CN111057151B - 单价血脑屏障穿梭模块 - Google Patents

单价血脑屏障穿梭模块 Download PDF

Info

Publication number
CN111057151B
CN111057151B CN201911053535.4A CN201911053535A CN111057151B CN 111057151 B CN111057151 B CN 111057151B CN 201911053535 A CN201911053535 A CN 201911053535A CN 111057151 B CN111057151 B CN 111057151B
Authority
CN
China
Prior art keywords
brain barrier
blood brain
antibody
amino acid
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911053535.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111057151A (zh
Inventor
P·鲁格尔
G·蒂芬塔勒
E·默斯纳
J·尼韦纳
A·胡根马特尔
邵翠英
F·罗斯
徐刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN111057151A publication Critical patent/CN111057151A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111057151B publication Critical patent/CN111057151B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Abstract

本文中记载了一种包括脑效应物实体、衔接物和一个结合血脑屏障受体的单价结合实体的血脑屏障穿梭模块，其中衔接物将效应物实体偶联至结合血脑屏障受体的单价结合实体，其中单价结合实体不包括抗转铁蛋白受体抗体8D3的可变结构域(SEQ ID NO:01和SEQ ID NO:02)或变体抗转铁蛋白受体抗体8D3v(SEQ ID NO:01和SEQ ID NO:03)的可变结构域。

Description

单价血脑屏障穿梭模块
本申请是申请日为2014年12月29日的、发明名称为“单价血脑屏障穿梭模块”的中国专利申请201480072065.5(PCT/EP2014/079353)的分案申请。
发明领域
本发明涉及具有特异性结合血脑屏障受体(BBBR)的一种结合特异性并且就该结合特异性而言是单价的血脑屏障穿梭模块(shuttle module)；还涉及使用此构建体作为血脑屏障穿梭体和用于神经疾病治疗的方法。
背景技术
神经疾病药物的脑透过，例如，具有低的脑穿透的大生物治疗药或小分子药，受到广泛的不能透过的血脑屏障(BBB)与神经血管单元(NUV)中的其他细胞组分的严格限制。已经测试了克服这种障碍的许多策略，并且其中之一是利用脑毛细血管内皮上表达的内源性受体(血脑屏障受体)介导的转胞吞途径。已经设计了重组蛋白，如单克隆抗体或肽，来对抗这些受体，使得生物治疗剂能够通过受体介导递送至脑。然而，最大化脑吸收、同时最小化脑内皮细胞(BEC)中的错分拣(miss-sorting)以及BEC中某些细胞器(尤其是导致生物治疗剂降解的细胞器)内的累积程度的策略，仍然未得以开发。
单克隆抗体和其他生物治疗剂对于治疗中枢神经***(CNS)中的病状具有巨大的治疗潜能。然而，它们进入脑的途径被BBB阻止。之前的研究已经说明，非常小百分比(大约0.1％)的注射在血流中的IgG能够穿透进入CNS区室中(Felgenhauer，Klin.Wschr.52(1974)1158-1164)。由于抗体在CNS内的低浓度，这当然会限制任何药理作用。
因此，需要可以有效地将药物穿梭运送至脑中的神经疾病药物跨BBB递送***。
WO2014/033074报道了血脑屏障穿梭。
Boado，R.J.等报道了小鼠8D3抗转铁蛋白抗体及其可变轻链结构域(VL)变体(L596V和L598I)(Biotechnol.Bioeng.102(2009)1251-1258)。
发明概述
本发明的一个方面是包括脑效应物实体、衔接物和一个结合血脑屏障受体的单价结合实体的血脑屏障穿梭模块，其中衔接物将效应物实体与结合血脑屏障受体的单价结合实体偶联，其中单价结合实体不包括抗转铁蛋白受体抗体8D3(SEQ ID NO:01和SEQ ID NO:02)或变体抗转铁蛋白受体抗体8D3v(SEQ ID NO:01和SEQ ID NO:03)的可变结构域。
抗转铁蛋白受体抗体8D3具有以下氨基酸序列的重链可变结构域：
Figure BDA0002255938790000021
抗转铁蛋白受体抗体8D3具有以下氨基酸序列的轻链可变结构域：
Figure BDA0002255938790000022
变体抗转铁蛋白受体抗体8D3v具有与抗体8D3相同的重链可变结构域和具有以下氨基酸序列的带L104V和L106I突变的轻链可变结构域：
Figure BDA0002255938790000023
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体是多肽。
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体包括选自血脑屏障受体配体、全长抗体、scFv、Fv、scFab和VHH的分子。
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，血脑屏障受体选自转铁蛋白受体、胰岛素受体、***受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白8、低密度脂蛋白受体相关蛋白1和肝素结合表皮生长因子样生长因子。在一个实施方案中，血脑屏障受体是转铁蛋白受体。
在一个实施方案中，单价结合实体特异性地结合人转铁蛋白受体和猕猴转铁蛋白受体。
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体包括一个针对转铁蛋白受体的scFab，更特别地，特异性地结合包括在SEQ ID.NO:04、05或06的氨基酸序列内的转铁蛋白受体中的表位的scFab。
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体包括一个针对转铁蛋白受体的scFv，更特别地，识别包括在SEQ ID.NO:04、05或06的氨基酸序列内的转铁蛋白受体中的表位的scFv。
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，脑效应物实体选自神经疾病药物、神经营养因子、生长因子、酶、细胞毒性剂、针对脑靶标的抗体、针对脑靶标的单克隆抗体、针对脑靶标的肽。
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，脑靶标选自β-分泌酶1、Aβ(Abeta)、表皮生长因子、表皮生长因子受体2、tau、磷酸化tau、磷酸化tau(pS422)、载脂蛋白(apolipoprotein)E4、α突触核蛋白(synuclein)、α突触核蛋白的寡聚片段、CD20、亨廷顿蛋白(huntingtin)、朊病毒蛋白(prion protein)、富含亮氨酸重复的激酶2、帕金蛋白(parkin)、早老蛋白2(presenilin 2)、γ分泌酶、死亡受体6、淀粉样蛋白前体蛋白、p75神经营养蛋白(neurotrophin)受体和胱天蛋白酶(caspase)6。
在血脑屏障穿梭模块的一个特定实施方案中，脑效应物实体是多肽。
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体是多肽，并且单价结合实体与脑效应物实体的C-末端直接或通过衔接物缀合。
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，脑效应物实体包括针对脑靶标的全长抗体。在一个实施方案中，全长抗体是IgG。
在血脑屏障穿梭模块的一个优选实施方案中，血脑屏障穿梭体包括作为脑效应物实体的全长IgG抗体、衔接物和作为单价结合实体结合血脑屏障受体的一个scFab，其中scFab通过衔接物与IgG抗体的重链之一的Fc区的C-末端缀合。
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，针对脑靶标的血脑屏障穿梭体的抗体的第一重链包括第一二聚化模块，且针对脑靶标的血脑屏障穿梭体的抗体的第二重链包括第二二聚化模块，从而允许两条重链的异二聚化。
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，根据杵进臼(knobs-into-holes)的策略，针对脑靶标的血脑屏障穿梭体的抗体的第一重链的第一二聚化模块包括杵(knob)，且针对脑靶标的血脑屏障穿梭体的抗体的第二重链的二聚化模块包括臼。
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，衔接物是肽衔接物。在一个实施方案中，肽衔接物具有至少25个氨基酸长度的氨基酸序列。在一个实施方案中，肽衔接物具有30至50个氨基酸长度的氨基酸序列。在一个实施方案中，肽衔接物是(G4S)6G2(SEQ ID NO:07)或(G4S)4(SEQ ID NO:08)。
以下三个实施方案针对血脑屏障穿梭模块，其中脑效应物实体是多肽，前提条件是，脑效应物实体不是全长抗体，特别不是全长IgG。
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体包括CH2-CH3 Ig实体和一个结合血脑屏障受体的scFab(包括第一衔接物)，其中scFab通过第二衔接物与CH2-CH3 Ig实体的C-末端偶联。
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，血脑屏障穿梭体包括脑效应物实体、衔接物、CH2-CH3 Ig结构域、第二衔接物和一个结合血脑屏障受体的scFab，其中脑效应物实体通过第一衔接物与CH2-CH3 Ig结构域的N-末端缀合，且scFab通过第二衔接物与CH2-CH3Ig结构域的C-末端缀合。
在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，CH2-CH3 Ig实体是CH2-CH3 IgG实体。
本发明的其它方面是编码本文中所述的血脑屏障穿梭模块的(分离)核酸、包括编码血脑屏障穿梭模块的(分离)核酸的宿主细胞、和包括血脑屏障穿梭模块的药物制剂。
本文中所述的血脑屏障穿梭模块可以用作药物，特别是可以用于治疗神经疾病，如，例如，阿尔茨海默氏病。
本文中所述的血脑屏障穿梭模块可以用于将脑效应物实体运送穿过血脑屏障。
在一个特定的实施方案中，本文中所述的血脑屏障穿梭模块的IgG抗体的重链在其Fc-区C-末端与作为单价结合实体的结合血脑屏障受体的scFab缀合，具有以下结构：
-IgG重链，
-衔接物，将IgG重链的Fc区的C-末端与scFab的VL结构域的N-末端缀合，
-scFab的可变轻链结构域(VL)和C-κ轻链结构域，
-衔接物，将scFab的C-κ轻链结构域的C-末端与scFab的VH结构域的N-末端缀合，
-scFab抗体的可变重链结构域(VH)和IgG CH1重链结构域。
本文中所述的一个方面是运送脑效应物实体穿过血脑屏障的融合多肽，其包括CH2-CH3 Ig实体、衔接物和一个特异性结合血脑屏障受体的scFab，其中scFab通过衔接物与CH2-CH3 Ig实体的C-末端缀合，其中scFab不包括抗转铁蛋白受体抗体8D3(SEQ ID NO:01和SEQ ID NO:02)或变体抗转铁蛋白受体抗体8D3v(SEQ ID NO:01和SEQ IDD NO:03)的可变结构域。
本文中所述的一个方面是运送脑效应物实体穿过血脑屏障的融合多肽，其包括CH2-CH3 Ig实体、衔接物和一个特异性结合血脑屏障受体的scFv，其中scFv通过衔接物与CH2-CH3 Ig实体的C-末端缀合，其中scFv不包括抗转铁蛋白受体抗体8D3(SEQ ID NO:01和SEQ ID NO:02)或变体抗转铁蛋白受体抗体8D3v(SEQ ID NO:01和SEQ IDD NO:03)的可变结构域。
在一个实施方案中，融合多肽还包括在CH2-CH3 Ig实体的N-末端的衔接物，其将脑效应物实体与CH2-CH3 Ig实体的N-末端汇合。
在融合多肽的一个实施方案中，脑效应物实体选自神经疾病药物、神经营养因子、生长因子、酶、细胞毒性剂、选自scFv、Fv、scFab、Fab、VHH、F(ab’)2的针对脑靶标的抗体片段或肽。
在融合多肽的一个实施方案中，特异性地结合血脑屏障受体的scFab或scFv特异性地结合转铁蛋白受体。在一个实施方案中，scFab或scFv特异性地结合包括在SEQ ID NO:04、05或06的氨基酸序列内的转铁蛋白受体表位。
在融合多肽的实施方案中，衔接物是肽衔接物。在一个实施方案中，肽衔接物具有至少15个氨基酸长度的氨基酸序列。在一个实施方案中，肽衔接物具有20至50个氨基酸长度。在一个实施方案中，肽衔接物具有氨基酸序列(G4S)6G2(SEQ ID NO:07)或(G4S)4(SEQID NO:08)。
在融合多肽的一个实施方案中，CH2-CH3 Ig实体是CH2-CH3 IgG实体。
本发明的其它方面是编码本文中所述的融合多肽的分离核酸和包含编码本文中所述的融合多肽的核酸的宿主细胞。
本文中所述的一个方面是缀合物，其包括本文中所述的融合多肽和通过衔接物与本文中所述的融合多肽的CH2-CH3 Ig实体的N-末端缀合的脑效应物实体。
在缀合物的一个实施方案中，脑效应物实体是神经营养因子，而将神经营养因子与CH2-CH3 Ig实体的N-末端缀合的衔接物是肽衔接物。
本文中所述的其它方面是包括本文中所述的缀合物和药物载体的药物制剂，本文中所述的缀合物的用途，特别是缀合物用于神经退行性疾病治疗的用途，特别是阿尔茨海默氏病。
特异性地结合血脑屏障受体的单价结合实体可以直接或通过肽衔接物与抗体的轻链或重链的任一个末端缀合。在一个实施方案中，单价结合实体与重链的C-末端缀合。
抗体重链的C-末端可以是完整的C-末端，结束于氨基酸残基PGK。重链的C-末端可以是缩短的C-末端，其中C-末端氨基酸残基的一个或两个已经被除去。在一个实施方案中，重链的C-末端是缩短的C-末端，结束于氨基酸残基PG。
单价结合实体可以直接或通过肽衔接物与相应抗体链缀合。在一个实施方案中，肽衔接物具有氨基酸序列GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:09)。
单价结合实体可以是抗体scFv片段。在一个实施方案中，单价结合实体是从N-至C-末端包括轻链可变结构域-轻链恒定结构域-肽衔接物-重链可变结构域-重链恒定结构域1的scFv。
在一个实施方案中，单价结合实体是具有(G4S)6肽衔接物(SEQ ID NO:10)的抗转铁蛋白受体-抗体的scFv片段。
在一个实施方案中，血脑屏障受体选自转铁蛋白受体、胰岛素受体、***受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白8、低密度脂蛋白受体相关蛋白1和肝素结合表皮生长因子样生长因子。在一个实施方案中，血脑屏障受体是人血脑屏障受体。在一个实施方案中，血脑屏障受体是转铁蛋白受体，并且抗体不抑制转铁蛋白受体与转铁蛋白的结合。在一个实施方案中，血脑屏障受体是人转铁蛋白受体。
在一个实施方案中，将单价结合实体与脑效应物实体缀合的肽衔接物是具有至少15个氨基酸长度的氨基酸序列。在一个实施方案中，肽衔接物具有18至25个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，脑效应物实体是全长抗体。在一个实施方案中，脑效应物实体是IgG1或IgG4亚类的全长抗体。
在一个实施方案中，单价结合实体是抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段。在一个实施方案中，抗血脑屏障受体抗体或其片段不损害血脑屏障受体与其天然配体中的一个或多个的结合。在另一个实施方案中，抗血脑屏障受体抗体以不抑制人转铁蛋白受体与人转铁蛋白结合的方式，特异性地结合人转铁蛋白受体。
在一个实施方案中，血脑屏障穿梭模块是效应物沉默的。
在一个实施方案中，脑效应物实体是包括Fc-区的全长抗体，其中在Fc-区是人IgG1亚类的情况中，Fc-区包括突变L234A、L235A和P239G(根据Kabat的EU索引编号)，或在Fc-区是人IgG4亚类的情况中，Fc-区包括突变S228P、L235E和P239G(根据Kabat的EU索引编号)。
发明实施方案的详述
I.定义
对于本文的目的，“受体人构架”是包括源自以下定义的人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“源自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可以包括与其相同的氨基酸序列，或可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
“亲和力”指在分子(例如抗体)的单个结合位点及其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和强度。除非另外指出，否则如本文中所用，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对于其配偶体Y的亲和力一般可以通过解离常数(Kd)来表示。亲和力可以通过本领域已知的常见方法，包括本文描述的那些，来进行测量。以下描述了用于测量结合亲和力的特定的说明性和示例性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个超变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致抗体对抗原的亲和力的提高。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们呈现出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”指非完整抗体的分子，其包括完整抗体中与完整抗体所结合的抗原结合的部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种。
抗体的“类”指抗体重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要的抗体类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中几个可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
“效应物功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随着抗体类别而改变。抗体效应物功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
药剂，例如药物制剂，的“有效量”是指，以所需剂量和时间段，有效地实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，其含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号根据EU编号***，也称为EU索引，如Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(目标免疫蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中描述的。
“构架”或“FR”指除了超变区(HVR)残基外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般以下述顺序在VH(或VL)中出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已引入其内的细胞，包括此细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和从其衍生的后代，不考虑传代数目。后代可以在核酸内容上与亲本细胞不完全等同，而是可以含有突变。在本文中涵盖具有针对原始转化细胞所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变体后代。
“人共有构架”是代表在选择的一系列人免疫球蛋白VL或VH构架序列中最常出现的氨基酸残基的构架。通常，选择的人免疫球蛋白VL或VH序列来自可变结构域序列的亚组。通常，该序列亚组是如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫目标蛋白的序列)，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等同上引文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等同上引文中的亚组III。
“人源化”抗体是指包括来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在特定实施方案中，人源化抗体将包括至少一个和一般两个可变结构域的基本上全部，其中HVR(例如CDR)的全部或基本上全部对应于非人抗体的，而FR的全部或基本上全部对应于人抗体的。人源化抗体任选可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经经历了人源化的抗体。
如本文使用的，术语“超变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中序列超变(“互补决定区”或“CDR”)和形成结构上限定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触者”)的各个区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。
本文中的HVR包括：
(a)出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)的超变环(Chothia，C.和Lesk，A.M.J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)出现在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)的CDR(Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(目标免疫蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutesof Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242)；
(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1),46-55(L2),89-96(L3),30-35b(H1),47-58(H2)和93-101(H3)的抗原接触者(MacCallum等J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2),47-56(L2),48-56(L2),49-56(L2),26-35(H1),26-35b(H1),49-65(H2),93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另有所指，HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等(见上引文)编号。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，如猴)、兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在特定实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已经与其天然环境中的组分分离的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电点聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评价抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman，S.等，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。
“分离的”核酸指已经与其天然环境中的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色***置不同的染色***置上。
如本文使用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同质的一个抗体群体的抗体，即，除了一般以微小量存在的可能的变体抗体(例如含有天然产生的或在单克隆抗体制备物的生产过程中出现的突变)外，群体中的各抗体是相同的和/或结合相同的表位。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比，单克隆抗体制备物的所有单克隆抗体都针对抗原上的一个决定簇。因此，修饰词“单克隆”是指抗体获自基本上同质的抗体群体的特征，并不应解释为要求通过任何特定方法生产该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这些方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中描述。
“天然抗体”指具有各种结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键连接的两条相同轻链和两条相同重链组成。从N到C末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后为三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。相似地，从N到C末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后为恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链，基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以分配至称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个类型之一。
术语“包装说明书”用于指习惯上包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有与此治疗产品使用相关的如下信息：适应症、用法、剂量、给药、联合治疗、禁忌和/或警告。
相对于参考多肽序列，“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为，在比对参考序列和候选序列且在需要时引入空位以实现最大序列同一性百分比后，不将任何保守置换考虑为序列同一的部分，在候选序列中与参考多肽序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域已知的多种方法实现，例如使用可公开获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括为在待比较的序列的全长上实现最大对齐所需的任何算法。然而，对于本文的目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创作，并且源代码已与用户文档一起提交给美国版权局(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.，20559，其注册为美国版权登记号TXU510087。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，South San Francisco，California公开获得，或可以由源代码编译。ALIGN-2程序应当编译以用于在UNIX操作***(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数通过ALIGN-2程序设置并且不改变。
在ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与或相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以可替代地表达为，与或相对于给定氨基酸序列B，具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
100乘以分数X/Y，
其中X是在ALIGN-2程序的A和B比对中由序列比对程序ALIGN-2评为相同匹配的氨基酸残基的数目，其中Y是B中的氨基酸残基的总数目。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的％氨基酸序列同一性不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文使用的所有％氨基酸序列同一性值，如紧前面段落中所述，通过ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”是指这样的制品，该制品的形式使得其中含有的活性成分的生物活性是有效的，并且不含有对制剂将施用于的受试者具有无法接受的毒性的另外组分。
“药物学上可接受的载体”是指在药物制剂中除了活性成分外的对受试者无毒的成分。药物学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文使用的，“治疗(treatment)”(及其语法变体，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指尝试改变所治疗个体的自然过程的临床干预，其可以执行用于预防或在临床病理学的过程中执行。治疗的期望效应包括但不限于，防止疾病的出现或复发、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态和缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明抗体用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)一般具有相似结构，其中每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个超变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，N.Y.(2007)第91页)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL结构域，分别筛选互补VL或VH结构域文库，以分离结合该特定抗原的抗体。参见,例如，Portolano等，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson，T.等，Nature 352(1991)624-628。
如本文使用的，术语“载体”是指能够扩增与之连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能够指导与之可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。
“血脑屏障”(BBB)是指外周循环与脑和脊髓之间的生理屏障，其由脑毛细血管内皮质膜内的紧密连接形成，从而建立限制分子(甚至非常小的分子如尿素(60道尔顿))运输进脑中的紧密屏障。脑内的BBB、脊髓内的血液-脊髓屏障、和视网膜内的血液-视网膜屏障，是CNS内的连续毛细血管屏障，并且在本文中被统称为血脑屏障或BBB。BBB还包括血液-CSF屏障(脉络丛)，此屏障由室管膜细胞而不是毛细血管内皮细胞构成。
“中枢神经***”(CNS)指，控制身体功能的神经组织的复合体，并且包括脑和脊髓。
“血脑屏障受体”(BBBR)是在脑内皮细胞上表达的细胞外膜连接的受体蛋白，其能够将分子运送通过BBB或者用于运送外源施用的分子。BBBR的实例包括但不限于转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、***受体(IGF-R)、低密度脂蛋白受体(包括但不限于低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)和低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8))以及肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。示例性BBBR是转铁蛋白受体(TfR)。
术语“脑效应物实体”是指，待跨BBB运输至脑的分子。效应物实体典型地具有希望递送至脑的特征性治疗活性。效应物实体包括神经疾病药物和细胞毒性剂，例如多肽和抗体，尤其是针对脑靶标的单克隆抗体或其片段。
术语“单价结合实体”是指能够特异性地且以单价结合模式与BBBR结合的分子。本文中所述的血脑穿梭模块和/或缀合物的特征在于，存在单个单价结合实体单位，即本发明的血脑穿梭模块和/或缀合物包含正好一个单位的单价结合实体。单价结合实体包括但不限于多肽、全长抗体、抗体片段，包括Fab、Fab′、Fv片段、单链抗体分子，如例如单链Fab、scFv。单价结合实体可以是例如使用现有技术(如噬菌体展示或免疫)工程改造的支架蛋白。单价结合实体还可以是多肽。在某些实施方案中，单价结合实体包含CH2-CH3 Ig结构域和针对血脑屏障受体的单链Fab(scFab)。所述scFab可以通过衔接物偶联至CH2-CH3 Ig结构域的C-末端。在某些实施方案中，所述scFab针对转铁蛋白受体。
术语“单价结合模式”是指与BBBR的特异性结合，其中单价结合实体和BBBR之间的相互作用通过一个单一表位而发生。由于单个表位相互作用点，单价结合模式可以阻断BBBR的任何二聚化/多聚化。单价结合模式可以阻止BBBR的胞内分选被变化。
术语“表位”指，能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和或特定的电荷特性。表位是被抗体结合的抗原区域。
“转铁蛋白受体”(TfR)是一种跨膜糖蛋白(具有约180,000Da的分子量)，其由两个二硫键键合的亚基(各自的表观分子量为约90,000Da)组成并参与脊椎动物中的铁摄取。在一个实施方案中，本文中的TfR是人TfR，其包含如在Schneider等(Nature 311(1984)：675-678)中报道的氨基酸序列。
术语“神经疾病”是指影响CNS和/或在CNS中具有病因的疾病或病症。示例性的CNS疾病或病症包括，但不限于，神经病、淀粉样变性、癌症、眼的疾病或病症、病毒或微生物感染、炎症、缺血、神经变性疾病、癫痫发作、行为疾病和溶酶体贮积病。为了本申请的目的，将理解CNS包括眼，其通常通过血液-视网膜屏障与身体的其它部分隔开。神经疾病的具体实例包括，但不限于，神经变性疾病(包括，但不限于，路易体病(Lewy body disease)，脊髓灰质炎后综合征(postpoliomyelitis syndrome)，夏伊-德雷格综合征(Shy-Draegersyndrome)，橄榄体脑桥小脑萎缩(olivopontocerebellar atrophy)，帕金森病(Parkinson′s disease)，多***萎缩(multiple system atrophy)，纹状体黑质变性(striatonigral degeneration)，Tau蛋白病(tauopathies)(包括，但不限于，阿尔茨海默氏病(Alzheimer disease)和核上性麻痹(supranuclear palsy))，朊病毒病(priondiseases)(包括，但不限于，牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy)，痒病(scrapie)，克-雅综合征(Creutzfeldt-Jakob syndrome)，库鲁病(kuru)，格-施-沙病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)，慢性消耗性疾病(chronic wastingdisease)和致命性家族性失眠症(fatal familial insomnia))，延髓性麻痹(bulbarpalsy)，运动神经元病(motor neuron disease)，和神经***异变性疾病(nervous systemheterodegenerative disorders)(包括，但不限于，卡纳范病(Canavan disease)，亨廷顿病(Huntington′s disease)，神经元蜡样脂褐素沉积症(neuronal ceroid-lipofuscinosis)，亚历山大病(Alexander′s disease)，图雷特综合征(Tourette′ssyndrome)，门克斯扭结发综合征(Menkes kinky hair syndrome)，科凯恩综合征(Cockayne syndrome)，哈勒沃登-施帕茨综合征(Halervorden-Spatz syndrome)，拉福拉病(lafora disease)，雷特综合征(Rett syndrome)，肝豆状核变性(hepatolenticulardegeneration)，莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)，和翁-隆综合征(Unverricht-Lundborg syndrome))，痴呆(dementia)(包括，但不限于，皮克病(Pick′s disease)和脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia))，癌症(例如CNS和/或脑的癌症，包括源自身体其它位置的癌症的脑转移)。
术语“神经疾病药物”是治疗一种或多种神经疾病的药物或治疗剂。神经疾病药物包括，但不限于，小分子化合物，抗体，肽，蛋白质，一种或多种CNS靶标的天然配体，一种或多种CNS靶标的天然配体的修饰形式，适体，抑制性核酸(即，小抑制性RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA))，核酶和小分子，或上述中任何一种的活性片段。示例性神经疾病药物描述于此并且包括，但不限于：抗体，适体，蛋白质，肽，抑制性核酸和小分子以及上任何一种的活性片段，它们本身是CNS抗原或靶标分子、或它们特异性识别和/或作用于(即，抑制，活化或检测)CNS抗原或靶标分子，如，但不限于，淀粉样蛋白前体蛋白或其部分，淀粉样蛋白β，β-分泌酶，γ-分泌酶，tau，α-突触核蛋白，帕金蛋白，亨廷顿蛋白，DR6，早老蛋白，ApoE，神经胶质瘤或其它CNS癌症标志物，以及神经营养蛋白。神经疾病药物以及可以使用它们治疗的对应疾病的非限制性实例：脑源神经营养因子(BDNF)，慢性脑损伤(神经发生)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，抗-表皮生长因子受体脑癌，(EGFR)-抗体，神经胶质细胞系衍生的神经因子，帕金森病，(GDNF)，脑衍生的神经营养因子(BDNF)，肌萎缩性侧索硬化，抑郁症，溶酶体酶，脑的溶酶体贮积疾病，睫状神经营养因子(CNTF)，肌萎缩性侧索硬化，神经调节蛋白-1，精神***症，抗-HER2抗体(例如曲妥珠单抗)，来自HER2-阳性癌症的脑转移。
术语“成像剂”是具有一种或多种允许其的存在和/或位置被直接或间接检测到的性质的化合物。这样的成像剂的实例包括掺入允许检测的标记实体的蛋白和小分子化合物。
术语“CNS抗原”或“脑靶标”是在CNS(包括脑)中表达的抗原和/或分子，其可以被抗体或小分子所靶向。这样的抗原和/或分子的实例包括，但不限于：β-分泌酶1(BACEl)、淀粉样蛋白β(Aβ)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)、Tau、载脂蛋白E4(ApoE4)、α-突触核蛋白、CD20、亨廷顿蛋白、朊病毒蛋白(PrP)、富含亮氨酸重复的激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、γ分泌酶、死亡受体6(DR6)、淀粉样蛋白前体蛋白(APP)、p75神经营养蛋白受体(p75NTR)和胱天蛋白酶6。在一个实施方案中，所述抗原是BACEl。
术语“特异性地结合”表示抗体选择性地或优先地结合抗原。通常使用标准试验来测定结合亲和力，所述试验如Scatchard分析，或表面等离子体共振技术(例如，使用
Figure BDA0002255938790000181
)。
如本文中使用的术语“CH2-CH3 Ig实体”是指从免疫球蛋白CH2或CH3结构域衍生出的蛋白实体。“CH2-CH3 Ig实体”包含两个形成二聚体的“CH2-CH3”多肽。所述免疫球蛋白可以是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。在一个实施方案中，所述CH2-CH3 Ig实体源自IgG免疫球蛋白，且在本文中被称作“CH2-CH3 IgG实体”。该术语包括CH2-CH3结构域的天然序列和变体CH2-CH3结构域。在一个实施方案中，所述“CH2-CH3 Ig实体”源自人重链CH2-CH3 IgG结构域，所述结构域从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C-端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非在本文中另外说明，CH2-CH3结构域区域或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号***，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。
“缀合物”是与一个或多个异源分子缀合的本发明的融合蛋白，所述异源分子包括，但不限于，标记物、神经疾病药物或细胞毒性剂。
本文中使用的“衔接物”是指化学衔接物或单链肽衔接物，其共价连接本文中所述的血脑屏障穿梭模块和/或融合蛋白和/缀合物的不同实体。例如，衔接物可以连接脑效应物实体与单价结合实体。例如，如果单价结合实体包含CH2-CH3 Ig实体和针对血脑屏障受体的scFab，那么衔接物可以将scFab缀合至CH3-CH2 Ig实体的C-末端。将脑效应物实体缀合至单价结合实体的衔接物(第一衔接物)和将scFab连接至CH2-CH3 Ig结构域的C-末端的衔接物(第二衔接物)可以相同或不同。
可以使用单链肽衔接物，其由一个至二十个通过肽键连接的氨基酸残基组成。在某些实施方案中，所述氨基酸选自二十种天然存在的氨基酸。在某些其它实施方案中，所述氨基酸中的一个或多个选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在其它实施方案中，所述衔接物是化学衔接物。在某些实施方案中，所述衔接物是单链肽衔接物，具有至少25个氨基酸残基长度的氨基酸序列，在一个优选实施方案中，具有32至50个氨基酸残基的长度。在一个实施方案中，肽衔接物是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3，n＝8、9或10)或(x＝4和n＝6、7或8)，在一个实施方案中，x＝4，n＝6或7，在一个优选实施方案中，x＝4，n＝7。在一个实施方案中，衔接物是(G4S)4(SEQ ID NO:08)。在一个实施方案中，衔接物是(G4S)6G2(SEQ ID NO:07)。
可以使用多种化学衔接物进行缀合。例如，可以使用多种双官能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚胺酯的双官能衍生物(如，盐酸己二亚氨酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、二-重氮鎓衍生物(如二-(对重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性的氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，缀合单价结合实体或融合蛋白和脑效应物实体。衔接物可以是“可断裂的衔接物”，从而利于效应物实体在递送至脑后释放。例如，可以使用酸不稳定的衔接物、肽酶敏感的衔接物、光不稳定的衔接物、二甲基衔接物或含有二硫键的衔接物(Chari等，Cancer Res.52(1992)127-131；美国专利号5,208,020)。
共价缀合可以直接进行或通过衔接物进行。在某些实施方案中，直接缀合通过构建多肽融合物进行(即，通过编码针对BBBR的单价结合实体和效应物实体的两个基因的基因融合，和表达为单一多肽(链))。在某些实施方案中，直接缀合为，在针对BBBR的单价结合实体的两部分之一上的反应基团与脑效应物实体上的对应基团或受体之间形成共价键。在某些实施方案中，直接缀合为，将要缀合的两种分子之一进行修饰(即基因修饰)，以包括在适当条件下可以与要缀合的另一分子形成共价连接的反应基团(作为非限制性实例，巯基或羧基)。作为一个非限制性实例，可以将具有期望的反应基团(即，半胱氨酸残基)的分子(即，氨基酸)，引入到例如针对BBBR抗体的单价结合实体中，与神经药物形成二硫键。使核酸与蛋白共价缀合的方法也是本领域已知的(即，光交联，参见，例如，Zatsepin等，Russ.Chem.Rev.(俄罗斯化学综述)74(2005)77-95)。还可以使用多种衔接物进行缀合。例如，使用多种双官能蛋白偶联剂，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚胺酯的双官能衍生物(如盐酸己二亚氨酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、二-重氮鎓衍生物(如二-(对重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性的氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)，可以缀合单价结合实体和效应物实体。也可以使用包含通过肽键连接的一至二十个氨基酸残基的肽衔接物。在某些这样的实施方案中，氨基酸残基选自二十种天然存在的氨基酸。在某些其它这样的实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。衔接物可以是“可断裂的衔接物”，利于效应物实体在递送至脑后释放。例如，可以使用酸不稳定的衔接物、肽酶敏感的衔接物、光不稳定的衔接物、二甲基衔接物或含有二硫键的衔接物(Chari等，CancerRes.52(1992)127-131；美国专利号5,208,020)。
II.组合物和方法
在一个方面中，本发明部分基于如下发现：本文中所述的血脑屏障穿梭模块可以用于递送脑效应物实体穿过血脑屏障进入脑中。在某些实施方案中，血脑屏障穿梭模块包括特异性地结合血脑屏障受体(如转铁蛋白受体)的单价结合实体。本文中所述的血脑屏障穿梭模块例如可用于神经疾病的诊断或治疗，所述神经疾病如阿尔茨海默氏病、帕金森病、和具有帕金森病共病的阿尔茨海默氏病。
A.示例性抗血脑屏障受体抗体
特异性结合血脑屏障受体的单价结合实体可以就其结合和转胞吞特性来表征：
-作为单价结合实体，对BBBR表达细胞的有效细胞结合，
-作为单价结合实体，有效的体外转胞吞作用，
-人-猕猴交叉反应性(例如，在BIAcore和FACS实验中)。
在基于hCMEC/D3的试验中进行了转胞吞作用筛选。试验以脉冲追踪模式进行。用单价结合实体孵育hCMEC/D3脑内皮细胞1小时，此后洗涤并在洗涤后0小时和4小时测定以下参数：
i)在荷载阶段期间，吸收至细胞中的单价结合实体量，
ii)荷载和洗涤后4小时，基底外侧的单价结合实体量；
iii)荷载和洗涤后4小时，顶端的单价结合实体量；
iv)荷载和洗涤后0小时和4小时，细胞中的单价结合实体量(通过细胞裂解)；
v)荷载和洗涤后0小时和4小时，单价结合实体的总量。
为了合适作为本文中所述的血脑屏障穿梭模块中的单价结合实体，单体结合实体必需i)被hCMEC/D3细胞吸收(胞吞作用)，ii)运送到hCMEC/D3细胞外(胞吐作用)，和iii)在hCMEC/D3细胞内是稳定的(没有向内体的运送降解或低的运送降解)。
因此，在一个实施方案中，在基于hCMEC/D3的试验中单价结合实体可以表征为：i)在一个小时荷载期中(实质性地)吸收至hCMEC/D3细胞中，ii)荷载期和洗涤步骤后在洗涤后的4小时内，释放至顶端和/或基底外侧区室中，和iii)低(胞内)降解速率。
在一个实施方案中，荷载浓度为约2.67μg/mL单价结合实体，持续一小时。
已经发现，为了合适作为本文中所述的血脑屏障穿梭模块的单价结合实体，单价结合实体必须在上述基于hCMEC/D3的试验中显示出以下阈值：
i)荷载期中吸收至细胞中的单价结合实体量为400pg或更高，
ii)荷载和洗涤后4小时基底外侧的单价结合实体量为100pg或更高，
iii)荷载和洗涤后4小时顶端的单价结合实体量为150pg或更高。
小鼠抗人转铁蛋白受体抗体128.1(对于可变区序列，参见WO 93/10819和SEQ IDNO:11和12)可以作为参照。在这种情况中，为了合适作为本文中所述的血脑屏障穿梭模块的单价结合实体，单价结合实体必须在上述基于hCMEC/D3的试验中显示出以下阈值：
i)在荷载期中吸收至细胞中的单价结合实体量为抗体128.1荷载量的20％或更多，
ii)荷载和洗涤后4小时，单价结合实体的基底外侧量为抗体128.1的基底外侧量的15％或更多；和
iii)荷载和洗涤后4小时，单价结合实体的顶端量为抗体128.1的顶端量的15％或更多。
如下进行基于hCMEC/D3的试验(这是本文描述的所有方面的一个实施方案)：
用于hCMEC/D3的培养基和补充剂(参见WO 2006/056879和Weksler，B.B.等，FASEBJ.19(2005)1872-1874)获自Lonza。在含有2.5％FBS、四分之一供应的生长因子、且完全补充了供应的氢化可的松、庆大霉素和抗坏血酸的EBM2培养基中，将/可以将hCMEC/D3细胞(23-29传代)在胶原蛋白包被的盖玻片上(显微镜)或在烧瓶中培养至汇合。
对于所有转胞吞试验，将高密度孔(1×108孔/cm2)PET膜滤器***物(0.4μm孔径，12mm直径)用于/可以用于12-孔细胞培养板中。对于顶端和基底外侧室，计算培养基体积，分别为400μL和1600μL。用/可以用大鼠尾胶原蛋白I(7.5μg/cm2)接着用纤连蛋白(5μg/mL)，包被滤器***物的顶端室，每次孵育在RT下持续1h。在EBM2培养基中10-12天，将hCMEC/D3细胞生长/可以生长至汇合单层(～2×105细胞/cm2)。在试验前，空滤器在/可以在含有1％BSA的PBS中封闭1小时或过夜(o/n)，然后在EBM2中校准至少1小时。
在无血清EBM2培养基(否则如本文其它地方描述进行重构)中进行试验(对于试验方案，参见图1)。在试验当天，对细胞实行血清饥饿60min，以耗尽所讨论的血脑屏障受体的天然配体。用所讨论的单克隆抗体(单价结合实体)在37℃在顶端孵育含有或不含细胞(但在完全培养基中封闭过夜)的滤器***物1小时。在顶端(400μL)和基底外侧(1600μL)在无血清培养基中在室温(RT)洗涤单层三次，每次3-5min。将预先温热的培养基加入顶端室中，并且将滤器转移至含有1600μL预先温热的培养基的新12孔板(用含有1％BSA的PBS封闭过夜)中。在这点，将含有或不含细胞的滤器在500μL RIPA缓冲液中裂解，以测定特定抗体(单价结合实体)吸收。剩余的滤器在37℃或4℃孵育，并且在不同时间点收集样品以测定抗体(单价结合实体)的顶端和/或基底外侧释放。可以使用高灵敏IgG ELISA来定量样品中的抗体含量(参见实施例10)。对于每个时间点，应当从两个空滤器和三个滤器细胞培养物产生数据。
69种抗转铁蛋白受体抗体的结果显示于下表中。抗体128.1用作参照。
Figure BDA0002255938790000241
Figure BDA0002255938790000242
Figure BDA0002255938790000251
Figure BDA0002255938790000261
抗体299显示出705pg的转胞吞荷载，4小时后在基底外侧区室中可以看到170pg(＝荷载的24％)，在顶端区室中可以看到294pg(＝荷载的42％)。
抗体494显示出3510pg的转胞吞荷载，4小时后在基底外侧区室中可以看到748pg(＝荷载的21％)，在顶端区室中可以看到1503pg(＝荷载的43％)。
满足如上所列标准的抗体是本发明的实施方案。
因此，本文的一个方面是抗转铁蛋白受体抗体或其转铁蛋白受体结合片段，其包含
(1)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(3)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(4)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(5)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(6)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(7)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(8)具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(9)具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(10)具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(11)具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(12)具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(13)具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(14)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(15)具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(16)具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(17)具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(18)具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(19)具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(20)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(21)具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(22)具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(23)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(24)具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(25)具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(26)具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(27)具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(28)具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(29)具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(30)具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(31)具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(32)具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(33)具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(34)具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(35)具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(36)具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(37)具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(38)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(39)源自具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(40)具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(41)具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(42)具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链可变结构域，或
(43)具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链可变结构域。
本文的一个优选方面是包含具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变结构域的抗转铁蛋白受体抗体或其转铁蛋白受体结合片段。
本文中所述的一个优选方面是包含具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变结构域的抗转铁蛋白受体抗体或其转铁蛋白受体结合片段。
代表性的氨基酸序列描述于下表中。
Figure BDA0002255938790000301
Figure BDA0002255938790000311
Figure BDA0002255938790000321
Figure BDA0002255938790000331
Figure BDA0002255938790000341
Figure BDA0002255938790000351
Figure BDA0002255938790000361
本文中所述的一个方面是人源化抗转铁蛋白受体抗体或其转铁蛋白受体结合片段，其包含
(1)源自具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(2)源自具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(3)源自具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(4)源自具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(5)源自具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(6)源自具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(7)源自具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(8)源自具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(9)源自具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(10)源自具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(11)源自具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(12)源自具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(13)源自具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(14)源自具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(15)源自具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(16)源自具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(17)源自具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(18)源自具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(19)源自具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(20)源自具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(21)源自具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(22)源自具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(23)源自具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(24)源自具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(25)源自具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(26)源自具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(27)源自具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(28)源自具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(29)源自具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(30)源自具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(31)源自具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(32)源自具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(33)源自具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(34)源自具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(35)源自具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(36)源自具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(37)源自具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(38)源自具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(39)源自具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(40)源自具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(41)源自具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(42)源自具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或
(43)源自具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域。
本文中所述的一个优选方面是包含源自具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域的人源化抗转铁蛋白受体抗体或其转铁蛋白受体结合片段。
本文中所述的一个方面是人源化抗人转铁蛋白受体抗体，其包括(a)包含SEQ IDNO:109的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包括(d)包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的HVR-L3。
本文中所述的一个方面是人源化抗人转铁蛋白受体抗体，其包括(a)包含SEQ IDNO:109的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包括(d)包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面中，本发明提供抗转铁蛋白受体抗体，其包括至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面中，本发明提供包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VHHVR序列的抗体：(a)包括SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包括SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的HVR-L3。在进一步的实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ IDNO:115的氨基酸序列的HVR-L3和包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HVR-H2。在进一步的实施方案中，抗体包括(a)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面中，本发明提供包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列的抗体：(a)包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包括(a)包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面中，本发明的抗体包括(a)VH结构域，其包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，其包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面中，本发明提供抗体，其包括(a)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的HVR-L3。
本文中所述的一个优选方面是包含源自具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域的人源化抗转铁蛋白受体抗体或其转铁蛋白受体结合片段。
本文中所述的一个方面是人源化抗人转铁蛋白受体抗体，其包括(a)包含SEQ IDNO:116的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包含(d)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的HVR-L3。
本文中所述的一个方面是人源化抗人转铁蛋白受体抗体，其包括(a)包含SEQ IDNO:116的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包含(d)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面中，本发明提供抗转铁蛋白受体抗体，其包括选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面中，本发明提供包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VHHVR序列的抗体：(a)包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的HVR-L3。在进一步的实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ IDNO:122的氨基酸序列的HVR-L3和包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的HVR-H2。在进一步的实施方案中，抗体包括(a)包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面中，本发明提供包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列的抗体：(a)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包括(a)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面中，本发明的抗体包括(a)VH结构域，其包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，其包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面中，本发明提供抗体，其包括(a)包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的HVR-L3。
本文中所述的一个方面是转铁蛋白穿梭模块，其包括作为脑效应物实体的全长IgG抗体、衔接物和一个作为单价结合实体的结合转铁蛋白受体的scFab，其中scFab通过衔接物与IgG抗体的重链之一的Fc-区的C-末端缀合。
本文中所述的一个方面是转铁蛋白穿梭模块，其包括作为脑效应物实体的全长IgG抗体、衔接物和一个作为单价结合实体的结合转铁蛋白屏障受体的scFv，其中scFv通过衔接物与IgG抗体的重链之一的Fc-区的C-末端缀合。
在一个优选的实施方案中，单价结合实体包括SEQ ID NO:109、110、112、113、114和115，或SEQ ID NO:116、117、119、120、121和122的HVR。
在进一步的方面中，根据以上任一个实施方案的抗转铁蛋白受体抗体可以单独或组合地并入以下部分1-6中所述的任何特征。
1.抗体亲和力
在一个实施方案中，Kd通过放射性标记抗原结合测定法(RIA)进行测量。在一个实施方案中，RIA用目的抗体的Fab形式及其抗原进行。例如，Fab对于抗原的溶液结合亲和力通过下述进行测量：在滴定系列的未标记抗原的存在下用最低浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，随后用抗Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原(参见，例如Chen等，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。为了建立用于该测定法的条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)包被
Figure BDA0002255938790000451
多孔板(Thermo Scientific)过夜，并且随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)阻断二到五小时。在非吸附性平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与系列稀释的目的Fab混合(例如，与Presta等，Cancer Res.57(1997)4593-4599中的抗VEGF抗体Fab-12的评价一致)。目的Fab随后孵育过夜；然而，孵育可以继续更长时间(例如约65小时)，以确保达到平衡。其后，将混合物转移至捕获平板，用于在室温下孵育(例如一小时)。随后去除溶液并且将平板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20(TWEEN-
Figure BDA0002255938790000461
)洗涤八次。平板干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且将平板在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数十分钟。选择给出小于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度，用于竞争结合测定法中。
根据另一个实施方案，Kd使用
Figure BDA0002255938790000462
表面等离子体共振测定法测量。例如，在25℃使用
Figure BDA0002255938790000463
-2000或
Figure BDA0002255938790000464
-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)，以～10反应单位(RU)使用固定化抗原CM5芯片进行测定。在一个实施方案中，根据供应商的说明书，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释至5μg/ml(～0.2μM)，之后以5μl/分钟的流速注射，以获得约10反应单位(RU)的偶联蛋白质。在抗原注射后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注射在具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍系列稀释的Fab(0.78nM-500nM)。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(
Figure BDA0002255938790000465
Evaluation Software版本3.2)，计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比值(参见，例如，Chen等,J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。如果通过以上表面等离子体共振测定法结合速率超过106M-1s-1，则结合速率可以通过使用荧光猝灭技术进行测定，所述荧光猝灭技术测量在递增浓度的抗原的存在下在25℃在PBS，pH 7.2中20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或降低，其中测量可以使用例如分光光度计，例如配备停流的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色杯的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)。
2.抗体片段
在特定实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括，但不限于，Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段及下文描述的其他片段。关于一些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.等，Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，参见例如，Pluckthun,A.，见The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学)，113卷，Rosenburg和Moore(编辑)，Springer-Verlag，New York(1994)，pp.269-315；也参见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见US5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等，Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger,P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。三抗体和四抗体也在Hudson,P.J.等，Nat.Med.9(2003)129-134中描述。
单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或者轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在特定实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，US 6,248,516)。
抗体片段可以通过多种技术进行制备，包括但不限于，完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文描述的。
3.嵌合和人源化抗体
在特定实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。特定嵌合抗体例如在US4,816,567；和Morrison，S.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855中描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物，如猴的可变区)和人恒定区。在进一步的实例中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中类或亚类已相对于亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在特定实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化，以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还可以包含人恒定区的至少部分。在一些实施方案中，在人源化抗体中的一些FR残基被置换为来自非人抗体(例如从其产生HVR残基的抗体)的相应残基，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法例如在Almagro,J.C.和Fransson,J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633中综述，并且例如在下述文献中进一步描述：Riechmann,I.等，Nature332(1988)323-329；Queen,C.等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US5,821,337，US7,527,791，US6,982,321和US7,087,409；Kashmiri,S.V.等，Methods 36(2005)25-34(描述特异性决定区(SDR)嫁接)；Padlan,E.A.，Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重建”(resurfacing))；Dall’Acqua,W.F.等，Methods 36(2005)43-60(描述“FR改组”)；和Osbourn,J.等，Methods 36(2005)61-68和Klimka,A.等，Br.J.Ccancer，83(2000)252-260(描述“引导选择”方法到FR改组)。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”法选择的构架区(参见，例如，Sims,M.J.等J.Immumol.151:2296(1993))；源自特定亚组的轻或重链可变区的人抗体共有序列的构架区(参见，例如，Carter,P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285；和Presta，L.G.等，J.Immumol.，151(1993)2623)；人成熟(体细胞成熟的)构架区或人种系构架区(参见，例如，Almagro,J.C.和Fransson,J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和源自筛选FR文库的构架区(参见，例如，Baca,M.等，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等，J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。
4.文库衍生的抗体
本发明的抗体可以通过在组合文库中筛选具有一种或多种期望活性的抗体进行分离。例如，本领域已知多种方法可以用于生成噬菌体展示文库且在此类文库中筛选具有所需结合特征的抗体。此类方法综述于例如Hoogenboom,H.R.等，Methods in MolecularBiology 178(2001)1-37，并进一步描述于例如McCafferty,J.等，Nature 348(1990)552-554；Clackson,T等，Nature 352(1991)624-628；Marks,J.D.等，J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.和Bradbury,A.，Methods in Molecular Biology 248(2003)161-175；Sidhu,S.S.等，J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.等，J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472和LEE,C.V.等，J.Immumol.Methods 284(2004)119-132中。
在特定噬菌体展示方法中，VH和VL基因库通过聚合酶链反应(PCR)分开克隆，且随机重组在噬菌体文库中，随后可以如Winter,G.等，Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455中所述在所述噬菌体文库中筛选抗原结合性噬菌体。噬菌体一般以单链Fv(scFv)片段的形式或以Fab片段的形式展示抗体片段。来自免疫源的文库提供了针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。可替代地，可以不经任何免疫接种，克隆(例如从人中)幼稚库(naiverepertoire)，以提供针对广泛的非自身以及自身抗原的单个抗体来源，如Griffiths,A.D.等，EMBO J.12(1993)725-734描述的。最后，幼稚文库还可以通过下述方式合成制备：从干细胞中克隆未重排的V基因区段，且使用含有随机序列的PCR引物以编码高可变CDR3区，在体外实现重排，如通过Hoogenboom,H.R.和Winter,G.，J.Mol.Biol.,227(1992)381-388描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括，例如：US 5,750,373和US 2005/0079574，US2005/0119455，US 2005/0266000，US 2007/0117126，US 2007/0160598，US 2007/0237764，US 2007/0292936和US 2009/0002360。
5.多特异性抗体
在特定实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是具有针对至少两个不同位点的结合特异性的单克隆抗体。在特定实施方案中，结合特异性之一针对转铁蛋白受体，并且另一个针对任何其他抗原。双特异性抗体还可以用于将细胞毒素剂定位至表达转铁蛋白受体的细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共同表达(参见Milstein,C和Cuello,A.C.，Nature 305(1983)537-540，WO 93/08829和Traunecker,A.等，EMBO J.10(1991)3655-3659和“杵进臼”工程(参见，例如，US 5,731,168)。多特异性抗体还可以通过下述进行制备：工程化静电转向效应(electrostatic steering effects)，用于制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，US 4,676,980和Brennan,M.等，Science，229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等,S.A.等，J.Immunol.148(1992)1547-1553；使用“双抗体”技术用于制备双特异性抗体片段(参见，例如，Holliger,P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448)；使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber,M等，J.Immumol.152(1994)5368-5374)；和制备三特异性抗体，如例如Tutt,A.等J.Immumol.147(1991)60-69中所述的。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点的改造抗体，包括章鱼抗体(“Octopusantibodies”)，也包括在本文中(参见，例如US 2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括“双重作用Fab”或“DAF”，其包含与转铁蛋白受体以及另一个不同抗原结合的抗原结合位点(参见，例如US 2008/0069820)。
本文中的抗体或片段还包括WO 2009/080251，WO 2009/080252，WO 2009/080253，WO 2009/080254，WO 2010/112193，WO 2010/115589，WO 2010/136172，WO 2010/145792和WO 2010/145793中所述的多特异性抗体。
在本文中所述所有方面的一个实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体是双特异性抗体。
本文中所述的一个方面是二价、双特异性抗体，其包括
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此替代，
其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。
a)的抗体不含b)所述的修饰，且a)的重链和轻链是分离的链。
在b)的抗体中
在轻链内
可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替代，
和
在重链内
可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替代。
在一个实施方案中，
i)在a)的第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被带正电荷的氨基酸置换，并且其中在a)的第一重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸(根据Kabat编号)被带负电荷的氨基酸置换，
或
ii)在b)的第二轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被带正电荷的氨基酸置换，并且其中在b)的第二重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)被带负电荷的氨基酸置换。
在一个优选的实施方案中
i)在a)的第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)置换(在一个优选的实施方案中，独立地被赖氨酸(K)或精氨酸(R)置换)，并且其中在a)的第一重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)置换，
或
ii)在b)的第二轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)置换(在一个优选的实施方案中，独立地被赖氨酸(K)或精氨酸(R)置换)，并且其中在b)的第二重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)置换。
在一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)被K置换。
在一个实施方案中，在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)被E置换。
在一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸被K置换，并且在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸被E置换(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中位置124和123的氨基酸被K置换，并且其中在第二轻链的恒定结构域CH1中位置147和213的氨基酸被E置换，并且在第一轻链的可变结构域VL中位置38的氨基酸被K置换，在第一重链的可变结构域VH中位置39的氨基酸被E置换，在第二重链的可变结构域VL中位置38的氨基酸被K置换，且在第二轻链的可变结构域VH中位置39的氨基酸被E置换(根据Kabat EU索引编号)。
本文中所述的一个方面是二价、双特异性抗体，其包括
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此替代，并且其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替代，
其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。
a)的抗体不含b)所述的修饰，且a)的重链和轻链是分离的链。
在b)的抗体中
在轻链内
可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替代，并且恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替代；
和
在重链内
可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替代，并且恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替代。
本文中所述的一个方面是二价、双特异性抗体，其包括
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替代，
其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。
a)的抗体不含b)所述的修饰，且a)的重链和轻链是分离的链。
在b)的抗体中
在轻链内
恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替代；
和
在重链内
恒定重链结构域CH1被所述抗体的轻链结构域CL替代。
本文中所述的一个方面是多特异性抗体，其包括
a)特异性结合第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体，和
b)特异性结合一个至四个其它抗原(即，第二和/或第三和/或第四和/或第五抗原，优选特异性结合一个其它抗原，即第二抗原)的、一个，两个，三个或四个单链Fab片段，
其中所述b)的单链Fab片段通过肽衔接物在所述全长抗体的重链或轻链的C-或N-端与所述a)的全长抗体融合，
其中第一抗原或其它抗原之一是人转铁蛋白受体。
在一个实施方案中，一个或两个结合第二抗原的相同单链Fab片段通过肽衔接物在所述全长抗体的重或轻链的C-端与所述全长抗体融合。
在一个实施方案中，一个或两个结合第二抗原的相同单链Fab片段通过肽衔接物在所述全长抗体的重链的C-端与所述全长抗体融合。
在一个实施方案中，一个或两个结合第二抗原的相同单链Fab片段通过肽衔接物在所述全长抗体的轻链的C-端与所述全长抗体融合。
在一个实施方案中，两个结合第二抗原的相同单链Fab片段通过肽衔接物在所述全长抗体的每条重链或轻链的C-端与所述全长抗体融合。
在一个实施方案中，两个结合第二抗原的相同单链Fab片段通过肽衔接物在所述全长抗体的每条重链的C-端与所述全长抗体融合。
在一个实施方案中，两个结合第二抗原的相同单链Fab片段通过肽衔接物在所述全长抗体的每条轻链的C-端与所述全长抗体融合。
本文中所述的一个方面是三价、双特异性抗体，其包括
a)特异性结合第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体，
b)第一多肽，由以下组成
ba)抗体重链可变结构域(VH)
或
bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，
其中所述第一多肽用其VH结构域的N-端通过肽衔接物与所述全长抗体的两条重链之一的C-端融合，
c)第二多肽，由以下组成
ca)抗体轻链可变结构域(VL)
或
cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)
其中所述第二多肽用其VL结构域的N-端通过肽衔接物与所述全长抗体的两条重链的另一条的C-端融合，
且
其中第一多肽的抗体重链可变结构域(VH)和第二多肽的抗体轻链可变结构域(VL)一起形成特异性结合第二抗原的抗原结合位点，
且
其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。
在一个实施方案中，通过在以下位置之间引入二硫键，使得b)的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和c)的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过链间二硫桥连接和稳定：
i)重链可变结构域位置44至轻链可变结构域位置100，或
ii)重链可变结构域位置105至轻链可变结构域位置43，或
iii)重链可变结构域位置101至轻链可变结构域位置100(总是根据Kabat EU索引编号)。
引入非天然的二硫桥用于稳定的技术描述于例如WO 94/029350，Rajagopal,V.等，Prot.Eng.(1997)1453-59；Kobayashi,H.等，Nuclear Medicine&Biology,Vol.25,(1998)387-393；或Schmidt,M.等，Oncogene(1999)18 1711-1721中。在一个实施方案中，b)和c)的多肽的可变结构域之间的任选二硫键在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，b)和c)的多肽的可变结构域之间的任选二硫键在重链可变结构域位置105和轻链可变结构域位置43之间(编号总是根据Kabat EU索引)。在一个实施方案中，优选在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间不具有所述任选二硫化物稳定的三价、双特异性抗体。
本文中所述的一个方面是三特异性或四特异性抗体，其包括
a)特异性结合第一抗原的全长抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性结合第二抗原的全长抗体的第二(修饰)轻链和第二(修饰)重链，其中可变结构域VL和VH彼此替代，和/或其中恒定结构域CL和CH1彼此替代，和
c)其中特异性结合一个或两个其它抗原(即，结合第三和/或第四抗原)的一个至四个抗原结合肽通过肽衔接物与a)和/或b)的轻链或重链的C-或N-末端融合，
其中第一抗原或第二抗原或其它抗原之一是人转铁蛋白受体。
a)的抗体不含b)所述的修饰，且a)的重链和轻链是分离的链。
在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)下包括特异性结合一个或两个其它抗原的一个或两个抗原结合肽。
在一个实施方案中，抗原结合肽选自scFv片段和scFab片段。
在一个实施方案中，抗原结合肽是scFv片段。
在一个实施方案中，抗原结合肽是scFab片段。
在一个实施方案中，抗原结合肽与a)和/或b)的重链的C-端融合。
在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)下包括特异性结合一个其它抗原的一个或两个抗原结合肽。
在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)下包括特异性结合第三抗原的两个相同的抗原结合肽。在一个优选的实施方案中，这两个相同的抗原结合肽通过相同的肽衔接物与a)和b)的重链的C-端融合。在一个优选的实施方案中，这两个相同的抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。
在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)下包括特异性结合第三和第四抗原的两个抗原结合肽。在一个实施方案中，所述两个抗原结合肽通过相同的肽衔接物与a)和b)的重链的C-端融合。在一个实施方案中，所述两个抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。
本文中所述的一个方面是双特异性、四价抗体，其包括
a)特异性地结合第一抗原的抗体的两条轻链和两条重链(并且包括两个Fab片段)，
b)特异性地结合第二抗原的另外两个抗体Fab片段，其中所述另外的Fab片段通过肽衔接物与a)的重链的C-或N-端融合，
且
其中在Fab片段中，进行以下修饰
i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，和/或恒定结构域CL和CH1彼此替代，
或
ii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，且恒定结构域CL和CH1彼此替代，
且
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，或恒定结构域CL和CH1彼此替代，
或
iii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，或恒定结构域CL和CH1彼此替代，
且
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，且恒定结构域CL和CH1彼此替代，
或
iv)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，且在
b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替代，
或
v)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替代，且
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，
其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。
在一个实施方案中，所述另外的Fab片段通过肽衔接物与a)的重链的C-端，或与a)的重链的N-端融合。
在一个实施方案中，所述另外的Fab片段通过肽衔接物与a)的重链的C-端融合。
在一个实施方案中，所述另外的Fab片段通过肽衔接物与a)的重链的N-端融合。
在一个实施方案中，在Fab片段中，进行以下修饰：
i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，
和/或
恒定结构域CL和CH1彼此替代。
在一个实施方案中，在Fab片段中，进行以下修饰：
i)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，
和/或
恒定结构域CL和CH1彼此替代。
在一个实施方案中，在Fab片段中，进行以下修饰：
i)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替代。
在一个实施方案中，在Fab片段中，进行以下修饰：
i)在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，
和/或
恒定结构域CL和CH1彼此替代。
在一个实施方案中，在Fab片段中，进行以下修饰：
i)在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替代。
本文中所述的一个方面是双特异性、四价抗体，其包括：
a)第一抗体的(修饰)重链，其特异性地结合第一抗原并且包括第一VH-CH1结构域对，其中所述第一抗体的第二VH-CH1结构域对的N端通过肽衔接物与所述重链的C-端融合，
b)a)的所述第一抗体的两条轻链，
c)第二抗体的(修饰)重链，其特异性地结合第二抗原并且包括第一VH-CL结构域对，其中所述第二抗体的第二VH-CL结构域对的N端通过肽衔接物与所述重链的C-端融合，和
d)c)的所述第二抗体的两条(修饰)轻链，每条包含CL-CH1结构域对，
其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。
本文中所述的一个方面是双特异性抗体，其包括
a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链，和
b)特异性结合第二抗原的第二全长抗体的重链和轻链，其中重链的N-端通过肽衔接物连接轻链的C-端，
其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。
a)的抗体不含b)所述的修饰，并且重链和轻链是分离的链。
本文中所述的一个方面是双特异性抗体，其包括
a)特异性地结合第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体，和
b)特异性地结合第二抗原的Fv片段，其包括VH2结构域和VL2结构域，其中两个结构域通过二硫桥彼此连接，
其中只有VH2结构域或VL2结构域通过肽衔接物与特异性地结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链融合，
其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。
在双特异性中，a)的重链和轻链是分离的链。
在一个实施方案中，VH2结构域或VL2结构域中的另一个不通过肽衔接物与特异性地结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链融合。
在本文中所述的所有方面中，第一轻链包括VL结构域和CL结构域，而第一重链包括VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在所有方面的一个实施方案中，本文中所述的抗体是多特异性抗体，其需要至少两条重链多肽的异二聚化，并且其中抗体特异性地结合人转铁蛋白受体和第二非人转铁蛋白受体抗原。
为了支持异二聚化而用于CH3修饰的几种方法已经描述于例如WO 96/27011，WO98/050431，EP 1870459，WO 2007/110205，WO 2007/147901，WO 2009/089004，WO 2010/129304，WO 2011/90754，WO 2011/143545，WO 2012/058768，WO 2013/157954，WO 2013/096291中，将其引用包括在本文中。典型地，在本领域已知的方法中，以互补的方式，将第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域进行工程化，使得包括一个工程化CH3结构域的重链不再能与相同结构的另一重链发生同二聚化(例如，CH3工程化的第一重链不再与另一CH3工程化的第一重链同二聚化；和CH3工程化的第二重链不再与另一CH3工程化的第二重链同二聚化)。由此迫使包括一个工程化CH3结构域的重链与包括以互补方式工程化的CH3结构域的另一重链异二聚化。对于本发明的该实施方案，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域以互补方式通过氨基酸置换进行工程化，从而迫使第一重链和第二重链异二聚化，而第一重链和第二重链不再能发生同二聚化(例如，出于空间原因)。
考虑以上引用和包括的本领域已知的用于支持重链异二聚化的不同方法，作为不同替换方案用于根据本发明的多特异性抗体，其中所述抗体包括源自特异性地结合第一抗原的第一抗体的“非交叉Fab区”(non-crossed Fab region)、和源自特异性地结合第二抗原的第二抗体的“交叉Fab区”(crossed Fab region)，结合以上针对本发明描述的特定氨基酸置换。
本文中所述的多特异性抗体的CH3结构域可以通过“杵进臼”技术来改变，所述技术详细描述于例如，WO 96/027011，Ridgway,J.B.等，Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant,A.M.等，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681的几个实例中。在这种方法中，两个CH3结构域的相互作用表面被改变，以提高含有这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域的每一个都可以是“杵”，而另一个是“臼”。二硫桥的引入可以进一步稳定该异二聚体(Merchant,A.M.等，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并提高产量。
在一个优选的实施方案中，本文中所述的多特异性抗体在“杵链”的CH3结构域中包括T366W突变，在“臼链”的CH3结构域中包括T366S、L368A、Y407V突变(编号根据Kabat EU索引)。还可以使用在CH3结构域之间的另外链间二硫桥(Merchant,A.M.等，NatureBiotech.16(1998)677-681)，例如，通过将Y349C突变引入“杵链”的CH3结构域中，并将E356C突变或S354C突变引入“臼链”的CH3结构域中。因此，在另一个优选的实施方案中，本文中所述的多特异性抗体在两个CH3结构域之一中包括Y349C和T366W突变，而在两个CH3结构域的另一个中包括E356C、T366S、L368A和Y407V突变，或本文中所述的多特异性抗体在两个CH3结构域之一中包括Y349C和T366W突变，而在两个CH3结构域的另一个中包括S354C、T366S、L368A和Y407V突变(一个CH3结构域中的该额外Y349C突变和另一个CH3结构域中的该额外E356C或S354C突变形成链间二硫桥)(编号根据Kabat EU索引)。
备选地或额外地，可以使用描述于EP 187459A1中的其他杵进臼技术。在一个实施方案中，本文中所述的多特异性抗体在“杵链”的CH3结构域中包括R409D和E370K突变，而在“臼链”的CH3结构域中包括D399K和E357K突变(编号根据Kabat EU索引)。
在一个实施方案中，本文中所述的多特异性抗体在“杵链”的CH3结构域中包括T366W突变，而在“臼链”的CH3结构域中包括T366S、L368A和Y407V突变，且额外地“杵链”的CH3结构域中还包括R409D和K370E突变，“臼链”的CH3结构域中还包括D399K和E357K突变(编号根据Kabat EU索引)。
在一个实施方案中，本文中所述的多特异性抗体在两个CH3结构域之一中包括Y349C和T366W突变，而在两个CH3结构域的另一个中包括S354C、T366S、L368A和Y407V突变，或本文中所述的多特异性抗体在两个CH3结构域之一中包括Y349C和T366W突变，而在两个CH3结构域的另一个中包括S354C、T366S、L368A和Y407V突变，且额外地“杵链”的CH3结构域中还包括R409D和K370E突变，“臼链”的CH3结构域中还包括D399K和E357K突变(编号根据Kabat EU索引)。
除了“杵进臼技术”，用于修饰多特异性抗体重链的CH3结构域以迫使异二聚化的其他技术是本领域已知的。这些技术，尤其是描述于WO 96/27011，WO 98/050431，EP1870459，WO 2007/110205，WO 2007/147901，WO 2009/089004，WO 2010/129304，WO 2011/90754，WO 2011/143545，WO 2012/058768，WO 2013/157954和WO 2013/096291中的那些，在本文中被考虑作为“杵进臼技术”的替换方案，与本文中所述的多特异性抗体组合。
在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将EP 1870459中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。这种方法基于：在第一和第二重链两者之间的CH3/CH3结构域界面中的特定位置引入具有相反电荷的带电荷氨基酸。
因此，该实施方案涉及本文中所述的多特异性抗体，其中在抗体的三级结构中第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域形成界面，该界面位于相应抗体CH3结构域之间，其中第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域各自的氨基酸序列分别包含一组在所述抗体三级结构中位于所述界面中的氨基酸，其中，来自位于一条重链的CH3结构域界面中的该组氨基酸的第一氨基酸被带正电荷的氨基酸置换，而来自位于另一条重链的CH3结构域界面中的该组氨基酸的第二氨基酸被带负电荷的氨基酸置换。根据该实施方案的多特异性抗体在本文中也被称为“CH3(+/-)工程化多特异性抗体”(其中缩写“+/-”表示在相应CH3结构域中引入的带相反电荷的氨基酸)。
在本文所述的CH3(+/-)工程化多特异性抗体的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K、R和H，而带负电荷的氨基酸选自E或D。
在本文所述的CH3(+/-)工程化多特异性抗体的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K和R，而带负电荷的氨基酸选自E或D。
在本文所述的CH3(+/-)工程化多特异性抗体的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸是K，而带负电荷的氨基酸是E。
在本文所述的CH3(+/-)工程化多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中位置409的氨基酸R被D置换，且位置的氨基酸K被E置换，而在另一条重链的CH3结构域中位置399的氨基酸D被K置换，且位置357的氨基酸E被K置换(编号根据Kabat EU索引)。
在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将WO2013/157953中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文所述的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中位置366的氨基酸T被K置换，而在另一条重链的CH3结构域中位置351的氨基酸L被D置换(编号根据Kabat EU索引)。在本文所述的多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被K置换且位置351的氨基酸L被K置换，而在另一条重链的CH3结构域中位置351的氨基酸L被D置换(编号根据Kabat EU索引)。
在本文所述的多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中位置366的氨基酸T被K置换且位置351的氨基酸L被K置换，而在另一条重链的CH3结构域中位置351的氨基酸L被D置换(编号根据Kabat EU索引)。另外，至少一个以下置换包含在另一条重链的CH3结构域中：位置349的氨基酸Y被E置换，位置349的氨基酸Y被D置换和位置368的氨基酸L被E置换(编号根据Kabat EU索引)。在一个实施方案中，位置368的氨基酸L被E置换(编号根据Kabat EU索引)。
在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将WO2012/058768中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文所述的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L被Y置换和位置407的氨基酸Y被A置换，而在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被A置换和位置409的氨基酸K被F置换(编号根据Kabat EU索引)。在另一个实施方案中，除了上述置换，在另一条重链的CH3结构域中，位置411(最初为T)，399(最初为D)，400(最初为S)，405(最初为F)，390(最初为N)和392(最初为K)的氨基酸中的至少一个被置换(编号根据Kabat EU索引)。优选的置换为：
-位置411的氨基酸T被选自N、R、Q、K、D、E和W的氨基酸置换(编号根据Kabat EU索引)，
-位置399的氨基酸D被选自R、W、Y和K的氨基酸置换(编号根据Kabat EU索引)，
-位置400的氨基酸S被选自E、D、R和K的氨基酸置换(编号根据Kabat EU索引)，
-位置405的氨基酸F被选自I、M、T、S、V和W的氨基酸置换(编号根据Kabat EU索引)，
-位置390的氨基酸N被选自R、K和D的氨基酸置换(编号根据Kabat EU索引)，和
-位置392的氨基酸K被选自V、M、R、L、F和E的氨基酸置换(编号根据Kabat EU索引)。
在本文所述的多特异性抗体的另一个实施方案中(根据WO2012/058768工程化的)，在一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L被Y置换和位置407的氨基酸Y被A置换，而在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被V置换和位置409的氨基酸K被F置换(编号根据Kabat EU索引)。在本文所述的多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y被A置换，而在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被A置换和位置409的氨基酸K被F置换(编号根据Kabat EU索引)。在上述最后一个实施方案中，在所述另一条重链的CH3结构域中，位置392的氨基酸K被E置换，位置411的氨基酸T被E置换，位置399的氨基酸D被R置换和位置400的氨基酸S被R置换(编号根据Kabat EU索引)。
在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将WO 20111/143545中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文所述的多特异性抗体的一个实施方案中，两条重链的CH3结构域中的氨基酸置换在位置368和/或409引入(编号根据Kabat EU索引)。
在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将WO 2011/090762中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。WO 2011/090762涉及根据“杵进臼”技术的氨基酸修饰。在本文所述的CH3(KiH)-工程化多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被W置换，而在另一条重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y被A置换(编号根据Kabat EU索引)。在本文所述的CH3(KiH)-工程化多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被Y置换，而在另一条重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y被T置换(编号根据Kabat EU索引)。
在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，其是IgG2同种型，将WO 2011/090762中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。
在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将WO 2009/089004中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文所述的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置392的氨基酸K或N被带负电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，被E或D，在一个优选的实施方案中，被D)置换，而在另一条重链的CH3结构域中，位置399的氨基酸D、位置356的氨基酸E或D、或位置357的氨基酸E被带正电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，K或R，在一个优选的实施方案中，K，在一个优选的实施方案中，位置399或356的氨基酸被K置换)置换(编号根据Kabat EU索引)。在一个进一步的实施方案中，除了上述置换，在一条重链的CH3结构域中，位置409的氨基酸K或R被带负电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，被E或D，在一个优选的实施方案中，被D)置换(编号根据Kabat EU索引)。在一个更进一步的实施方案中，除了上述置换额外地、或作为上述置换的替代，在一条重链的CH3结构域中，位置439的氨基酸K和/或位置370的氨基酸K彼此独立地被带负电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，被E或D，在一个优选的实施方案中，被D)置换(编号根据Kabat EU索引)。
在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将WO 2007/147901中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文所述的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置253的氨基酸K被E置换，位置282的氨基酸D被K置换和位置322的氨基酸K被D置换，而在另一条重链的CH3结构域中，位置239的氨基酸D被K置换，位置240的氨基酸E被K置换和位置292的氨基酸K被D置换(编号根据KabatEU索引)。
在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将WO 2007/110205中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。
在本文的所有方面和实施方案的一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。在本发明的一个优选实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。
在本文的所有方面的一个实施方案中，抗体是二价抗体或三价抗体。在一个实施方案中，抗体是二价抗体。
在本文的所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构。在本文中所述的所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG1亚类、或具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG2亚类的。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG3亚类的。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG4亚类，或具有另外的突变S228P的人IgG4亚类。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG1亚类或人IgG4亚类的。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变L234A和L235A突变的人IgG1亚类的(编号根据Kabat EU索引)。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变L234A、L235A和P329G突变的人IgG1亚类的(编号根据Kabat EU索引)。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变S228P和L235E突变的人IgG4亚类的(编号根据Kabat EU索引)。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变S228P、L235E和P239G突变的人IgG4亚类的(编号根据Kabat EU索引)。
在本文所有方面的一个实施方案中，本文中所述包含包括CH3结构域的重链的抗体，包括额外的C-端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，编号根据Kabat EU索引)。在本文所有方面的一个实施方案中，本文所述的包含包括CH3结构域的重链的抗体，包括额外的C-端甘氨酸残基(G446，编号根据Kabat EU索引)。
6.抗体变体
在特定实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望提高抗体的结合亲和力和/或其他生物性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过将合适修饰引入编码抗体的核苷酸序列内，或通过肽合成，进行制备。此类修饰包括例如在抗体的氨基酸序列内的残基的缺失、和/或***和/或置换。可以进行缺失、***和置换的任何组合以获得最终构建体，只要最终构建体具有所需特征，例如抗原结合即可。
a)置换、***和缺失变体
在特定实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVR和FR。保守置换显示于表1中标题“保守性置换”下。更实质性的变化在表1中标题“示例性置换”下提供，并且在下文参考氨基酸侧链种类进一步描述。可以将氨基酸置换引入目的抗体内且就所需活性，例如保留/提高的抗原结合、减少的免疫原性或提高的ADCC或CDC，筛选产物。
表1
原始残基 示例性置换 保守性置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以根据共同侧链性质进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换需要这些类型之一的成员交换为另一类型的成员。
一类置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个超变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在特定生物性质(例如增加的亲和力、减少的免疫原性)上具有修饰(例如改善)，和/或基本上保留了亲本抗体的特定生物性质。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文描述的，方便地生成。简而言之，使一个或多个HVR残基突变，并且将变体抗体展示在噬菌体上且筛选特定生物活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中作出改变(例如置换)，例如以改善抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点”(即，由在体细胞成熟过程中高频率经历突变的密码子编码的残基)(参见，例如Chowdhury,P.S.，Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)，和/或接触抗原的残基中作出，测试所得到的变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库且从中再选择而进行的亲和力成熟，例如描述于Hoogenboom,H.R.等，Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中。在亲和力成熟的一些实施方案中，可以通过多种方法中的任一种(例如易错PCR、链改组、或寡核苷酸定向诱变)，将多样性引入选择用于成熟的可变基因内。随后制备二级文库。随后筛选文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向的方法，其中几个HVR残基(例如一次4-6个残基)被随机化。可以具体地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别地，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在特定实施方案中，置换、***或缺失可以在一个或多个HVR内发生，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文提供的保守性置换)。此类改变可以例如在HVR中抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的特定实施方案中，每个HVR可以是未改变的，或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
用于鉴定可以作为诱变靶标的抗体残基或区域的一个有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如通过Cunningham,B.C.和Wells,J.A.，Science 244(1989)1081-1085描述的。在此方法中，鉴定一个残基或一组靶标残基(例如荷电残基例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并且替换为中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)，以确定抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对该最初置换显示出功能性敏感的氨基酸位置上引入进一步的置换。可替代地或另外地，可以利用抗原-抗体复合物的晶体结构，鉴定在抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可以作为用于置换的候选物被靶向或消除。可以筛选变体，以确定它们是否含有所需性质。
氨基酸序列***包括氨基和/或羧基末端融合(长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽)，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他***变体包括抗体的N或C末端与酶(例如对于ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽的融合。
b)糖基化变体
在特定实施方案中，改变本文提供的抗体，以提高或降低抗体糖基化的程度。对抗体添加或缺失糖基化位点，可以通过改变氨基酸序列从而形成或去除一个或多个糖基化位点而方便地完成。
当抗体包含Fc区时，可以改变与之连接的碳水化合物。通过哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分支的、二天线寡糖，其一般通过N键连接Fc区的CH2结构域的Asn297(参见，例如，Wright,A和Morrison,S.L.，TIBTECH 15(1997)26-32)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接至二天线寡糖结构的“茎”中的GlcNAc上的岩藻糖。在一些实施方案中，可以在本文提供的抗体中进行寡糖的修饰，以便产生具有特定改良性质的抗体变体。
在一些实施方案中，提供具有缺乏(直接或间接)连接至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％、或20％至40％。可以按照例如WO 2008/077546中所述的，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，相对于连接至Asn 297的所有糖结构(例如复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算在Asn297位的糖链中的岩藻糖的平均量，以确定岩藻糖的量。Asn297指位于Fc区的大约位置297上的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可以位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸处，即位置294和300之间。此类岩藻糖基化变体可以具有提高的ADCC功能。参见，例如，US 2003/0157108；US 2004/0093621。与“去岩藻糖化的”或“岩藻糖缺陷的”抗体变体有关的出版物实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A。等，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等Biotech.Bioeng.87(2004)614。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系实例包括具有蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.等，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；和WO 2004/056312 A1，尤其是实施例11)，和敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohunki,N.等，Biotech.Bioeng.87(2004)614-612；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.，94(2006)680-688和WO2003/085107)。
进一步提供了具有平分型寡糖(bisected oligosaccharide)的抗体变体，例如其中与抗体的Fc区附着的二天线寡糖通过GlcNAc平分。此类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或提高的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878；US 6,602,684；和US 2005/0123546中。还提供了在与Fc区附着的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有提高的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764。
c)Fc-区变体
在特定实施方案中，一个或多个氨基酸修饰可以引入本文提供的抗体的Fc区内，从而生成Fc区变体。Fc区变体可以包括包含在一个或多个氨基酸位置上的氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在特定实施方案中，本发明考虑具有一些但并非所有效应物功能的抗体变体，这使得其成为用于如下应用的期望候选物，在所述应用中抗体在体内的半衰期是重要的，而一些效应物功能(例如补体和ADCC)是不需要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以证实CDC和/或ADCC活性的降低/耗竭。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定试验，以确保抗体缺乏FcγR结合(从而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞即NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在造血细胞上的FcR表达概括在Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定试验的非限制性实例描述于US5,500,362中(参见，例如Hellstrom,I.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502；US 5,821,337(参见Bruggemann,M.等，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。可替代地，可以采用非放射性测定试验方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定试验(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)；和CytoTox
Figure BDA0002255938790000721
非放射性细胞毒性测定试验(Promega，Madison，WI)。可以用于此类测定试验的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，目的分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在动物模型中，例如公开于Clynes,R.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95(1988)652-656中的。还可以进行C1q结合测定试验，以证实抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见，例如，WO2006/029879和WO 2005/100402中C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定试验(参见，例如，Gazzano-Santoro,H.等，J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等，Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie，Blood 103(2004)2738-2743)。FcRn结合和体内清除率/半衰期确定还可以使用本领域已知的方法进行(参见，例如，Petkova,S.B.等，Int’l.Immunol.18(2006)1759-1769)。
具有降低的效应物功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的置换的那些(US 6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个上具有置换的Fc突变体，包括具有残基265和297的丙氨酸置换的所谓“DANA”Fc突变体(US 7,332,581)。
描述了具有提高或降低的FcRs结合的特定抗体变体。(参见，例如，US 6,737,056；WO 2004/056312和Shields,R.L.等，J.Biol.Chem.276(2011)6591-6604)。
在特定实施方案中，抗体变体包含具有提高ADCC的一个或多个氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334上的置换(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，在Fc区中作出改变，以导致改变的(例如提高或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如US 6,194,551，WO 99/51642，和Idusogie,E.E.等,J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述的。
在US2005/0014934A1中描述了具有增加的半衰期和提高的新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体，所述新生儿Fc受体负责母源IgGs至胎儿的转移(Guyer,R.L.等，J.Immunol.117(1976)587和Kim,J.K.等，J.Immunol.24(1994)249)。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，所述一个或多个置换改善Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在如下Fc区残基的一个或多个上具有置换的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的置换(US 7,371,826)。.
关于Fc区变体的其他实例，还参见Duncan,A.R.&Winter,G.，Nature 322(1988)738-40；US 5,648,260；US 5,624,821；和WO 94/29351。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在特定实施方案中，可能期望制备半胱氨酸工程化抗体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或多个残基由半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，被置换的残基位于抗体的可接近位点上。通过用半胱氨酸置换这些残基，从而将反应性巯基基团置于抗体的可接近位点上，这些巯基基团可以用于使抗体缀合至其他部分例如药物部分或衔接物-药物部分，以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在特定实施方案中，下述残基中的任何一个或多个可以由半胱氨酸残基置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以如例如US 7,521,541中所述的，产生半胱氨酸工程化抗体。
e)抗体衍生物
在特定实施方案中，本文提供的抗体可以进一步被修饰，以含有本领域已知的且可容易获得的另外非蛋白质性部分。适于衍生抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二
Figure BDA0002255938790000741
烷、聚-1,3,6-三
Figure BDA0002255938790000742
烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、前丙二醇(propropylene glycol)同聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛，由于其在水中的稳定性，可以在制造中具有优点。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支或未分支的。连接至抗体的聚合物数目可以改变，并且如果连接超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同分子。通常，用衍生的聚合物的数目和/或类型可以基于如下考虑进行确定，所述考虑包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能，抗体衍生物是否用于在限定条件下的治疗中等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射线而被选择性加热的非蛋白质性部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性部分是碳纳米管(Kam,N.W.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以是任何波长，并且包括但不限于，不伤害普通细胞，但可以将非蛋白质性部分加热至能杀死抗体-非蛋白质性部分附近的细胞的温度的波长。
B.重组方法和组合物
抗体可以使用重组方法和组合物进行生产，例如如US 4,816,567中所述的。在一个实施方案中，提供了编码本文中所述的抗转铁蛋白受体抗体的分离核酸。此核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻和/或重链)。在进一步的实施方案中，提供了包含此核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在进一步的实施方案中，提供了包含此核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如已经用以下载体转化)：(1)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列和含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗转铁蛋白受体抗体的方法，其中所述方法包括在适于抗体表达的条件下培养如上文提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，且任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。
对于抗转铁蛋白受体抗体的重组生产，分离编码抗体的核酸，例如如上所述的，并且***一个或多个载体内用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。此核酸可以使用常规程序(例如通过使用能够与编码抗体重和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。
用于抗体编码载体的克隆或表达的合适宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，特别是当不需要糖基化和Fc效应物功能时，抗体可以在细菌中生产。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如US 5,648,237，US 5,789,199，和US 5,840,523。(还参见Charlton,K.A.，Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编辑)，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，pp.245-254，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以在可溶级分中从细菌细胞糊分离且可以进一步纯化。
除了原核生物外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是用于抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，这导致具有部分或全人糖基化模式的抗体生产。参见Gerngross，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等，Nat.Biotech(2006)24:210-215。
用于糖基化抗体表达的合适宿主细胞也可以源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了众多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞结合使用，特别用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见，例如，US 5,959,177，US 6,040,498，US6,420,548，US 7,125,978和US 6,417,429(描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，悬浮生长适应化的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如293或例如Graham,F.L.等，J.Gen Virol.36(1997)59中所述的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(如例如Mather,J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-251中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；Buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠***肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather,J.P.等，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。对于适合于抗体生产的一些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki,P.和Wu,A.M.，Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo.B.K.C.(编辑)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)pp.255-268。
C.测定试验
可以通过本领域已知的各种测定试验，针对其物理/化学特性和/或生物活性，鉴定、筛选或表征本文中提供的抗转铁蛋白受体抗体。
1.结合测定试验
在一个方面中，可以就其抗原结合活性，例如通过已知方法，如ELISA、αLISA、蛋白质印迹、抗体或反相阵列等，测试本发明的抗体。
在示例性ELISA或αLISA测定中，溶液(细胞上清液、细胞或组织裂解液、体液等)中的转铁蛋白受体结合捕获抗体(所述捕获抗体特异性地结合转铁蛋白受体上的第一表位或特定构象的转铁蛋白受体)以及与检测实体偶联的检测抗体(所述检测实体特异性地结合转铁蛋白的第二表位或构象)。基于检测实体(化学发光、荧光、能量转移诱发的发光等)获得读出。
在抗体阵列的情况中，将抗体点在玻璃或硝基纤维素芯片上。用含有转铁蛋白受体的溶液阻断并孵育载玻片，洗涤以除去未结合的抗体，并用荧光标记的相应的二抗检测结合的抗体。通过荧光载玻片扫描仪测量荧光信号。相似地，对于反相阵列，将重组转铁蛋白受体、细胞上清液、细胞或组织裂解液、体液等，点在玻璃或硝基纤维素芯片上。将载玻片阻断并用对抗转铁蛋白受体上的特异性表位的抗体孵育单独的阵列。洗掉未结合的抗体，并用荧光标记的相应二抗检测结合的抗体。荧光信号通过荧光载玻片扫描仪来测量(Dernick,G.等，J.Lipid Res.，52(2011)2323-2331)。
D.用于诊断和检测的方法和组合物
在特定的实施方案中，将本文中提供的任一种抗转铁蛋白受体抗体用于检测生物样品中人转铁蛋白受体的存在。本文中使用的术语“检测”包括定量或定性检测。在特定实施方案中，生物样品包括细胞或组织，如脑组织。
在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法中的抗转铁蛋白受体抗体。在进一步的方面中，提供了检测生物样品中转铁蛋白受体存在的方法。在特定实施方案中，该方法包括将生物样品在允许抗转铁蛋白受体抗体与转铁蛋白受体结合的条件下接触本文中所述的抗转铁蛋白受体抗体，并且检测抗转铁蛋白受体抗体和转铁蛋白受体之间是否形成了复合物。这样的方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，将抗转铁蛋白受体抗体用于选择适宜使用抗转铁蛋白受体抗体治疗的受试者，例如，当转铁蛋白受体是用于患者选择的生物标志物时。
可以使用本发明的抗体诊断的示例性病症包括具有1型脑内铁沉积性神经变性(neurodegeneration with brain iron accumulation type 1,NBIA1)、单纯性自主神经衰竭(pure autonomic failure)、唐氏综合征(Down’s syndrome)、关岛复合征(complexof Guam)和严重的路易体病(several Lewy body disorders)，如弥漫性路易体病(diffuse Lewy body disease(DLBD))、阿尔茨海默氏病路易体变异型(Lewy bodyvariant of Alzheimer’s disease(LBVAD))、高歇氏病(Gaucher’s disease)的特定形式和帕金森病痴呆(Parkinson’s Disease dementia(PDD))。
在特定实施方案中，提供了标记的抗转铁蛋白受体抗体。标记包括，但不限于，可以直接检测的标记或部分(例如荧光、生色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及可以间接(例如通过酶促反应或分子相互作用)检测的部分，如酶或配体。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团，如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹磺酰，伞形酮，萤光素酶，如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US 4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶，杂环氧化酶，如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与采用过氧化氢以氧化染料前体的酶偶联，如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定自由基等。
E.药物制剂
可以制备如本文所述的抗转铁蛋白受体抗体的药物制剂，例如通过使具有所需纯度的抗体与一种或多种任选的药学可接受的载体(Remington’s PharmaceuticalScience，第16版，Osol，A.(编辑)(1980))混合，以冻干制剂或水溶液的形式制备。药学可接受的载体在采用的剂量和浓度下对接受者一般是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。示例性药学可接受的载体在本文中进一步包括间质(insterstitial)药物分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0002255938790000791
Baxter International，Inc.)。US 2005/0260186和US 2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP及其使用方法，包括rhuPH20。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的葡糖胺聚糖酶(如软骨素酶)组合。
示例性冻干抗体制剂描述于US 6,267,958。水性抗体制剂包括US 6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后面的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的制剂还可以针对所治疗的特定适应症按照需要含有一种以上的活性成分，优选具有互补活性且不会不利地彼此影响的那些。此类活性成分适于以对于预期目的有效的量组合存在。
活性成分可以截留在例如通过凝聚技术(coacervation)或通过界面聚合制备的微囊中(例如分别地羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)、在胶体药物递送***(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒和纳米囊)中，或在粗乳液中。此类技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A(编辑)(1980)。
可以制备持续释放的制剂。持续释放的制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质可以为成形物品例如薄膜或微胶囊的形式。
待用于体内施用的制剂一般是无菌的。无菌性可以通过例如经由无菌过滤膜过滤而容易地达到。
III.制造品
在本发明另一方面，提供含有可以用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制造品。制造品可以包含容器和在容器上或与容器结合的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料形成。容器容纳组合物(单独地或与对于治疗、预防和/或诊断所述状况有效的另外组合物组合的方式)，且可以具有无菌进入口(例如容器可以是具有可被皮下注射针穿透的塞子的静脉溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装说明书指示组合物用于治疗所选择的状况。此外，制造品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其它的细胞毒性剂或另外的治疗剂。在本发明的该实施方案中，制造品可以进一步包含指示组合物可以用于治疗特定状况的包装说明书。可替代地或另外地，制造品可以进一步包括包含药学可接受的缓冲液的第二(或第三)容器，所述药学可接受的缓冲液例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户观点来看希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
应当理解，任何上述制成品可以，作为抗转铁蛋白受体抗体的替代，或在抗转铁蛋白受体抗体之外额外地，包括本发明的免疫缀合物。
实施例
以下是本发明方法和组合物的实例。应当理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施多种其他实施方案。
材料和方法
重组DNA技术
按照Sambrook，J.等，Molecular cloning:A laboratory manual(分子克隆：实验室手册)；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989中所述的，使用标准方法操纵DNA。分子生物试剂根据制造商的说明使用。
基因和寡核苷酸合成
在Geneart GmbH(Regensburg，德国)，通过化学合成制备了所需的基因片段。将合成的基因片段克隆至大肠杆菌质粒中，用于繁殖/扩增。通过DNA测序验证了亚克隆的基因片段的DNA序列。或者，经由PCR或通过退火化学合成的寡核苷酸，装配短的合成DNA片段。通过metabion GmbH(Planegg-Martinsried，德国)制得了相应的寡核苷酸。
试剂
如果没有另外指出，按照制造商的实验方案，使用所有商业化学品、抗体和试剂盒。
实施例1
兔和小鼠的免疫
小鼠的免疫
通过经皮施用100μg载体DNA，接着电穿孔(1000V/cm的2个矩形脉冲(squarepulses)，持续时间0.1ms，间隔0.125s；接着287.5V/cm的4个矩形脉冲，持续时间10ms，间隔0.125s)，使用编码全长人或猕猴TfR的质粒表达载体，遗传免疫NMRI小鼠。小鼠在第0、14、28、42、56、70和84天，接受了6或7次连续免疫。第四和第六次免疫使用编码猕猴TfR的载体进行；编码人TfR的载体用于所有其他免疫。在第36、78和92天采血，并制得血清，将其用于通过ELISA的滴定测定(参见下文)。选择具有最高滴定的动物，在第96天进行加强：静脉内注射106个人TF-1细胞或50μg缺乏螺旋结构域的重组人可溶性TfR(在Leu122开始并在Asn608结束的人TfR胞外结构域，作为与人Fc-区的N-端融合物在HEK239F细胞中表达，并且通过蛋白A亲和性色谱和大小排阻色谱纯化)，并且通过杂交瘤技术，基于其结合稳定转染的CHO-K1细胞表面表达的人和猕猴转铁蛋白受体的能力，分离单克隆抗体(参见实施例4)。
兔的免疫
通过经皮施用400μg载体DNA，接着电穿孔(750V/cm的5个矩形脉冲，持续时间10ms，间隔1s)，使用编码全长人或猕猴TfR的质粒表达载体，对新西兰白兔或表达人源化抗体库的转基因兔，实施了遗传免疫。兔子在第0、14、28、56、84和112天，接受6次连续免疫。第四和第六次免疫使用编码猕猴TfR的载体进行；编码人TfR的载体用于所有其他免疫。在第35、63、91和119天采血(估算的总血液体积的10％)。制得血清，将其用于通过ELISA的滴定测定(参见下文)，并且分离外周单个核细胞，将其用作B细胞克隆过程中抗原特异性B细胞的来源(参见实施例2)。
血清滴度的测定(ELISA)
将人重组可溶性TfR(R&D Systems Cat.No.2474-TR)在PBS中以3μg/mL，100μL/孔固定于96-孔NUNC Maxisorb板上，接着：用PBS中的2％CroteinC阻断平板，200μL/孔；施加PBS中0.5％CroteinC中的抗血清连续稀释物，一式两份，100μL/孔；用以下进行检测：(1)HRP缀合的山羊抗小鼠抗体(Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071；1/16 000)，用于所有小鼠血清，(2)HRP缀合的驴抗兔IgG抗体(Jackson Immunoresearch/Dianova711-036-152；1/16 000)，用于所有兔血清，(3)兔抗人IgG抗体(Pierce/ThermoScientific 31423；1/5000)，只用于来自转基因兔的血清，(4)生物素化山羊抗人κ抗体(Southern Biotech/Biozol 2063-08，1/5 000)和链霉亲和素-HRP，只用于来自转基因兔的血清；在PBS中0.5％CroteinC中稀释，100μL/孔。对于所有步骤，平板在37℃孵育1h。在所有步骤之间，用PBS中的0.05％Tween 20洗涤平板3次。通过添加BM Blue POD Substratesoluble(Roche)，100μL/孔，来产生信号；并且通过添加1M HCl，100μL/孔来停止。相对作为参照的690nm，在450nm读出吸光度。滴度定义为导致半最大信号的抗血清稀释度。
实施例2
来自兔的B-细胞克隆
兔外周血单个核细胞(PBMC)的分离
总共获取了6只动物(2只野生型(wt)兔和4只转基因(tg)兔)的血样。这些兔子源自2轮不同的免疫：第一轮免疫使用2只wt和2只tg兔子，而第二轮免疫使用2只tg兔子(还参见实施例“兔的免疫”)。用1×PBS(PAA，Pasching，奥地利)将含有EDTA的全血稀释两倍，接着根据制造商的说明，使用哺乳动物淋巴细胞分离液(lympholyte mammal)(CedarlaneLaboratories，Burlington，Ontario，加拿大)进行密度离心。用1×PBS将PBMC洗涤两次。
EL-4B5培养基
补充了10％FCS(Hyclone，Logan，UT，USA)，2mM谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素溶液(PAA，Pasching，奥地利)，2mM丙酮酸钠，10mM HEPES(PAN Biotech，Aidenbach，德国)和0.05mMβ-巯基乙醇(Gibco，Paisley，苏格兰)的RPMI 1640(Pan Biotech，Aidenbach，德国)。
细胞的耗竭
第一轮免疫：通过非特异性粘附以及非特异性结合淋巴细胞，使用包被了汇合单层CHO细胞的无菌6-孔板(细胞培养级)，耗竭巨噬细胞/单核细胞。
第二轮免疫：省略了使用覆盖了CHO细胞的孔的耗竭步骤，因为我们不能排除产生与仓鼠转铁蛋白受体抗体交叉反应的抗体的那些B-细胞被耗竭。因此，使用空白无菌6-孔板(细胞培养级)，通过非特异性粘附来耗竭巨噬细胞和单核细胞，使得产生仓鼠交叉反应性(和可能地小鼠交叉反应性)表面抗体的潜在B-淋巴细胞可以到达工作流的下一个步骤。
对于每轮免疫：每个孔最大装4mL培养基和高达6×106个来自免疫兔子的PBMC，并允许其在温箱中在37℃结合1h。将上清液中的细胞(外周血淋巴细胞(PBL))用于抗原淘选步骤。
在人转铁蛋白受体上富集B-细胞
向覆盖了单层人转铁蛋白受体阳性CHO细胞的6-孔组织培养板，接种高达6×106个PBL/4mL培养基，并使其在温箱中在37℃结合1h。通过用1×PBS小心洗涤孔1-2次，除去未粘附的细胞。通过胰蛋白酶在温箱中37℃处理10min，使剩余粘着的细胞脱壁。用EL-4B5培养基停止胰蛋白酶作用。将细胞保持在冰上，直至免疫荧光染色。
免疫荧光染色和流式细胞术
将抗-IgG FITC(AbD Serotec，Düsseldorf，德国)用于单细胞分选。对于表面染色，用PBS中的抗-IgG FITC抗体孵育来自耗竭和富集步骤的细胞，并在4℃在黑暗中孵育45min。染色后，用冰冷PBS将PBMC洗涤两次。最后，将PBMC重悬浮于冰冷PBS中并立即接受FACS分析。在FACS分析之前，加入5μg/mL浓度的碘化丙啶(BD Pharmingen，San Diego，CA，USA)，以区分死细胞和活细胞。
将配备有计算机和FACSDiva软件(BD Biosciences，USA)的Becton DickinsonFACSAria用于单细胞分选。
B-细胞培养
通过与Zubler等(1985)所述相似的方法，准备兔B-细胞的培养。简而言之，将分选的单个兔B-细胞，在含有200μL/孔EL-4B5培养基的96-孔板中，在培养箱中在5％CO2气氛中在37℃孵育7天，其中所述培养基含有Pansorbin Cell(1:100000)(Calbiochem(Merck)，Darmstadt，德国)，5％兔胸腺细胞上清液(charge TSN-M13(10242)，MicroCoat，Bernried，德国)和γ-辐射的鼠EL-4-B5胸腺瘤细胞(2.5×104/孔)。收集B细胞培养的上清液用于筛选，并且立即收集剩余的细胞并在100μL RLT缓冲液(Qiagen，Hilden，德国)中冷冻在-80℃。
实施例3
噬菌体展示用于单价抗-TfR IgG的选择和生产
通过噬菌体展示进行选择
使用标准实验方案(Silacci等，Proteomics，5(2005)2340-2350)，通过噬菌体展示，产生结合人和猕猴TfR的抗体。将hTfR ECD与携带C-端Avi-标签(SEQ ID NO:99)的人臼Fc-区的N-端铰链连接，并连接入哺乳动物表达载体，以克隆编码hTfR-Fc(KiH)-Avi(KiH＝杵进臼，Avi＝AviTag)抗原的合成基因。我们的所有哺乳动物表达载体都携带MPSV启动子用于转录和翻译的启动，其中转录通过位于该ORF下游的合成polyA信号序列来终止。此外，载体含有EBV oriP序列用于在EBV-ENBA表达细胞系中的自主复制。测序验证了正确的ORF。通过与空的杵-Fc-区和BirA蛋白共表达，该载体用于在HEK293 EBNA悬浮细胞中表达，将1mM生物素加入培养基中。通过蛋白A亲和色谱，接着通过大小排阻色谱，纯化所得到的生物素化蛋白。分别产生cyTfR-Fc(KiH)-Avi抗原(SEQ ID NO:100)。
所用的文库是使用VH1，3，4，5家族以及V-κ1，-2和-3和V-λ3的人构架的完全合成的文库。随机化的氨基酸在CDR-H3和CDR-L3中。使用每条重链VH与所有不同的轻链文库一起，产生了文库集合。根据以下程序，在溶液中进行了选择：1.每个文库大约1012个噬菌粒在1mL的总体积中与100nM生物素化TfR-avi-his结合0.5h，2.通过加入5.4×107个链霉亲和素-包被的磁珠10min，捕获生物素化的TfR-avi-his和特异性结合的噬菌体颗粒，3.使用5-10×1mL PBS/Tween 20和5-10×1mL PBS洗涤珠子，4.通过加入1mL 100mM TEA(三乙胺)10min，洗脱噬菌体颗粒，并通过加入500μL 1M Tris/HCl pH7.4中和，和5.重新感染指数生长的大肠杆菌TG1细菌，用辅助噬菌体VCSM13感染，随后PEG/NaCl沉淀噬菌粒，以用于随后的选择轮中。使用恒定的或递减(从10-7M至2×10-9M)抗原浓度，将选择进行3-5轮。在第2轮中，使用中性亲和素(neutravidin)板替代链霉亲和素珠子，进行抗原/噬菌体复合物的捕获。因为相对重组可溶性抗原产生的结合剂常常在细胞上只显示出弱结合，故我们在第二轮或第三轮在重组抗原上的富集后，引入了使用展示天然抗原的细胞的另外两个选择步骤。在此，使用了两个细胞系TF-1和NCI-H460(都获自ATCC)。简而言之，用大约1012个噬菌体颗粒在冰上孵育1*106个细胞1h，以避免受体介导的内化。使用PBST缓冲液(含有1％Tween-20的PBS)通过5-10个离心步骤进行洗涤。将完整细胞用于感染TG1细菌，用于噬菌体拯救。
如下通过ELISA鉴定特异结合剂：将100μL 10nM生物素化TfR-avi-his/孔包被在中性亲和素板上。加入含有Fab的细菌上清液，并且通过使用抗-FLAG/HRP二抗，通过其FLAG-标签来检测结合性Fab。以96-孔格式，将ELISA-阳性克隆通过细菌表达为可溶性Fab片段，并且使用ProteOnXPR36(BioRad)，通过SPR分析，对上清液进行动力学筛选实验。鉴定了表达具有最高亲和力常数的Fab的克隆，将相应的噬菌粒测序。
Fab抗体的纯化
用所有细胞ELISA阳性克隆的噬菌粒质粒，单独转染Top10细胞。将细胞生长于培养基中并且诱导Fab抗体的产生。通过周质制备来分离Fab抗体，并使用IMAC纯化。
FACS分析
将纯化的Fab抗体以各种浓度施用于TF-1细胞。使用荧光标记的抗-Fab抗体检测结合Fab抗体的细胞，并通过FACS测量。计算EC50值。
所选克隆的产生和表征
转化成IgG形式
选择了具有6至20分钟的复合半衰期(t1/2)或10nM至500nM的细胞上EC50、具有在FACS或细胞ELISA上的独特细胞结合信号、以及相对hTfR-Fc(KiH)-Avi和cyTfR-Fc(KiH)-Avi抗原的交叉反应性结合的所选克隆，将其转化成IgG形式。
因此，通过PCR扩增VL结构域并克隆至如上所述的哺乳动物表达载体中，直接在CL结构域的上游。此外，通过PCR扩增VH结构域并且直接克隆在CH-Fc结构域的上游。测定了两个表达载体的序列。
IgG抗体的产生
用编码LC和HC的两个质粒转染HEK293 EBNA悬浮细胞并培养7天。通过无菌过滤澄清上清液。通过蛋白A色谱测定IgG浓度。
使用TagLite技术测定EC50
将包括跨膜结构域的hTfR或cyTfR的ECD的基因，在SNAP-标签的下游连接至哺乳动物表达载体中。将这个载体用于转染HEK293 EBNA悬浮细胞，导致具有C-端SNAP标签融合的TfR的展示(SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:102)。用SNAP-Lumi4Tb(Cisbio)特异性地标记SNAP标签。通过测量615nm处的铽的发射，测定了标记效率。将标记的细胞储存于-80℃。
在抗人Fc-d2 IgG抗体的存在下，用各种稀释度的IgG上清液孵育标记的细胞并且在4小时后测量FRET信号(供体染料Lumi4Tb的发射：615nm，而受体染料d2：665nm)。计算EC50值，获得25个结合hTfR和cyTfR两者的IgG。
通过FACS测定细胞结合
将全长TfR或cyTfR的基因分别克隆至哺乳动物表达载体中。将这个载体用于CHOEBNA悬浮细胞的转染。将IgG上清液直接用于TfR展示细胞。用PBST洗涤后，使用抗-huFcIgG-HRP抗体缀合物，接着用3,3’-5,5’-四甲基联苯胺显色，来检测抗原-抗体复合物。使用商业上可购得的抗-TfR抗体来验证功能性展示。所有25个TagLite阳性克隆都呈现了强烈的结合信号。
单价IgG样分子的产生和纯化
将VH结构域克隆至编码人杵IgG1 HC的哺乳动物表达载体中，所述人杵IgG1 HC携带L234A、L235A和P329G突变。将这个载体用于在HEK293 EBNA悬浮细胞中的表达，共同表达LC(上述载体)和携带L234A、L235A、P329G、H435R和Y436F突变的空臼-Fc结构域。通过蛋白A亲和性色谱纯化所得到的蛋白质。在通过分析性大小排阻色谱测定单体蛋白>95％的情况中，通过大小排阻色谱进一步纯化蛋白质。
实施例4
通过细胞ELISA鉴定人和猕猴TfR-结合抗体
为了就识别人和猕猴TfR的抗体筛选兔B-细胞或小鼠杂交瘤上清液，利用了使用稳定转染的CHO-K1细胞的细胞ELISA。通过用表达质粒转染CHO-K1细胞获得了稳定的转染体，所述表达质粒含有用于人或猕猴TfR以及用于新霉素-磷酸转移酶的表达盒。转染后，将细胞在含有500μg/mL G418(Life Technologies)的生长培养基中稀释。生长克隆出现后，分离细胞，用MEM-75(Abcam)或13E4(Life Technologies)以及PE标记的二抗用于人或猕猴TfR的染色，并且将高荧光细胞分选为单细胞至96-孔平板孔中(FACS Aria)。7天生长后，再次检查克隆的TfR表达，并选择最佳表达克隆用于细胞ELISA实验。
简而言之，向384-孔板的每个孔接种15,000个细胞，并且在37℃，5％CO2下孵育18h。使用自动化洗涤器(BIOTEK)除去上清液，并将30μL含有抗体的上清液加入每个孔中，接着加入24μL生长培养基。2小时孵育后，排空孔并在RT下加入30μL PBS中的0.05％戊二醛45min。用PBS/0.025％Tween20(PBST)洗涤3次，加入阻断缓冲液中1:5000稀释的30μL抗-兔-HRP或抗-小鼠-HRP(Southern Biotech)并将平板在RT下孵育1小时。用PBST洗涤孔6次并使用30μL TMB/孔产生了信号，并且在450nm下测量吸光度。
实施例5
抗-TfR抗体的克隆和表达
重组DNA技术
按照Sambrook,J等，Molecular cloning:A Laboratory manual(分子克隆：实验室手册)；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，使用标准方法来操纵DNA。根据制造商的说明使用分子生物试剂。
基因和寡核苷酸合成
通过在Geneart GmbH(Regensburg，德国)化学合成制备了所需的基因区段。将合成的基因片段克隆至用于繁殖/扩增的大肠杆菌质粒中。通过DNA测序验证了亚克隆的基因片段的DNA序列。或者，通过使化学合成的寡核苷酸退火或经由PCR来装配短的DNA片段。通过metabion GmbH(Planegg-Martinsried，德国)制备了相应的寡核苷酸。
V-结构域的PCR扩增
根据制造商的实验方案，使用NucleoSpin 8/96RNA试剂盒(Macherey&Nagel；740709.4，740698)，从B-细胞裂解物制得了总RNA。用60μL无RNAse水稀释RNA。根据制造商的说明，使用Superscript III第一链合成SuperMix(Invitrogen 18080-400)和寡-dT-引物，通过逆转录酶反应，使用6μL RNA来产生cDNA。所有步骤在Hamilton ML Star***上进行。使用引物rbHC.up和rbHC.do用于重链，rbLC.up和rbLC.do用于野生型兔B细胞的轻链，以及BcPCR_FHLC_leader.fw和BcPCR_huCkappa.rev用于转基因兔B-细胞的轻链(参见下表)，在50μL最终体积中使用AccuPrime SuperMix(Invitrogen 12344-040)和4μL cDNA来扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH和VL)。所有正向引物是(VH或VL的)信号肽特异性的，而反向引物是(VH或VL的)恒定区特异性的。用于RbVH+RbVL的PCR条件如下：94℃热启动5min；94℃20sec，70℃20sec，68℃45sec，35个循环，以及在68℃最终延伸7min。用于HuVL的PCR条件如下：94℃热启动5min；94℃20sec，52℃20sec，68℃45sec，40个循环，以及在68℃最终延伸7min。
Figure BDA0002255938790000911
将50μL PCR溶液中的8μL加载于2％的48E-凝胶(Invitrogen G8008-02)上。根据制造商的实验方案，使用NucleoSpin Extract II试剂盒(Macherey&Nagel；740609250)，清洁阳性PCR反应，并在50μL洗脱缓冲液中洗脱。所有清洁步骤在Hamilton ML Starlet***上进行。
兔单克隆二价抗体的重组表达
为了兔单克隆二价抗体的重组表达，通过突出端克隆方法(RS Haun等，BioTechniques(1992)13，515-518；MZ Li等，Nature Methods(2007)4，251-256)，将编码VH或VL的PCR产物作为cDNA克隆至表达载体中。表达载体含有由包括内含子A的5’CMV启动子和3’BGH多腺苷酸化序列组成的表达盒。除了表达盒，质粒含有pUC18-衍生的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，用于在大肠杆菌中扩增质粒。使用了基础质粒的三个变体：一个质粒含有设计来接受VH区的兔IgG恒定区，另外两个质粒含有兔或人κLC恒定区以接受VL区。
使用重叠引物，通过PCR扩增了编码κ或γ恒定区和VL/VH***片段的线性化表达质粒。
用T4 DNA-聚合酶孵育纯化的PCR产物，产生单链突出端。通过添加dCTP停止反应。
在下一个步骤中，将质粒和***片段混合并且与recA孵育，其诱导位点特异性重组。将重组的质粒转化至大肠杆菌中。第二天，挑选生长的集落，并且通过质粒制备、限制性分析和DNA-测序，检查了正确的重组质粒。
对于抗体表达，将分离的HC和LC质粒瞬时共转染至HEK293细胞中并且在1周后收获上清液。
用于兔单克隆单价抗体表达的载体的产生
为了将选择的候选物重组表达为单克隆单价抗体，将所有VH链的兔恒定区转化成在CH3区段中包括杵突变的人恒定区。对于源自兔野生型B-细胞的VL链，将兔Cκ恒定区转化成人的。将4μL选定的候选物的cDNA在50μL最终体积中用于扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区，其中使用AccuPrime SuperMix(Invitrogen 12344-040)，使用信号肽特异性的正向引物、和CDR3-J区特异性的反向引物(其具有(在3’端)与(VH或VL的)人恒定区同源的重叠序列(20bp))。用于VH和VL链扩增的PCR条件如下：94℃热启动5min；94℃20sec，68℃20sec，68℃45sec，35个循环，并且在68℃最终延伸7min。
通过突出端克隆方法(RS Haun等，BioTechniques(1992)13，515-518；MZ Li等，Nature Methods(2007)4，251-256)，将编码VH或VL的PCR产物作为cDNA克隆至表达载体中。表达载体含有由包括内含子A的5’CMV启动子和3’BGH多腺苷酸化序列组成的表达盒。除了表达盒，质粒含有pUC18-衍生的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，用于在大肠杆菌中质粒扩增。使用了基础质粒的两个变体：一个质粒含有设计来接受新扩增的VH链的人IgG恒定区，第二质粒含有人κLC恒定区以接受VL链。
使用重叠引物，通过PCR扩增了编码κ或γ恒定区和VL/VH***片段的线性化表达质粒。
用T4 DNA-聚合酶孵育纯化的PCR产物，产生单链突出端。通过添加dCTP停止反应。
在下一个步骤中，将质粒和***片段混合并且与recA孵育，其诱导位点特异性重组。将重组的质粒转化至大肠杆菌中。第二天，挑选生长的集落，并且通过质粒制备、限制性分析和DNA-测序，检查了正确的重组质粒。
实施例6
单价抗-TfR抗体的瞬时表达
在F17培养基(Invitrogen Corp.)中培养的瞬时转染的HEK293细胞(人胚肾细胞系293衍生的)中，体内产生抗体。对于转染，使用“293-Free”转染试剂(Novagen)。从各单独的表达质粒表达如上所述的抗体和基于抗体的修饰分子。按照制造商说明书中说明，进行转染。在转染后三至七天，收集含有重组蛋白的细胞培养物上清液。将上清液储存在降低的温度下(例如，-80℃)，直至纯化。
关于例如HEK293细胞中的人免疫球蛋白的重组表达的一般信息在：Meissner，P.等，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中给出。
实施例7
单臂转铁蛋白受体抗体的高通量纯化
将96深孔平板中的50mL含有单臂抗体的澄清上清液加载于200μL MabSelectSuRe柱上。用pH 7.4的PBS洗涤步骤后，使用Tecan/Atoll-***，用2.5mM HCl洗脱蛋白质，获得0.5mL洗脱液。通过2M pH8的Tris中和洗脱液。使用Nanodrop分光光度计定量纯化的蛋白质并在变性和还原条件通过CE-SDS以及分析性SEC进行分析。为了获得具有高纯度(>95％)的蛋白质，大量抗体必须在大小排阻色谱上进一步纯化，以与半抗体、杵-杵抗体和较大聚集物分离。在下文中，使用Dionex UltiMate 3000，将500μL样品在含有140mM NaCl pH6.0的20mM组氨酸中注射至Superdex200 10/300GL上。此方法允许分级分离25-30个样品/天，并且因此可以以单臂模式整理(polishing)大量筛选命中物。将级分合并并再次按照上述进行分析。
实施例8
用于转胞吞试验的hCMEC/D3细胞培养物
用于hCMEC/D3(Weksler,B.B.等，FASEB J.19(2005),1872-1874)的培养基和补充剂获自Lonza。将hCMEC/D3细胞(传代26-29次)在胶原蛋白包被的盖玻片上(显微镜检查)或烧瓶中，在含有2.5％FBS，四分之一提供的生长因子和完全补充了提供的氢化可的松、庆大霉素和抗坏血酸的EBM2培养基中，培养至汇合。
对于所有转胞吞试验，在12-孔细胞培养平板中使用了高密度孔(1×108孔/cm2)PET膜滤器***物(0.4μm，12mm直径)。对于顶端和基底外侧室，计算的最佳培养基体积分别为400μL和1600μL。滤器***物的顶端室用大鼠尾胶原蛋白I(7.5μg/cm2)，接着用纤连蛋白(5μg/mL)包被，每次孵育在RT下持续1小时。将hCMEC/D3细胞在EMB2培养基中生长10-12天至汇合单层(大约2×105细胞/cm2)。
实施例9
单价抗体的转胞吞试验
整个试验在无血清EBM2培养基中进行(否则按照实施例1中所述的重构)。用单价抗体(浓度：2.67μg/mL)在顶端与具有细胞的滤器***物在37℃孵育1小时，此后收集整个顶端和基底外侧培养基。从这些值，计算细胞旁侧流(paracellular flux)。将单层在RT在无血清培养基中在顶端(400μL)和基底外侧(1600μL)各自洗涤3×3-5min。搜集所有洗涤液以监控未结合抗体的除去效率。将预先温热的培养基加入顶端室中并且将滤器转移至含有1600μL预先温热的培养基的新12孔板中(用含有1％BSA的PBS阻断过夜)。在这点上，将滤器上的细胞在500μL RIPA缓冲液中裂解，以测定特异性抗体吸收。将剩余的滤器在37℃孵育并在不同的时间点收集样品，以测定抗体的顶端和/或基底外侧释放。使用高灵敏度IgGELISA定量样品中的抗体量(参见实施例3)。对于每个时间点，从三个滤器细胞培养物产生数据。
实施例10
转胞吞试验后灵敏的IgG ELISA
整个程序在RT下进行，使用自动化洗涤器用于洗涤步骤。384-孔平板用30μL/孔的PBS中的1μg/mL抗人/鼠-IgG(Fcγ特异性的)包被2小时，接着在含有1％BSA或1％CroteinC的阻断缓冲液PBS中孵育1小时(分别用于人和鼠IgG试验)。将来自转胞吞试验的连续稀释的样品和转胞吞试验中使用的标准浓度的抗体加入平板中并孵育2小时。四次洗涤后，加入30μL/孔的阻断缓冲液中的50ng/mL抗人/鼠-F(ab)2-生物素，并再孵育2小时。6次洗涤后，加入30μL/孔的50ng/mL(huIgG试验)或100ng/mL(mIgG试验)poly-HRP40-链霉亲和素(Fitzgerald；在含有1％BSA和0.05％Tween-20的PBS中)，并孵育30min。4次洗涤后，通过加入30μL/孔的BM化学发光底物(Roche)来检测免疫复合物。使用发光平板阅读器来测量发光信号，并且使用拟合的标准曲线来计算浓度。试验的灵敏度范围为10pg/mL至10ng/mL。
实施例11
通过用hTfR突变体转染的CHO细胞的细胞ELISA进行表位作图为了能够确定人转铁蛋白受体(hTfR)上的表位区，遵循如下依据，在表面暴露的氨基酸簇在比对的小鼠TfR序列中具有不同氨基酸的位置(参见下表)，将突变引入hTfR序列中：尽管人和鼠TfR之间显著的同源性(77％同一性)，但已知没有针对胞外部分的抗体在两个直系同源物之间显示出良好交叉反应性。以上描述了具有相应突变的质粒的克隆。为了作图人TfR结合剂与表位的结合，用所述的质粒瞬时转染CHO-K1细胞，并且在细胞ELISA中测量抗体结合。简而言之，在实验前一天，将104个细胞接种于96-孔板每孔的正常生长培养基(RPMI/10％FCS)中。另一天，将培养基换成OPTI-MEM血清减少培养基(Gibco)，并在30分钟预孵育后，将1200μL OPTI-MEM，12μg质粒DNA和12μL XtremeGENE转染试剂(Roche)的混合物的10μL加入孔中。将细胞在37℃/7.5％CO2下孵育2天，然后除去培养基并加入在生长培养基中1nM至100nM浓度的TfR抗体，接着在4℃孵育2h。此后，以PBS中的0.05％戊二醛替代抗体溶液，并且将细胞在RT下固定15min，然后用PBS洗涤两次，并用HRP-缀合的抗-人-Fc二抗(BioRad；ELISA阻断试剂(Roche)中1:2000)在RT下孵育1.5小时。用PBS洗涤3次后，使用50μL TMB/孔产生信号，并在450nm测量吸光度。
Figure BDA0002255938790000961
实施例12
用于人TfR抗体相互作用的基于表面等离子体共振的结合试验
在配备有C1传感器芯片(GE Healthcare，目录编号BR1005-35)的BIAcore B 4000(GE Healthcare)上进行结合实验，其中根据供应商的手册，使用标准胺偶联化学程序，预先用抗人Fab抗体(GE Healthcare，目录编号28-9583-25)处理所述芯片。
对于动力学测量，在25℃，在pH7.4，0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水中，使用60秒的接触时间和10μL/min的流速，固定样品抗体。以递增浓度施加重组His6-标签的人转铁蛋白受体(R&D systems，目录编号2474-TR-050)，并且随着时间监控信号。记录30μL/min流速下150秒结合时间和600秒解离时间的平均时间跨度。使用1:1结合模型(Langmuirisotherm)来拟合数据。
因此，提供了以下本发明的一些实施方案：
1.血脑屏障穿梭模块，其包含
跨血脑屏障运输至脑的分子和
一个抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段，
其中该抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段包含：
(a)SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)SEQ ID NO:113的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)SEQ ID NO:114的氨基酸序列的HVR-L2；
(f)SEQ ID NO:115的氨基酸序列的HVR-L3。
2.实施方案1的血脑屏障穿梭模块，其中血脑屏障穿梭模块还包含衔接物，其中所述衔接物将所述跨血脑屏障运输至脑的分子偶联至所述抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段上。
3.实施方案1的血脑屏障穿梭模块，其中抗血脑屏障受体抗体是单价抗体。
4.实施方案1的血脑屏障穿梭模块，其中抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段包括选自全长抗体、scFv、Fv、Fab、scFab和VHH的分子。
5.实施方案1至4之任一项的血脑屏障穿梭模块，其中血脑屏障受体是转铁蛋白受体。
6.实施方案1的血脑屏障穿梭模块，其中所述抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段特异性地结合人转铁蛋白受体和猕猴转铁蛋白受体。
7.实施方案3的血脑屏障穿梭模块，其中所述单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段包含一个针对人转铁蛋白受体的Fab或scFab。
8.实施方案7的血脑屏障穿梭模块，其中所述Fab或scFab特异性地结合包含在SEQID.NO:04、05或06的氨基酸序列内的转铁蛋白受体表位。
9.实施方案3的血脑屏障穿梭模块，其中所述单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段包含一个针对转铁蛋白受体的scFv。
10.实施方案7的血脑屏障穿梭模块，其中所述scFv特异性地结合包含在SEQID.NO:04、05或06的氨基酸序列内的转铁蛋白受体表位。
11.实施方案1的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子选自神经疾病药物、生长因子、酶和细胞毒性剂。
12.实施方案11的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子选自神经营养因子和针对脑靶标的肽。
13.实施方案12的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是针对脑靶标的抗体。
14.实施方案13的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是针对脑靶标的单克隆抗体。
15.实施方案11的血脑屏障穿梭模块，其中脑靶标选自β-分泌酶1、Aβ、表皮生长因子、表皮生长因子受体2、tau、载脂蛋白E4、α突触核蛋白、α突触核蛋白的寡聚片段、CD20、亨廷顿蛋白、朊病毒蛋白、富含亮氨酸重复的激酶2、帕金蛋白、早老蛋白2、γ分泌酶、死亡受体6、淀粉样蛋白前体蛋白、p75神经营养蛋白受体和胱天蛋白酶6。
16.实施方案11的血脑屏障穿梭模块，其中脑靶标是磷酸化的tau(pS422)。
17.实施方案1的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是多肽。
18.实施方案1的血脑屏障穿梭模块，其中所述抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段与所述跨血脑屏障运输至脑的分子的C-末端直接或通过衔接物缀合。
19.实施方案1的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子包括针对脑靶标的全长抗体。
20.实施方案19的血脑屏障穿梭模块，其中全长抗体是IgG。
21.实施方案1的血脑屏障穿梭模块，其中血脑屏障穿梭模块包含作为跨血脑屏障运输至脑的分子的针对脑靶标的全长IgG抗体、衔接物、和作为单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段的一个Fab或一个scFab，其中所述Fab或scFab通过衔接物与所述IgG抗体的重链之一的C-末端缀合。
22.实施方案21的血脑屏障穿梭模块，其中针对脑靶标的血脑屏障穿梭模块的抗体的第一重链包括第一二聚化模块，且针对脑靶标的血脑屏障穿梭模块的抗体的第二重链包括第二二聚化模块，从而允许两条重链的异二聚化。
23.实施方案22的血脑屏障穿梭模块，其中根据杵进臼策略，针对脑靶标的血脑屏障穿梭模块的抗体的第一重链的第一二聚化模块包含杵，且针对脑靶标的血脑屏障穿梭模块的抗体的第二重链的二聚化模块包含臼。
24.实施方案2或21的血脑屏障穿梭模块，其中衔接物是肽衔接物。
25.实施方案24的血脑屏障穿梭模块，其中肽衔接物具有至少25个氨基酸长度的氨基酸序列。
26.实施方案24或25的血脑屏障穿梭模块，其中肽衔接物具有30至50个氨基酸长度的氨基酸序列。
27.实施方案24的血脑屏障穿梭模块，其中肽衔接物是(G4S)6G2(SEQ ID NO:07)或(G4S)4(SEQ ID NO:08)。
28.实施方案1或实施方案22的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是多肽，前提条件是，跨血脑屏障运输至脑的该分子不是全长抗体。
29.实施方案3的血脑屏障穿梭模块，其中单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段包含CH2-CH3 Ig结构域和结合血脑屏障受体的一个Fab或一个scFab，其中所述Fab或scFab通过衔接物与CH2-CH3 Ig结构域的C-末端偶联。
30.实施方案29的血脑屏障穿梭模块，其中结合血脑屏障受体的scFab包含第二衔接物。
31.实施方案28的血脑屏障穿梭模块，其中血脑屏障穿梭模块包含跨血脑屏障运输至脑的分子、第一衔接物、CH2-CH3 Ig结构域、第二衔接物、和作为抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段的一个Fab或一个scFab，其中跨血脑屏障运输至脑的分子通过第一衔接物与CH2-CH3Ig结构域的N-末端缀合，且Fab或scFab通过第二衔接物与CH2-CH3Ig结构域的C-末端缀合。
32.实施方案29至31之任一项的血脑屏障穿梭模块，其中CH2-CH3 Ig结构域是人CH2-CH3 IgG1结构域。
33.核酸，其编码实施方案1至32之任一项的血脑屏障穿梭模块。
34.实施方案33的核酸，其中所述核酸是分离的核酸。
35.宿主细胞，其包含实施方案33或34的编码血脑屏障穿梭模块的核酸。
36.药物制剂，其包含实施方案1至32之任一项的血脑屏障穿梭模块。
37.实施方案1至32之任一项的血脑屏障穿梭模块在制备用于治疗神经疾病的药物中的用途。
38.实施方案1至32之任一项的血脑屏障穿梭模块在制备用于治疗阿尔茨海默氏病的药物中的用途。
39.实施方案1至32之任一项的血脑屏障穿梭模块在制备用于将跨血脑屏障运输至脑的分子运送穿过血脑屏障的用于治疗神经疾病的药物中的用途。
40.实施方案21的血脑屏障穿梭模块，其中所述血脑屏障穿梭模块的IgG抗体的重链在其C-末端与作为单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段的Fab缀合，其具有以下结构：
-IgG重链，
-将IgG重链的Fc区的C-末端与Fab的VL或VH结构域的N-末端缀合的衔接物，其中可变轻链结构域(VL)与IgG CH1重链恒定结构域缀合，或可变重链结构域(VH)与IgG CL轻链恒定结构域缀合。
41.实施方案21的血脑屏障穿梭模块，其中所述血脑屏障穿梭模块的IgG抗体的重链在其C-末端与作为单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段的scFab缀合，其具有以下结构：
-IgG重链，
-将IgG重链的Fc区的C-末端与scFab的VL结构域的N-末端缀合的衔接物，
-scFab的可变轻链结构域(VL)和C-κ轻链结构域，
-将scFab的C-κ轻链结构域的C-末端与scFab的VH结构域的N-末端缀合的衔接物，
-scFab抗体的可变重链结构域(VH)和IgG CH1重链结构域。
42.运送跨血脑屏障运输至脑的分子的融合多肽，其包含CH2-CH3 Ig结构域、衔接物和特异性结合血脑屏障受体的一个Fab或一个scFab，其中Fab或scFab通过衔接物与CH2-CH3 Ig结构域的C-末端缀合，
其中所述Fab或scFab包含：
(a)SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)SEQ ID NO:113的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)SEQ ID NO:114的氨基酸序列的HVR-L2；
(f)SEQ ID NO:115的氨基酸序列的HVR-L3。
43.运送跨血脑屏障运输至脑的分子的融合多肽，其包含CH2-CH3 Ig结构域、衔接物和特异性结合血脑屏障受体的一个scFv，其中scFv通过衔接物与CH2-CH3 Ig结构域的C-末端缀合，
其中所述scFv包含：
(a)SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)SEQ ID NO:113的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)SEQ ID NO:114的氨基酸序列的HVR-L2；
(f)SEQ ID NO:115的氨基酸序列的HVR-L3。
44.实施方案42或43的融合多肽，其还包含在CH2-CH3 Ig结构域的N-末端的衔接物，所述衔接物将跨血脑屏障运输至脑的分子缀合至CH2-CH3 Ig结构域的N-末端。
45.实施方案42或43的融合多肽，其中跨血脑屏障运输至脑的分子选自神经疾病药物、生长因子、酶、细胞毒性剂、选自scFv、Fv、Fab、scFab、Fab、VHH、F(ab’)2的针对脑靶标的抗体片段或肽。
46.实施方案42或43的融合多肽，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是神经营养因子。
47.实施方案42或43的融合多肽，其中特异性地结合血脑屏障受体的Fab或scFab或scFv特异性地结合人转铁蛋白受体。
48.实施方案42或43的融合多肽，其中Fab或scFab或scFv特异性地结合包含在SEQID NO:04、05或06的氨基酸序列内的转铁蛋白受体表位。
49.实施方案42或43的融合多肽，其中衔接物是肽衔接物。
50.实施方案49的融合多肽，其中肽衔接物具有至少15个氨基酸长度的氨基酸序列。
51.实施方案50的融合多肽，其中肽衔接物具有20至50个氨基酸长度。
52.实施方案49或50的融合多肽，其中肽衔接物具有氨基酸序列(G4S)6G2(SEQ IDNO:07)或(G4S)4(SEQ ID NO:08)。
53.实施方案42或43的融合多肽，其中CH2-CH3 Ig结构域是人CH2-CH3 IgG1结构域。
54.分离的核酸，其编码实施方案42至53之任一项的融合多肽。
55.宿主细胞，其包含实施方案54的编码融合多肽的核酸。
56.缀合物，其包含实施方案42至53之任一项的融合多肽和通过衔接物与所述融合多肽的CH2-CH3 Ig结构域的N-末端缀合的跨血脑屏障运输至脑的分子。
57.实施方案56的缀合物，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是神经营养因子，且将所述神经营养因子与CH2-CH3 Ig结构域的N-末端缀合的衔接物是肽衔接物。
58.药物制剂，其包含实施方案42至53任一项的缀合物和药物载体。
59.实施方案42至53任一项的融合多肽在制备用于神经退行性疾病治疗的药物中的用途。
60.实施方案59的用途，其中神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病。
61.实施方案3的血脑屏障穿梭模块，其中所述血脑屏障穿梭模块包含抗体作为跨血脑屏障运输至脑的分子，其中所述单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段直接或通过肽衔接物与所述抗体的轻链或重链的任一个末端缀合。
62.实施方案61的血脑屏障穿梭模块，其中单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段与所述跨血脑屏障运输至脑的抗体的重链的C-末端缀合。
63.实施方案61或62的血脑屏障穿梭模块，其中抗体重链的C-末端是完整的C-末端，结束于氨基酸残基PGK。
64.实施方案61或62的血脑屏障穿梭模块，其中重链的C-末端是缩短的C-末端，其中C-末端氨基酸残基的一个或两个已经被除去。
65.实施方案61或62的血脑屏障穿梭模块，其中重链的C-末端是缩短的C-末端，结束于氨基酸残基PG。
66.实施方案61的血脑屏障穿梭模块，其中单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段直接或通过肽衔接物与相应抗体链缀合。
67.实施方案66的血脑屏障穿梭模块，其中肽衔接物具有氨基酸序列GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:09)。
68.实施方案3或61的血脑屏障穿梭模块，其中单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段是抗体scFv或Fab或scFab片段。
69.实施方案3或61的血脑屏障穿梭模块，其中单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段是从N-至C-末端包含轻链可变结构域-轻链恒定结构域-肽衔接物-重链可变结构域-重链恒定结构域1的scFv。
70.实施方案3或61的血脑屏障穿梭模块，其中单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段是具有(G4S)6肽衔接物(SEQ ID NO:10)的抗人转铁蛋白受体抗体的scFv片段。
71.实施方案1或61的血脑屏障穿梭模块，其中血脑屏障受体是转铁蛋白受体，并且抗体不抑制转铁蛋白受体与转铁蛋白的结合。
72.实施方案1或61的血脑屏障穿梭模块，其中血脑屏障受体是人转铁蛋白受体。
73.实施方案2或61的血脑屏障穿梭模块，其中将抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段与跨血脑屏障运输至脑的分子缀合的肽衔接物是具有至少15个氨基酸长度的氨基酸序列。
74.实施方案2或61的血脑屏障穿梭模块，其中肽衔接物具有18至25个氨基酸的长度。
75.实施方案1或61的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是全长抗体。
76.实施方案1或61的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是人IgG1或IgG4亚类的全长抗体。
77.实施方案1或61的血脑屏障穿梭模块，其中抗血脑屏障受体抗体或其片段不损害血脑屏障受体与其天然配体中的一个或多个的结合。
78.实施方案76或77的血脑屏障穿梭模块，其中抗血脑屏障受体抗体以不抑制人转铁蛋白受体与人转铁蛋白结合的方式，特异性地结合人转铁蛋白受体。
79.实施方案1或61的血脑屏障穿梭模块，其中血脑屏障穿梭模块是效应物功能沉默的。
80.实施方案1或61的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是包括Fc-区的全长抗体，其中在Fc-区是人IgG1亚类的情况中，Fc-区包含根据Kabat的EU索引编号的突变L234A、L235A和P239G，或在Fc-区是人IgG4亚类的情况中，Fc-区包含根据Kabat的EU索引编号的突变S228P、L235E和P239G。
Figure BDA0002255938790001061
Figure BDA0002255938790001071
Figure BDA0002255938790001081
Figure BDA0002255938790001091
Figure BDA0002255938790001101
Figure BDA0002255938790001111
Figure BDA0002255938790001121
Figure BDA0002255938790001131
Figure BDA0002255938790001141
Figure BDA0002255938790001151
Figure BDA0002255938790001161
Figure BDA0002255938790001171
Figure BDA0002255938790001181
Figure BDA0002255938790001191
Figure BDA0002255938790001201
Figure BDA0002255938790001211
Figure BDA0002255938790001221
Figure BDA0002255938790001231
Figure BDA0002255938790001241
Figure BDA0002255938790001251
Figure BDA0002255938790001261
Figure BDA0002255938790001271
Figure BDA0002255938790001281
Figure BDA0002255938790001291
Figure BDA0002255938790001301
Figure BDA0002255938790001311
Figure BDA0002255938790001321
Figure BDA0002255938790001331
Figure BDA0002255938790001341
Figure BDA0002255938790001351
Figure BDA0002255938790001361
Figure BDA0002255938790001371
Figure BDA0002255938790001381
Figure BDA0002255938790001391
Figure BDA0002255938790001401
Figure BDA0002255938790001411
Figure BDA0002255938790001421
Figure BDA0002255938790001431
Figure BDA0002255938790001441
Figure BDA0002255938790001451
Figure BDA0002255938790001461
Figure BDA0002255938790001471
Figure BDA0002255938790001481
Figure BDA0002255938790001491
Figure BDA0002255938790001501
Figure BDA0002255938790001511
Figure BDA0002255938790001521
Figure BDA0002255938790001531
Figure BDA0002255938790001541
Figure BDA0002255938790001551
Figure BDA0002255938790001561
Figure BDA0002255938790001571
Figure BDA0002255938790001581
Figure BDA0002255938790001591
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司(F. Hoffmann-La Roche AG)
<120> 单价血脑屏障穿梭模块
<130> P31922
<150> PCT/CN2014/070183
<151> 2014-01-06
<160> 122
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Met Asn Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Pro Thr Ser His Tyr Val Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Val
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu
1 5 10 15
Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Arg Val Gln Val
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Tyr Asn Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体抗转铁蛋白受体抗体 8D3v具有带突变L104V 和 L106I的轻链可变结构域
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu
1 5 10 15
Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Arg Val Gln Val
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Tyr Asn Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位作图肽
<400> 4
Ile Gly Gln Asn Met Val Thr Ile Val Gln Ser Asn Gly Asn Leu
1 5 10 15
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位作图肽
<400> 5
Asn Met Val Thr Ile Val Gln Ser Asn Gly Asn Leu Asp Pro Val
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位作图肽
<400> 6
Gln Ser Asn Gly Asn Leu Asp Pro Val Glu Ser Pro Glu Gly Tyr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽衔接物
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽衔接物
<400> 8
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 9
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽衔接物
<400> 9
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 10
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽衔接物
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 11
<211> 137
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 11
Met Glu Trp Ser Trp Val Met Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val Arg Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Asn Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Pro Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 12
<211> 128
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 12
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Leu Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Ile Asp Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser
50 55 60
Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Met Glu Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg
100 105 110
Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Arg
115 120 125
<210> 13
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆0128 VH
<400> 13
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Tyr
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Pro Ser Gly Tyr Ala Tyr Tyr Thr Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Val
85 90 95
Gly Asp Gly Gly Gly Thr Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 128 VL
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0143 VH
<400> 15
Gly Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr
1 5 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu
20 25 30
Ser Thr Tyr Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Tyr Ile Gly Ile Ile Ser Ser Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Thr Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Asn Gly Gly Trp Lys Thr Pro Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Arg Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0143 VL
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ile Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 17
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0146 VH
<400> 17
Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
1 5 10 15
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
20 25 30
Phe Gly Asp Phe Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Ala Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
65 70 75 80
Asn Thr Leu Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Cys Asp Ala Ser Asn Asp Tyr Gly
100 105 110
Tyr Cys Lys Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 18
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0146 VL
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 19
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0279 VH
<400> 19
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Pro
65 70 75 80
Ser Pro Thr Met Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asp
85 90 95
Ala Glu Tyr Gly Asp Ala Asn Gly Phe Ala Ile Trp Gly Pro Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Leu
115
<210> 20
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0279 VL
<400> 20
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gly Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Leu Ser Thr Ile Asn
85 90 95
Ile Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 21
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0291 VH
<400> 21
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Gly Ala
20 25 30
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr
85 90 95
Gly Ala Asp Tyr Pro Asp Phe Gly Asp Ala Asn Gly Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0291 VL
<400> 22
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu Ser Thr Ile Asn
85 90 95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 23
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0299 VH
<400> 23
Gln Ser Met Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Tyr
85 90 95
Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Asn Gly Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0299 VL
<400> 24
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Cys Tyr Ser Ser Ser Asn
85 90 95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 25
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0300 VH
<400> 25
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Glu Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Tyr
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Phe Ile His Thr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Thr Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Cys Arg Tyr Leu
85 90 95
Val Ser Gly Gly Thr Ile Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0300 VL
<400> 26
Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val
1 5 10 15
Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Ala Ser Lys Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu
65 70 75 80
Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Cys Gly Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Tyr Gly Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 27
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 302 VH
<400> 27
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ala
20 25 30
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Ala Gly Thr Asp Ile Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Ser Ile
65 70 75 80
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Lys Val
85 90 95
Pro Tyr Thr Gly Val Ser Asp Tyr Leu Tyr Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0302 VL
<400> 28
Ala Phe Glu Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Gly Asn Val
85 90 95
Ile Leu Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 29
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0304 VH
<400> 29
Gln Ser Met Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Tyr
85 90 95
Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Asn Gly Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0304 VL
<400> 30
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Cys Tyr Ser Ser Ser Asn
85 90 95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 31
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0323 VH
<400> 31
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Pro Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala Asp
85 90 95
Thr Val Tyr Arg Asp Asp Tyr Gly Trp Ser Leu Trp Gly Pro Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0323 VL
<400> 32
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Tyr Ser Asn
85 90 95
Val Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0325 VH
<400> 33
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Asn
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Ser Asp Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asp
85 90 95
Ala Ala Ala Tyr Thr Thr Gly Thr Glu Phe Phe Ser Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0325 VL
<400> 34
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Val Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Ser Ser Asn
85 90 95
Leu Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Arg Arg
100 105 110
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0329 VH
<400> 35
Gly Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
20 25 30
Asn Ser Tyr Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Asn
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Tyr Asp Thr Thr Asp Asn Gly Phe Asn Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0329 VL
<400> 36
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Arg Tyr Met Asn
85 90 95
Val Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 37
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0339 VH
<400> 37
Gly Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr
1 5 10 15
Pro Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu
20 25 30
Ser Ser His Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Asp Leu Lys Ile Pro Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Ala Asp Glu Tyr Gly Asp Ala Asn Gly Phe Asn Ile
100 105 110
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Leu
115 120
<210> 38
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0339 VL
<400> 38
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gly Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu Ser Ser Ser Tyr
85 90 95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 39
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0343 VH
<400> 39
Gly Val Gln Cys Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
1 5 10 15
Thr Pro Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser
20 25 30
Leu Ser Ile Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Asp Trp Ile Gly Phe Ile Tyr Val Asp Ser Ser Ser Ala His Tyr
50 55 60
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr
65 70 75 80
Val Asp Leu Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Arg Asp Val Asp Ser Ser Tyr Phe Trp Gly Phe Asn Leu
100 105 110
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0343 VL
<400> 40
Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Gly Ala Val
1 5 10 15
Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu
65 70 75 80
Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser Ile Gly Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 41
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0346 VH
<400> 41
Gly Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr
1 5 10 15
Pro Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
20 25 30
Ser Ser Asn Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Gly Tyr Ser Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0346 VL
<400> 42
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Ile Asp Gly Gly Asn Arg
85 90 95
Gly Lys Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 43
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0348 VH
<400> 43
Gly Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr
1 5 10 15
Pro Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu
20 25 30
Asn Ser Val Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Ile Gly Ile Ile Tyr Ala Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Asp Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Val Arg Ser Ala Asp Tyr Asp Ser Gly Met Pro Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 44
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0348 VL
<400> 44
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Trp Asn Asn
20 25 30
Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu
65 70 75 80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Val Tyr Ser Asp
85 90 95
Asn Ile Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 45
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0349 VH
<400> 45
Gly Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr
1 5 10 15
Pro Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
20 25 30
Ser Ser Ser Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Tyr Ile Gly Phe Ile His Thr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Leu Val Gly Ser Gly Ala Val Ala Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 46
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0349 VL
<400> 46
Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val
1 5 10 15
Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu
65 70 75 80
Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Cys Gly Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Tyr Gly Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 47
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0350 VH
<400> 47
Gly Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr
1 5 10 15
Pro Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
20 25 30
Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Ser Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Ser Ala Gly Ser Gly Asp Ala Met Gly Phe Asn Leu Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 48
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0350 VL
<400> 48
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu Ser Val Ile His
85 90 95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 49
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0411 VH
<400> 49
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr
85 90 95
Gly Ala Gly Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Asn Gly Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0411 VL
<400> 50
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Ser Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Ile Ile Asn
85 90 95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
<210> 51
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0431 VH
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Ser Ser Tyr Ile Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0431 VL
<400> 52
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asp Tyr Gly Asp Gly
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 53
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0432 VH
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Ser Trp Trp Leu Ser Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0432 VL
<400> 54
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Met Thr Glu Ser Met Asn Tyr
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 55
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0433 VH
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Ser Thr Trp Phe Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0433 VL
<400> 56
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ile Asp Ser Ser Gly Asn His
85 90 95
Asp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 57
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0434 VH
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Pro Trp Tyr Ile Trp Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 58
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0434 VL
<400> 58
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Pro Asp Ser Ile Ala Tyr Gly
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 59
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0435 VH
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Tyr Phe Leu Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ile Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0435 VL
<400> 60
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Glu Asp Ser Glu Ser Asn Leu
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 61
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0441 VH
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Phe Gly Glu Trp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0441 VL
<400> 62
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ile Asp Ser Ala Leu Asp His
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 63
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0445 VH
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Trp Tyr Gly Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 64
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0445 VL
<400> 64
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Met Ser Leu Asn Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 65
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0447 VH
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Phe Tyr Gly Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 66
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0447 VL
<400> 66
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Thr Leu Ile Val
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 67
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0449 VH
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Thr Trp Gly Trp Val Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 68
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0449 VL
<400> 68
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Pro Asp Ser Ser Val Asn Tyr
85 90 95
Met Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 69
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0451 VH
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Tyr Tyr Tyr Leu Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 70
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0451 VL
<400> 70
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Ile Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ile Ile Gly Asp Ala
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 71
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0452 VH
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Trp Asp Tyr Leu Ser Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 72
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0452 VL
<400> 72
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ile Asp Ser Glu Gly Asn Asp
85 90 95
Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 73
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0453 VH
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Tyr Gly His Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0453 VL
<400> 74
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ile Asp Leu Ser Met Asp Ile
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 75
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0486 VH
<400> 75
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Glu Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Asp Pro Phe Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Asn Tyr Tyr Gly Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 76
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0486 VL
<400> 76
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Gln Ser Val Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Ile Thr His Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Phe Asn Arg Phe Tyr Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 77
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0487 VH
<400> 77
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Thr Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser Asp Phe Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 78
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0487 VL
<400> 78
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr
20 25 30
Ile Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser
85 90 95
Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg
100 105 110
Arg
<210> 79
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0488 VH
<400> 79
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Pro Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Lys Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Phe Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 80
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0488 VL
<400> 80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Thr Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Gly Gln Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Phe Cys His Gln Tyr Phe Tyr Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 81
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0489 VH
<400> 81
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Leu Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Thr Leu Asn Thr Ile Tyr Gly Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Ser Thr Val Ile Ser Tyr Trp His Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 82
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0489 VL
<400> 82
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ser Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 83
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0490 VH
<400> 83
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Thr Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser Asp Phe Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 84
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0490 VL
<400> 84
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr
20 25 30
Ile Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser
85 90 95
Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg
100 105 110
Arg
<210> 85
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0491 VH
<400> 85
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Thr Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Pro Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Lys Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Phe Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 86
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0491 VL
<400> 86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Thr Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Gly Gln Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Phe Cys His Gln Tyr Phe Tyr Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 87
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0492 VH
<400> 87
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Ala Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Gly Asn Phe Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 88
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0492 VL
<400> 88
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr
20 25 30
Gln Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser
85 90 95
Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg
<210> 89
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0493 VH
<400> 89
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Pro Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Lys Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Phe Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 90
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0493 VL
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Thr Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Gly Gln Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Phe Cys His Gln Tyr Phe Tyr Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 91
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0494 VH
<400> 91
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Val Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Pro Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Ile Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Cys Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Val Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Asp Tyr Leu Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 92
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0494 VL
<400> 92
Lys Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Gln Thr Tyr Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 93
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0495 VH
<400> 93
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Ser Tyr
20 25 30
Val Val His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Asp Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 94
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0495 VL
<400> 94
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Ile Arg Asn Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Phe Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 95
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0496 VH
<400> 95
Gln Val Gln Leu Ile Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Asn Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Asp Ile Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Pro His Tyr Val Gly Asn Arg Tyr Tyr Ala Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 96
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0496 VL
<400> 96
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Thr Thr Glu Asp Ile Tyr Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Gly Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 97
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0497 VH
<400> 97
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Phe Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Asn Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Thr Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 98
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 0497 VL
<400> 98
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 99
<211> 916
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huTfR-Fc(kih)-Avi
<400> 99
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp
20 25 30
His Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
35 40 45
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
50 55 60
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
65 70 75 80
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
85 90 95
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
100 105 110
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
115 120 125
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
130 135 140
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
145 150 155 160
Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
165 170 175
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
180 185 190
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
195 200 205
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
210 215 220
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
225 230 235 240
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
245 250 255
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys Arg Lys Leu Ser
275 280 285
Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile Lys Leu Leu Asn
290 295 300
Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln Lys Asp Glu Asn
305 310 315 320
Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe Lys Leu Ser Lys
325 330 335
Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val Lys Asp Ser Ala
340 345 350
Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Leu Val Tyr Leu
355 360 365
Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys Ala Ala Thr Val
370 375 380
Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys Lys Asp Phe Glu
385 390 395 400
Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile Val Arg Ala Gly
405 410 415
Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu Ser Leu Asn Ala
420 425 430
Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe Pro Ile Val Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly Thr Gly Asp Pro
450 455 460
Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln Phe Pro Pro Ser
465 470 475 480
Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr Ile Ser Arg Ala
485 490 495
Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp Cys Pro Ser Asp
500 505 510
Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser Glu Ser Lys Asn
515 520 525
Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile Lys Ile Leu Asn
530 535 540
Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp His Tyr Val Val
545 550 555 560
Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala Ala Lys Ser Gly
565 570 575
Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met Phe Ser Asp Met
580 585 590
Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile Ile Phe Ala Ser
595 600 605
Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr Glu Trp Leu Glu
610 615 620
Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr Tyr Ile Asn Leu
625 630 635 640
Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val Ser Ala Ser Pro
645 650 655
Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn Val Lys His Pro
660 665 670
Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp Ala Ser Lys Val
675 680 685
Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe Leu Ala Tyr Ser
690 695 700
Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp Thr Asp Tyr Pro
705 710 715 720
Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu Ile Glu Arg Ile
725 730 735
Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu Val Ala Gly Gln
740 745 750
Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn Leu Asp Tyr Glu
755 760 765
Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp Leu Asn Gln Tyr
770 775 780
Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln Trp Leu Tyr Ser
785 790 795 800
Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu Thr Thr Asp Phe
805 810 815
Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys Lys Leu Asn Asp
820 825 830
Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro Tyr Val Ser Pro
835 840 845
Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser Gly Ser His Thr
850 855 860
Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys Gln Asn Asn Gly
865 870 875 880
Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala Leu Ala Thr Trp
885 890 895
Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp Val Trp Asp Ile
900 905 910
Asp Asn Glu Phe
915
<210> 100
<211> 916
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cyTfR-Fc(kih)-Avi
<400> 100
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp
20 25 30
His Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
35 40 45
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
50 55 60
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
65 70 75 80
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
85 90 95
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
100 105 110
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
115 120 125
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
130 135 140
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
145 150 155 160
Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
165 170 175
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
180 185 190
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
195 200 205
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
210 215 220
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
225 230 235 240
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
245 250 255
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys Arg Lys Leu Ser
275 280 285
Glu Lys Leu Asp Thr Thr Asp Phe Thr Ser Thr Ile Lys Leu Leu Asn
290 295 300
Glu Asn Leu Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln Lys Asp Glu Asn
305 310 315 320
Leu Ala Leu Tyr Ile Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe Lys Leu Ser Lys
325 330 335
Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val Lys Asp Ser Ala
340 345 350
Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Gly Leu Val Tyr Leu
355 360 365
Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys Ala Ala Thr Val
370 375 380
Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys Lys Asp Phe Glu
385 390 395 400
Asp Leu Asp Ser Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile Val Arg Ala Gly
405 410 415
Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu Ser Leu Asn Ala
420 425 430
Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe Pro Ile Val Lys
435 440 445
Ala Asp Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly Thr Gly Asp Pro
450 455 460
Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln Phe Pro Pro Ser
465 470 475 480
Gln Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr Ile Ser Arg Ala
485 490 495
Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp Cys Pro Ser Asp
500 505 510
Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Lys Met Val Thr Ser Glu Asn Lys Ser
515 520 525
Val Lys Leu Thr Val Thr Asn Val Leu Lys Glu Thr Lys Ile Leu Asn
530 535 540
Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp His Tyr Val Val
545 550 555 560
Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala Ala Lys Ser Ser
565 570 575
Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met Phe Ser Asp Met
580 585 590
Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile Ile Phe Ala Ser
595 600 605
Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr Glu Trp Leu Glu
610 615 620
Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr Tyr Ile Asn Leu
625 630 635 640
Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val Ser Ala Ser Pro
645 650 655
Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asp Val Lys His Pro
660 665 670
Val Thr Gly Arg Ser Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp Ala Ser Lys Val
675 680 685
Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe Leu Ala Tyr Ser
690 695 700
Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp Thr Asp Tyr Pro
705 710 715 720
Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu Val Glu Arg Ile
725 730 735
Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu Val Ala Gly Gln
740 745 750
Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Thr Glu Leu Asn Leu Asp Tyr Glu
755 760 765
Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Leu Phe Leu Arg Asp Leu Asn Gln Tyr
770 775 780
Arg Ala Asp Val Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln Trp Leu Tyr Ser
785 790 795 800
Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu Thr Thr Asp Phe
805 810 815
Arg Asn Ala Glu Lys Arg Asp Lys Phe Val Met Lys Lys Leu Asn Asp
820 825 830
Arg Val Met Arg Val Glu Tyr Tyr Phe Leu Ser Pro Tyr Val Ser Pro
835 840 845
Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser Gly Ser His Thr
850 855 860
Leu Ser Ala Leu Leu Glu Ser Leu Lys Leu Arg Arg Gln Asn Asn Ser
865 870 875 880
Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala Leu Ala Thr Trp
885 890 895
Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp Val Trp Asp Ile
900 905 910
Asp Asn Glu Phe
915
<210> 101
<211> 954
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huTfR-SNAP tag
<400> 101
Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu
1 5 10 15
Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp
20 25 30
Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala
35 40 45
Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly
50 55 60
Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly
65 70 75 80
Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr
85 90 95
Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro
100 105 110
Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys
115 120 125
Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile
130 135 140
Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln
145 150 155 160
Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val
180 185 190
Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg
195 200 205
Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys
210 215 220
Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys
225 230 235 240
Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile
245 250 255
Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu
260 265 270
Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe
275 280 285
Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly
290 295 300
Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln
305 310 315 320
Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr
325 330 335
Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp
340 345 350
Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser
355 360 365
Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile
370 375 380
Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp
385 390 395 400
His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala
405 410 415
Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met
420 425 430
Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile
435 440 445
Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr
450 455 460
Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr
465 470 475 480
Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val
485 490 495
Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn
500 505 510
Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp
515 520 525
Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe
530 535 540
Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp
545 550 555 560
Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu
565 570 575
Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu
580 585 590
Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn
595 600 605
Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp
610 615 620
Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln
625 630 635 640
Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu
645 650 655
Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys
660 665 670
Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro
675 680 685
Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser
690 695 700
Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys
705 710 715 720
Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala
725 730 735
Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp
740 745 750
Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe Thr Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
755 760 765
Asp Tyr Ala Ser Gly Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu
770 775 780
Asp Ser Pro Leu Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu
785 790 795 800
His Glu Ile Lys Leu Leu Gly Ser Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val
805 810 815
Glu Val Pro Ala Pro Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met
820 825 830
Gln Ala Thr Ala Trp Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile
835 840 845
Glu Glu Phe Pro Val Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln Glu
850 855 860
Ser Phe Thr Arg Gln Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe
865 870 875 880
Gly Glu Val Ile Ser Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro
885 890 895
Ala Ala Thr Ala Ala Val Lys Thr Ala Leu Ser Gly Asn Pro Val Pro
900 905 910
Ile Leu Ile Pro Cys His Arg Val Val Ser Ser Ser Gly Ala Val Gly
915 920 925
Gly Tyr Glu Gly Gly Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu
930 935 940
Gly His Arg Leu Gly Lys Pro Gly Leu Gly
945 950
<210> 102
<211> 954
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cyTfR-SNAP tag
<400> 102
Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu
1 5 10 15
Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp
20 25 30
Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Gly Val Asp Glu Glu Glu Asn Thr
35 40 45
Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Gly Thr Lys Pro Lys Arg Cys Gly Gly
50 55 60
Asn Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Ile Phe Phe Leu Ile Gly
65 70 75 80
Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr
85 90 95
Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Ala Arg Glu Glu Pro
100 105 110
Glu Glu Asp Phe Pro Ala Ala Pro Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys
115 120 125
Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Thr Thr Asp Phe Thr Ser Thr Ile
130 135 140
Lys Leu Leu Asn Glu Asn Leu Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln
145 150 155 160
Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Ile Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val
180 185 190
Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Gly
195 200 205
Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys
210 215 220
Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys
225 230 235 240
Lys Asp Phe Glu Asp Leu Asp Ser Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile
245 250 255
Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu
260 265 270
Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe
275 280 285
Pro Ile Val Lys Ala Asp Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly
290 295 300
Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln
305 310 315 320
Phe Pro Pro Ser Gln Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr
325 330 335
Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp
340 345 350
Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Lys Met Val Thr Ser
355 360 365
Glu Asn Lys Ser Val Lys Leu Thr Val Thr Asn Val Leu Lys Glu Thr
370 375 380
Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp
385 390 395 400
His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala
405 410 415
Ala Lys Ser Ser Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met
420 425 430
Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile
435 440 445
Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr
450 455 460
Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr
465 470 475 480
Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val
485 490 495
Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asp
500 505 510
Val Lys His Pro Val Thr Gly Arg Ser Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp
515 520 525
Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe
530 535 540
Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp
545 550 555 560
Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu
565 570 575
Val Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu
580 585 590
Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Thr Glu Leu Asn
595 600 605
Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Leu Phe Leu Arg Asp
610 615 620
Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Val Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln
625 630 635 640
Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu
645 650 655
Thr Thr Asp Phe Arg Asn Ala Glu Lys Arg Asp Lys Phe Val Met Lys
660 665 670
Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr Tyr Phe Leu Ser Pro
675 680 685
Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser
690 695 700
Gly Ser His Thr Leu Ser Ala Leu Leu Glu Ser Leu Lys Leu Arg Arg
705 710 715 720
Gln Asn Asn Ser Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala
725 730 735
Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp
740 745 750
Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe Thr Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
755 760 765
Asp Tyr Ala Ser Gly Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu
770 775 780
Asp Ser Pro Leu Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu
785 790 795 800
His Glu Ile Lys Leu Leu Gly Ser Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val
805 810 815
Glu Val Pro Ala Pro Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met
820 825 830
Gln Ala Thr Ala Trp Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile
835 840 845
Glu Glu Phe Pro Val Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln Glu
850 855 860
Ser Phe Thr Arg Gln Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe
865 870 875 880
Gly Glu Val Ile Ser Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro
885 890 895
Ala Ala Thr Ala Ala Val Lys Thr Ala Leu Ser Gly Asn Pro Val Pro
900 905 910
Ile Leu Ile Pro Cys His Arg Val Val Ser Ser Ser Gly Ala Val Gly
915 920 925
Gly Tyr Glu Gly Gly Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu
930 935 940
Gly His Arg Leu Gly Lys Pro Gly Leu Gly
945 950
<210> 103
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rbHC.up
<400> 103
aagcttgcca ccatggagac tgggctgcgc tggcttc 37
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rbHCf.do
<400> 104
ccattggtga gggtgcccga g 21
<210> 105
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rbLC.up
<400> 105
aagcttgcca ccatggacay gagggccccc actc 34
<210> 106
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rbLC.do
<400> 106
cagagtrctg ctgaggttgt aggtac 26
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BcPCR_FHLC_leader.fw
<400> 107
atggacatga gggtccccgc 20
<210> 108
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BcPCR_huCkappa.rev
<400> 108
gatttcaact gctcatcaga tggc 24
<210> 109
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 299 HVR-H1
<400> 109
Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
1 5
<210> 110
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 299 HVR-H2s
<400> 110
Trp Ser
1
<210> 111
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 299 HVR-H2
<400> 111
Tyr Ile Trp Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
<210> 112
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 299 HVR-H3
<400> 112
Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Asn Gly Phe Asp
1 5 10
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 299 HVR-L1
<400> 113
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 114
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 299 HVR-L2
<400> 114
Arg Ala Ser
1
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 299 HVR-L3
<400> 115
Cys Tyr Ser Ser Ser Asn Val Asp Asn
1 5
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 494 HVR-H1
<400> 116
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
1 5
<210> 117
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 494 HVR-H2s
<400> 117
Ala Asn Gly
1
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 494 HVR-H2
<400> 118
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Cys Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Val
<210> 119
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 494 HVR-H3
<400> 119
Tyr Leu Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp
1 5
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 494 HVR-L1
<400> 120
Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
1 5
<210> 121
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 494 HVR-L2
<400> 121
Gly Ala Ser
1
<210> 122
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 494 HVR-L3
<400> 122
Thr Tyr Asn Tyr Pro Leu
1 5

Claims (74)

1.血脑屏障穿梭模块，其包含
跨血脑屏障运输至脑的分子和
一个抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段，
其中该抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段结合人转铁蛋白受体，并包含：
(a)SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)SEQ ID NO:113的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)SEQ ID NO:114的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)SEQ ID NO:115的氨基酸序列的HVR-L3。
2.权利要求1的血脑屏障穿梭模块，其中血脑屏障穿梭模块还包含衔接物，其中所述衔接物将所述跨血脑屏障运输至脑的分子偶联至所述抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段上。
3.权利要求1的血脑屏障穿梭模块，其中抗血脑屏障受体抗体是单价抗体。
4.权利要求1的血脑屏障穿梭模块，其中抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段包括选自全长抗体、scFv、Fv、Fab和scFab的分子。
5.权利要求3的血脑屏障穿梭模块，其中所述单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段包含一个针对人转铁蛋白受体的Fab或scFab。
6.权利要求3的血脑屏障穿梭模块，其中所述单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段包含一个针对转铁蛋白受体的scFv。
7.权利要求1的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子选自神经疾病药物、生长因子、酶和细胞毒性剂。
8.权利要求7的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子选自神经营养因子和针对脑靶标的肽。
9.权利要求8的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是针对脑靶标的抗体。
10.权利要求9的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是针对脑靶标的单克隆抗体。
11.权利要求10的血脑屏障穿梭模块，其中脑靶标选自β-分泌酶1、Aβ、表皮生长因子、表皮生长因子受体2、tau、载脂蛋白E4、α突触核蛋白、α突触核蛋白的寡聚片段、CD20、亨廷顿蛋白、朊病毒蛋白、富含亮氨酸重复的激酶2、帕金蛋白、早老蛋白2、γ分泌酶、死亡受体6、淀粉样蛋白前体蛋白、p75神经营养蛋白受体和胱天蛋白酶6。
12.权利要求10的血脑屏障穿梭模块，其中脑靶标是磷酸化的tau(pS422)。
13.权利要求1的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是多肽。
14.权利要求1的血脑屏障穿梭模块，其中所述抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段与所述跨血脑屏障运输至脑的分子的C-末端直接或通过衔接物缀合。
15.权利要求1的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子包括针对脑靶标的全长抗体。
16.权利要求15的血脑屏障穿梭模块，其中全长抗体是IgG。
17.权利要求1的血脑屏障穿梭模块，其中血脑屏障穿梭模块包含作为跨血脑屏障运输至脑的分子的针对脑靶标的全长IgG抗体、衔接物、和作为单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段的一个Fab或一个scFab，其中所述Fab或scFab通过衔接物与所述IgG抗体的重链之一的C-末端缀合。
18.权利要求17的血脑屏障穿梭模块，其中针对脑靶标的血脑屏障穿梭模块的抗体的第一重链包括第一二聚化模块，且针对脑靶标的血脑屏障穿梭模块的抗体的第二重链包括第二二聚化模块，从而允许两条重链的异二聚化。
19.权利要求18的血脑屏障穿梭模块，其中根据杵进臼策略，针对脑靶标的血脑屏障穿梭模块的抗体的第一重链的第一二聚化模块包含杵，且针对脑靶标的血脑屏障穿梭模块的抗体的第二重链的第二二聚化模块包含臼。
20.权利要求2的血脑屏障穿梭模块，其中衔接物是肽衔接物。
21.权利要求17的血脑屏障穿梭模块，其中衔接物是肽衔接物。
22.权利要求20的血脑屏障穿梭模块，其中肽衔接物具有至少25个氨基酸长度的氨基酸序列。
23.权利要求21的血脑屏障穿梭模块，其中肽衔接物具有至少25个氨基酸长度的氨基酸序列。
24.权利要求22或23的血脑屏障穿梭模块，其中肽衔接物具有30至50个氨基酸长度的氨基酸序列。
25.权利要求20或21的血脑屏障穿梭模块，其中肽衔接物是(G4S)6G2(SEQ ID NO:07)或(G4S)4(SEQ ID NO:08)。
26.权利要求1或权利要求14的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是多肽，前提条件是，跨血脑屏障运输至脑的该分子不是全长抗体。
27.权利要求3的血脑屏障穿梭模块，其中单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段包含CH2-CH3 Ig结构域和结合血脑屏障受体的一个Fab或一个scFab，其中所述Fab或scFab通过衔接物与CH2-CH3 Ig结构域的C-末端偶联。
28.权利要求27的血脑屏障穿梭模块，其中结合血脑屏障受体的scFab包含第二衔接物。
29.权利要求26的血脑屏障穿梭模块，其中血脑屏障穿梭模块包含跨血脑屏障运输至脑的分子、第一衔接物、CH2-CH3 Ig结构域、第二衔接物、和作为抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段的一个Fab或一个scFab，其中跨血脑屏障运输至脑的分子通过第一衔接物与CH2-CH3Ig结构域的N-末端缀合，且Fab或scFab通过第二衔接物与CH2-CH3 Ig结构域的C-末端缀合。
30.权利要求27至29之任一项的血脑屏障穿梭模块，其中CH2-CH3 Ig结构域是人CH2-CH3 IgG1结构域。
31.核酸，其编码权利要求1至30之任一项的血脑屏障穿梭模块。
32.权利要求31的核酸，其中所述核酸是分离的核酸。
33.宿主细胞，其包含权利要求31或32的编码血脑屏障穿梭模块的核酸。
34.药物制剂，其包含权利要求1至30之任一项的血脑屏障穿梭模块。
35.权利要求1至30之任一项的血脑屏障穿梭模块在制备用于治疗神经疾病的药物中的用途。
36.权利要求1至30之任一项的血脑屏障穿梭模块在制备用于治疗阿尔茨海默氏病的药物中的用途。
37.权利要求1至30之任一项的血脑屏障穿梭模块在制备用于将跨血脑屏障运输至脑的分子运送穿过血脑屏障的用于治疗神经疾病的药物中的用途。
38.权利要求17的血脑屏障穿梭模块，其中所述血脑屏障穿梭模块的IgG抗体的重链在其C-末端与作为单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段的Fab缀合，其从N端至C端方向具有以下结构：
-IgG重链，
-衔接物，
-Fab，
其中，衔接物将IgG重链的Fc区的C-末端与Fab的VL结构域或VH结构域的N-末端缀合，
其中所述Fab的可变轻链结构域(VL)与IgG CH1重链恒定结构域缀合，或所述Fab的可变重链结构域(VH)与IgG CL轻链恒定结构域缀合。
39.权利要求17的血脑屏障穿梭模块，其中所述血脑屏障穿梭模块的IgG抗体的重链在其C-末端与作为单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段的scFab缀合，其具有以下结构：
-IgG重链，
-将IgG重链的Fc区的C-末端与scFab的VL结构域的N-末端缀合的衔接物，
-scFab的可变轻链结构域(VL)和C-κ轻链结构域，
-将scFab的C-κ轻链结构域的C-末端与scFab的VH结构域的N-末端缀合的衔接物，
-scFab抗体的可变重链结构域(VH)和IgG CH1重链结构域。
40.运送跨血脑屏障运输至脑的分子的融合多肽，其包含CH2-CH3 Ig结构域、衔接物和特异性结合血脑屏障受体的一个Fab或一个scFab，其中Fab或scFab通过衔接物与CH2-CH3Ig结构域的C-末端缀合，其中所述Fab或scFab结合人转铁蛋白受体并包含：
(a)SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)SEQ ID NO:113的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)SEQ ID NO:114的氨基酸序列的HVR-L2；
(f)SEQ ID NO:115的氨基酸序列的HVR-L3。
41.运送跨血脑屏障运输至脑的分子的融合多肽，其包含CH2-CH3 Ig结构域、衔接物和特异性结合血脑屏障受体的一个scFv，其中scFv通过衔接物与CH2-CH3 Ig结构域的C-末端缀合，
其中所述scFv结合人转铁蛋白受体并包含：
(a)SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)SEQ ID NO:113的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)SEQ ID NO:114的氨基酸序列的HVR-L2；
(f)SEQ ID NO:115的氨基酸序列的HVR-L3。
42.权利要求40或41的融合多肽，其还包含在CH2-CH3 Ig结构域的N-末端的衔接物，所述衔接物将跨血脑屏障运输至脑的分子缀合至CH2-CH3 Ig结构域的N-末端。
43.权利要求40或41的融合多肽，其中跨血脑屏障运输至脑的分子选自神经疾病药物、生长因子、酶、细胞毒性剂、选自scFv、Fv、Fab、scFab、和F(ab’)2的针对脑靶标的抗体片段或肽。
44.权利要求40或41的融合多肽，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是神经营养因子。
45.权利要求40或41的融合多肽，其中衔接物是肽衔接物。
46.权利要求45的融合多肽，其中肽衔接物具有至少15个氨基酸长度的氨基酸序列。
47.权利要求46的融合多肽，其中肽衔接物具有20至50个氨基酸长度。
48.权利要求45的融合多肽，其中肽衔接物具有氨基酸序列(G4S)6G2(SEQ ID NO:07)或(G4S)4(SEQ ID NO:08)。
49.权利要求40或41的融合多肽，其中CH2-CH3 Ig结构域是人CH2-CH3 IgG1结构域。
50.分离的核酸，其编码权利要求40至49之任一项的融合多肽。
51.宿主细胞，其包含权利要求50的编码融合多肽的核酸。
52.缀合物，其包含权利要求40至49之任一项的融合多肽和通过衔接物与所述融合多肽的CH2-CH3 Ig结构域的N-末端缀合的跨血脑屏障运输至脑的分子。
53.权利要求52的缀合物，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是神经营养因子，且将所述神经营养因子与CH2-CH3 Ig结构域的N-末端缀合的衔接物是肽衔接物。
54.药物制剂，其包含权利要求40至49任一项的融合多肽或权利要求52至53任一项的缀合物和药物载体。
55.权利要求40至49任一项的融合多肽在制备用于神经退行性疾病治疗的药物中的用途。
56.权利要求52或53任一项的缀合物在制备用于神经退行性疾病治疗的药物中的用途。
57.权利要求55或56的用途，其中神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病。
58.权利要求3的血脑屏障穿梭模块，其中所述血脑屏障穿梭模块包含跨血脑屏障运输至脑的抗体，其中所述单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段直接或通过肽衔接物与所述抗体的轻链或重链的任一个末端缀合。
59.权利要求58的血脑屏障穿梭模块，其中单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段与所述跨血脑屏障运输至脑的抗体的重链的C-末端缀合。
60.权利要求58或59的血脑屏障穿梭模块，其中所述跨血脑屏障运输至脑的抗体的重链的C-末端是完整的C-末端，结束于氨基酸残基PGK。
61.权利要求58或59的血脑屏障穿梭模块，其中所述跨血脑屏障运输至脑的抗体的重链的C-末端是缩短的C-末端，其中C-末端氨基酸残基的一个或两个已经被除去。
62.权利要求58或59的血脑屏障穿梭模块，其中所述跨血脑屏障运输至脑的抗体的重链的C-末端是缩短的C-末端，结束于氨基酸残基PG。
63.权利要求58的血脑屏障穿梭模块，其中单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段直接或通过肽衔接物与相应抗体链缀合。
64.权利要求63的血脑屏障穿梭模块，其中肽衔接物具有氨基酸序列GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:09)。
65.权利要求3或58的血脑屏障穿梭模块，其中单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段是抗体scFv或Fab或scFab片段。
66.权利要求3或58的血脑屏障穿梭模块，其中单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段是从N-至C-末端包含轻链可变结构域-轻链恒定结构域-肽衔接物-重链可变结构域-重链恒定结构域1的scFv。
67.权利要求3或58的血脑屏障穿梭模块，其中单价抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段是具有(G4S)6肽衔接物(SEQ ID NO:10)的抗人转铁蛋白受体抗体的scFv片段。
68.权利要求1或58的血脑屏障穿梭模块，其中血脑屏障受体是人转铁蛋白受体。
69.权利要求2或58的血脑屏障穿梭模块，其中将抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段与跨血脑屏障运输至脑的分子缀合的肽衔接物是具有至少15个氨基酸长度的氨基酸序列。
70.权利要求2或58的血脑屏障穿梭模块，其中肽衔接物具有18至25个氨基酸的长度。
71.权利要求1或58的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是全长抗体。
72.权利要求1或58的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是人IgG1或IgG4亚类的全长抗体。
73.权利要求1或58的血脑屏障穿梭模块，其中血脑屏障穿梭模块是效应物功能沉默的。
74.权利要求1或58的血脑屏障穿梭模块，其中跨血脑屏障运输至脑的分子是包括Fc-区的全长抗体，其中在Fc-区是人IgG1亚类的情况中，Fc-区包含根据Kabat的EU索引编号的突变L234A、L235A和P239G，或在Fc-区是人IgG4亚类的情况中，Fc-区包含根据Kabat的EU索引编号的突变S228P、L235E和P239G。
CN201911053535.4A 2014-01-06 2014-12-29 单价血脑屏障穿梭模块 Active CN111057151B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2014/070183 2014-01-06
CN2014070183 2014-01-06
CN201480072065.5A CN105873947A (zh) 2014-01-06 2014-12-29 单价血脑屏障穿梭模块
PCT/EP2014/079353 WO2015101588A1 (en) 2014-01-06 2014-12-29 Monovalent blood brain barrier shuttle modules

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480072065.5A Division CN105873947A (zh) 2014-01-06 2014-12-29 单价血脑屏障穿梭模块

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111057151A CN111057151A (zh) 2020-04-24
CN111057151B true CN111057151B (zh) 2022-05-03

Family

ID=52396646

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911053535.4A Active CN111057151B (zh) 2014-01-06 2014-12-29 单价血脑屏障穿梭模块
CN201911054923.4A Active CN111057147B (zh) 2014-01-06 2014-12-29 单价血脑屏障穿梭模块
CN201480072065.5A Pending CN105873947A (zh) 2014-01-06 2014-12-29 单价血脑屏障穿梭模块

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911054923.4A Active CN111057147B (zh) 2014-01-06 2014-12-29 单价血脑屏障穿梭模块
CN201480072065.5A Pending CN105873947A (zh) 2014-01-06 2014-12-29 单价血脑屏障穿梭模块

Country Status (13)

Country Link
US (2) US10364292B2 (zh)
EP (2) EP3092251B1 (zh)
JP (1) JP6557664B2 (zh)
KR (2) KR102381685B1 (zh)
CN (3) CN111057151B (zh)
AR (1) AR099019A1 (zh)
BR (1) BR112016015589A2 (zh)
CA (1) CA2932547C (zh)
ES (1) ES2864160T3 (zh)
MX (3) MX2016008190A (zh)
PL (1) PL3092251T3 (zh)
RU (1) RU2694659C2 (zh)
WO (1) WO2015101588A1 (zh)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
ES2549638T3 (es) 2011-02-28 2015-10-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Proteínas de unión a antígeno
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
MX2016003593A (es) 2013-10-11 2016-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos de cadena ligera variable comun intercambiada de dominio multiespecifico.
EP3227332B1 (en) 2014-12-03 2019-11-06 F.Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
EP3292149B1 (en) 2015-05-04 2021-12-01 CytomX Therapeutics, Inc. Activatable anti-cd71 antibodies, and methods of use thereof
DK3313879T3 (da) 2015-06-24 2022-03-14 Hoffmann La Roche Anti-transferrinreceptor-antistoffer med tilpasset affinitet
EA039366B1 (ru) 2015-06-24 2022-01-19 Джей Си Ар ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ КО., ЛТД. Антитело к рецептору трансферрина человека, проникающее через гематоэнцефалический барьер
CA2990565A1 (en) 2015-06-24 2016-12-29 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Fusion protein containing bdnf and anti-human transferrin receptor antibody
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
JP6937746B2 (ja) * 2015-10-02 2021-09-22 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ｃｄ１９×ｃｄ３ｔ細胞活性化抗原結合分子
WO2017055385A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xgd2 bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2017055318A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Cd33xcd3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
AR106189A1 (es) * 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
US20170096485A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3150636A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
EP3150637A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antibodies
WO2017055388A2 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN107849137B (zh) * 2015-10-02 2021-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗ceaxcd3 t细胞活化性抗原结合分子
WO2017055395A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xrob04 bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN114014936A (zh) 2015-10-02 2022-02-08 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法
WO2017055392A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xcd44v6 bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN108290958B (zh) * 2015-10-02 2021-12-28 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗体
WO2017055393A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xtim-3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
JP7325186B2 (ja) 2015-12-09 2023-08-14 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗薬物抗体の形成を減少させるためのｉｉ型抗ｃｄ２０抗体
MX2018008347A (es) 2016-01-08 2018-12-06 Hoffmann La Roche Metodos de tratamiento de canceres positivos para ace utilizando antagonistas de union a eje pd-1 y anticuerpos biespecificos anti-ace/anti-cd3.
WO2017165681A1 (en) * 2016-03-24 2017-09-28 Gensun Biopharma Inc. Trispecific inhibitors for cancer treatment
IL276191B2 (en) * 2016-12-26 2024-02-01 Japan Chem Res A new anti-human transferrin receptor antibody capable of penetrating the blood-brain barrier
AU2018221731C1 (en) 2017-02-17 2021-11-18 Denali Therapeutics Inc. Engineered transferrin receptor binding polypeptides
SG11201908127WA (en) 2017-03-10 2019-10-30 Hoffmann La Roche Method for producing multispecific antibodies
CN108864283B (zh) * 2017-05-12 2021-10-29 中国药科大学 一种脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体及应用
AU2018304173A1 (en) 2017-07-17 2020-01-30 Janssen Biotech, Inc. Antigen binding regions against fibronectin type III domains and methods of using the same
CN111148757A (zh) * 2017-08-10 2020-05-12 戴纳立制药公司 工程改造的转铁蛋白受体结合多肽
MX2020002918A (es) 2017-10-02 2020-07-22 Denali Therapeutics Inc Proteinas de fusion que comprenden enzimas de terapia de reemplazo de enzimas.
EP3749373A1 (en) 2018-02-07 2020-12-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for therapeutic protein delivery
EP3810186B1 (en) 2018-06-21 2022-09-28 Novo Nordisk A/S Novel compounds for treatment of obesity
WO2020260326A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel icos antibodies and tumor-targeted antigen binding molecules comprising them
MX2022015586A (es) * 2020-06-12 2023-03-15 Nkarta Inc Linfocitos citolíticos naturales modificados genéticamente para inmunoterapia de cáncer dirigida a cd70.
AU2021291011A1 (en) 2020-06-19 2023-01-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to CD3 and CD19
US20230400471A1 (en) * 2020-10-15 2023-12-14 Bioincept, Llc Systems, compositions and methods of determining viability of embryos using the same
US20240117069A1 (en) * 2021-01-29 2024-04-11 Amgen Inc. Materials and Methods for Monitoring Cancer by Administering an Anti-MCL1 Antibody
EP4351648A1 (en) * 2021-06-10 2024-04-17 The Texas A&M University System Treatment for down syndrome-related accelerated aging
WO2023277627A1 (ko) * 2021-07-02 2023-01-05 주식회사 아임뉴런 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도
US11827702B2 (en) 2021-09-01 2023-11-28 Biogen Ma Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and uses thereof
KR102575322B1 (ko) * 2021-12-31 2023-09-08 주식회사 아임뉴런 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도
WO2023128702A1 (ko) * 2021-12-31 2023-07-06 주식회사 아임뉴런 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도
WO2023218431A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 BioNTech SE Rna compositions targeting hiv
WO2024026488A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified transferrin receptor locus
WO2024026494A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Viral particles retargeted to transferrin receptor 1

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993010819A1 (en) * 1991-11-26 1993-06-10 Alkermes, Inc. Process for the preparation of transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
CN102741282A (zh) * 2009-12-16 2012-10-17 国家科研中心 针对转铁蛋白受体的抗体以及其用于依赖于铁的肿瘤的免疫疗法的用途
CN102740888A (zh) * 2009-11-24 2012-10-17 奥尔德生物制药公司 Il-6抗体及其用途

Family Cites Families (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
DE69830901T2 (de) 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PRODUCING A POLYPEPTIDE
AU784983B2 (en) 1999-12-15 2006-08-17 Genentech Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
ES2528794T3 (es) 2000-04-11 2015-02-12 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
NZ592087A (en) 2001-08-03 2012-11-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
RU2303461C9 (ru) * 2002-08-06 2007-12-27 Глаксо Груп Лимитед Антитела против миелин-ассоциированного гликопротеина (mag)
ES2347144T3 (es) * 2002-08-30 2010-10-26 Biorexis Pharmaceutical Corporation Proteinas de fusion de la transferrina modificada que comprenden dominos aino o carboxilo de transferrina duplicados.
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
DE60332957D1 (de) 2002-12-16 2010-07-22 Genentech Inc Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
CN1788017B (zh) * 2003-02-10 2013-04-24 to-BBB控股股份有限公司 炎症状态下在血脑屏障中差异表达的核酸
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
UA94213C2 (ru) * 2004-09-17 2011-04-26 Домантис Лимитед Применение полипептида одноцепочечного антитела, который подавляет активность cd40 или cd40l в приготовлении медикамента для лечения аутоиммунного заболевания
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
WO2006056879A1 (en) 2004-11-29 2006-06-01 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Human blood brain barrier model
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US8053569B2 (en) * 2005-10-07 2011-11-08 Armagen Technologies, Inc. Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
ZA200804337B (en) * 2005-11-28 2009-11-25 Genmab As Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AU2007229698B9 (en) 2006-03-24 2012-11-08 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
JP2009540799A (ja) * 2006-06-07 2009-11-26 ウイスコンシン アラムナイ リサーチ フオンデーシヨン 血液脳関門標的化抗体
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
US8497246B2 (en) * 2006-08-18 2013-07-30 Armagen Technologies, Inc. Methods for diagnosing and treating CNS disorders by trans-blood-brain barrier delivery of protein compositions
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN101245107B (zh) * 2007-02-14 2010-10-13 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 抗人转铁蛋白受体人源抗体及其应用
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
US20100098693A1 (en) * 2008-10-07 2010-04-22 Pardridge William M Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of organophosphatases
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
MX2011010169A (es) * 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-1/anti-c-met.
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
WO2010136172A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
SI2519543T1 (sl) 2009-12-29 2016-08-31 Emergent Product Development Seattle, Llc Beljakovine, ki se vežejo s heterodimeri in njihova uporaba
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
SI2646470T1 (sl) * 2010-11-30 2017-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Protitelesa proti receptorjem antitransferina in njihova uporaba za prenos terapevtskega enoverižnega variabilnega fragmenta (scfv) prek krvno-možganske pregrade
AU2011336470B8 (en) * 2010-12-01 2017-09-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
WO2012087835A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Boston Biomedical Research Institute Compositions and methods for enhancing protein folding
CA2822288A1 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Medimmune, Llc Anti-c5/c5a/c5adesr antibodies and fragments
PT2691417T (pt) * 2011-03-29 2018-10-31 Roche Glycart Ag Variantes de fc de anticorpos
JP2014514313A (ja) * 2011-04-20 2014-06-19 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 血液脳関門のｐＨ依存性通過のための方法及び構築物
US9598496B2 (en) 2011-05-09 2017-03-21 Perseus Proteomics Inc. Antibody capable of specifically recognizing transferrin receptor
WO2013006244A1 (en) * 2011-06-08 2013-01-10 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Bispecific monoclonal antibody therapeutics against west nile virus with improved cns penetration
CA2859667C (en) 2011-12-20 2022-05-24 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
MX360109B (es) 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
CN104520329A (zh) 2012-08-29 2015-04-15 霍夫曼-拉罗奇有限公司 血脑屏障穿梭体
EP2999716A2 (en) 2013-05-20 2016-03-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993010819A1 (en) * 1991-11-26 1993-06-10 Alkermes, Inc. Process for the preparation of transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
CN102740888A (zh) * 2009-11-24 2012-10-17 奥尔德生物制药公司 Il-6抗体及其用途
CN102741282A (zh) * 2009-12-16 2012-10-17 国家科研中心 针对转铁蛋白受体的抗体以及其用于依赖于铁的肿瘤的免疫疗法的用途

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"immunoglobulin heavy chain, partial [Oryctolagus cuniculus]";Zhai,S.K 等;《genbank》;20130109;ACCESSION NO.AGB75998 *
"Selective transport of an anti-transferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo ";W M Pardridge 等;《J Pharmacol exp ther》;19911031;第259卷(第1期);第66-70页 *
"Transferrin- and transferrin-receptor-antibody-modified nanoparticles enable drug delivery across the blood-brain barrier (BBB)";Karsten Ulbrich 等;《European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics》;20080905;第71卷(第2期);第251-256页 *
"抗转铁蛋白受体单链抗体的可溶性表达及其对脑的靶向性研究";颜冰 等;《生物工程学报》;20040630;第20卷(第3期);第342-347页 *
"抗转铁蛋白受体单链抗体的表达、纯化及活性测定";赵莉霞 等;《生物工程学报》;20060630;第22卷(第3期);第488-491页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111057151A (zh) 2020-04-24
RU2694659C2 (ru) 2019-07-16
US10364292B2 (en) 2019-07-30
KR20210108491A (ko) 2021-09-02
EP3851452A1 (en) 2021-07-21
CA2932547C (en) 2023-05-23
KR20160105799A (ko) 2016-09-07
US20200071413A1 (en) 2020-03-05
RU2016130707A (ru) 2018-02-12
JP2017509588A (ja) 2017-04-06
US20170051071A1 (en) 2017-02-23
CN105873947A (zh) 2016-08-17
WO2015101588A1 (en) 2015-07-09
MX2016008190A (es) 2016-10-21
BR112016015589A2 (pt) 2017-10-31
CA2932547A1 (en) 2015-07-09
RU2016130707A3 (zh) 2018-08-15
ES2864160T3 (es) 2021-10-13
EP3092251B1 (en) 2021-01-20
CN111057147B (zh) 2023-11-10
MX2020013058A (es) 2021-03-02
AR099019A1 (es) 2016-06-22
EP3092251A1 (en) 2016-11-16
PL3092251T3 (pl) 2021-08-02
CN111057147A (zh) 2020-04-24
KR102381685B1 (ko) 2022-04-01
JP6557664B2 (ja) 2019-08-07
MX2020013057A (es) 2021-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111057151B (zh) 单价血脑屏障穿梭模块
JP6975508B2 (ja) 目的に合わせた親和性を有する抗トランスフェリンレセプター抗体
JP7367101B2 (ja) 抗アルファ－シヌクレイン抗体及び使用方法
JP6695812B2 (ja) Ｈｅｒ３のベータヘアピン及びｈｅｒ２のドメインｉｉに結合するｈｅｒ３／ｈｅｒ２二重特異性抗体
TWI545132B (zh) 人類化抗－ＴＡＵ（ｐＳ４２２）抗體及使用方法
JP6998869B2 (ja) 多重特異性抗体のスクリーニング方法
JP2018522549A (ja) Ｈｅｒ２及び血液脳関門受容体に特異的な三重特異性抗体及び使用方法
CN107148429B (zh) 抗-pdgf-b抗体和使用方法
TW201625680A (zh) 人類化抗Ｔａｕ（ｐＳ４２２）抗體腦部穿梭子及其用途
CN115916826A (zh) 与CD3和FolR1结合的抗体
CN106459207B (zh) 结合HER3β-发夹的抗HER3抗体
JP7326584B2 (ja) 抗ｈｌａ－ｇ抗体及びその使用
TW201605903A (zh) 結合至ｈｅｒ１貝他－髮夾的ｈｅｒ１抗原結合蛋白
RU2799436C1 (ru) Одновалентные модули-переносчики через гематоэнцефалитический барьер
JP2016512489A (ja) 抗ｍｃｓｐ抗体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40025301

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant