JP3012908B2 - ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド多量体の融合タンパク質（▲ｉ▼） - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、DHFRと略
す。）と抗アレルギー性ペプチドであるアスパラギン酸
（Asp）−セリン（Ser）−アスパラギン酸（Asp）−グ
リシン（Gly）−リジン（Lys）の５個のアミノ酸配列よ
りなるペプチド（以下、DSDGKと略す。）を繰り返し単
位とする多量体をアルギニンを介在アミノ酸として含む
融合タンパク質（以下融合タンパク質（Ｉ）と略す。）
を大量に生産可能とする新規組換えプラスミド、そのプ
ラスミドを含有する大腸菌、DHFR−DSDGK多量体の融合
タンパク質（Ｉ）、DHFR−DSDGK多量体の融合タンパク
質（Ｉ）の製造法、DSDGK多量体の製造法及びDSDGKの製
造法に関するものである。本発明は、発酵工学、医薬品
工業などの分野に有効に利用されるものである。

〔従来の技術〕

DSDGKは、抗アレルギー性ペプチドの一種であり、ケ
ミカルメディエーターに起因して発症するアレルギー性
鼻炎、アレルギー性皮膚炎、気管支喘息及びその他のア
レルギー性疾患の予防薬及び治療薬としての利用が期待
される興味深い生理活性ペプチドである（特開平１−31
6398号）。

アミノ酸数の少ないオリゴペプチドの製造方法として
は、通常、化学合成法が知られているが、近年は遺伝子
組換え技術によっても容易に製造しうる方法が開発され
ている。例えば、巌倉らは大腸菌のDHFRを大量に発現さ
せることが可能なプラスミドpTP70−１を作製し（特開
昭63−267276号）、DHFRのカルボキシル末端アミノ酸付
近をコードする塩基配列を種々改変して異種遺伝子を導
入し、有用なポリペプチドをDHFRとの融合タンパク質の
状態で大腸菌に産生させた。その例としてはソマトスタ
チン（特開平１−144977号、特開平１−144995号）、ブ
ラジキニン（特開平１−252289号）がある。

また、巌倉らはDHFRの生産効率を高める目的で、効率
のよいターミネート領域として知られるrrnB遺伝子とpT
H70−１を使用して組換えプラスミドpTH104−４を作製
し（特開平１−144979号）、それを利用してDHFR−ロイ
シンエンケファリン融合タンパク質を発現させることの
できる組換えプラスミドpLEK1の作製も行っている。こ
こで得られる融合タンパク質はDHFRの酵素活性も保持さ
れているので、その精製はDHFRの特性と活性を利用して
容易に行われている。また、目的とするペプチドは、融
合タンパク質をブロモシアン処理もしくはトリプシン処
理した後、HPLCで精製して取得されている（特開平１−
252290号）。

これらの例では、目的とするポリペプチドの産生量の
増大を図るため、プロモータ領域やターミネータ領域の
改変が行われているが、目的とするポリペプチドをタン
デムに複数個連結させたポリペプチドを産生させること
も行われている（特開昭61−31090号）。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の課題は、DSDGKを遺伝子操作技術により大量
に製造することにあり、このために、DSDGKを繰り返し
単位とする多量体をコード化する遺伝子を組み込んだ有
効なプラスミドを作製しようとするものである。そして
このプラスミドは下記の要件を満たすことが必要であ
る。

（ｉ）DSDGKを繰返し含む融合タンパク質（Ｉ）として
産生することができるものであること （ii）融合タンパク質（Ｉ）の遺伝子を大量発現させる
ものであること （iii）産生される融合タンパク質（Ｉ）の精製が容易
なものであること （iv）融合タンパク質（Ｉ）からのDSDGKの分離が容易
なものであること 〔課題を解決するための手段〕 本発明者らは、鋭意研究の結果、大腸菌のジヒドロ葉
酸還元酵素遺伝子を用いることにより、上記課題が解決
できることを見いだし、その知見に従ってDHFRとDSDGK
の多量体からなる融合タンパク質（Ｉ）をコード化する
遺伝子を組み込んだ組換えプラスミドを作製し、本発明
を完成させた。

すなわち、本発明は下記のアミノ酸配列を有する（ジ
ヒドロ葉酸還元酵素）−（アスパラギン酸−セリン−ア
スパラギン酸−グリシン−リジン）ｎの融合タンパク質
（ｎは２から10）をコードする塩基配列を含む組換えプ
ラスミドにある。

（式中、＿は介在アミノ酸Argを示す） 上記組換えプラスミドにおけるジヒドロ葉酸還元酵素
−抗アレルギー性ペンタペプチド多量体の融合タンパク
質（Ｉ）において、抗アレルギー性ペンタペプチドが二
量体である融合タンパク質（Ｉ）は下記のアミノ酸配列
を有するものである。

（式中、＿はジヒドロ葉酸還元酵素と抗アレルギー性ペ
ンタペプチドとの介在アミノ酸を示す） 上記抗アレルギー性ペンタペプチドが二量体である融
合タンパク質（Ｉ）をコードする塩基配列としては例え
ば下記の塩基配列が挙げられる。

（式中、＿はジヒドロ葉酸還元酵素と抗アレルギー性ペ
ンタペプチドとを介在するアミノ酸をコードする塩基配
列を示す） 更に、上記組換えプラスミドにおけるジヒドロ葉酸還
元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド多量体の融合タ
ンパク質（Ｉ）において抗アレルギー性ペンタペプチド
が三量体である融合タンパク質（Ｉ）は、下記のアミノ
酸配列を有するものである。

（式中、＿は前記と同じ意味である） 上記抗アレルギー性ペンタペプチドが三量体である融
合タンパク質（Ｉ）をコードする塩基配列としては下記
の塩基配列が挙げられる。

（式中、＿は前記と同じ意味である） 更に上記抗アレルギー性ペンタペプチドが二量体であ
る融合タンパク質（Ｉ）をコードする塩基配列を含む組
換えプラスミドには、大腸菌において安定に複製され、
宿主である大腸菌にトリメトプリム耐性及びアンピシリ
ン耐性を与え、かつ4655塩基対の大きさを有するものが
含まれる。

更に上記の抗アレルギー性ペンタペプチドが三量体で
ある融合タンパク質（Ｉ）をコードする塩基配列を含む
組換えプラスミドには、大腸菌において安定に複製さ
れ、宿主である大腸菌にトリメトプリム耐性及びアンピ
シリン耐性を与え、かつ4670塩基対の大きさを有するも
のが含まれる。

上記組換えプラスミドには第１図の塩基配列を有する
組換えプラスミドpBBK7DAが含まれる。

更に、上記組換えプラスミドには第２図の塩基配列を
有する組換えプラスミドpBBK5.6TAが含まれる。

更に本発明は上記組換えプラスミドにより形質転換さ
れた大腸菌にある。

更に本発明は下記のアミノ酸配列を有するジヒドロ葉
酸還元酵素−Arg−抗アレルギー性ペンタペプチド二量
体の融合タンパク質にある。

（式中、＿は前記と同じ意味である） 更に本発明は、下記のアミノ酸配列を有するジヒドロ
葉酸還元酵素−Arg−抗アレルギー性ペンタペプチド三
量体の融合タンパク質にある。

（式中、＿は前記と同じ意味である） 更に本発明は上記形質転換した大腸菌を培養し、培養
菌体から上記ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペ
ンタペプチド二量体の融合タンパク質（Ｉ）又はジヒド
ロ葉酸還元酵素抗−アレルギー性ペンタペプチド三量体
の融合タンパク質（Ｉ）を採取することを特徴とするジ
ヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド多
量体の融合タンパク質（Ｉ）の製造方法にある。そし
て、前記ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタ
ペプチド多量体の融合タンパク質（Ｉ）の採取工程は、
培養菌体の無細胞抽出液から、ストレプトマイシン処
理、硫安沈澱、及びメソトリキセート結合アフィニティ
クロマトグラフィーを順次用いて精製する工程を含むも
のである。

更に本発明はジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性
ペンタペプチド多量体の融合タンパク質（Ｉ）を酵素処
理することにより、アスパラギン酸−セリン−アスパラ
ギン酸−グリシン−リジンのアミノ酸配列からなる抗ア
レルギー性ペンタペプチドを採取することにある。

そして、上記の酵素処理に用いる酵素としては、トリ
プシンが挙げられる。

以下に本発明の詳細を（１）新規組換えプラスミドの
作製、（２）形質転換された大腸菌、（３）DHFR−DSDG
K多量体の融合タンパク質（Ｉ）の製造工程、（４）得
られたDHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質（Ｉ）、
（５）DSDGK多量体の製造工程、（６）DSDGKの製造工
程、の順に説明する。

（１）新規組換えプラスミドの作製 ｉ）DSDGK多量体をコードするDNAの作製 DSDGK多量体をコードするDNAの作製は、一本鎖DNAを
それぞれ化学合成した後、両鎖をアニールさせて行う。
目的とする二本鎖DNAが長い場合は途中でいくつかに区
切って作製してもよい。

DSDGK多量体をコードするDNAは、両端にベクターと連
結する粘着末端を有し、その間に、DHFRコード領域に近
い方から、DHFRとDSDGK多量体の結合を切断するための
介在アミノ酸であるアルギニンをコードする塩基配列、
DSDGK多量体をコードする塩基配列及び翻訳終了を指令
する塩基配列を含む構造である。

粘着末端としては制限酵素の作用によって生じる切断
面の塩基配列とし、プラスミドpMEK2を用いる場合は、D
HFRコード領域に近い方の末端にBamH Iによる切断面
を、反対側の末端にはXho Iによる切断面を用いるのが
都合がよい。

DHFRとDSDGK多量体との間の介在アミノ酸としては、
例えばアルギニン、イソロイシン−グルタミン酸−グリ
シン−アルギニン［ファクターテンエー（FXa）の認識
配列］等の、カルボキシ末端にアルギニンを有するもの
を用いることができるが、アルギニンが好ましい。

DSDGKの多量体の重合度は好ましくは二量体から十量
体である。なお、後述の具体例としては二量体及び三量
体を例示した。

ii）DSDGK多量体をコードするDNAのベクタープラスミド
への挿入 DSDGK多量体をコードするDNAを発現させるためのベク
ターは、DHFRを発現させることができるものを用いる。
その例としては既に巌倉らが作製している組換えプラス
ミドpMEK2（特開平１−252289号公報参照）がある。pME
K2は、大腸菌に安定に保持され、pMEK2を含有する大腸
菌は、微工研にFERM BP−1816として寄託されている。p
MEK2は、pMEK2を含有する大腸菌から通常に行われるプ
ラスミドの分離方法に従って分離精製し利用することが
できる。精製したpMEK2をBamH I及びXho Iで切断して得
たDNA断片に上記ｉ）の二本鎖DNAをT4−DNAリガーゼを
用いて連結し、目的とする融合タンパク質（Ｉ）を大腸
菌菌体内で発現可能とする新規組換えプラスミドを得
る。

iii）新規プラスミドの塩基配列 第１図は本発明の一例である新規組換えプラスミドpB
BK7DAの全塩基配列を示している。二本鎖環状DNAのうち
遺伝情報をコードしている片方のDNA鎖塩基配列だけ
を、プラスミド中に唯一存在する制限酵素Cla Iの認識
切断部位、５′−ATCGAT−３′、最初の“A"を１番とし
て数えて、５′末端から３′末端の方向に記述してい
る。pBBK7DAは、4655塩基対の大きさであり、宿主であ
る大腸菌にトリメトプリム及びアンピシリン耐性を付与
することができる。pBBK7DAは、pMEK2（4640塩基対より
なる。）のBamH I及びXho I切断によって得られる大き
い方のDNA断片（4614塩基対よりなる。）とDSDGK二量体
をコードする塩基配列を含む41塩基対の化学合成DNAが
結合した構造をしている。第１図において、533番目か
ら573番目までの配列が化学合成DNA由来の配列である。
ちなみに、pMEK2の全塩基配列は既に本発明者らによっ
て明らかにされており（特開平１−252289号公報参
照）、第１図に示す塩基配列のうち533番目から573番目
までの配列が、以下に示す26塩基対の配列に置き変わっ
た構造である。

化学合成した二本鎖DNAの末端の配列には、制限酵素B
amH Iによる切断の際に生じる粘着末端、５′−GATC−
３′（第１図の533番目から536番目までの配列。）、及
び制限酵素Xho Iによる切断の際に生じる粘着末端、
３′−AGCT−５′（第１図の574番目から577番目までの
配列と相補する配列。）、を含ませてある。pMEK2由来
の部分には、BamH I及びXho I切断によって生じる粘着
末端部位が存在するので方向を定めて異種DNAの導入を
行い、DHFR遺伝子との融合遺伝子を容易に作製すること
ができる。

第１図の57番目から569番目までの配列は、DHFRカル
ボキシル末端側にDSDGK二量体がアルギニンを介して結
合したDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）をコ
ード化している。

DHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）をコード
化する配列の上流にはDHFR−DSDGK二量体の融合タンパ
ク質（Ｉ）遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在
する（特開昭63−267276号明細書）。

