JPS6226226A - 抗腫瘍性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は抗腫瘍性ポリペプチドに関し、特にこの内、
一般的にＴＮＦと称されるＬ−９２９マウス線維芽細胞
に対し毒作用を有するヒト起源の抗腫瘍性ポリペプチド
に関する。

〔従来の技術〕

Ｌ−９２９マウス線雌芽細胞に対し毒作用を有するヒト
起源の抗腫瘍性ポリペプチドとしては、ＴｈｅＪｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　　２６０．
　２３４５−２３５４．　　（１９８５）に記載されて
いるヒト細胞株ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ２４０）より得ら
れたＴＮＦと名付けられたポリペプチドが知られている
。このポリペプチドは、そのアミノ酸配列も殆ど全部が
知られている。

更に、ＴＮＦと名付けられたポリペプチドは、組換えプ
ラスミドにより形質転換された大腸菌により生産される
ことも知られている（Ｎａｔｕｒｅ。

３１２．７２４−７２９．　　（１９８４，１２゜２０
／２７）、Ｎａｔｕｒｅ、３１３，８０３−８０６゜（
１９８５，２，２８）、５ｃｉｅｎｃｅ、２２８゜１４
９−１５４．　　（１９８５，４，１２））。

これらの形質転換された大腸菌により産生されるポリペ
プチドも又、クローン化されたＤＮＡより推測される塩
基配列はＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　　２６０に記載されたものと同じであり
、Ｎａｔｕｒｅ、　　３１３に記載されたものがＮ−末
端アミノ酸の２個バリンとアルギニンが欠落している点
が相違するのみである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

この発明の目的は、叙上のような情況下において、新規
な抗腫瘍性ポリペプチドを見い出すことにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は叙上の目的を達成するものとして以下の性
質を有する抗腫瘍性ポリペプチドを、製造することに成
功した。

すなわち本発明は、Ｎ末端からのアミノ酸配列がＶａｌ
−Ａ−３ｅｒ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｂ−Ｔｈｒ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−
Ｆ−Ｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａ
ｓＫで表わされ、かつＡがＡｒｇ又はＬｙｓ　ＳＢがＡ
ｒｇ又はＰｒｏ、　Ｃが＾ｒｇ又はＰｒｏ、ＤがＳｅｒ
又はＬｙｓ、　ＥがＡｒｇ又はＰｒｏ、　ＦがＬｙｓ又
はＶａｌ、　ＧがＰｈｅ又はＰｒｏ、　Ｘが未同定アミ
ノ酸であるペプチドフラグメントを有し、他にトリプシ
ン分解フラグメントとしてＶａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａ
ｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−八１ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ａｌａ、　Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−シａｌ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ。

１ｉｅ−八１ａ−Ｖａｌ−Ｘ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ａｓｎ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−＾１ａ、Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−０Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ
−Ｐｈｅ及びＬｅｕ−Ｓｅｒ−＾１ａ４１ｕ−１１ｅ−
Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−＾
５ｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを有し、かつ下記の理化学的性質を
有する抗腫瘍性ポリペプチドである。

（ａ）分子量：　１７４００±５００（ＳＤＳ電気泳動
法） （ｂ）等電点ｚ）１５．７±０．２（ゲル等電点電気泳
動法） （ｃ）ｐＨ安定性：　ｐＨ６から９の範囲で安定（ｄ）
温度安定性：ｐＨ７，０，６５℃、１時間の加熱により
６０〜７０％失 活する （ｅ）蛋白質分解酵素に対する安定性：失活する（ｆ）
生理活性：ヒト正常細胞に対し細胞毒性を示さず、ヒト
腫瘍細胞に対し細 胎毒性を示す このものは、例えばヒト急性骨髄性白血病細胞ＴＨＰ−
１（Ｉｎｔ、　　Ｊ、　　Ｃａｎｃｅｒ　、　　２６．
　１７１−１７６　（１９８０））を分化誘導物質と接
触せしめつつ又は接触せしめた後、培養又は培地中に懸
濁することにより製造することができる。

分化誘導物質は、悪性化単球性細胞と接触した時、この
悪性化単球性細胞をマクロファージ、顆粒球の単球細胞
に分化誘導せしめる作用を有する物質であり、具体的に
はヘミン、アクチノマイシンＤ、ヘキサメチレンアクラ
ミノマイシンＡ、テレオシジン、マイトマイシンＣ，プ
レオマイシン。

