JP5935030B2 - 白血病を治療するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2010年5月14日に出願された米国仮特許出願第61/334,991号明細書、2010年8月4日に出願された米国仮特許出願第61/370,745号明細書、2010年8月22日に出願された米国仮特許出願第61/375,863号明細書、2011年3月24日に出願された米国仮特許出願第61/467,376号明細書、および2011年3月24日に出願された米国仮特許出願第61/467,342号明細書の優先権を主張する。これらの特許出願の内容は、その全体を参照によって本明細書に援用する。
この研究は、国立衛生研究所(National Institutes of health)からの補助金番号K08CA128972によって支援された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
「作用物質」は、あらゆる小分子化合物、抗体、核酸分子、またはポリペプチド、またはその断片を意味する。
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遺伝子制御は、基本的に、可逆的な高分子の非共有結合アセンブリーによって支配される。RNAポリメラーゼへの信号伝達は、クロマチンの翻訳後修飾状態を解釈できるアセンブリー要素によって空間的に制御される、より高次のタンパク質複合体を必要とする。エピジェネティックなリーダーは、ヒストンタンパク質またはDNAの共有結合修飾を認識する、1つまたは複数の進化的に保存されたエフェクターモジュールをそれぞれが保有する、構造的に多様なタンパク質である。ヒストン尾部上のリジン残基(Kac)のε−N−アセチル化は、オープンクロマチン構造および転写活性化と関連付けられている(Marushige Proc Natl Acad Sci U S A 73,3937−3941,(1976))。アセチルリジンのコンテクスト特異的分子認識は、主にブロモドメインによって媒介される。
本発明は、BETファミリーメンバー(例えばBRD2、BRD3、BRD4)の第1のブロモドメインのapo結晶構造の結合ポケット中に結合する化合物(例えば、JQ1、および本明細書で記述される式の化合物)を提供する。理論による拘束は望まないが、これらの化合物は、特に、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性リンパ球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単核白血病(CMML)、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群をはじめとするが、これに限定されるものではない白血病を抑制するのに効果的であってもよい。1つのアプローチでは、白血病および関連障害の治療に有用な化合物は、ブロモドメイン構造結合ポケットに結合することが予測される化合物を同定する、分子ドッキングプログラムを使用して選択される。特定の実施形態では、本発明の化合物は、BETファミリーメンバー(例えばBRD2、BRD3、BRD4、BRDT)の生物学的活性を少なくとも10%、25%、50%、75%、または100%妨げ、阻害し、または妨害し、または低下させて、および/または例えばブロモドメインapo結合ポケット中の結合部位に結合することにより、このようなタンパク質の細胞内局在化を妨害し得る。
式中、
XはNまたはCR5であり;
R5は、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;
RBは、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、ヒドロキシラルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または−COO−R3であり;
環Aはアリールまたはヘテロアリールであり;
各RAは独立して、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;または任意の2つのRAはそれにそれぞれが付着する原子と一緒に融合アリールまたはヘテロアリール基を形成し得て;
Rは、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;
R1は−(CH2)n−L(式中、nは0〜3であり、LはHである)、−COO−R3、−CO−R3、−CO−N(R3R4)、−S(O)2−R3、−S(O)2−N(R3R4)、N(R3R4)、N(R4)C(O)R3、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり;
R2はH、D(重水素)、ハロゲン、または任意選択的に置換されるアルキルであり;
各R3は独立して、
(i)H、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリール;
(ii)ヘテロシクロアルキルまたは置換ヘテロシクロアルキル;
(iii)O、S、またはNから選択される、0、1、2、または3個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、−C1〜C8アルキル、−C2〜C8アルケニルまたは−C2〜C8アルキニル;それぞれが任意選択的に置換されていてもよい、−C3〜C12シクロアルキル、置換−C3〜C12シクロアルキル、−C3〜C12シクロアルケニル、または置換−C3〜C12シクロアルケニル;および
(iv)NH2、N=CR4R6
からなる群から選択され;
各R4は独立して、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;またはR3およびR4はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒になって4〜10員環を形成し;
R6は、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;またはR4およびR6はそれにそれらが付着する炭素原子と一緒になって4〜10員環を形成し;
mは0、1、2、または3であるが;
ただし
(a)環Aがチエニルであり、XがNであり、Rがフェニルまたは置換フェニルであり、R2がHであり、RBがメチルであり、R1が−(CH2)n−L(式中、nは1であり、Lは−CO−N(R3R4)である)であれば、次にR3およびR4はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒にならずモルホリノ環を形成せず;
(b)環Aがチエニルであり、XがNであり、Rが置換フェニルであり、R2がHであり、RBがメチルであり、R1が−(CH2)n−L(式中、nは1であり、Lは−CO−N(R3R4)である)であり、R3でR4の一方がHであれば、次にR3およびR4の他方はメチル、ヒドロキシエチル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、ピリジルまたは置換ピリジルでなく;
(c)環Aがチエニルであり、XがNであり、Rが置換フェニルであり、R2がHであり、RBがメチルであり、R1が−(CH2)n−L(式中、nは1であり、Lは−COO−R3である)であれば、次にR3はメチルでもエチルでもない
化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
式中、
XはNまたはCR5であり;
R5は、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;
RBは、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、ヒドロキシラルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または−COO−R3であり;
各RAは独立して、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;または任意の2つのRAはそれにそれぞれが付着する原子と一緒に融合アリールまたはヘテロアリール基を形成し得て;
Rは、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;
R’1はH、−COO−R3、−CO−R3、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり;
各R3は独立して、
(i)H、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール;
(ii)ヘテロシクロアルキルまたは置換ヘテロシクロアルキル;
(iii)O、S、またはNから選択される、0、1、2、または3個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、−C1〜C8アルキル、−C2〜C8アルケニルまたは−C2〜C8アルキニル;それぞれが任意選択的に置換されていてもよい、−C3〜C12シクロアルキル、置換−C3〜C12シクロアルキル、−C3〜C12シクロアルケニル、または置換−C3〜C12シクロアルケニルからなる群から選択され;
mは0、1、2、または3であるが;
ただしR’1が−COO−R3であり、XがNであり、Rが置換フェニルであり、RBがメチルであれば、次にR3はメチルでもエチルでもない
化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
式中、
XはNまたはCR5であり;
R5は、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;
RBは、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、ヒドロキシラルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または−COO−R3であり;
環Aはアリールまたはヘテロアリールであり;
各RAは独立して、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;または任意の2つのRAはそれにそれぞれが付着する原子と一緒に融合アリールまたはヘテロアリール基を形成し得て;
Rは、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;
各R3は独立して、
(i)H、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリール;
(ii)ヘテロシクロアルキルまたは置換ヘテロシクロアルキル;
(iii)O、S、またはNから選択される、0、1、2、または3個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、−C1〜C8アルキル、−C2〜C8アルケニルまたは−C2〜C8アルキニル;それぞれが任意選択的に置換されていてもよい、−C3〜C12シクロアルキル、置換−C3〜C12シクロアルキル、−C3〜C12シクロアルケニル、または置換−C3〜C12シクロアルケニル;および
(iv)NH2、N=CR4R6
からなる群から選択され;
各R4は独立して、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;またはR3およびR4はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒になって4〜10員環を形成し;
R6は、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;またはR4およびR6はそれにそれらが付着する炭素原子と一緒になって4〜10員環を形成し;
mは0、1、2、または3であるが;
ただし
(a)環Aがチエニルであり、XがNであり、Rがフェニルまたは置換フェニルであり、RBがメチルであれば、次にR3およびR4はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒にならずモルホリノ環を形成せず;
(b)環Aがチエニルであり、XがNであり、Rが置換フェニルであり、R2がHであり、RBがメチルであり、R3およびR4の一方がHであれば、次にR3およびR4の他方はメチル、ヒドロキシエチル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、ピリジルまたは置換ピリジルでない、そして
化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
式中、
XはNまたはCR5であり;
R5は、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;
RBは、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、ヒドロキシラルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または−COO−R3であり;
環Aはアリールまたはヘテロアリールであり;
各RAは独立して、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;または任意の2つのRAはそれにそれぞれが付着する原子と一緒に融合アリールまたはヘテロアリール基を形成し得て;
R1は−(CH2)n−L(式中、nは0〜3であり、LはHである)、−COO−R3、−CO−R3、−CO−N(R3R4)、−S(O)2−R3、−S(O)2−N(R3R4)、N(R3R4)、N(R4)C(O)R3、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり;
R2はH、D、ハロゲン、または任意選択的に置換されるアルキルであり;
各R3は独立して、
(i)H、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリール;
(ii)ヘテロシクロアルキルまたは置換ヘテロシクロアルキル;
(iii)O、S、またはNから選択される、0、1、2、または3個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、−C1〜C8アルキル、−C2〜C8アルケニルまたは−C2〜C8アルキニル;それぞれが任意選択的に置換されていてもよい、−C3〜C12シクロアルキル、置換−C3〜C12シクロアルキル、−C3〜C12シクロアルケニル、または置換−C3〜C12シクロアルケニル;および
(iv)NH2、N=CR4R6
からなる群から選択され;
各R4は独立して、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;またはR3およびR4はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒になって4〜10員環を形成し;
R6は、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;またはR4およびR6はそれにそれらが付着する炭素原子と一緒になって4〜10員環を形成し;
mは0、1、2、または3であるが;
ただし
(a)環Aがチエニルであり、XがNであり、R2がHであり、RBがメチルであり、R1が−(CH2)n−L(式中、nは0であり、Lは−CO−N(R3R4)である)であれば、次にR3およびR4はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒にならずモルホリノ環を形成せず;
(b)環Aがチエニルであり、XがNであり、R2がHであり、RBがメチルであり、R1が−(CH2)n−L(式中、nは0であり、Lは−CO−N(R3R4)である)であれば、R3およびR4の一方はHであり、次にR3およびR4の他方はメチル、ヒドロキシエチル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、ピリジルまたは置換ピリジルでなく;
(c)環Aがチエニルであり、XがNであり、R2がHであり、RBがメチルであり、R1が−(CH2)n−L(式中、nは0であり、Lは−COO−R3である)であれば、次にR3はメチルでもエチルでもない
化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
によって表される化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
または
によって表される化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
または
によって表される化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
によって表される化合物のいずれか1つ、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
によって表される化合物のいずれか1つ、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
によって表される化合物のいずれか1つ、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
の構造の1つによって表され、またはその塩、溶媒和化合物または水和物であり得る。
によって表され、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
によって表され、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
によって表され、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
(式中、R、R1、およびR2およびRBは式(I)中と同じ意味を有し;YはO、N、S、またはCR5であり、R5は式(I)中と同じ意味を有し;nは0または1であり;式(VII)中の破線の円は芳香族または非芳香族環を示す)、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
によって表され、またはその塩、溶媒和化合物、または水和物である。
および
からなる群から選択される化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
のいずれかに記載の化合物が挙げられる。
スキーム1に示されるように、JQ1のt−ブチルエステルの加水分解は、カルボン酸を与え、それはジフェニルリン酸アジド(DPPA)で処理されて、クルチウス転位条件にさらされてCbz保護アミンを提供し、次にそれは脱保護されてアミンをもたらす。例えば還元的アミノ化による引き続くアミン基の合成は第二級アミンをもたらし、それをらにアルキル化して三級アミンを提供し得る。
スキーム2は、例えば、(例えば式Iの環Aを異なる芳香族環で置換することで)その中で融合環コアが修飾される、式Iの本発明の化合物のさらなる実施例の合成を示す。(例えば後述のスキームS1中のアミノジアリールケトンS2に代えて)適切な官能性を有するアミノジアリールケトンを使用することで、多様な融合環コアおよび/または付属アリール基(式Iの基Rに対応する)を有する新しい化合物を提供する。このようなアミノジアリールケトンは市販され、またはそのいくつかが当該技術分野で公知の多様な方法によって調製され得る。
スキーム3で示されるように、融合二環式前駆体(この化合物の合成については後述のスキームS1を参照されたい)を部分R(DAM=ジメチルアミノメチレン保護基)で官能化し、次にヒドラジドとの反応によって合成して、三環式融合コアを形成する。置換基Rxは、適切なヒドラジドの選択によって変化させ得る。
アミドは、例えば対応するカルボン酸またはエステルの調製と、それに続く標準条件を使用した適切なアミンでのアミド化によって、調製し得る。特定の実施形態では、アミドは、末端末端窒素含有環(例えばピリジル、ピペリジル、ピペラジニル、イミダゾリル(N−メチル−イミダゾリルを含む)、モルホリニルなどとの二炭素「リンカー」を提供する。例示的なアミド構造としては、
が挙げられる。
式中、
R’1はC1〜C4アルキルであり;
R’2は水素、ハロゲン、またはハロゲン原子またはヒドロキシル基で任意選択的に置換されるC1〜C4アルキルであり;
R’3はハロゲン原子、任意選択的にハロゲン原子によって置換されるフェニル、C1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシ、またはシアノ;−NR5−(CH2)m−R6(式中、R5は水素原子またはC1〜C4アルキルであり、mは0〜4の整数であり、R6は任意選択的にハロゲン原子によって置換されるフェニルまたはピリジルである);または−NR7−CO−−(CH2)n−R8(式中、R7は水素原子またはC1〜C4アルキルであり、nは0〜2の整数であり、R8は任意選択的にハロゲン原子によって置換されるフェニルまたはピリジルである)であり;
R’4は−(CH2)a−CO−NH−R9(式中、aは1〜4の整数であり、R9は、C1〜C4アルキルである);C1〜C4ヒドロキシアルキル;C1〜C4アルコキシ;または任意選択的にC1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシ、アミノまたはヒドロキシル基または−(CH2)b−COOR10(式中、bは1〜4の整数であり、R10はC1〜C4アルキルである)によって置換されるフェニルまたはピリジルである。
本発明は、Brd4の発現または活性を阻害する阻害性核酸分子と、白血病(例えば、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CLL)、急性リンパ球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単核白血病(CMML)、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害、脊髄形成異常症を治療するためのこのような作用物質の使用とをさらに提供する。このようなオリゴヌクレオチドとしては、Brd4をコードする核酸分子(例えば、アンチセンス分子、siRNA、shRNA)に結合する一本鎖および二本鎖核酸分子(例えば、DNA、RNA、およびそのアナログ)、ならびにBrd4に直接結合してその生物学的活性を調節する核酸分子(例えば、アプタマー)が挙げられる。
本発明のアンチセンスBrd4配列を含む触媒RNA分子またはリボザイムを使用して、生体内でBrd4核酸分子の発現を阻害し得る。アンチセンスRNA内へのリボザイム配列の包含は、それらにRNA切断活性を与え、したがってコンストラクトの活性を増大させる。標的RNA特異的リボザイムのデザインおよび使用は、そのそれぞれを参照によって援用する、Haseloff et al.,Nature 1988;334:585−591および米国特許出願公開第2003/0003469A1号明細書に記載される。
短い21〜25ヌクレオチドの二本鎖RNAは、下方制御遺伝子発現に効果的である(参照によって本明細書に援用するZamore et al.,Cell101:25−33;Elbashir et al.,Nature 2001;411:494−498)。哺乳類におけるsirNAアプローチの治療有効性は、McCaffrey et al.Nature 2002;418:38−39によって生体内で実証された。
裸の阻害性核酸分子、またはそのアナログは、哺乳類細胞に入って、例えばBrd4などの関心のある遺伝子発現を抑制することができる。それでもなお、オリゴヌクレオチドまたはその他の核酸塩基オリゴマーの細胞への送達を助ける製剤を利用するのが、望ましいことがある。(例えば、それぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第5,656,611号明細書、米国特許第5,753,613号明細書、米国特許第5,785,992号明細書、米国特許第6,120,798号明細書、米国特許第6,221,959、米国特許第6,346,613号明細書、および米国特許第6,353,055号明細書を参照されたい)。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して、薬理効果を有することが発見された作用物質(例えばJQ1または本明細書に記述される式の化合物)は、薬剤として、または合理的薬物設計による既存化合物の構造的修飾の情報として有用である。治療用途では、本明細書で開示される方法を使用して同定された組成物または作用物質は、例えば生理的食塩水などの薬理的に許容可能な緩衝液中に配合して、全身投与してもよい。好ましい投与経路としては、例えば、患者中で連続的な持続性薬剤レベルを提供する、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または皮内注射が挙げられる。ヒト患者またはその他の動物の治療は、生理学的に許容可能なキャリア中の本明細書で同定された治療薬の治療的有効量を使用して実施される。適切なキャリアおよびそれらの処方については、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences by E.W.Martinに記載される。投与される治療薬の量は、投与様式、患者の年齢と体重、および白血病(例えば、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性リンパ球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単核白血病(CMML)、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症、および骨髄増殖性障害)の臨床症状次第で変動する。一般に、量は、白血病と関連付けられているその他の疾患の治療で使用されるその他の作用物質で使用される量の範囲内であるが、場合によっては、化合物の特異性増大のためにより少ない量が必要とされる。化合物は、当業者に知られている方法による測定で、または細胞増殖または生存度を測定するアッセイを使用した測定で、がん細胞の増殖、成長または生存を低下させる投与量で投与される。
白血病治療のための化合物投与は、その他の構成要素と組み合わさって、白血病細胞の増殖または生存を低下させるのに効果的な治療薬濃度をもたらす、あらゆる適切な手段によってもよい。化合物は、任意の適切なキャリア物質中に任意の適切な量で含有されてもよく、通常、組成物総重量の1〜95重量%の量で存在する。組成物は、非経口(例えば皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内)投与経路に適した剤形で提供されてもよい。医薬組成物は、従来の製薬慣行に従って調合してもよい(例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams & Wilkins,2000およびEncyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988−1999,Marcel Dekker,New Yorkを参照されたい)。特定の一実施形態では、本発明の作用物質は、対象に直接、全身投与される。
医薬組成物は、投薬形態または製剤での注射、輸液または移植(皮下、静脈内に、筋肉内、腹腔内、など)によって、または従来の無毒の薬学的に許容可能なキャリアおよびアジュバントを含有する適切な送達デバイスまたはインプラントを介して、非経口的に投与してもよい。このような組成物の処方および調製は、製剤処方当業者に周知である。処方は、前出のRemington:The Science and Practice of Pharmacyにある。
放出制御非経口組成物は、水性懸濁液、微小球、マイクロカプセル、磁性微小球、油剤、油懸濁液、またはエマルションの形態であってもよい。代案としては、活性薬剤は、生体適合性キャリア、リポソーム、ナノ粒子、インプラント、または輸液用器具に組み込まれてもよい。
経口使用のための製剤としては、無毒の薬学的に許容可能な賦形剤との混合物中の活性成分を含有する錠剤が挙げられる。このような製剤は、当業者に知られている。賦形剤は例えば、不活性希釈剤または増量剤(例えばスクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶セルロース、ジャガイモデンプンを含むデンプン類、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム);顆粒化剤および崩壊剤(例えば、微結晶セルロースを含むセルロース誘導体、ジャガイモデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩、またはアルギン酸);結合剤(例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、α化デンプン、微結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはポリエチレングリコール);および平滑剤、流動促進剤、および粘着防止剤(例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油、または滑石)であってもよい。その他の薬学的に許容可能な賦形剤は、着色剤、着香剤、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤などであり得る。
経口使用のための放出制御組成物は、例えば、活性物質の溶出および/または拡散を制御することで、活性治療薬を放出するように構築されてもよい。溶出または拡散放出制御は、錠剤、カプセル、ペレットの適切なコーティングによって、または化合物の顆粒製剤によって、または化合物を適切なマトリックスに組み込むことによって達成し得る。放出制御コーティングとしては、上述の1つまたは複数のコーティング物質および/または、例えば、シェラック、蜜蝋、グリコワックス、水素化ヒマシ油、カルナウバ蝋、ステアリルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセリン、エチルセルロース、アクリル樹脂、dl−ポリ乳酸、酢酸酪酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メタクリル酸メチル、2−ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートハイドロゲル、1,3ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレート、および/またはポリエチレングリコールが挙げられる。放出制御マトリックス製剤中では、マトリックス材は、例えば、水和メチルセルロース、カルナウバ蝋およびステアリルアルコール、カルボポル934、シリコーン、トリステアリン酸グリセリル、アクリル酸メチル−メタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、および/またはハロゲン化フルオロカーボンもまた含んでもよい。
任意選択的に、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性リンパ球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単核白血病(CMML)、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症、および骨髄増殖性障害をはじめとするがこれに限定されるものではない白血病を治療するための治療薬が、単独で投与され、または当業者に知られており、Remington’s Pharmaceutical Sciences by E.W.Martinに記載されるがんを治療するためのその他の標準治療法と組み合わせて投与される。所望ならば、本発明の作用物質(例えば、本明細書に記述される式の化合物であるJQ1、およびその誘導体)が、がん治療に有用な任意の従来の化学療法薬と組み合わせて投与される。
本組成物は、白血病(例えば、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性リンパ球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単核白血病(CMML)、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症、および骨髄増殖性障害)の治療で使用するためのキットまたは医薬品システムに組み立ててもよい。本発明のこの態様に従ったキットまたは医薬品システムは、その中に、バイアル、チューブ、アンプル、ボトルなどの1つまたは複数の収容手段を厳重に密封して有する、箱、カートン、筒などの運搬手段を含んでなる。本発明のキットまたは医薬品システムは、本発明の作用物質を使用するための付属使用説明もまた含んでなってもよい。
治療法は、家庭、医院、診療所、病院の外来、または病院など、がん治療法が実施される任意の場所で提供されてもよい。治療は、一般に、医師が治療法の効果を綿密に観察し、必要なあらゆる調節をし得るように、病院で開始される。治療法の持続期間は、治療されるがんの種類、患者の年齢および病状、患者の疾患の病期およびタイプ、および患者の身体が治療にどのように応答するかに左右される。薬剤投与は、異なる間隔(例えば、毎日、毎週、または毎月)で実施してもよい。治療法は、患者の身体が健康な新しい細胞を構築して、その強度を取り戻す機会があるように、休息期間を含む間欠的周期で与えられてもよい。
本発明の化合物は、本明細書の説明を考慮して、本明細書に記載される方法によって、および/または当業者に知られている方法に従って、合成し得る。
上に示すスキームに従って、化合物JQ1を調製した。
N,N−ジメチルホルムアミド(1.5ml、1.0M)中の9−フルオレニルメトキシカルボニル−アスパラギン酸β−tert−ブチルエステル[Fmoc−Asp(Ot−Bu)−OH](864mg、2.1mmol、2.10等量)の溶液に、(2−(6−クロロ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスファート(HCTU)(827mg、2.0mmol、2.00等量)、およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.72ml、4.0mmol、4.00等量)を逐次添加した。次に混合物を23℃で5分間撹拌した。次にS2(266mg、1.0mmol、1等量)を固体として添加した。反応混合物を23℃で撹拌した。16時間後、酢酸エチル(20ml)および鹹水(20ml)を添加した。2層が分離し、水層を酢酸エチル(2×20ml)で抽出した。合わせた有機層を鹹水(30ml)で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Combiflash RF system、40グラムのシリカゲル、勾配0〜100%酢酸エチル−ヘキサン)によって精製し、S3(625mg、90%)を褐色油として得た。
23℃のDMF溶液(4.0ml、0.22M)中の20%ピペリジンに、化合物S3(560mg、0.85mmol、1等量)を溶解した。30分後、酢酸エチル(20ml)および鹹水(20ml)を反応混合物に添加した。2層が分離し、水層を酢酸エチル(2×20ml)で抽出した。合わせた有機層を鹹水(3×25ml)で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Combiflash RF system、24グラムのシリカゲル、勾配0〜100%酢酸エチル−ヘキサン)によって精製し、遊離アミンS4(370mg、90%)を黄色固体として得た。エナンチオマ純度は75%に下がった(AS−Hカラムを使用して、Berger超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)により測定された)。
アミノケトン(S4)(280mg、0.63mmol)を10%酢酸エタノール溶液(21ml、0.03M)に溶解した。反応混合物を85℃に加熱した。30分後、全ての溶剤を減圧下で除去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Combiflash RF system、12グラムのシリカゲル、勾配0〜100%酢酸エチル−ヘキサン)によって精製し、化合物S5(241mg、95%)を白色固体として得た。S5のエナンチオマ純度は67%であった(AS−Hカラムを使用して、Berger超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)により測定された)。
ジグリム(1.25ml、0.4M)中のS5(210mg、0.5mmol、1等量)溶液に、五硫化リン(222mg、1.0mmol、2.00等量)、炭酸水素ナトリウム(168mg、2.0mmol、4.00等量)を逐次添加した。反応混合物を90℃に加熱した。16時間後、鹹水(20ml)および酢酸エチル(35ml)を添加した。2層が分離し、水層を酢酸エチル(3×30ml)で抽出した。合わせた有機層を鹹水(2x15ml)で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Combiflash RF system、24グラムシリカゲル、勾配0〜100%酢酸エチル−ヘキサン)によって精製し、回収されたS5(73mg、34%)と共に、S6(141mg、65%)を褐色固体として得た。
0℃のTHF(2.6ml、0.14M)中のS6(158mg、0.36mmol、1等量)溶液に、ヒドラジン(0.015ml、0.45mmol、1.25等量)を添加した。反応混合物を23℃に加温して、23℃で1時間撹拌した。全ての溶剤を減圧下で除去した。得られたヒドラジンを精製なしで直接使用した。次にヒドラジンをオルト酢酸トリメチルとトルエンの2:3混合物(6ml、0.06M)に溶解した。反応混合物を120℃に加熱した。2時間後、全ての溶剤を減圧下で除去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Combiflash RF system、4gのシリカゲル、勾配0〜100%酢酸エチル−ヘキサン)によって精製し、JQ1(140mg、2段階で85%)を白色固体として得た。反応条件は、不斉中心をさらにエピマー化して、ラセミ体JQ1がもたらされた。(AS−Hカラムを用いて、Berger超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)により測定された)。
N,N−ジメチルホルムアミド(1.0ml、1.0M)中の9−フルオレニルメトキシカルボニル−アスパラギン酸β−tert−ブチルエステル[Fmoc−Asp(Ot−Bu)−OH](411mg、1.00mmol、1.0等量)溶液に、(ベンゾトリアゾール−1−イルオキシル)トリピロリジノホスホニウム(PyBOP)(494mg、0.95mmol、0.95等量)、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.50ml、2.8mmol、2.75等量)を逐次した。次に混合物を23℃で5分間撹拌した。次にS2(266mg、1.0mmol、1等量)を固体として添加した。反応混合物を23℃で撹拌した。4時間後、酢酸エチル(20ml)および鹹水(20ml)を添加した。2層が分離し、水層を酢酸エチル(2×20ml)で抽出した。合わせた有機層を鹹水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Combiflash RF system、40グラムのシリカゲル、勾配0〜100%酢酸エチル−ヘキサン)によって精製し、S3(452mg,72%)を褐色油として得た。
23℃のDMF溶液(2.2ml、0.22M)中の20%ピペリジンに、化合物S3(310mg、0.47mmol、1等量)を溶解した。30分後、酢酸エチル(20ml)および鹹水(20ml)を反応混合物に添加した。2層が分離し、水層を酢酸エチル(2×20ml)で抽出した。合わせた有機層を鹹水(3×25ml)で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Combiflash RF system、24グラムのシリカゲル、勾配0〜100%酢酸エチル−ヘキサン)によって精製し、遊離アミンS4(184mg、90%)を黄色固体として得た。エナンチオマ純度は、91%であった。(AS−Hカラムを使用して、Berger超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)によりチェックした)。
アミノケトン(S4)(184mg、0.42mmol)をトルエン(10ml、0.04M)に溶解した。シリカゲル(300mg)を添加して、反応混合物を90℃に加熱した。3時間後、反応混合物を23℃に冷却した。シリカゲルを濾過して、酢酸エチルで洗浄した。合わせた濾液を濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Combiflash RF system、12グラムのシリカゲル、勾配0〜100%酢酸エチル−ヘキサン)によって精製し、化合物S5(168mg、95%)を白色固体として得た。エナンチオマ純度は90%であった(AS−Hカラムを使用して、Berger超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)により測定された)。
−78℃のTHF(1.8ml、0.15M)中のS5(114mg、0.27mmol、1等量)溶液に、カリウムtert−ブトキシド(THF中の1.0M溶液、0.3ml、0.30mmol、1.10等量)を添加した。反応混合物を−10℃に加温して、23℃で30分間撹拌した。反応混合物を−78℃に冷却した。クロロリン酸ジエチル(0.047ml、0.32mmol、1.20等量)を反応混合物に添加した22。得られた混合物を−10℃で45分間加温した。酢酸ヒドラジド(30mg、0.40mmol、1.50等量)を反応混合物に添加した。反応混合物を23℃で撹拌した。1時間後、90℃に加熱された反応混合物に、1−ブタノール(2.25ml)を添加した。1時間後、全ての溶剤を減圧下で除去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Combiflash system、4gシリカゲル、勾配0〜100%酢酸エチル−ヘキサン)で精製し、(+)−JQ1(114mg、92%)を白色固体として90%のエナンチオマ純度で得た(AS−Hカラム、85%ヘキサン−メタノール、210nm、tR(R−鏡像異性体)=1.59分、tR(S−鏡像異性体)=3.67分を使用して、Berger超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)によって測定した)。キラル分取HPLC(OD−Hカラムを使用したAgilent高圧液体クロマトグラフィー)によって生成物をさらに精製し、99%ee以上でS鏡像異性体を得た。
1HNMR(600MHz,CDCl3,25℃)δ7.39(d,J=8.4Hz,2H),7.31(d,J=8.4Hz,2H),4.54(t,J=6.6MHz,1H),3.54−3.52(m,2H),2.66(s,3H),2.39(s,3H),1.67(s,3H),1.48(s,9H).
13CNMR(150MHz,CDCl3,25℃)δ171.0,163.8,155.7,150.0,136.9,131.1,130.9,130.6,130.3,128.9,81.2,54.1,38.1,28.4,14.6,13.5,12.1.
HRMS(ESI)計算値C21H24ClN2O3S[M+H]+:457.1460,実測値457.1451m/z.
TLC(EtOAc)、Rf:0.32(UV)
[α]22 D=+75(c0.5、CHCl3)
スキームS3で図示されるようにして、追加的な本発明の化合物を調製した。
実施例1:Brd4は、急性骨髄性白血病細胞の増殖のために、決定的かつ特異的に必要とされる。
急性骨髄性白血病(AML)の維持に必要なエピジェネティックな経路を体系的に探索するために、shRNAスクリーニングを行った。このためには、243個の公知のクロマチン調節因子を標的とする、特定用途向けshRNAライブラリーを構築した。このライブラリーは、エピジェネティックなマークの大部分の「writer」、「reader」、および「eraser」を含んだ(図1A)。この1,095個のshRNA(遺伝子あたり3〜6個)のライブラリーは、負の選択RNAiスクリーニング向けに最適化させたベクターであるTRMPV中で構築した。一次スクリーニングでは、MLL−AF9およびNrasG12D融合遺伝子を含む確立されたTet−OnコンピテントAMLマウスモデル細胞系に、ライブラリーを1つのプールとして形質導入した(Zuber et al.,Nat Biotechnol 2011;29:79−83)。薬剤選択に続いて、ドキシサイクリン(dox)の添加によってshRNA発現を誘導した。ゲノムDNAから増幅されたshRNAguide鎖の大規模シークエンシングを使用して、14日間の培養後のライブラリー表現の変化をモニターした(図1Bおよび2A〜2D)。2つの独立した複製のそれぞれで、177個のshRNAが、20倍を超える消耗を呈示し、それをスコア付基準として使用した。必須遺伝子(Rpa1、Rpa3、Pcna、Polr2b)を標的とする8つの陽性対照shRNAの全てで、ならびに2つの公知のMLL−AF9補助因子(Men1およびPsip1)を標的とするいくつかのshRNAで、正のスコアを得た。一次スクリーニングでスコア付基準を達成した少なくとも2つの独立したshRNAを有する遺伝子には、独立したMLL−AF9/NrasG12DAML系およびベクターシステムを使用して、詳細な一つずつの検証を行った(図3A)(追加的な詳細については、国際公開第2010/111712号パンフレットを参照されたい)。一次スクリーニングおよび検証段階の双方で、転写因子Brd4を標的とするshRNAは、最も強く消耗した1つである。全体的に、Brd4は、このshRNAスクリーニングの実験条件に対する最も応答性の遺伝子として同定された(図1Bおよび3B)。
Brd4の第1のブロモドメインに対する最も高い親和性がある、BETブロモドメインのファースト・イン・クラス小分子阻害剤(Filippakopoulos et al.,2010)である、JQ1の効果を多様な白血病細胞型に対して試験した。マウスMLL融合白血病細胞の増殖は、これらの異なる細胞型の増殖に対するBrd4−shRNAの相対的影響に合致して、線維芽細胞およびG1E(図6B)と比較して、マイクロモル以下のJQ1濃度に対して著しく感受性であった。成人および小児の原発性白血病サンプルなど、一連の確立されたヒト白血病細胞系におけるJQ1の成長阻害効果もまた試験した。多様な遺伝子サブタイプにわたり、13/14のAML細胞系(図6Cおよび7A)および12/15の原発性AML(図8および9)において、JQ1(IC50<500nM)の広範な成長抑制活性が観察された。これに加えて、3/3の試験された原発性MLL再構成型小児白血病は、JQ1(図9Aおよび9B)に高度に感受性であったのに対し、その他の試験された非AML白血病および固形腫瘍細胞系は、化合物に対して最小の感受性しか示さなかった(図6Cおよび7B)。全ての試験されたAML系で、JQ1処理は、shRNA媒介Brd4ノックダウン後に見られた効果と同様に、細胞周期停止およびアポトーシスを普遍的に引き起こした(図6D、6E、8A〜8D、9A〜9C、10A〜10C)。総合して、これらのデータは、Brd4がAMLの生体外成長にとって重要であり、それはブロモドメイン阻害剤JQ1を使用して、効果的に標的にし得ることを示す。
生体内のAMLの進行に対するBrd4の妥当性を調査した。マウス中の確立されたAMLにおいてBrd4を阻害するために、Tet−OnコンピテントMLL−AF9/NrasG12D白血病細胞を抗Brd4 shRNA含有または対照shRNA含有TRMPVコンストラクトで形質導入した。次にこれらの細胞をあらかじめ亜致死的に照射された二次受容マウスに移植した。生物発光イメージングによって確認された疾患発症に続いて、ドキシサイクリン(dox)投与によってshRNA発現を誘導した(図11A〜11F)。引き続くモニタリングは、Brd4の抑制が白血病の進行に著しい遅延をもたらし、著しい延命効果を提供したことを明らかにした(図12A〜12C)。TRMPVベクター中のshRNA発現と連動するdsRedレポーター(Zuber et al.,Nat Biotechnol 2011;29:79−83)を活用して、フローサイトメトリー分析は、対照と比較して、Brd4−shRNA陽性細胞が末期白血病負荷内で消耗したことを確認した。このデータは、試験マウスにおける致死性が、Brd4−shRNA陰性細胞成長の帰結であったことを示す(図12Dおよび12E)。総合して、これらのデータは、Brd4のRNAi媒介抑制が、生体内で白血病拡大を阻害することを示す。
JQ1が、AML中で単一作用物質活性を有するかどうかを試験するために、MLL−AF9/NrasG12D白血病細胞を移植したマウスを毎日注射されるJQ1(50mg/kg)またはビヒクルのどちらかで処理した。JQ1投与は、疾患進行の著しい遅延と、顕著に伸びた生存期間(図12F〜12H)をもたらした。JQ1はまた、そのどちらも従来の化学療法に対して非感受性であることが知られている(Zuber et al.,Genes Dev 2009;23:877−89)MLL−AF9/NrasG12DおよびAML1−ETO9a/NrasG12D/p53−/−AMLモデル(図12I、13A〜13E、および14A〜14C)で見られるように、確立された疾患状況において単一作用物質活性を示した。先の知見(Filippakopoulos et al.,Nature 2010;468:1067−73)と一致して、JQ1処理はマウスで良好に耐えられて、正常な造血にはたとえあったとしても極わずかな影響しか及ぼさなかった(図15、16、17A、および17B)。これらの知見は、JQ1が生体内で単一作用物質として、強力かつ白血病特異的な効果を有することを実証する。
AMLは、最終骨髄分化完了の不能と結びついた、拡大された自己再生能力によって特徴付けられる。したがって、Brd4の存在が、白血病細胞の分化状態に影響を及ぼすかどうかを次に考察した。Brd4 shRNA発現およびJQ1処理のどちらも、MLL−AF9/NrasG12D白血病細胞の形態を骨髄単核芽球から、マクロファージ様外観を有する細胞に改変させた(図18Aおよび18B)。shRNAまたはJQ1処理のどちらかによるBrd4阻害時に、マクロファージ機能に関与する遺伝子と、骨髄性分化マーカーであるMac−1とが上方制御された。Brd4阻害は、そのレベルがMLL再構成型白血病における白血病幹細胞(LSC)頻度と相関する、c−kitを下方制御した(図18Cおよび18D)。これに加えて、JQ1処理は、程度は様々であるが、試験された原発性白血病サンプルの大部分において、成熟表現型の形態学的徴候を誘導した(図8および9)。
Myc経路は白血病幹細胞自己再生と関連付けられており、MycはBrd4の下流標的であるように見えるので、Mycレベルに対するBrd4阻害の効果を調べた。マウスMLL−AF9/NrasG12D白血病細胞において、shRNAまたはJQ1処理を介したBrd4阻害は、Myc mRNAレベルおよびMycタンパク質レベルに劇的な低下をもたらし;対照的に、Brd4阻害は、MEFまたはG1E細胞には最小の効果しか及ぼさなかった(図20A〜20C、21A、および21B)。Myc mRNAレベルの下方制御はJQ1曝露の60分間以内に起き、Cd74などのマクロファージ分化に関連した遺伝子発現増大に定性的に先行する(図20D)。直接転写調節をさらに支持するために、クロマチン免疫沈降法実験によって、JQ1への曝露に続いて排除される、Mycプロモーターの約2キロベース上流の局所的Brd4占有領域が同定された(図20E)。予期されたように、shRNAによるまたはJQ1によるBrd4阻害のRNAiまたはJQ1が誘導する抑制は、Myc標的遺伝子発現の全体的低下もまたもたらした(図21Cおよび22)(Kim et al.,Cell 2010;143:313−24;およびSchuhmacher et al.,Nucleic Acids Res 2001;29:397−406もまた参照されたい)。著しいことに、JQ1処理は、検査された広範囲のマウスおよびヒト白血病細胞系でMyc下方制御を引き起こし(図20A〜20C、図23Aおよび23B)、JQ1がMyc経路を白血病サブタイプの範囲に抑える手段を提供することを示唆する。図21Dは、Myc下流標的遺伝子発現の変化を評価するGSEAプロットを含む。
次に、実験を行って、Myc活性の抑制を介して、JQ1処理の抗増殖効果が生じるかどうかをさらに評価した。ここでは、Myc cDNAがレトロウイルスプロモーターから異所性に発現されるように、MLL−AF9/NrasG12D白血病培養を作成し、JQ1誘導性転写抑制に対して完全に抵抗性である、わずかであるが構成的なMyc過剰発現をもたらした(図20F、24A、および24B)。特に、異所性Mycは、JQ1、Brd4 shRNA誘導性細胞周期停止、およびマクロファージ分化に対して、ほぼ完全な抵抗性を与えた(図20G、20H、および25A〜D)。さらに、全体的発現プロファイリングは、JQ1誘導性転写変化の大部分が、事実上Myc下方制御の二次効果であることを明らかにした(図26A〜26C)。Mycそれ自体のshRNAノックダウンもまた、Brd4阻害と似ている成長停止および骨髄性分化のパターン引き起こし(図27A〜D)、JQ1誘導性効果の重要媒介物としてのMycをさらに支持する。重要なことには、異所性Myc発現はJQ1誘導性細胞死を阻止できず、細胞生存の調節における、Brd4の追加的なMyc非依存性役割が示唆された(図24Cおよび24D)。これらの知見は、Myc活性化を保ち、白血病における未分化細胞状態を維持する上で、Brd4が重要な役割を有することを示す。
条件的RNAi実験のために、先に記載されているTRMPV−NeoベクターまたはTtTMPV−Neoベクターのどちらかから、shRNAを発現させた(Zuber et al.,Nat Biotechnol 2011;29:79−83)。スクリーニング検証のために、PuroR導入遺伝子をNeoRカセットで置換することにより、LMP3をベースとして作成されたLMN(MSCV−miR30−PGK−NeoR−IRES−GFP)に、shRNAをクローンした。Mycレスキュー実験のためには、野生型マウスMyc cDNAをMSCV−PGK−Puro−IRES−GFP(MSCV−PIG)にサブクローニングした(Hemann et al.,Nat Genet 2003;33:396−400)。
先に記載されたようにして(Zuber et al.,2011)、miR30適応BIOPREDsi予測を使用して、243個のクロマチン調節マウス遺伝子を標的にする特定用途向けshRNAライブラリーをデザインし(Huesken et al.,Nature Biotechnology 2005;23:995−1001)(6個のshRNA/遺伝子)、PCR−クローニングによって、55kの特定用途向けアレイ(Agilent Technologies,Lexington,MA)上で、オリゴヌクレオチドのプールを構築した。配列検証に続いて、1095個のshRNA(3〜6個/遺伝子)をいくつかの陽性および陰性対照shRNAと一緒に、等濃度で1つのプールに合わせた。単一レトロウイルス組み込みを優勢にもたらし、計算された>500個の細胞数あたり1個のshRNAに相当する(感染時に総計3千万個の細胞、2%の形質導入効率)条件を使用して、このプールをTRMPV−Neoにサブクローニングし、Tet−OnMLL−AF9/NrasG12D白血病細胞に形質導入した。1mg/mlのG418(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して、形質導入された細胞を5日間にわたり選択し;各継代培養時に>2千万個の細胞を維持して、実験全体を通じてライブラリー表現を保った。薬剤選択に続いてT0サンプルが得られ(複製あた約2千万個の細胞)、引き続いて0.5mg/mlのG418および1μg/mlのドキシサイクリン添加の下で細胞を培養し、shRNAの発現を誘導した。14日後(=12回の継代培養、T14)に、FACSAriaII(商標)(BD Biosciences,Sparks,MD)を使用して、各複製について約1.5千万個のshRNA発現(dsRed+/Venus+)細胞をソートした。PhaseLock(商標)チューブ(5prime,Gaithersburg,MD)を使用して、2回のフェノール抽出と、それに続くイソプロパノール沈殿によって、T0およびT14サンプルからゲノムDNAを単離した。先に記載されたようにして、shRNAガイド鎖のPCR増幅によって、大規模シークエンシングテンプレートライブラリーを作成した(Zuber et al.,2011)。Illumina(登録商標)ゲノム分析器(SanDiego,CA)上で、8pMの最終濃度で、ライブラリーを分析し;ガイド鎖内へ逆方向読み取りするプライマーを使用して、18個のntを配列決定した(miR30EcoRISeq、TAGCCCCTTGAATTCCGAGGCAGTAGGCA。実験的サンプル中のshRNA消耗を検出するための十分なベースラインを提供するために、T0サンプル中のshRNAあたり>500の読み取り得ることが望ましく、プールされたプラスミド調製品に固有の、またはPCRバイアスによって導入された、shRNA表現の格差を代償するために、それはサンプルあたり>1千万の読み取りを必要とした。これらの条件で、1072(全部の97%)個のshRNAについての>500の読み取りのT0ベースラインを得た。カスタマイズされたGalaxyプラットフォームを使用して、配列プロセッシングを実施した(Taylor et al.,Curr Protoc Bioinformatics Chapter 10,Unit 10 5(2007))。各shRNAおよび条件について、レーンあたりライブラリー特異的読み取り総数に対して、マッチング読み取り数を正規化し、さらなる分析のためにデータベースにインポートした。
全てのマウスMLL白血病細胞系は、末期症状の受容マウスから得られた骨髄に由来し、10%ウシ胎仔血清(FBS)およびペニシリン/ストレプトマイシン添加RPMI1640内で培養された。MLL−AF9(単独)、MLL−AF9/NrasG12D、Tet−OnMLL−AF9/NrasG12D、およびMLL−ENL/FLT3ITD細胞培養は、先に記載されているようにして誘導された(Zuber. et al.,Genes Dev 2009;23:877−89およびZuber et al.,2011)。Tet−On不死化MEF培養については先に記載されている(Zuber et al.,2011)。G1E細胞は、Mitchell Weiss(University of Pennsylvania)によって親切にも提供された。MEF細胞は、10%FBSおよび1%グルタミン添加DMEM中で培養した(GIBCO(登録商標),Carlsbad,CA)。G1E細胞は15%FBS、2U/mlエリスロポエチン(Sigma−Adrich)、および10%キットリガンド条件培地添加IMDM中で培養した。全ヒト白血病細胞系はRPMI1640/10%FBS内で培養したが、KASUMI−1細胞のみ20%FBS内で培養した。NOMO−1およびMOLM−13は、DSMZから購入された。KASUMI−1、HL−60、およびIMR−90は、ATCCから得られた。K−562およびTHP−1は、Martin Carroll(University of Pennsylvania)によって親切にも提供された。U2OS、HeLa、およびJurkatは、CSHL組織培養サービスによって提供された。
Brd4ウエスタンブロットでは、30μgのホールセル溶解産物RIPA抽出物(25mMのTrispH7.6、150mMのNaCl,1%のNP−40、1%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1%のSDS)を各レーンに装入した。Mycウエスタンブロットでは、細胞をLaemmli緩衝液に直接溶解した。およそ50,000個の細胞相当量を各レーンに装入した。SDS−PAGE電気泳動によってタンパク質抽出物を分離して、ブロッティングのためにニトロセルロースに転写した。
72時間にわたる生存細胞数の増大を計数することで、増殖アッセイを実施した。ヨウ化プロピジウム(PI)を含めることで、死細胞を排除した。前方/側方散乱/PI細胞を使用して、生存細胞のみをゲーティングして、Guava Easycyte(Millipore,Billerica,MA)上で細胞濃度の測定を実施した。式、を使用して増殖速度を計算した。ln(細胞濃度72h/細胞濃度0h)/72。相対増殖速度は、DMSO処理細胞の速度を正規化することで計算した。
MLL−AF9/NrasG12D白血病細胞を1μg/mlのドキシサイクリンで処理してTRMPV shRNAを誘導し、または100nMのJQ1で2日間処理した。50,000個の細胞を100μlのFACS緩衝液(5%FBS、PBS中の0.05%NaN3)中に再懸濁し、Shandon Cytospin 2 Centrifugeを使用して500rpmで5分間、スライドガラス上にサイトスピンした。製造会社のプロトコルに従って、メイ・グリュンワルド(Sigma−Aldrich、#019K4368)およびギムザ(Sigma−Aldrich、#010M4338)染色を実施した。40倍の対物レンズでZeiss Observer Microscopeを使用して、画像を収集した。
製造業者のプロトコルに従って(BD、APC BrdU Flow Kit、#552598)、BrdU組み込みアッセイを実施し、細胞はBrdUで30分間パルスされた。DNA含量測定のために、細胞を7−AADまたはDAPIで共染色した。全ての条件的shRNA実験で、分析は、shRNA+/dsRed+細胞集団上でゲートした。製造会社のプロトコル(BD Biosciences、APCアネキシンV、#550475)に従って、アポトーシスのアネキシンV染色を実施した。図4eでは、生細胞(FSC/SCC)およびdsRed+/shRNA+集団上で、アネキシンVゲーティングを実施して、shRNA効果の明瞭な読み取りを確保した。このゲーティング法は、初期アポトーシス細胞(アネキシンV+、DAPI−)を選択的に視覚化し、したがって一見するとプロット中に蓄積した死細胞(アネキシンV+、DAPI+)が欠如している。全分析は、Flowjoソフトウェアを使用して実施した。
ヒトshRNAをTRMPV−Neoベクターにクローンし、THP−1およびMOLM−13細胞のレトロウイルス形質導入がそれに続き、MSCV−RIEPプラスミド(rtTA−ires−EcoR−PGK−Puro)を使用して、Ecotropic受容体およびrtTA3を発現するよう修飾した。細胞は、400μg/mlのG418によって1週間にわたり選択された。細胞を1μg/mlのドキシサイクリンで処理して、shRNA発現を誘導した。FACSを使用したdsRed+/shRNA+細胞の相対変化を使用して、成長阻害をモニターした。BrdU細胞周期分析は、上述したように実施した。
原発性白血病細胞は、診断時(n=10)または再発時(n=2)にAMLがある、12人の(未治療)患者の末梢血(PB)または骨髄(BM)吸引サンプルから得られた。診断は、French−American−British(FAB)Cooperative Study Group(Delhommeau et al.,N Engl J Med 2009;360:2289−301;およびLey et al.,N Engl J Med 2010;363:2424−33)、および世界保健機関(WHO))(Zuber et al.,Nat Biotechnol2011;29:79−83)によって提供される基準に従って確立した。Ficollを使用して単核細胞(MNC)を調製し、使用時まで液体窒素内で保存した。いずれの場合にも、献血またはBM穿刺に先だって、インフォームドコンセントを得た。 研究はMedical University of ViennaのInstitutional Review Board(Ethics Committee)によって認可された。HL60およびMOLM13細胞系を対照として含めた(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,DSMZ,Braunschweig,Germany)。解凍後、AML細胞の生存度は、トリパンブルー排除による評価で、70%〜99%の範囲であった。
施設内審査委員会認可プロトコルの下で、新たに診断された急性白血病がある小児から診断骨髄サンプルを収集した。Helsinkiプロトコルに従って、インフォームドコンセントを得た。収集時に、Ficoll−Paque PLUS(GE Healthcare,Piscataway,NJ)を使用して密度遠心分離によって、原発性白血病胞を濃縮し、引き続いて液体窒素内で保存した。冷凍保存細胞のバイアルを解凍し、培地に再懸濁して、生白血病細胞を密度遠心分離によって濃縮した。細胞を20%ウシ胎仔血清補給培地中に維持した。全白血病細胞を5%CO2内で37℃で培養した。
パラフィン包埋切片をヘマトキシリン&エオジン(H&E)で染色した。NIS−Elements F2.30ソフトウェアを使用して、2560×1920の解像度で、Nikon Digital Sightカメラ付きNikon Eclipse 80i顕微鏡上で写真を撮影した。Adobe Photoshop CS2を使用して、画像をサイズ変更し、解像度を300ピクセル/インチに設定して、自動コントラストを適用し、アンシャープマスクを使用して画像の明確さを改善した。
ヒトshRNAをTRMPV−Neoベクターにクローンし、THP−1およびMOLM−13細胞のレトロウイルス形質導入がそれに続き、MSCV−RIEPプラスミド(rtTA−ires−EcoR−PGK−Puro)を使用して、Ecotropic受容体およびrtTA3を発現するよう修飾した。細胞は、400μg/mlのG418によって1週間にわたり選択された。細胞を1μg/mlのドキシサイクリンで処理して、shRNA発現を誘導した。FACSを使用したdsRed+/shRNA+細胞の相対変化を使用して、成長阻害をモニターした。BrdU細胞周期分析は、上述したように実施した。
CSHL microarray shared resourceによって、マイクロアレイが実施された。RNeasy(登録商標)Mini Kit(QIAGEN,Germantown,MD、#74104)を使用して、107個の細胞からRNAを単離した。Agilent 2100 Bioanalyzer,RNA 6000 Pico Series II Chips(Agilent,PaloAlto,CA,USA)上で、RNAの質を評価した。RINスコアによって、サンプルを評価した(2.0以上は合格)。修正Eberwine技術によってRNAを増幅し、次にAmbion(登録商標)WT発現キット(Ambion,Austin,TX)を使用して、aRNAをcDNAに転換した。Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano Series II Chips(Agilent,Palo Alto,CA,USA)を使用して、3’バイアスについて評価されたaRNAおよびcDNAの粒度分布を全サンプルで実施した。次にAffymetrix(登録商標)GeneChip WT末端標識キット(Affymetrix,Santa Clara,CA)を使用して、cDNAを断片化して末端をビオチンで標識した。次にハイブリダイゼーションのためにサンプルを調製し、ハイブリダイズして洗浄し、マウス遺伝子ST 1.0 GeneChips(Affymetrix,Santa Clara,CA)上で製造会社の使用説明書に従ってスキャンした。Affymetrix Expression Console QC測定基準を使用して、画像データを通過させた。RベースBioconductor中のAffymetrixおよびLimmaパッケージによって、生データを処理した。
GSEA v2.07ソフトウェア(Broad Institute,Cambridge,MA)を使用して、1000個の表現型置換で、遺伝子セット濃縮分析(Subramanian et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:15545−50)を実施した。白血病幹細胞およびMyc遺伝子セットは、示される出版物(Kim et al.,Cell2010;143:313−24、Schuhmacher et al.,Nucleic Acids Res 2001;29:397−406、およびSomervaille et al,Cell Stem Cell 2009;4:129−40)から得られた。マクロファージ発生遺伝子セットは、Ingenuity(登録商標)Pathway Analysis(IPA)ソフトウェア(Ingenuity,Redwood City,CA)から得られた。Mybシグネチャー遺伝子セット(shMyb MLL−AF9/NrasG12D白血病細胞中のトップ500下方制御遺伝子)およびMLL−AF9シグネチャー遺伝子セット(MLL−AF9 Tet−OFF MLL−AF9/NrasG12D白血病細胞中のトップ500下方制御遺伝子)は、Lowe/Vakoc研究所からの未発表研究からのマイクロアレイデータから得られた(Zuber et al.,提出済み)。
ChIPアッセイを正確に記載される通りに(Filippakopoulos et al.)実施した。逐次EGS(Pierce)/ホルムアルデヒドで、架橋を実施した(Nicodeme et al.,Nature 2010;468:1119−23)。全ての結果は、ABI 7900HT上でSYBR green(ABI)を使用して実施されたqPCRによって、定量化した。各IPシグナルを入力標準曲線希釈シリーズ(IP/入力)に対して参照し、出発細胞数の差とプライマー増幅効率について正規化した。
Trizol(登録商標)試薬(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して、RNAを調製した。qScript(商標)cDNASuperMix(Quanta Biosciences,Gaithersburg,MD、#101414−106)を使用して、cDNA合成を実施した。Sybr green(ABI,Carlsbad,CA、#4364344)によりABI(商標)7900HT上で、定量的PCR(qPCR)分析を実施した。全てのシグナルは、デルタCt法を使用して定量化した。全てのシグナルは、GAPDHのレベルに対して正規化した。
マウスRT−qPCRプライマー(5’から3’方向に記載)
Bim:CCTGCTTTGCTCTCTCCATTTTおよびCCCCACCCCAGACACAAGTA
Brd4:CCATGGACATGAGCACAATCおよびTGGAGAACATCAATCGGACA
Ccl4:CCCGAGCAACACCATGAAGおよびCCACGAGCAAGAGGAGAGAGA
Cd74:CCAACGCGACCTCATCTCTAAおよびAGGGCGGTTGCCCAGTA
Gapdh:TTCACCACCATGGAGAAGGCおよびCCCTTTTGGCTCCACCCT
Hoxa7:AGTTCAGGACCCGACAGGAAおよびCAGGTAGCGGTTGAAATGGAA
Hoxa9:CCGAAAACAATGCCGAGAAおよびCCGGGTTATTGGGATCGAT
Itgax:CCAGGTTGCCCAGTGAGAAおよびCTCAGATGGGCGGGTTCA
Mmp9:CATTCGCGTGGATAAGGAGTおよびTCACACGCCAGAAGAATTTG
Myc:GCCGATCAGCTGGAGATGAおよびGTCGTCAGGATCGCAGATGAAG
BIM:CACCGTGTCCATTACAGCAGおよびCTAAAATGCAGGAGGCCAAG
BRD4:CCCCTCGTGGTGGTGAAGおよびGCTCGCTGCGGATGATG
GAPDH:CCTGACCTGCCGTCTAGAAAおよびCTCCGACGCCTGCTTCAC
MYC:AGGGATCGCGCTGAGTATAAおよびTGCCTCTCGCTGGAATTACT
Myc−3.8kb:TGTGGCTTTCCTGTCCTTTTおよびAGGGGACATCCCCATTTTAC
Myc−2.2kb:ATTCATTTTCCCCATCCACAおよびTTGCAAAGAGGGGGAGTAGA
Myc−1.9kb:ACAAATCCGAGAGCCACAACおよびAACACCAAGAGCCACCAATC
Myc−1.8kb:GGTGGCTCTTGGTGTTTGAGおよびTCGAGCTCATTGCACAATTC
Myc−1.7kb:CAACTTTGAACAATGAGCACCTおよびCTCTCACTGCTACCCGGTTT
Myc−1.5kb:CGAGGAGTCCGGAATAAGAAおよびTCTTTTGCTCTGTGCATTGG
Myc−1kb:GCCTCTTGTGAAAACCGACTおよびCCGGTCTACACCCCATACAC
Myc+1kb:TGGAATCCTGAGGTCTTTGGおよびCAGAAATGCACCAAGCTGAA
Myc+1.5kb:CCCTCCCCTTTTATTTCGAGおよびGCTTTTCTTTCCGATTGCTG
Myc+3.7kb:TGCTTTGGGTGTGTCTGAAGおよびCTCCCAGAAAGGCAGAACAG
ウエスタンブロット法で使用した抗Brd4抗体はGerd Blobelから贈与され、ChIPで使用した抗Brd4抗体はSigma(#HPA015055)から購入された。抗Myc抗体は、Epitomics(#1472−1)から購入された。FACSで使用される抗体:APC抗マウスCD117/ckit(Biolegend #105811)、APC抗マウスCD11b(Biolegend #101211)、PacificBlue抗マウスCD45.2(Biolegend #109820)、マウス造血系eFluor(登録商標)450 cocktail(ebioscience #88−7772−72)、APC抗マウスCD45R/B220(Biolegend #103212)、APC抗マウスTER−119/Erythroid Cells(Biolegend #116212)、APC抗マウスLy−6G/Gr−1(ebioscience #17−5931)、PE−Cy7抗マウスCD117/ckit(ebioscience #25−1171−82)、およびAPC抗マウスSca−1(ebioscience #17−5981−81)。抗β−アクチンHRP抗体は、Sigma(#A3854)から購入された。
生体内条件的RNAi実験では、Tet−On MLL−AF9/NrasG12D白血病細胞をTRMPV−shRNAコンストラクトで形質導入した。亜致死的に(5.5Gy)照射されたB6/SJL(CD45.1)受容マウスへの1×106個の細胞の尾静脈注射によって、白血病細胞を移植した。
Affymetrix ST 1.0 GeneChipsを使用して、発現マイクロアレイを実施した。GSEAv2.07ソフトウェアを使用して、1000の表現型置換により経路分析を実施した(Subramanian et al.)。
前述の説明から、本明細書に記載される発明に変更および修正を加えて、様々な用途と条件に適合させてもよいことは明らかである。このような実施形態もまた、以下の請求項の範囲内である。
Claims (15)
- Brd4を阻害する作用物質を含んでなる、被験体における白血病を治療するための医薬組成物であって、該作用物質が、以下の構造式:
のいずれか1つで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩である、医薬組成物。 - 前記白血病が、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、好酸球性白血病、毛様細胞性白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群である、請求項1に記載の医薬組成物。
- Brd4を阻害する作用物質を含んでなる、白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させるための医薬組成物であって、該作用物質が、以下の構造式:
のいずれか1つで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩である、医薬組成物。 - Brd4を阻害する作用物質を含んでなる、白血病細胞における細胞死または最終分化を誘導するための医薬組成物であって、該作用物質が、以下の構造式:
のいずれか1つで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩である、医薬組成物。 - 細胞が被験体中にある、請求項3または4記載の医薬組成物。
- 細胞が、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、好酸球性白血病、毛様細胞性白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症または骨髄増殖性障害に由来する、請求項3〜5のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- Brd4を阻害する作用物質を含んでなる、被験体において急性骨髄性白血病を治療するための医薬組成物であって、該作用物質が、以下の構造式:
のいずれか1つで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩である、医薬組成物。 - 被験体が哺乳類である、請求項1、3、4または7に記載の医薬組成物。
- 被験体がヒト患者である、請求項8に記載の医薬組成物。
- 前記ヒト患者が成人である、請求項9に記載の医薬組成物。
- 前記ヒト患者が小児である、請求項9に記載の医薬組成物。
- 前記組成物が、被験体中で白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させる、請求項1または7に記載の医薬組成物。
- 請求項1に規定されるBrd4を阻害する作用物質の治療有効量、および
該作用物質の投与のための指示書
を含んでなる、白血病を治療するためのキット。 - 少なくとも1つの作用物質が、以下の構造式:
のいずれか1つで表される化合物あるいはその薬学的に許容可能な塩である、請求項1、3、4または7記載の医薬組成物。 - 該化合物が、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて投与される、請求項1、3〜7、8〜14のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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