即に、43番目から50番目までの配列がSD配列と呼ばれ
るもので、効率のよい翻訳に、また、4613番目から4641
番目までが、コンセンサス転写プロモーターであり、効
率のよい転写に貢献する。そのためpBBK7DAは、大腸菌
に導入された場合、多量のDHFR−DSDGK二量体の融合タ
ンパク質（Ｉ）を作る。作られたDHFR−DSDGK二量体の
融合タンパク質（Ｉ）は、菌体内に可溶性の状態で、菌
体タンパク質の約20％程度蓄積する。トリメトプリムは
このDHFRに対する阻害剤であるが、pBBK7DAを有する大
腸菌はDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）を菌
体内に大量に蓄積するので、トリメトプリム耐性を示す
ようになる。

第２図は本発明の他の一例である新規組換えプラスミ
ドpBBK56TAの全塩基配列を示している。第１図と同様
に、二本鎖環状DNAのうち遺伝子情報をコードしている
片方のDNA鎖の塩基配列だけを、プラスミド中に唯一存
在する制限酵素Cla Iの認識切断部位、５′−ATCGAT−
３′、の最初の“A"を１番として数えて、５′末端から
３′末端の方向に記述している。pBBK56TAは、4670塩基
対の大きさで、pMEK2（4640塩基対よりなる。）のBamH
I及びXho I切断によって得られる大きい方のDNA断片（4
614塩基対よりなる。）とDSDGK三量体をコードする塩基
配列を含む59塩基対の化学合成DNAが結合した構造をし
ている。第２図において、533番目から588番目までの配
列が化学合成DNA由来の配列である。

第２図の57番目から584番目までの配列は、DHFRのカ
ルボキシル末端側にDSDGK三量体がアルギニンを介して
結合したDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（Ｉ）を
コード化している。

pBBK56TAは、大腸菌に導入された場合、多量のDHFR−
DSDGK三量体の融合タンパク質（Ｉ）を産生するほかはp
BBK7DAと同様な特徴をもっている。

pBBK7DA及びpBBK56TAは、それぞれ実施例１及び実施
例２に従って作製することができるが、組換えプラスミ
ドの作製方法によって本発明が制限されるものではな
い。

（２）形質転換された大腸菌 上記（１）で作製した組換えプラスミドを常法に従い
大腸菌に取り込ませる。形質転換された大腸菌は、トリ
メトプリム及びアンピシリンに対して耐性を示す。この
プラスミドを含有する大腸菌は、プラスミド上のDHFR−
DSDGK多量体の融合タンパク質（Ｉ）遺伝子の効率のよ
い発現の結果、DHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質
（Ｉ）を菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積する。この
プラスミドを含有する大腸菌をYT＋Ap培地（培地1L中
に、5gのNaCl、8gのトリプトン、5gのイーストエキス、
及び100mgのアンピシリンナトリウムを含む液体培
地。）を用いて、37℃で定常期まで培養した場合、蓄積
するDHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質（Ｉ）は、菌
体タンパク質の約20％に達する。培養菌体を、リン酸緩
衝液などの適当な緩衝液に懸濁し、フレンチプレス法も
しくは超音波破砕法で破砕し、これを遠心分離法により
上清と沈澱に分離した場合、ほとんど全てのDHFR−DSDG
K多量体の融合タンパク質（Ｉ）は上清中に回収され
る。この新規な組換えプラスミドのうちpBBK7DAを含有
する大腸菌は、微工研条寄第2391号（FERM BP−2391）
として、またpBBK56TAを含有する大腸菌は、微工研条寄
第2390号（FERM BP−2390）として、それぞれ寄託され
ている。

（３）DHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質（Ｉ）の製
造工程 本発明のDHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質（Ｉ）
の製造工程は、ｉ）菌体の培養、ii）菌体の破砕、ii
i）ストレプトマイシン処理、iv）硫安沈澱、及びｖ）
メソトリキセート（MTX）結合アフィニティクロマトグ
ラフィーの５工程により成り立っている。

ｉ）菌体の培養 本発明のプラスミドを含有する大腸菌の培養は、YT＋
Ap培地（培地1L中に、5gのNaCl、8gのトリプトン、5gの
イーストエキス、及び50mgのアンピシリンナトリウムを
含む液体培地。）で培養することができる。培地として
は、この他にST＋Ap培地（培地1L中に、2gのグルコー
ス、1gのリン酸２ナトリウム、5gのポリペプトン、5gの
イーストエキス及び50mgのアンピシリンナトリウムを含
む液体培地。）など、菌体が成長する培地であれば、い
ずれの培地でも用いることができるが、DHFR−DSDGK多
量体の融合タンパク質（Ｉ）の生産にはYT＋Ap培地が望
ましい。本発明のプラスミドを含有する大腸菌を、培地
に接種し、37℃で対数成長期の後期もしくは定常期まで
培養する。培養温度により菌体中のDHFR−DSDGK多量体
の融合タンパク質（Ｉ）の蓄積量が変動し、調べた限り
では、培養温度が高いほど蓄積量が大であった。培養し
た菌体は、4,700×ｇの遠心分離により集める。培地1L
から湿重量２〜4gの菌体が得られる。集菌及びこれ以降
の操作は、特にことわらない限り低温（０から10℃の
間、４℃が望ましい。）で行うのが好ましい。

ii）菌体の破砕 培養して得られた菌体を、培養液1Lにつき、10mの
割合で緩衝液１［0.mMエチレンジアミン４酢酸２ナトリ
ウム（EDTA・Na₂）及び14mM 2−メルカプトエタノール
を含む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）］に懸濁
し、フレンチプレスまたは超音波破砕機を用いて菌体を
破砕する。菌体破砕液を27,000×ｇで、20分間遠心分離
し、上清（以下、無細胞抽出液という。）を得る。

iii）ストレプトマイシン処理 無細胞抽出液に対して1.5％（W/V）のストレプトマイ
シン硫酸をスターラーで攪拌しながらゆっくり加える。
20分間攪拌した後ストレプトマイシン処理した液を27,0
00×ｇで、20分間遠心分離し、上清を得る。

iv）硫安沈澱 上記の操作により得られた上清１容に対して0.8〜0.9
容の飽和硫酸アンモニウム液をスターラーで攪拌しなが
らゆっくり加える。20分間攪拌した後硫安沈澱処理した
液を27,000×ｇで、20分間遠心分離し、上清を得る。

ｖ）MTX結合アフィニティクロマトグラフィー 上記の操作により得られた上清に、あらかじめ緩衝液
１で平衡化した25mのMTX結合アガロースゲル（ジグマ
社製）を加える。10分間放置しゲルに吸着させた後、ゲ
ルをカラムに詰める。カラムを緩衝液１、1M KClを含む
緩衝液１、1M KClを含む緩衝液２［0.1mMエチテンジア
ミン４酢酸２ナトリウム（EDTA・Na₂）、14mM 2−メル
カプトエタノールを含む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH
8.5）。］の順で洗う。DHFR−DSDGK多量体の融合タンパ
ク質（Ｉ）の溶出は、1MのKClと3mMの葉酸を含む緩衝液
１を2NのNaOHでpHを9.3に調整した溶液を用いて行い、
溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画する。分画した溶出液についてDHFR活性を測定し、酵
素活性が含まれる画分を集める。得られた溶液を、緩衝
液１に対して透析する。この段階で、純度90％以上のDH
FR−DSDGK多量体の融合タンパク質（Ｉ）が得られる。

以上の操作により、DHFR−DSDGK多量体の融合タンパ
ク質（Ｉ）の精製を再現性良く行うことができる。本発
明に従うと、DHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質
（Ｉ）の精製は、培養を含めて３日以内に行うことがで
き、回収率約80％で、均一なタンパク質標品を得ること
ができる。

DHFR酵素活性の測定は、反応液［0.05mMのジヒドロ葉
酸、0.06mMのNADPH、12mMの２−メルカプトエタノール
を含む50mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）。］1m
をキュベットにとり、これに試料を加え、25℃で340nm
の吸光度の時間変化を測定することにより行う。酵素活
性はユニットで表し、上記反応条件において、１分間に
１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵
素量を１ユニットとして定義する。この測定は、分光光
度計を用いて容易に行うことができる。

（４）得られたDHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質
（Ｉ） 第３図は、DHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質
（Ｉ）の一例として、pBBK7DAに含まれるDHFR−DSDGK二
量体の融合タンパク質（Ｉ）をコード化する部分のDNA
配列とそれから作られるタンパク質のアミノ酸配列を示
している。DHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）
は、171アミノ酸よりなる新規なタンパク質である。ア
ミノ末端側から数えて、１から159番目までの配列が、
大腸菌の野生型DHFRに１箇所のアミノ酸置換が起こった
［Cys−152（wild）→Glu−152］配列であり、162番目
から171番目までがDSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）
の配列である。160番目のイソロイシン（Ile）は、pMEK
2のBamH I部位にDSDGK二量体をコード化する遺伝子を導
入する際に、遺伝子情報の読み取り枠を合わせるために
生じた配列である。161番目のアミノ酸、つまりDSDGK二
量体の配列の直前のアミノ酸はアルギニン（Arg）であ
る。そのため、DHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質
（Ｉ）をアルギニルエンドペプチダーゼ処理することに
より、DSDGK二量体を切り出すことができる。DHFR−DSD
GK二量体の融合タンパク質（Ｉ）の分子量は、19,299で
ある。

また、第４図はDHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質
（Ｉ）の他の一例として、pBBK5.6TAに含まれるDHFR−D
SDGK酸量体の融合タンパク質（Ｉ）をコード化する部分
のDNA配列とそれから作られるタンパク質のアミノ酸配
列を示している。DHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質
（Ｉ）は176アミノ酸よりなる新規なタンパク質であ
る。アミノ末端側から数えて１から171番目までの配列
は、上記のDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）
と同一であるが、DHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質
（Ｉ）はDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）の
カルボキシル末端側にもう一つDSDGKが結合した構造と
なっている。DHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質
（Ｉ）の分子量は19,801である。

なお、DHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）及
びDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（Ｉ）は、DHFR
のカルボキシ末端側に、介在アミノ酸を介してそれぞれ
DSDGK二量体及びDSDGK三量体が結合した構造をしている
にもかかわらず、DHFR酵素活性を有する。このため、大
腸菌がDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）やDHF
R−DSDGK三量体の融合タンパク質（Ｉ）を多量につくる
と、DHFRの阻害剤であるトリメトプリムに対して耐性を
示すようになる。

（５）DSDGK多量体の製造工程 上記（４）のDHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質
（Ｉ）においてDSDGK多量体の直前のアミノ酸はアルギ
ニン（Arg）である。そこでこのDHFR−DSDGK多量体の融
合タンパク質（Ｉ）をアルギニルエンドペプチターゼで
酵素処理すると、DHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質
（Ｉ）からDSDGK多量体が切り出される。その酵素処理
分解物をHPLCで精製することで、DSDGK多量体を得る。

（６）DSDGKの製造工程 上記（５）で得たDSDGK多量体をトリプシンで処理す
るか、またリジルエンドペプチダーゼで処理してDSDGK
を得る。また、（４）で得たDHFR−DSDGK多量体の融合
タンパク質（Ｉ）にトリプシンを作用させ、その分解物
をHPLCで精製することにより、DSDGK多量体を経ること
なく直接DSDGKを得ることもできる。

〔実施例〕

次に本発明を実施例により更に詳細に説明する。但
し、本発明はこれらの実施例により限定されるものでな
い。

（実施例１） pBBK7DAの作製 DSDGK二量体をコード化するDNAとしては、 の２本の41ヌクレオチドからなるDNAをホスホミダイド
法に従って化学合成機（ミリジェン社製、7500型）で化
学合成し、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（アプ
ライド・バイオシステムズ社製）で精製後、DNAを約0.0
2m（約0.1μｇのDNAを含んでいる。）ずつ取り、これ
にカイネーション用反応液（50mM Tris−HCl pH7.8、10
mM MgCl₂、5mMジチオトレイトール、0.5mM ATP）を180
μとT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製 10ユ
ニット／μ）を１μ加え、37℃で30分間インキュベ
ートすることによって、５′末端をリン酸化した。これ
を一旦80℃でインキュベートした後、徐々に冷却させる
ことにより、両DNAをアニールさせ、下記の二本鎖DNAを
得た（これを以下、DNA1と呼ぶ。）。

