JP3004788B2 - アルギニンデイミナーゼ発現ベクター、形質転換微生物およびアルギニンデイミナーゼの製造法 - Google Patents
アルギニンデイミナーゼ発現ベクター、形質転換微生物およびアルギニンデイミナーゼの製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アルギニンデイミナー
ゼもしくはその類縁体の発現ベクターを大腸菌に組み込
み、この形質転換微生物を用いてアルギニンデイミナー
ゼもしくはその類縁体を大量に生産する方法に関する。
ゼもしくはその類縁体の発現ベクターを大腸菌に組み込
み、この形質転換微生物を用いてアルギニンデイミナー
ゼもしくはその類縁体を大量に生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アルギニンデイミナーゼ（酵素分類番号
３、５、３、６）はＬ−アルギニンと水からＬ−シトル
リンとアンモニアを生成する酵素反応を触媒する酵素で
あり、動物、細菌、酵母類にその存在が知られている。
既にマイコプラズマから得られたアルギニンデイナーゼ
が強い癌細胞増殖阻害活性を有することが明らかとな
り、これを新規な制癌剤として利用することが期待され
ている（特開平３−１６４１７３号公報）。
３、５、３、６）はＬ−アルギニンと水からＬ−シトル
リンとアンモニアを生成する酵素反応を触媒する酵素で
あり、動物、細菌、酵母類にその存在が知られている。
既にマイコプラズマから得られたアルギニンデイナーゼ
が強い癌細胞増殖阻害活性を有することが明らかとな
り、これを新規な制癌剤として利用することが期待され
ている（特開平３−１６４１７３号公報）。
【０００３】アルギニンデイミナーゼは従来、アルギニ
ンデイミナーゼ生産菌であるマイコプラズマ・アルギニ
ーニ（Mycoplasma arginini)より生産していたが、生産
性が低いこと、マイコプラズマの培養管理が煩雑であ
り、本酵素の大量生産における酵素源として用いるには
難点があること、精製法が煩雑である等の問題点があっ
た。
ンデイミナーゼ生産菌であるマイコプラズマ・アルギニ
ーニ（Mycoplasma arginini)より生産していたが、生産
性が低いこと、マイコプラズマの培養管理が煩雑であ
り、本酵素の大量生産における酵素源として用いるには
難点があること、精製法が煩雑である等の問題点があっ
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の欠点を
解決するためになされたものであって、本発明の目的は
アルギニンデイミナーゼもしくはその類縁体の発現が高
く、これを効率よく生産できる発現ベクターを大腸菌に
組み込み、この形質導入された大腸菌を用いて遺伝子工
学的手法によってアルギニンデイミナーゼもしくはその
類縁体を大量かつ安価に生産する方法を提供しようとす
るものである。
解決するためになされたものであって、本発明の目的は
アルギニンデイミナーゼもしくはその類縁体の発現が高
く、これを効率よく生産できる発現ベクターを大腸菌に
組み込み、この形質導入された大腸菌を用いて遺伝子工
学的手法によってアルギニンデイミナーゼもしくはその
類縁体を大量かつ安価に生産する方法を提供しようとす
るものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決する手段について検討し、ｔａｃプロモーターの
フラグメント、プラスミドｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏ
ｒｉ）のフラグメント、テトラサイクリン耐性遺伝子を
含むフラグメントおよびアルギニンデイミナーゼもしく
はその類縁体のアミノ酸をコードするＤＮＡフラグメン
トが結合しているアルギニンデイミナーゼ発現ベクター
を創製し、これを用いて大腸菌に形質導入し、この形質
転換微生物を培養したところ、培養物の中に大量のアル
ギニンデイミナーゼもしくはその類縁体が生産され、こ
れを容易に精製することができることを見出して、本発
明を完成するに至った。
を解決する手段について検討し、ｔａｃプロモーターの
フラグメント、プラスミドｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏ
ｒｉ）のフラグメント、テトラサイクリン耐性遺伝子を
含むフラグメントおよびアルギニンデイミナーゼもしく
はその類縁体のアミノ酸をコードするＤＮＡフラグメン
トが結合しているアルギニンデイミナーゼ発現ベクター
を創製し、これを用いて大腸菌に形質導入し、この形質
転換微生物を培養したところ、培養物の中に大量のアル
ギニンデイミナーゼもしくはその類縁体が生産され、こ
れを容易に精製することができることを見出して、本発
明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、次のようなアルギニ
ンデイミナーゼ発現ベクターを大腸菌に組み込み、この
形質導入した形質転換微生物を用いてアルギニンデイミ
ナーゼを製造する方法に関する。
ンデイミナーゼ発現ベクターを大腸菌に組み込み、この
形質導入した形質転換微生物を用いてアルギニンデイミ
ナーゼを製造する方法に関する。
【０００７】（１）ｔａｃプロモーターのフラグメン
ト、プラスミドｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフ
ラグメント、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むフラグ
メント、およびアルギニンデイミナーゼもしくはその類
縁体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡフラグメントが
結合しているアルギニンデイミナーゼまたはその類縁体
の発現ベクター。 （２）前記アルギニンデイミナーゼまたはその類縁体の
発現ベクターを大腸菌に形質導入したことからなる形質
転換微生物。 （３）前記の形質転換微生物を培養して、アルギニンデ
イミナーゼもしくはその類縁体を発現させ、培養物から
アルギニンデイミナーゼもしくはその類縁体を採取し、
これを塩酸グアニジン及び還元剤を含有する溶液で可溶
化した後、リン酸カリウム緩衝液でリフォールディング
することからなるアルギニンデイミナーゼもしくはその
類縁体の製造法。
ト、プラスミドｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフ
ラグメント、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むフラグ
メント、およびアルギニンデイミナーゼもしくはその類
縁体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡフラグメントが
結合しているアルギニンデイミナーゼまたはその類縁体
の発現ベクター。 （２）前記アルギニンデイミナーゼまたはその類縁体の
発現ベクターを大腸菌に形質導入したことからなる形質
転換微生物。 （３）前記の形質転換微生物を培養して、アルギニンデ
イミナーゼもしくはその類縁体を発現させ、培養物から
アルギニンデイミナーゼもしくはその類縁体を採取し、
これを塩酸グアニジン及び還元剤を含有する溶液で可溶
化した後、リン酸カリウム緩衝液でリフォールディング
することからなるアルギニンデイミナーゼもしくはその
類縁体の製造法。
【０００８】アルギニンデイミナーゼの全塩基配列は、
本発明者らによって決定され（特開平３−１６４１７
３）、アミノ酸全４０９個よりなる分子量約４．５万
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）または約９万（ゲル濾過ＨＰＬ
Ｃ）のポリペプチドである。そして、その微生物の由
来、例えばM. arginini; M. arthritidis等によってＮ
末端アミノ酸が多少相違する。本発明ではこのようなＮ
末端のアミノ酸が相違したり、あるいはアミノ酸が相違
してもアルギニンデイミナーゼ作用を有するものをアル
ギニンデイミナーゼ類縁体として包含する（以下、これ
らの類縁体をも含めてアルギニンデイミナーゼとい
う）。
本発明者らによって決定され（特開平３−１６４１７
３）、アミノ酸全４０９個よりなる分子量約４．５万
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）または約９万（ゲル濾過ＨＰＬ
Ｃ）のポリペプチドである。そして、その微生物の由
来、例えばM. arginini; M. arthritidis等によってＮ
末端アミノ酸が多少相違する。本発明ではこのようなＮ
末端のアミノ酸が相違したり、あるいはアミノ酸が相違
してもアルギニンデイミナーゼ作用を有するものをアル
ギニンデイミナーゼ類縁体として包含する（以下、これ
らの類縁体をも含めてアルギニンデイミナーゼとい
う）。
【０００９】本発明のアルギニンデイミナーゼ発現ベク
ターについてその創製方法を例示して説明する。
ターについてその創製方法を例示して説明する。
【００１０】本発明におけるベクターとなる部分のプラ
スミドは次のようにして調製することができる。ｔａｃ
プロモーターのフラグメントの塩基配列は公知であるの
で、このフラグメントは、ＤＮＡ合成機等を用いて容易
に製造することができる。これを市販のプラスミドｐＵ
Ｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメントと組合せ
るとよい。しかし、市販のプラスミドの切り出し、接合
等を組み合わせることによって比較的容易にｔａｃプロ
モーターのフラグメントとプラスミドｐＵＣ１８の複製
開始点（Ｏｒｉ）のフラグメントの組合せを調製するこ
とができる。例えば市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３
（ファルマシア製）を制限酵素ＰｖｕＩ及びＮｒｕＩで
切断し、ｔａｃプロモーターのフラグメントを含むサイ
ト部を得る。一方、プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素Ｐ
ｖｕＩ及びＮｒｕＩで切断した複製開始点（Ｏｒｉ）の
フラグメントを含むサイト部を得る。そして両サイトを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで接合してプラスミドｐＭＫ２を
得、これをｔａｃプロモーター及びプラスミドｐＵＣ１
８の複製開始点（Ｏｒｉ）を含むプラスミドとして用い
ることができる。
スミドは次のようにして調製することができる。ｔａｃ
プロモーターのフラグメントの塩基配列は公知であるの
で、このフラグメントは、ＤＮＡ合成機等を用いて容易
に製造することができる。これを市販のプラスミドｐＵ
Ｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメントと組合せ
るとよい。しかし、市販のプラスミドの切り出し、接合
等を組み合わせることによって比較的容易にｔａｃプロ
モーターのフラグメントとプラスミドｐＵＣ１８の複製
開始点（Ｏｒｉ）のフラグメントの組合せを調製するこ
とができる。例えば市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３
（ファルマシア製）を制限酵素ＰｖｕＩ及びＮｒｕＩで
切断し、ｔａｃプロモーターのフラグメントを含むサイ
ト部を得る。一方、プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素Ｐ
ｖｕＩ及びＮｒｕＩで切断した複製開始点（Ｏｒｉ）の
フラグメントを含むサイト部を得る。そして両サイトを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで接合してプラスミドｐＭＫ２を
得、これをｔａｃプロモーター及びプラスミドｐＵＣ１
８の複製開始点（Ｏｒｉ）を含むプラスミドとして用い
ることができる。
【００１１】また、アルギニンデイミナーゼのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡフラグメントは次のようにして
調製する。好ましくは、アルギニンデイミナーゼの構造
遺伝子中に含まれるＴＧＡコドン全てを大腸菌のトリプ
トファンコドンであるＴＧＧコドンに置換した遺伝子を
用い、これとその上流に２４０ｂｐの調節遺伝子を含む
遺伝子を、市販のプラスミドｐＵＣ１９のＳａｃＩ−Ｈ
ｉｎｄIII サイドに挿入してプラスミドｐＡＤ１２を作
成する（特開平３−１６４１７３号公報参照）。
配列をコードするＤＮＡフラグメントは次のようにして
調製する。好ましくは、アルギニンデイミナーゼの構造
遺伝子中に含まれるＴＧＡコドン全てを大腸菌のトリプ
トファンコドンであるＴＧＧコドンに置換した遺伝子を
用い、これとその上流に２４０ｂｐの調節遺伝子を含む
遺伝子を、市販のプラスミドｐＵＣ１９のＳａｃＩ−Ｈ
ｉｎｄIII サイドに挿入してプラスミドｐＡＤ１２を作
成する（特開平３−１６４１７３号公報参照）。
【００１２】このプラスミドｐＡＤ１２を図１に示すよ
うに制限酵素ＳａｃＩとＨｉｎｄIII で切断し、アルギ
ニンデイミナーゼをコードするＤＮＡフラグメントを精
製する。
うに制限酵素ＳａｃＩとＨｉｎｄIII で切断し、アルギ
ニンデイミナーゼをコードするＤＮＡフラグメントを精
製する。
【００１３】さらにまた、市販のファージベクターＭ１
３ｍｐ１９を制限酵素ＳａｃＩ及びＨｉｎｄIII で切断
し、その切断部位に前記アルギニンデイミナーゼをコー
ドするＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結
し、プラスミドＭ１３ＡＤＭＥを得る。これを用いて大
腸菌ＪＭ１０１を形質転換し、得られるプラークより調
製した二重鎖ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ
III で切断してアルギニンデイミナーゼのアミノ酸をコ
ードするＤＮＡフラグメントを得る。このフラグメント
のなかにその後に制限酵素で処理するさいに切断されて
はならないＤＮＡ配列がある場合には変異導入プライマ
ー等を用いて塩基配列を予め変換しておくとよい。
３ｍｐ１９を制限酵素ＳａｃＩ及びＨｉｎｄIII で切断
し、その切断部位に前記アルギニンデイミナーゼをコー
ドするＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結
し、プラスミドＭ１３ＡＤＭＥを得る。これを用いて大
腸菌ＪＭ１０１を形質転換し、得られるプラークより調
製した二重鎖ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ
III で切断してアルギニンデイミナーゼのアミノ酸をコ
ードするＤＮＡフラグメントを得る。このフラグメント
のなかにその後に制限酵素で処理するさいに切断されて
はならないＤＮＡ配列がある場合には変異導入プライマ
ー等を用いて塩基配列を予め変換しておくとよい。
【００１４】そして、このＤＮＡフラグメント及び、こ
のフラグメントがアルギニンデイミナーゼの塩基配列を
一部欠く場合には、その部分に相当するＤＮＡフラグメ
ントとを、前記プラスミドｐＭＫ２の制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄIII 切断部位に組入れ、ｔａｃプロモー
ター；プラスミドｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）の
フラグメント及びアルギニンデイミナーゼのアミノ酸配
列をコードするＤＮＡフラグメントを有するプラスミド
ｐＭＫＡＤとし、これで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
して増幅させる。そして、このプラスミドを制限酵素Ｐ
ｓｔＩ及びＨｉｎｄIII で切断し、これに欠失している
Ｃ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡフラグメントを
連結し、プラスミドｐＭＫ△ＣＡＤを得る。
のフラグメントがアルギニンデイミナーゼの塩基配列を
一部欠く場合には、その部分に相当するＤＮＡフラグメ
ントとを、前記プラスミドｐＭＫ２の制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄIII 切断部位に組入れ、ｔａｃプロモー
ター；プラスミドｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）の
フラグメント及びアルギニンデイミナーゼのアミノ酸配
列をコードするＤＮＡフラグメントを有するプラスミド
ｐＭＫＡＤとし、これで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
して増幅させる。そして、このプラスミドを制限酵素Ｐ
ｓｔＩ及びＨｉｎｄIII で切断し、これに欠失している
Ｃ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡフラグメントを
連結し、プラスミドｐＭＫ△ＣＡＤを得る。
【００１５】さらに、これにプラスミドの安定化をはか
るために、プラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＡｖａＩで切断し、クレノー酵素で平滑化末端と
しテトラサイクリン耐性遺伝子を得、これをプラスミド
ｐＭＫ△ＣＡＤの制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位に連結
し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して、アルギニンデ
イミナーゼ遺伝子と逆方向にテトラサイクリン遺伝子が
連結している発現プラスミドｐＡＤＴｃ１を得る。
るために、プラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＡｖａＩで切断し、クレノー酵素で平滑化末端と
しテトラサイクリン耐性遺伝子を得、これをプラスミド
ｐＭＫ△ＣＡＤの制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位に連結
し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して、アルギニンデ
イミナーゼ遺伝子と逆方向にテトラサイクリン遺伝子が
連結している発現プラスミドｐＡＤＴｃ１を得る。
【００１６】本発明の発現プラスミドは、これらの遺伝
子以外に用いたプラスミドに由来する他の遺伝子を含ん
でいても何ら支障はないが、例えばｒｒｎＢターミネー
ター、アンピシリン耐性遺伝子等のフラグメントを含ん
でいるとアルギニンデイミナーゼを高発現することがで
き、またスクリーニングが簡便となるので特に好まし
い。
子以外に用いたプラスミドに由来する他の遺伝子を含ん
でいても何ら支障はないが、例えばｒｒｎＢターミネー
ター、アンピシリン耐性遺伝子等のフラグメントを含ん
でいるとアルギニンデイミナーゼを高発現することがで
き、またスクリーニングが簡便となるので特に好まし
い。
【００１７】しかし、本発明では、ｔａｃプロモーター
のフラグメント、プラスミドｐＵＣ１８の複製開始点
（Ｏｒｉ）のフラグメント、テトラサイクリン耐性遺伝
子を含むフラグメント及びアルギニンデイミナーゼもし
くはその類縁体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡフラ
グメントが連結していることが必要であって、このフラ
グメントの１種を欠いてもアルギニンデイミナーゼは高
収率では発現しない。
のフラグメント、プラスミドｐＵＣ１８の複製開始点
（Ｏｒｉ）のフラグメント、テトラサイクリン耐性遺伝
子を含むフラグメント及びアルギニンデイミナーゼもし
くはその類縁体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡフラ
グメントが連結していることが必要であって、このフラ
グメントの１種を欠いてもアルギニンデイミナーゼは高
収率では発現しない。
【００１８】次に、このようにして得られたアルギニン
デイミナーゼ発現プラスミドｐＡＤＴｃ１で大腸菌ＪＭ
１０１株を形質転換し、テトラサイクリンを含む培地に
培養し、菌体を集菌し、これからアルギニンデイミナー
ゼを採取する。
デイミナーゼ発現プラスミドｐＡＤＴｃ１で大腸菌ＪＭ
１０１株を形質転換し、テトラサイクリンを含む培地に
培養し、菌体を集菌し、これからアルギニンデイミナー
ゼを採取する。
【００１９】培地としては２×ＴＹ培地、ＬＢ培地等適
宜の培地を使用することができ培養条件としては３７℃
前後の温度で１夜乃至数日通気攪拌培養する。培養物か
ら菌体の集菌は遠心分離等により行うとよい。また、集
められた菌体からアルギニンデイミナーゼの採取は、ま
ず菌体を生理食塩水等で洗浄し、０．１Ｍリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁させ、超音波により菌体
を破砕し、遠心分離して不溶性画分を得る。この不溶性
画分をトリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）
などの界面活性剤等で洗浄して、大腸菌の膜画分を除去
した後、塩酸グアニジン、トリス−塩酸緩衝液及び還元
剤〔例えばジチオスレイトール（−Ｓ−Ｓ−結合の切断
のために使用する）〕よりなる抽出液でアルギニンデイ
ミナーゼを抽出し、前記リン酸カリウム緩衝液で希釈す
ることにより、リフォールディングさせる。この抽出液
を濾過し、濾液をＱセファロースカラムクロマトグラフ
ィーやアルギニン−セファロースカラムにかけてアルギ
ニンデイミナーゼを精製する。このようにすると精製さ
れたアルギニンデイミナーゼを得ることができる。
宜の培地を使用することができ培養条件としては３７℃
前後の温度で１夜乃至数日通気攪拌培養する。培養物か
ら菌体の集菌は遠心分離等により行うとよい。また、集
められた菌体からアルギニンデイミナーゼの採取は、ま
ず菌体を生理食塩水等で洗浄し、０．１Ｍリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁させ、超音波により菌体
を破砕し、遠心分離して不溶性画分を得る。この不溶性
画分をトリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）
などの界面活性剤等で洗浄して、大腸菌の膜画分を除去
した後、塩酸グアニジン、トリス−塩酸緩衝液及び還元
剤〔例えばジチオスレイトール（−Ｓ−Ｓ−結合の切断
のために使用する）〕よりなる抽出液でアルギニンデイ
ミナーゼを抽出し、前記リン酸カリウム緩衝液で希釈す
ることにより、リフォールディングさせる。この抽出液
を濾過し、濾液をＱセファロースカラムクロマトグラフ
ィーやアルギニン−セファロースカラムにかけてアルギ
ニンデイミナーゼを精製する。このようにすると精製さ
れたアルギニンデイミナーゼを得ることができる。
【００２０】アルギニンデイミナーゼの活性はFenskeら
の方法〔J.Bacteriol.、126 、501〜510 (1976)〕によ
ってシトルリンを生成させ、その量をArchibald の方法
〔J.Biol. Chem. 、156 、121 〜142 (1944)〕によって
測定することにより求めることができる。
の方法〔J.Bacteriol.、126 、501〜510 (1976)〕によ
ってシトルリンを生成させ、その量をArchibald の方法
〔J.Biol. Chem. 、156 、121 〜142 (1944)〕によって
測定することにより求めることができる。
【００２１】すなわち、１０ｍＭアルギニン溶液〔０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解〕１．０ｍｌ
に、アルギニンデイミナーゼ試料溶液２０μｌを添加
し、３７℃で５〜３０分間酵素反応を行なった後、酸混
合液（Ｈ2 ＳＯ4 ：Ｈ3 ＰＯ4 ＝１：３）１ｍｌを添加
し酵素反応を停止させる。反応液に３％ジアセチルモノ
オキシム水溶液２５μｌを添加し、遮光下で１００℃で
２０分間加熱した後、室温で３０分間放冷し、４９０ｎ
ｍにおける吸光度を測定することにより、生成したシト
ルリンを定量する。尚、１分間に１μｍｏｌのシトルリ
ンを生成するアルギニンデイミナーゼ活性を１ユニット
（Ｕ）と定義する。
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解〕１．０ｍｌ
に、アルギニンデイミナーゼ試料溶液２０μｌを添加
し、３７℃で５〜３０分間酵素反応を行なった後、酸混
合液（Ｈ2 ＳＯ4 ：Ｈ3 ＰＯ4 ＝１：３）１ｍｌを添加
し酵素反応を停止させる。反応液に３％ジアセチルモノ
オキシム水溶液２５μｌを添加し、遮光下で１００℃で
２０分間加熱した後、室温で３０分間放冷し、４９０ｎ
ｍにおける吸光度を測定することにより、生成したシト
ルリンを定量する。尚、１分間に１μｍｏｌのシトルリ
ンを生成するアルギニンデイミナーゼ活性を１ユニット
（Ｕ）と定義する。
【００２２】以下に、本発明について実施例を挙げて具
体的に説明する。
体的に説明する。
【００２３】
【実施例１】アルギニンデイミナーゼ発現ベクターｐＡＤＴｃ１の作
製（図１参照 ） 図１に示すように、アルギニンデイミナーゼ発現ベクタ
ーｐＡＤ１２（特開平３−１６４１７３号公報）を制限
酵素ＳａｃＩとＨｉｎｄIII で切断し、アルギニンデイ
ミナーゼをコードするＤＮＡフラグメントを精製した。
このフラグメントとプラスミドＭ１３ｍｐ１９ＲＦを制
限酵素ＳａｃＩとＨｉｎｄIII で切断したフラグメント
をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、J. Messing〔Meth
ods in Enzymology, 101, 21-78 (1983)〕の方法に従っ
て大腸菌ＪＭ１０１を形質転換した。得られたプラーク
から単鎖ＤＮＡを調製し、アルギニンデイミナーゼのア
ミノ酸配列の２５１−２５２位の塩基配列に存在するＥ
ｃｏＲＩ部位をつぶすために Kukelの方法〔Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)〕に従い、変異導
入プライマーを用いて、ＧＡＡＴＴＣ→ＧＡＡＴＴＴの
ように変異を入れた。このようにして得られた変異アル
ギニンデイミナーゼ遺伝子を含む二重鎖ＤＮＡを制限酵
素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII で切断して、アルギニンデ
イミナーゼのＮ−末端１０アミノ酸をコードする塩基配
列が欠失したフラグメントを精製した。また、大腸菌発
現ベクターｐＭＫ２を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したの
ち、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼにより平滑末端に
し、制限酵素ＨｉｎｄIII で切断したベクターフラグメ
ントを調製した。上記２つのフラグメントを連結し、発
現ベクターを作製するために以下に示すＮ−末端をコー
ドするリンカーＤＮＡを合成した。
製（図１参照 ） 図１に示すように、アルギニンデイミナーゼ発現ベクタ
ーｐＡＤ１２（特開平３−１６４１７３号公報）を制限
酵素ＳａｃＩとＨｉｎｄIII で切断し、アルギニンデイ
ミナーゼをコードするＤＮＡフラグメントを精製した。
このフラグメントとプラスミドＭ１３ｍｐ１９ＲＦを制
限酵素ＳａｃＩとＨｉｎｄIII で切断したフラグメント
をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、J. Messing〔Meth
ods in Enzymology, 101, 21-78 (1983)〕の方法に従っ
て大腸菌ＪＭ１０１を形質転換した。得られたプラーク
から単鎖ＤＮＡを調製し、アルギニンデイミナーゼのア
ミノ酸配列の２５１−２５２位の塩基配列に存在するＥ
ｃｏＲＩ部位をつぶすために Kukelの方法〔Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)〕に従い、変異導
入プライマーを用いて、ＧＡＡＴＴＣ→ＧＡＡＴＴＴの
ように変異を入れた。このようにして得られた変異アル
ギニンデイミナーゼ遺伝子を含む二重鎖ＤＮＡを制限酵
素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII で切断して、アルギニンデ
イミナーゼのＮ−末端１０アミノ酸をコードする塩基配
列が欠失したフラグメントを精製した。また、大腸菌発
現ベクターｐＭＫ２を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したの
ち、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼにより平滑末端に
し、制限酵素ＨｉｎｄIII で切断したベクターフラグメ
ントを調製した。上記２つのフラグメントを連結し、発
現ベクターを作製するために以下に示すＮ−末端をコー
ドするリンカーＤＮＡを合成した。
【００２４】
【化１】
【００２５】以上３つのフラグメントをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより連結し大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ア
ルギニンデイミナーゼ発現プラスミドｐＭＫＡＤを得
た。次に、アルギニンデイミナーゼ遺伝子の３′−非翻
訳領域を欠失させるためにプラスミドｐＭＫＡＤを制限
酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄIII で切断し、ベクターフラグ
メントを精製した。
ーゼにより連結し大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ア
ルギニンデイミナーゼ発現プラスミドｐＭＫＡＤを得
た。次に、アルギニンデイミナーゼ遺伝子の３′−非翻
訳領域を欠失させるためにプラスミドｐＭＫＡＤを制限
酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄIII で切断し、ベクターフラグ
メントを精製した。
【００２６】また、Ｃ末端アミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡを以下に示すように４種のＤＮＡに分けて合成し構
築した。
ＮＡを以下に示すように４種のＤＮＡに分けて合成し構
築した。
【００２７】
【化２】
【００２８】４種のＤＮＡを精製したのち、５′−端の
ＤＮＡを除く２種のＤＮＡをリン酸化後、アニールし
た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、二重鎖ＤＮＡを
得た。これを上記のベクターに連結し、プラスミドｐＭ
Ｋ△ＣＡＤを得た。さらにプラスミドの安定化を考慮
し、テトラサイクリン耐性遺伝子を導入することにし
た。プラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡ
ｖａＩで切断し、１．４Ｋｂｐのテトラサイクリン耐性
遺伝子フラグメントを精製したのち、クレノー酵素で平
滑末端にした。また、プラスミドｐＭＫ△ＣＡＤを制限
酵素ＢａｍＨＩで切断したのち、クレノー酵素で平滑末
端にしたベクターフラグメントを調製し、両者のフラグ
メントをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌ＪＭ
１０９株を形質転換し、アルギニンデイミナーゼ遺伝子
と逆方向にテトラサイクリン遺伝子が連結している発現
プラスミドｐＡＤＴｃ１を得た。
ＤＮＡを除く２種のＤＮＡをリン酸化後、アニールし
た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、二重鎖ＤＮＡを
得た。これを上記のベクターに連結し、プラスミドｐＭ
Ｋ△ＣＡＤを得た。さらにプラスミドの安定化を考慮
し、テトラサイクリン耐性遺伝子を導入することにし
た。プラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡ
ｖａＩで切断し、１．４Ｋｂｐのテトラサイクリン耐性
遺伝子フラグメントを精製したのち、クレノー酵素で平
滑末端にした。また、プラスミドｐＭＫ△ＣＡＤを制限
酵素ＢａｍＨＩで切断したのち、クレノー酵素で平滑末
端にしたベクターフラグメントを調製し、両者のフラグ
メントをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌ＪＭ
１０９株を形質転換し、アルギニンデイミナーゼ遺伝子
と逆方向にテトラサイクリン遺伝子が連結している発現
プラスミドｐＡＤＴｃ１を得た。
【００２９】
【実施例２】アルギニンデイミナーゼの発現 上記発現プラスミドｐＡＤＴｃ１により形質転換された
大腸菌ＪＭ１０１株〔微工研条寄第３６１７号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３６１７）〕を１５μｇ／ｍｌのテトラサイ
クリンを含む２×ＴＹ培地（バクトトリプトン１６ｇ／
ｌ、バクトイーストエキストラクト１０ｇ／ｌ、ＮａＣ
ｌ ５ｇ／ｌ）中、３７℃で一晩培養した。培養後、１
ｍｌを集菌し、１００μｌのレムリのサンプル緩衝液に
懸濁し、加熱溶解後、３μｌをＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に供した。泳動後、クマシーブリリア
ントブルーにより染色し、脱色したところ、分子量４
５，０００の位置にアルギニンデイミナーゼの発現が認
められた（図２参照）。
大腸菌ＪＭ１０１株〔微工研条寄第３６１７号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３６１７）〕を１５μｇ／ｍｌのテトラサイ
クリンを含む２×ＴＹ培地（バクトトリプトン１６ｇ／
ｌ、バクトイーストエキストラクト１０ｇ／ｌ、ＮａＣ
ｌ ５ｇ／ｌ）中、３７℃で一晩培養した。培養後、１
ｍｌを集菌し、１００μｌのレムリのサンプル緩衝液に
懸濁し、加熱溶解後、３μｌをＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に供した。泳動後、クマシーブリリア
ントブルーにより染色し、脱色したところ、分子量４
５，０００の位置にアルギニンデイミナーゼの発現が認
められた（図２参照）。
【００３０】
【実施例３】５ｌ発酵槽中でのアルギニンデイミナーゼ生産菌の発酵 ５ｌの発酵槽において、２ｌの２％のグリセロールを含
む２×ＴＹ培地中で大腸菌ＪＭ１０１／ｐＡＤＴｃ１
（微工研条第３６１７号）の細胞を３７℃、２４時間通
気攪拌培養したところ、アルギニンデイミナーゼの発現
量は全菌体蛋白質の１５％に達した。また、菌体の生育
はＡ６６０＝２５であり、培養液１ｌあたり約１５０ｍ
ｇの発現量が得られた。
む２×ＴＹ培地中で大腸菌ＪＭ１０１／ｐＡＤＴｃ１
（微工研条第３６１７号）の細胞を３７℃、２４時間通
気攪拌培養したところ、アルギニンデイミナーゼの発現
量は全菌体蛋白質の１５％に達した。また、菌体の生育
はＡ６６０＝２５であり、培養液１ｌあたり約１５０ｍ
ｇの発現量が得られた。
【００３１】
【実施例４】アルギニンデイミナーゼ生産菌からのアルギニンデイミ
ナーゼの精製法（可溶化及び活性再生法 ） 発酵の後、培養液２ｌを遠心分離（６，０００×ｇ、１
０分間）して菌体を回収した。湿菌体を１０ｍＭリン酸
緩衝液ｐＨ７．０ ２００ｍｌに懸濁し、超音波処理し
て破菌した。この懸濁液を遠心分離にかけ、不溶性画分
である沈澱を得た。不溶性画分の沈澱を４％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００、１０ｍＭリン酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ ｐＨ７．０の溶液２００ｍｌで洗浄し、膜画分を可
溶化した。沈澱を１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で洗
浄したのち、６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭジチオスレイトールを２
５０ｍｌになるように加え室温で可溶化した。これを１
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で１００倍
希釈し、１０〜２０℃で一夜攪拌し、リフォールディン
グさせた。リフォールディング後、４９００Ｕの活性が
得られた。
ナーゼの精製法（可溶化及び活性再生法 ） 発酵の後、培養液２ｌを遠心分離（６，０００×ｇ、１
０分間）して菌体を回収した。湿菌体を１０ｍＭリン酸
緩衝液ｐＨ７．０ ２００ｍｌに懸濁し、超音波処理し
て破菌した。この懸濁液を遠心分離にかけ、不溶性画分
である沈澱を得た。不溶性画分の沈澱を４％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００、１０ｍＭリン酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ ｐＨ７．０の溶液２００ｍｌで洗浄し、膜画分を可
溶化した。沈澱を１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で洗
浄したのち、６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭジチオスレイトールを２
５０ｍｌになるように加え室温で可溶化した。これを１
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で１００倍
希釈し、１０〜２０℃で一夜攪拌し、リフォールディン
グさせた。リフォールディング後、４９００Ｕの活性が
得られた。
【００３２】
【実施例５】活性化したアルギニンデイミナーゼの精製法 実施例４で得られた希釈液を３．２μｍフイルター（ポ
ール社製）を通して濾過した。得られた濾液を１０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＱ
−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）カラム（４．
４×２ｃｍ）にかけた。適用後、平衡化緩衝液で洗浄
し、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で活性型ＡＤを段
階溶出させたところ、４５０６Ｕの活性が回収された。
活性画分を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したアルギニン−セファロース４Ｂ（ファ
ルマシア社製）カラムにかけた。０．２Ｍ ＮａＣｌを
含む平衡化緩衝液で洗浄後、以下に示す条件で溶離し
た。
ール社製）を通して濾過した。得られた濾液を１０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＱ
−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）カラム（４．
４×２ｃｍ）にかけた。適用後、平衡化緩衝液で洗浄
し、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で活性型ＡＤを段
階溶出させたところ、４５０６Ｕの活性が回収された。
活性画分を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したアルギニン−セファロース４Ｂ（ファ
ルマシア社製）カラムにかけた。０．２Ｍ ＮａＣｌを
含む平衡化緩衝液で洗浄後、以下に示す条件で溶離し
た。
【００３３】カラムの大きさ：２．２×２０ｃｍ 流 速 ：７６ｍｌ／ｈｒ 画分量 ：７．６ｍｌ 溶出液 ：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０） （０．２〜１．０Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配）
【００３４】得られた各画分について２８０ｎｍの吸光
度及びアルギニンデイミナーゼ活性を測定した。この結
果を図３及び図４に示す。この結果にみられるように、
アルギニンデイミナーゼは画分３０〜５２に含まれてい
ることが判明した。最終的に４１６０Ｕの活性が得られ
た。上記、活性画分をレムリらの方法〔Ｎａｔｕｒｅ，
７２７，６８０〜６８５（１９７０）〕に従ってＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、分
子量４５，０００の位置に単一バンドとして検出され、
完全に精製された組み換え型アルギニンデイミナーゼが
得られたことが確認された（図５）。精製標品の酵素活
性を測定した結果、比活性は３２Ｕ／ｍｇであり、マイ
コプラズマ由来のアルギニンデイミナーゼと同等の活性
を有することが判明した。各工程における精製の度合を
表１に示した。
度及びアルギニンデイミナーゼ活性を測定した。この結
果を図３及び図４に示す。この結果にみられるように、
アルギニンデイミナーゼは画分３０〜５２に含まれてい
ることが判明した。最終的に４１６０Ｕの活性が得られ
た。上記、活性画分をレムリらの方法〔Ｎａｔｕｒｅ，
７２７，６８０〜６８５（１９７０）〕に従ってＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、分
子量４５，０００の位置に単一バンドとして検出され、
完全に精製された組み換え型アルギニンデイミナーゼが
得られたことが確認された（図５）。精製標品の酵素活
性を測定した結果、比活性は３２Ｕ／ｍｇであり、マイ
コプラズマ由来のアルギニンデイミナーゼと同等の活性
を有することが判明した。各工程における精製の度合を
表１に示した。
【００３５】
【表１】 ──────────────────────────────────── 精製ステップ 全蛋白質 全活性 比活性 収 率 (mg) (U) (U/mg) （％） ──────────────────────────────────── リフォールディング N.D 4900 ─── 100 Q-セファロースFF 140.8 4506 32.0 92 アルギニン−セファロース4B 128.2 4160 32.4 85 ────────────────────────────────────
【００３６】
【実施例６】組み換え型アルギニンデイミナーゼの物性値 至適ｐＨ範囲は図６に示すように、６．０〜７．０で、
至適反応温度は図７に示すように４５〜５０℃であっ
た。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により
測定した結果、分子量は約４５，０００であった。ま
た、ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー社製）カラム
を用いたゲル濾過ＨＰＬＣ法により測定した結果、分子
量は約９０，０００であり、二量体を形成していると考
えられた。等電点電気泳動法により等電点を測定した結
果、等電点は約４．７であり、マイコプラズマ由来アル
ギニンデイミナーゼと一致した。アミノ酸組成及びＮ末
端アミノ酸配列を調べたところ、アミノ酸組成値は表２
に示すようにマイコプラズマ由来アルギニンデイミナー
ゼとほぼ同じ値を示し、Ｎ末端配列は表３に示すように
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅであり、開始コドンに由来する
Ｍｅｔは完全に除去されていることが確認された。
至適反応温度は図７に示すように４５〜５０℃であっ
た。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により
測定した結果、分子量は約４５，０００であった。ま
た、ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー社製）カラム
を用いたゲル濾過ＨＰＬＣ法により測定した結果、分子
量は約９０，０００であり、二量体を形成していると考
えられた。等電点電気泳動法により等電点を測定した結
果、等電点は約４．７であり、マイコプラズマ由来アル
ギニンデイミナーゼと一致した。アミノ酸組成及びＮ末
端アミノ酸配列を調べたところ、アミノ酸組成値は表２
に示すようにマイコプラズマ由来アルギニンデイミナー
ゼとほぼ同じ値を示し、Ｎ末端配列は表３に示すように
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅであり、開始コドンに由来する
Ｍｅｔは完全に除去されていることが確認された。
【００３７】
【表２】 アミノ酸組成分析（0.5nmol=22.5μg) ──────────────────────────────────── アミノ酸 マイコプラズマAD リコンビナントAD 理論値 ──────────────────────────────────── Asx 43.6 42.6 47 Thr 17.0 17.1 18 Ser 20.0 20.5 23 Glx 43.2 43.0 44 Gly 23.0 23.0 23 Ala 25.1 25.0 25 Cys 1.0 1.2 2 Val 29.0 29.9 34 Met 9.4 9.6 10 Ile 24.7 25.3 28 Leu 42.4 43.0 43 Tyr 13.5 14.0 14 Phe 17.5 18.0 18 His 10.2 10.5 11 Lys 27.8 28.0 28 Arg 16.3 16.7 17 Pro 18.9 19.5 19 Trp n.d n.d 5 ────────────────────────────────────
【００３８】
【表３】 Ｎ−末端アミノ酸配列分析 (1nmol=45μg) ──────────────────────────────────── サイクル アミノ酸 含 量(pmol) ──────────────────────────────────── 1 Ser 203 2 Val 916 3 Phe 756 4 Asp 299 5 Ser 186 6 Lys 801 7 Phe 705 8 Lys 333 9 Gly 580 10 Ile 618 ────────────────────────────────────
【００３９】
【発明の効果】本発明によるとアルギニンデイミナーゼ
を遺伝子工学によって大量に生産することができる。そ
して得られたアルギニンデイミナーゼはマイコプラズマ
由来のアルギニンデイミナーゼと同等の活性を示し、抗
腫瘍酵素として制癌剤に有効に利用することができる。
を遺伝子工学によって大量に生産することができる。そ
して得られたアルギニンデイミナーゼはマイコプラズマ
由来のアルギニンデイミナーゼと同等の活性を示し、抗
腫瘍酵素として制癌剤に有効に利用することができる。
【図１】本発明のアルギニンデイミナーゼ発現ベクター
の構築方法の概念図を示す。
の構築方法の概念図を示す。
【図２】大腸菌でのアルギニンデイミナーゼの発現を示
す電気泳動図を示す。
す電気泳動図を示す。
【図３】アフィニティークロマトグラフィーによるそれ
ぞれの画分におけるアルギニンデイミナーゼの活性を示
す。
ぞれの画分におけるアルギニンデイミナーゼの活性を示
す。
【図４】図３のそれぞれの画分のアルギニンデイミナー
ゼの発現を示す電気泳動図を示す。
ゼの発現を示す電気泳動図を示す。
【図５】マイコプラズマ由来のアルギニンデイミナーゼ
と本発明の遺伝子組換え型アルギニンデイミナーゼの精
製標品の電気泳動による純度検定を示す。
と本発明の遺伝子組換え型アルギニンデイミナーゼの精
製標品の電気泳動による純度検定を示す。
【図６】本発明のアルギニンデイミナーゼ活性とｐＨと
の関係を示す。
の関係を示す。
【図７】本発明のアルギニンデイミナーゼ活性と温度と
の関係を示す。
の関係を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 平３−76579（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−133383（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−133381（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−164173（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/900 C12N 9/00 - 9/99 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 ｔａｃプロモーターのフラグメント、プ
ラスミドｐＵＣ１８の複製開始点（ｏｒｉ）のフラグメ
ント、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むフラグメン
ト、及びアルギニンデイミナーゼもしくはその類縁体の
アミノ酸配列をコードするＤＮＡフラグメントが結合し
ている発現ベクターを大腸菌に形質導入した形質転換微
生物を培養して、アルギニンデイミナーゼもしくはその
類縁体を発現させ、培養物から、アルギニンデイミナー
ゼもしくはその類縁体を採取し、これを塩酸グアニジン
及び還元剤を含有する溶液で可溶化した後、リン酸カリ
ウム緩衝液でリフォールディングすることを特徴とする
活性アルギニンデイミナーゼの製造方法。 - 【請求項２】 形質転換微生物が微工研条寄第３６１７
号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６１７）として寄託されている
大腸菌である請求項１記載の活性アルギニンデイミナー
ゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30848891A JP3004788B2 (ja) | 1991-10-28 | 1991-10-28 | アルギニンデイミナーゼ発現ベクター、形質転換微生物およびアルギニンデイミナーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30848891A JP3004788B2 (ja) | 1991-10-28 | 1991-10-28 | アルギニンデイミナーゼ発現ベクター、形質転換微生物およびアルギニンデイミナーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0662867A JPH0662867A (ja) | 1994-03-08 |
| JP3004788B2 true JP3004788B2 (ja) | 2000-01-31 |
Family
ID=17981622
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30848891A Expired - Fee Related JP3004788B2 (ja) | 1991-10-28 | 1991-10-28 | アルギニンデイミナーゼ発現ベクター、形質転換微生物およびアルギニンデイミナーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3004788B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11659819B2 (en) | 2018-10-05 | 2023-05-30 | X Development Llc | Sensor positioning system |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2884717B1 (fr) | 2005-04-25 | 2009-07-03 | Erytech Pharma Soc Par Actions | Erythrocytes renfermant de l'arginine deiminase |
| FR2919804B1 (fr) | 2007-08-08 | 2010-08-27 | Erytech Pharma | Composition et vaccin therapeutique anti-tumoral |
| CN108265068B (zh) * | 2016-12-31 | 2021-06-15 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 重组精氨酸脱亚胺酶及其产业化制备方法和应用 |
-
1991
- 1991-10-28 JP JP30848891A patent/JP3004788B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11659819B2 (en) | 2018-10-05 | 2023-05-30 | X Development Llc | Sensor positioning system |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0662867A (ja) | 1994-03-08 |
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