プロピオン酸、酢酸ナトリウム、カダベリン、ツニカマ
イシン、１２−ｏ−テトラデカノイルフォルボール１３
アセテート（ＴＰＡ）、　　γ−インターフェロン等の
リンフ才力イン、Ｄ−因子、フルキナーゼ。ヒストンＨ
１，リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、脂質Ａ、グルコ
コルチコイド。

１ｄ−２５−デバイドロオキシビタミンＤ３＋　ポリ　
（Ｉ）、ポリ　（Ａ　Ｄ　Ｐ−リボース）、ＢＣＧ。

クロロキン等があげられる。

ヒト骨髄性白血病細胞ＴＨＰ−１を分化誘導物質に接触
せしめる方法は、ＴＨＰ−１を分化誘導物質を含有する
培地に懸濁または培養すればよい。

ＴＨＰ−１を培養して抗腫瘍性ポリペプチドを生成せし
めるには、分化誘導物質が存在する条件下で培養を続け
てもよいが、ヒト骨髄性白血病細胞を分化誘導物質と接
触せしめた後、同細胞を分化誘導物質を含まない培地に
移し変えて培養してもよい。後者の方法の場合、ＴＨＰ
−１を移し変えた後の培地に生体外刺激物質を添加して
もよい。

生体外刺激物質とは、ヒト細胞の細胞膜またはライソゾ
ームに変化を与え生体内高分子を細胞外に放出または漏
出し易くさせる作用を存するものである。具体的にはり
ポポリサンカライド（ＬＰＳ）。

各種レクチン、ビタミンＡ等がある。

ＴＨＰ−１を培養する培地は、動物細胞を培養する通常
の培地のいずれもが用いられる。具体的にはローズウェ
ル・パーク・メモリアル・インスティテユート１６４０
培地（Ｒｏｓｅｗｅｌｌ　Ｐ　ａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌ
　　Ｉ　ｎ５ｔｉｕｔｅ　−１６４０、以下、ＲＰＭＩ
−１６４０と略す。）が好適であるが、他にダルベツコ
変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ　Ｍｏｄｉｆｉ
ｅｄＥａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　）　、イーグル基礎培
地（ＥａｇｌｅｓＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
Ｍｅｄｉｕｍ　、以下、ＭＥＭ培地と略す、、）、クリ
ック培地（Ｃ１ｉｃｋ　Ｍｅｄｉｕｍ　）なども用いら
れる。これらの培地には胎児ウシ血清（以下ＦＢＳと略
す。）や新生児ウシ血清、ウマ血清などを添加して用い
ることもあるが、血清を全く含まない培地を用いたとき
抗腫瘍性ポリペプチドの分離、精製工程において極めて
良い結果が得られる。

ＴＨＰ−１の培養は通常１〜５×１０ｂ個７ｍｌの細胞
密度で３５〜３８°Ｃにて４〜６％炭酸ガス気流中で行
ない、培養は浮遊培養で行なう。

分化誘導物質は、通常培養当初より培地に含有せしめる
。また、生体外刺激物質は分化されたヒト骨髄性白血病
細胞の培養当初より培地に含有せしめてもよいが、同細
胞の増殖がある程度進んでから培地に含有せしめてもよ
い。しかし、生体刺激物質を添加しなくとも抗腫瘍性ポ
リペプチドは充分生産されるので、生体外刺激物質を添
加しない方が、抗腫瘍性ポリペプチドの精製の際に好都
合である。

抗腫瘍性ポリペプチドは以下のように定性及び定量分析
できる。即ち、標的細胞であるし一９２９細胞（Ｐｒｏ
ｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、７２．３６６６−３６７０）をＭＥＭ培地
に５％仔牛脂児血清を加え育成し、８Ｘ１０’細胞が１
００μｌの同上培地に含まれる様にし、９６大の平底プ
レートに育種する。育種条件は３７℃、２時間、５％Ｃ
Ｏ□、１００％Ｈｔ　Ｏで通常細胞培養に用いられる方
法でよい。その後、アクチノマイシンＤ培地中に終濃度
１μｇ／ｍｌとなる様に加え、培養液の液量を１５０μ
ｌとする。即座に抗腫瘍性ポリペプチドを含むと考えら
れる検体を適当にＭＥＭ培地で稀釈したものを５０μ℃
加える。この際、稀釈率を適宜調整してＥＤ５０を求め
ることができる。更に、最終液量が２００μｌとなった
Ｌ−９２９細胞を上記条件で１８時間培養を継続する。

細胞壊死活性は、まず全培地を除去し、ここに０．２％
クリスタルバイオレットの２％メチルアルコール溶液を
加え固定染色する。クリスタルバイオレットは全有核細
胞を染色し、抗腫瘍性ポリペプチドにより壊死し、フラ
スコ底面より遊離した細胞は染色しないので、抗腫瘍性
ポリペプチド活性を直接測定できる。この染色度を’Ｏ
Ｄ５９０ｎｍの吸収で測定し、対照群に対する染色度と
比較することにより抗ＩＩＩ　１％性ポリペプチド活性
を測定する。活性の定義は次の様に行う。Ｌ−９２９細
胞が５０％生存できる検体原液の稀釈率を原液のｌ　ｒ
ｍｌあたりの活性とする。即ち、原液の１倍稀釈でＥＤ
５０を与える検体の活性は１単位／ｍｉである。

このようにして得られる抗腫瘍性ポリペプチドが生成蓄
積された培養液は通常の蛋白質の精製法に準じて精製さ
れ、本発明の抗１［性ポリペプチドが精製される。即ち
、塩基性陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグラ
フィー、塩析法、透析法、ゲル濾過法、疎水クロマトグ
ラフィー、高速分子篩クロマトグラフィー、電気泳動法
等を順次又は適宜組み合せることによって精製される。

以下、更に具体的に説明する。塩基性陰イオン交換体と
してはＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５゜Ａ−５０，
ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６８゜ＤＥＡＥ−セファ
ミル（以北、ファルマシア社製）が好ましく、その他ジ
エチルアミノ基、アミノエチル基または四級化アミノエ
チル基含有陰イオン交換体等も使用される。使用される
緩衝液としてはｐＨ６，０〜９．０のトリス−塩酸塩ま
たはリン酸緩衝液が望ましく、これら０．０５Ｍ程度の
希薄な緩衝液で抗腫瘍性ポリペプチドの培養液を稀釈し
、塩濃度０．１Ｍ以下の溶液としてて陰イオン交換体と
接触せしめて抗腫瘍性ポリペプチドを吸着させる。抗腫
瘍性ポリペプチドの溶出は０．１〜０．２Ｍの食塩又は
塩化カリウム等の塩類溶液で行なわれ、抗ｌ１ｉｉ性ポ
リペプチドは０．２　Ｍ付近の塩濃度で溶出される。当
該陰イオン交換体との接触はカラム法が望ましいが、大
量の場合にはバッチ法も採用される。

陰イオン交換クロマトグラフィーを行なう前に、前処理
として限外濾過膜で低分子物質を除去することが望まし
く、精製効果を上げることが出来る。

陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた溶液は透析
後、濃縮してゲル濾過に付される。ゲル。

濾過用の担体としてはセファデックスＧ−７５゜Ｇ−１
００（ファルマシア社製）、セファクリルＳ−２００（
ファルマシア社製）、バイオゲルＰ−１００（バイオラ
ット社製）及びトーヨーパールＨＷ−５０，ＨＶ／−５
５（東洋曹達工業社製）等が使用される。ゲル濾過に使
用する緩衝液はｐＨ６，０〜９．０のトリス−塩酸塩ま
たはリン酸緩衝液が使用され、吸着を防く目的で０．２
〜０．５Ｍの食塩等の塩類を添加して使用ずことが望ま
しい。この工程による精製度は２〜１０倍である。

また、陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた抗腫
瘍性ポリペプチド活性溶液は疎水クロマトグラフィーで
精製することもでき、この場合はブチルート−ヨーバー
ル６５０（東洋曹達工業社製）等を担体とし、硫安２食
塩等の塩類を用いて抗腫瘍性ポリペプチドを溶出せｔ７
める。この工程による精製度は５・〜３０倍であり、回
収率は８０％以上である。また、この段階で抗腫瘍性ポ
リペプチドの比活性は１×１０６以上、抗腫瘍性ポリペ
プチド含有率は１．０％以上になる。

ゲル濾過で精製した抗腫瘍性ポリペプチド含有液は、次
いでＭｏｎｏＱ　　ＨＲ５１５カラム（ファルマシア社
製、高性能陰イオン交換体カラム）を使用するファルマ
シアＦ　Ｐ　Ｌ　Ｃ（Ｆａｓｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ。

Ｐｅｐｔｉｄｅ、　　Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、
　　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏ−ｇｒａｐｈｙ）
システムによる高性能陰イオン交換クロマトグラフィー
によって更に精製される。精製度は５〜１０倍で活性の
回収率は７０〜９０％である。

この高性能陰イオン交換体クロマトグラフィーの条件は
最初のＤＥＡＥ−セファローズ等の担体を使用する陰イ
オン交換クロマトグラフィーノ場合と同じ条件下である
。

Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃにより精製された抗腫瘍性ポリペプチド
溶液をＭｏｎｏＱ　　ＨＲ５１５カラムを使用する再Ｆ
ＰＬＣで５ＤＳ−電気泳動的に単一な活性蛋白として精
製することができ、この方法による精製度は５〜１０倍
であり、蛋白に対する比活性５ｘ　ｌ　Ｑ　１１単位／
可蛋白質を有する精製標品が得られる。

ところが、この５ＤＳ−電気泳動的に単一な活性標品に
ついて溶出条件を変えてＭｏｎｏＱＨＲ５１５カラムを
使用ＶるＦＰＬＣによるイオン交換クロマトグラフィー
を行うことにより３種類の活性蛋白質成分が分離される
ことが判明した。それぞれの活性蛋白を分取し、同条件
下で再ＦＰＬＣを行うことにより３種類の活性蛋白標品
が得られる。

ＦＰＬＣで溶出される順にＴＮＦ−１，ＴＮＦ−２，及
びＴＮＦ−３と名づけだ。

これら単離された抗腫瘍性ポリペプチドの理化学的性質
及びＬ−９２９に対する比活性は次のとおりである。

ＴＮＦ−Ｉ　　　　ＴＮＦ−２・ＴＮＦ−３分子量　　
　　１７，４００　　１７，４００　　１７．４００等
電点　　　　　　５．７　　　　　　５．７　　　　　
　５．７比活性（Ｌｌ／ｗ）３．２ｘｌ　Ｏ”　　　６
．０ｘｌＯ”　　　４．５Ｘ１０’この表に示すように
分子量及び等電点について差は見られないが、比活性に
おいて差が見出される。次にＴＮＦ−１，ＴＮＦ−２，
ＴＮＦ−３のＮ末端アミノ酸配列を示す。

Ｔ　Ｎ　　Ｆ　　−Ｉ　　　Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−
Ｘ−Ｔｈｒ−八ｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒ。

Ｔ　Ｎ　Ｆ　　２　　Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔ
ｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ　　　　　　Ｐ
ｒ。

Ｔ　Ｎ　Ｆ　−３Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　　　Ａｒｇ Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｉ　　Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ
−Ｖａｌ−Ａｌａ−ｌ４ｅ−Ｖａｌａｌ Ｔ　Ｎ　Ｆ　−２Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−シ
ａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＶａｌＬｙｓ　　　Ｖａｌ　Ａ
ｌａ Ｔ　Ｎ　Ｆ　−３Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−＾１ａ−Ｈｉｓ−ＶａｌＬｙｓ　　Ａｒｇ　　Ｖ
ａｌ　　へＩａ上記Ｎ末端アミノ酸配列においてＸで示
される第４番目のアミノ酸は気相アミノ酸配列分析機で
同定されないアミノ酸であり、Ｓｅｒは検出されず、こ
の方法では検出されないアミノ酸であるＣｙｓの可能性
が考えられる。前述のヒト細胞株ＨＬ−６０より得られ
るＴＮＦのＮ末端アミノ酸配列はＶａｔ−Ａｒｇ−Ｓｅ
ｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−４ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ
−へ５ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−八１ａ−１１ｉｓ
−Ｖａｌであることが記載されており、これと比較する
とＴＮＦ−１，ＴＮＦ−２゜ＴＮＦ−３は第４番目のア
ミノ酸がＳｅｔではなく、第５番目のアミノ酸もＳｅｔ
ではな（Ｔｈｒとなっており、第１０番目のアミノ酸も
ＡｓｐではなくＡｒｇ又はＰｒｏとなっている。更にＴ
ＮＦ−１は第１２番目のアミノ酸がＰｈｅとなっている
。従って、ＨＬ−６０より得られるＴＮＦと本発明の抗
腫瘍性ポリペプチドはＮ末端アミノ酸配列において明ら
かに異なっている。因みにウサギのＴＮＦのＮ末端アミ
ノ酸配列は特開昭６０−１９７１９号公報にＳｅｔ−Ａ
ｈａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−八１ａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ｌ４ｅ−Ｖａｌ
であることが記載されているが、これとＨＬ−６０のＴ
ＮＦを比較すると、Ｎ末端の２個のアミノ酸が欠如して
いるほか、第４．第７゜第８及び第１３番目のアミノ酸
が異なっている。

他の大部分のアミノ酸配列はウサギのものもＨＬ−６０
のものも差がないといわている。本発明の抗腫瘍性ポリ
ペプチドについてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動で単一なハンドを示す抗腫瘍性ポリペプチド（ＴＮＦ
−１，ＴＮＦ−２およびＴＮＦ−３の混合物）１００μ
ｇを含む水溶液１００μｌにトリプシン３．３μｇを加
え３７℃、Ｉ）Ｈ８，Ｏで２２時間放置してトリプシン
分解を行った。分解物をＲＰ３１８カラム（バイオラン
ド社製、逆相ＨＰＬＣ用カラム）を使用するＨＰＬＣに
よりＦ−１からＦ−８のフラグメントとして分離した。

それぞれのフラグメントについてアプライド・バイオシ
ステムズ社製、アミノ酸シークエンジングアナライザー
（モデル４７０Ａ）を用いてエドマン分解を行った。遊
離してくるフェニル千オヒダントインーアミノ酸をＨＰ
ＬＣ（島津ＬＣ−４Ａ型）にて分析を行い常法に従って
アミノ酸を決定した。その結果は次のとおりであった。

Ｆ　　　　１　　：Ｖａｌ−Ｖａｌ−へｌａ−へ５ｎ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉ
、ｅｕ−Ｇｌｎ Ｆ２：Ａｌａ−＾５ｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌ
ａＦ　　　３　　：　Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ
−Ｖａｌ−Ｘ−Ｘ＝Ｘ−Ｇｌｙ−ＬｅｕＦ　−４：　ｌ
１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｘ−ＴｙｒＦ　−５：　Ｖａｌ
−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＬｅｕＦ　−６：　Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＡｌａＦ
　−７：　Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ４１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ−ＰｈｅＦ　　−８：　　Ｌ
ｅｕ−Ｓｅｒ−へ１ａ−Ｇｌｕｌｌｅ−Ａｓｎ−八ｒｇ
−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖ
ａｌ−Ｔｙｒ これらのＦ−１〜Ｆ−８のトリプシン分解フラグメント
の分析結果から推定される構造はいずれもＨＬ−６０の
ＴＮＦ構造中に見い出されるので、ＴＮＦ−１，ＴＮＦ
−２，およびＴＮＦ−３のいずれもＮ末端から１３番目
以降のアミノ酸配列はＨＬ−６０のＴＮＦと同じである
と推定される。

高純度に精製された本発明の抗腫瘍性ポリペプチドはヒ
トに投与したときに副作用がなく、腫瘍細胞のみを壊死
せしめる作用を有するものと期待される。精製した抗腫
瘍性ポリペプチドはマウスに静注投与したとき急性およ
び亜急性毒性を示さず、たとえば腎原発肺転移を有する
末期癌患者に静注投与すれば病巣は消失、縮退または拡
大を停止し、治癒するものと思われる。本発明の抗腫瘍
性ポリペプチドはヒト正常細胞Ｗｌ−３８及びＦＩｏｗ
ｌｏｏｏ並びにマウス胎児細胞に対して細胞毒性を示さ
ないが、ヒト腫瘍細胞ヘラ（Ｈｅｌａ）及びＫＢ並びに
マウス腫瘍細胞サルコーマ１８０及びＬ−１２１０に対
しては細胞毒性を示すと思われる。

〔実施例〕

以下、実施例にて本発明の詳細な説明する。

実施例１ ５％牛脂児性血清を存するＲＰＭＩ−１６４０無菌培地
２００βを３００！容培養槽に張り込み、この培地にＴ
ＨＰ−１細胞を２Ｘ１０Ｓ個／ｍｌになるように懸濁し
た。これを３７℃で４日間培養し、得られた培養液を遠
心分離してＴＨＰ−１細胞を無菌的に採取した。この細
胞を別の培養槽に入れた血清を含まない上記ＲＰＭＩ−
１６４０培地２００１に移し、これにＴＰＡを１１００
ｎ／ｍ（！添加し、ゆるやかに液を攪拌（１００ｒ、ｐ
、ｍ、）　しつつ無菌的条件下３７．０℃で５時間培養
（誘導）を行った。このようにして得られた培養液を遠
心分離して細胞を分離、除去して１．５Ｘ１０３単位／
ｍｌの抗腫瘍性ポリペプチド活性を有する培養液を得た
。このようにして得られた培養上清液を限外濾過膜（ミ
リポア社製、ＨＶＬＰ　　ＯＨＶ　　２０）で１／１０
量になるまテ濃縮した。この濃縮液に固形硫酸アンモニ
ウムを加え（６５％飽和量）で溶解し、蛋白を沈澱させ
た。該沈澱物を遠心分離（１０００ｒ、ｐ、ｍ、。

２０分間）により採取し、少量の０．０５Ｍ）リス−塩
酸塩緩衝液（ｐＨ７，７）に溶解せしめた。

次いで、これを同緩衝液に対し透析しく５℃、２４時間
）、内液に等量の緩衝液を加え、これを予め同緩衝液で
平衡化させたＤＥＡＥ−トーヨーパールＭ６５０カラム
（５Ｘ４０ｃｍ）に負荷した。

このカラムを同緩衝液１．０Ｊで洗浄後、０．２　Ｍの
食塩を含有する同緩衝液で溶出した。

抗腫瘍性ポリペプチド活性区分２．０ｊｌ！を集め、硫
安分画（４０％〜５５％飽和画分）を行い、得られた硫
安沈澱を少量の水に溶かし、この水溶液を同緩衝液で十
分透析した（５℃、２４時間）。

透析内液に４０％飽和量の硫安を加えて溶解し、遠心分
離して不溶物を除去し、予め４０％飽和硫安を含む０．
０５Ｍｌ−リス−塩酸塩緩衝液で平衡化したブチルート
−ヨーパール６５０８カラム（２，５Ｘ３０（Ｊ）を用
い流速２．０　ｍｍｌ！　／ｍｉｎ。

の条件で疎水クロマトグラフィーを行った。次いで、抗
腫瘍性ポリペプチド活性画分を集め、０．０５Ｍ　）　
ＩＪスス−酸塩緩衝液（ｐＨ７，８）で透析した。透析
内液を予め５０ｍＭトリス−塩酸塩緩衝液（ｐＨ８，５
）で平衡化したＭｏｎ、ｏ　Ｑ　　ＨＲ５１５カラムに
負荷し、同緩衝液で洗浄した後、０．１゜０．１５．０
．２．０．３Ｍと順次食塩濃度を上げる段溶出され、比
活性１×１Ｏ１１単位／ｍｇ蛋白質まで精製された。こ
の工程における精製度は５〜１５倍、回収率は８０％以
上であった。

このようにして得られた活性区分を集め、ＭｏｎｏＱ　
　ＨＲ５１５カラムを用いて同条件で再びＦＰＬＣを行
った。再ＦＰＬＣの溶出パターンを第１図に示す。この
図において縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度（％）を示
し、横軸は溶出時間（分）を示す。図面から明らかなよ
うに、抗腫瘍性ポリペプチド活性はＯ，１Ｍの食塩で溶
出され、２８０ｎｍのピークと良く一致した。この活性
区分を集めて純水で透析した後、凍結乾燥して２００μ
ｇの精製標品を得た。この標品の比活性は５．０Ｘ１０
８単位／ｎｖ蛋白質である。

次に本蛋白質についてファルマシア製、ＦＰＬＣシステ
ムのアニオン交換カラムＭｏｎｏ　Ｑ　　カラムクロマ
トを行い、下記の条件で溶出を行った。

〜／ この溶出条件においてリテンションタイム３５分、３６
分、３７．８分に溶出される３つのピークを分取した。

（これら３つのピークはそれぞれＴＮＦ−１，ＴＮＦ−
２，ＴＮＦ−３である。）さらに、各々について上記の
条件で再クロマトを行い、純化した。それぞれの抗腫瘍
性ポリペプチドは以下に示す方法でいずれも単一な蛋白
であることが証明される。

まず、それぞれのサンプルについてＰｒｏ−ＲＰＣＨＲ
５／２　（ファルマシア社製、Ｃ−４逆相担体）カラム
を用いて逆相ＦＰＬＣを行った。０，１％トリフルオロ
酢酸を展開液とし、アセトニトリルの濃度を０％から７
０％直線時に変えて溶出した。

この内ＴＮＦ−１の溶出パターンを第２図に示す。

ＴＮＦ−１ポリペプチドはアセトニトリル３６％付近で
溶出され、他に蛋白のピークは認められない。ＴＮＦ−
２およびＴＮＦ−３についても同じような結果が得られ
た。従って、逆相ＦＰＬＣ的に単一物質といえる。

次に、同じサンプルを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。

すなわち、バイオランド社製のスラブ電気泳動装置（ｒ
ＰＲＯＴＥＡＮＪ、１６ｃｍ）を用い、０．１％ＳＤＳ
を含有する１５．０％のポリアクリルアミドゲルにサン
プルを負荷し、２０ｍＡの定電流で電気泳動を行った。

次いで銀染色を行って蛋白を検出した。この結果、いず
れも１７．４　Ｋｄの位置に単一バンドとして検出され
、他に蛋白のバンドは認められなかった。従って、本蛋
白標品は５ＤＳ−ＰＡＧＥ的に均一な蛋白であることが
証明された。またこれらの蛋白標品についてＬＫＢ社製
のアンホライン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）ポリアクリルア
ミドゲルを使用するポリアクリルアミドゲル等電点電気
泳動法により等電点を測定した結果、いずれも等電点（
ｐｉ）は５．７であった。

次に、これら３つの抗腫瘍性ポリペプチドについて、Ｎ
末端よりアミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列の決定
はガスフェイズアミノ酸シークエンサー（モデル４７０
Ａ）を用い、各々のサンプルについて約１０μｇを分析
した。その結果を梅考損肴半＃ＴＮ　Ｆ−１、祷掃播袢
≠す≠ＴＮＦ−２及び桶川國畔蜘自≠ぺ丁ＮＦ−３のＮ
末端アミノ酸配列は前記した通りであった。

本発明に使用するＴＨＰ−１はＩｒ＋ｔ、　Ｊ、　Ｃａ
ｎｃｅｒ２６．１７１−１７６　　（１９８０）　に記
載されているものであり、この載支の著者より分与され
たものである。ＴＨＰ−１はＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、エエ、５３９７−５４０１　　（１９
８３）。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　４２．　４８４
−４８９（１９８２）　　（ここには、ＴＨＰ−１は叶
、Ｇ。

Ｒｏνｅｒａより分与されたものであると記載されてい
る。）にも記載されていて、これらの研究機関にも分与
されている。また、本発明者らは権利を有するいずれの
ものに対してもＴＨＰ−１を分与する用意がある。

正常細胞には細胞毒性を示さないが、ヒト腫瘍細胞を浮
遊培養することによっても、また血清を含まない培地を
用いても製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗腫瘍性ポリペプチド混合物の陰イオン交換ク
ロマトグラフと抗腫瘍性ポリペプチド活性を示すグラフ
、第２図はＴＮＦ−１の逆相クロマトグラフを示すもの
である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｎ末端からのアミノ酸配列がＶａｌ−Ａ−Ｓｅｒ
   −Ｘ−Ｔｈｒ−Ｂ−Ｔｈｒ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｖａ
   ｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎで表わさ
   れ、かつＡがＡｒｇ又はＬｙｓ、ＢがＡｒｇ又はＰｒｏ
   、ＣがＡｒｇ又はＰｒｏ、ＤがＳｅｒ又はＬｙｓ、Ｅが
   Ａｒｇ又はＰｒｏ、ＦがＬｙｓ又はＶａｌ、ＧがＰｈｅ
   又はＰｒｏ、Ｘが未固定アミノ酸であるペプチドフラグ
   メントを有し、他にトリプシン分解フラグメントとして
   【アミノ酸配列があります】及び【アミノ酸配列があり
   ます】 を有し、かつ下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性ポリ
   ペプチド。 （ａ）分子量：１７４００±５００（ＳＤＳ電気泳動法
   ） （ｂ）等電点：ｐＩ５．７±０．２（ゲル等電点電気泳
   動法） （ｃ）ｐＨ安定性：ｐＨ６から９の範囲で安定 （ｄ）温度安定性：ｐＨ７．０、６５℃、１時間の加熱
   により６０〜７０％失活する （ｅ）蛋白質分解酵素に対する安定性：失活する （ｆ）生理活性：ヒト正常細胞に対し細胞毒性を示さず
   、ヒト腫瘍細胞に対し細胞毒性を示す