JP5612663B2 - 二重特異性抗ErbB−1/抗c−Met抗体 - Google Patents
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Description
ErbBタンパク質ファミリーは、4種類のメンバーであるErbB−1(別名、上皮生長因子受容体(EGFR))、ErbB−2(ヒトではHER2、齧歯動物ではneu)、ErbB−3(別名、HER3)及びErbB−4(別名、HER4)から成る。ErbBファミリー・タンパク質は、受容体チロシンキナーゼであって、細胞増殖、分化、及び生存の重要な伝達物質となっている。
Erb−B1(ERBB1、ヒト上皮増殖因子受容体、EGFR、HER−1又は鳥類白血病ウイルス(v−erb−b)癌遺伝子相同体;配列番号16とも呼ばれる)は、c−erbB癌原遺伝子によりコードされる170kDaの膜貫通受容体であり、固有のチロシンキナーゼ活性を有する(Modjtahedi, H., et al., Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235;Herbst, R.S., and Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611)。EGFRにはアイソフォーム及び変異体(例えば選択的RNA転写産物、切断型、多型等)も存在し、これに限定されるものではないが、SwissProtデータベースの登録番号P00533−1、P00533−2、P00533−3、P00533−4によって特定されるものが挙げられる。EGFRは、上皮増殖因子(EGF)、形質転換増殖因子α(TGF−α)、アンフィレギュリン、ヘパリン結合EGF(hb−EGF)、βセルリン、エピレギュリン等のリガンドと結合することが知られている(Herbst, R.S., and Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611;Mendelsohn, J., and Baselga, J., Oncogene 19 (2000) 6550-6565)。EGFRは、チロシンキナーゼ媒介型シグナル伝達経路を通じて、多数の細胞プロセスを調節している。例えば、これに限定されるものではないが、細胞増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管新生、有糸***、転移等を制御するシグナル伝達経路の活性化等が挙げられる(Atalay, G., et al., Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363;Tsao, A.S., and Herbst, R.S., Signal 4 (2003) 4-9;Herbst, R.S., and Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593- 1611;Modjtahedi, H., et al., Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235)。
MET(間葉−上皮移行因子)は、タンパク質METをコードする癌原遺伝子であり、(c−Met、肝細胞増殖受容体HGFR;HGF受容体;細胞分散因子受容体;SF受容体;配列番号15としても知られている)(Dean, M., et al., Nature 318 (1985) 385-8;Chan, A.M., et al., Oncogene 1 (1987) 229-33;Bottaro, D.P., et al., Science 251 (1991) 802-4;Naldini, L., et al.5 EMBO J. 10 (1991) 2867-78;Maulik, G., et al., Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2002) 41-59)。METは、胚発生と創傷治癒に不可欠な膜受容体である。肝細胞増殖因子(HGF)は、MET受容体の唯一の既知のリガンドである。METは通常、上皮起源の細胞によって発現されるが、HGFの発現は間葉起源の細胞に限られている。HGF刺激により、METは浸潤性増殖として知られているプログラムをまとめて引き起こす複数の生物反応を誘発する。癌における異常なMET活性化は、異常な活性のMETが腫瘍増殖や、腫瘍に栄養を供給する新生血管の形成(血管新生)や、他の臓器への癌の分散(転移癌)を引き起こす、予後不良と関連がある。METは、腎臓、肝臓、胃、***、及び脳の癌を含めた多くのタイプのヒト悪性腫瘍において無秩序である。本来なら、幹細胞と始原細胞だけがMETを発現しており、それが胎児において新しい組織を作り出したり、成人において損傷した組織を再生するために、これらの細胞が侵襲的に増殖することを可能にしている。しかしながら、癌幹細胞は、正常細胞がMETを発現する能力を乗っ取り、それによって癌持続性と体内の他の部位への分散の原因となると考えられている。
広範な種類の組換え抗体フォーマットが最近開発されてきている、例えば、IgG抗体フォーマットと一本鎖ドメインの融合による、例えば、四価二重特異性抗体が開発された(例えば、Coloma M. J. et al., Nature Biotech. 15(1997)159-163;WO2001077342;及びMorrison S. L. Nature Biotech. 25(2007)1233-1234を参照のこと)。
i)前記第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン内に配列番号17のCDR3H領域、配列番号18のCDR2H領域、及び配列番号19のCDR1H領域を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメイン内に配列番号20のCDR3L領域、配列番号21のCDR2L領域、及び配列番号22のCDR1L領域を含んでなり;そして
前記第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン内に配列番号29のCDR3H領域、配列番号30のCDR2H領域、及び配列番号31のCDR1H領域を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメイン内に配列番号32のCDR3L領域、配列番号33のCDR2L領域、配列番号34のCDR1L領域を含んでなるか;
ii)前記第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン内に配列番号23のCDR3H領域、配列番号24のCDR2H領域、配列番号25のCDR1H領域を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメイン内に配列番号26のCDR3L領域、配列番号27のCDR2L領域、及び配列番号28のCDR1L領域を含んでなり、そして
前記第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン内に配列番号29のCDR3H領域、配列番号30のCDR2H領域、配列番号31のCDR1H領域を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメイン内に配列番号32のCDR3L領域、配列番号33のCDR2L領域、配列番号34のCDR1L領域を含んでなる、
を特徴とする前記二重特異性抗体である。
i)ErbB−1に特異的に結合する前記第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号1の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号2の配列を含んでなり;そして
c−Metに特異的に結合する前記第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号5の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号6の配列を含んでなるか;又は
ii)ErbB−1に特異的に結合する前記第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号3の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号4の配列を含んでなり;そして
c−Metに特異的に結合する前記第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号5の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号6の配列を含んでなる、
を特徴とする。
この発明の第一の態様は、ヒトErbB−1に特異的に結合する第1の抗原結合部位とヒトc−Metに特異的に結合する第2の抗原結合部位を含んでなるヒトErbB−1及びヒトc−Metに特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記二重特異性抗体は、その不存在下でのc−Metの内部移行と比較すると、フローサイトメトリーアッセイにより2時間後に測定した場合、OVCAR−8細胞上での15%以下のc−Metの内部移行を示すことを特徴とする。
i)ErbB−1に特異的に結合する前記第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号1の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号2の配列を含んでなり;そして
c−Metに特異的に結合する前記第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号5の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号6の配列を含んでなるか;又は
ii)ErbB−1に特異的に結合する前記第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号3の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号4の配列を含んでなり;そして
c−Metに特異的に結合する前記第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号5の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号6の配列を含んでなる、
を特徴とする前記二重特異性抗体である。
本発明の抗体は、2個以上の結合部位を持つので、多特異性であり、好ましくは二重特異性である。すなわち、抗体は、2以上の結合部位がある場合でさえ、二重特異性であり得る(すなわち、抗体は三価又は多価性である)。本発明の二重特異性抗体には、例えば多価性一本鎖抗体、二重特異性抗体、及び三重特異性抗体、並びに1若しくは複数のペプチド・リンカーを介して連結された更なる抗原結合部位(例えば一本鎖Fv、VHドメイン及び/又はVLドメイン、Fab、又は(Fab)2)を持つ全長抗体の定常ドメイン構造を有する抗体が含まれる。抗体は、単一種からの全長であることも、又はキメラ化若しくは又はヒト化されることもできる。3つ以上の抗原結合部位を有する抗体に関しては、タンパク質に2つの異なった抗原のための結合部位がある限り、いくつかの結合部位が同一のであることもあり得る。すなわち、第1の結合部位がErbB−1に特異的である一方で、第2の結合部位はc−Metに特異的であり、そして逆もまた同様である。
免疫グロブリン定常領域を含んでなるヒトErbB−1及びヒトc−Metに対する二重特異性の二価抗体は、例えば、WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253若しくはRidgway, J.B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621;WO96/027011;Merchant, A.M., et al. Nature Biotech 16 (1998) 677-681;Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35及びEP1870459A1に記載のように使用できる。
a)ErbB−1に特異的に結合する全長抗体の軽鎖及び重鎖;並びに
b)ヒトc−Metに特異的に結合する全長抗体の軽鎖及び重鎖;
を含んでなり、ここで、定常ドメインCLとCH1、及び/又は可変ドメインVLとVHが互いによって置き換えられている二価の二重特異性抗体である。
a)ヒトc−Metに特異的に結合する全長抗体の軽鎖及び重鎖;並びに
b)ErbB−1に特異的に結合する全長抗体の軽鎖及び重鎖;
を含んでなり、ここで、定常ドメインCLとCH1、及び/又は可変ドメインVLとVHが互いによって置き換えられている二価の二重特異性抗体である。
ここで、前記界面は二価の二重特異性抗体の形成を促進するよう変更され、ここで、前記変更が:
a)二価の二重特異性抗体内のもう片方の重鎖のCH3ドメインの本来の界面と接触する、一方の重鎖のCH3ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ残基により置換され、それにより、もう片方の重鎖のCH3ドメインの界面内の腔に位置決定できる、一方の重鎖CH3ドメインの界面内に***部を生じるように、一方の重鎖のCH3ドメインが変更され、そして
b)二価の二重特異性抗体内の第1CH3ドメインの本来の界面と接触する、第2CH3ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、第1CH3ドメインの界面内の***部が位置決定できる第2CH3ドメインの界面内に腔を生じるように、もう片方の重鎖のCH3ドメインが変更されることにより更に特徴づけられる。
この発明の別の好ましい態様は、以下の:
a)ヒトErbB−1に特異的に結合し、且つ、2つの抗体重鎖及び2つの抗体軽鎖から成る全長抗体;並びに
b)ヒトc−Metに特異的に結合する1つの一本鎖Fabフラグメント
を含んでなり、ここで、前記のb)の一本鎖Fabフラグメントが、前記のa)の全長抗体に、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のC又はN末端のペプチドコネクタを介して融合される、三価の二重特異性抗体である。
a)ヒトErbB−1に特異的に結合し、且つ、2つの抗体重鎖及び2つの抗体軽鎖から成る全長抗体;並びに
b)ヒトc−Metに特異的に結合する1つの一本鎖Fvフラグメント
を含んでなり、ここで、前記のb)の一本鎖Fvフラグメントが、前記のa)の全長抗体に、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のC又はN末端のペプチドコネクタを介して融合される、三価の二重特異性抗体である。
a)ヒトErbB−1に特異的に結合し、且つ、2つの抗体重鎖及び2つの抗体軽鎖から成る全長抗体;
b)以下の:
ba)抗体重鎖可変ドメイン(VH);又は
bb)抗体重鎖可変ドメイン(VH)と抗体定常ドメイン1(CH1)、から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、VHドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちの一方のC末端に融合されていて、
ca)抗体軽鎖可変ドメイン(VL);又は
cb)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)と抗体軽鎖定常ドメイン(CL)、
から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドはVLドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちのもう片方のC末端に融合されている、
を含んでなり;そして
ここで、b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)とc)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)が一緒になって、ヒトc−Metに特異的に結合する抗原結合部位を形成する、三価の二重特異性抗体である。
i)重鎖可変ドメインの第44位〜軽鎖可変ドメインの第100位
ii)重鎖可変ドメインの第105位〜軽鎖可変ドメインの第43位、又は、
iii)重鎖可変ドメインの第101位〜軽鎖可変ドメインの第100位(付番は常にKabatのEUインデックスに準じる)。
ここで、前記界面は二価の二重特異性抗体の形成を促進するよう変更され、ここで、前記変更が:
a)二価の二重特異性抗体内のもう片方の重鎖のCH3ドメインの本来の界面と接触する、一方の重鎖のCH3ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ残基により置換され、それにより、もう片方の重鎖のCH3ドメインの界面内の腔に位置決定できる、一方の重鎖CH3ドメインの界面内に***部を生じるように、一方の重鎖のCH3ドメインが変更され、そして
b)三価の二重特異性抗体内の第1CH3ドメインの本来の界面と接触する、第2CH3ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、第1CH3ドメインの界面内の***部が位置決定できる第2CH3ドメインの界面内に腔を生じるように、もう片方の重鎖のCH3ドメインが変更されることにより更に特徴づけられる。
a)ヒトErbB−1に特異的に結合し、且つ、以下の:
aa)N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常重鎖ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ領域(HR)、抗体重鎖定常ドメイン2(CH2)、及び抗体重鎖定常ドメイン3(CH3)から成る2つの抗体重鎖;及び
ab)N末端からC末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、及び抗体軽鎖定常ドメイン(CL)から成る2つの抗体軽鎖(VL−CL);
から成る全長抗体;並びに
b)ヒトc−Metに特異的に結合する1つの一本鎖Fabフラグメント、
ここで、前記一本鎖Fabフラグメントが、抗体重鎖可変ドメイン(VH)と抗体定常ドメイン1(CH1)、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、抗体軽鎖定常ドメイン(CL)及びリンカーから成り、且つ、ここで、前記抗体ドメインと前記リンカーが、N末端からC末端に向かって、以下の順序:
ba)VH−CH1−リンカー−VL−CL、又は
bb)VL−CL−リンカー−VH−CH1、
のうちの一方を有し、
ここで、前記リンカーが少なくとも30個のアミノ酸、好ましくは32〜50個のアミノ酸から成るペプチドである、
を含んでなり、そして
ここで、前記のb)の一本鎖Fabフラグメントが、前記のa)の全長抗体に、その全長抗体の重鎖又は軽鎖ののC又はN末端の(好ましくは重鎖のC末端の)ペプチドコネクタを介して融合されている;
ここで、前記ペプチドコネクタは、少なくとも5個のアミノ酸、好ましくは10〜50個のアミノ酸から成るペプチドである、三価の二重特異性抗体である。
a)ヒトErbB−1に特異的に結合し、且つ、以下の:
aa)N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常重鎖ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ領域(HR)、抗体重鎖定常ドメイン2(CH2)、及び抗体重鎖定常ドメイン3(CH3)から成る2つの抗体重鎖;及び
ab)N末端からC末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、及び抗体軽鎖定常ドメイン(CL)から成る2つの抗体軽鎖(VL−CL);
から成る全長抗体;並びに
b)ヒトc−Metに特異的に結合する1つの一本鎖Fvフラグメント、
ここで、前記のb)の一本鎖Fvフラグメントが、前記のa)の全長抗体に、その全長抗体の重鎖又は軽鎖ののC又はN末端の(好ましくは重鎖のC末端の)ペプチドコネクタを介して融合され;そして
ここで、前記ペプチドコネクタは、少なくとも5個のアミノ酸、好ましくは10〜50個のアミノ酸から成るペプチドである、三価の二重特異性抗体である。
a)ヒトErbB−1に特異的に結合し、且つ、以下の:
aa)N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常重鎖ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ領域(HR)、抗体重鎖定常ドメイン2(CH2)、及び抗体重鎖定常ドメイン3(CH3)から成る2つの抗体重鎖;及び
ab)N末端からC末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、及び抗体軽鎖定常ドメイン(CL)から成る2つの抗体軽鎖(VL−CL);
から成る全長抗体;並びに
b)ヒトc−Metに特異的に結合する1つの一本鎖Fvフラグメント、
ここで、前記のb)の一本鎖Fvフラグメントが、前記のa)の全長抗体に、その全長抗体の重鎖のC末端のペプチドコネクタを介して融合され(2つの抗体重鎖−一本鎖Fv融合ペプチドをもたらし);そして
ここで、前記ペプチドコネクタは、少なくとも5個のアミノ酸である、三価の二重特異性抗体である。
a)ヒトErbB−1に特異的に結合し、且つ、以下の:
aa)N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常重鎖ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ領域(HR)、抗体重鎖定常ドメイン2(CH2)、及び抗体重鎖定常ドメイン3(CH3)から成る2つの抗体重鎖;及び
ab)N末端からC末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、及び抗体軽鎖定常ドメイン(CL)から成る2つの抗体軽鎖;
から成る全長抗体;並びに
b)以下の:
ba)抗体重鎖可変ドメイン(VH);又は
bb)抗体重鎖可変ドメイン(VH)と抗体定常ドメイン1(CH1)、から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、VHドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちの一方のC末端に融合されて(抗体重鎖−VH融合ペプチドをもたらし)、
ここで、前記ペプチドコネクタが5つのアミノ酸、好ましくは25〜50個のアミノ酸から成るペプチドである、
ca)抗体軽鎖可変ドメイン(VL);又は
cb)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)と抗体軽鎖定常ドメイン(CL)、
から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドはVLドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちのもう片方のC末端に融合されて(抗体重鎖−VL融合ペプチドをもたらし)、
ここで、前記ペプチドコネクタがb)のペプチドコネクタと同一である、
を含んでなり;そして
ここで、b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)とc)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)が一緒になって、ヒトc−Metに特異的に結合する抗原結合部位を形成する、三価の二重特異性抗体である。
a)ヒトErbB−1に結合し、2つの抗体重鎖、VH−CH1−HR−CH2−CH3及び2つの抗体軽鎖VL−CLから成る全長抗体;
(ここで、好ましくは2つのCH3ドメインのうちの一方がY349C、T366W突然変異を含んでなり、そして2つのCH3ドメインのうちのもう片方がS354C(又はE356C)、T366S、L368A、Y407V突然変異を含んでなる);
b)以下の:
ba)抗体重鎖可変ドメイン(VH);又は
bb)抗体重鎖可変ドメイン(VH)と抗体定常ドメイン1(CH1)、
から成るポリペプチド;
ここで、前記ポリペプチドはVHドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちの一方のC末端に融合されている;
ca)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、又は
cb)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)と抗体軽鎖定常ドメイン(CL)、から成るポリペプチド、ここで、前記ポリペプチドはVLドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちのもう片方のC末端に融合されている;
を含んでなり、そして
ここで、b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)とc)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)が一緒になって、ヒトc−Metに特異的に結合する抗原結合部位を形成する。
一実施形態では、本発明による多特異性抗体は四価であり、ここで、ヒトc−Metに特異的に結合する(単数若しくは複数の)抗原結合部位は、(例えばWO2009/007427に記載のように)c−Metの二量化を阻害する。
a)ヒトc−Metに特異的に結合し、且つ、2つの抗体重鎖と2つの抗体軽鎖から成る全長抗体;並びに
b)ErbB−1に特異的に結合する2つの同一の一本鎖Fabフラグメント、
を含んでなり、
ここで、前記のb)の一本鎖Fabフラグメントが、前記のa)の全長抗体に、その全長抗体の重鎖又は軽鎖のC又はN末端のペプチドコネクタを介して融合されている、四価の二重特異性抗体である。
a)ヒトErbB−1に特異的に結合し、且つ、2つの抗体重鎖と2つの抗体軽鎖から成る全長抗体;並びに
b)ヒトc−Metに特異的に結合する2つの同一の一本鎖Fabフラグメント、
を含んでなり、
ここで、前記のb)の一本鎖Fabフラグメントが、前記のa)の全長抗体に、その全長抗体の重鎖又は軽鎖のC又はN末端のペプチドコネクタを介して融合されている、四価の二重特異性抗体である。
a)ErbB−1に特異的に結合し、且つ、2つの抗体重鎖と2つの抗体軽鎖から成る全長抗体;並びに
b)ヒトc−Metに特異的に結合する2つの同一の一本鎖Fvフラグメント、
を含んでなり、
ここで、前記のb)の一本鎖Fvフラグメントが、前記のa)の全長抗体に、その全長抗体の重鎖又は軽鎖のC又はN末端のペプチドコネクタを介して融合されている、四価の二重特異性抗体である。
a)ヒトc−Metに特異的に結合し、且つ、2つの抗体重鎖と2つの抗体軽鎖から成る全長抗体;並びに
b)ErbB−1に特異的に結合する2つの同一の一本鎖Fvフラグメント、
を含んでなり、
ここで、前記のb)の一本鎖Fvフラグメントが、前記のa)の全長抗体に、その全長抗体の重鎖又は軽鎖のC又はN末端のペプチドコネクタを介して融合されている、四価の二重特異性抗体である。
a)ヒトErbB−1に特異的に結合し、且つ、以下の:
aa)N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常重鎖ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ領域(HR)、抗体重鎖定常ドメイン2(CH2)、及び抗体重鎖定常ドメイン3(CH3)から成る2つの同一の抗体重鎖;及び
ab)N末端からC末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、及び抗体軽鎖定常ドメイン(CL)から成る2つの同一の抗体軽鎖(VL−CL);
から成る全長抗体;並びに
b)ヒトc−Metに特異的に結合する2つの一本鎖Fabフラグメント、
ここで、前記一本鎖Fabフラグメントが、抗体重鎖可変ドメイン(VH)と抗体定常ドメイン1(CH1)、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、抗体軽鎖定常ドメイン(CL)及びリンカーから成り、且つ、ここで、前記抗体ドメインと前記リンカーが、N末端からC末端に向かって、以下の順序:
ba)VH−CH1−リンカー−VL−CL、又は
bb)VL−CL−リンカー−VH−CH1、
のうちの一方を有し、
ここで、前記リンカーが少なくとも30個のアミノ酸、好ましくは32〜50個のアミノ酸から成るペプチドである、
を含んでなり;そして
ここで、前記のb)の一本鎖Fabフラグメントが、前記のa)の全長抗体に、その全長抗体の重鎖又は軽鎖ののC又はN末端のペプチドコネクタを介して融合されている;
ここで、前記ペプチドコネクタは、少なくとも5個のアミノ酸、好ましくは10〜50個のアミノ酸から成るペプチドである、四価の二重特異性抗体である。
i)重鎖可変ドメインの第44位〜軽鎖可変ドメインの第100位
ii)重鎖可変ドメインの第105位〜軽鎖可変ドメインの第43位、又は、
iii)重鎖可変ドメインの第101位〜軽鎖可変ドメインの第100位(付番は常にKabatのEUインデックスに準じる)。
i)重鎖可変ドメインの第44位〜軽鎖可変ドメインの第100位
ii)重鎖可変ドメインの第105位〜軽鎖可変ドメインの第43位、又は、
iii)重鎖可変ドメインの第101位〜軽鎖可変ドメインの第100位。
本発明の1つの態様は、本発明による抗体を含んでなる医薬組成物である。本発明の別の態様は、医薬組成物の製造のための本発明による抗体の使用である。本発明の更なる態様は、本発明による抗体を含んでなる医薬組成物の製造のための方法である。別の態様では、本発明は、医薬担体と一緒に処方される本発明による抗体を含んでなる組成物、例えば医薬組成物を提供する。
配列番号1 重鎖可変ドメイン<ErbB−1>セツキシマブ
配列番号2 軽鎖可変ドメイン<ErbB−1>セツキシマブ
配列番号3 重鎖可変ドメイン<ErbB−1>ヒト化ICR62
配列番号4 軽鎖可変ドメイン<ErbB−1>ヒト化ICR62
配列番号5 重鎖可変ドメイン<c−Met>Mab 5D5
配列番号6 軽鎖可変ドメイン<c−Met>Mab 5D5
配列番号7 重鎖<c−Met>Mab 5D5
配列番号8 軽鎖<c−Met>Mab 5D5
配列番号9 重鎖<c−Met>Fab 5D5
配列番号10 軽鎖<c−Met>Fab 5D5
配列番号11 ヒトIgG1の重鎖定常領域
配列番号12 ヒトIgG3の重鎖定常領域
配列番号13 ヒト軽鎖カッパ定常領域
配列番号14 ヒト軽鎖ラムダ定常領域
配列番号15 ヒトc−Met
配列番号16 ヒトErbB−1
配列番号17 重鎖CDR3H、<ErbB−1>セツキシマブ
配列番号18 重鎖CDR2H、<ErbB−1>セツキシマブ
配列番号19 重鎖CDR1H、<ErbB−1>セツキシマブ
配列番号20 軽鎖CDR3L、<ErbB−1>セツキシマブ
配列番号21 軽鎖CDR2L、<ErbB−1>セツキシマブ
配列番号22 軽鎖CDR1L、<ErbB−1>セツキシマブ
配列番号23 重鎖CDR3H、<ErbB−1>ヒト化ICR62
配列番号24 重鎖CDR2H、<ErbB−1>ヒト化ICR62
配列番号25 重鎖CDR1H、<ErbB−1>ヒト化ICR62
配列番号26 軽鎖CDR3L、<ErbB−1>ヒト化ICR62
配列番号27 軽鎖CDR2L、<ErbB−1>ヒト化ICR62
配列番号28 軽鎖CDR1L、<ErbB−1>ヒト化ICR62
配列番号29 重鎖CDR3H、<c−Met>Mab 5D5
配列番号30 重鎖CDR2H、<c−Met>Mab 5D5
配列番号31 重鎖CDR1H、<c−Met>Mab 5D5
配列番号32 軽鎖CDR3L、<c−Met>Mab 5D5
配列番号33 軽鎖CDR2L、<c−Met>Mab 5D5
配列番号34 軽鎖CDR1L、<c−Met>Mab 5D5
材料と方法
組換えDNA技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載の標準的な方法を、DNAを操作するために使用した。分子生物学的試薬を製造業者の取扱説明書に従って使用した。
以下でヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する概説は:Kabat, E.A. et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242にある。抗体鎖のアミノ酸には、EUナンバリングに従って付番した(Edelman, G.M., et al., PNAS 63(1969)78-85; Kabat, E.A., et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242)。GCG(Genetics Computer Group、Madison, Wisconsin)のソフトウェアパッケージ バージョン10.2及びInfomaxのVector NTI Advance suiteバージョン8.0を、配列新規作成、マッピング、分析、アノテーション及び図示に使用した。
DNA配列を、SequiServe(Vaterstetten, Germany)及びGeneart AG(Regensburg, Germany)にて実施された二本鎖配列決定法によって決定した。
所望の遺伝子セグメントは、自動化遺伝子合成によって合成オリゴヌクレオチドとPCR産物からGeneart AG(Regensburg, Germany)で調製された。1つの制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接した遺伝子セグメントを、pGA18(ampR)プラスミド内にクローン化した。プラスミドDNAを形質転換細菌から精製し、そしてUV分光法によって濃度決定した。サブクローニングした遺伝子フラグメントのDNA配列を、DNA配列決定法で確認した。同じように、ペプチドコネクタで連結されているC末端<c−Met>5D5 scFab VH領域を持つ/持たないCH3ドメイン内にS354C及びT366Wが突然変異を保有する改変「ノブ−into−ホール」<ErbB−1>抗体重鎖、並びにペプチドコネクタで連結されているC末端<c−Met>5D5 scFab VL領域を持つ/持たない、Y349C、T366S、L368A、及びY407V突然変異を保有する「ノブ−into−ホール」<ErbB−1>抗体重鎖をコードするDNA配列を、隣接するBamHI及びXbaI制限部位を用いて遺伝子合成によって調製した。最後に、<ErbB−1>抗体及び<c−Met>5D5抗体の無改変重鎖及び軽鎖をコードするDNA配列を、隣接するBamHI及びXbaI制限部位によって合成した。すべての構築物をリーダーペプチド(MGWSCIILFLVATATGVHS)をコードする5’末端DNA配列を用いて設計し、そして真核細胞内での分泌のためのタンパク質を目的とした。
Roche発現ベクターを、すべての重及び軽鎖scFv融合タンパク質をコードする発現プラスミドの構築に使用した。ベクターは、以下の要素:
− 選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
− エプスタイン−バールウイルス(EBV)の複製開始点、oriP、
− E.コリ内でのこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からの複製開始点、
− E.コリ内でアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子、
− ヒト・サイトメガロウイルス(HCMV)からの前初期エンハンサー及びプロモーター
− ヒト1−免疫グロブリン・ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列、及び
− 固有のBamHI及びXbaI制限部位、
から構成される。
遺伝子組み換え免疫グロブリン変異体を、製造業者の取扱説明書(Invitrogen, USA)に従ってFreeStyle(商標)293発現系を使用したヒト胎児腎臓293−F細胞の一過性トランスフェクションによって発現した。簡単に言えば、懸濁液FreeStyle(商標)293−F細胞を、37℃/8%のCO2にてFreeStyle(商標)293発現培地中で培養し、そしてその細胞をトランスフェクションの日に1〜2×l06生存細胞/mlの密度で新しい培地中に植え付けた。DNA−293fectin(商標)複合体を、250mlの最終的なトランスフェクション体積に対して1:1モル比で、325μlの293fectin(商標)(Invitrogen, Germany)と250μgの重鎖又は軽鎖プラスミドDNAを使用したOpti-MEM(登録商標)I培地(Invitrogen, USA)中で調製した。「ノブ−into−ホール」DNA−293fectin複合体を、250mlの最終的なトランスフェクション体積に対して1:1:2モル比で、325μlの293fectin(商標)(Invitrogen, Germany)と、250μgの「ノブ−into−ホール」重鎖1及び2と、軽鎖プラスミドDNAを使用したOpti-MEM(登録商標)I培地(Invitrogen, USA)中で調製した。抗体を含有している細胞培養上清を、14000gで30分間の遠心分離及び滅菌濾紙(0.22μm)を通して濾過してトランスフェクションの7日後に採取した。上清を−20℃にて精製まで保存した。
三価の二重特異性抗体及び対照抗体を、Protein A-Sepharose(商標)(GE Healthcare、Sweden)を使用した親和性クロマトグラフィーとSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。簡単に言えば、滅菌濾過した細胞培養上清を、PBSバッファー(10mMのNa2HPO4、1mMのKH2PO4、137mMのNaCl及び2.7mMのKCl、pH、7.4)で平衡化したHiTrap ProteinA HP(5ml)カラムにかけた。非結合タンパク質を平衡化バッファーで洗い落とした。抗体と抗体変異体を、0.1Mのクエン酸バッファー、pH2.8で溶出し、そしてタンパク質含有画分を0.1mlの1M Tris(pH8.5)で中和した。次いで、溶出したタンパク質画分を貯留し、Amiconの超遠心濾過機デバイス(MWCO:30K、Millipore)を用いて3mlの体積まで濃縮し、20mMのヒスチジン、140mMのNaCl、pH6.0で平衡化したSuperdex200 HiLoad 120ml 16/60ゲル濾過カラム(GE Healthcare、Sweden)に投入した。高分子量集合体が5%未満しかない、精製された二重特異性抗体と対照抗体を含有する画分を貯留し、そして1.0mg/mlのアリコートとして−80℃にて保存した。Fabフラグメントを、精製した5D5モノクローナル抗体のパパイン消化と、それに続くプロテインAクロマトグラフィーによる夾雑Fcドメインの除去によって作り出した。非結合Fabフラグメントを、20mMのヒスチジン、140mMのNaCl、pH6.0で平衡化したSuperdex200 HiLoad 120ml 16/60ゲル濾過カラム(GE Healthcare、Sweden)で更に精製し、貯留し、そして1.0mg/mlのアリコートとして−80℃にて保存した。
精製タンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を使用し、280nmにて吸光度(OD)を計測することによって測定した。二重特異性抗体及び対照抗体の純度と分子量を、還元剤(5mMの1,4−ジチオスレイトール)の存在下と不存在下でのSDS−PAGE分析、そしてクーマシーブリリアントブルーでの染色によって分析した。NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen, USA)を、製造業者の取扱説明書に従って使用した(4−20%のトリスグリシン・ゲル)。二重特異性抗体及び対照抗体サンプルの凝集体量を、200mMのKH2PO4、250mMのKCl、pH7.0の泳動バッファー中、25℃にてSuperdex200分析用サイズ排除カラム(GE Healthcare、Sweden)を使用した高性能SECによって分析した。25μgのタンパク質を、0.5ml/分の流量にてカラム上に注入し、そして50分間かけて定組成で溶出した。安定性分析のために、1mg/mlの濃度の精製タンパク質を、4℃と40℃にて7日間インキュベートし、その後、高性能SECによって評価した。還元した二重特異性抗体軽鎖及び重鎖のアミノ酸骨格の完全性を、ペプチド−N−グリコシダーゼF(Roche Molecular Biochemicals)での酵素的処理によるN−グリカンの除去後のNanoElectrospray Q-TOF質量分析によって確認した。
6ウェルプレートの1ウェルあたり5x10e5個のA549細胞を、0.5%のFCS(ウシ胎仔血清)を含むRPMI中、HGF刺激の前日に植え付けた。翌日に、成長培地を、0.2%のBSA(ウシ血清アルブミン)を含むRPMIで一時間、置き換えた。次いで、5μg/mLの二重特異性抗体を培地に加え、そして細胞を、HGFを加えるまで10分間インキュベートし、50ng/mlの終濃度で更に10分間インキュベートした。それらを氷上に置いてすぐに、細胞を1mMのバナジウム酸ナトリウムを含有する氷冷PBSで一度洗浄し、そしてそれらを、100μLの溶解バッファー(50mMのTris−Cl pH7.5、150mMのNaCl、1%のNP40、0.5%のDOC、アプロチニン、0.5mMのPMSF、1mMのバナジウム酸ナトリウム)を用いて細胞培養プレート内で溶解した。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、そして溶解を氷上で30分間進めた。タンパク質濃度を、BCA方法(Pierce)を使用して測定した。30〜50μgの溶解物を、4−12%のBis-Tris NuPageゲル(Invitrogen)により分離し、そしてゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜を、5%のBSAを含有するTBS−Tで一時間ブロッキングし、そして製造業者の取扱説明書に従って、Y1230、1234、1235(44-888、Biosource)に対するリン酸化部位特異的c−Met抗体を用いて現像した。免疫ブロットを、非リン酸化c−Metに結合する抗体(AF276、R&D)で再検出した。
6ウェルプレートの1ウェルあたり5x10e5個のA431細胞を、10%のFCS(ウシ胎仔血清)を含むRPMI中、抗体追加の前日に植え付ける。翌日に、5μg/mLの対照又は二重特異性抗体を培地に加え、そして細胞を、更に1時間インキュベートする。それらを氷上に置いてすぐに、細胞を1mMのバナジウム酸ナトリウムを含有する氷冷PBSで一度洗浄し、そしてそれらを100μLの溶解バッファー(50mMのTris−Cl pH7.5、150mMのNaCl、1%のNP40、0.5%のDOC、アプロチニン、0.5mMのPMSF、1mMのバナジウム酸ナトリウム)を用いて細胞培養プレート内で溶解する。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、そして溶解を氷上で30分間進める。タンパク質濃度を、BCA方法(Pierce)を使用して測定する。30〜50μgの溶解物を、4−12%のBis-Tris NuPageゲル(Invitrogen)により分離し、そしてゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に移す。膜を、5%のBSAを含有するTBS−Tで一時間ブロッキングし、そして製造業者の取扱説明書に従って、Y1173(sc-12351、Santa Cruz)に対するリン酸化部位特異的EGFR抗体を用いて現像する。免疫ブロットを、非リン酸化EGFRに結合する抗体(06-847、Upstate)で再検出する。
