JPS63501471A

JPS63501471A - インタ−フェロンの精製方法

Info

Publication number: JPS63501471A
Application number: JP86500450A
Authority: JP
Inventors: 直樹東; 俊二郎杉本; 雅文辻本; 白澤　邦内; 勉岡田; 山本　和守; ナガブシャン，タッタナハリ・エル; トロッタ，ポール・フィリップ
Original assignee: サントリー株式会社
Priority date: 1984-12-27
Filing date: 1985-12-26
Publication date: 1988-06-09
Also published as: NO863424L; FI863378A0; AU5304886A; EP0227834A1; WO1986004067A1; FI863378A; DK407386D0; KR930007429B1; US4828990A; DK407386A; AU598455B2; NO863424D0; HU201775B; HUT41812A; KR870700635A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】インターフェロンの精製方法（技術の分野）本発明は組み換えＤＮＡ技術によって得られる生理活性を有するポリペプチド、特に生理活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターによって形質転換された微生物によって生産されるポｌｊ−？プチドを変性することなく、かつプロテアーゼによって分解されることなく精製する方法に関する。本発明はインターフェロン、特にヒト免疫インターフェロン（または、ガンマインターフェロン）活性を有するポリＲゾチド生産微生物の培養物から目的ポリペプチドを精製するのに有効な方法を提供するものである。

（技術背景）インターフェロン蛋白は抗原性及び構造の差異に基きα−βおよびγの３種（各々、工ＦＮ−α、工ＦＮ−βおよびＩＦＮ−γと略す）に分類されている。ＩＦＮ−ｒはＩＦＮ−αおよび工ＦＮ−βと区別される多くの特徴を持っている。それらの差異としては抗原区別性と免疫調節および抗腫瘍効果についてのよシ強い作用とである。ヒトＩＦＮ−γ（以下、ｈ−工ＦＮ−γと略す）は’ｌ’　−リン、ｅ球が感作される免疫原または抗原によって刺激されたＴ−リンパ球によって生産することができる。

更に、と）−ＩＦＮ−γは従来技術で知られているクローニング及び発現技術によシ生産することもできる。

近年、遺伝子工学的手法の進展によシ、従来は生体からの分離、ｎ製に頼っていた多くの生理活性ポリペプチド９を微生物や動物細胞から生産することが可能となった。しかしながら、それらの目的物質を薬剤として使用するのに十分な程純粋に、しかも変性や分解を受けることなく抽出・精製する方法は未だ十分確立されているとは言えない。

しかしながら、得られた工ＦＮ−γ含有細胞を集め、浸透圧ショック、超音波振動、粉砕または高剪断力破砕のような種々の手段で破砕し、そして破砕された細胞／工ＦＮ−、混合物を次いで処理してＩＦＮ−γを単離している。不溶性の破砕片は遠心分離によって除去され、ＩＦＮ−ｒを含有する上清は精製のために集められる。

組換え微生物の生産するポリペプチドを塩酸グアニジンや尿素などを用いて抽出、精製する方法（特開昭５９−１６１３２１号公報および米国特許４４７へ０４９）や、モノクローナル抗体を用いた精製法（特開昭５９−１８６９９５号公報）など精製法に関する技術が開示されているが、これらの方法においても、目的物質が変性を受けず、その活性が損われることなく十分精製され得るとは限らない。

ヨーロッパ特許出願Ｑ　０８７．６８６は細胞を含まない上清からまた粗インターフェロン原料からの抽出液から、ヒト免疫インター７エロ／のための３工程精製法が開示されている。第１工程（天然産出インターフェロンについて）ではコンカナバリン−Ａセファロースのようなアフィニティーカラムが使用され、次いで増加塩濃度勾配を用いるカルボキシメチルシリカカラムによるクロマトグラフィーを行い、最後にシリカゲル透過カラムによるクロマトグラフィーを行う。もし十分な純度が得られない場合、ＴＳＫまたはＣＭのいずれかのカラムによる濃縮およびクロマトグラフィーが用いられる。

ヨーロッパ特許出願ＱＯ６３，４８２には１）制御された孔性ガラスヒ−，ｌ：、２）　コンカバリン−Ａセファロース、３）ヘパリン−セファロースまたはプロジオンレッド−アガロース、および４）ゲル濾過、を用いるクロマトグラフィー技術を用いる精製法が開示されている。

ヨーロッパ特許出願Ｑ　１０７．４９８および０．０　？　７．６７０には１）ポリエチレンイミン沈澱；２）細菌蛋白質のｐＨ沈澱；３）濃縮および透析；および４）ａ）カルボキシメチルセルロース％　ｂ）！Ｊン酸カルシウムゲル、Ｃ）カルボキシメチルセルロースおよびｄ）ゲル濾過樹脂、によるクロマトグラフィー；を用いる精製方式が開示されている。

これらの精製法は複数工程を必要とし、インターフェロン分子の分解または凝集によるインターフェロンの劣化を生じるか、またはそうでなければ、低い収率でまたは低い活性の工ＦＮ−γ生成物しか得られない。

特に目的物質の生理活性を損うことなく、あるいは変性を伴うことなく目的物質生産微生物の培養物からの目的ポリペプチドを抽出、ｎ＃する技術はそのポリペプチドを医薬品として使用する場合に重要であシ、その技術の確立が産業上有用であることは言をまたない。

このような精製技術は、現在医薬品としての利用が進められているインターフェロンについて特に望まれている。インターフェロンは抗ウィルス活性を有するが、その中でもＩＦＮ−γは特に細胞増殖抑制作用が強いことから、抗ウィルス剤の他、抗腫瘍剤、免疫調節剤としての利用が期待される。また、インターフェロン活性は種特異性があることから、例えばそれらを薬剤としてヒトに用いる場合、ヒト由来のインターフェロンを用いることが望まれる。遺伝子工学的に生産されるインターフェロンでは特にその抽出、精製工程の確立が望まれている。

通常、組換え微生物からのポリペプチドの抽出、精製においては、まず培養微生物を殺菌剤を用いて死菌としだ後（安全性の面から必須の工程）、菌体を破砕し、続いて抽出操作に付す。

これらの処理において目的とするポリはプチドが変性したシ、その活性が損われることがある。また、これらの処理は菌体に含まれるプロテアーゼの活性化をおこしやすく目的ポリはプチドが分解されることもある。

これまで、組換え微生物から目的ポリペプチドを精製する場合、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤で変性、可溶化させた蛋白を抽出し、精製過程で変性剤を除く手法が開示されている（前掲、特開昭５９−１６１３２１号公報、米国特許４．４７６．０４９等）。しかしながら、変性剤を除去しても目的ポリペプチドが完全に復元した保証を得るのは困難である。従って、この方法は目的ポリペプチドを医薬品として使用する場合は好しいことではない。なぜなら、一部変性したものが混在する場合は、抗原ともなシうるからである。

一方、モノクローナル抗体を用いた精製法も報告されていやが（前掲、特開昭５９−１８６９９５など）、使用するモノクローナル抗体の認識する抗原決定基によっては変性された好しくないポリペプチドや、二量体、二量体のような重合したポリはプチドも結合し得ることが考えられる。最近、ポリペプチドのプロテアーゼによる分解を阻止する目的で、プロテアーゼインヒビター共存下で組換え大腸菌の生産するｈ−ＩＦＮ−γを抽出する方法が前掲米国特許に開示されたが、ここで用いられる塩酸グアニジンは蛋白変性剤としても知られておシ（例えば、特開昭５９−１６１３２１号公報）、プロテアーゼによるポリはプチドの切断は抑制し得るが、変性蛋白が生成されることが予想される。

更に、１）ガンマインターフェロンが生産された細胞の破砕の細胞片からガンマインターフェロンを分離する精製方式を提供し；２）細胞不純物から高収率で、しかも高純度、高活性のガンマインターフェロンを分離し；３）組換えガンマインターフェロンを細胞不純物から分離し；４）実質上インターフェロンを分解することなく細胞不純物からガンマインターフェロンを分離する；ことが好しいであろう。以下に述べる方法がその好しい分離方法である。

本発明における精製方法はポリペプチドの変性を伴うことなく、また、プロテアーゼによるポリペプチドの分解を抑えつ＼、効率良く、実質的に純粋な目的生理活性を有するポリペプチドを提供しようとするものである。尚、本発明は便宜上ｈ−ＩＦＮ−γ活性を有するポリペプチドの精製について以下に説明するが、本発明の方法は組換え微生物の産生するＡｒｇ−ＬｙｓやＡｒｇ−Ａｒｇなどのプロテアーゼ分解を受け易いような部位を含むｈ−１ＦＮ−γ以外のポＩＪｓプテドの抽出、精製にも適用でき本発明によれば、抽出工程において亜鉛または銅の塩類の１種または２種以上とポリエチレンイミン（以下、ＰＥＩと略す）を添加することによシ上記の問題点を解決した。更に詳細には、組換え微生物の培養菌体を亜鉛または銅の塩類の１種または２種以上を含む緩衝液で懸濁し、菌体を破砕し、次にその遠心上清にＰＥＩを添加し、続いて適当な精製工程に移ることによシ目的を達することができる。

使用される亜鉛または銅の塩類としては種々の化合物が考えられるが、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸亜鉛、亜鉛アセチルアセトネート、硫酸銅等があるが、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、硫酸銅が好しい。また、これら塩類の添加量は生産菌株によって最適濃度に違いが認められるが、一般的には亜鉛の塩類の場合、０．５〜５ｍＭ、好しくけ１〜３ｍＭであシ、銅の塩類では０．０１〜３ｍＭ、好しくけ０．２５〜１ｍＭの濃度である。

これらの塩類を上記濃度で緩衝溶液に配合し、培養終了後の菌体をこの溶液中に懸濁後、菌体を破砕し、遠心によシ上清を得る。この上清にＰＥＩを添加する。

ＰＥＩは最終濃度が０．５〜１．１％になるような量で添加される。ＰＥ工添加は相当量の不純な蛋白を沈澱せしめる役割も有す。ＰＥ工添加後上滑液を充分低温（例えば、４℃前後）に放置する。次に、生ずる沈澱を遠心・除去した後、常法による精製工程に入る。精製は従来よシ用いられている種々のカラム、透析法を適宜組み合わせて行なえる。場合によシ、塩析を工程中に含めることもある。

詳しくは後述する実施例で説明する。

本出願以前に、工ＦＮ−β生産に際して培養培地に亜鉛塩類を添加すると工Ｆ’ Ｎ−βの生産性が上がるという報告がちるが（特開昭５９−１４６５９７号公報）、単に培養時の力価向上を目的としたもので、！、本発明のようにＰＥＩと共に抽出時に添加することについては何ら記載されていない。銅化合物の精製段階における使用については、特開昭５９−１６７５９７号公報で銅キレート樹脂カラムを使用する例が報告されているが、その発明は予備精製したＩＦＮ溶液の精製法に関するものである。これらの発明も含め、終始蛋白を変性および分解させることなく精製することを目的に抽出時に、これら金属塩を添加することを特徴とする本発明とは本質的に異なるものである。

本発明のもう１つの目的として、本発明の抽出、精製法によって得られたｈ−ＩＦＮ−γ活性を有する実質的に純粋なポリペプチドの提供があげられる。

本発明で述べるｈ−工ＦＮ−γ活性を有するポリはプチド生産株の１つであるＷ３１１０／１：１ＩＮ５Ｔ４　の造成についてはヨーロッパ特許出願Ｑ１３４，６７３に開示されている。この生産株によって生産されるポリはプチドはＧ工Ｆ ’１４５と命名され次のアミノ酸配列（１）で示される。

Ａｈａ　Ｇｌｕ　Ａｅｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　ＡｌａＧａｙ　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｎ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＴｈｒＧｌｎ　工１ｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈ５Ｌｙｅ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　工１θ　ＧｌｎＬｙｅ　Ｓｅｒ　Ｍａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ＭｅｔＡｓｎ　Ｍａｌ　Ｌｙ８　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＬｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇ’ｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＴｙｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｎ　Ｇｌｎ　ＡｒｇＬｙｓ　Ａｌａ　工ｍｅ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｉ’ｌｅ　Ｇｌｎ　ＶａＩＭｅｔＡｈａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＧｌｙＬｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｃ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ＡｒｇＧｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　（１）とのＧ工Ｆ１４５生産株は下記のＧＩＦ１４５をコードするＤＮＡ配列（Ｉ［）で示すＤＮＡ断片を含むプラスミドベクター大腸菌Ｗ３１１０を形質転換したものである。

ＴＧＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧ　ＧＡＣＣＣＡ　ＴＡＣＧＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＡＡＣＧ　ＡＴＧ　ＡＣＧ　ＧＴＣＣＴＧ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＣＡＣＴＴＣＣＴＴＧＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡＣＣＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＡＣＴＴＣＡＡＣＧＣＴＣＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＧ　ＧＡＣＴＴＣＴＴＴ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＧ　ＣＧＡＧＧＴ　ＣＡＴ　ＴＣＴ　ＧＡＣＧＴＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣＡＡＣＧＧＴ　ＡＣＴＣＣＡ　ＧＴＡ　ＡＧＡ　ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＣＧＡ　ＣＴＧ　ＴＴＧ　ＣＣＡ　ＴＧＡＣＴＧ　ＴＴＣＣＴＧ　ＧＧＴ　ＡＴＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＣＴＧＧ　ＡＡＡＧＡＣＡＡＧ　ＧＡＣＣＣＡ　ＴＡＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＴＴＧ　ＡＣＣＴＴＴＧＡＡ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　ＧＡＣＣＧＴ　ＡＡＡ　ＡＴＣＡＴＧ　ＣＡＧ　ＴＣＴＣＴＴ　ＣＴＴ　ＡＧＡ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＴＴＴ　ＴＡＧ　ＴＡＣＧＴＣＡＧＡＣＡＧ　ＡＴＣＧＴＴ　ＴＣＴ　ＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧ　ＣＴＧ　ＴＴＣＧＴＣＴＡＧ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡ　ＡＡＣＴＴＣＡＡＧ　ＧＡＣＧＡＣＣＡＧ　ＴＣＴ　ＡＴＣＣＡＧＴＴＴ　ＴＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣＡＧＡ　ＴＡＧ　ＧＴＣＡＡＡ　ＴＣＴ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＡＴＣＡＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＣＡＴＧＴＴＴ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＡＧ　ＴＴＣＣＴＴ　ＣＴＧ　ＴＡＣＡＡＣＧＴＴ　ＡＡＧ　ＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＴ　ＡＡＣＡＡＧ　ＡＡＡＴＴＧ　ＣＡＡ　ＴＴＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＴＴＧ　ＡＧＡ　ＴＴＧ　ＴＴＣＴＴＴＡＡＧ　ＣＧＴ　ＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧＡＡ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ＡＡＣＴＴＣＧＣＡ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＴＴＣＧＡＡ　ＴＧＡ　ＴＴＧＴＡＣＴＣＴ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　ＧＡＣＣＴＴ　ＡＡＴ　ＧＴＡ　ＣＡＧ　ＣＧＴＡＴＧ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＴＧＡ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴＡ　ＣＡＴ　ＧＴＣＧＣＡＡＡＡ　ＧＣＴ　ＡＴＣＣＡＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＧＴＴ　ＡＴＧＴＴＴ　ＣＧＡ　ＴＡＧ　ＧＴＡ　ＣＴＴ　ＧＡＣＴＡＧ　ＧＴＣＣＡＡ　ＴＡＣＧＣＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＴＣＣＣＣＧ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＡＣＴ　ＧＧＴＣＧＡ　ＣＴＴ　ＧＡＣＡＧＧ　ＧＧＣＣＧＡ　ＣＧＡ　ＴＴＴ　ＴＧＡ　ＣＣＡＡＡＧ　ＣＧＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＴＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＴＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧ　ＧＣＡＧＧＴ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＴＡＡＣＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＣＧＡ　ＡＧＡ　ＧＴＣＡＴＴ　（Ｉ［）一方、ｈ−ＩＦＮ−ｒ活性を有し、次のアミアミノ酸配列＠）で示されるポリペブチ）；”（ＧＩＦ１４３と言う）の生産株（ｗ３１１０／ｐ工Ｎ５Ｔ４Ｎ１４３）は参考例で詳しく説明するが以下のように造成することができる。

Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　５ｅｒＡｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｅｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　ＬｅｕＧｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　５ｅｒＡｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　工ｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　ＩＩｓ　ＶａｌＳｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈ８Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ＰｈｅＬｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇ’ｌｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｌｙｅ　Ｓｅｒ　ＶａＩＧｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｃｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｍａｌ　ＬｙｅＰｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａａｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　ＡｓｐＡｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａａｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＭａｌＴｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｍａｌ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｅ　Ａｌａ　工１ｅＨ１ｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｅ　ＶａＩＭｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＬｅｕＳｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｈａ　Ａｈａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　ＬｙｓＡｒｇ　Ｓａｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＡｒｇＡｘａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　（Ｉｎ）（尚、Ｇｌｎ　はＧｌｎまたはｐ−Ｇｌｎを示す。）また、このポリペプチド” （Ｇ工Ｆ’１４３）　をコード−ｉるＤＮＡ配列で示されるＤＮＡ断片が目的プラスミドベクターの造成に使用できる。

ＣＡＧ　ＧＡＣＣＣＡ　ＴＡＣＧＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡＣＧＴＣＣＴＧ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＣＡＣＴＴＣＣＴＴ　ＣＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＧＣＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＡＣＴＴＣＡＡＣＧＣＴ　ＧＧＴ　ＣＡＴ　ＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＴＴ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＧ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＧＴＡ　ＡＧＡＧＡＣＧＴＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣＡＡＣＧＧＴ　ＡＣＴ　ＣＴＧ　ＴＴＣＣＴＧＣＴＧ　ＣＡＡ　ＣＧＡ　ＣＴＧ　ＴＴＧ　ＣＣＡ　ＴＧＡ　ＧＡＣＡＡＧ　ＧＡＣＧＧ’ｌ’　ＡＴＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＣＴＧＧ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＴＣＴＣＣＡ　ＴＡＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＴＴＧ　ＡＣＣＴＴＴ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＡＧＡＧＡＣＣＧＴ　ＡＡＡ　ＡＴＣＡＴＧ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＡＴＣＧＴＴＣＴＧ　ＧＣＡ　ＴＴＴ　ＴＡＧ　ＴＡＣＧＴＣＡＧＡ　ＧＴＣＴＡＧ　ＣＡＡＴＣＴ　ＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧ　ＣＴＧ　ＴＴＣＡＡＡ　ＡＡＣＴＴＣＡＧＡ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＣＧＡＣＡＡＧ　ＴＴＴ　ＴＴＧ　ＡＡＧＡＡＧ　ＧＡＣＧＡＣＣＡＧ　ＴＣＴ　ＡＴＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＴＣＴＧＴＴＴＴＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣＡＧＡ　ＴＡＧ　ＧＴＣＴＴＴ　ＡＧＡ　ＣＡＡＧＡＡ　ＡＣＴ　ＡＴＣＡＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＣＡＴＧ　ＡＡＣＧＴＴ　ＡＡＧＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＡＧ　ＴＴＣＣＴＴ　Ｃ！ＴＧ　ＴＡＣＴＴＧ　ＣＡＡ　ＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＴ　ＡＡＣＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＣＧＴ　ＧＡＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＴＴＧ　ＡＧＡ　ＴＴＧ　ＴＴＣＴＴＴ　ＴＴＣＧＣＡ　ＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＡ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ＡＡＣＴＡＣＴＣＴ　ＧＴＴＣＴＧ　ＡＡＧ　ＣＴ、Ｔ　ＴＴＣＧＡＡ　ＴＧＡ　ＴＴＧ　ＡＴＧ　ＡＧＡ　ＣＡＡＡＣＴ　ＧＡＣＣＴＴ　ＡＡＴ　ＧＴＡ　ＣＡＧ　ＣＧＴ　ＡＡＡ　ＧＣＴ　ＡＴＣＴＧＡ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴＡ　ＣＡＴ　ＧＴＣＧＣＡ　ＴＴＴ　ＣＧＡ　ＴＡＧＣＡＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧＧＴＡ　ＣＴＴ　ＧＡＣＴＡＧ　ＧＴＣＣＡＡ　ＴＡＣＣＧＡ　ＣＴＴ　ＧＡＣＴＣＣＣＣＧ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＡＡＧ　ＣＧＴ　ＡＡＡＡＧＧ　ＧＧＣＣＧＡ　ＣＧＡ　ＴＴＴ　ＴＧＡ　ＣＣＡ　ＴＴＣＧＣＡ　ＴＴＴＡＧＡ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＴＴＣＣＧＴ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＣＧＴＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＴＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＴＡＡＣＧＡ　ＡＧＡ　ＧＴＣＡＴＴ　（■）（図面の簡単な説明）第１図は本発明のｎ製方法が適用されるＧＩＦ１４３を生産するだめの大腸菌形質転換用プラスミドベクターｐＩＮ５Ｔ４Ｎ１４３の造成経路を説明する図である。

第２図は本発明のガンマインターフェロン精製方法の好しい態様を示すフローダイアダラムである。

第３図は主としてクロマｈダラフイー精製手段を示す本精製方法のよシ好しい態様のフローダイアダラムである。

第４図は本発明の特に好しい態様のフローダイアダラムである。

第５図は、各種濃度の塩化亜鉛を含む緩衝液中で菌体（Ｗ３１１０／ｐＩＮ５Ｔ４Ｎ１４６　）を破砕しその上清を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　にかけて得られる蛋白バンドを示す写真である。

第６図は、塩化亜鉛に代えて硫酸銅を使用して得られる５ＤＳ−ＰＡＧＥ　の蛋白バンドを示す写真である。

第７図は各種濃度の塩化亜鉛を含む緩衝液中で菌体（ｗ３１．１０／ｐ工Ｎ５Ｔ４Ｎ１４３を破砕し、その上清を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　にかけて得られる蛋白バンドを示す写真である。

添付の図面第１図を参照して説明すると、まずｐＧ工Ｆ’５４（特開昭５８−２０１９９５中に開示されているｐＧ工Ｆ４と実質的に同じプラスミド）のＡｓｔｌｌとＢｇ１１１切断によシ得られるＤＮＡ断片を、さらにＡｖａｌ［で処理し、第１図に示す様なＡｖａｌｌ　−Ｂｇｌｌｌ断片を得る。次に、この断片のＡｖａ［サイトと、ｐＩＮ５Ｔ４　（ヨーロッパ特許出願Ｑ１３４，６７３に開示）をＢｇｌ［とＥｃｏＲＩで処理して得られるテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃｒ）を持つ長い方のＤＮＡ断片のＥｃｏＲＩサイトの間に、両端にＥｃｏＲＩとＡｖａ［ｌのサイトを持つ合成リンカ−ＤＮＡリガーゼの存在下に挿入することによシ、目的とするプラスミドｐＩＮ５Ｔ４Ｎ１４３を得る。これは、ＧＩＦ ’１４５のＮ末端側の３個のアミノ酸残基からなる配列、　Ｃｙｓ　−Ｔｙｒ− Ｃｙｓ配列が欠除したポＩＪ−ｅプチドＧ工Ｆ１４３に対応する遺伝子を含んでいる。続いて、このプラスミドル工Ｎ５Ｔ４Ｎ１４３によシ宿主（Ｅ、Ｃｏ１１Ｗ３１１０）を常法によシ形質転換して、ＧＩＦ’１４３生産形質転換大腸菌株（Ｗ３１１０／ｐ工Ｎ５Ｔ４Ｎ１４３　）を得る。

全ての図面において、精製方法はホモジナイズされたガンマインターフェロン含有細胞の遠心分離によって生じる上清から、核酸を除去することから開始される。それ以前の工程は説明のために示されているが本発明の一部ではない。

なお、実施例においては亜鉛の塩類として塩化亜鉛を用いた精製例を述べるが、塩類としてはこれに限ることなく、例えば硫酸亜鉛や酢酸亜鉛のような亜鉛の塩類、また硫酸銅のような銅の塩類を用いてもよい。第１表は、種々の金属塩化合物のプロテアーゼ阻害効果を、それらの化合物を１ｍＭと０．２　ｍ　Ｍ含む緩衝溶液中で組換え菌体を破砕し、その上清に含まれるｈ−ＩＦＮ−γ活性を有するポリペプチドの安定性を指標にして調べたものである。第１表から明らかなように塩化亜鉛の他に硫酸亜鉛、酢酸亜鉛、亜鉛アセチルアセトネート、硫酸銅などが効果があることがわかる。

第１表：　Ｚｎ、Ｃｕおよび他の金属塩の添加によるポリペプチドに対するプロテアーゼ分解阻止効果ポリペプチドの分解阻止効果塩化亜鉛　十　− （ＩＩＩｔ酸並鉛　十　− 酢酸亜鉛　十　− 亜鉛アセチルアセトネート＋− サリチル酸亜鉛　士　− 硫酸銅　廿　十硫酸第一鉄　−− 塩化コバルト　−− モＩＪ／’７’ン酸アンモニウム　±　−十　分解阻止効果ＭシＩＩＩ　なしまた、第５図（写真）はｈ−ＩＦＮ−ｒ活性を有するポリペプチド（図中ＧＩＦ ”１４６と表示した矢印で示した蛋白の）；ンド）の安定性を示す５ＤＳ−ＰＡＧＥのパターンである。試験サンプルは各種濃度の塩化亜鉛を含む望ましい緩衝溶液中で菌体を破砕して調製された。第５図からｈ−ＩＦＮ−γ活性を有するポリペプチド◆は０．５　ｍ　Ｍ〜２ｍＭの塩化亜鉛存在下で安定であシ、塩化亜鉛を含まない場合または低濃度の場合では分解を受け易いことを示している。矢印Ｂで示す蛋白のバンドは、精製工程中プロテアーゼによってＧＩＦ１４５が部分分解されたポリペプチドのバンドを示す。尚、２−１で示されるサンプルは２ｍＭのＺ　ｎ　Ｃｌｚを使用して同様に処理し、更に精製を進めた段階で得たサンプルによるものでおる。また、２−２で示されるサンプルはＺ　ｎ　Ｃ１２を使用せずに処理し、更に精製を進めた段階で得たサンプルによるものである。

塩化亜鉛の代わシに硫酸銅を用いた同様な実験例を第６図（写真）に示すが、この場合、Ｑ、　ｌ　ｍ　Ｍ〜４ｍＭで有効であることを示している。これらの塩化合物は高い方が充分なプロテアーゼ阻害作用を示すが、精製工程でこれらの塩化合物は最終的にとシのぞく必要があるのでできるだけ低くするのが好ましい。

塩化亜鉛の場合、１〜３ｍＭ、硫酸銅の場合、０．２５ｍＭ〜１ｍＭが好ましい。

第７図（写真）はＧＩＦ１４３生産菌について第５図について行ったものと同様の処理して得た写真である。図中、Ｇ工Ｆ１４３と表示した矢印で示した蛋白のバンドはｈ−工ＦＮ−γ活性を有するポリはプチドであシ、ＥはＧＩＦ１４３のプロテアーゼによる部分分解ポリＲプチト２を示す。

破砕された細胞／ガンマインターン二ロン混合物中の主たる不純物は微小サイズの粒子および水溶性画分であシ、水溶性画分としては核酸、蛋白分解酵素、細胞蛋白、炭水化物、脂質、インターフェロン分解断片、インターフェロン凝集物およびインターフェロンが生産された細胞の破砕によって生じる他の断片等である。発明者等は、インターフェロン含有混合物を下記の具体的順序で処理してインターフェロンの分解を最少にし、混合物から不純物を以下に特定する順に除去することによシ、高純度かつ生物学的活性を保持しながら、しかも良好な収率でガンマインターフェロンを得ることができる。

十分に改善された純度および活性は、以下の順でインターフェロン含有混合物中の不純物を除去することによって得られる。

１）核酸；２）負に荷電した蛋白分解酵素および不純物細胞蛋白；３）正に荷電した蛋白分解酵素および不純物細胞蛋白；および４）分解および凝集インターフェロン。

この工程順序は本発明の所望の結果を得るためには必須である。上に列挙した不純物を特定した順に除去することを前提として、高分子量疎水性物質のような他の不純物が存在する場合、追加の工程によってその不純物を除去できる。これらの他の不純物は工程３）または工程４）の後で除去するのが好都合である。

これらの分離のそれぞれについては多くの公知の方法がある。

前述のように、最も穏かな条件で分離を行ってインターフェロンの分解を最も少くすることができるこれら方法が最も望しい。

発明者等は、好しい方法としては最初にポリエチレンイミン沈澱を行い、次いでいくつかのクロマトグラフィーによる分離を行うことによシ上に特定した順序で不純物を除去すること、であることを見出した。クロマトグラフィー分離で使用される樹脂およびそれらの使用順は次の通シである。

１）陰イオン交換樹脂２）陽イオン交換樹脂３）分子ふるいクロマトグラフィー分離に加えて、沈澱、濾過、濃縮および透析等の手法を用いることが有益である。

好しい方法において、ガンマインターフェロン含有混合物に次の方法を行う。

１）ホリエチレンイミンを用いる核酸の除去；２）弱堪基性陰イオン交換樹脂を用いる負に荷電した蛋白分解酵素および不純物細胞蛋白の除去；３）弱酸性陽イオン交換樹脂を用いる正に荷電した蛋白分解酵素および不純物細胞蛋白の除去；４）分子ふるいを用いる分解及び凝集インターフェロンおよび細胞フラグメントの除去。

各工程後の濾過、工程３および／または４の後の濃縮および工程５の後の透析が有益な付加的工程である。

この新規方法では、５チ以上の収率で少くとも９５％の純度を持つガンマインターフェロンが確実に生産された。

本発明の重要な特徴は新規な精製方式にあり、この方法は組織培養によって増殖されたヒトの細胞から、血液サンプルから集められた白血球から、または当業界においてよく知られているクローニングの技術による等の多くの方法のいずれかで生産されたガンマインターフェロンへの使用に適している。この精製方式は大腸菌細胞から回収される組換えガンマインターフェロンの精製に非常に適している。細胞は、例えばクロルヘキシジングルコネートのような化学殺菌剤の添加による等の標準的ないずれかの方法により不活化される。不活化細胞を遠心し、緩衝液に再懸濁し、そしてホモジナイズする。ガンマインターフェロン含有細胞のホモシネ−ジョンのだめの便利な方法はマントンーガーリン（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ　）ホモジナイザーを用いる高剪断破砕である。破砕された細胞を遠心分離によシ沈澱物と上清とに分離する。この方法で得た上清は以下に述べる方法によって単離および精製されるガンマインターフェロンの好適な原料である。

溶解された細胞の懸濁液は蛋白、脂質、炭水化物および核酸、並びに不溶性細胞破砕片を含んでいる。慣用の方法を利用することによシ、水不溶性成分は、上清中に残っている細胞の水溶性成分から分離される。

細胞からのガンマインターフェロンの抽出に先立って、ある種の予備的処理、例えば処理中のインターフェロンの分解を最少にするような方法を行うことがしばしば望ましい。どのような予備処理も、それが本発明の精製方式を妨害しないことを前提に、使用できる。

この多工程精製方式によれば、生物活性を保持しながら、高純度インターフェロンについての高収率が達成される。分離工程の順序は非常に区別性があり、開示された所望の結果を達成するのに臨界的である。

インターフェロン含有混合物からの不純物の除去の順序は次の通シである。

ａ）核酸の除去；ｂ）負に荷電した蛋白分解酵素および不純物細胞蛋白の除去；Ｃ）正に荷電した蛋白分解酵素および不純物細胞蛋白の除去；ｄ）低および高分子量不純物、分解されたインターフェロンおよびインターフェロン凝集物の除去。

現在では未だ理由は知られていないが、前記の順序での不純物の除去は、生物活性を保持した精製ガンマインターフェロンについて高い収率を達成するのに臨界的である。それぞれの群の不純物の除去に使用される個々の工程は慣用であシ、当該技術分野において知られている。ガンマインターフェロンカ苛酷な条件下では分解または凝集して不活性体になる傾向があるため、最も穏かな処理条件下で行うことができる精製工程が好しい。

インターフェロンの分解を最も少くできることが判った具体的処理工程および条件を用いて、この発明を更に説明するが、不゛純物除去の順を記述のように維持することを前提にして、開示の方法を他の慣用の処理工程で置き換えることができる。

以下の記述において、別途言及しないかぎシ、与えられたｐＨ値は一般に±０．５、好しくけ±０．２５、最も好しくは±０．１の範囲で変わシ得る。導電率の値は±５ｍＳの範囲で変え得るが、±３ｍＳの範囲に維持することが好しい。操作は約２〜約１５℃の温度で行われる。

本処理方式の第Ｉ工程は核酸の除去である。溶解されたガンマインターフェロン含有細胞の遠心した混合物からの上清にポリエチレンイミンを添加することによって、この除去を行うことが好都合である。別法として、所望によ多細胞のホモジナイズの前にポリエチレンイミン溶液を添加することもできる。攪拌下にポリエチレンイミンを最大濃度的０．８％にまでゆつくシ添加し、そして混合物を適当な期間、一般的には約３０〜９０分間静置する。次いで混合物を遠心し、上清を集める。ポリエチレンイミンを１０％（Ｖ／Ｖ　）水溶液として、溶液全量に対して約０７〜０．８％（ｖ／ｖ　）となるような十分な量を添加する場合に、優れた結果が得られる。溶液のｐＨは８±０，５、好しくは±０１であシ、温度は約２〜１５℃の範囲に保持される。上清中の蛋白濃度は、標準のコマ−ジブルー結合検定によシ、この工程および他の各処理工程において測定される。

核酸除去の別法は、ヒドロキシアパタイトまたは固定化ＰＥ工のクロマトグラフィーを用いることによる。プロタミン硫酸塩による沈澱は別の有用な方法である。

核酸の除去後、ガンマインターンェロン含有混合物を第一の除去工程にかける。

蛋白分解酵素を除去する最も便利な方法は陰イオン交換樹脂を用いて、核酸除去工程からの上清をクロマトグラフィーにかけることによる。第四級７ミノエチル、混合アミンまだはその他の中間体塩基樹脂またはｐ−アミノベンジルセルロースのような弱塩基樹脂が特に有用である。

第四級アミノエチルは好しい陰イオン交換樹脂である。第四級アミノエチルは架橋デキスラン、セルロース、アガロースまたはアクリル系支持体に結合することができる。上清のｐＨは水酸化ナトリウムまたは他のいずれかの好しい塩基を用いることによ！Ｄ、８．７±０．５、好しくは±０，１に調節する。溶液の導電率は脱イオン水を添加することによ５１０ｍ５以下、好しくは約４〜ＢｍＳの範囲に調節する。

溶出緩衝液は２ＱｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ビベラジンープロノξン硫酸ナトリウムおよびＯ，１％　（ｖ／ｖ）　２−メルカプトエタノールを含んでいる。この緩衝液のｐＨは水酸化ナトリウムまたは他の塩基によシ約８．７に調節される。同じｐＨ範囲での使用に適する他の緩衝液をピー！５ジン誘導体に代えることができ、しかも他の抗酸化剤を上記メルカプトエタノールに代えることもできる。

第四級アミノエチルカラムは緩衝溶液で予じめ予備平衡化し、ガンマインターフェロン含有溶液を添加し、そして吸着物質を同じ緩衝液で溶出する。溶出された蛋白溶液の最初の２／３、すなわち全容積の最初の２７３を、次の精製工程忙移すために溜める。溶出された液の残りの１／３は同じ方法で平衡化した同じカラムで再度クロマトグラフィーにかけることができる。残シの溶液は更に同じ方法で処理できる。前に述べたように、蛋白濃度はコマ−ジブルー結合検定によって測定される。

精製のこの時点で任意の濃縮工程が使用できる。溶液を濃縮する１つの便利な方法は硫酸アンモニウムによる沈澱である。

第四級アミノエチルカラムからの溶出液を０．２μフイルターを通過させ、硫酸アンモニウムを攪拌下、５〜１０分間にわたって添加し、最終濃度約４０〜６０チ飽和にする。懸濁液を水浴中で数時間放置する。次いで、沈殿物遠心分離で集め、更に処理が必要なときまで約−２０℃で保存できる。

必要な場合、２０ｍＭトリス−ＨＣＡｌ　および０．１チ２−メルカプトエタノールからなる溶液（ｐＨ，約７．５）で予じめＩＱＯＯＯ分子量カットオンフィルターを通したものに沈澱物を溶解する。溶液の導電率を、］　ＯｍＭ）　リス −Ｈ（Ｊ　および０、１１２−メルカプトエタノールから成る溶液（ｐＨ，約７．５）を添加することによシ約３〜５ｍＳに低下させる。この溶液を０．２μフイルターに通し、後続の処理に供する。同一のｐＨ範囲での使用に適する他の緩衝液をトリス−ＨＯ２に代え、他の抗酸化剤を前記メルカプトエタノールに代えて使用できる。

溶液中の正に荷電した蛋白分解酵素およびその他の蛋白は、陽イオン交換樹脂を用いることによシ好都合に実施される次の処理工程において除去される。

カルボキシメチル陽イオン交換樹脂（カルボキシメチル結合架橋デキストラン、セルロース、アガロースまたはアクリル支持体）を用いることによシ優れた結果が得られる。前の工程で得られた溶液のｐＨは、ＨＣｌ　’またけ他の適当な酸を用いることによシ約７．５に調節される。２−メルカプトエタノールまたは他の適当な抗酸化剤を約０．１　％　（ｖ／ｖ）の濃度に添加する。

０、１　％　（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノールを含有する脱イオン水を添加し、導電率を２０ｍ５以下、好しくけ約３〜５ｍＳに低下させる。この溶液を０，２μフイルターを通して濾過し、後のクロマトグラフィーに備える。

陽イオン交換樹脂カラムを２０ｍＭ）リス−ＨＣ１および０．１チ２−メルカプトエタノールから成る溶液（ｐＨ，約７．５）のような適当な緩衝液で平衡化する。平衡化カラムを同じ緩衝液で２〜３回洗浄し、ガンマインターフェロン含有溶液を添加した後、この溶液を、平衡化に使用した緩衝液中に溶解した塩化ナトリウムの勾配（カラム容積の約１３〜１５倍量）で溶出する。

塩化ナトリウム含量は緩衝液中０ないしほぼ０．５　Ｍの濃度に増加される。

適当な両分を集め、ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、分析ＨＰＬＣおよび抗ウィルス活性について分析することもできる。最も純度の高い両分を以後の処理のためにプールする。低濃度のインターフェロン含有画分はほぼ４０〜６０％飽和度の硫酸アンモニウムで沈澱し、再溶解し、済過し、前述のようにカルボキシメチルカラムによシ再度クロマトグラフィーにかける。

再クロマトグラフィー溶液から回収した画分を分析し、最も純度の高い画分を第一のカルボキシメチル溶出液から得た画分と共にプールする。

もし、高分子量の疎水性不純物の存在が５ＤＳ−ＰＡＧＥ　−ｉたはその他の適当な方法で検出される場合には、溶出液を任意のクロマトグラフィーにかけて精製方法におけるこの時点で前記不純物を除去する。フェニル樹脂によって満足すべき結果が得られることが判明した。まだ、オクチルおよびブチル樹脂も使用できる。前工程で得た溶液を０．２μフイルターを通して濾過し、塩化ナトリウム（０，５〜０．７５　Ｍ　）を加えて溶液の導電率をほぼ５０〜７５ｍ５に上昇させる。

緩衝液は２０ｍＭ）リス−ＨＣ４，０，１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールおよび導電率を適切な範囲に上昇させるためのＮａＣｌを５００〜８５０ｍＭ、好しくは５００〜７００ｍＭである。

カラムは緩衝液で予備平衡化し、サンプルをカラムにかける。

カラム容積の約２〜４倍量の緩衝液をカラムに添加する。次いで吸着された物質を、２０ｍＭ）リス−ＨＣ１，１００ｍＭＮ　ａ　Ｃｌ　および０．１％（Ｖ／Ｖ）２−メルカプトエタノールから成る溶液（ｐＨ，はぼ７．５）のカラム容積の少くとも１倍以上、好しくけ約５〜約１０倍量で溶出する。適当なサイズの画分を集め、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、分析ＨＬＰＣおよび抗ウィルス活性について分析し、最高純度の画分をプールする。

インターフェロン含有溶液を、フェニルカラムクロマト／、７フイーの後で濃縮することが一般に好しい。また、任意工程である疎水性カラムクロマトグラフィーが用いられない場合の事例では、この時点でインターフェロン含有溶液を濃縮することが一般的に望しい。

溶液の蛋白濃度はコマ−ジブルー結合検定によって決定される。蛋白濃度が０．２　ｍｙ　／ｒａｔ以下である場合、その溶液をＩＱＯＯＯ分子量カットオフ膜を用いる限外渥過によって濃縮することが好しい。

この溶液に最終濃度約４０〜約６０％飽和度となるように硫酸アンモニウムを攪拌下に５〜１０分間に亘って添加するととによシ、更に濃縮を行うことができる。懸濁液を水浴中に放置し、その後沈澱物を遠心分離で集める。この沈澱物を、２ｏＩｎＭトリスーＨＣｌ、５００ｍＭ　ＮａＣ／および０．１％２−メルカプトエタノールから成シ予じめＩＱＯＯＯ分子量カットオフフィルターを通して濾過した溶液（ｐＨ，約７．５）に溶解する。この濃縮液を０．２μフイルターを通過させ、次の精製工程に供する。

低分子量および高分子量不純物、および分解されたガンマインターフェロンおよびインターフェロン凝集物を最終クロマトダラフイー精製工程で除去する。この工程は前の処理工程からのガンマインターフェロン含有溶液をゲル濾過樹脂を通過させることによって行われる。親水性濾過ゲルは分子ふるいとして働き、溶液中に含まれる低および高分子量不純物から適当なサイズの画分を分離する。特に有用な濾過ゲルはファルマシアファインケミカル社製の商標名セファデックスＧ −Ｚｏｏとして特定される架橋デキストランをベースとするゲルである。この樹脂は球状蛋白およびＲプチドについて４，０００〜１５ＱＯＯＯの分画分子量および多糖類について１．　ＯＯ，Ｏ＝−：１：ＱＯＯＯの分画分子量を持つ。蛋白について約ＬＯＯＯ〜約２０ＱＯＯＯのカットオフ範囲を持つ他の樹脂も使用できる。

セファデックスＧ−１００樹脂カラムは２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ　ＮａＣｌおよび０．１１２−メルカプトエタノールから成る緩衝溶液（ｐＨ，約７．５）で予じめ平衡化される。吸着された物質を上記緩衝液で溶出し、次いで適当な両分を集める。各両分の蛋白濃度をコマ−ジノル−結合検定で測定する。画分は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、分析ＨＰＬＣおよび抗ウィルス活性によシ判断した純度に基いていっしょにされる。

別法として、硫酸アンモニウム濃縮工程での沈澱物を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ　Ｎａ（Ｊ、および０．１チ（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールから成る溶液（ｐＨ１約７．５）に溶解することができる。このガンマインターフェロン含有溶液を予じめ上記緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−２００ゲル濾過カラムにかける。（尚、セファクリルＳ−２００はアクリルアミドで架橋されたアガロース樹脂であるファルマシアファインケミカル社の商標名である。

）最終生成物は透明々いし僅かに曇った溶液で、無色ないし淡黄色である。５ＤＳ−ＰＡＧＥで決定された見かけ分子量は１７，０００〜ＩＣ４５００でおる。

精製されたガンマインターフェロンは前に用いた緩衝液に対して透析する。適当な緩衝液は２０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび５ｍＭＬ−シスラインから成シ、ｐＨ約６．８である。他の適当な緩衝液は１５ｍＭのリン酸ナトリウム、８ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび６ｍＭのＬ−システィンＨＣｌかう成るｐＨ５，０の溶液である。８時間以上透析を継続し、系中に窒素を連続的に通して酸化を最底に押えることが好しい。

必要に応じて、精製ガンマインターフェロン溶液は上記の方法で濃縮できる。

以下参考例および実施例１−３で本発明をさらに詳しく説明する。

参考例（ＧＩＦ’１４３発現イクターの作製Ｇ工Ｆ１４３発現イクターを以下の手順に従って作製した。

ｄｃｍ大腸菌（シトシンのメチル化反応が欠損し九株）形質転換体であるＷＡ８０２／ｐＧＩＥ’５４　よシ常法に従ってｐＧＩＦ５４（ＧＩＦ１４６に相当する遺伝子を含むｐＧＩＦ’４と実質的に同等なシラスミ１）を得た。ｓｐｙのｐＧＩＦ’５４を２Ｑ　ｕｎｉｔのＡａｔ■及び２Ｑ　ｕｎｉｔのＢａ１１１で処理し、約６００塩基対の、Ｇ工Ｆ’１４６遺伝子の一部と１ａｃＵＶ５　プロモーターを含むＤＮＡ断片を得た。次に、このＤＮＡ断片約０．５ｐｆｌを５　ｕｎｉｔのＡｖａｎを用いて切断し、Ｇ工Ｆ１４６遺伝子の一部を含む約４００塩基対のＤＮＡ断片を得た。一方ｐＩＮ５Ｔ４　５μｇを、２０ｕｎｉｔのＥｃｏＲ工と２０　ｕｎｉｔのＢｇｌ■　を用いて切断し、テトラサイクリン耐性遺伝子、ｌｐｐプロモーター、及び複製起点を含むＤＮＡ断片を得た。この両ＤＮＡ断片と第１図に示した化学合成リンカ−（Ｄ　Ｎ　Ａ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　；　ＡｐｐＨｄ、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３８０Ａ　を用いて合成）０．５μＩを混合ライゲーションすることによシ、ｐＩＮ５Ｔ４Ｎ１４３を得た。さらに得られたｐ工Ｎ５Ｔ４Ｎ１４３を常法例えば、特願昭５６−１６３３０３記載の方法によシＷ３１１０に形質転換し、Ｗ　３１１０／ｐＩＮ５Ｔ４Ｎ１４３を得た。

得られた形質転換体がＧＩＦ１４３生産株であることは、以下に示す手順で確認した。

Ｗ３１１０／ｐ１Ｎ５Ｔ４Ｎ１４３　をポリイブトン３チ、酵母エキス２％、グルコース２％、ＫＨ２ＰＯ４０，５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０１％およびテトラサイクリン２０μｉ／ｒａｔ　を含む培地１．５ｍｌと共に、１６．５ｍｍ試験管で３０℃、２４時間振盪培養した。

培養終了後（ＯＤ６６ｏキ８）培養液０．５　ｍｌを１．５ｍｌ容エツｄ　７ドルフカツプにとシ、遠心分離（１ａ　ｏ　ｏ　ｏ　ｒｐｍ、ｓ分間）することによシ集菌した。これを、１　ｍｙ／ｍｌ　リゾチーム・１ｍＭ−ＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液（０，８１ＮａＣ／、０．０２％ＫＣＪ。

０．１１５％Ｎａ２ＨＰＯ４，０，０２％Ｎ　ａ　Ｈ２ＰＯ２）　０．５　ｍｌに懸濁し０℃、３０分間反応後、凍結融解を３回線シ返すことによシ細胞を破壊し、遠心分離（］、　Ｑ　Ｏ００ｒｐｍ、１０分間）して上清画分を回収した。

この上清両分を特開昭５８−２０１９９５に記載の方法に従って抗ウィルス活性を検討した。その結果６　Ｘ　１０’　ｕｎｉｔ／ｍｌの抗ウィルス活性を認めた。一方、同様に集菌し得られた菌体をＳＤＳサンプル溶液（７Ｍ尿素、１チＳＤＳ、１％２−メルカプトエタノールを含んだｌ　ＱｍＭリン酸緩衝液１）Ｈ７，２）２００μｌに溶解後、沸騰水浴中で１０分間加熱した。このサンプル２０ μｌをｌ　３％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ　で分離後、コマ−ジブルーＲ２５０で蛋白染色を行った。その結果、大腸菌総蛋白の約２０％に相当するＧＩＦＩ　４３蛋白（分子量約ＩＢＫａ）の生産を認めた。

実施例Ｉ　Ｇ工Ｆ１４６の抽出・精製ＧＩＦ１４６生産株であるＷ３１１０／ｐ１Ｎ５Ｔ４　をポリープトン３％、酵母エキス２チ、ダルコース２％、ｘａ２ｐｏ、ｏ、ｓチ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０１％およびテトラサイクリア２０μｍ７７ｍ１　を含む培地で、２４時間通気攪拌培養した。培養液の菌体をグルコン酸クロルヘキシジンで完全に殺菌後、遠心分離しく　ａ　０００　ｒｐｍ、１０分間）、ｗ３１１０／ｐ工Ｎ５Ｔ４の湿菌体８００ｇを得た。これを１　ｍ　Ｍ　ＺａＣｌ　２　を含む冷却した２０ｍＭ）リス塩酸バッファー（以下ＴＨＥ）ｐＨ７，４５，１ｌＩに懸濁し、氷冷したＭａｎｔｏｎ　Ｇａｕｌｉｎ社製ホモジナイザーＭ１５にて、ホモジナイズした後、遠心分離しく７．ＯＯＯｒｐｍ、２０分間）上清を得た。これに、１５チポリエチレンイミン（以下ＰｇＩ）水溶液（ｐＨ８，０、ＨＣＩで調整）を最終濃度０，７５チとなる様に加え１０分間攪拌後、４℃で２時間放置した。生じた沈澱を遠心分離（７，ＯＯＯｒｐｍ、２０分間）で除去し、上清４゜７１を得た。この上清を、２０ｍＭＮ−２−ヒドロキシエチルピはラジンーＮ′−３− フロパンスルフォン酸バッファー（ＥＰＰＳバッファー）ｐＨ８，６で平衡化したＱＡＥセファデックスＡ−２５（ファルマシア社製）カラムにかけ、素通シ画分を得た。次に、０．１％の２−メルカプトエタノール（以下２−ＭＥ）を含む２０ｍＭＴＨＢ　ｐＨ７４で平衡化した０Ｍセファロース０Ｌ６Ｂ（ファルマシア社製）カラムに、この素通り画分をかけ吸着した活性画分をＯ〜０．５ＭのＮａＣｌ　直線濃度勾配で溶出し、インターフェロン活性の高い区分を集めた。

なお、インターフェロン活性は特開昭５８−２０１９９５号公報に記載した方法に準じて測定した。続いてこの両分に５０％飽和となる様に硫酸アンモニウムを添加し、塩析を行い、７０００　ｒｐｍ、２０分間遠心分離して沈澱を得た。沈澱部を０．３Ｍ　Ｎａ（Ｊ’及び０．１％２ＭＥを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（以下、２ＱｍＭＰＢＳ　）ｐＨ７，４に溶解し、同バッファーで平衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）カラムにかけ、最終ｎ製品として２９８■のＧＩＦ１４６に対応するポリペプチドを得た（インターフェロンの比活性１．６〜１．７　Ｘ　１０６Ｕ／ｍｙ蛋白）。コ（７）ポリペプチドのＳＤＳ／ＰＡＧＥによる純度検定では純度９９チ以上で１、また同Ｓ　Ｄ　Ｓ／Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅのバント３の位置は分解を受けていないＧＩＦ’１４６の位置と一致した。更に、アミノ酸分析よシ得られたポリペプチドが前記アミノ酸配列（１）と同じアミノ酸配列を有することも確認し、本発明の抽出精製方法が有用であることが認められた。

尚、上記の精製過程中で用いたセファクリルＳ−２００の代シにセファデックスＧ−１００（フマルマシア社製）を用いても同様な結果を得た。

実施例２　ＧＩＦ１４３の抽出および精製実施例１と同様に、Ｖ／３１１０／ｐＩＮ５Ｔ４Ｎ１４３　（参考側参照）を培養の後、グルコン酸クロルヘキシジンで殺菌し、集菌して得られた湿菌体３００！！を３ｍＭ　ＺｎＣＡ’２　を含む冷却しり２０　ｍＭ　ＴＨＢ　ｐＨ７，４２，１１に懸濁し、ホモジナイズした後、遠心分離しく　７０００　ｒｐｍ、２０分間）、上清画分を得た。

これを実施例１と同様にＰＥＩ処理して、上清１０１００Ｑ！を得た。次に、この上清を０．１％２ＭＥを含む２０　ｍ　Ｍ　Ｔ　ＨＥ（ｐＨ７，４）で平衡化したＣＭセファロースＣＬ５Ｂカラムに吸着させた後、０．１〜０．８Ｍ　ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。活性画分ｔｏ、１％２ＭＥを含む２０ｍＭＴＨＥで１０倍稀釈し、同／ζソファ−で平衡化したＣＭ−）−ヨーパールカラム（東洋曹達社製）に吸着させ、洗浄後、０．１〜０．ＢＭ　Ｎａ（Ｊ直線濃度勾配で溶出した。インターフェロン活性を有する区分を集め、硫酸アンモニウムを加えて２０％飽和とした後、プチルトーヨーバールカラム（東洋曹達社製）を通過させ、通過区分を蒸留水に対して透析した。これによシ最終的に３９６ｍ９の蛋白を得た（インターフェロン比活性：　４．８　Ｘ　ｔｏ’ｔＪＡｎｙ蛋白）。

実施例１の場合と同様にアミノ酸分析及びＳＤＳ／ＰＡＧＥの結果から、純度９９チ以上で前記アミノ酸配列側と同じアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＧＩＦ１４３）が得られた。更に、抽出時に添加した亜鉛化合物は原子吸光分析を行っても検出できなかった。

組換えガンマインターフェロンを含む不活性化した大腸菌（Ｗ３１１０／ｐ工Ｎ５Ｔ４）細胞を遠心分離によって集める。細胞を１ｍＭ　ＺｎＣｌ２を含有する２　０　ｍＭ　）リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，５）中に懸濁する。細胞は高圧ホモジナイザー中で破砕し、細胞破砕物を遠心分離し、上清を回収する。塩酸でｐＨ８に調節したｘｏ％（ｖ／ｖ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）水溶液を上清に添加し、最終ＰＥＩ濃度を最大０．８％にする。混合物を遠心分離し、上清を集める。

■、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）カラムクロマトグラフィーＰＥＩ上清のｐＨを４ＮＮａＯＨによシ８．７に調節する。脱イオン水を添加して導電率を１０ｍ５以下に減じる。このバッチをゲル１１当シ蛋白質５０９以下の負荷でＱＡＥカラムにかける。カラムにかける前に、２０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル） −１−ピＲラジ／−プロノぐンスルホン酸ナトリウムおょヒ０．１％の２−メルカプトエタノールの緩衝液（ｐＨ８，７）でカラムを平衡化する。溶出は同じ緩衝液で行う。蛋白溶液を集め、次の第■工程でクロマトグラフィーにかける。

工程２からの蛋白溶出液のｐＨを４ＮＨＣ／で７．５に調節し、２−メルカプトエタノールを最終濃度０．１チとなるように添加する。０．１％の２−メルカプトエタノールを含有する限外濾過水で稀釈することによシ導電率を２０ｍ５以下に調節する。この溶液を０．２μフイルターに通し、次いでゲル１１当シ蛋白３５ｇ以下の負荷で０Ｍカラムに加える。カラムにかける前に、ｐＨ７，５であシ、ＮａＣ！！　で導電率を２ＱｍＳ以下に調節した２ｏｍＭ）リス−Ｈ（Ｊ　と０．１％２−メルカプトエタノールとから成る緩衝液でカラムを平衡化する。この平衡化緩衝液をカラム容量の少くとも２倍でカラムを洗浄する。この平衡化緩衝液に溶解した０〜０．５Ｍ　ＮａＣ１の塩濃度勾配でガンマインターフェロンを溶出する。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で決定される両分をいっしょにする。

ＩＶ、フェニルカラムクロマトグラフィー５ＤＳ−ＰＡＧＥによって高分子量不純物が検出された後、フェニルカラムによるクロマトグラフィーが行われる。ＮａＣＪを添加して導電率を５０〜７５ｍ５にし、その後溶液を、ゲルＢ’当シ蛋白１５．９以下の負荷でフェニルカラムに添加する。

カラムにかける前に、２０ｍ１ｉ’！）リス−ＨＣｌ、０．５Ｍ　ＮａＣＪおよび０．１１２−メルカプトエタノール（ｐＨ７，５）で平衡化する。サンプルをカラムに負荷した後、少くともカラム容積量の平衡化緩衝液を加える。カラムを２０ｍＭトリス−ＨＣｌ。

０．１５Ｍ　ＮａＣＣ０，１％　２−メルカプトエタノール（１）Ｈ７，５）で溶出する。５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ウイルス検定によって決定される活性画分をいっしょにする。

■、硫酸アンモニウム沈澱いっしょにしたカルボキシメチル（工程■）またはフェニル（工程■）画分の蛋白濃度が０．２　ｍｙ／ｍ１未満の場合、この溶液をＩＱＯＯＯＭ、Ｗ、カットオフ膜を用いる限外濾過によシ濃縮する。硫酸アンモニウムを最終濃度４０〜６０チ飽和度となるように添加する。必要であれば沈澱物を遠心分離で集め、約− ２０℃で保存する。

■、セファデックスＧ−１００カラムクロマトグラフィー硫酸アンモニウム沈澱物を２０ｍＭ）リス−ＨＣ１！、０，５ＭＮａ（Ｊ、０．１％２−メルカプトエタノールから成る緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解する。この溶液を０．２μフイルターに通過させる前に遠心分離する。Ｆ液を、予じめ上記の緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−１００カラムに供給する。負荷はゲル１／当シ蛋白３．５１！以下である。カラムを上記緩衝液で溶出し、両分を５Ｄ８−ＰＡＧＥで決定していっしょにする。

セファデックスＧ−１００画分をいっしょにしたものを１５ｍＭリン酸ナトリウム、８ｍＭクエン酸ナトリウム、５ｍＭＬ−システィン塩酸塩から成る液（ｐＨ５，０）で透析する。透析は、短かくとも５時間の間隔で緩衝液を２回交換し、緩衝液中を通して窒素を連続吹込みして行う。必要であれば、透析溶液をＩＱＯＯＯ分子量カットオフ膜を用いる限外濾過によシ、蛋白濃度１ｍ９７ｍ１以上に濃縮する。精製ガンマインターフェロン溶液を０．２μフイルターに通し、約− ２０℃以下で保存する。

精製ガンマインターフェロンは、その溶液に５０％グリセロールを添加することによシ、はぼ−２０〜約−３０℃の温度で少くとも数ケ月保存できる。

カンマインターフェロンは０．２μフイルターを通ステ過オヨび２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび５ｍＭＬ−システィンから成る溶液（ｐＨ，約６．８）に対して透析することによって使用に供せられる。別法としては、透析液を、１５ｍＭリン酸ナトリウム、　８ｍＭクエン酸ナトリウムおよび６ｍＭＬ−システィン塩酸塩から成る溶液（９８％約５）にする。連続窒素吹込み下で少くも８時間透析を行った後、溶液を、ＩＱＯＯＯ分子量カットオフ膜により濾過することが好しい。

得られる生成物は少くとも９５チのガンマインターフェロン純度を持ちおよび約５％以上の収率である。

算ア５図秦６　図基７図国際調査報告１ｍ＃１１ａｍａａｌ　Ａｅ両−ＩｈＰｃＴ／ＪＰ　８５１００７１５ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims

【特許請求の範囲】１）組換えＤＮＡ技術によつて得られる生理活性を有するポリペプチドの生産微生物を培養して得られる培養物から、該ポリペプチドの抽出または精製工程において亜鉛又は銅の塩及びポリエチレンイミンを添加することを特徴とする生理活性を有するポリペプチドの精製方法。２）前記生産微生物の培養物から得られる微生物細胞を亜鉛又は銅の塩を含む溶液に懸濁して破砕し、その遠心上清にポリエチレンイミンを添加することを特徴とする請求の範囲第１項記載の精製方法。３）前記生理活性を有するポリペプチドがインターフェロン活性、好しくはヒトガンマインターフエロン活性を有するポリペプチド、特にＧＩＦ１４６またはＧＩＦ１４３である請求の範囲第１項又は第２項記載の精製方法。４）前記亜鉛の塩の添加量が０．５〜５ｍＭの範囲であり；または前記銅の塩の添加量が０．０５〜３ｍＭの範囲であり；かつポリエチレンイミンを０．５〜１．５％濃度と左るように添加することを特徴とする請求の範囲第１項、第２項または第３項のいずれかの項に記載の精製方法。５）ガンマインターフエロン−含有溶液から負に荷電した不純物蛋白；高分子量物質を除去する工程から成り、該工程は（１）弱塩基性陰イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーにより負に荷電した不純物蛋白を除去し、（２）弱酸性陽イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーによる正に荷電した不純物蛋白を除去し、ついで１３）グルろ過樹脂による透過クロマトグラフィーで低及び高分子量物質を除去する、から成ることを特徴とする請求の範囲第１項左いし第４項のいずれかの項記載の方法。６）正に荷電した蛋白を除去した直後か又は低又は高分子量物質を除去した直後にガンマインターフェロン含有溶液から高分子量疎水性物質を除去する工程を更に含むことを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。７）前記陰イオン交換樹脂が第四級アミノエチル樹脂であり；および／または前記弱酸性陽イオン交換樹脂がカルボキシメチル樹脂であり；および／またはゲル濾過樹脂がセフアデツクスＧ−１００またはセフアクリルＳ−２００から選択され；および／またはガンマインターフェロン含有溶液を、工程１、すなわち硫酸アンモニウムによる沈澱（具体的には限外濾過し、硫酸アンモニウムによる沈澱、または限外濾過と硫酸アンモニウムによる沈澱）の後に濃縮することを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。８）当該方法が、酸素を含まない環境でのシステイン含有緩衝液に対するガンマインターフェロン含有溶液の透析を最終工程として包含する請求の範囲第５左いし７項のいずれかの項記載の方法。９）（１）ポリエチレンイミンおよび亜鉛または銅塩を含有する混合物を遠心分離し、得られた沈澱物を上清から分離し；（２）上記（１）からの溶液を陰イオン交換樹脂を含むカラムに吸着させ；（３）吸着物質を溶出し；（４）陽イオン交換樹脂を含むカラムに上記（３）で得た溶出液を吸着させ；（５）吸着物質を溶出し；（６）ゲル濾過樹脂を含むカラムに上記（５）の溶出液を吸着させ；そして（７）吸着された物質を溶出する；の各工程を更に含む請求の範囲第１ないし４項のいずれかの項記載の方法。１０）工程２からの吸着物質を４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン −プロパンスルホン酸すトリウムと抗酸化剤、好しくは２−メルカプトエタノールとから成る緩衝液で溶出し；および／または工程４からの吸着物質をトリスーＨＣｌおよび抗酸化剤から成る緩衝液で溶出し；および／または工程６からの吸着物質をトリスーＨＣｌから成る緩衝液で溶出する、ことを特徴とする請求の範囲第９項記載の方法。１１）陰イオン交換樹脂が第四級アミノエチル樹脂であり；陽イオン交換樹脂がカルボキシメチル樹脂であり；ゲル濾過樹脂がセフアデツクスＧ−１００である、ことを特徴とする請求の範囲第１０項記載の方法。