精製した約１μｇのpMEK2を20ユニットのBamH I（宝
酒造社製）及び20ユニットのXho I（宝酒造社製）で切
断した後、0.85％アガロースゲル電気泳動法により分離
した。約4.6キロ塩基対のDNA断片を含むゲルを切出し、
ゲルからDNAを回収した（これを以下、DNA2と呼ぶ）。B
amH I及びXho IによるDNAの切断の操作は、“Molecular
Cloning:A Laboratory Manual"［T.Maniatis,E.F.Frit
sch,J.Sambrook,eds.Cold Spring Harbor Laboratory
（1982）。］に記載されている方法に従って行った。全
20μのDNA2に20μｌのリガーゼ用反応液（10mM Tris
−HCl pH7.4、5mM MgCl₂、10mMジチオトレイトール、5m
M ATP）、10μのDNA1を加え、これに１μのT4−DNA
リガーゼ（宝酒造社製300ユニット／μ）を加えて、
室温で19時間DNAの連結反応を行わせた。この反応物
を、形質転換法（transformation method、上記Maniati
sらの文献に記載。）に従って、大腸菌（宝酒造社製E.c
oli HB101コンピテントセル）に取り込ませた。この処
理をした菌体を、100mg/のアンピシリンナトリウム及
び5mg/のトリメトプリムを含む栄養寒天培地（培地1L
中に、2gのグルコース、1gのリン酸２カリウム、5gのイ
ーストエキス、5gのポリペプトン、及び15gの寒天を含
む。）上に塗布し、37℃で24時間培養することにより、
数十個のコロニーを得ることができた。これらのコロニ
ーのうち６個を、2mのYT＋Ap培地（培地1L中に、5gの
NaCl、8gのトリプトン、5gのイーストエキス、及び100m
gのアンピシリンナトリウムを含む。）で37℃、一晩菌
体を培養した。培養液をそれぞれエッペンドルフ遠心管
（15m容）に取り、エッペンドルフ社製遠心分離機（5
414S型）を使用して12,000回転／分で10分間遠心分離
し、菌体を沈澱として集めた。これに、0.1mの電気泳
動用サンプル調製液［0.0709MのTris−HCl pH6.8、２％
（W/V）のラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、11％（V/
V）のグリセリン、５％（V/V）の２−メルカプトエタノ
ール、及び0.045％（W/V）のブロムフェノールブルーを
含む。］を加え、菌体を懸濁し、これを沸騰水中に５分
間保ち、菌体を溶かした。この処理をしたサンプルをSD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［U.K.Laemmli;N
ature,vol.227,p680（1970）。］に従って分析した。分
子量マーカーとしてラクトアルブミン（分子量14,20
0）、トリプシンインヒビター（分子量20,100）、トリ
プシノーゲン（分子量24,000）、カーボニックアンヒド
ラーゼ（分子量29,000）、グリセロアルデヒド−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ（分子量36,000）、卵アルブミン
（分子量45,000）、及び牛血清アルブミン（分子量66,0
00）の混合物（シグマ社製DALTON MARK VII−Ｌ）を使
用し、アクリルアミド濃度が10から20％である濃度勾配
ゲル（第一化学社製）で泳動した。その結果、６個のコ
ロニーのうち１個について、推定される大きさのタンパ
ク質が作られていることが明らかになった。このコロニ
ーをYT＋Ap培地で培養し、TanakaとWeisbiumの方法［T,
Tanaka,B.Weisblum;J.Bacteriology vol.121,p.354（19
75）。］に従って、プラスミドを調製した。得られたプ
ラスミドをpBBK7DAと名付けた。pBBK7DAは、pMEK2のBam
H IとXho I部位の間の配列が合成DNAと置き換わった構
造をしているはずである。合成DNAには、制限酵素Xho I
で認識切断させる配列、５′−CTCGAC−３′、が含まれ
ているので、Xho IでpBBK7DAの切断を試みたところ、確
かに切断された。また、pBBK7DAのEcoR I（第１図の471
−476番目の配列）とSal I（第１図の872−877番目の配
列。）による切断によって得られる約400ヌクレオチド
長のDNAについて、M13ファージを用いたジデオキシ法
［J.Messing;Methods in Enzymology,vol.101,p20（198
3）。］に従って、EcoR IからSal Iの方向に塩基配列を
決定した。その結果、第１図に示すpBBK7DAの全塩基配
列の471番目から872番目までの配列が確かめられた。

また、pBBK7DAのBamH I−Xho I切断によって得られる
約4.6キロ塩基対のDNAは、EcoR I,Pst I,Hind III,Hpa
I,Pvu II,Bgl II,Cla I（以上は、宝酒造社製）及びAat
II（東洋紡社製）を用いた制限酵素による切断実験の
結果、pMEK2のBamH I−Xho I切断によって得られる約4.
6キロ塩基対のと全く同一であることが示された。

以上の結果から、pBBK7DAの全塩基配列を第１図に示
したとおり決定した。

（実施例２） pBBK7DAを含有する大腸菌が作るDHFR−DSDGK二量体の融
合タンパク質（Ｉ） pBBK7DAを含有する大腸菌が作るDHFR−DSDGK二量体の
融合タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列は、DHFR−DSDGK
二量体の融合タンパク質（Ｉ）遺伝子の塩基配列から予
想することができる。第１図の57番目から569番目まで
の配列がDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）を
コード化していることから、トリプレットコード表を用
いてアミノ酸配列を推定した。その結果、第３図に示す
アミノ酸配列が得られた。そして、pBBK7DAを含有する
大腸菌を用い、以下のようにして、DHFR−DSDGK二量体
の融合タンパク質（Ｉ）の分離精製及びその同定を行っ
た。

DHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）の精製 A.用いた菌体量：湿重量15.9g/3L培養液 B.酵素精製工程：下記表１に示す（表におけるは無細
胞抽出液、はストレプトマイシン処理、及びはメソ
トリキセート結合アフィニティクロマトグラフィーを表
す。

DHFR酵素活性の測定は、反応液［0.05mMのジヒドロ葉
酸、0.06mMのNADPH、12mMの２−メルカプトエタノー
ル、50mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）］1mをキ
ュベットにとり、これに試料を加え、25℃で340nmの吸
光度の時間変化を測定することにより行った。酵素活性
はユニットで表し、上記反応条件において、１分間に１
マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素
量を１ユニットとして定義した。

得られたDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）
をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（実施例１
に記載の方法。）により分析したところ、約22,000の単
一なタンパク質バンドが示され、得られたDHFR−DSDGK
二量体の融合タンパク質（Ｉ）標品が均一であることが
示された。

（実施例３） 精製分離したDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質
（Ｉ）からのDSDGK二量体の分離 実施例２で得られた31mlの精製均一化したDHFR−DSDG
K二量体の融合タンパク質（Ｉ）の溶液を阻外濾過膜
（アミコン社製YM5 径25mm）で濃縮し、EDTA・Na₂を含
まない緩衝液１で透析し、6mのDHFR−DSDGK二量体の
融合タンパク質（Ｉ）濃縮液を得た。これは、27.6mg/m
の濃度でDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）
を含んでいた。このDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク
質（Ｉ）濃縮液20μに1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.
0）10μ、精製水130μ、１ユニット/mのアルギニ
ルエンドペプチダーゼ（宝酒造社製）60μを加え、37
℃で一晩インキュベートした。反応後、この反応液25μ
をとり、高速液体クロマトグラフィー装置（日立655
形）を用いYMC−ODS−５カラム（山村化学社製 径4.6
×250mm）で分離した。溶出は、0.1％トリフルオロ酢酸
中、アセトニトリルの濃度勾配（０％から10％）をかけ
ることによって行った。０から５分までは、０％のアセ
トニトリルを用い、５分から35分までは、０％から10％
のアセトニトリルの直線濃度勾配をかけた。その結果、
第５図に示すような溶出曲線が得られた。試料注入後約
28分後のピーク画分を分離し、分離した溶出液に少量の
水を加え凍結乾燥して溶媒を除き、ペプチドを得た。得
られたペプチドを酸加水分解後、その1.4分の１をアミ
ノ酸分析に用いた。その結果、アスパラギン酸が1.8n m
ole、セリン、グリシン、及びリジンがそれぞれ、0.9n
moleずつ検出された。アミノ酸組成は、DSDGK二量体の
それと一致した。この結果から、精製均一化したDHFR−
DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）をアルギニンエン
ドペプチダーゼ処理し、次いで高速液体クロマトグラフ
ィーを用いて分離することにより収率約19％でDSDGK二
量体を回収できることが明らかになった。DHFR−DSDGK
二量体の融合タンパク質（Ｉ）の精製の収率が約43％で
あり、DHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）から
のDSDGK二量体の分離の収率が約19％であることから、
無細胞抽出液からのDSDGKの単離収率は約８％であっ
た。

（実施例４） 分離精製したDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質
（Ｉ）からのDSDGKの分離 実施例３で使用したDHFR−DSDGK二量体の融合タンパ
ク質（Ｉ）濃縮液20μをエッペンドルフ遠心管（1.5m
容）に入れ、これにアセトン80μを加えた。そして
−20℃の冷凍庫中に30分間置き、DHFR−DSDGK二量体の
融合タンパク質（Ｉ）を沈澱させた。これをエッペンド
ルフ社製遠心分離機（5414S型）を使用して12,000回転
／分で２分間遠心分離して上清液を除き、10μの1Mト
リス−塩酸緩衝液（pH8.0）、90μの精製水、10μ
のTPCK−トリプシン（シグマ社製）を加え、37℃で一晩
インキュベートした。反応後、このうちの10μをと
り、高速液体クロマトグラフィー装置（日立655形）を
用い、YMC−ODS−５カラム（山村化学社製 径4.6×250
mm）で分離した。溶出は実施例３と同一の条件で行っ
た。その結果、第６図に示すような溶出曲線が得られ
た。試料注入後約８分後のピークがDSDGKである。化学
合成で得られた濃度のわかっているDSDGK溶液を標準と
して、クロマトグラムのピーク高さから、得られたDSDG
Kの量を求めたところ、1.8μｇであった。このことか
ら、DHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）をトリ
プシン処理して、DSDGKを得るときの回収率は約69％と
計算される。

（実施例５） pBBK56TAの作成 DSDGK三量体をコード化するDNAとしては、 の４本のDNAをホスホアミダイド法に従って化学合成機
（ミリジェン社製7500型）で化学合成し、オリゴヌクレ
オチド精製カートリッジ（アプライド・バイオシステム
ズ社製）で精製後、DNAを約0.1m（約0.1μｇのDNAを
含んでいる。）ずつ取り、これにカイネーション用反応
液（50mM Tris−HCl pH7.8、10mM MgCl₂、5mMジチオト
レイトール、0.5mM ATP）を180μとT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（宝酒造社製10ユニット／μ）を１μ加
え、37℃で30分間インキュベートすることによって、
５′末端をリン酸化した。これを一旦80℃でインキュベ
ートした後、徐々に冷却させることにより、両DNAをア
ニールさせ、下記の二本鎖DNAを得た（これを以下、DNA
3と呼ぶ。）。

10μのDNA3に、20μのDNA1、20μのリガーゼ用
反応液、１μのT4−DNAリガーゼ（いずれも実施例１
に記載）を加えて室温で19時間DNAの連結反応を行っ
た。そして、実施例１記載の方法に従って大腸菌の形質
転換、形質転換体の培養、培養菌体を用いたSDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行った。

その結果、４個のコロニーについて推定される大きさ
のタンパク質の産生が認められた。そこで、このうちの
１個のコロニーをYT＋Ap培地で培養し、前記TanakaとWe
isblumの方法に従ってプラスミドを調製した。得られた
プラスミドをpBBK56TAと名付けた。pBBK56TAは、pMEK2
のBamH IとXho I部位の間の配列が合成DNAと置き換わっ
た構造をしているはずである。合成DNAには、制限酵素X
ho Iで認識切断される配列、５′−CTCGAG−３′、が含
まれているので、Xho IでpBBK56TAの切断を試みたとこ
ろ、確かに切断された。また、pBBK56TAのEcoR I（第２
図の471−476番目の配列）とSal I（第２図の887−892
番目の配列）による切断によって得られる約400ヌクレ
オチド長のDNAについて、M13ファージを用いたジデオキ
シ法に従って、EcoR IからSal Iの方向に塩基配列を決
定した。その結果、第２図に示すpBBK56TAの全塩基配列
の471番目から887番目までの配列が確かめられた。

また、pBBK56TAのBamH I−Xho I切断によって得られ
る約4.6キロ塩基対のDNAは、EcoR I,Pst I,Hind III,Hp
a I,Pvu II,Bgl II,Cla I（以上は宝酒造社製）及びAat
II（東洋紡社製）を用いた制限酵素による切断実験の
結果、pMEK2のBamH I−Xho I切断によって得られる約4.
6キロ塩基対のと全く同一であることが示された。

以上の結果から、pBBK56TAの全塩基配列を第２図に示
したとおり決定できた。

（実施例６） pBBK56TAを含有する大腸菌が作るDHFR−DSDGK三量体
の融合タンパク質（Ｉ） pBBK56TAを含有する大腸菌が作るDHFR−DSDGK三量体
の融合タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列は、DHFR−DSDG
K三量体の融合タンパク質（Ｉ）遺伝子の塩基配列から
予想することができる。第２図の57番目から584番目ま
での配列がDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（Ｉ）
をコード化していることから、トリプレット暗号表を用
いてアミノ酸配列を推定した。その結果、第４図に示す
アミノ酸配列が得られた。そして、pBBK56TAを含有する
大腸菌を用い、以下のようにしてDHFR−DSDGK三量体の
融合タンパク質（Ｉ）の分離精製及びその同定を行っ
た。

DHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（Ｉ）の精製 A.用いた菌体量：湿重量28.4g/3L培養液 B.酵素精製工程：下記表２に示す。（表におけるは無
細胞抽出液、はストレプトマイシン処理及びはメソ
トリキセート結合アフィニティクロマトグラフィーを表
す。

DHFR酵素活性の測定方法及び活性の定義は実施例２に
従った。

得られたDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（Ｉ）
をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（実施例１
に記載の方法。）により分析したところ、約21,500の単
一なタンパク質バンドが示され、得られたDHFR−DSDGK
三量体の融合タンパク質（Ｉ）標品が均一であることが
示された。

（実施例７） 分離精製したDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質
（Ｉ）からのDSDGK三量体の分離 実施例６で得られた56mの精製したDHFR−DSDGK三量
体の融合タンパク質（Ｉ）の溶液を阻外濾過膜（アミコ
ン社製YM5径25mm）を用いて濃縮し、6.5mのDHFR−DSD
GK三量体の融合タンパク質（Ｉ）濃縮液を得た。これ
は、65mg/mの濃度でDHFR−DSDGK三量体の融合タンパ
ク質（Ｉ）を含んでいた。

このDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（Ｉ）濃縮
液10μに1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）10μ、精
製水140μ、１ユニット/mのアルギニルエンドペプ
チダーゼ（宝酒造社製）60μを加え、37℃で一晩イン
キュベートした。反応後、この反応液30μをとり、高
速液体クロマトグラフィー装置（日立655形）を用い、Y
MC−ODS−５カラム（山村化学社製 径4.6×250mm）で
分離した。溶出は実施例３と同一の条件で行った。その
結果、第７図に示すような溶出曲線が得られた。試料注
入後約34分後のピーク画分を分離し、分離した溶出液に
少量の水を加え凍結乾燥して溶媒を除きペプチドを得
た。得られたペプチドを酸加水分解後、その1.4分の１
をアミノ酸分析に用いた。その結果、アスパラギン酸が
3.1n mole、セリン、グリシン及びリジンがそれぞれ1.6
n moleずつ検出された。アミノ酸組成は、DSDGK三量体
のそれと一致した。この結果から、精製したDHFR−DSDG
K三量体のタンパク質をアルギニルエンドペプチターゼ
処理し、次いで高速液体クロマトグラフィーを用いて分
離することにより収率約17％でDSDGK三量体を回収でき
ることがわかった。DHFR−DSDGK三量体の融合タンパク
質（Ｉ）の精製の収率が約90％であり、DHFR−DSDGK三
量体の融合タンパク質（Ｉ）からのDSDGK三量体の分離
の収率が約17％であることから、無細胞抽出液からのDS
DGK三量体の収率は約15％であると計算される。

（実施例８） 分離精製したDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質
（Ｉ）からのDSDGKの分離 実施例７で使用したDHFR−DSDGK三量体の融合タンパ
ク質（Ｉ）濃縮液10μをエッペンドルフ遠心管（1.5m
容）に取り、これにアセトン40μを加えた。そして
−20℃の冷凍庫中に30分間置き、DHFR−DSDGK三量体の
融合タンパク質（Ｉ）を沈澱させた。

これをエッペンドルフ社製遠心分離機（5414S型）を
使用して12,000回転／分で２分間遠心分離して上清を除
き、沈澱に8M尿素を20μ加えて溶解させた。さらに80
μの0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）、10μの0.5
％トリプシン（Difco社製）を加え、37℃で一晩インキ
ュベートした。反応後、そのうちの20μをとり、高速
液体クロマトグラフィー装置（日立655形）を用いYMC−
ODS−５カラム（山村化学社製 径4.6×250mm）で分離
した。溶出は実施例３と同一条件で行った。その結果、
第８図に示すような溶出曲線が得られた。試料注入後約
９分後のピーク画分を分離し、分離した溶出後に少量の
水を加え凍結乾燥し溶媒を除き、ペプチドを得た。得ら
れたペプチドを酸加水分解後、その1.6分の１のアミノ
酸分析に用いた。その結果、アスパラギン酸が9.2n mol
e、セリン、グリシン及びリジンがそれぞれ4.7n moleず
つ検出された。アミノ酸組成は、DSDGKのそれと一致し
た。この結果から、精製したDHFR−DSDGK三量体の融合
タンパク質（Ｉ）をトリプシン処理し、次いで高速液体
クロマトグラフィーを用いて分離することにより収率約
42％でDSDGKを回収できることがわかった。DHFR−DSDGK
三量体の融合タンパク質（Ｉ）の精製の収率が約90％で
あり、DHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（Ｉ）から
のDSDGKの分離の収率は42％であることから、無細胞抽
出液からのDSDGKの収率は約38％であると計算される。

〔発明の効果〕

上記のように、本発明の新規組換えプラスミドは、DH
FR−DSDGK多量体の融合タンパク質（Ｉ）をコード化し
ているため、このプラスミドを有する大腸菌はDHFR−DS
DGK多量体の融合タンパク質（Ｉ）を可溶性の状態で大
量に生産蓄積する。さらに、産生されるDHFR−DSDGK多
量体の融合タンパク質（Ｉ）は、DHFR酵素活性を保持し
ており、精製を容易に行うことができる。本発明の精製
法に従うことにより、DHFR−DSDGK多量体の融合タンパ
ク質（Ｉ）の精製を迅速に効率よく行うことができる。
また、このようにして得られたDHFR−DSDGK多量体の融
合タンパク質（Ｉ）に直接トリプシンを作用させるか、
又はアルギニルエンドペプチダーゼ等適当な酵素によっ
てDSDGK多量体を切り出した後にトリプシンを作用さ
せ、高速液体クロマトグラフィーによってDSDGKを単離
精製することができる。精製されたDSDGKはアレルギー
性疾患の治療薬として有用である。従って、本発明によ
り、アレルギー性疾患の治療薬として有用なDSDGKを遺
伝子操作技術によって製造するための有利な手段が提供
できた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、それぞれpBBK7DA及びpBBK56TAの
全塩基配列を示した図であり、二本鎖DNAのうち遺伝情
報をコードしている片方のDNA鎖の塩基配列だけを、
５′未満から３′未満の方向に記述している。図中符号
は、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシン
を、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを示している。図中番
号は、pBBK7DA及びpBBK56TAにそれぞれ１箇所存在する
制限酵素Cla Iの認識切断部位、５′−ATCGAT−３′、
の最初の“A"を１番として数えた番号を示している。 第３図及び第４図は、それぞれpBBK7DA及びpBBK56TA中
に存在するDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（Ｉ）
及びDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（Ｉ）をコー
ド化する部分の塩基配列及びタンパク質のアミノ酸配列
を示す図である。図中符号は、核酸塩基及びアミノ酸を
表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニン
を、Ｔはチミンを、Glyはグリシンを、Alaはアラニン
を、Valはバリンを、Leuはロイシンを、Ileはイソロイ
シンを、Serはセリンを、Thrはトレオニンを、Cysはシ
ステインを、Metはメチオニンを、Aspはアスパラギン酸
を、Asnはアスパラギンを、Gluはグルタミン酸を、Gln
はグルタミンを、Argはアルギニンを、Lysはリジンを、
Hisはヒスチジンを、Pheはフェニルアラニンを、Tyrは
チロシンを、Trpはトリプトファンを、Proはプロリンを
示している。図中番号は、融合タンパク質（Ｉ）のアミ
ノ末端のアミノ酸であるメチオニンを１番として数えた
番号を示している。 第５図及び第７図は、それぞれDHFR−DSDGK二量体の融
合タンパク質（Ｉ）及びDHFR−DSDGK三量体の融合タン
パク質（Ｉ）をアルギニルエンドペプチダーゼで処理
し、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー装
置で分離したときのクロマトグラムを示している。横軸
は時間を分単位で、縦軸は220nmの吸光度を任意単位で
表している。図中の矢印はそれぞれDSDGK二量体及びDSD
GK三量体が溶出される位置を示している。第６図及び第
８図は、それぞれDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質
（Ｉ）及びDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（Ｉ）
をトリプシンで処理し、逆相カラムを用い高速液体クロ
マトグラフィー装置で分離したときのクロマトグラムを
示している。横軸は時間を分単位で、縦軸は220nmの吸
光度を任意単位で表している。 図中の矢印はいずれもDSDGKの溶出される位置を示して
いる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 1/22 Ｃ０７Ｋ 19/00 7/06 Ｃ１２Ｎ 1/21 19/00 9/02 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/50 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 井筒 浩 茨城県つくば市和台48番 日立化成工業 株式会社筑波開発研究所内 (72)発明者 小原 和彦 茨城県つくば市和台48番 日立化成工業 株式会社筑波開発研究所内 (72)発明者 高須賀 晶子 茨城県つくば市和台48番 日立化成工業 株式会社筑波開発研究所内 (56)参考文献 特開 平１−316398（ＪＰ，Ａ)

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有する（ジヒドロ葉
   酸還元酵素）−（アスパラギン酸−セリン−アスパラギ
   ン酸−グリシン−リジン）ｎの融合タンパク質（ｎは２
   から10）をコードする塩基配列を含む組換えプラスミ
   ド。 （式中、＿は介在アミノ酸Argを示す）
2. 【請求項２】前記融合タンパク質が（アスパラギン酸−
   セリン−アスパラギン酸−グリシン−リジン）の二量体
   を含み、下記のアミノ酸配列を有するものである請求項
   １記載の組換えプラスミド。 （式中、＿は前記と同じ意味である）
3. 【請求項３】前記融合タンパク質をコードする塩基配列
   が下記の塩基配列である請求項２記載の組換えプラスミ
   ド。 （式中、＿は介在アミノ酸Argをコードする塩基配列を
   示す）
4. 【請求項４】前記融合タンパク質が（アスパラギン酸−
   セリン−アスパラギン酸−グリシン−リジン）の三量体
   を含み、下記のアミノ酸配列を有するものである請求項
   １記載の組換えプラスミド。 （式中、＿は前記と同じ意味である）
5. 【請求項５】前記融合タンパク質をコードする塩基配列
   が下記の塩基配列である請求項４記載の組換えプラスミ
   ド。 （式中、＿は前記と同じ意味である）
6. 【請求項６】組換えプラスミドが、大腸菌において安定
   に複製され、宿主である大腸菌にトリメトプリム耐性及
   びアンピシリン耐性を与え、かつ4655塩基対の大きさを
   有するものである請求項２記載の組換えプラスミド。
7. 【請求項７】組換えプラスミドが、大腸菌において安定
   に複製され、宿主である大腸菌にトリメトプリム耐性及
   びアンピシリン耐性を与え、かつ4670塩基対の大きさを
   有するものである請求項４記載の組換えプラスミド。
8. 【請求項８】組換えプラスミドが第１図の塩基配列を有
   する組換えプラスミドpBBK7DAである請求項２記載の組
   換えプラスミド。
9. 【請求項９】組換えプラスミドが第２図の塩基配列を有
   する組換えプラスミドpBBK5.6TAである請求項４記載の
   組換えプラスミド。
10. 【請求項１０】請求項１乃至９記載の組換えプラスミド
    により形質転換された大腸菌。
11. 【請求項１１】下記のアミノ酸配列を有するジヒドロ葉
    酸還元酵素−Arg−抗アレルギー性ペンタペプチド二量
    体の融合タンパク質。 （式中、＿は前記と同じ意味である）
12. 【請求項１２】下記のアミノ酸配列を有するジヒドロ葉
    酸還元酵素−Arg−抗アレルギー性ペンタペプチド三量
    体の融合タンパク質。 （式中、＿は前記と同じ意味である）
13. 【請求項１３】請求項10記載の大腸菌を培養し、培養菌
    体から請求項１記載の融合タンパク質を採取することを
    特徴とする該融合タンパク質の製造方法。
14. 【請求項１４】前記融合タンパク質の採取工程が、培養
    菌体の無細胞抽出液から、ストレプトマイシン処理、硫
    安沈殿、及びメソトリキセート結合アフィニティクロマ
    トグラフィーを順次用いて精製する工程を含むものであ
    る請求項13記載の製造方法。
15. 【請求項１５】請求項11又は請求項12記載のジヒドロ葉
    酸還元酵素−Arg−抗アレルギー性ペンタペプチド二量
    体の融合タンパク質又はジヒドロ葉酸還元酵素−Arg−
    抗アレルギー性ペンタペプチド三量体の融合タンパク質
    を酵素処理することにより、アスパラギン酸−セリン−
    アスパラギン酸−グリシン−リジンのアミノ酸配列から
    なる抗アレルギー性ペンタペプチドを採取することを特
    徴とするアスパラギン酸−セリン−アスパラギン酸−グ
    リシン−リジンのアミノ酸配列からなる抗アレルギー性
    ペンタペプチドの製造方法。
16. 【請求項１６】酵素が、トリプシンである請求項15記載
    の製造方法。