JP2584206B2

JP2584206B2 - ヒト癌壊死因子

Info

Publication number: JP2584206B2
Application number: JP59172307A
Authority: JP
Inventors: 山田　　正明; 泰治古谷; 三津恵野竹; 純一山岸
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1984-08-17
Filing date: 1984-08-17
Publication date: 1997-02-26
Anticipated expiration: 2012-02-26
Also published as: JPS6150923A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はヒト癌壊死因子に関する。

癌壊死因子（Tumor Necrosis Factor）は癌細胞を選
択的に傷害する生理活性因子として、1975年Carswellら
により発見された。それ以来、この様な因子を抗癌剤と
して臨床に応用すべく、その生産方法，精製方法や物理
化学的諸性質に関し広汎な研究が続けられている。しか
しながら、これまでの癌壊死因子の生産方法は、哺乳動
物にあらかじめbacillus Calmette−Gurin（BCG）又
はPropionibacterium acnesを投与し、さらにエンドト
キシン等を投与するという方法であった。従って、ウサ
ギやマウス等を用いた研究は進められてきたが、ヒトで
はこの生産方法は採用できず、ヒト由来の癌壊死因子を
得ることは極めて難しい状況であった。

一方、ヒトマクロファージ由来の癌細胞傷害因子とし
て、Matthewsにより報告された、正常人の末梢単球細胞
あるいは骨髄性単球性白血病細胞が産生する因子（Anti
−tumor cytotoxin）［Immunology,44,135（1981）］，
及びReedらにより報告された、ヒト末梢血中の培養器壁
付着細胞が産生する因子（Adherent cell toxin）［J.I
mmunol.,115,395（1975）］などが知られている。ま
た、Williamsonらは、ヒトＢ細胞樹立株から産生される
分子量約７万ダルトンの物質をヒト癌壊死因子として報
告している［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,5397（198
3）］。しかし、いずれの場合もその物質としての実体
は全く不明であった。

そこで、本発明者らは遺伝子組み換え技術に着目し、
ヒト癌壊死因子の微生物による生産方法について研究を
重ね、ヒト癌壊死因子をコードするcDNAのクローン化に
成功し（特願昭59−43617号明細書参照）、さらにこの
クローン化DNAを組み込んだ形質発現ベクターで形質転
換された微生物中でヒト癌壊死因子を生産させることに
成功した（特願昭59−82653号明細書参照）。

さらに、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、この様
にして生産されたヒト癌壊死因子含有生産物から、不純
物を実質的に含まないヒト癌壊死因子ポリペプチドを得
ることに成功し、本発明を完成した。

本発明は、さらに詳しくは、下記のアミノ酸配列を有
するヒト癌壊死因子ポリペプチド及びその活性部分の一
部又は全部を有するポリペプチドに関する。

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ilu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu ［Ｉ］アミノ酸配列［Ｉ］で示されるヒト癌壊死因子ポリペ
プチド（以下単にポリペプチド［Ｉ］と記すこともあ
る。）の活性部分を一部又は全部を有するポリペプチド
には次の様な物質も包含されると理解されるべきであ
る。

ポリペプチド［Ｉ］の対立遺伝子変異体ポリペプチド
及びそのＮ末端又はＣ末端にアミノ酸又はペプチド（オ
リゴ又はポリペプチド）が結合しているポリペプチドで
あって、癌壊死因子の生理活性を示す物質、ポリペプチ
ド［Ｉ］又はその対立遺伝子変異体ポリペプチドのアミ
ノ酸配列のうち一部のアミノ酸が欠失しているが癌壊死
因子の生理活性を有するポリペプチド、例えばポリペプ
チド［Ｉ］のＮ末端部分のアミノ酸が４個欠失している
ポリペプチド、上記のポリペプチドの鎖上の側鎖官能
基、Ｎ末端のアミノ基又はＣ末端のカルボキシル基を利
用して形成される誘導体、例えばカルボキシル基と脂肪
族アルコールとのエステル類，第一級もしくは第二級ア
ミンとの酸アミド類，アミノ基のＮ−アシル誘導体又は
ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体。さらには、上記の
ポリペプチドのカルボキシル基又はアミノ基等とで形成
される塩、例えば水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，
アルギニン，カフェイン，プロカイン，塩酸，グルコン
酸等との塩。

また、上述のポリペプチドは単量体又はその集合体と
して存在しうる場合もあり、この様な集合体も本発明の
物質に当然含まれる。

以上の物質を総称して本発明物質と記すこともある。

尚、本明細書でいうヒト癌壊死因子とはヒト細胞に由
来し、（１）in vitroでマウスＬ細胞を傷害し、（２）
in vivoでMeth−Ａ肉腫を壊死させる生理活性を有する
物質を意味する。

本発明物質、特にポリペプチド［Ｉ］は次の様にして
製造単離される。

ポリペプチド［Ｉ］及びその前駆体をコードするDNA
の単離は、特願昭59−43617号明細書に記載の方法（例
えば参考例１の方法）に従って行われる。表１にヒト癌
壊死因子前駆体をコードするDNAの塩基配列及び塩基配
列から推測されるアミノ酸配列を示す。表１中，〔〕
で囲んだ部分がポリペプチド［Ｉ］をコードする領域で
ある。

ポリペプチド［Ｉ］をコードするDNA塩基配列の５′
末端に開始コドンATGを付加し、かつ３′末端に終止コ
ドンを含む塩基配列を有するDNA断片を作製し、これを
適当なプロモーター及びシャイン・ダルガーノ（SD）配
列に続いて結合させ、ベクターに組み込むことにより、
非融合型の該物質生産用の形質発現ベクターを得ること
ができる。

また、宿主中で発現し得るオペロンの構造遺伝子の翻
訳領域の途中に読み枠をあわせて、ポリペプチド［Ｉ］
をコードする領域及び終止コドンを含む塩基配列を含む
DNA断片を挿入すれば、融合型の該物質生産用の形質発
現ベクターを得ることもできる。

プロモーターとしては、例えばlac，trp，tac，pho
S，phoA，P_L,SV40初期プロモーター等が挙げられる。ベ
クターとしては、形質転換させる宿主中で増殖するもの
はすべて用いることができる。例えば、プラスミド（pB
R322等），ファージ（λファージ誘導体等），ウィルス
（SV40等）が挙げられる。また、ランナウェイプラス
ミドも有用である。

これらの形質発現ベクターを適当な宿主、例えば大腸
菌などに、例えばCohenらの方法［Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,69,2110（1972）］により導入することにより形質
転換体を得て、次いで該形質転換体を培養することによ
りポリペプチド［Ｉ］又はそのＮ末端にメチオニンが付
加されたポリペプチドを産生させることができる。該生
産物は使用したプロモーターと形質発現ベクターの構築
法により、宿主中の細胞質内又は細胞質外のいずれにも
蓄積させることができる。細胞質外に分泌させるには、
例えばアルカリホスファターゼの構造遺伝子（phoA）や
リン酸結合蛋白の構造遺伝子（phoS）を用い、それらの
シグナルペプチドをコードする領域に続いてポリペプチ
ド［Ｉ］をコードするDNAを結合させた形質発現ベクタ
ーを構築すればよい。

このようにして得られた形質転換体を、それぞれの形
質転換体に応じた適当な培養条件下で、目的のポリペプ
チド［Ｉ］が十分に産生されるまで培養したのち、培養
物からポリペプチド［Ｉ］を抽出する。産生したポリペ
プチド［Ｉ］が細胞質中に蓄積される場合は、例えば、
リゾチーム消化と凍結融解や超音波破砕，フレンチプレ
ス等により宿主細胞を破壊したのち、遠心分離又は濾過
にて抽出液を集める。また、ペリプラスムに蓄積される
場合は、例えばWillskyらの方法［J.Bacteriol.,127,59
5（1976）］に従って抽出することができる。

このようにして得られた粗製のポリペプチド［Ｉ］は
一般的な蛋白の精製法、例えば限外濾過，透析，イオン
交換クロマトグラフィー，ゲル濾過，電気泳動，アフィ
ニティクロマトグラフィー等の組み合わせにより精製す
ることができ、ポリペプチド［Ｉ］を実質的に純品とし
て得ることができる。