6ウェルプレートの1ウェルあたり5x10e5個のA431細胞を、10%のFCS(ウシ胎仔血清)を含むRPMI中、抗体追加の前日に植え付ける。翌日に、5μg/mLの対照又は二重特異性抗体を培地に加え、そして細胞を、更に1時間インキュベートする。次いで、一部の細胞を、25ng/mLのHGF(R&D、294-HGN)で更に15分間刺激する。それらを氷上に置いてすぐに、細胞を1mMのバナジウム酸ナトリウムを含有する氷冷PBSで一度洗浄し、そしてそれらを100μLの溶解バッファー(50mMのTris−Cl pH7.5、150mMのNaCl、1%のNP40、0.5%のDOC、アプロチニン、0.5mMのPMSF、1mMのバナジウム酸ナトリウム)を用いて細胞培養プレート内で溶解する。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、そして溶解を氷上で30分間進める。タンパク質濃度を、BCA方法(Pierce)を使用して測定する。30〜50μgの溶解物を、4−12%のBis-Tris NuPageゲル(Invitrogen)により分離し、そしてゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に移す。膜を、5%のBSAを含有するTBS−Tで一時間ブロッキングし、そして製造業者の取扱説明書に従って、Thr308(Cell signaling、9275)に対するリン酸化部位特異的AKT抗体を用いて現像する。免疫ブロットを、アクチンに結合する抗体(Abcam、ab20272)で再検出する。
6ウェルプレートの1ウェルあたり5x10e5個のA431細胞を、10%のFCS(ウシ胎仔血清)を含むRPMI中、抗体追加の前日に植え付ける。翌日に、5μg/mLの対照又は二重特異性抗体を培地に加え、そして細胞を、更に1時間インキュベートする。次いで、一部の細胞を、25ng/mLのHGF(R&D、294-HGN)で更に15分間刺激する。それらを氷上に置いてすぐに、細胞を1mMのバナジウム酸ナトリウムを含有する氷冷PBSで一度洗浄し、そしてそれらを100μLの溶解バッファー(50mMのTris−Cl pH7.5、150mMのNaCl、1%のNP40、0.5%のDOC、アプロチニン、0.5mMのPMSF、1mMのバナジウム酸ナトリウム)を用いて細胞培養プレート内で溶解する。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、そして溶解を氷上で30分間進める。タンパク質濃度を、BCA方法(Pierce)を使用して測定する。30〜50μgの溶解物を、4−12%のBis-Tris NuPageゲル(Invitrogen)により分離し、そしてゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に移す。膜を、5%のBSAを含有するTBS−Tで一時間ブロッキングし、そして製造業者の取扱説明書に従って、Thr202/Tyr204(CellSignaling、Nr.9106)に対するリン酸化部位特異的Erk1/2抗体を用いて現像する。免疫ブロットを、アクチンに結合する抗体(Abcam、ab20272)で再検出する。
化合物処置の前日に、A549(1ウェルあたり4000個の細胞)又はA431(1ウェルあたり8000個の細胞)を、0.5%のFCSを含むRPMI中、96ウェルのE-Plate(Roche、05232368001)内の200μLの全容量の中に植え付けた。接着と細胞成長を、電気抵抗を観察する15分毎のスイープによりReal Time Cell Analyzer機器で一晩観察した。翌日、細胞を、5分毎にスイープしながらPBS中のそれぞれの抗体希釈物5μLと共にプレインキュベートした。30分後に、20ng/mLの終濃度をもたらす2.5μLのHGF溶液を加え、そして実験を更に72時間続けた。急激な変化を、180分間の1分毎のスイープで観察し、続いて残りの期間、15分毎のスイープで観察した。
a)結合アッセイ
c−Met及びErbB−1発現性細胞を剥離し、そしてカウントした。96ウェルのコニカルプレートの1ウェルあたり1.5×10e5個の細胞を植え付けた。細胞を、遠沈し(1500rpm、4℃、5分間)、そして2%のFCS(ウシ胎仔血清)を含むPBS中のそれぞれの二重特異性抗体の希釈系列50μL中で、氷上において30分間インキュベートした。細胞を、再度遠沈し、そして2%のFCSを含有するPBS200μLで洗浄し、続いて2%のFCS(Jackson Immunoresearch、109116098)を含有するPBSに希釈した、ヒトFcに対するフィコエリトリン結合抗体と一緒に30分間の2回目のインキュベーションを行った。細胞を、2%のFCSを含有するPBS200μLで2回、遠沈洗浄し、BD CellFix溶液(BD Biosciences)で再懸濁し、そして氷上で少なくとも10分間インキュベートした。細胞の平均蛍光強度(mfi)を、フローサイトメトリー(FACS Canto、BD)によって測定した。Mfiを、少なくとも2つの独立した染色の二重反復試験で決定した。フローサイトメトリースペクトルを、FlowJoソフトウェア(TreeStar)を使用して更に加工した。最大半減結合を、XLFit4.0(IDBS)及び用量応答ワンサイトモデル205を使用して決定した。
細胞は、剥離し、そしてカウントした。5×10e5個の細胞を、エッペンドルフチューブ内の50μLの完全培地中に入れ、5μg/mLのそれぞれの二重特異性抗体と一緒に37℃にてインキュベートした。表示した時点で細胞を氷上に保存し、タイムコースが完了するまで保存した。その後、細胞を、FACSチューブに移し、遠沈し(1500rpm、4℃、5分間)、PBS+2%のFCSで洗浄し、そして2%のFCS(Jackson Immunoresearch、109116098)を含有したPBS中に希釈した、ヒトFcに対するフィコエリトリン結合二次抗体50μLと一緒に30分間インキュベートした。細胞を、再度遠沈し、PBS+2%のFCSで洗浄し、そして蛍光強度をフローサイトメトリー(FACS Canto、BD)によって測定した。
細胞生存率と増殖をcell titer glowアッセイ(Promega)を使用することで定量化した。製造業者の取扱説明書に従ってアッセイを実施した。簡単に言えば、細胞を、96ウェルプレート内の100μLの全容量中で所望の期間、培養した。増殖アッセイのために、細胞を、インキュベーターから取り出し、そして室温にて30分間、静置した。100μLのcell titer glow試薬を加え、そしてマルチウェルプレートを2分間、オービタル振盪機にかけた。発光をマイクロプレートリーダー(Tecan)により15分後に定量化した。
Wst−1生存率と細胞増殖アッセイをエンドポイント分析として実施し、代謝的に活性な細胞の数を検出した。簡単に言えば、20μLのWst−1試薬(Roche、1164480700)を200μLの培地に加えた。色素の完全な現像まで、96ウェルプレートを更に30分間〜1時間インキュベートした。染色強度を、450nmの波長にてマイクロプレートリーダー(Tecan)により定量化した。
以下に発現され、そして精製された二重特異性<ErbB1−c−Met>抗体はすべて、以下に示すように最終的に修飾されたIgG1サブクラスの定常領域又は少なくともFcの一部(配列番号11のヒトIgG1定常領域)を含んでなる。
ErbB−1及びc−Metへの二重特異性抗体の結合(表面プラズモン共鳴法)
結合親和力を、25℃にて標準的な結合アッセイ、例えば表面プラズモン共鳴法などによって測定した(BIAcore(登録商標)、GE-Healthcare、Uppsala, Sweden)。親和性測定のために、30μg/mlの抗Fcγ抗体(ヤギ由来、Jackson Immuno Research)を、標準的なアミン・カップリングによってCM−5センサーチップの表面に結合させ、そしてSPR器具(Biacore T100)により化学的にブロッキングした。結合後に、単一又は二重特異性ErbB1/cMet抗体を、25℃、5μL/分の流速にて注入し、続いて30μL/分にてヒトErbB1又はc−Met ECDの希釈系列(0nM〜1000nM)を注入した。結合実験のためのランニングバッファーとしてPBS/0.1% BSAを使用した。次いで、前記チップを、10mMのグリシンHCl、pH2.0溶液の60秒パルスを用いて再生した。
二重特異性Her1/c−Met抗体フォーマットによるHGF誘発c−Met受容体リン酸化の阻害
二重特異性Her1/c−Met抗体のc−Met部分の機能性を確認するために、c−Metリン酸化アッセイを実施する。この実験では、A549肺癌細胞又はA431大腸癌細胞を、二重特異性抗体又は親対照抗体で処理した後にHGFに晒した。親又は二重特異性抗体の結合が、受容体リン酸化の阻害につながる。あるいは、当業者は、オートクリンHGFループを有する細胞、例えばU87MGを使用して、親又は二重特異性抗体の不存在下又は存在下でのc−Met受容体リン酸化を評価できる。
Her1/cMet二重特異性抗体での処置後のHer1受容体リン酸化の分析
二重特異性Her1/cMet抗体のEGFR結合部分の機能性を確認するために、A431を、親EGFR抗体又は二重特異性Her1/cMet抗体のいずれかと一緒にインキュベートする。
親又は二重特異性抗体が結合して、関係のないIgG対照抗体が結合しないことで、受容体リン酸化の阻害につながる。あるいは、当業者は更に、親又は二重特異性抗体の存在又は不存在下、EGFで刺激されてErbB1/Her1受容体リン酸化を引き起こす細胞も使用できる。
Her1/cMet二重特異性抗体での処置後のPI3Kシグナル伝達の分析
EGFR並びにc−Met受容体は、細胞増殖シグナルを伝えるPI3K経路を介してシグナル伝達できる。AKTのEGFR及びc−Met受容体リン酸化の同時標的化を実証するために、PI3K経路の下流標的を観察することもできる。このために、非刺激細胞、EGF若しくはHGFで処理した細胞又は両サイトカインで処理した細胞を、非特異的、親対照又は二重特異性抗体と一緒に並行してインキュベートした。あるいは、当業者は更に、ErbB1/Her1を過剰発現する細胞、及び/又はc−Metシグナル伝達を活性化するオートクリンHGFループを有する細胞を評価することもできる。AKTはPI3K経路の主要な下流シグナル伝達成分であり、そしてこのタンパク質のリン酸化はこの経路を介したシグナル伝達の重要な指標である。
Her1/cMet二重特異性抗体での処置後のMAPKシグナル伝達の分析
ErbB1/Her1及びc−Met受容体は、MAPK経路を介してシグナル伝達できる。ErbB1/Her1及びc−Met受容体の標的化を実証するために、MAPK経路の主要な下流標的であるERK1/2のリン酸化を観察することができる。このために、非刺激細胞、EGF又はHGFと共に処理した細胞又は両サイトカインで処理した細胞を、非特異的、親対照又は二重特異性抗体と一緒に並行してインキュベートした。あるいは、当業者は更に、ErbB1/Her1を過剰発現する細胞、及び/又はc−Metシグナル伝達を活性化するオートクリンHGFループを有する細胞を評価することもできる。
二重特異性Her1/c−Met抗体フォーマットによるHGF誘発HUVEC増殖の阻害
HUVEC増殖検定は、HGFの血管新生及び細胞***効果を実証するために実施することができる。HUVECに対するHGFの添加は、c−Met結合抗体によって用量依存様式で阻害され得る細胞増殖の増加をもたらす。
二重特異性Her1/c−Met抗体によるA431増殖の阻害
a)フローサイトメトリーにより独立に確認されているように、A431細胞は、高いHer1の細胞表面レベル及び中程度に高いc−Metの細胞表面発現を示している。二重特異性Her1/c−Met抗体によるA431増殖の阻害は、48時間後にCellTiterGlow(商標)アッセイにより計測した。結果を図8aに示す。対照はPBSバッファーであった。
第2の計測では、EGFR抗体であるセツキシマブ(0%の阻害)と一価のc−Met抗体である片腕5D5(OA5D5)(1%の阻害)の阻害効果はほとんど示されなかった。二重特異性Her1/c−Met抗体BsAB01(BsAb)(39%の阻害)は、A431細胞の癌細胞増殖の顕著な阻害を示した。EGFR抗体のセツキシマブと一価のc−Met抗体の片腕5D5(OA5D5)の組合せは、細胞増殖の顕著ではない減少に至った(20%の阻害)。
二重特異性Her1/c−Met抗体フォーマットによる癌細胞株DU14SにおけるHGF誘発細胞−細胞播種(分散)の阻害の分析
細胞のHGF誘発分散は細胞の形態学的変化を誘導し、そして細胞の円形化、糸状仮足様の突起、紡錘状の構造、及び細胞の特定の運動性をもたらす。二重特異性Her1/cMet抗体は、HGF誘発細胞−細胞播種を抑制した。
ErbB−1及びc−Mct発現癌細胞株における抗体媒介型受容体内部移行の分析
細胞の、Her1又はc−Metに特異的に結合する抗体とのインキュベーションが、受容体の内部移行を引き起こすことを示した。二重特異性抗体の内部移行能力を評価するために、抗体誘発受容体内部移行を検討するために実験構成を設計する。このために、OVCAR−8細胞((NCI Cell Line designation;NCI(国立癌研究所)から購入したOVCAR-8-NCI;Schilder RJ, et al Int J Cancer, 1990 Mar 15;45(3):416-22;Ikediobi ON, et al, Mol Cancer Ther. 2006;5;2606-12;Lorenzi, P.L., et al., Mol Cancer Ther. 2009; 8(4):713-24))(フローサイトメトリーで確認されたとおり、この細胞はHer1並びにcMetを発現する−図7bを参照のこと)を、37℃にてそれぞれの一次抗体と一緒に異なった期間(例えば0、30、60、120分=0、0.5、1、2時間(h))インキュベートした。細胞プロセスは、細胞を4℃に急速に冷やすことによって停止する。一次抗体のFcに特異的に結合する蛍光体を結合した二次抗体を、細胞表面に結合した抗体を検出するのに使用した。抗体−受容体複合体の内部移行は、細胞表面の抗体−受容体複合体を激減させるので、平均蛍光強度の減少を結果的にもたらす。内部移行はOvcar−8細胞において検討した。結果を以下の表及び図9に示す。それぞれの受容体の内部移行率(%)を、それぞれの抗体の内部移行を介して計測する(図9において、二重特異性<ErbB1−cMet>抗体BsAB01はcMet/Her1と示されており、親単一特異性の二価抗体は<HER1>及び<cMet>と示されている)。
糖鎖操作されたバージョンの二重特異性Her1/c−Met抗体の調製
二重特異性Her1/c−Met抗体のDNA配列を、各ベクターがEBV OriP配列を担持している、MPSVプロモーター及び合成ポリA部位の上流の制御下にある哺乳動物発現ベクター内にサブクローニングする。
二重特異性Her1/c−Met抗体の糖構造の分析
フコース及び非フコース(a−フコース)含有オリゴ糖構造の相対比の測定のために、精製した抗体材料の放出されたグリカンをMALDI−Tof−質量分析法によって分析する。今回、タンパク質骨格からオリゴ糖を放出するために、抗体サンプル(約50μg)を、0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0中の5mU N−グリコシダーゼF(Prozyme# GKE-5010B)と一緒に37℃にて一晩インキュベートする。それに続いて、放出されたグリカン構造物を、NuTip−Carbonピペットチップ(Glygenから入手:NuTip1〜10μl、Cat.Nr#NTlCAR)を使用して分離し、そして脱塩する。第1ステップとして、NuTip−Carbonピペットチップを、3μlの1M NaOHに続き、20μLの純水(例えばBaker製のHPLCグラジエントグレード、#4218)、3μLの30% 酢酸、そして再び20μLの純水で洗浄することによって、オリゴ糖の結合に向けて準備する。今回、それぞれの溶液を、NuTip−Carbonピペットチップ内のクロマトグラフィー材料の上部に添加し、そして圧力をかけてそれを通過させる。その後、10μgの抗体に相当するグリカン構造物を、先に記載のN−グリコシダーゼF消化産物を4〜5回ほど吸い上げたり吸い出したりすることによって、NuTip−Carbonピペットチップ内の材料に結合させる。NuTip−Carbonピペットチップ内の材料に結合したグリカンを、先に記載したやり方で20μLの純水で洗浄し、そしてそれぞれ0.5μLの10%と2.0μLの20% アセトニトリルを用いて段階的に溶出する。このステップのために、溶出溶液を、0.5mLの反応ベイル(reaction vails)内に充填し、そして各回毎に4〜5回吸い上げたり吸い出したりする。MALDI−Tof質量分析法による分析のために、両方の溶出液を組み合わせる。この計測において、0.4μLの組み合わせた溶出液を、MALDI標的上で1.6μLのSDHBマトリックス溶液(5mg/mlで20%のエタノール/5mMのNaCl中に溶解した2.5−ジヒドロキシ安息香酸/2−ヒドロキシ−5−メトキシ安息香酸[Bruker Daltonics#209813])と混合し、そして、適当に調整したBruker Ultraflex TOF/TOF装置で分析した。日常的には、50〜300ショットが、記録され、そして1回の実験にまとめられる。得られたスペクトルを、フレックス分析ソフトウェア(Bruker Daltonics)によって評価し、そして質量を検出したピークのそれぞれについて決定する。それに続いて、計算した質量を、それぞれの構造物(例えばそれぞれフコースを含む及び含まない複合体、ハイブリッド、及びオリゴ又は高マンノース)について理論的に予想した質量を比較することによって、ピークをフコース又はa−フコース(非フコース)含有グリコール構造物に割り当てる。
Her1/cMet二重特異性抗体での処置後の細胞遊走の分析
活性なc−Metシグナル伝達の1つの重要な側面は、遊走と侵襲的なプログラムの誘導である。c−Met阻害抗体の有効性は、HGF誘発細胞遊走の阻害を計測することによって測定できる。このために、HGF誘導性癌細胞株A431を、二重特異性抗体又はIgG対照抗体の存在下又は不存在下、HGFで処理し、そして8μmの細孔を遊走して通過した細胞の数を、インピーダンス読み出しを備えたCIMプレートを使用するAceaリアルタイム細胞分析装置により時間依存様式で計測する。
二重特異性Her1/c−Met抗体のインビトロADCC
本発明によるHer1/cMet二重特異性抗体は、両受容体を発現している細胞において(対応する単一特異性の親c−Met抗体と比較して)少ない内部移行を示す。少ない内部移行は、細胞表面の抗体−受容体複合体の長期暴露がNk細胞により認識されやすいので、これらの抗体を糖鎖操作することの理論的根拠を大いに裏付けている。少ない内部移行と糖鎖操作は、親抗体と比較して高い抗体依存性細胞傷害(ADCC)に置き換えられる。これらの効果を実証するインビトロ実験構成は、細胞表面にHer1とcMetの両方を発現する癌細胞、例えばA431、及びNk細胞株又はPBMCのもののようなエフェクター細胞を使用して設計できる。腫瘍細胞を、親単一特異性抗体又は二重特異性抗体と一緒に最長24hプレインキュベートし、続いてエフェクター細胞株を加える。細胞溶解物を定量し、そして単一特異性抗体と二重特異性抗体の識別を可能にする。
パラクリンHGFループを有する皮下異種移植モデルにおける二重特異性Her1/cMet抗体のインビボ有効性
Mrc−5細胞と同時注入される皮下のA549モデルは、c−Metのパラクリン活性化ループによく似ている。A549は、細胞表面にHer1並びにc−Metを発現する。A549及びMrc−5細胞は、対数増殖期において標準的な細胞培養条件下で維持される。A549とMrc−5細胞は、1000万個のA549細胞と100万個のMrc−5による10:1の比で注射される。細胞を、SCIDベージュマウスに移植する。腫瘍が定着し、そして100〜150mm3のサイズに達した後、処置を始める。マウスを、20mg/kgの抗体/マウスの負荷量で処置し、その後毎週一回、10mg/kgの抗体/マウスで処置する。腫瘍体積を1週間に二度計測し、そして動物の体重を平行して観察する。単一抗体の単独処置と組合せを、二重特異性抗体での治療法と比較する。
パラクリンHGFループを有する皮下異種移植モデルにおける二重特異性Her1/cMet抗体のインビボ有効性
Mrc−5細胞と同時注入される皮下のA431モデルは、c−Metのパラクリン活性化ループによく似ている。A431は、細胞表面にHer1並びにc−Metを発現する。A431及びMrc−5細胞は、対数増殖期において標準的な細胞培養条件下で維持される。A431とMrc−5細胞は、1000万個のA431細胞と100万個のMrc−5による10:1の比で注射される。細胞を、SCIDベージュマウスに移植する。腫瘍が定着し、そして100〜150mm3のサイズに達した後、処置を始める。マウスを、20mg/kgの抗体/マウスの負荷量で処置し、その後毎週一回、10mg/kgの抗体/マウスで処置する。腫瘍体積を1週間に二度計測し、そして動物の体重を平行して観察する。単一抗体の単独処置と組合せを、二重特異性抗体での治療法と比較する。
二重特異性Her1/cMet抗体によるOvcar−8増殖の阻害
a)フローサイトメトリーにより独立に確認されているように、Ovcar−8細胞は、高いHer1の細胞表面レベル及び中程度に高いc−Metの細胞表面発現を示している。二重特異性Her1/c−Met抗体によるOvcar−8増殖の阻害は、48時間後にCellTiterGlow(商標)アッセイにより計測した。結果を図10aに示す。対照はPBSバッファーであった。
Claims (10)
- ヒトErbB−1と特異的に結合する第1の抗原結合部位及びヒトc−Metに特異的に結合する第2の抗原結合部位を含んでなる、ヒトErbB−1及びヒトcMetに特異的に結合する二重特異性抗体であって、
フローサイトメトリーアッセイにおいて2時間後に計測した場合に、OVCAR−8細胞上での、当該二重特異性抗体の不存在下でのc−Metの内部移行と比較して5%以下のc−Metの内部移行を示し、
前記二重特異性抗体が、ヒトErbB−1に特異的に結合する2つの抗原結合部位及びヒトc−Metに特異的に結合する第3の抗原結合部位を含む、三価の抗体であると共に、
前記二重特異性抗体が、IgG1又はIgG3サブクラスの定常領域を含むことを特徴とする前記二重特異性抗体。 - 以下の:
a)ErbB−1に特異的に結合し、且つ、2つの抗体重鎖と2つの抗体軽鎖から成る全長抗体;並びに
b)ヒトc−Metに特異的に結合する1つの一本鎖Fabフラグメント、
を含んでなり、
ここで、前記のb)の一本鎖Fabフラグメントが、前記のa)の全長抗体に、当該全長抗体の重鎖又は軽鎖のC又はN末端のペプチドコネクタを介して融合されていることを特徴とする、請求項1に記載の抗体。 - 以下の:
i)前記第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン内に配列番号17のCDR3H領域、配列番号18のCDR2H領域、及び配列番号19のCDR1H領域を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメイン内に配列番号20のCDR3L領域、配列番号21のCDR2L領域、及び配列番号22のCDR1L領域を含んでなり;そして
前記第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン内に配列番号29のCDR3H領域、配列番号30のCDR2H領域、及び配列番号31のCDR1H領域を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメイン内に配列番号32のCDR3L領域、配列番号33のCDR2L領域、配列番号34のCDR1L領域を含んでなるか;
ii)前記第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン内に配列番号23のCDR3H領域、配列番号24のCDR2H領域、配列番号25のCDR1H領域を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメイン内に配列番号26のCDR3L領域、配列番号27のCDR2L領域、及び配列番号28のCDR1L領域を含んでなり、そして
前記第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン内に配列番号29のCDR3H領域、配列番号30のCDR2H領域、及び配列番号31のCDR1H領域を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメイン内に配列番号32のCDR3L領域、配列番号33のCDR2L領域、配列番号34のCDR1L領域を含んでなる、
を特徴とする、請求項1に記載の二重特異性抗体。 - 以下の:
i)ErbB−1に特異的に結合する前記第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号1の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号2の配列を含んでなり;そして
c−Metに特異的に結合する前記第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号5の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号6の配列を含んでなるか;又は
ii)ErbB−1に特異的に結合する前記第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号3の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号4の配列を含んでなり;そして
c−Metに特異的に結合する前記第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号5の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号6の配列を含んでなる、
を特徴とする、請求項3に記載の二重特異性抗体。 - 前記抗体がAsn297にて糖鎖でグリコシル化されていることで、当該糖鎖内のフコース量が65%以下であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の二重特異性抗体をコードする核酸。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の二重特異性抗体を含んでなる医薬組成物。
- 癌治療のための請求項7に記載の医薬組成物。
- 癌治療のための、請求項1〜5のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 癌の治療薬の製造のための、請求項1〜5のいずれか1項に記載の二重特異性抗体の使用。
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