano não foi significativamente diferente daquela do Nivolumab, e nenhuma inibição significativa foi observada para o anticorpo de controle negativo.
4.3 O PD1-H944 BLOQUEIA A LIGAÇÃO DO LIGANTE DE PD-1 HUMANA (PD-L1) ÀS CÉLULAS QUE EXPRESSAM PD-1 HUMANA
[0124] 5 × 105 células/tube de PD-1 humana que expressam de maneira estável as células Jurkat/PD-1 em fase de proliferação logarítmica foram adicionadas com PD1-H944, com Nivolumab e com o anticorpo H7N9-R1-IgG4 de controle negativo em diferentes concentrações (0,260 μg/ml, 0,390 μg/ml, 0,585 μg/ml, 0,878 μg/ml, 1,317 μg/ml, 1,975 μg/ml, 2,963 μg/ml, 4,444 μg/ml, 6,667 μg/ml ou 10,000 μg/ml) e incubadas a 4 °C. Houve adição de 10 μl de 0,4 μg/ml de B7H1- Fc-Biotina (Sino Biological, Inc.), lavagem com PBS e remoção de anticorpo não ligado por centrifugação. O Conjugado Estreptavidina Alexa Fluor® 488 (Life Technologies) foi adicionado, incubado a 4 °C durante 20 minutos, lavado várias vezes e centrifugado, e 200 μl de PBS foram adicionados para suspender novamente as células para detecção em um citômetro de fluxo. Os resultados mostraram que a proteína PD-L1 humana recombinante pô de se ligar com eficácia às células Jurkat/PD-1, e a ligação da proteína PD-L1 humana recombinante às células Jurkat/PD-1 foi inibida com eficácia quando diferentes concentrações de PD1-H944 e Nivolumab foram adicionadas (Figura 8). As concentrações inibidoras IC50 foram 1,78 μg/ml (R2=0,994) e 2,48 μg/ml (R2=0,989), respectivamente. O PD1-H944 inibiu a ligação de PD-1 humana e PD-L1 humano um pouco melhor que o Nivolumab, e nenhuma inibição significativa foi observada para o anticorpo de controle negativo.
4.4 LIGAÇÃO DO PD1-H944 A CD16A
[0125] A proteína CD16a receptor (FcγRIIIa) de afinidade é o maior receptor Fc que medeia os efeitos de ADCC em que uma CD16a que contém o sítio V158 SNP tem uma afinidade relativamente alta. A ligação de PD1-H944 à proteína CD16a (V158) recombinante foi medida por ELISA para avaliar a potencialidade de PD1-H944 com relação aos efeitos de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC).
[0126] O PD1-H944-1-IgG1 de controle positivo (o) usado nesse ensaio é a região variável do PD1-H944 ligado à IgG1 natural, e o PD1-H944-1-IgG1 de controle negativo é a região variável do PD1-H944 ligado à IgG1 mutante N297A cujo fragmento não tem capacidade de se ligar à CD16a devido à deleção de N-glicosídeo. A proteína PD-1 humana recombinante(10 μg/ml, 100 μl/poço) foi revestida em placas com 96 poços de um dia para o outro a 4 °C, lavada no dia seguinte e bloqueada à temperatura ambiente durante 1 hora. O PD1-H944, Nivolumab, anticorpo PD1-H944-1-IgG1(o) de controle positivo (Sino Biological, Inc.) e o anticorpo de PD1-H944-1-IgG1 de controle negativo (Sino Biological, Inc.) em concentrações diferentes (0,020 μg/ml, 0,078 μg/ml, 0,3125 μg/ml, 1,25 μg/ml, 5 μg/ml, 20 μg/ml e 80 μg/ml) foram adicionados (consultar a Figura 9), e as placas foram adicionadas para remover anticorpo não ligado após incubação. 10 μg/ml da proteína CD16a-AVI-His (V158)+BirA recombinante (Sino Biological, Inc.) foram adicionados aos poços após incubação com 1 μg/ml de estreptavidina/HRP, e a OD450 foi detectada por desenvolvimento de cor após incubação.
[0127] Os resultados mostraram que a ligação do anticorpo de controle positivo à proteína CD16a recombinante aumentou com a concentração de anticorpo. O PD1-H944, o Nivolumab e o anticorpo de controle negativo não se ligaram à proteína CD16a recombinante em qualquer uma das concentrações testadas (Figura 9). Isso sugere que tanto o PD1-H944 construído como anticorpos do subtipo IgG4 quanto o Nivolumab têm uma capacidade muito baixa para se ligar à CD16a, o que prevê que o PD1-H944 não tem efeito de ADCC ou efeito de ADCC muito baixo.
4.5 LIGAÇÃO DO PD1-H944 À C1q
[0128] A ligação do PD1-H944 à proteína C1q recombinante foi medida por ELISA, desse modo, avaliando a potencialidade do PD1-H944 dos efeitos de citotoxicidade dependente de complemento (CDC).
[0129] O PD1-H944-1-IgG1(o), obtido ligando-se a região variável de PD1-H944 à IgG1 natural, foi usado como o anticorpo de controle positivo (Sino Biological, Inc.), e o H7N9-R1-IgG4 (Sino Biological, Inc.) foi usado como o anticorpo de controle de isótipo. As concentrações diferentes (20 μg/ml, 10 μg/ml, 5 μg/ml, 2,5 μg/ml, 1,25 μg/ml, 0,625 μg/ml, 0,313 μg/ml, 0,156 μg/ml e 0,078 μg/ml) (consultar a Figura 10) do PD1-H944, do Nivolumab, do anticorpo de controle positivo e do anticorpo de controle de isótipo foram revestidas em placas com 96 poços a 100 μl por poço de um dia para o outro a 4 °C. No dia seguinte, as placas foram lavadas, bloqueadas à temperatura ambiente durante 1 hora, e 100 μl de 5 μg/ml da proteína C1q recombinante (Quidel Corporation) foram adicionados respectivamente, e as placas foram incubados durante 3 horas. 100 μl do anticorpo secundário anti-C1q/HRP (Abcam) a uma diluição 1:400 vezes foram adicionados, incubados durante 1 hora, desenvolveram cor, e a OD450 foi detectada.
[0130] Os resultados mostraram que ligação de anticorpos de controle positivo à proteína C1q recombinante aumentou com a concentração de anticorpo. Os anticorpos PD1- H944, Nivolumab e de controle de isótipo tiveram capacidade de ligação comparável à proteína C1q recombinante, com capacidade de ligação significativamente inferior aos controles positivos do tipo IgG1 (Figura 10).
4.6 LIGAÇÃO DO PD1-H944 À FcRn
[0131] A ligação do PD1-H944 à proteína receptor Fc (FcRn) humana recombinante foi medida por ELISA e, então, a farmacocinética do PD1-H944 em seres humanos foi avaliada.
[0132] A proteína antibiotina Avidin (Thermo Fisher Scientific) a uma concentração de 10 μg/ml foi revestida em placas com 96 poços a 100 μl por poço e incubada de um dia para o outro a 4 °C e lavada no dia seguinte, bloqueada à temperatura ambiente durante 1 hora e incubada com 10 μg/ml da proteína FCGRT-His+B2M biotinilada (Sino Biological, Inc.) durante 1 hora, em seguida, o PD1-H944, Nivolumab ou anticorpo H7N9-R1-IgG4 de controle de isótipo (Sino Biological, Inc.) em concentrações diferentes (0,123 μg/ml, 0,37 μg/ml, 1,11 μg/ml, 3,33 μg/ml, 10 μg/ ml, 30 μg/ml, 90 μg/ml, 270 μg/ml) foi adicionado respectivamente (consultar a Figura 11), incubado durante 1 hora, lavado, e 250 ng/ml de IgG Fc/HRP anti-humano de cabra (Sino Biological Inc.) foram adicionados. O processo da diluição de anticorpo até a incubação de anticorpo secundária foi mantido a um pH 6,0, e a OD450 foi medida.
[0133] Os resultados mostraram que o PD1-H944 e Nivolumab puderam se ligar à proteína FcRn humana recombinante, e a capacidade de ligação aumentou com a concentração; em altas concentrações (270 μg/ml), a ligação do PD1-H944 à proteína FcRn humana recombinante foi aproximadamente 1,62 vez aquela do Nivolumab (Figura 11). Com base nesse resultado, é formulada a hipótese de que o PD1-H944 tem boa farmacocinética em seres humanos. EXEMPLO 5: ANÁLISE DE FUNÇÃO DO ANTICORPO PD1-H944
HUMANIZADO
5.1 ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T CD4+ EM RESPOSTAS LINFOIDES MISTURADAS ESTIMULADAS POR PD1-H944
[0134] A atividade neutralizante do anticorpo PD-1 anti-humano foi detectada pelo ensaio de mistura de linfócitos CD4+ T com DCs. As células mononucleares de sangue periférico humanas (PBMCs) foram isoladas por centrifugação gradiente de densidade Ficoll, e, em seguida, células mononucleares foram obtidas pelo método de cultura de adesão, meio de cultura celular 1640 (GIBCO) (que contém 10% de FBS, 100 unidades/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina) que contém 160 ng/ml de rhIL-4 (Sino Biological, Inc.), e 20 ng/ml de rhGM-CSF (R&D Systems) foram adicionados às células mononucleares resultantes e incubados em um incubador de CO2 até o terceiro dia, em seguida, um meio volume do meio de cultura foi mudado. Após 6 dias de incubação, foram coletadas as células suspensas que são conhecidas como DCs. A densidade de DCs foi ajustada para 2 x 106 células/ml, mitomicina a uma concentração final de 50 μg/ml foi adicionada, tratada a 37 °C durante 20 minutos, lavada três vezes com o meio 1640 para etapas adicionais.
[0135] Os linfócitos T CD4+ foram classificados das PBMC isoladas do sangue periférico de outra pessoa com o uso de um kit de escolha de linfócitos T CD4+ (MiltenyiBiotec). Os linfócitos T CD4+ de cada um dos três doadores de sangue foram usados em cada lote desse ensaio.
[0136] Os linfócitos T CD4+ classificados foram misturados com DCs tratadas anteriormente com 50 μg/ml mitomicina em uma razão 10:1, e 105 células/poço foram inoculadas de maneira uniforme em placas com 96 poços com PD1-H944, Nivolumab, e o anticorpo H7N9-R1-IgG4 de controle negativo (Sino Biological, Inc.), respectivamente e outro grupo de controle de linfócitos misturados, isto é, o grupo com uma mistura de apenas linfócitos T CD4+ e DCs sem anticorpo, grupo de controle de células DC, isto é, o grupo com apenas células DC sem anticorpo e linfócitos T CD4+, grupo de controle de células T CD4+, isto é, o grupo com apenas células T CD4+ sem anticorpo e DCs células, com o mesmo volume do meio 1640 de diluente de amostra, o gradiente de concentração final de cada anticorpo foi 1 μg /ml, 0,1 μg/ml, 0,01 μg/ml e incubado em um incubador CO2 a 37 °C e 5% de CO2 durante 5 dias. Os sobrenadantes de cultura foram coletados, e os níveis de expressão de IL-2 e IFN-γ nos sobrenadantes de cultura foram medidos por ELISA.
[0137] Os resultados mostraram que a secreção de IFN-γ e IL-2 não pôde ser detectada nos sobrenadante de culturas célula T CD4+ sem mistura de DCs, ao passo que no grupo de controle de linfócitos misturados, a mistura de células T CD4+ e DCs aumentou significativamente a secreção de IFN-γ e IL-2 de células T CD4+. Após a adição do anticorpo anti-PD-1 ao sistema de linfócitos misturados, a ativação das células T CD4+ na resposta linfática misturada da CD4+ T e das DCs foi promovida significativamente com maior secreção de IFN-γ e IL-2. Diferentemente do PD1-H944 e do Nivolumab, que tiveram um efeito significativo, o anticorpo de controle negativo não mostrou esse efeito. Os resultados são mostrados na Figura 12, o que sugere que o PD1-H944 tem melhor atividade funcional que aquele do Nivolumab e pode reativar com eficácia as células T imunossuprimidas reativas.
5.2 O PD1-H944 ESTIMULA A ATIVAÇÃO DOS GENES REPÓRTERES NA VIA DE SINALIZAÇÃO DE IL2 A JUSANTE DA PD1
[0138] Nesse ensaio, as células efetoras Jurkat-NFAT-Luc2p-PD-1 (SinoCellTech Ltd) e as células-alvo CHO-K1-PD-L1-CD3E (SinoCellTech Ltd) foram usadas como materiais experimentais. A interação PD-1/PD-L1 resultante da cocultura dessas duas células inibe a sinalização de TCR e a bioluminescência mediada por NFAT-RE, e a adição do anticorpo PD-1 bloqueou a interação PD-1/PD-L1 e, então, liberou essa inibição. A função de ativação do PD1-H944 no sistema de células repórteres de PD-1 humana recombinante foi determinada medindo-se a intensidade de bioluminescência (RLU) nas células efetoras.
[0139] As células-alvo CHO-K1-PD-L1-CD3E foram inoculadas a 2× 104/poço em placas com 96 poços e cultivadas de um dia para o outro em meio DMEM que contém 10% de FBS, em seguida, o sobrenadante foi removido. O PD1-H944, Nivolumab e o anticorpo H7N9-R1-IgG4 de controle negativo (Sino Biological, Inc.) em concentrações diferentes (0,007 μg/ml, 0,023 μg/ml, 0,082 μg/ml, 0,286 μg/ml, 1,000 μg/ml, 3,499 μg/ml, 12,245 μg/ml, 42,857 μg/ml, 150 μg/ml) foram adicionados a 40 μl/poço (consultar a Figura 13), 7,5 × 104 células efetoras Jurkat-NFAT-Luc2p-PD-1 foram adicionadas subsequentemente a 40 μl/poço e incubadas em um incubador de CO2 durante 6 horas. Cada ensaio foi realizado em tripleto nas células-alvo, nas células efetoras e no controle negativo M. Após 6 horas de incubação, um tampão de lise passiva 5X (Promega) foi adicionada a 20 μl/poço, e a placa com 96 poços foi, em seguida, colocada em um refrigerador a -80 °C para detecção adicional. Para o ensaio, as placas com 96 poços foram colocadas a -80 °C, desgeladas à temperatura ambiente, sendo agitadas, e 20 μl do sobrenadante por poço foi transferido a uma placa de fundo branco com 96 poços para detecção de luminescência pelo ensaio Luminol de Microplaca LB960.
[0140] Os resultados mostraram que tanto o PD1- H944 quanto o Nivolumab de anticorpo de controle tiveram uma ativação significativa do sistema celular de gene repórter de PD-1 humano recombinante, conforme mostrado na Figura 13. Na faixa de concentração de 0,007-150 μg/ml, a EC50 do PD1- H944 foi 0,49 μg/ml e aquela do Nivolumab foi 1,08 μg/ml. O PD1-H944 teve uma EC50 significativamente inferior àquela do Nivolumab, sua atividade é 2,21 vezes aquela do Nivolumab. O anticorpo de controle negativo não teve função de ativação no sistema celular de gene repórter de PD-1 humano recombinante.
5.3 O PD1-H944 NÃO ESTIMULA SIGNIFICATIVAMENTE A FUNÇÃO DE ADCC DA VIA CD16A DO RECEPTOR FC
[0141] Nesse ensaio, a célula efetora Jurkat- NFAT-Luc2p-CD16A (SinoCellTech Ltd) e a célula-alvo CHO-PD- 1 (SinoCellTech Ltd) foram usadas como materiais de ensaio para medir o efeito de ADCC mediado por PD1-H944 pelo método de sistema de gene repórter da CD16a (V158) altamente ativa recombinante. O mecanismo funciona da seguinte maneira: quando duas células são cocultivadas e o PD1-H944 é adicionado simultaneamente, o fragmento Fab de PD1-H944 se liga à células-alvo superexpressas de PD-1, fazendo, então, com que seu fragmento Fc se ligue às células efetoras portadoras da CD16A de receptor Fcγ, consequentemente, ativa as células efetoras Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A e promove a quimiluminescência mediada por NFAT-RE.
[0142] As células-alvo CHO-PD-1 foram inoculadas a 2 ×104/poço em uma placa com 96 poços e cultivadas de um dia para o outro em meio DMEM que contém 10% de FBS, e o sobrenadante foi removido. As placas foram lavadas duas vezes com meio RPMI 1640 (livre de vermelho fenol) que contém 0,1% de BSA e, em seguida, o anticorpo PD1-H944-1-IgG1(o), PD1-H944, Nivolumab e anticorpo H7N9-R1-
IgG4 de controle negativo (Sino Biological, Inc.) foram adicionados a concentrações diferentes (consultar as Figuras 14A-B) a 40 μl/poço, 1×106 células efetoras Jurkat-NFAT- Luc2p-CD16A a 40 μl/poço foram adicionadas e colocadas em um incubador CO2 a 37 °C e 5% de CO2 durante 4 horas. Cada ensaio foi realizado em tripleto em células-alvo, células efetoras e controle negativo. Ao término de 4 horas, 20 μl/poço de tampão de lise passiva 5X (Promega) foram adicionados, e a placa com 96 poços foi colocada em um refrigerador a -80 °C para teste. Para o ensaio, as placas com 96 poços foram desgeladas à temperatura ambiente, agitadas e 20 μl do sobrenadante por poço foram transferidos a uma placa branca de 96 poços para detecção de luminescência pelo ensaio Luminal de Microplacas LB960.
[0143] Os resultados mostraram que o anticorpo PD1-H944-1-IgG1(o) de controle positivo teve um efeito de medição de ADCC significativo, o Nivolumab teve um efeito de ADCC mais fraco ao passo que o PD1-H944 teve um efeito de ADCC mais fraco que o Nivolumab na faixa de concentração de 0,018-300 ng/ml (p<0,01). A Figura 14A e a Figura 14B mostram os resultados de diferentes lotes de ensaios. As Figuras 14C e 14D indicam a intensidade de bioluminescência (RLU) que corresponde ponto mais alto da concentração de anticorpo (300 ng/ml) em A e B, respectivamente. Nesse ensaio funcional de ADCC sensível, a ativação celular acionada pela ligação de PD1-H944 à CD16a foi significativamente inferior àquela do Nivolumab, e os resultados foram repetíveis. A baixa atividade de ADCC do fármaco de PD1-H944 é um bom suporte para a eficácia e segurança desse anticorpo na clínica.
5.4 O PD1-H944 NÃO ATIVA SIGNIFICATIVAMENTE A FUNÇÃO DE CDC
DA VIA DE C1q de complemento
[0144] Após sua ligação às células tumorais superexpressas de PD-1, o PD1-H944 pôde ativar a via de complemento clássica para exterminar células tumorais, causando a morte das mesmas. Nesse ensaio, o efeito de CDC do PD1-H944 foi investigado com o uso do método WST-8.
[0145] As células CHO-PD-1 foram suspensas novamente no meio 1640 RPMI que contém 0,1% de BSA (SinoCellTech Ltd) e inoculadas de maneira uniforme em placas com 96 poços a 5 × 104/poço, seguido da adição de anticorpos em concentrações diferentes (Figura 15) a 50 μl/poço e, em seguida, da C1q de complemento a uma diluição de 1:4 a 50 μl/poço (uma lambda). Em seguida, os anticorpos foram o anticorpo PD1-H944-1-IgG1(o) de controle positivo (Sino Biological, Inc.), PD1-H944, Nivolumab e o anticorpo de PD1- H944-1-IgG1 de controle negativo (Sino Biological, Inc.), com poço branco de ensaio B (sem células) e controle negativo M (com células, porém sem anticorpo). Após a incubação durante 3 horas a 37 °C, 15 μl de solução de desenvolvimento de cor WST-8 foi adicionada a cada poço, e absorbância foi medida a 450 nm e 630 nm no Analisador ELISA após a estabilização do desenvolvimento de cor. Os resultados foram calculados com o uso dos valores de absorbância OD450-OD630 com o valor de poço branco subtraído. % de extermínio = (OD do controle negativo M - OD da amostra)/OD do controle negativo M × 100%.
[0146] Os resultados mostraram que o PD1-H944, Nivolumab e o anticorpo de controle negativo não teve efeito de CDC no CHO-PD-1, uma célula tumoral que superexpressa a PD-1, ao passo que o anticorpo de controle positivo teve o efeito de extermínio no CHO-PD-1 com uma taxa de extermínio máximo de 82,1%, os resultados são mostrados na Figura 15. O ensaio de CDC também confirmou que o PD1-H944 não teve efeito de CDC nas células-alvo que expressam a PD-1, demonstrando boa segurança do anticorpo.
5.5 O PD1-H944 INIBE DE MANEIRA SEGURANÇA A PROLIFERAÇÃO DO
MODELO TUMORAL DE TRANSPLANTE SUBCUTÂNEO DE CÂNCER DE CÓLON MC38 EM CAMUNDONGOS COM PD-1 HUMANIZADA IN VIVO (1) ESTUDO FARMACOCINÉTICO I DE PD1-H944 EM UM MODELO DE CAMUNDONGO COM PD-1 HUMANIZADA COM TUMOR DE TRANSPLANTE SUBCUTÂNEO DE CÂNCER DE CÓLON MC38
[0147] As células de MC38 no estágio de proliferação logarítmica (Sun Ran Shanghai Biotechnology Co., Ltd.) foram usadas para inoculação tumoral. As células de MC38 suspensas novamente em PBS foram inoculadas a 5 × 105 células/0,1 ml em camundongos humanizados com B-hPD-1 (Biocytogen) (obtidos substituindo-se parte do éxon 2 do gene de PD-1 dos camundongos C57BL/6 pela parte correspondente do genoma de PD-1 humana) por via subcutânea no lado direito do tórax lateral de camundongos, 47 camundongos no total. Após o crescimento do volume tumoral em aproximadamente 100 mm3, os camundongos foram eleitos de acordo com seu volume tumoral individual, atribuído aleatoriamente a 5 grupos com o uso do software Excel, 8 animais em cada grupo. Os grupos 4 e 5 foram administrados com outros anticorpos anti-PD-1 irrelevantes para essa aplicação, então, os dados dos mesmos não são apresentados no presente documento. A dosagem foi iniciada no dia do agrupamento. Os camundongos foram administrados por injeção intraperitoneal (I.P.), uma vez a cada 3 dias por 6 doses consecutivas, executados 10 dias após a última dose e o tecido com tumor foi removido para pesagem. O regime de dosagem específico foi mostrado na Tabela 3 a seguir. O efeito antitumoral do fármaco foi avaliado calculando-se a taxa de inibição do crescimento tumoral TGI (%). TGI (%) < 60% foi considerada ineficaz; TGI (%) ≥ 60% e o volume tumoral do grupo tratado foi significativamente inferior àquela do grupo de controle de solvente (P<0,05) foram considerados eficazes, isto é, tiveram um efeito inibidor significativo no crescimento tumoral. A TGI (%) foi calculado conforme a seguir.
[0148] TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] × 100, em que
[0149] Ti: o volume tumoral médio no grupo de tratamento no dia i.
[0150] T0: o volume tumoral médio no grupo de tratamento no dia 0.
[0151] Vi: o volume tumoral médio do grupo de controle de solvente no dia i.
[0152] V0: volume tumoral médio do grupo de controle de solvente no dia 0.
[0153] Os animais foram executados no término do ensaio, pesados quanto ao peso tumoral, e a taxa de inibição de peso tumoral IRTW% foi calculada com IRTW%> 60% como o índice de referência da eficácia, calculado conforme a seguir.
[0154] Taxa de inibição do peso tumoral IRTW (%) = (Wcontrole de solvente - Wgrupo de tratamento)/W controle de solvente × 100, W é o peso tumoral. TABELA 3. GRUPOS E REGIMES DE DOSAGEM
Programa Rota de n° de Fármacos Dose de Grupo administraçã animais (mg/kg)a tratamen o to Controle 1 8 de -- I.P. Q3d x 6 solvente Nivoluma I.P. 2 8 20 Q3d x 6 b 3 8 PD1-H944 20 I.P. Q3d x 6 Observação: a: O volume da administração é calculado a 10 μl/g com base no peso corporal do animal testado.
[0155] Todos os animais de teste estiveram em boa condição geral em termos de atividade e alimentação durante o período de dosagem, e o peso corporal deles aumentou até certo ponto. Não houve diferença significativa (P>0,05) no peso corporal dos animais após a administração do fármaco de teste (grupo 3) e o fármaco de controle (grupo 2). As mudanças no peso corporal de todos os animais são mostradas na Figura 16 e Tabela 4. TABELA 4. EFEITO DO PD1-H944 NO PESO CORPORAL EM CAMUNDONGOS HUMANIZADOS COM B-HPD-1 SUBMETIDOS A TRANSPLANTE DE CÂNCER DE CÓLON MC38 Peso corporal (g)a Mudança de n° de 25 dias peso após Grupo animai Antes da 25 dias de após a s c administra P b administraç primeira ção ão (g) dose Grupo 1: Controle de 8 19,9±0,4 23,7±0,5 -- +3,8 solvente Grupo 2: 0, 20 mg/kg de 8 19,8±0,8 21,8±1,1 10 +2,0 Nivolumab 5 Grupo 3: 20 0, mg/kg de PD1- 8 20,0±0,6 22,3±0,6 07 +2,3 H944 4 a: média ± erro padrão. b: comparação estatística do peso corporal no grupo de tratamento àquele do grupo de controle de solvente 25 dias após administração, teste t. c: O grupo 2 teve 7 camundongos no término do experimento.
[0156] Os resultados de volume tumoral para cada grupo no teste são mostrados na Tabela 5 e na Figura
17. TABELA 5: EFEITO DE PD1-H944 NO VOLUME TUMORAL EM CAMUNDONGOS HUMANIZADOS COM B-HPD-1 SUBMETIDOS A TRANSPLANTE DE CÂNCER DE CÓLON MC38 Controle de Nivolumab PD1-H944 solvente Dias Volume Volume Volume
TGI TGI Tumoral N Tumoral N Tumoral N (%) (%) (mm3) (mm3) (mm3) 6 104±7 8 104±7 8 / 103±7 8 / 8 215±23 8 181±21 8 30,4 170±19 8 39,5 12 367±59 8 333±39 8 13,0 202±26*  8 62,3 15 618±84 8 432±58 8 36,1 195±33**  8 82,2 19 802±118 8 648±85 8 22,0 189±40**  8 87,7 22 1009±143 8 870±152 8 15,4 182±40**  8 91,3 26 1363±252 8 1310±221 8 4,3 162±47**  8 95,3 28 1745±339 8 1608±240 8 8,3 156±45**  8 96,8 31 2171±430 8 1802±228 7 17,8 171±51**  8 96,7 Observação: *P<0,05, **P<0,01 em comparação ao controle de solvente; P <0,05, P<0,01 em comparação ao grupo Nivolumab. Dias: Número de dias após inoculação celular
[0157] 25 dias após a primeira dose, todos os animais foram submetidos à eutanásia, e os tumores foram removidos, pesados e fotografados. Os pesos tumorais foram comparados estatisticamente entre grupo, e os resultados são resumidos na Tabela 6 e na Figura 18. TABELA 6: EFEITO DE PD1-H944 NO PESO TUMORAL EM CAMUNDONGOS HUMANIZADOS COM B-HPD-1 SUBMETIDOS A TRANSPLANTE DE CÂNCER DE CÓLON MC38 Taxa de n° de inibição de Grupo Peso tumoral (g) animais peso tumoral IRTW (%) Grupo 1: Controle de 8 1,719±0,310 -- solvente Grupo 2: 7 1,492±0,274 13,2 Nivolumab Grupo 3: PD1-  8 0,044±0,017** 97,4 H944 Observação: *P<0,05, **P<0,01 em comparação ao controle de solvente; P<0,05, P<0,01 em comparação ao grupo Nivolumab
[0158] Consistente com os resultados de volume tumoral, o Nivolumab não inibiu significativamente os tumores nesse modelo, ao passo que o peso tumoral médio do grupo PD1-H944 foi 0,044 ± 0,017 g. Sua taxa de inibição do peso tumoral (IRTW) atingiu 97,4%. A análise de dados mostrou que os tumores do grupo PD1-H944 foram significativamente diferentes daqueles dos controles de solvente (P<0,05), o que demonstra a eficácia antitumoral significativa do PD1- H944.
[0159] No término do ensaio, o volume tumoral médio do grupo de controle de solvente foi 2171±430 mm3, e o peso tumoral foi 1,719±0,310 g. O volume tumoral médio do Nivolumab de grupo de controle positivo (20 mg/kg) foi 1802±228 mm3, a TGI% foi 17,8% e o peso tumoral foi
1,492±0,274 g. A taxa de inibição do peso tumoral IRTW foi 13,2%, o que não foi significativamente diferente do volume tumoral do grupo de controle de solvente (P=0,480). Em contrapartida, o volume tumoral médio do PD1-H944 foi 171±51 mm3, a TGI% foi 96,7%, o peso tumoral foi 0,044±0,017 g, e a taxa de inibição do peso tumoral IRTW foi 97,4%, o que foi significativamente diferente e em comparação ao volume tumoral do controle de solvente (P<0,05), indicando que o anticorpo doador PD1-H944 ligado ao epítopo PD-1 foi eficaz e mostrou inibição significativa de tumores de enxerto subcutâneo de câncer de cólon MC38 a um nível de dose de 20 mg/kg. (2) ESTUDO FARMACOCINÉTICO II DE PD1-H944 EM UM CAMUNDONGO PD-1 HUMANIZADO COM TUMOR DE TRANSPLANTE SUBCUTÂNEO DE CÂNCER DE CÓLON MC38
[0160] As células de MC38 no estágio de proliferação logarítmica (Sun Ran Shanghai Biotechnology Co., Ltd.) foram usadas para inoculação tumoral. As células de MC38 suspensas novamente em PBS foram inoculadas a 5 × 105 células/0,1 ml em camundongos humanizados com B-hPD-1 (Biocytogen) (camundongos obtidos substituindo-se parte do éxon 2 do gene de PD-1 dos camundongos C57BL/6 pela parte correspondente do genoma de PD-1 humana). Um total de 80 camundongos foi inoculado por via subcutânea no lado direito do tórax lateral. Após o crescimento do volume tumoral em aproximadamente 100 mm3, os camundongos foram eleitos de acordo com seu volume tumoral individual, atribuído aleatoriamente a 8 grupos com o uso do software Excel, 8 animais em cada grupo. Os grupos 3, 4, 7 e 8 foram administrados com outros anticorpos anti-PD-1 irrelevantes para essa aplicação, então, os dados dos mesmos não foram apresentados no presente documento. A dosagem foi iniciada no dia do agrupamento. Os camundongos foram administrados por injeção intraperitoneal (I.P.), uma vez que a cada 3 dias por 6 doses consecutivas, em que os camundongos foram executados 10 dias após a última dose e o tecido tumoral foi removido para pesagem. O regime de dosagem específico é mostrado na Tabela 7 a seguir. TABELA 7: GRUPOS DE TESTE E DOSAGEM Dose Programa Rota de n° de Fármacos de Grupo administraçã animais sob teste (mg/kg) tratament o a o Controle de 1 8 -- I.P. Q3d x 6 solvente Pembrolizum I.P. 2 8 20 Q3d x 6 abb 5 8 PD1-H944 8 I.P. Q3d x 6 6 8 PD1-H944 2 I.P. Q3d x 6 Observação: a: O volume de administração foi calculado com base no peso corporal do animal a 10 μl/g; b: Pembrolizumab: Sino Biological, Inc.
[0161] O efeito antitumoral do fármaco foi avaliado calculando-se a taxa de inibição de crescimento tumoral TGI(%). A TGI(%) < 60% foi considerada ineficaz; a TGI(%) ≥ 60% e o volume tumoral do grupo tratado estatisticamente inferior àquela do grupo de controle de solvente (p<0,05) foi considerada eficaz, isto é, teve um efeito inibidor significativo no crescimento tumoral. A TGI(%) foi calculada conforme a seguir.
[0162] TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] × 100, em que
[0163] Ti: o volume tumoral médio do grupo de tratamento no dia i.
[0164] T0: o volume tumoral médio do grupo de tratamento no dia 0.
[0165] Vi: o volume tumoral médio do grupo de controle de solvente no dia i.
[0166] V0: volume tumoral médio do grupo de controle de solvente no dia 0.
[0167] Os animais são executados no término do ensaio, o tumor foi pesado, e taxa de inibição de peso tumoral IRTW% foi calculada, em que IRTW% > 60% foi considerada o índice de referência de eficácia, calculado com o uso da fórmula a seguir,
[0168] taxa de inibição de peso tumoral IRTW (%) = (W controle de solvente - W grupo de tratamento)/W controle de solvente ×100, W é o peso tumoral.
[0169] Todos os animais de teste estiveram sob boas condições gerais em termos de atividade e alimentação durante a administração do fármaco, e até certo ponto, seu peso corporal aumentou. Não houve diferença significativa no peso corporal dos animais após a administração dos fármacos de teste e de controle (P>0,05) (Tabela 8 e Figura 19). TABELA 8: EFEITO DO PD1-H944 NO PESO CORPORAL DE CAMUNDONGOS HUMANIZADOS COM B-HPD-1 SUBMETIDOS A TRANSPLANTE DE CÂNCER DE CÓLON MC38 Peso corporal (g)a Mudança de n° de 23 dias peso após Grupo animai Antes da após a 23 dias de s administra Pb dosagem primeir ção (g) a dose Grupo 1: 29,5±0, Controle de 8 27,3±0,5 -- +2,2 4 solvente Grupo 2: 20 8 27,6±0,6 28,2±0, 0,062 +0,6 mg/kg de 5 Pembrolizumab Grupo 5: 28,9±0, 8 mg/kg de 8 28,1±0,6 0,421 +0,8 6 PD1-H944 Grupo 6: 28,4±0, 2 mg/kg de 8 27,3±0,5 0,070 +1,1 4 PD1-H944 Observação: a: média ± erro padrão. b: comparação estatística do grupo de tratamento peso corporal ao grupo de controle de solvente peso corporal 23 dias após dosagem, teste t.
[0170] Os volumes tumorais para cada grupo no ensaio foram mostrados na Tabela 9 e na Figura 20. TABELA 9: EFEITO DE PD1-H944 NO VOLUME TUMORAL EM CAMUNDONGOS HUMANIZADOS COM B-HPD-1 SUBMETIDOS A TRANSPLANTE DE CÂNCER DE CÓLON MC38 (MÉDIA ± ERRO PADRÃO) Solvente Pembrolizumab PD1-H944 PD1-H944 Di Grupo de Grupo 20 Grupo 8 Grupo 2 a controle mg/kg mg/kg mg/kg Volu Volum Volume Volume me e TGI Tumora TGI Tumora TGI Tumo N Tumor N N N (%) l (%) l (%) ral al (mm ) 3 (mm ) 3 (mm3) (mm3) 148± 152±1 6 8 8 / 148±15 8 / 146±12 8 / 11 4 - - 274± 248±2 23, 8 8 8 308±22 8 26, 312±24 8 31, 29 0 6 3 2 782± 334±3 71, 415±61 57, 454±31 51, 11 8 8 8 8 129 3** 2 * 9 * 4 1052 309±1 82, 428±88 69, 429±47 68, 16 8 8 8 8 ±148 03** 6 ** 0 ** 7 1597 263±1 92, 448±11 79, 509±91 75, 19 8 8 8 8 ±286 34** 3 1** 3 ** 0 1783 213±1 96, 441±95 82, 435±88 82, 21 8 8 8 8 ±339 10** 3 ** 1 ** 3 26 2712 8 212±1 8 97, 350±11 8 92, 470±12 8 87,
±590 49** 7 1** 1 0** 3 3405 248±1 97, 484±82 89, 626±15 85, 29 8 8 8 8 ±624 76** 0 ** 7 0** 3 Observação: *P<0,05, **P<0,01 em comparação ao controle de solvente. dias: número de dias após inoculação celular; N: número de animais no grupo incluído na estatística
[0171] 24 dias após a primeira dose, todos os animais foram submetidos à eutanásia, e os tumores foram removidos, pesados e fotografados. Os pesos tumorais foram comparados estatisticamente entre grupo, e os resultados são resumidos na Tabela 10 e na Figura 21. TABELA 10: EFEITO DE PD1-H944 NO PESO TUMORAL EM CAMUNDONGOS HUMANIZADOS COM B-HPD-1 SUBMETIDOS A TRANSPLANTE DE CÂNCER DE CÓLON MC38 (MÉDIA ± ERRO PADRÃO) n° de Peso tumoral IRTW(%) do Grupo animais (g) Tumor Grupo de controle de 8 2,888±0,426 -- solvente Pembrolizumab 0,186±0,158* 8 93,5 Grupo 20 mg/kg * Grupo 8 mg/kg de 0,352±0,106* 8 87,8 PD1-H944 * Grupo 2 mg/kg de 0,441±0,129* 8 84,7 PD1-H944 * Observação: *P < 0,05, **P < 0,01 em comparação ao grupo de controle de solvente.
[0172] Para o grupo de controle de solvente: o volume tumoral continuou a crescer após o agrupamento e o volume tumoral médio no término do teste ter sido 3405 ± 624 mm3.
[0173] Para o grupo de controle positivo: após a administração de Pembrolizumab a 20 mg/kg, o volume tumoral aumentou lentamente em comparação ao grupo de controle de solvente, com uma diferença significativamente no volume tumoral a partir do dia 5 da administração (P<0,05); a TGI% no término do teste foi 97,0% e a taxa de inibição do peso tumoral foi 93,5%, P<0,05 em comparação ao grupo de controle de solvente. O Pembrolizumab mostrou inibição de tumor evidente nesse modelo de eficácia, o que indica que esse modelo pode ser usado para a avaliação de eficácia do fármaco de anticorpo de ligação ao epítopo Keytruda.
[0174] Para o grupo 8 mg/kg de PD1-H944: Após a administração do PD1-H944 a 8 mg/kg, o volume tumoral aumentou lentamente em comparação ao grupo de controle de solvente, e o volume tumoral mostrou uma diferença significativamente do 5º dia de administração (P<0,05); a TGI% no término do teste foi 89,7% e a taxa de inibição do peso tumoral foi 87,8%, P<0,05 em comparação ao grupo de controle de solvente.
[0175] Para o grupo 2 mg/kg de PD1-H944: Após PD1-H944 administrado a 2 mg/kg, o volume tumoral aumentou lentamente em comparação ao grupo de controle de solvente, com uma diferença significativa no volume tumoral do dia 5 (p<0,05); a TGI% no término do teste foi 85,3%, e a taxa de inibição de peso tumoral foi 84,7%, p<0,05 em comparação ao grupo de controle de solvente. Isso sugere novamente que o anticorpo PD1-H944 submetido à ligação ao epítopo PD-1 é eficaz nesse modelo, exibindo um efeito de supressão sobre o tumor significativo nos tumores de enxerto subcutâneo de câncer de cólon MC38 que exibem correlação de dose. A eficácia antitumoral de PD1-H944 e Pembrolizumab nesse ensaio também foi confirmada em termos de peso tumoral.
[0176] Os resultados desse ensaio mostraram que a administração intraperitoneal de PD1-H944 a 8 mg/kg ou a 2 mg/kg a cada 3 dias por 6 doses consecutivas inibiu significativamente o crescimento de tumores submetidos a transplante de MC38 em camundongos humanizados com PD-1 (P<0,05), e a caracterização do animal e os pesos corporais dos grupos administrados não foram diferentes daqueles do grupo-modelo. Considerando a preferência do desenho do modelo para diferentes epítopos de anticorpos, esse ensaio não avaliou a diferença de eficácia entre PD1-H944 e Pembrolizumab.
[0177] O estudo farmacocinético in vivo investigou o efeito antitumoral do PD1-H944 isoladamente em câncer de cólon MC38 submetido a transplante subcutâneo em camundongo PD-1 C57BL/6 humanizado como o modelo animal. O camundongo humanizado com B-hPD-1 é um camundongo C57BL/6 camundongo cujo gene de PD-1 foi humanizado, tornando o camundongo adequado para avaliação in vivo da eficácia de fármacos de anticorpo PD-1 anti-humano. O modelo foi seletivo para a eficácia de diferentes epítopos de anticorpos PD-1, e o Pembrolizumab mostrou inibição tumoral significativa nesse modelo. Os resultados mostraram que o PD1-H944 sozinho (2, 8 e 20 mg/kg administrados a cada 3 dias para 6 doses consecutivas) inibiu significativamente o crescimento de tumores MC38 submetidos a transplante, e os dados resumidos são apresentados nas Tabelas 11 e 12. TABELA 11: EFEITO ANTITUMORAL DE PD1-H944 EM CAMUNDONGOS HUMANIZADOS COM B-HPD-1 SUBMETIDOS A TRANSPLANTE DE CÂNCER DE CÓLON MC38 Subgrupos Duração e Rota de No término do ensaio n=7-8 frequência administraç Taxa de da ão inibição IRTW(%) do administra do Volume Tumor ção Tumoral TGI (%) Grupo de 3 controle de dias/dose 0,0 0,0 solvente ×6 vezes, observados Injeção 20 mg/kg de durante 10 intraperito 17,8 13,2 Nivolumab dias após neal interrupçã 20 mg/kg de o do 96,7 97,4 PD1-H944 fármaco TABELA 12: EFEITOS ANTITUMORAIS DE DIFERENTES DOSES DE PD1- H944 EM CAMUNDONGO PD-1 HUMANIZADO COM TUMORES DE
TRANSPLANTE DE CÂNCER DE CÓLON No término do ensaio Duração e frequência Rota de Taxa de Subgrupos da administraç Inibição IRTW (%) do n=7-8 do Volume administra ão tumor ção tumoral TGI (%) Grupo de controle de 3 0,0 0,0 solvente dias/dose Pembrolizuma ×6 vezes, b observados Injeção 97,0 93,5 20 mg/kg durante 9 intraperito dias após neal 2 mg/kg de interrupçã 85,3 84,7 PD1-H944 o do 8mg/kg de fármaco 89,7 87,8 PD1-H944 EXEMPLO 6 IDENTIFICAÇÃO DE SÍTIOS DE AMINOÁCIDO LIGADOS ESPECIFICAMENTE PELO PD1-H944
[0178] Os dados do Exemplo 4.2 mostram que o PD1-H944 compete de maneira eficaz com o PD-L1 (Figura 7A) ou com o PD-L2 (Figura 7B) pela ligação à proteína PD-1, o que demonstra a sobreposição entre o epítopo de ligação no PD-1 tido como alvo pelo PD1-H944 e que foi tido como alvo pelo ligante PD-L1 ou PD-L2.
6.1 SIMULAÇÃO MOLECULAR QUE PREVÊ EPÍTOPOS CONFORMACIONAIS DE PD1-H944
[0179] A fim de investigar a interação entre a interface de proteína PD-1-PD1-H944, nesse exemplo, é realizado o encaixe ZDOCK do PD1-H944 e a proteína PD-1. Com base no fato de que o epítopo de ligação da proteína PD-1 tido como alvo pelo PD1-H944 se sobrepõe àquele tido como alvo pelo ligante PD-L1, a modelagem de homologia para PD1- H944 foi realizada com o com o uso do programa de modelo de anticorpo em DS 4.0 (Accelrys Software Inc.), e a validade de construto do modelo final foi testada pelo mapa de Ramachandran. A estrutura tridimensional da proteína PD-1 foi transferida por download do banco de dados PDB (PDB ID: 4ZQK) e inicializada pelo programa de Preparação de Proteína. O modelo de ligação do modelo PD1-H944 e da estrutura PD-1 foi realizado pelo programa ZDOCK. O dez primeiros na pontuação foram, então, otimizados por RDOCK. O modelo foi analisado adicionalmente pelo programa de Análise de Interface de Proteína (Figura 22). A interação da interface de modelo de encaixe mostrou que as sequências de peptídeos principais ligadas pelo PD1-H944 à proteína PD-1 foram folhas CC’ e FG (Tabela 13). TABELA 13 AS SEQUÊNCIAS DE PEPTÍDEOS PRINCIPAIS EM PD1-H944 SE LIGAM À PROTEÍNA PD-1 (SUBLINHADA) PREVISTA POR
SIMULAÇÕES MOLECULARES Localização Sequências Folha CC’ 60SESFV64 78KLAAFPEDRSQP89 Folha FG 128LAPKAQI134
6.2 VALIDAÇÃO DE EPÍTOPOS DE LIGAÇÃO A PD1-H944 TESTADOS
POR MUTANTES DE PROTEÍNA PD-1
[0180] A fim de confirmar adicionalmente o epítopo funcional de PD1-H944, com base nas sequências de peptídeos previstas como sendo os sítios principais para a ligação de PD1-H944 à proteína PD-1 na Tabela 13, uma série de mutantes de PD-1 de proteína mutante de alanina foi preparada e analisada por ensaios ELISA. A fim de validar a precisão do modelo, diversos sítios fora do modelo do Exemplo
6.1 também foram eleitos para esse estudo (Tabela 14), e esses sítios mutantes foram amplamente agrupados em cinco epítopos conformacionais espaciais (Figura 23). TABELA 14: DESENHO DE MUTANTES NA REGIÃO EXTRACELULAR DA PROTEÍNA PD-1 RECOMBINANTE Distribuição Sítios de mutação alça N D29A\R30A, R30A Folha CC’ E61A, N66A, K78A, D85A, D85A\S87A Folha FG P130A, P130A \K131A, E136A\ R139A
[0181] A ligação de cada mutante na Tabela 14 ao PD1-H944 foi determinada por ELISA, de acordo com o método do Exemplo 4.2. Os mutantes têm um grau diferente de diminuição na ligação em comparação à proteína PD-1 não mutante. Os dados foram analisados e plotados com o uso do Excel 2007 com perfil mutante de proteína PD-1 como a coordenada horizontal e a taxa de ligação como a coordenada vertical [taxa de ligação = OD (mutante de proteína PD-1 )/OD (proteína PD-1)×100%)]. Os resultados mostraram que os sítios de ligação principais da proteína PD-1 para o ligante PD-L1 foram o Sítio 2, Sítio 3, Sítio 4 e Sítio 5 nas folhas CC’ e FG da proteína PD-1, que foram consistentes com o complexo de cristal (PDB ID: 4ZQK). Os sítios de ligação para a ligação de Nivolumab de controle positivo à proteína PD-1 foram localizados principalmente no Sítio 1 e no Sítio 4 de sua alça N e folhas FG, e esse resultado também foi consistente com a análise de seus cristais complexos (PDB ID: 5WT9); os sítios de ligação principais para PD1-H944 à proteína PD-1 foram E61, K78, D85 e P130 no Sítio 3 e Sítio 4. Os resultados também foram consistentes com aqueles do modelo de encaixe no exemplo acima (Figura 24 e Tabela 15) e validaram a precisão do modelo de encaixe entre PD1-H944 e as proteínas PD-1. TABELA 15: LIGAÇÃO DE PD-L1, DE NIVOLUMAB E DE PD1-H944 A CADA MUTANTE DE PD-1 alça N Folhas CC’ Folhas FG Sítio 1 Sítio 2 Sítio 3 Sítio 4 Síti PD- o 5 1 D29 R30 N66 K78 D85 D85 E61 P130 P130 E136
A A A A A A A A A A R30 S87 K131 R139
A A A A PD-L1 + + - - - +/- + - - - + Nivolu - +/- + +/- + + +/- - - + + mab PD-1- + + + +/- - - - - - + + H944 Observação:+:representa a taxa de ligação >85%, nenhum sítio de ligação sensível; +/-:representa 85%≥taxa de ligação>50%, sítios de ligação parcialmente sensíveis;-:representa a taxa de ligação<50%, sítios de ligação sensíveis.
[0182] O modelo de encaixe entre PD1-H944 e proteína PD-1 mostra que o epítopo de ligação na proteína PD-1 tida como alvo pelo PD1-H944 se sobrepõe a isso pelo ligante PD-L1. Esse fato sustenta a ideia de que o P1-H944 atua por meio de impedimento estérico de espaço direto.
Enquanto isso, a sobreposição entre o epítopo tido como alvo tanto pelo PD1-H944 quanto pelo Nivolumab sugeriu que o PD1- H944 tem uma região maior para bloquear a ligação do PD-L1 aos epítopos (Figuras 25A-C). Portanto, o PD1-H944 pode ter eficácia terapêutica superior em um tratamento oncológico.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve ou porção da mesma e/ou uma região variável de cadeia pesada ou porção da mesma; em que a região variável de cadeia leve ou porção da mesma compreende um CDR1 de cadeia leve que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, um CDR2 de cadeia leve que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e um CDR3 de cadeia leve que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; e a região variável de cadeia pesada ou porção da mesma compreende um CDR1 de cadeia pesada que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, CDR2 de cadeia pesada que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e CDR3 de cadeia pesada que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
2. Anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreender, consistir em ou consistir essencialmente em: uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 92%, 95%, 98% ou 100% de identidade de sequência com a região variável de anticorpo PD-1 de sequência de cadeia leve de SEQ ID NO:23 e/ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 92%, 95%, 98% ou 100% de identidade de sequência com a região variável de anticorpo PD-1 de sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO:22.
3. Anticorpo PD-1 isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o dito anticorpo ainda compreender uma região constante de cadeia leve e uma região constante de cadeia pesada, sendo que, preferencialmente, a dita região constante de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 92%, 95%, 98% ou 100% identidade de sequência com a região constante de cadeia leve de kappa de SEQ ID NO:25 e/ou a dita região constante de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 92%, 95%, 98% ou 100% de identidade de sequência com a região constante de cadeia pesada IgG4 de SEQ ID NO:24.
4. Anticorpo PD-1 isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado por ser um anticorpo IgG, preferencialmente um anticorpo IgG4.
5. Anticorpo PD-1 isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado por ser um anticorpo monoclonal.
6. Anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado por se ligar à proteína PD-1 humana recombinante com uma afinidade na média de KD de 20 a 200 pM, preferencialmente de 60 a 70 pM, mais preferencialmente 64,8 pM.
7. Anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado por se ligar especificamente a uma molécula de proteína PD-1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 ou a uma molécula de proteína que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 92%, 95%, 98% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1.
8. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 7, caracterizado por se ligar especificamente a uma sequência de peptídeos selecionada a partir de pelo menos uma dentre regiões extracelulares de proteína PD-1 60SESFV64, 78KLAAFPEDRSQP89, 128LAPKAQI134; preferencialmente, se ligar especificamente a resíduos de aminoácido selecionados a partir de pelo menos uma das regiões extracelulares de proteína PD-1 E61, K78, D85 e P130.
9. Anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado por se ligar especificamente a uma sequência de peptídeos selecionada a partir de pelo menos uma das regiões extracelulares de proteína PD-1 60SESFV64, 78KLAAFPEDRSQP89, 128LAPKAQI134; preferencialmente, se ligar especificamente a resíduos de aminoácido selecionados a partir de pelo menos uma das regiões extracelulares de proteína PD-1 E61, K78, D85 e P130.
10. Anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado por o fragmento de ligação ao antígeno estar sob a forma de Fv, Fab, Fab′, Fab′-SH, F(ab′)2, fragmento de Fd, fragmento de Fd’, molécula de anticorpo de cadeia única ou anticorpo de domínio único; em que a molécula de anticorpo de cadeia única é, preferencialmente, scFv, di-scFv, tri-scFv, diacorpo ou scFab.
11. Molécula de fármaco modificada caracterizada por ser um conjugado covalente ou não covalente ou fármaco de fusão recombinante de múltiplos alvos formado pelo anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-10, e outra molécula, sendo que a dita outra molécula é selecionada a partir de um pequeno composto de molécula e/ou uma biomacromolécula.
12. Ácido nucleico isolado caracterizado por compreender, consistir em ou consistir essencialmente em: uma sequência de nucleotídeo que codifica o anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-10, sendo que, preferencialmente, o dito ácido nucleico isolado compreende, consiste em ou consiste essencialmente em: a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 26 e/ou 27.
13. Vetor caracterizado por compreender o ácido nucleico isolado, conforme definido na reivindicação 12.
14. Célula isolada caracterizada por compreender o ácido nucleico isolado, conforme definido na reivindicação 12, e/ou compreender o vetor, conforme definido na reivindicação 13.
15. Método para produzir o anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-10, sendo que o dito método é caracterizado por compreender a cultura de células isoladas, conforme definido na reivindicação 14, e a purificação do dito anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
16. Uso do anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-10, ou da molécula de fármaco modificada, conforme definido na reivindicação 11, caracterizado por se destinar à preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor ou câncer.
17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o dito tumor ou câncer ser câncer de cólon.
18. Uso do anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-10, ou da molécula de fármaco modificada, conforme definido na reivindicação 11, caracterizado por se destinar ao tratamento de um tumor ou câncer.
19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o dito tumor ou câncer ser câncer de cólon.
20. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-10, ou a molécula de fármaco modificada, conforme definido na reivindicação 11.
21. Combinação farmacêutica caracterizada por compreender a composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 20, com um ou mais outros agentes terapêuticos.
22. Kit caracterizado por compreender o anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-10, a molécula de fármaco modificada, conforme definido na reivindicação 11, a composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 20, ou a combinação farmacêutica, conforme definido na reivindicação 21, preferencialmente, compreender adicionalmente um dispositivo para administração.
23. Método para tratar um tumor ou câncer caracterizado por compreender a administração, a um indivíduo em necessidade da mesma, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo PD-1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-10, ou da molécula de fármaco modificada, conforme definido na reivindicação 11, ou da composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 20, ou da combinação farmacêutica, conforme definido na reivindicação 21, ou do kit, conforme definido na reivindicação 22, tratando, então, o dito tumor ou câncer, preferencialmente, em que o dito tumor ou câncer é câncer de cólon.
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