ポリペプチド［Ｉ］及びそのＮ末端にメチオニンが付
加されたポリペプチド以外の本発明物質は、上記の方法
に準じ、或いは後述の方法（トリプシン処理），或いは
公知の方法を適宜組み合わせて実施することにより製造
することができる。

本発明のポリペプチド［Ｉ］の特性について以下に詳
述する。

（１）物理化学的並びに化学的特性分子量実施例で得られたポリペプチド［Ｉ］の分子量を、TS
K−gel G3000SWカラム（7.5×600mm,東洋曹達工業）を
用い、ゲル濾過法により測定した。溶媒としては、0.2M
リン酸緩衝液（pH7）及び8M尿素のみ又は8M尿素と0.5％
β−メルカプトエタノールを含有する同緩衝液を用い
た。分子量既知の標準タンパクとして、ウシ血清アルプ
ミン（MW6.6×10⁴），ウサギトリオースホスフェート
イソメラーゼ（MW5.3×10⁴），オボアルプミン（MW4.
5×10⁴），ブタペプシン（MW3.27×10⁴），大豆トリ
プシンインヒビター（MW2.05×10⁴），ウマミオグ
ロビン（MW1.78×10⁴），ウマチトクロームｃ（MW1.2
4×10⁴）を用いた。

その結果、ポリペプチド［Ｉ］の分子量は尿素非存在
下では45,000±5,000ダルトン、尿素存在下では18,000
±3,000ダルトンと求められた。

実施例１項に示した形質発現プラスミドpHTR91に組み
込まれたポリペプチド［Ｉ］をコードするDNAから翻訳
されるアミノ酸残基数は155残基である。その配列から
推定される分子量は17,097ダルトンである（ただし、開
始コドンATGに由来するメチオニンを除く）。尿素存在
下でのゲル濾過分析で求められたポリペプチド［Ｉ］の
見かけの分子量はこの推定分子量とほぼ一致した。

この結果は、ポリペプチド［Ｉ］はサブユニット構造
をとり、尿素存在下では解離し単量体となるが、これら
解離剤の非存在下では、すなわち自然状態では集合体を
形成していることを示すものである。

等電点ポリペプチド［Ｉ］の等電点をpH範囲4.0〜6.5のファ
ルマライト（ファルマシア社）と５％ポリアクリルアミ
ドを含むフラットゲルを用いた等電点電気泳動法にて測
定した。その結果、ポリペプチド［Ｉ］の等電点は5.9
±0.3であった。

泳動は５ワット,3時間で行った。クーマシー・ブリリ
アント・ブルーを用いる染色で蛋白の位置を、又ゲルを
3mm間隔に切り出し、20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.8）
で抽出し、Ｌ−Ｍ細胞傷害活性を測定した。蛋白の染色
位置に一致して強い細胞傷害活性を認めた。尚、活性の
測定法は後記生物活性の項の記載に従って行った。

アミノ酸組成ポリペプチド［Ｉ］を常法に従って塩酸加水分解した
後、オルトフタルアルデヒドを用いた蛍光法による微量
アミノ酸分析システム（島津製作所）により各アミノ酸
を定量し、アミノ酸組成を求めた。

ポリペプチド［Ｉ］50μｇを6N塩酸中、110℃で、24,
48,72時間加熱し、加水分解した。各アミノ酸の含量値
は３時点の加水分解物での平均値及び補正値より算出し
た。なお、シスチン（又はシステイン）は過ギ酸酸化に
よりシステイン酸として定量し、トリプトファンは蛍光
法［Pajot,P.,Eur.J.Biochem.,63263（1976）］にて定
量した。

その結果を表３に示す。その分析値は、ポリペプチド
［Ｉ］をコードするDNAの塩基配列から推測されたアミ
ノ酸組成とよく一致した。

Ｎ末端部分アミノ酸配列ポリペプチド［Ｉ］のＮ末端部分のアミノ酸配列はエ
ドマン分解法［Arch.Biochem.Biophys.,22,475（194
9）］により決定した。

ポリペプチド［Ｉ］約140μｇをフェニルイソチオシ
アネートとカップリング反応させ、次いでＮ末端アミノ
酸をチアゾリノン誘導体として切断し、さらにフェニル
チオヒダントイン−アミノ酸に変換し、これをTSK−gel
ODS−120Aカラム（4.6×250mm,東洋曹達工業）を用い
た高速液体クロマトグラフィーにより同定し、Ｎ末端部
分のアミノ酸を決定した。さらに、この操作を順次繰り
返すことにより、Ｎ末端部分のアミノ酸配列を決定し
た。

その結果、ポリペプチド［Ｉ］のＮ末端部分のアミノ
酸配列は、Ser−Ser−Ser−Arg−Thr−Pro−Ser−Asp−
−−−であった。

遺伝子組み換え技術によりポリペプチドを生産した
時、翻訳の開始コドンATGに由来するメチオニンが目的
とするポリペプチドのＮ末端に付加されている場合のあ
ることが一般的に知られているが、実施例に従って生産
し、精製したポリペプチド［Ｉ］の場合は、そのＮ末端
にメチオニンは検出されなかった。

Ｃ末端部分アミノ酸配列ポリペプチド［Ｉ］のＣ末端部分のアミノ酸配列はカ
ルボキシペプチターゼを用いる酵素法により決定した。

ポリペプチド［Ｉ］約15μｇにカルボキシペプチター
ゼＡ（シグマ社）及びＹ（オリエンタル酵母社）を作用
させ、反応開始後２分から180分間にわたり経時的に遊
離してくるアミノ酸を分析した。

その結果、ポリペプチド［Ｉ］のＣ末端部分のアミノ
酸配列は、−−−−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−Ala−Le
uであった。

トリプシン処理ポリペプチド［Ｉ］500μｇにTPCK処理トリプシン
（シグマ社,typeXIII）20μｇを5mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.8）中、室温で５時間反応させた。この反応液を
実施例２項に示したのと同じ条件にて調製用等電点電気
泳動に付した。泳動終了後、クーマシー・ブリリアント
・ブルーによる蛋白染色と、3mm巾で切り出したゲル片
からの抽出液（20mMトリス−塩酸緩衝液,pH7.8にて抽
出）中のＬ−Ｍ細胞傷害活性の測定を行った。その結
果、ポリペプチド［Ｉ］の泳動位置（pH5.9付近）よりp
Hが約0.3程酸性側の位置に蛋白のバンドと一致するＬ−
Ｍ細胞傷害活性を認めた。

尚、活性の測定法は後記生物活性の項の記載に従って
行なった。

この物質（分解産物という）について、Ｎ末端部分及
びＣ末端部分のアミノ酸配列をそれぞれエドマン分解法
とカルボキシペプチターゼを用いる方法にて解析した。

その結果、この分解産物のＮ末端部分及びＣ末端部分
のアミノ酸配列は、それぞれThr−Pro−Ser−Asp−−−
−、及び−−−−Ile−Ala−Leuであった。すなわち、
この分解産物はポリペプチド［Ｉ］のＮ末端部分のSer
−Ser−Ser−Argの４残基が欠失したアミノ酸配列をも
つポリペプチドである。

この分解産物がＬ−Ｍ細胞傷害活性を有することか
ら、ポリペプチド［Ｉ］のアミノ酸配列のうち、少くと
もＮ末端側の４残基のアミノ酸は、その細胞傷害活性に
必ずしも必須ではないといえる。

（２）生物活性ポリペプチド［Ｉ］の生物活性はin vitroにおけるＬ
−Ｍ細胞傷害活性と、in vivoでのMeth−Ａ肉腫に対す
る抗腫瘍活性で評価した。

ポリペプチド［Ｉ］のＬ−Ｍ細胞傷害活性の比活性
は、２×10⁶単位/mg以上であった。

その測定法はRuffの方法［J.Immunol.,126,235（198
1）］に準じ、改良した方法を用いた。すなわち、ポリ
ペプチド［Ｉ］を順次培地で希釈した試料0.1mlとＬ−
Ｍ細胞（ATCC,CCL1.2）の１×10⁵個/mlの懸濁液0.1mlを
96穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・ラボラト
リー社）に加えた。培地は1v/v％のウシ胎児血清を含む
イーグルのミニマム・エッセンシャル培地（その組成
は、例えば、「組織培養」中井準之助他編集、朝倉書
店、1967年に記載されている）を用いた。マイクロプレ
ートを５％の炭酸ガスを含む空気中、37℃で48時間培養
した。培養終了後、グルタルアルデヒド20μｌを加え、
生き残った細胞を固定した。固定後、マイクロプレート
を洗浄、乾燥して、0.05％メチレンブルー溶液を0.1ml
加え、固定された細胞を染色した。余分なメチレンブル
ーを洗い流し、乾燥した後、固定された細胞に付着した
メチレンブルーを0.36N塩酸で抽出し、その665nmにおけ
る吸光度をタイターテック・マルチスキャン（フロー・
ラボラトリー社）で測定した。この吸光度は、生き残っ
た細胞数に比例する。Ｌ−Ｍ細胞の50％を殺すために必
要な生理活性量を１単位/mlと定義し、試料を加えない
対照の吸光度の50％の値に相当する試料の希釈率を、グ
ラフあるいは計算によって求め、その希釈率の逆数を試
料の生理活性量（単位/mlで表記する）とした。

尚、蛋白濃度はLowry法［J.Biol.Chem.,193,265（195
1）］により測定した。

次にポリペプチド［Ｉ］をMeth−Ａ肉腫担癌マウスに
投与し、その抗腫瘍効果をみた。

BALB/cマウス（体重約23g）の腹部皮内に２×10⁵個の
Meth−Ａ細胞を移植し、７日後に６〜7mm径の腫瘍が形
成されたマウスを選び、１群５匹で実験した。本物質の
投与量はマウス当り１×10³単位,3×10³単位及び１×10
⁴単位とし、Meth−Ａ細胞移植後７日目に静脈内又は腫
瘍内に１回投与した。なお、本標品中のエンドトキシン
含量は１×10⁴単位当り0.01ng以下であった。

腫瘍内投与群では、１×10³単位,3×10³単位,1×10⁴
単位の各投与量で投与後24時間以内に全例に腫瘍部位の
壊死反応を認め、完治したマウスは５例中それぞれ３
例,5例,5例であった。本物質を投与しなかった対照群で
は壊死反応及び完治例ともに全く認められなかった。

一方、静脈内投与群では、３×10³単位及び１×10⁴単
位の投与量で全例に壊死反応を認め、完治例は５例中そ
れぞれ３例と４例であった。

（３）免疫学的性質精製抗ウサギ癌壊死因子血清を用い、ポリペプチド
［Ｉ］とウサギ癌壊死因子との免疫学的交差性を試験し
た。精製抗ウサギ癌壊死因子血清（モルモット血清）の
作製法は特願昭59−43617号明細書の記載（参考例５の
方法）に従い行った。

この抗血清の約1,000倍希釈液はウサギ癌壊死因子の
Ｌ−Ｍ細胞傷害活性50単位を完全に中和する能力を有す
る。

本物質の100単位/ml溶液を抗血清の100倍希釈液と等
容量混合し、37℃で２時間反応させた後、Ｌ−Ｍ細胞に
対する細胞傷害活性を測定した。

その結果、本物質の活性は抗ウサギ癌壊死因子血清に
より中和されなかった。

従って、ポリペプチド［Ｉ］はウサギ癌壊死因子とは
免疫学的に区別し得るポリペプチドである。

本発明物質の製剤化にあたっては、溶液及び凍結乾燥
品のいずれでも良いが、長期安定性の点から凍結乾燥品
が望ましい。その凍結乾燥にあたっては、賦形剤や安定
化剤を添加するのが好ましい。安定化剤としては、例え
ばアルブミン，グロブリン，ゲラチン，プロタミン，プ
ロタミン塩，グルコース，ガラクトース，キシローズ，
マンニット，グルクロン酸，トレハロース，デキストラ
ン，ヒドロキシエチルデンプン，非イオン界面活性剤
（ポリオキシエチレン脂肪酸エステル，ポリオキシエチ
レンアルキルエーテル，ポリオキシエチレンアルキルフ
ェニルエーテル，ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸
エステル，ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステ
ル，ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油，ポリオキシエチ
レンヒマシ油，ポリオキシエチレンポリオキシプロピレ
ンアルキルエーテル，ポリオキシエチレンポリオキシプ
ロピレンブロックポリマー，ソルビタン脂肪酸エステ
ル，ショ糖脂肪酸エステル，グリセリン脂肪酸エステ
ル）等が挙げられる。

本発明物質は抗腫瘍剤として有用である。特にポリペ
プチド［Ｉ］はヒトに対し同種蛋白であり抗原性の面か
らもとりわけ好ましい物質である。投与方法としては非
経口投与又は局所投与がある。本発明物質は腫瘍細胞を
選択的に傷害する特性を有することから、腫瘍細胞が広
範囲に拡がっている場合や転移している場合、さらに転
移予防等を目的とし、静脈内投与や筋肉内投与の非経口
投与が用いられる。また、局在する腫瘍組織に対して
は、直接的な腫瘍内投与が望ましい。投与量は腫瘍の種
類，大きさ，症状及び投与方法により異なるが通常１回
当り１×10²〜１×10⁷単位/kg,好ましくは１×10³〜１
×10⁶単位/kgである。

以下に実施例を挙げて更に具体的に説明するが、本発
明はこれらにより限定されるものではない。

実施例 1.ポリペプチド［Ｉ］の生産ポリペプチド［Ｉ］生産用の形質発現ベクターとして
trpプロモーター及びSD配列の下流に開始コドン（ATG）
に続いてポリペプチド［Ｉ］をコードするDNA（終止コ
ドンを含む）を結合し、これをプラスミドpBR322に挿入
した組み換え体プラスミドpHTR91を大腸菌HB101に導入
し形質転換体を得た。尚、構築方法の詳細は特願昭59−
82653号明細書に記載の方法（参考例2,3の方法）に従っ
た。

この形質転換体をテトラサイクリン（12.5μg/ml）を
含むLBブロス（組成:1当り、トリプトン10g,酵母エキ
ス5g,NaC10g;pH7.5）に一夜培養し、この培養液を10
倍量の改良M9培地（組成:0.7％ Na₂HPO₄・12H₂O,0.3％
KH₂PO₄,0.05％ NaCl,0.1％ NH₄Cl,2mg/lビタミンB₁,
0.45％カザミノ酸,1mM MgSO₄,0.1mM CaCl₂,0.5％ブ
ドウ糖,12.5μg/mlテトラサイクリン）に接種し、37℃
で１時間培養し、次いでインドール−３−アクリル酸を
最終濃度20μg/mlになるように加え、更に４時間培養を
継続したのち、遠心分離により菌体を集めた。菌体を培
地容量の1/10容量の0.1％リゾチームと30mM NaClを含む
50mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）に懸濁させ、０℃で3
0分間静置した。更にドライアイス／エタノール浴での
凍結と37℃での融解を繰り返した後、遠心分離により菌
体残渣を除いた上清液を粗抽出液とした。

2.ポリペプチド［Ｉ］の精製次いで、この粗抽出液から以下に示す工程にて、ポリ
ペプチド［Ｉ］を精製した。

［陰イオン交換クロマトグラフィー］ 20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.8）であらかじめ平衡
化したDEAE−Sepharose CL−6B（ファルマシア社）のカ
ラム（5.0×20cm）に、上記の粗抽出液1030mlを付し、
次いで、3lの同緩衝液でカラムを洗浄した後、溶出溶媒
の食塩濃度を０から0.3Mまで連続的に上昇させ、流速13
3ml/時で溶出した。溶出液は10mlずつに分画し、各画分
のＬ−Ｍ細胞傷害活性を測定し、活性を有する画分を採
取した。この工程での活性回収率は53％、精製度は約９
倍であった。

［調製用等電点電気泳動］上記の工程で得られた活性画分の一部30mlを分画分子
量10,000の分子篩膜（YM10アミコン社）を装着した限外
濾過器を用いて、脱塩後、約3mlに濃縮した。この濃縮
液を調製用ゲル等電点電気泳動に付した。LKB社のイモ
ビラインを用いて、pH5.6からpH6.1の固定化pH勾配をも
つゲル平板（2.0mm×10cm×10cm）を作製し、該濃縮液
1.0mlをこのゲル平板上にのせた。電気泳動は15℃、240
0Vで、16時間行った。泳動終了後、ゲル平板上のＬ−Ｍ
細胞傷害活性を有する蛋白のバンドに相当する位置（pH
5.9付近）を中心にして10mm巾でゲル断片を切り出し、
該物質を20mMのトリス−塩酸緩衝液（pH7.8）で抽出し
た。この調製用等電点電気泳動を３回繰り返し、抽出液
を集め、限外濾過で濃縮し次いでBio−Gel P−６（バイ
オラッド社）のカラム（0.7×25cm）でゲル濾過し脱塩
した。これを精製ポリペプチド［Ｉ］とした。

このようにして精製したポリペプチド［Ｉ］について
0.1％SDSを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析
した。電気泳動後、クーマシー・ブリリアント・ブルー
で蛋白染色すると単一のバンドを示した。また同条件で
電気泳動を行い、泳動後、ゲルを3mm等間隔で切り出
し、各ゲルからの抽出液について、Ｌ−Ｍ細胞傷害活性
を測定した結果、その活性の最大を示すゲル位置は、蛋
白染色バンドの位置と一致した。

この精製したポリペプチド［Ｉ］は蛋白質1mgあた
り、２×10⁶単位のＬ−Ｍ細胞傷害活性を有していた。

精製工程における生物活性は、前記生物活性の項の記
載に従って行なった。蛋白濃度はLowry法により測定し
た。

尚、本明細書では記載の簡略化のために以下の略号を
使用した。

ＡアデニンＣシトシンＧグアニンＴチミン Ala アラニン Arg アルギニン Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Cys システイン Gln グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グリシン His ヒスチジン Ile イソロイシン Leu ロイシン Lys リジン Met メチオニン Phe フェニルアラニン Pro プロリン Ser セリン Thr スレオニン Trp トリプトファン Tyr チロシン Val バリン DNA デオキシリボ核酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム TPCK Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニルク
ロロメチルケトン cDNA 相補DNA RNA リボ核酸 mRNA 伝令RNA poly（Ａ）mRNA ポリアデニル酸伝令RNA dATP デオキシアデノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸オリゴ（dC）オリゴデオキシシチジル酸オリゴ（dG）オリゴデオキシグアニル酸オリゴ（dT）オリゴデオキシチミジル酸ポリ（Ａ）ポリアデニル酸ポリ（Ｕ）ポリウリジル酸ポリ（dA）ポリデオキシアデニル酸ポリ（dC）ポリデオキシシチジル酸ポリ（dG）ポリデオキシグアニル酸ポリ（dT）ポリデオキシチミジル酸 ATP アデノシン三リン酸 EDTA エチレンジアミン四酢酸 kbp キロ塩基対参考例１（１）ヒト癌壊死因子をコードするクローン化DNAを検
出するためのプローブの調製特願昭58−228790号に開示されている方法（参考例４
の方法）に従って、ウサギ癌壊死因子をコードするクロ
ーン化DNAを得た。このDNAを制限酵素HaeII及びAvaＩを
用いて切り出し、それぞれ第33〜120番の88bpから成るD
NA断片と第285〜583番の299bpから成るDNA断片を得た。
制限酵素AvaＩで切り出した299bpのDNA断片はウサギ癌
壊死因子をコードする領域であり、HaeIIで切り出した8
8bpのDNA断片はウサギ癌壊死因子前駆体をコードする領
域に相当する部分である。

この２種のDNA断片を³²Pで標識して、ヒト癌壊死因子
cDNAのクローニングのためのプローブとし、（８）項で
使用した。

（２）ヒト肺胞マクロファージからのmRNA画分の単離ヒト肺からリン酸緩衝化生理食塩液を用いて肺胞マク
ロファージを6.3×10⁷個採取した。この肺胞マクロファ
ージを10％牛胎児血清含有のRPMI−1640培地に懸濁させ
てペトリディッシュ（直径8cm）に１枚当たり９×10⁶個
となるように播き、37℃で５％炭酸ガス含有空気中、湿
度90〜100％で前培養した。１時間の前培養の後、エン
ドトキシン（大腸菌由来のリポポリサッカライド）,TPA
（ホルボール−12−ミリステート−13−アセテート）及
びシクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度が10μg/ml,10n
g/ml及び１μg/mlとなるように添加混和し、更に培養を
継続した。４〜4.5時間後（通算５〜5.5時間）に培養液
を吸引除去し、ディッシュ上に残ったマクロファージを
0.6％ラウロイルサルコシン酸ナトリウムと6mMクエン酸
ナトリウムを含む5Mグアニジルチオシアネート液で溶解
し、ホモジナイズした。このホモジネートを0.1M EDTA
含有5.7M塩化セシウム水溶液上に重層し、超遠心分離機
（RPS27−２ローター，日立製作所）を用い26,500rpmで
20時間遠心し、全RNA画分をペレットとして得た。これ
を0.35M NaCl,20mM Tris及び20mM EDTAを含む7M尿素液
の少量に溶解し、エタノール沈殿として回収した。全RN
Aとして159μｇが得られた。

この全RNA画分を1mM EDTAを含む10mM Tris−HCl緩衝
液（pH7.4）（以下TE液という）1mlに溶解し、65℃で５
分間加熱した。これにNaCl溶液を0.5Mとなるように加え
た後、あらかじめ0.5M NaClを含むTE液で平衡化したオ
リゴ（dT）セルロースカラムに対し、吸着したpoly
（Ａ）mRNAをTE液で溶出することにより、８μｇのpoly
（Ａ）mRNAを得た。このpoly（Ａ）mRNAを1.9ng/nlの濃
度で蒸留水に溶解し、これをアフリカツメガエルの卵母
細胞１個当たり50nlずつ注入し、前述の方法に従って、
卵母細胞中で翻訳された蛋白質のＬ−929細胞傷害活性
を測定した。その結果、10個の卵母細胞のホモジネート
0.1ml中に6.6単位/mlの活性を認め、このpoly（Ａ）mRN
A調製品中にヒト癌壊死因子のmRNAが含まれていること
を確認した。

（３）cDNAの合成（２）項で得られたpoly（Ａ）mRNAを鋳型としてグブ
ラー（Gubler）らの方法［Gene,25,263（1983）］に従
ってcDNAを合成した。

反応液量;40μｌ 50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.3）;10mM MgCl₂;10mMジ
チオスレイトール;4mMピロホスフェートナトリウム;
1.25mM dGTP,dATP,dTTP;0.5mM dCTP;0.167μM α−³²P
−dCTP（比活性3000Ci/mmole）;4μｇオリゴ(d
T)_12〜18;6μg poly（Ａ）mRNA;120単位トリ骨髄性白血
病ウイルス由来逆転写酵素。

43℃で30分間反応させた後、EDTAを加えて反応を停止
させ、フェノール−クロロホルム混液（1:1）で抽出
し、その水層に酢酸アンモニウムを最終濃度2.5Mになる
ように加え、エタノールにより反応生成物（単鎖cDNA−
RNA複合体）を沈殿させた。この単鎖cDNA−RNA複合体を
下記組成の反応緩衝液100μｌに溶解した。

反応緩衝液組成： 20mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）:5mM MgCl₂;10mM (NH
₄)₂SO₄;100mM KCl;0.15mM β−ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド;50μg/mlウシ血清アルブミン;40μ
M dGTP,dATP,dTTP,dCTP;0.9単位大腸菌リボヌクレアー
ゼH;23単位大腸菌DNAポリメラーゼＩ。

12℃で60分間、続いて22℃で60分間反応させた後、ED
TAを加えて反応を停止させ、上記と同様にフェノール−
クロロホルム混液で抽出し、エタノールにより沈殿させ
て二重鎖cDNAを得た。

（４）オリゴ（dC）テール付加cDNAの調製（３）項で得られた二重鎖cDNAに次の組成の反応緩衝
液100μｌを加え、37℃で30分間反応させ、二重鎖cDNA
にオリゴ（dC）テールを付加させた。

反応緩衝液； 2mM CoCl₂,0.2mMジチオスレイトール,0.1mM α−³²P
−dCTP（比活性3Ci/mmole）及び10単位ターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含有する100m
Mカコジル酸ナトリウム（pH7.2）。

反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール−
クロロホルム混液で抽出し、オリゴ（dC）テール付加cD
NAをエタノールにより沈殿させ回収した。これを10mM T
ris−HCl緩衝液（pH7.4）,1mM EDTA及び100mM NaClを含
む水溶液に1ml当たり２μｇのオリゴ（dC）テール付加c
DNAを含むように溶解した。

（５）オリゴ（dG）テール付加プラスミドpBR322 DNAの調製 20mM Tris−HCl緩衝液（pH7.4）,10mM MgCl₂,50mM (N
H₄)₂SO₄及び1ml当たり0.1mgのウシ血清アルブミンを含
む水溶液100μｌにpBR322を10μｇ溶解し、制限酵素Pst
Ｉエンドヌクレアーゼ15単位を加え、37℃で１時間反応
させた。反応終了後、反応液をフェノール−クロロホル
ム混液で抽出し、水層からエタノール沈殿によってDNA
を回収した。得られたDNAを前述のオリゴ（dC）テール
付加に用いた水溶液（但し³²P−dCTPの代わりに³H−dGT
Pを含む）200μｌに溶解し、ターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ80単位を用いて37℃で20分
間反応させ、約10〜15個のdG残基を取り込ませた。反応
液をフェノール−クロロホルム混液で抽出し、水層から
エタノール沈殿によってオリゴ（dG）テール付加プラス
ミドpBR322DNAを回収した。これをオリゴ（dC）テール
付加cDNAの場合と同様の緩衝液に1ml当たり20μｇのオ
リゴ（dG）テール付加プラスミドpBR322DNAを含むよう
に溶解した。

（６）組み換え体プラスミドの作製（４）項で得られたオリゴ（dC）テール付加cDNA溶液
120μｌを、（５）項で得られたオリゴ（dG）テール付
加pBR322DNA溶液120μｌと混合し、65℃で５分間、57℃
で120分間インキュベートしてアニーリングを行い、組
み換え体プラスミド溶液を調製した。

（７）形質転換体の選択（６）項で得られた組み換え体プラスミド溶液を用
い、E.coliχ 1776株を形質転換させた。即ち、E.coli
χ 1776株を、ジアミノピメリン酸100μg/ml及びチミジ
ン40μg/mlを補ったＬ−ブロス20ml中、37℃で吸光度
（600nm）が0.5となるまで培養し、菌体を４℃で遠心し
て集め、50mM CaCl₂含有10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.
3）10mlに分散し、４℃で再度遠心して沈殿させた。集
めた菌体を同じ緩衝液2mlに分散し、０℃で５分間静置
した。この分散液0.2mlに（６）項で得られた組み換え
体プラスミド溶液0.1mlを添加混合し、０℃で15分間静
置し、更に42℃で２分間保持した後、前の培養で用いた
のと同一組成のＬ−ブロス0.5mlを加えて１時間振盪培
養を行った。この培養液の一部を取り、前述の成分の他
にテトラサイクリン15μg/mlを含むＬ−ブロス寒天平板
に広げ、37℃で約12時間培養し、テトラサイクリン耐性
菌を選択してcDNAライブラリーを作製した。

（８）クローニング（７）項で得られたcDNAライブラリーについて、ヒト
癌壊死因子をコードするcDNAを含むプラスミドを持つ形
質転換体をスクリーニングするため、（１）項で得られ
たウサギ癌壊死因子をコードするDNAの制限酵素AvaＩで
切り出した断片（299 bp）の³²P標識物をプローブと
し、コロニー・ハイブリダイゼーション試験をハナハン
（Hanahan）らの方法［Gene,10,63（1980）］に従って
行った。約２万個のコロニーから、この標識プローブと
強く結合する塩基配列を含む組み換え体プラスミドを持
つ形質転換体43個を選び出した。

更に、この43個のコロニーについて、制限酵素HaeII
で切り出したウサギ癌壊死因子コード領域の上流に相当
するDNA断片（88 bp）の³²P標識物をプローブとし、二
次スクリーニングを行い、このプローブと強くハイブリ
ダイズする６個のコロニーを選び出した。この２回のス
クリーニングにより、ウサギ癌壊死因子をコードするDN
A塩基配列及びその上流部分と相同性の高い塩基配列を
含むDNAを得た。

（９）形質発現（８）項で選ばれた６個のクローン（プラスミド番号
pHTNF−1,−4,−5,−13,−22,−26）から、それぞれの
組み換え体プラスミドを取り出し、E.coliHB101株を宿
主として形質転換体を得た。それぞれの形質転換体につ
いて、ナガタ（Nagata）らの方法［Nature,284,316（19
80）］に準じて50ml培養を行った。培地にはLBブロスを
用いた。吸光度（600nm）が約0.8になるまで培養し、約
３〜５×10¹⁰個の菌体を集めた。0.1％リゾチームを含
む50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）と30mM NaClより成る
溶液の1mlに菌体を懸濁させ、氷水中で30分間静置した
後、凍結融解を６回繰返して菌体を破壊し、遠心分離し
て菌体抽出液を得た。それぞれの形質転換体から得られ
た抽出液について、Ｌ−929細胞傷害活性を測定した結
果、プラスミドpHTNF−13による形質転換体の抽出液に1
86.1単位/mlの活性を認めた。

（10）クローン化DNAの塩基配列の決定（９）項で選択された組み換え体プラスミドpHTNF−1
3による形質転換体をLBブロスで培養して菌体を得た。
この菌体をウイルキー（Wilkie）らの方法［Nucleic Ac
ids Res.,７,859（1979）］に従って処理し、プラスミ
ドDNAを得た。このプラスミドDNAを制限酵素PstＩで分
解し、分離精製してクローン化DNAを得た。このクロー
ン化DNA断片を種々の制限酵素で分解し、16種の制限酵
素断片について、それぞれの塩基配列をマキサム−ギル
バート（Maxam−Gilbert）法により脱リン酸化，³²Pに
よる末端標識，塩基特異的化学分解反応，ゲル電気泳動
及びオートラジオグラフィーを行い決定した。

その塩基配列及びこの塩基配列から翻訳されたアミノ
酸配列は表１の通りである。ヒト癌壊死因子のポリペプ
チドをコードする領域は、表４に示したウサギ癌壊死因
子をコードする塩基配列との相同性に基づいて推定し
た。即ち、ヒト癌壊死因子ポリペプチドは、表１の第23
5〜237番のTCAのコドン（Serに対応）から始まり、第69
7〜699番のCTG（Leuに対応）で終わり、155残基のアミ
ノ酸から成っている。Ｃ末端のロイシンのコドンに続い
てTGAの終止コドンがある。塩基配列第１〜234番はヒト
癌壊死因子の前駆体をコードするために必要な配列と考
えられる。

参考例２（１）ヒト癌壊死因子をコードするDNAの調製特願昭59−43617号明細書に開示された方法（参考例
１の方法）に従って得た、ヒト癌壊死因子前駆体をコー
ドするDNAを組み込んだ組み換え体プラスミドpHTNF−13
により形質転換させたE.coliHB101から得たプラスミドD
NAから、制限酵素PstＩでヒト癌壊死因子前駆体をコー
ドする領域を含むクローン化DNAを切り出し、更に非翻
訳領域の一部を制限酵素EcoRＩで分解し、約1.1kbpの断
片を得た。これをプラスミドpBR322のPstＩ−EcoRＩ断
片（約3.6kbp）に組み込むことにより再クローニング
し、このプラスミドをpHT113と名づけた。

（２）tacプロモーター付き形質発現プラスミドpHTT26
の構築 tacプロモーターベクターpDR540［Russell,D.R.,et
al.,Gene,20,231（1982）;P−Ｌバイオケミカルス社
（米国）より購入］の300μｇに制限酵素EcoRＩ（4800
単位）及びBamHＩ（2000単位）を含む2mlの反応緩衝液
［10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）,50mM NaCl,6mM MgCl
₂,6mM2−メルカプトエタノール］を加え、37℃で60分間
反応させた。終濃度0.3MになるようにNaClを加え、更に
２倍容のエタノールを加え、DNA断片をエタノール沈殿
として回収した。５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によりtacプロモーター領域を含む387bpの断片を約8.3
μｇ得た。このDNA断片に、トリエステル法で化学合成
した、開始コドンATGとヒト癌壊死因子構造遺伝子の一
部を含み、その両端がそれぞれ制限酵素BamHＩとAvaＩ
の認識配列を有する、次の式５′−GATCCATGTCATCTTCTCGAACC ３′−GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT で示されるオリゴヌクレオチドアダプターをT₄DNAリ
ガーゼを用いて結合させた。ここに得られたDNA断片
を、以下tacプロモーター・アダプター断片という。

一方、第（１）項で得たヒト癌壊死因子をコードする
DNAの組み込まれたプラスミドpHT113の300μｇに、制限
酵素HindIII（1200単位）とAvaＩ（1200単位）を上記と
同じ反応緩衝液中で37℃,60分間作用させた後、DNA断片
をエタノール沈殿として回収した。５％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により、ヒト癌壊死因子の翻訳領域の
大部分を含む578bpのDNA断片（以下HTNF断片という）を
分離精製し、約２μｇ得た。

別途に、プラスミドpBR322の50μｇに制限酵素HindII
I（1200単位）とEcoRＩ（2500単位）を上記と同じ反応
緩衝液中で37℃,120分間作用させた後、エタノール沈殿
させ、次いで0.7％低融点アガロースゲル電気泳動によ
り、アンピシリン耐性遺伝子を含む約4.3kbpのDNA断片
（以下pBR322−Amp^r断片という）を約10μｇ得た。

pBR322−Amp^r断片６μｇとHTNF断片１μｇを6.6mM Mg
Cl₂を含有する66mM Tris−HCl緩衝液（pH7.6）に溶解
し、55℃で10分間加温した後、室温で10分間放置し、次
いで1mM ATP,10mMジチオスレイトール存在下にT₄DNAリ
ガーゼ168単位を添加し、22℃で120分間反応させた後、
フェノール抽出によりDNA約４μｇを回収した。

このDNA断片0.8μｇとtacプロモーター・アダプター
断片0.3μｇを上記と同様の反応条件（但し、T₄DNAリガ
ーゼは63単位用いる）で22℃,120分間反応させた後、蒸
留水で６倍希釈し、下記の方法でカルシウム処理したE.
coli JM103［lacI ^Q;Russell,D.R.,et al.,Gene,20,231
（1982）］（Ｐ−Ｌバイオケミカルス社より購入）を等
容量添加した。これを氷水中で20分間,42℃で１分間，
室温で10分間インキュベートした後、LBブロスを加え、
37℃で60分間振盪した。その菌体懸濁液の一部を25μg/
mlのアンピシリンを含むLB寒天平板に播き、37℃で一夜
培養した後、アンピシリン耐性株を選択して形質転換体
を得た。ここで得たヒト癌壊死因子生産用形質発現プラ
スミドをpHTT26、それによるJM103株の形質転換体をE.c
oli JM103/pHTT26と名づけた。

E.coli JM103のカルシウム処理法は次の通りである。
JM103株をＬブロス（組成:1当たり、トリプトン10g,
酵母エキス5g,NaCl5gブドウ糖1g;pH7.2）の5mlに接種
し、37℃で一夜培養した。その菌体懸濁液の1mlを100ml
のＬブロスに接種し、濁度（吸光度650nm）が0.6になる
まで37℃で培養した。氷水中で30分間静置後、菌体を遠
心分離により集め、これを50mlの50mM CaCl₂に懸濁し、
０℃で60分間静置した。次いで、遠心分離により菌体を
集め、20％グリセリンを含む50mM CaCl₂の10mlに再懸濁
し、これをカルシウム処理E.coli JM103とした。

（３）非融合型ヒト癌壊死因子の生産第（２）項で得た形質転換体E.coli JM103/pHTT26をL
Bブロス中37℃で一夜振盪培養した。その菌体懸濁液の
0.5mlを5mlのLBブロスに接種し、37℃で１時間培養後、
終濃度1mMになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシドを添加し、更に４時間培養した。菌体
を遠心分離により集め洗浄した後、0.1％リゾチームを
含む50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）−30mM NaCl液の1m
lに再懸濁し、０℃で30分間静置した後、ドライアイス
／エタノール浴での凍結と37℃での融解を６回繰り返し
た。次いで、遠心分離により菌体残渣を除き、清澄な上
清液を得た。

この上清液中のヒト癌壊死因子活性（Ｌ−929細胞傷
害活性）は9.9×10⁴単位/mlであった。

参考例３ trpプロモーターを用いて、ヒト癌壊死因子生産用形
質発現プラスミドを構築した。制限酵素による切断及び
T₄DNAリガーゼによる結合の反応条件は、参考例２の第
（２）項とほぼ同じである。

（１）trpプロモーター付き形質発現プラスミドpHTR91
の構築（第１及び２図参照）参考例２の第（１）項で得たプラスミドpHT113に制限
酵素AvaＩとSalを作用させることにより、３種のDNA断
片（それぞれ約0.8kbp,1.3kbp及び2.6kbp）が生じた。
これらの断片のうち、ヒト癌壊死因子をコードする領域
の大部分とプラスミドpBR322のテトラサイクリン耐性遺
伝子の一部を含む約1.3kbpのDNA断片を分離精製した。
この断片に、次の式５′−CGATATGTCATCTTCTCGAACC ３′−TATACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT で示される合成オリゴヌクレオチドアダプターをT₄DN
Aリガーゼを用いて結合させた。ここに得られたDNA断片
を、以下HTNF−アダプタ−断片という（第１図参照）。

一方、trpプロモーターベクターpDR720［Russell,
D.R.,et al.,Gene,20,231（1982）;P−Ｌバイオケミカ
ルス社より購入］に制限酵素EcoRＩとHpaＩを作用さ
せ、trpプロモーター領域の一部を含むDNA断片（35bp）
を切り出し、これに次の式５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAAT ３′−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCATTAGC で示される合成オリゴヌクレオチドアダプターをT₄DN
Aリガーゼを用いて結合させた。ここに得られたDNA断片
を、以下trpプロモーター断片という。

別途に、プラスミドpBR322に制限酵素EcoRIとSalＩを
作用させ、大きなDNA断片（約3.7kbp）を切り出した。
これに、先に調製したHTNF−アダプター断片とtrpプロ
モーター断片をT₄DNAリガーゼを用いて結合させ、ヒト
癌壊死因子発現プラスミドを構築し、参考例２の第
（２）項と同様にして形質転換体を得た。但し、宿主と
してE.coli HB101を用い、形質転換体の選択はテトラサ
イクリン（12.5μg/ml）耐性で行った。ここで得た形質
発現プラスミドをpHTR91、それによる形質転換体をE.co
li HB101/pHTR91と名づけた。

第２図はtrpプロモーター付き形質発現プラスミドpHT
R91の構築工程を示す。

参考例４（１）ウサギ肺胞マクロファージからのmRNA分画の単離
精製ウサギ（体重約2.5kg）にプロピオニバクテリウム
アクネス（Propionibacterium acnes）死菌体を１羽当
り100mgの投与量で静脈内に注入し、８日後に屠殺し
た。直ちに開胸気管切開し、気管内に挿入したチューブ
を介してリン酸緩衝化生理食塩液を用い肺洗浄を繰返
し、肺胞マクロファージを採取した。12羽のウサギより
約３×10⁹個の肺胞マクロファージが得られた。この肺
胞マクロファージを10％牛胎児血清含有のRPMI−1640培
地に懸濁させてペトリディッシュ（直径8cm）に１枚当
り２×10⁷個となるように播き、37℃で５％炭酸ガス含
有空気中、湿度90〜100％で前培養した。１時間の前培
養の後、エンドトキシン（大腸菌由来のリポポリサッカ
ライド）,TPA（ホルボール−12−ミリステート−13−ア
セテート）及びシクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度が
10μg/ml,10ng/ml及び１μg/mlとなるように添加混和
し、更に培養を継続した。４〜4.5時間後（通算５〜5.5
時間）に培養液を吸引除去し、ディッシュ上に残ったマ
クロファージを0.6％ラウロイルサルコシン酸ナトリウ
ムと6mMクエン酸ナトリウムを含有する5Mグアニジルチ
オシアネート液で溶解しホモジナイズした。このホモジ
ネートを0.1M EDTA含有5.7M塩化セシウム水溶液上に重
層し、超遠心分離機（RPS27−２ローター，日立製作
所）を用い26,500rpmで20時間遠心し全RNA画分をペレッ
トとして得た。これを0.35M NaCl,20mM Tris及び20mM E
DTAを含む7M尿素液の少量に溶解し、エタノール沈殿と
して回収した。12羽のウサギより全RNAとして5.2mgが得
られた。

この全RNA画分を1mM EDTAを含む10mM Tris−HCl緩衝
液（pH7.4）（以下TE液という）2mlに溶解し、65℃で５
分間加熱した。これにNaCl溶液を0.5Mとなるように加え
た後、あらかじめ0.5M NaClを含むTE液で平衡化したオ
リゴ（dT）セルロースカラムに付し、吸着したpoly
（Ａ）mRNAをTE液で溶出することにより、314μｇのpol
y（Ａ）mRNAを得た。ここで得たpoly（Ａ）mRNAの200μ
ｇをアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％,6M尿素存
在下,pH4）に付し、その分子サイズに従って７つの画分
に分け、ゲルを融解（70℃,10分間）させた後、水飽和
フェノールによる抽出とクロロホルムによる抽出のの
ち、エタノールにより沈殿させて各画分よりpoly（Ａ）
mRNAを回収した。各画分のpoly（Ａ）mRNAについてアフ
リカツメガエルの卵母細胞を用いる方法でウサギ癌壊死
因子mRNA量を測定し、分子サイズとして1.6〜2.7kbに相
当する画分にウサギ癌壊死因子mRNAを高濃度に回収し
た。この精製poly（Ａ）mRNAの比活性は約1,230単位／
μgRNAであり、未精製poly（Ａ）mRNA調製品の比活性約
320単位／μgRNAに比べて約４倍に濃縮された。

ここで得られた精製poly（Ａ）mRNAを以下の実験に用
いた。

（２）cDNAの合成精製poly（Ａ）mRNA4μｇを用い以下に示す条件でcDN
Aを合成した。

反応液量;100μｌ 50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.3）;10mM MgCl₂;70mM KC
l;1mMジチオスレイトール;0.5mM dTTP,dCTP,dATP,dGTP
（但しdCTPは³²Pで標識，比活性4.4×10⁶cpm/nmole）;3
μｇオリゴ(dT)_12〜18,80単位トリ骨髄性白血病ウイル
ス由来逆転写酵素。

43℃で90分間反応させた後、EDTA水溶液で反応を停止
させた。フェノール−クロロホルム混液（1:1）によりc
DNA−mRNA複合体を抽出し、エタノールにより沈殿させ
回収した。更に、アルカリ加温処理することによりmRNA
を分解除去した後、合成された単鎖cDNAをエタノールに
より沈殿させ回収した。

この単鎖cDNAの沈殿を下記組成の反応緩衝液40μｌに
溶解した。

反応緩衝液； 0.5mM dATP,dTTP,dGTP,dCTP;5mM MgCl₂;70mM KCl;1.5
mM β−メルカプトエタノール;8単位大腸菌DNAポリメラ
ーゼＩ（ラージフラグメント）を含有する0.1Mヘペス
（Hepes）緩衝液（pH6.9）。

15℃で20時間反応させ二重鎖cDNAを合成した。反応液
にドデシル硫酸ナトリウム水溶液を加えて反応を停止さ
せ、二重鎖cDNAをフェノール−クロロホルム混液で抽出
し、エタノールにより沈殿させ回収した。

得られた二重鎖cDNAの沈殿を、50mM酢酸ナトリウム
（pH4.5）,1mM ZnSO₄,200mM NaCl,0.5％グリセロール及
びS1ヌクレアーゼ0.5単位を含有する水溶液100μｌに溶
解し、37℃で20分間反応させてヘアピン構造を開裂させ
た。反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール
−クロロホルム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出し
た後、エタノールにより沈殿させcDNAを回収した。

（３）オリゴ（dC）テール付加cDNAの調製上記により得られた二重鎖cDNAに次の組成の反応緩衝
液100μｌを加え37℃で20分間反応させ、二重鎖cDNAに
オリゴ（dC）テールを付加させた。

反応緩衝液； 1mM CoCl₂,0.1mMジチオスレイトール,0.2μｇポリ
（Ａ）,0.1mM ³H−dCTP（比活性5400cpm/pmol）及び10
単位ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼを含有する130mMカコジル酸ナトリウム−30mM Tris
−HCl緩衝液（pH6.8）。

反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール−
クロロホルム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出した
後、オリゴ（dC）テール付加cDNAをエタノールにより沈
殿させ回収した。これを10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.
4）,1mM EDTA及び100mM NaClを含む水溶液に1ml当り0.2
μｇのオリゴ（dC）テール付加cDNAを含むように溶解し
た。

（４）オリゴ（dG）テール付加プラスミドpBR322DNAの
調製 20mM Tris−HCl緩衝液（pH7.4）,10mM MgCl₂,50mM (N
H₄)₂SO₄及び1ml当り0.1mgのウシ血清アルブミンを含む
水溶液100μｌにpBR322を10μｇ溶解し、制限酵素PstＩ
エンドヌクレアーゼ15単位を加え、37℃で１時間反応さ
せた。反応終了後、反応液をフェノール抽出し、水層か
らエタノール沈殿によってDNAを回収した。得られたDNA
を前述のオリゴ（dC）テール付加に用いた水溶液（但し
³H−dCTPの代りに³H−dGTPを含む）200μｌに溶解し、
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
80単位を用いて37℃で20分間反応させ、約10〜15個のdG
残基を取り込ませた。反応液を水飽和フェノール−クロ
ロホルム混液で抽出し、水層からエタノール沈殿によっ
てオリゴ（dG）テール付加プラスミドpBR322DNAを回収
した。これをオリゴ（dC）テール付加cDNAの場合と同様
の緩衝液に1ml当り２μｇのオリゴ（dG）テール付加プ
ラスミドpBR322DNAを含むように溶解した。

（５）組み換え体プラスミドの作製オリゴ（dC）テール付加cDNA溶液50μｌをオリゴ（d
G）テール付加pBR322DNA溶液50μｌと混合し、65℃で10
分間、57℃で120分間、45℃で60分間、35℃で60分間及
び室温で60分間インキュベートしてアニーリングを行
い、組み換え体プラスミド溶液を調製した。

（６）形質転換体の選択上記で得られた組み換え体プラスミド溶液を用い、E.
coli χ1776株を形質転換させた。即ち、E.coli χ17
76株を、ジアミノピメリン酸100μg/ml及びチミジン40
μg/mlを補ったＬ−ブロス20ml中、37℃で吸光度（600n
m）が0.5となるまで培養し、菌体を冷却器付遠心分離機
で集め、50mM CaCl₂含有10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.
3）10mlに分散し、０℃で再度遠心して沈殿させた。集
めた菌体を同じ緩衝液2mlに分散し、０℃で５分間静置
した。この分散液0.2mlに上記組み換え体プラスミド溶
液0.1mlを添加混合し、０℃で15分間静置し、更に42℃
で２分間保持した後、前の培養で用いたのと同一組成の
Ｌ−ブロス0.5mlを加えて１時間振盪培養を行った。こ
の培養液の一部を取り、前述の成分の他にテトラサイク
リン15μg/mlを含むＬ−ブロス寒天平板に広げ37℃で約
12時間培養し、テトラサイクリン耐性菌を選択してcDNA
ライブラリーを作製した。

（７）ハイブリダイゼーション試験前記のcDNAライブラリーについて、ウサギ癌壊死因子
をコードするcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換体を
スクリーニングするため³²P標識cDNAプローブを用いる
コロニー・ハイブリダイゼーション試験をハナハン（Ha
nahan）らの方法［Gene,10,63（1980）］に従って行っ
た。³²P標識cDNAプローブは、誘導プラス及びマイナス
肺胞マクロファージより上記（１）項の方法で得たmRNA
を鋳型として、（２）項の方法で合成した。但し、³²P
−dCTPは高放射能比活性のものを用い、高濃度に標識し
た。この試験により誘導プラスのプローブと強く結合
し、誘導マイナスのプローブとはハイブリダイズしない
塩基配列を含む組換え体プラスミドを有する形質転換体
を選別した。約２万個のコロニーから50個のコロニーが
選び出された。

次いで、これらの選択された菌株についてハイブリダ
イゼーション・トランスレーション試験を“モレキュラ
ークローニング”〔Maniatis,T.,et al.,（ed）“Mol
ecular Cloning",329（1980）,Cold Spring Harbor La
b.〕に記載の方法に従って行った。それぞれの形質転換
体よりプラスミドDNAを抽出し、ニトロセルロースフィ
ルター上に加熱変性させたのち固定し、これに上記
（１）項で得たウサギ癌壊死因子mRNAを含むpoly（Ａ）
mRNA画分を加え、50℃で180分間反応させ、ハイブリダ
イゼーションを行った。結合したmRNAを溶出回収した後
アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、回収されたmR
NAがウサギ癌壊死因子mRNAであるか否かを検定した。こ
の試験により、上記で選択された20個の形質転換体より
ウサギ癌壊死因子mRNAと強くハイブリダイズするcDNAを
含むプラスミドを持つ菌株３個を見いだした。そのうち
最も長いcDNA（約750bp）を有するプラスミドより、制
限酵素DdeＩでDNA断片を切り出し、二次スクリーニング
用のプローブとした。このDNA断片を³²Pで標識し、上記
（６）項で得たcDNAライブラリーについて再度コロニー
・ハイブリダイゼーション試験を行い、標識プローブと
強く結合するcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換体を
選んだ。cDNAライブラリーの約６万個のコロニーのうち
98個が陽性コロニーであった。これからcDNAを制限酵素
PstＩで切り出し、そのサイズをポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で調べ、1kbp以上のサイズを有する17個のク
ローンを選び出した。これらのうち最も大きなcDNAを含
む形質転換体（菌体番号:RTNF802,クローン化DNA番号:p
RTNF802）について、クローン化DNAを単離し、次の方法
で塩基配列を決定した。

（８）クローン化DNAの塩基配列の決定（７）項で選択された菌株（RTNF802）をジアミノピ
メリン酸及びチミジンを添加したＬ−ブロスで培養して
菌体を得た。この菌体をウイルキー（Wilkie）らの方法
［Nucleic Acids Res.,７,859（1979）］に従って処理
し、プラスミドDNAを得た。このプラスミドDNAを制限酵
素PstＩで分解し、精製分離してクローン化DNAを得た。
このクローン化DNA断片を種々の制限酵素で分解し、適
当な制限酵素断片についてそれぞれの塩基配列をマキサ
ム−ギルバート（Maxam−Gilbert）法により脱リン酸
化，³²Pによる末端標識，塩基特異的化学分解反応，ゲ
ル電気泳動及びオートラジオグラフィーから決定した。

その塩基配列は次の表４の通りである。

参考例５ウサギ癌壊死因子の単離精製ウサギ（体重2.5〜3.0kg）にプロピオニバクテリウム
アクネス（Propionibacterium acnes）死菌体50mgを
耳静脈より注射した。８日後にエンドトキシン（大腸菌
由来のリポポリサッカライド）100μｇを耳静脈より注
射し、２時間後に心臓より全採血した。採取した血液に
100ml当り100単位のヘパリンナトリウムを加えた後、5,
000rpmで30分間冷却遠心操作を行い、血球及び不溶固形
物を除去した。400羽のウサギより3,000単位/mlの力価
を有する血漿24lが得られた。

この血漿24lにEDTA24g及びセライト240gを加え１時間
撹拌した後、孔径３μ,1μ及び0.2μのフィルターで順
次濾過した。

濾過24lに0.04M Tris−HCl緩衝液（pH7.8）12lを加え
た後、0.1M NaClを含む0.04M Tris−HCl緩衝液（pH7.
8）で十分に平衡化したDEAE−セファロースCL−6B（フ
ァルマシア社）のカラム（27×45cm）に徐々に付した。
次いでカラム平衡化緩衝液75l及び0.15M NaClを含む0.0
4M Tris−HCl緩衝液（pH7.8）50lで順次洗浄後、0.18M
NaClを含む0.04M Tris−HCl緩衝液（pH7.2）を用いて溶
出した。溶出液は8lずつ分画して活性画分を集めた。こ
の活性画分に同容量の0.04M Tris−HCl緩衝液（pH7.8）
を加えて希釈した後、DEAE−セファロースCL−6Bのカラ
ム（10×13cm）に付した。次いで0.1M NaClを含む0.04M
Tris−HCl緩衝液（pH7.8）１を用いて洗浄した後、
0.18M NaClを含む0.04M Tris−HCl緩衝液（pH7.2）5lを
用いて溶出した。溶出液は250mlずつ分画して活性画分
を集めた。

次にこの溶出液を容器に移し70℃の湯浴中に浸し、撹
拌しながら溶出液の温度が60℃になるまで加熱した。そ
の後60℃の別の湯浴に移し、30分間加熱処理した後、速
やかに４℃に冷却した。加熱処理した溶液は、限外濾過
により濃縮した。

0.1M NaClを含む0.005Mリン酸緩衝液（pH7.4）で十分
に平衡化したセファクリルＳ−200（ファルマシア社）
のカラム（５×80cm）に上記濃縮液を付し、同緩衝液で
溶出した。40mlずつ分画して活性画分を採取し、限外濾
過により濃縮した。

ゲル濾過によって得られた活性画分の濃縮液をZn²⁺キ
レートセファロースカラムに付した。ポラス（Porath）
らの方法〔Nature,258,598（1975）〕で得られたキレー
トセファロース（イミノジ酢酸固定化樹脂）を充填した
カラム（1.6×20cm）に、1mg/mlの塩化亜鉛水溶液120ml
を流した。次いで0.1M NaClを含む0.05Mリン酸緩衝液
（pH7.4）で十分に平衡化した後、前工程で得られた濃
縮液を付し、同緩衝液で溶出した非吸着画分を採取し
た。活性はこの画分にほとんどが回収された。

前精製工程で得られた活性画分を濃縮し、0.15M NaCl
を含む0.005Mリン酸緩衝液（pH7.4）で十分に平衡化し
たトヨパールHW−55（東洋ソーダ株式会社）のカラム
（1.5×90cm）に付した。同緩衝液で溶出し活性画分を
採取した。全精製工程を通しての活性の回収率は60％、
精製度は7.5×10⁴倍であった。このようにして得られた
精製ウサギ癌壊死因子の比活性は6.0×10⁶単位/mg蛋白
質であった（活性単位の定義は特開昭58−174330号のそ
れと同じである）。また、マウスに移植したMeth A肉腫
を用いる生物評価において、１匹当り3,000〜5,000単位
を静脈内に投与した場合の活性は（＋）以上であった。

参考例６抗ウサギ癌壊死因子抗体の作製参考例５で得られた精製ウサギ癌壊死因子1.9×10⁵単
位を含む溶液を等量のフロインドの完全アジュバントと
乳濁化し、それをモルモットの背部皮下数カ所に注射し
た。その後、1,3及び６週後に同様の方法で免疫した。
更に８週後に、同量の精製ウサギ癌壊死因子を水酸化ア
ルミニウムゲルとともに腹腔内に注射した。最初の免疫
から９週後に心臓より全採血し、遠心分離により血清を
分離することによって抗ウサギ癌壊死因子抗体を含む抗
血清を得た。

この抗血清を、正常ウサギ血清成分を吸着させたセフ
ァロース4B（ファルマシア社）カラムに３回繰返して通
過させることにより非特異的な抗体を除去し、ウサギ癌
壊死因子に対する特異抗体のみを含む精製抗血清を得
た。この抗血清は、免疫電気泳動法及びゲル内二重拡散
法により精製ウサギ癌壊死因子との間にのみ単一の沈降
線を形成した。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例３のHTNF−アダプター断片の構築工程を
示し、第２図は参考例３のtrpプロモーター付形質発現
プラスミドpHTR91の構築工程を示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山岸純一豊中市上新田２丁目23の14 (56)参考文献特開昭60−252496（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記のアミノ酸配列： Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu を有するヒト癌壊死因子ポリペプチドのその配列のＮ末
端側の１〜４個のアミノ酸残基を欠失せしめたアミノ酸
配列を有するポリペプチド。
【請求項２】下記のアミノ酸配列を有する特許請求の範
囲第１項記載のポリペプチド。 Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu