JP2713912B2 - ヒト免疫グロブリンｅ結合因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ヒト免疫グロブリンＥ結合因子（IgE-B
F）、このポリペプチドをコードするmRNA,DNA及びハイ
ブリドベクター、このハイブリドベクターを含有する宿
主、並びに前記ポリペプチド、mRAN、DNA、ハイブリド
ベクター及び宿主の製造方法に関する。このポリペプチ
ドはアレルギー疾患の予防及び／又は治療のために使用
することができ、そしてそれ故にこの発明はまた前記ポ
リペプチドを含有する医薬に関する。 〔発明の背景〕 アレルギー疾患は、その高い発生率（人口の20〜30
％）のため及び治療手段の欠如のためなお主要な健康問
題である。これに対する療法は通常抗ヒスタミン剤の使
用又は幾分有効な免疫化法に限定されている。古典的な
抗アレルギー剤は、これらが特に治療された患者におい
て種々の副作用を生じさせるために、幾つかの欠点を有
する。免疫化法は１又は２種類のアレルゲンに限定され
るが、ほとんどの患者は多数のアレルゲンに感受性であ
る。さらに、除感作処置は治癒的でもなく保護的でもな
い。 大多数のアレルギー疾患が、多数の風媒アレルゲン、
例えば花粉、動物のフケ、ホコリダニ、食品抗原、医薬
製剤、例えばペニシリン、又は膜翅目の毒により媒介さ
れる。IgEの生産を制御する機構は実験室動物において
広範に研究されている〔K.Ishizaka,Ann.Rev.Immunol.
2,159（1984）〕。これらの研究は、動物モデルにおい
てIgEの生産を制御する抗原特異的でないがしかしIgEア
イソタイプ特異的な機構を明瞭に示した。これらの制御
機構のエフェクター分子は、IgEに対するそれらの親和
性に基いてIgE-結合因子（IgE-BF）と命名された。IgE-
BFはIgE−抑制因子（IgE-suppressive factor;IgE-SF）
とIgE−増強因子（IgE-potentiating factor;IgE-PF）
とに分けられ、これらの分子はその炭水化物含量によっ
てのみ異る。IgE-SFはグリコシル化されていないか、又
は対応するIgE-PFよりも少なくグリコシル化されてい
る。動物モデルにおけるIgEの実際の生産はこれら２種
類のIgE-BF間の比率によって決定される。 同じ細胞が、異るＴリンパ球亜集団により分泌される
グリコシル化阻害因子又は増強因子の影響に従ってIgE-
SF又はIgE-PEのいずれかを生産することができる。 M.Sarfati等〔Immunology,53,197,207,783（1984）〕
は齧歯動物において記載されているものと類似する生物
学的活性を有するIgE-BFを分泌するヒトＢセルラインの
存在を報告している。他の研究者はヒトＴ細胞による
〔T.F.Huff及びK.Ishizaka,Proc.Natl.Acad.Sci.（US
A）81,1514（1984）〕又は遺伝子工学的技法による〔ヨ
ーロッパ特許出願No.155,192〕IgE-BFの生産を記載して
いる。Ｔ−細胞由来のIgE-BFとＢ−細胞由来のそれとの
関係は今まで知られていない。本発明から明らかになる
様に、Ｂ−細胞由来のIgE-BFはＴ−細胞由来のIgE-BFと
統計的な類似性を有しない。 精製されたIgE-BFはアレルギー性疾患及びこれと関連
する免疫抑制疾患の診断及び療法のために重要である。
特に、IgE−抑制活性を有するIgE-BFはアレルギー疾患
の治療において有用であり、他方IgE−増強活性を有す
るIgE-BFは感染に対する耐性、例えば寄性体感染に対す
る耐性を増強するであろう。Ｂ−細胞からのIgE-BFの検
出のためのアッセイはロゼット阻害試験に基き、この試
験においてはIgEのリセプター（FcεＲ）を発現するRPM
I8866細胞（リンパ芽球様Ｂ−セルライン）がIgE−コー
トウシ赤血球と共にロゼット形成される。後者が最初に
IgE-BFと共にプレインキュベートされれば、もはやRPMI
8866細胞に結合することができず、そしてそれ故にロゼ
ットを形成する細胞の比率が低下する。このアッセイは
定量的ではなく、ウシ赤血球へのIgEのカップリングの
可変性の故に技術的に微妙であり、そしてロゼットを顕
微鏡観察しなければならないこと、セルラインが永久に
生存しなければならないこと、IgE−コート赤血球を常
に調製しなければならないこと、等のために煩雑であ
り、そのため１日に１人により少数の（20〜40）試験の
みが合理的に実施可能である。より便利で、定量的で且
つ実施が容易なアッセイにおいては、IgE-BFと交差反応
する、リンパ球FcεＲに対するモノクローナル抗体が使
用される。この様なモノクローナル抗体はG.Delespesse
等、EP86810244.3により調製されており、そしてそのた
めのハイブリドーマセルラインはパリのパスツール研究
所のCollection Nationale de Cultures de Microorgan
ismesに寄託されており、そして受託番号No.I-425（ク
ローン208.25 A.4,3/135）、I-420（クローン208,25 D.
2,1/176）、I-451（クローン207.25 A.4,4/30）、I-452
（クローン207.25 A.4,4/45）、及びI-486（クローン20
8.25 D.2/94）のもとで入手可能である。対応するモノ
クローナル抗体がそれぞれMab-135,Mab-176,Mab-30,Mab
-45及びMab-94と命名される。これらはまた、アフィニ
ティークロマトグラフィーによるIgE-BFの効果的な精製
を可能にする。 上記モノクローナル抗体の使用にもかかわらず、天然
ヒトＢセルラインから単離された単一IgE-BFのアミノ酸
配列を決定することは不可能であった。療法目的のた
め、所望のIgE−結合性を有し、定義されたアミノ酸配
列を有し、そして容易に多量に製造することができる純
粋な単一ポリペプチドを手にすることが非常に望まし
い。 近年における組換DNA法の急速な進歩がこの目的を達
成するための一般的な方法を提供している。ポリペプチ
ドの構造が未知の場合、組換DNA技法の成功は天然源か
らの目的ポリペプチドをコードするmRNA又はDNAの同定
に依存している。適当なアッセイによるmRNAの同定の
後、相補的DNA（cDNA）を調製することができる。このc
DNAを適当なベクターに導入することができ、得られた
ハイブリドベクターによる適当な宿主の形質転換の後、
形質転換された宿主の選択及び培養がポリペプチドの生
産及び最終的に単離を可能にする。目的のポリペプチド
をコードするcDNAの単離及び配列決定がポリペプチドの
アミノ酸配列の決定を可能にする。cDNA又はその部分を
用いて目的のポリペプチドをコードする他のヌクレオチ
ド配列について天然のmRNA又はDNAゲノムをスクリーニ
ングすることができる。 従って、本発明においては、IgE-BFの構造が知られて
いないため、第一の目的はヒトＢ−細胞の分画されたmR
NAによりアフリカツメガエル〔キセノプス・レービス(X
enopus laevis）〕の卵を形質転換することにより目的
ポリペプチドをコードするヒトＢ−細胞のmRNAを同定
し、そしてこの目的mRNAを含有するクローンを前記のモ
ノクローナル抗体を用いるアッセイによって決定するこ
とであった。他の目的は、cDNA及びハイブリドベクター
を調製し、適当な宿主を形質転換し、そして最後に該宿
主を培養しそして目的ポリペプチドを単離することであ
った。ポリペプチドの発現の後に翻訳後修飾が起こり得
るため、単離されたポリペプチドは必ずしも天然ポリペ
プチドと同じではない。 〔発明の目的〕 本発明の対象は、ヒトＢ−細胞のIgE-BFに関連するポ
リペプチド、該ポリペプチドをコードするDNA配列を挿
入部として含んで成るハイブリドベクター、該ポリペプ
チドをコードするRNA及びDNA、並びに該ポリペプチドの
有効量を含有する医薬である。 他の対象は、前記ポリペプチド、ハイブリドベクタ
ー、形質転換された宿主、RNA及びDNA分子の製造方法、
医薬、並びに該ポリペプチドの使用である。 この発明の他の目的は、IgE-BFに関連する本発明のポ
リペプチドの有効量を投与することによるアレルギーの
予防及び／又は治療の方法を提供することである。 これらの目的は式（Ｉ）のポリペプチド及びその断片
をコードするDNAの調製により達成された。 〔発明の具体的な記載〕 本発明のポリペプチド 本発明は、次の式（Ｉ）： で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並び
に該ポリペプチドの断片、変異体及び誘導体に関する。 式（Ｉ）中の単一文字は次の天然Ｌ−アミノ酸を示
す：（Ａ）アラニン、（Ｃ）システイン、（Ｄ）アスパ
ラギン酸、（Ｅ）グルタミン酸、（Ｆ）フェニルアラニ
ン、（Ｇ）グリシン、（Ｈ）（ヒスチジン）、（Ｉ）イ
ソロイシン、（Ｋ）リジン、（Ｌ）ロイシン、（Ｍ）メ
チオニン、（Ｎ）アスパラギン、（Ｐ）プロリン、
（Ｑ）グルタミン、（Ｒ）アルギニン、（Ｓ）セリン、
（Ｔ）スレオニン、（Ｖ）バリン、（Ｗ）トリプトファ
ン、（Ｙ）チロシン。 式（Ｉ）のポリペプチド、並びに該ポリペプチドの断
片、変異体及び誘導体は“この発明のポリペプチド”な
る単一表現のもとにグループ化される。これらはヒトＢ
−細胞上のIgEリセプターに関連し、そして膜係留配列
（membrane anchoring sequence）が無い場合には前記
のSarfati等のIgE-BFに関連する。 この発明のポリペプチドの断片は式（Ｉ）の完全ポリ
ペプチドの部分であって、式（Ｉ）の対応する配列中の
10個以上で320個以下の連続するアミノ酸を有する。こ
の様な断片は例えば、第一アミノ酸又はＮ−末端から始
まって約133個以下のアミノ酸が欠けている式（Ｉ）の
ポリペプチドである。この欠けたＮ−末端はこのポリペ
プチドをＢ−細胞の細胞質膜に結合せしめる膜係留配列
である。他の断片は、Ｎ−末端とＣ−末端との間のアミ
ノ酸、例えばおよそ110-130のアミノ酸、又はＣ−末端
のアミノ酸、例えばおよそ250-321のアミノ酸が欠けて
いる式（Ｉ）のポリペプチドである。 この発明は特に、アミノ酸106-127を含んで成るアミ
ノ酸配列が欠けていること、あるいはアミノ酸120,121,
123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,13
5,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,
148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159又
は160のいずれかから始まりそして282と321の間のアミ
ノ酸のいずれか１つ、好ましくは321において終るポリ
ペプチドから成る群から選択されることを特徴とする式
（Ｉ）のポリペプチドの断片に関する。 式（Ｉ）のポリペプチドの好ましい断片はアミノ酸11
9からアミノ酸321までのアミノ酸配列から成ることを特
徴とする。 式（Ｉ）のポリペプチドの他の好ましい断片はアミノ
酸134からアミノ酸321までのアミノ酸配列から成ること
を特徴とする。 式（Ｉ）のポリペプチドの他の好ましい断片はアミノ
酸148又は150からアミノ酸321までのアミノ酸配列から
成ることを特徴とする。これら２種類の断片はRPMI8866
細胞の上清に見出すことができ、そしてそれ故に天然の
IgE-BFに相当する。 これらの断片は、特にE.コリでの発現によって得られ
る場合、Ｎ−末端に付加されたメチオニンを有すること
ができる。 この発明のポリペプチドの変異体は、その１個（点変
異）又は複数個であっておよそ10個までのアミノ酸の１
個又は複数個の他のアミノ酸に対する交換により特徴付
けられる。これらは異るコドンを導くDNAレベルでの対
応する変異の結果である。 この発明のポリペプチドの誘導体は、官能基、例えば
アミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基又はカルボキ
シル基が誘導体化、例えばそれぞれグリコシル化、アシ
ル化、アミド化又はエステル化されているものである。
グリコシル化誘導体においては、オリゴサッカライドが
通常、アスパラギン、セリン、スレオニン及び／又はリ
ジンに連結されている。アシル化誘導体は特に、天然有
機酸又は無機酸、例えば酢酸、リン酸又は硫酸によりア
シル化されており、このアシル化は通常、それぞれ、Ｎ
−末端アミノ基、又は特にチロシンもしくはセリンのヒ
ドロキシ基において生ずる。エステルは天然アルコー
ル、例えばメタノール又はエタノールのエステルであ
る。 他の誘導体は塩、特に医薬として許容される塩、例え
ば金属塩、例えばアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属
塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩又は亜鉛塩、あるいはアンモニア又は
適当な有機アミン、例えば低級アルキルアミン、例えば
トリエチルアミン、ヒドロキシ低級アルキルアミン、例
えば２−ヒドロキシエチルアミン等により形成されるア
ンモニウム塩である。 式（Ｉ）のポリペプチドは、ロゼット阻害アッセイ、
及びIgE-BFに特異的なモノクローナル抗体、例えばMab-
135及びMab-176への結合によって証明することができる
ように、IgE−結合活性を有する。断片、変異体及び誘
導体の内IgE−結合活性を有するものが好ましい。 この発明のポリペプチドは組換DNA技法により製造さ
れ、この技法はこのようなポリペプチドをコードするmR
NAの定定、DNA又はcDNAの調製、cDNAハイブリドベクタ
ーの造成、該ベクターの発現を許容する宿主細胞の形質
転換、及び前記ポリペプチドの単離を含んで成る。 従って、この発明はさらに式（Ｉ）のポリペプチド、
並びに該ポリペプチドの断片、変異体又は誘導体の製造
方法に関し、この方法は、 ａ）式（Ｉ）のポリペプチド又は該ポリペプチドの断片
もしくは変異体をコードするDNA配列を含んで成るハイ
ブリドベクターを含有する形質転換された宿主を培養
し；又は ｂ）式（Ｉ）のポリペプチド又は該ポリペプチドの断片
もしくは変異体をコードするmRNAを適当な翻訳系におい
て翻訳し； そして必要であれば、式（Ｉ）のポリペプチド又はそ
の断片もしくは変異体をそれらの誘導体に転換する； ことを特徴とする。 ａ）形質転換細胞は原核細胞又は真核細胞、例えば細
菌、真菌、例えば酵母、又は高等細胞、例えばヒト−セ
ルラインから選択される。E.コリの菌株、例えばE.コリ
HB101,BZ234又はB1472、使用可能なS.セレビシエー
（S.cerevisiae）の株、例えばRH971であって、この発
明のポリペプチドをコードしそして適当なプロモータ
ー、エンハンサー、マーカー、シグナル配列等を含有す
るハイブリドベクターにより形質転換されるものであ
る。 形質転換された宿主細胞は、当業界において知られて
いる方法により、通常は資化性炭素源及び窒素源並びに
所望により適当な増殖因子を含有する液体培地中で培養
される。 形質転換された原核微生物及び真核微生物の増殖のた
め種々の炭素源を使用することができる。好ましい炭素
源の例として資化性炭水化物、例えばグルコース、マル
トース、マンニトールもしくはラクトース又は酢酸塩が
挙げられ、これらはそれ自体として又は適当な混合物と
して使用することができる。好ましい窒素源の例として
アミノ酸、蛋白質、例えばトリプトン、ペプトンは肉エ
キス、酵母エキス、マルトエキス、そしてさらにアンモ
ニウム塩、例えば塩化アンモニウム又は硝酸アンモニウ
ムが挙げられ、これらはそれ自体として、又は適当な混
合物として使用することができる。 培地はさらに微量要素、例えばK⁺,Ca ，Mg⁺⁺,Fe ,M
g ,Zn ,Cu ，NO₃ ^-,SO₄ ^--,HPO₄ ^--,H₂PO₄ ^-,Cl^-,BO₃ ^---
及びMoO₄ ^--を含有する。さらに、選択圧を提供しそして
発現ベクターを失った宿主の増殖を防止する物質を添加
するのが好ましい。すなわち、例えば、ハイブリド発現
ベクターがamp^R遺伝子を含有する場合にはアンピシリン
が培地に添加される。抗生物質の添加はまた、抗生物質
感受性の汚染微生物が生存できないという効果を有す
る。宿主生物として例えば必須アミノ酸について栄養要
求性の酵母株が使用される場合、プラスミドは好ましく
は宿主の欠損を補完する酵素をコードする遺伝子を含有
する。酵母株の培養は前記アミノ酸を欠く最少培地にお
いて行われる。 動物細胞は、ほとんどの場合哺乳類の血清が補充され
た市販の培地（例えばギブコ、フローラボラトリーズ）
を用いて組織培養条件下で増殖する。細胞は固体支持
体、例えばローラーボトル、ミクロキャリャー、又は多
孔性ガラスフィルターに付着した状態で、あるいは適当
な容器中での自由浮遊細胞として大量に増殖する。 培養は当業界において知られている方法により行われ
る。培養条件、例えば温度、培地のpH及び発酵時間は、
この発明のポリペプチドの最高力価が得られる様に選択
される。すなわち、E.コリ又は酵母株は、好気的条件下
で、振とう又は攪拌を伴なう液中培養として、約20℃〜
40℃、好ましくは約30℃の温度において、そして４〜
６、好ましくは約７のpHにおいて、約４〜30時間、好ま
しくはこの発明のポリペプチドの最大収量の達成される
まで培養される。 ｂ）この発明のポリペプチドをコードするmRNAは、適当
な翻訳系、例えばアフリカツメガエル(Xenopus laevi
s）の卵母細胞中で翻訳されそして発現され得る。この
発明のポリペプチドをコードするmRNAを雌性カエル(Xen
opus laevis）の卵母細胞に微量注入する。形質転換さ
れた卵母細胞を、FCSが補充されたBarth溶液中で約20℃
にて約45時間インキュベートする。インキュベーション
培地を除去した後、卵母細胞を卵母細胞溶解緩衝液中で
ホモジナイズしそして遠心する。モノクローナル抗体を
用いるRIAアッセイにより示されるように、上清はこの
発明のポリペプチドを含有する。この発明のポリペプチ
ドを製造するためのこの方法は、主として同定目的のた
めに有用である。 この発明のポリペプチドのレベルが最高に達した時、
培養を中断し、そしてポリペプチドを単離することがで
きる。ポリペプチドが適切なシグナルペプチド配列と融
合している場合、このものは細胞により直接上清に分泌
される。その他の場合には、細胞をSDS又はトリトンの
ごとき洗剤で処理することにより破壊するか、又はリゾ
チーム又は同様に作用する酵素により細胞溶解しなけれ
ばならない。宿主微生物として酵母を使用する場合、グ
ルコシダーゼによる酵素的消化によって細胞壁を除去す
ることができる。この方法に代えて、又はこの方法に加
えて、機械的力、例えば剪断力（例えばＸ−プレス、フ
レンチプラス、ダイノミルによる）、又はガラスビーズ
もしくは酸化アルミニウムとの振とう、あるいは例えば
液体窒素中での凍結と解凍との反復、さらには超音波を
使用して細胞を破壊することができる。この発明のポリ
ペプチドを含有する、細胞上清又は細胞の破壊の後に得
られた混合物を、当業界においてよく知られている方
法、特にポリエチレンイミン処理、遠心分離、及び塩、
例えば硫酸アンモニウム又は亜鉛塩による沈澱によって
濃縮することができる。追加の精製段階は例えば超遠心
分離、ダイアフィルトレーション、ゲル電気泳動、クロ
マトグラフ法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、
サイズ排除クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラ
フィー（HPLC）、逆相HPLC、ファスト・プレッシャー・
液体クロマトグラフィー（FPLC）等、適当なゲル濾過カ
ラムによる分子サイズに従う混合物の成分の分離、透
析、アフィニティークロマトグラフィー、例えば抗体、
物にモノクローナル抗体、特にMab-135及びMab-179を用
いるアフィニティークロマトグラフィー、並びに当業界
において知られている他の方法である。 好ましい態様においては、この発明のポリペプチド
は、モノクローナル抗体アフィゲル（affigel）、例え
ばMab-45−アフィゲルを通して細胞上清を濾過し、結合
したIgE-BFポリペプチドを、例えばpH2.6の0.1Mグリシ
ン−HCl緩衝液により溶出し、目的ポリペプチドを含有
する画分を陰イオン交換カラム、例えばシンクロパック
（SynChropak）AX300に負荷し、カラムを例えばTris-HC
l緩衝液（pH7.4）により洗浄し、蛋白質を例えば塩化ナ
トリウム溶液、例えば1M NaClにより溶出し、目的ポリ
ペプチドを含有する画分を透析しそして凍結乾燥し、透
析された画分を逆相クロマトグラフィー、例えばシンク
ロパックRP-4カラム上に負荷し、そして目的ポリペプチ
ドを例えばアセトニトリル/0.1％TFAグラジエントによ
り溶出することにより、細胞上清から単離される。 この方法は特に、RPMI8866細胞上清から天然IgE-BFを
精製するために特に適当である。この方法により精製さ
れた天然IgE-BFはアミノ酸配列決定法のために十分な純
度を有し、そしてこの配列決定により、これが次のＮ−
末端アミノ酸配列： を有する２種類の蛋白質から成ることが明らかになっ
た。 上記の番号は式（Ｉ）の番号に対応する。Ｘで示され
るアミノ酸は決定されなかったが、式（II）又は（II
I）のDNA配列との比較により次の様に帰属させることが
できる：X₁₄₉＝R,X₁₅₁＝E,X₁₅₅＝S,X₁₆₀＝C,X₁₆₃＝C_Oこ
の分析により、天然IgE-BFは少なくとも２つのポリペプ
チド、すなわちL₁₄₈からS₃₂₁に伸びるアミノ酸配列を有
するもの及びM₁₅₀からS₃₂₁に伸びるアミノ酸配列を有す
るもの〔式（Ｉ）において〕が約40:60の比率で存在す
るという結論が可能とする。 最後に、単離された蛋白質のIgE−結合活性は当業界
においてよく知られた方法、例えばロゼット阻害アッセ
イ、抗−IgE抗体へのIgE−結合のブロック、アフィニテ
ィークロマトグラフィー実験、及びアレルギー個体から
のリンパ球によるインビトロIgE合成の進行の抑制の測
定実験により決定することができる。 正しい配列を有するがしかし三次元的折りたたみが誤
っているこの発明のポリペプチドは再生実験における中
間体として有用である。 この発明はまた、この発明の方法により製造される式
（Ｉ）のポリペプチド又はその断片、変異体もしくは誘
導体に関する。 形質転換された宿主の調製 この発明はさらに、この発明のポリペプチドを発現す
ることができる形質転換された宿主の多段階製造方法に
関し、この方法は、 １）式（Ｉ）のポリペプチド又はその断片、変異体もし
くは誘導体をコードするDNAを調製し； ２）得られたDNAを適当なベクターに導入し； ３）得られたハイブリドベクターにより適当な宿主を形
質転換し； ４）未形質転換宿主から形質転換された宿主を選択し；
そして場合によっては、 形質転換された宿主からハイブリドベクターを単離し、
該ハイブリドベクターのコード領域又は非コード領域を
変形し、そして段階３及び４を再度行う； ことを特徴とする。 宿主の調製に使用される段階は後でさらに詳細に記載
する。この発明はまた単一の段階にも関する。 1.この発明のポリペプチドをコードするDNAの調製 この発明は式（Ｉ）のポリペプチド、又はその断片、
変異体もしくは誘導体をコードするDNA、及びその製造
方法に関する。 この発明のポリペプチドをコードするDNAは、ａ）単
離されたmRNAをcDNAに逆転写するか、ｂ）ゲノムDNAを
単離するか、又はｃ）化学合成する、ことにより得るこ
とができる。 この発明においては、DNAの構造が未知であったの
で、DNAをゲノムDNAから、又はmRNAを介してcDNAライブ
ラリーから得なければならなかった。cDNAライブラリー
は細胞から単離されたmRNAに対して相補的な遺伝情報を
含む。 ａ）単離されたmRNAのcDNAへの逆転写 cDNAラリブラリーを得るため、IgE−結合活性を発現
する細胞、特にヒトＢ−細胞及びこれに由来するセルラ
インからmRNAを単離する。このmRNAを２本鎖cDNAに転換
する。好ましいヒトＢ−セルラインはRPMI8866である。
他の有用なＢ−セルラインは天然Ｂ−細胞をエプスタイ
ン−バールウイルスにより不滅化することによって調製
することができる。当業界においてよく知られている標
準的方法がmRNAの調製のために使用される。細胞膜を破
壊し、そして細胞内容物を放出せしめ、これからmRNAを
単離する。細胞膜は好ましくは、物理的方法により、又
はSDSのごとき洗剤、グアニジニウムチオシアナート、
一定塩濃度又は好ましくは混合によるホモジネーション
による細胞溶解により破壊する。フェノール抽出、エタ
ノール沈澱、遠心分離及びクロマトグラフィー、好まし
くは幾つかの方法の組合わせの標準的方法によりmRNAを
単離する。遠心分離は好ましくはグラジエント、例えば
CsClグラジエント上で行う。クロマトグラフィーのた
め、好ましくはカラム、特にオリゴ−dTカラムを使用す
る。 従来技術の方法に従って、全mRNAを直接ds-cDNAに転
換することができる。好ましくは、幾つかの技法、例え
ば電気泳動、クロマトグラフィー及び遠心分離、好まし
くはシュークロースグラジエント遠心分離を用いて、こ
の発明のポリペプチドをコードするmRNAをさらに濃縮す
る。 この発明のポリペプチドをコードするmRNAを含有する
画分を、幾つかの方法、例えばインビボ又はインビトロ
翻訳とこれに続くIgE−結合因子活性の検出により、あ
るいはヌクレオチド配列が知られている場合にはオリゴ
ヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによ
り検出することができる。 インビボ翻訳系は原核系又は真核系であることができ
る。好ましいインビボ翻訳系はManiatis等（１）により
記載されたアフリカツメガエル(Xenopus laevis）卵母
細胞系である。インビトロ翻訳系は例えば小麦胚及びラ
ビット網状赤血球ライセート系であり、いずれも市販さ
れている。 IgE結合因子性のスクリーニングのための検出系にお
いては、好ましくは式（Ｉ）のペプチドに対するモノク
ローナル抗体、特にMab-135又はMab-176を用いる。他の
可能な系においてはIgEタイプの免疫グロブリンを常用
のイムノアッセイにおいて使用する。 未分画の又は分画されたmRNA由来のmRNAのプールか
ら、当業界において良く知られている方法によりds-cDN
Aを得ることができる。好ましい一般的方法がManiatis
等（１）、Okayama及びBerg（２）、並びにHeidecker
（３）により記載されている。一般に、mRNAを逆転写酵
素を使用してまずss-cDNAに転換し、そして次に逆転写
酵素又はDNAポリメラーゼＩ（Klenow断片）を用いて２
本鎖cDNAに転換する。この発明においては、この方法は
好ましくはManiatis等（１）により記載された方法に従
って行う。ds-cDNAの合成をプライムするために２つの
方法のいずれかを使用することができる。１つの方法に
おいてはss-cDNAの天然ループ形成を用いる。第二の方
法はss-cDNAをホモポリマーテイル、例えばポリ−dC又
はポリ−dTによりテイル形成することにより行う。 その対応するポリペプチドが検出系において最高の活
性を示すmRNA画分を当業界においてよく知られている方
法により相補的cDNAに転写する。mRNA及びプライマーと
してのオリゴ−dTを混合する。次に、dNTPを出発物質と
して添加し、そしてcDNA-mRNAハイブリド分子の合成を
逆転写酵素により実現する。RNA分子をNaOHの添加によ
り分解する。DNAポリメラーゼ、好ましくはDNAポリメラ
ーゼＩのKlenow断片を混合し、そしてこの混合物を適当
な温度、例えば12℃〜15℃においてインキュベートす
る。この混合物をヌクレアーゼS1と共にインキュベート
し、そしてこの発明のポリペプチドをコードするmRNAに
対応するds-cDNAを得る。 増幅及び構造の解明のため、得られたds-cDNAを適当
なベクター、例えばプラスミドpUC-KOに連結し、そして
得られたハイブリドベクターを、後でさらに詳細に記載
するように、適当な宿主、例えばE.コリHB101を用いて
複製する。ハイブリドベクターの再単離、及び挿入され
たcDNAの回収により、この発明のポリペプチドをコード
するDNAの構造決定が可能となる。得られたハイブリド
ベクター、pCL-2及びpCL-1はそれぞれ式（II）及び式
（III）の挿入部を含有する。pCL-2のcDNA挿入部は次の
式（II）： で表わされる配列を有する。 式（II）のDNA配列中、式（Ｉ）のポリペプチドをコ
ードする領域がアミノ酸記号により標示されている。非
コードフランキング領域もまた、単離されたmRNAの非コ
ード領域である。制限部位が で示されている。 mRNAから得られた他のcDNAは式（III）の配列を有
し、この場合、式（Ｉ）のポリペプチドのアミノ酸106-
127をコードするヌクレオチド、すなわち式（II）のヌ
クレオチド316-378が欠失しており、そして他のコード
領域及び２つのフランキング配列の部分が式（II）のDN
A配列と同一である。このcDNA挿入部はpCL-1中に見出さ
れ、そして次の式（III）： により表わされる配列を有する。 ｂ）ゲノムDNAの単離 この発明のポリペプチドをコードするDNAを得るため
の他の適当な方法は組織又は細胞培養のゲノムDNAから
前記DNAを単離することから成る。細胞を好ましくはSDS
及びプロテイナーゼＫを用いて溶解し、そしてフェノー
ルによる抽出を反復してDNAの脱蛋白質を行う。RNAを好
ましくはRNAアーゼにより消化する。得られた原料DNAを
適当な制限酵素例えばHae III及びAlu Iにより部分消化
し、そして15〜20kbの断片を単離し、そして適当なファ
ージ又はコスミド、例えばシャロン4A又はEMBL-3ファー
ジ中で増幅し、そして目的の配列について例えば放射能
標識されたDNAプローブにより、又は前記の他の方法に
よりアッセイする。 ｃ）DNAの化学合成 この発明のポリペプチドをコードするDNAの第三の調
製方法は化学合成である。DNAの化学合成はS.A.Marang
（４）により要約されている。既知の合成法が40又は60
塩基までのポリヌクレオチドの良好な収量、高純度、且
つ比較的短時間での調製を可能にする。適切に保護され
たヌクレオチドをK.L.Agarwal等（５）のホスホジエス
テル法、C.B.Reesm（６）のホスホトリエステル法、又
はR.L.Letsinger等（6a）のホスファイトトリエステル
法により連結する。オリゴヌクレオチド及びポリヌクレ
オチドの合成の単純化が固相法により可能であり、この
方法においては核酸鎖が適当なポリマーに結合される。
DNA合成機を使用するのが有利である。 実際の２本鎖DNAは、化学合成された短かいがしかし
オーバーラップするセグメントから酵素的に構成するこ
とができる。例えば、Khorana等（７）によれば、両DNA
鎖からのオーバーラップするポリヌクレオチドが使用さ
れ、これらが塩基対合によって正しい配置に維持され、
そして次にDNAリガーゼ酵素により化学的に連結され
る。他の可能性は、各場合において２本のDNA鎖からの
１つのポリヌクレオチド配列を、DNA−ポリメラーゼ、
例えばDNA−ポリメラーゼＩ、ポリメラーゼＩのKlenow
断片もしくはT4DNAポリメラーゼ又は逆転写酵素と共に
４種類の必要なデオキシヌクレオシドトリホスフェート
の存在下で、短いオーバーラップするセグメントと共に
インキュベートする。これによって２本のポリヌクレオ
チド配列が塩基対合によって正しい配置に維持され、そ
して必要なヌクレオチドが酵素により補充されて完全な
２本鎖DNAが得られる〔S.A.Narang等（８）〕。 ｄ）式（Ｉ）のポリペプチドの断片をコードするDNAの
調製 式（Ｉ）のポリペプチドの断片をコードするDNAは、
式（II）もしくは（III）のDNA又はこれを含有するベク
ターを適当な制限酵素及び／又は適当なエキソヌクレア
ーゼで消化し、そして必要な場合には得られたDNA断片
に化学的方法で合成されたDNA断片を補充し、あるいは
所望の断片を全体として化学合成することにより得られ
る。 適当な制限酵素及びその制限部位は式（II）に示され
ている。式（Ｉ）のポリペプチド配列S₁₁₉‐S₃₂₁をコー
ドするDNA断片の調製のため、Bgl II及びBsa Iが適当で
ある。ポリペプチド配列A₁₃₄‐S₃₂₁をコードするDNA断
片はHind III及びRsa I〔式（II）、第４図を参照のこ
と〕で制限酵素処理することにより得られる。DNA断片
の調製はまた段階的に達成することができ、この場合ま
ずより大きなDNA断片を例えばHinc II及びRsa Iによる
制限酵素処理により調製し、これを適当なベクターにサ
ブクローニングし、次にこれをそれぞれBgl II及びBamH
I、又はHind IIIにより切断する（第３図及び第４図を
参照のこと）。 部分的又は全体的化学合成と制限酵素及び／又はエキ
ソヌクレアーゼの使用との組み合わせが、式（II）に含
まれる所望のDNA断片の調製を可能にする。 この発明はまた、式（II）のDNAの他のDNA断片に関す
る。これらの断片はIgE−結合活性を有するポリペプチ
ドをコードしており、又は天然もしくは合成に由来する
前記のようなDNAを同定するためのプローブとして使用
することができる。好ましいDNA断片は式（Ｉ）に含ま
れ好ましいポリペプチド断片をコードするものである。
DNAプローブは７個以上、好ましくは約15個以上のヌク
レオチドの配列を有する。 2.ハイブリドベクターの調製 この発明のハイブリドベクターは、式（Ｉ）のポリペ
プチド又はその断片、変異体もしくは誘導体をコードす
るDNAを適当なベクターに連結することにより調製され
る。 適当なベクターは組み込まれたパッセンジャーDNAの
ためのキャリャーであって宿主微生物例えばヒト細胞を
形質転換するために使用することができるものであり、
そして宿主内で複成することができるものである。プラ
スミド、ファージ又はコスミドがベクターとして適当で
ある。適当なベクターは定められた位置にDNA挿入部を
担持する。 一般に、この様なベクターはレプリコン及び制御配
列、すなわちプロモーターを含有し、これらは、これら
が使用される宿主細胞と適合性の種に由来する。ベクタ
ーは通常、レプリコン部位、及び形質転換された細胞の
表現型選択を行うことができる配列（マーカー遺伝子）
を担持する。適当なマーカーは宿主に抗生物質耐性又は
重金属耐性を付与し、又は宿主の遺伝的欠損を補完す
る。この様なベクター中の有用な配列はエンハンサー及
びアクチベーター配列である。 出発ベクターは広範囲の原核生物及び真核生物にわた
る宿主細胞において使用するために適当なものである。
ベクターは形質転換に使用される宿主細胞に依存して選
択される。 好ましい出発ベクターは当業界において入手可能なプ
ラスミドDNA及びバクテリアファージDNAである。特に、
プラスミドpBR322及びその誘導体が有用である。この様
な誘導体は例えばプラスミドpUC-8,pUC-9,pMC-9,pGEM^TM
−１及びpGEM^TM−２である。バクテリオファージベクタ
ーの内λファージDNA、例えばλファージgt-11のDNAが
好ましい。他の好ましいファージベクターはシャロン4A
及びEMBL-3ファージである。λクローニング系はManiat
is等（１）により記載されている。 例えば式（II）又は（III）のパッセンジャーDNAを担
持するベクターはハイブリドベクターと称される。 得られたDNAを常法により出発ベクターに連結する。 出発プラスミドはまず適当な制限酵素により線状化す
る。例えばプラスミドpUC-KOはPst Iにより線状化す
る。次にdGTP及びターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼの存在下でdGテイルを付与する。２本
鎖cDNA挿入部にdCTP及びターミナルデオキシヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼの存在下でdC−テイルを付与す
る。cDNA及びベクターの両者を一緒にしてハイブリドベ
クターを得る。バクテリオファージ、例えばラムダ
（λ）はゲノムライブラリーを造成するために好まし
い。λクローニング系はManiatis等（１）により記載さ
れている。適当なベクターDNAを適当な制限酵素により
完全消化して、そして速度勾配遠心又はゲル電気泳動に
より中央断片からレフトアーム及びライトアームを分離
する。他の方法においてはレフトアーム及びライトアー
ム内に認識部位を有しない制限酵素により原料断片の部
分を消化する。単離されたゲノムDNAを15〜20kbの長さ
の断片に部分消化する。この後、アームの末端と適合す
る末端を有する外来DNAの断片とアームとを連結する。 適当なDNA挿入部をもとのクローニングのために使用
したもとのベクターから適当な発現ベクターにレクロー
ニングする。この目的のため、適切な制限酵素（第３図
及び第４図）を最終的にはエキソヌクレアーゼ、特にBa
l31と組み合わせて使用して所望のDNA断片を生じさせ
る。これらの断片を、平滑末端を直接使用することによ
り、又は適当な化学合成されたオリゴヌクレオチド架橋
の付加により、適当な発現ベクターに組み込む。末端の
変形のため、例えばHind III及びBgl IIを使用すること
ができる。この方法はこれらの特定の制限酵素に限定さ
れない。化学合成されたオリゴヌクレオチドと組合わせ
て適当な制限酵素を用いて、発現ベクターとDNA挿入部
との間の望ましい連結を行うことができる。 この発明はさらにハイブリドベクターに関し、このハ
イブリドベクターでは式（Ｉ）のポリペプチド又はその
断片、変異体もしくは誘導体をコードするDNAが場合に
よっては発現制御配列に作用可能に連結されている。 発現のために、適当なハイブリド発現ベクターが使用
される。ハイブリド発現ベクターなる語は、DNA配列が
その発現を行うことができる他の配列、すなわちオペレ
ーター、エンハンサー及びプロモーター配列に作用可能
に連結されている、ベクター中に含まれるDNA配列を発
現することができる特定のベクターを包含する。要約す
れば、発現ベクターは機能的定義により特徴付けられ、
その中に含まれる特定のDNAを発現せしめることができ
る任意のDNA配列を意味する。この発明は、当業界にお
いて知られている発現ベクターから作ることができるす
べての形態の発現ベクター、及びこの発明のポリペプチ
ドをコードするDNA挿入部を含有する機能的同等物を包
含することが意図される 幾つかの発現制御配列を遺伝子発現の制御のために用
いることができる。微生物発現ベクターは一般にそれ自
体の蛋白質の発現のために微生物宿主により使用される
プロモーターを含有する。組換DNA造成のために最も一
般に使用されるプロモーターにはβ−ラクタマーゼ及び
ラクトースプロモーター系〔Chang等（９）;Goeddel等
（10）〕、トリプトファン（trp）プロモーター系〔Goe
ddel等（11）〕、又はバクテリオファージプロモーター
系、例えばλ由来のP_Lプロモーターが含まれる。これら
が最も一般的に使用されるが、他の微生物プロモーター
が見出されそして使用されており、そしてこれらのヌク
レオチド配列に関する詳細が公表されており、当業者は
これらをプラスミドベクターと機能的に連結することが
できる〔Siebenlist等、（12）〕。原理的には、選択さ
れた宿主中で複製しそしてこの発明のポリペプチドを発
現せしめるすべての宿主が適当である。この発明のポリ
ペプチドの発現のために適当なベクターの例としてプラ
スミドpKK222-3,pDR720及びpPL-λ、又はλ‐gtllのご
ときバクテリオファージλのベクターを挙げることがで
き、いずれも市販されている（ファルマシヤ、スエーデ
ン；プロモか、バイオフェック、米国）。この発明の好
ましいベクターはタイプpIH-ompA〔Charayeb等、（1
3）〕の発現及び分泌ベクター、及びP_Lプロモーターを
含有するベクターである。 酵母における複製及び発現のために適当なベクターは
１又は複数の、例えば２個の酵母レプリコン開始部及び
１又は複数の酵母用選択マーカーを含有する。酵母レプ
リコン開始部、例えば染色体自律複製セグメント（ars
l）又は２μoriを含有するハイブリドベクターは形質転
換の後酵細胞内で染色体外に維持されそして自律複製す
る。酵母のための適当なマーカー遺伝子は特に、抗生物
質耐性を宿主に付与するもの、あるいは栄養要求性酵母
変異株の場合には宿主の欠損を補完する遺伝子である。
対応する遺伝子は、例えば抗生物質シクロヘキシミドに
対する耐性を付与し、又は栄養要求変異株において原栄
養性を提供する遺伝子、例えばURA3,LEU2,HIS3、又は特
にTRP I遺伝子である。酵母ハイブリドベクターはさら
に、好ましくは、ベクター又はその中間体の造成及びク
ローニングを細菌宿主中でも行うことができるように、
細菌、特にE.コリのレプリコン開始部及びマーカー遺伝
子を含有することができる（シャトルベクター）。酵母
での発現のために適当な発現制御配列は、例えば高度に
発現される酵母遺伝子の発現制御配列である。すなわ
ち、TRP I遺伝子、ADH I又はADH II遺伝子、ホスファタ
ーゼ（PH03又はPH05）遺伝子、イソチトクローム遺伝子
のそれぞれのプロモーター、又は解糖系に関与するプロ
モーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３
−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）又は３−ホ
スホグリセレートキナーゼ（PGK）のプロモーターを使
用することができる。好ましいベクターは増殖条件の変
化によってターンオン又はターンオフされ得るプロモー
ターを含有する。例えば、PH05プロモーターは、培地中
の無機リン酸イオンの濃度を上昇又は低下せしめるだけ
で抑制又は抑制解除することができる。 このような細胞のための発現ベクターは、発現される
べき遺伝子の前に位置する多才な（versatile）そして
強力なエンハンサー−プロモーターユニットを含有す
る。cDNAが発現されるべき場合、RNAスプライス部位、
ポリアデニル化部位及び最後に転写停止配列が遺伝子に
付加される。哺乳類細胞において使用するため、発現ベ
クター上の制御機能はしばしばウイルス材料によって提
供される。例えば、一般に使用されるエンハンサー−プ
ロモーターユニットはシミアンウイルス40（SV40）、ラ
ウス肉腫ウイルス、アデノウイルス２、又はマウス及び
ヒト−サイトメガロウイルスに由来する。特に、マウス
−サイトメガロウイルスの直接初期遺伝子（immediate
early gene）のエンハンサー−プロモーターユニット、
及びヒトα−グロビンプロモーターと組合わされたSV40
のエンハンサーが適当である。さらに、誘導性プロモー
ター、例えば、ヒートショック遺伝子又はメタロチオネ
イン遺伝子由来のプロモーターも有用である。さらに、
目的遺伝子配列に通常関連しているプロモーター又は制
御配列を使用することもできる。複製開始点は、例えば
SV40又は他のウイルス起因（例えばポリオーマウイル
ス、アデノウイルス、VSV,SPV等）の外来開始点を含有
するようにベクターを造成することにより提供され、又
は宿主細胞染色体複製機構により提供される。ベクター
が宿主細胞染色体に組込まれる場合、後者の方法が一層
効果的である。 クローン化されたDNA挿入部を含有するベクターDNAの
宿主からの再単離は常法に従って、特に宿主細胞の溶
解、並びに遠心分離、特にCsCl密度遠心分離及びフェノ
ール／クロロホルムによるDNAの精製により達成され
る。 この発明はまた、式（Ｉ）のポリペプチド又はその断
片、変異体もしくは誘導体をコードするDNA配列を挿入
部として含有するハイブリドベクターに関する。 特に、この発明は、挿入部が、アミノ酸106-127を含
んで成るアミノ酸配列が欠けている式（Ｉ）のポリペプ
チド；あるいは アミノ酸120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,
130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,14
2,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,
155,156,157,158,159又は160のいずれかから始まりそし
てアミノ酸282と321との間のいずれかのアミノ酸で終る
ポリペプチドから成る群から選択される式（Ｉ）のポリ
ペプチドの断片；あるいは、 アミノ酸119からアミノ酸321までのアミノ酸配列から成
る式（Ｉ）のポリペプチドの断片；あるいは、 アミノ酸134からアミノ酸321までのアミノ酸配列から成
る式（Ｉ）のポリペプチドの断片；あるいは、 アミノ酸148からアミノ酸321までのアミノ酸配列から成
る式（Ｉ）のポリペプチドの断片；あるいは、 アミノ酸150からアミノ酸321までのアミノ酸配列から成
る式（Ｉ）のポリペプチドの断片； をコードしていることを特徴とする、式（Ｉ）のポリペ
プチドの断片のをコードしているDNA配列を挿入部とし
て含んで成るハイブリドベクターに関する。 特に、この発明は式（II）もしくは（III）のDNA配列
又はその断片もしくは変異体を含んで成るハイブリドベ
クターに関する。 特定のハイブリドベクターは、pCL2,pCL1,pFK-1,pFK-
2,pPL-BF,pJDB207R/RHO5-BF,pCAL5-R/ND,pCAL8-BF/ND及
びpPL.PTIS-BFである（第１図〜第８図）。 この発明の他のハイブリドベクターは、式（II）の挿
入部の一部分に100％相同である少なくとも15ヌクレオ
チドのDNA配列を含んで成る。 3.宿主の形質転換 強力な発現ベクターに続き、適合性の宿主細胞が、こ
の発明の目的ポリペプチドの発現のために使用される。
一般に、DNA配列のクローニング及びベクターの組立て
のためには原核生物が好ましい。組立てられたベクター
は次に適当な宿主細胞に形質転換され、この場合原核細
胞及び真核細胞を使用することができる。使用すること
ができる微生物種にはE.コリ(E．coli）、バシルス・ズ
ブチリス（Bacillus subtilis）、バシルス・ステアロ
サーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、及
び他のエンテロバクテリアッセー(Enterobacteriacea
e)、例えばサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella
typhimurium)又はセラチア・マルセセン（Serratia
marcesans)、及び色々なシュードモナス（Pseudomonas)
の種が含まれる。特に、E.コリの株、例えばE.コリＢ、
HB101,BZ234,X1776,W3110,JA221及びK12が有用である。
これらの例は言うまでもなく限定的なものではなく例示
的なものである。 原核生物に加えて、真核微生物、例えば酵母を使用す
ることもできる。真核微生物の間ではサッカロミセス・
セレビシエー、又は通常のパン酵母が最も一般的に使用
されるが、他の多くの種も利用可能である。サッカロミ
セスでの発現のため、例えばプラスミドYRp7〔Stinchom
b等（14）;Kingsman等（14a）;Tschemper等（15）〕を
使用することができる。 微生物のほかに、多細胞生物由来の細胞培養物を宿主
として使用することもできる。原理的には脊椎動物又は
無脊椎動物のいずれからの任意の細胞培養物が有効であ
るが、しかしながら脊椎動物の細胞培養物が最も興味深
い。この様な有用なセルラインの例としてVero細胞、He
la細胞、チャイニーズハムスター卵巣（COH）セルライ
ン、Bowesメラノーマセルライン、RPMI8866、及びCos-7
セルラインが挙げられる。 得られたハイブリドベクターDNAの受容体への形質転
換は、例えばManiatis等（１）により記載されているよ
うな、当業界において良く知られている方法により達成
される。細菌はハイブリドベクターDNAにより、例えばC
aCl形質転換法により形質転換される。 ベクターとしてのλファージのDNAとの組合わせにお
けるE.コリ宿主細菌のための他の適当な形質転換法はハ
イブリドベクターDNAのインビトロパッケージング及び
前記細菌の感染である。インビトロパッケージングは主
として入手可能なパッケージングキット（ファルマシ
ァ、スエーデン；ベーリンガー、マンハイム）を用いる
ことにより達成される。感染はManiatis（１）,275頁、
により記載されているMgCl₂法による行われる。 酵母の形質転換は、グルコシダーゼによる酵母細胞壁
の酵素的除去、得られたスフェロプラストのポリエチレ
ングリコール及びCa⁺⁺イオンの存在下でのベクターによ
る処理、並びに寒天へのスフェロプラストの包埋による
細胞壁の再生を含んで成る。好ましくは、再生寒天は再
生及び形質転換された細胞の選択が同時に可能なように
調製される。 組織培養で増殖した脊椎動物細胞の形質転換は当業界
においてよく知られている幾つかの方法の１つを用いて
達成することができる。細胞核へのDNAの直接注入、E.
コリのプロトプラストと他の宿主細胞との融合、又はDN
Aとリン酸カルシウムとの間の同時沈澱物の添加を用い
ることができる。これに続く、形質転換された細胞の選
択は、発現ベクター中に共有結合により組み込まれてい
るか又は別個に添加される選択マーカーを用いて行うこ
とができる。選択マーカーはG418及びハイガロマイシン
のごとき抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子、又は
宿主の遺伝子欠損、例えばチミジンキナーゼ又はヒポキ
サンチンホスホリボシルトランスフェラーゼの欠損を補
完する遺伝子を包含する。 4.形質転換された宿主の選択 ベクターに組み込まれた選択ユニットの性質を担持す
る形質転換された宿主は、形質転換された宿主のみが生
存する適当な選択条件下で細菌を増殖せしめることによ
り未形質転換宿主から選択される。バクテリオファージ
との組合わせにおける他の選択方法は、プレートされた
E.コリ宿主細菌上でのプラーク形成である。 この発明のポリペプチドをコードするDNA配列を挿入
部として含有するハイブリドベクターを担持する宿主の
スクリーニングは、その様なポリペプチドの断片をコー
ドする放射能標識されたオリゴヌクレオチドプローブを
用いることにより、又は前記DNA挿入部のポリペプチド
生成物についてスクリーニングすることにより達成する
ことができる。ハイブリダイゼーションは特に、この発
明のポリペプチドの断片をコードする約12個又はそれよ
り多くの連続するヌクレオチドを含有するmRNA又は任意
のオリゴヌクレオチドプローブを用いて行われる。 特に、この発明のポリペプチドをコードする挿入部を
コードするハイブリドベクターにより形質転換されたE.
コリ宿主の選択は、アガロースプレート上に拡げられた
cDNAライブラリーに由来するレプリカフィルターへのオ
リゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションに
より行うことができる。オリゴヌクレオチドプローブ
は、T4−キナーゼ酵素を用いて³²P‐αATPにより５′−
末端において、又はファージM13にクローン化されたこ
の発明のポリペプチドをコードするcDNAの任意の断片を
用いるKlenowポリメラーゼによるプライム合成により内
部的にラベルすることができる。 スクリーニング目的のための蛋白質生成物はインビト
ロ又はインビボ翻訳、Maniatis等（１）に記載されてい
るように、特にアフリカツメガエル(Xenopus laevis）
の卵母細胞系を用いて得られる。翻訳された蛋白質生成
物はモノクローナル抗体、例えばMab-45,Mab-176及びMa
b-135を用いることにより、あるいは機能的試験系、例
えばSarfati等（17）によるロゼット阻害試験において
行われるようなポリペプチドへのIgEの結合を用いるこ
とにより出検される。 この発明のポリペプチドをコードするDNA配列を担持
する組換ファージは、ハイブリダイゼーションのために
前記ポリペプチドをコードするDNAの断片を含んで成る
放射能標識されたヌクレオチド配列を用いるハイブリダ
イゼーションにより同定される。この方法に代えて、こ
れらはMab-135及びMab-176のごときモノクローナル抗体
を用いる免疫学的スクリーニングにより検出される。 ハイブリドベクターのコード領域又は非コード領域の
変形は例えば1d）において前記した方法により達成され
る。 この発明はさらに、例えば花粉、ネコのフケ、家庭の
ホコリダニ等あるゆる種類の抗原に対してアレルギー性
である患者におけるアレルギー状態の治療又は予防のた
めに、IgE結合活性を有するこの発明のポリペプチドを
使用することに関する。母乳が提供されない特に危険性
の高い新生児を含む、危険期間中の高危険患者の治療が
特に重要であろう。この発明のポリペプチドは経腸的
に、例えば鼻内に、直腸に、又は経口的に、あるいは非
経口的に、例えば筋肉内に、皮下に又は静脈内に、通常
は投与単位形として、例えば錠剤、丸剤、アンプル、バ
イアル又は坐薬として適用される。投与されるべきポリ
ペプチドの量はその比活性、患者の体重及び一般的症
状、疾患の重症度、投与の態様等に依存し、そして医師
の判断に基かなければならない。一般に、体重1kg1日当
り100μｇ〜5000μｇの量が投与される。 この発明はさらに、抗アレルギー的に有効な量のIgE
−結合活性を有するこの発明のポリペプチドを、経口投
与、直腸投与、鼻内投与又は非経口投与、すなわち筋肉
内投与、皮下投与、又は腹腔内投与のために適当な医薬
として許容される常用のキャリャーと共に含んで成る医
薬に関する。 適当な錠剤、カプセル、固体粉末を含有するバイア
ル、又はネブライザー、スプレー、バイアル、アンプ
ル、及び等であって、注入溶液、好ましくは水溶性又は
懸濁液を含有する類似のものが存在し、これらは使用前
に、例えば活性成分をキャリャー、例えばマンニトー
ル、グリコース、アルブミン等と共に含有する凍結乾燥
調製物から調製することができる。医薬製剤は無菌化す
ることができ、そして所望により助剤、例えば防腐剤、
安定剤、乳化剤、溶解剤、緩衝剤、及び／又は浸透圧調
節塩を混合することができる。無菌化は小孔サイズ（0.
45μｍ以下の直径）のフィルターを通して無菌濾過する
ことにより達成することができ、次に所望により凍結乾
燥を行うことができる。無菌性を維持するために抗生物
質を添加することもできる。 この発明の医薬調製物は、単位投与当り１〜2000mgの
医薬として許容される担体、及び単位投与当り好ましく
は２〜50mgの活性成分を含んで成る単位投与剤、例えば
アンプルに調製することができる。 この発明はまた、この発明のポリペプチドを医薬とし
て許容される担体と混合することを特許とする医薬の製
造方法に関する。 この薬剤は、それ自体公知の方法により、例えば常用
の混合、溶解、凍結乾燥等の方法により製造され、そし
て約0.1％〜100％、特に約１％〜50％の活性物質を含有
する。 この発明の新規なポリペプチドの、人体の予防的及び
治療的処置のための使用もこの発明の対象である。 この明細書を通して使用される略号は次の意味を有す
る。 bp 塩基対 BSA ウシ血清アルブミン cDNA 相補的DNA cpm 分当たりカウント（放射能崩壊） dA ２′−デオキシアデノシン dATP ２′−デオキシアデノシントリホスフェート dC ２′−デオキシシチジン dCTP ２′−デオキシシチジントリホスフェート dG ２′−デオキシグアノシン dGTP ２′−デオキシグアノシントリホスフェート dT ２′−デオキシチミジン dTTP ２′−デオキシチミジントリホスフェート DNA デオキシリボ核酸 dNTP dATP,dCTP,dGTP及びdTTPの混合物 ds ２本鎖 DTT 1,4−ジチオスレイトール EDTA エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム FCS ウシ胎児血清 HAT ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン HBSS Hankの平衡塩溶液 HT ヒポキサンチン／アミノプテリン Hepes Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−
２−エタンスルホン酸 IgE 免疫グロブリンＥ mRNA メッセンジャーRNA min 分 PBS リン酸緩衝化生理的塩溶液 Pipes ピペラジン−N,N′−ビス（２−エタンスルホン
酸） PMSF フェニルメチルスルホニルフルオリド RIA ラジオイムノアッセイ RNA リボ核酸 rpm 分当り回転数 SDS ドデシル硫酸ナトリウム ss 単鎖 Tris トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン tRNA トランスファーRNA μg マイクログラム 微生物の寄託 プラスミドpCL-2を含有するエッセリシャ・コリ(Esch
erichia coli）HB101/pCL-2は、1986年７月30日に、D-
3400ゲッチンゲン・グリセバッハストラッセ８のDeutsc
he Sammlung fur Mikroorganismenに受託番号DSM3807と
して寄託された。 次の例は、本発明を例示するものであって、限定する
ものではない。 例 次の緩衝溶液及び培地が使用される： 寒天:2％寒天が補充されたLB−ブイヨン。 溶離緩衝液:10mM Tris-HCl、pH7.5、1mMのEDTA、0.2％S
DS。 LB−ブロス:1％バクト−トリプトン（Difco）、0.5％バ
クト酵母エキス（Difco）、170mMのNaCl;NaOHによりpH
7.5に調製。 細胞溶解溶液:0.5M NaOH、1.5N NaCl。 HBSS:水１中8gのNaCl、400mgのKCl、48mgのNa₂HPO⁴、
350mgのNaHCO₃、60mgのKH₂PO₄、100mgのフェノールレッ
ド。 HBSS-FCS:10％のFCS、0.01％NaN₃、66mM Tris-HCl（pH
7.2）を補充したHBSS。 HT−培地:2−メルカプトエタノール40μｌ、100μＭヒ
ポキサンチン、１μＭチミジンが補充されたRPMI/C−培
地。 HAT−培地:10μＭアミノプテリンが補充されたHT−培
地。 MBS-H:88mM NaCl、1mM KCl、0.33mM Ca(NO₃)₂、0.41mM
CaCl₂、0.82mM MgSO₄、2.4mM NaHCO₃、10mM Hepes（pH
7.4）。 マッコンキー寒天：蒸溜水１当り予備混合されたマッ
コンキー寒天（Becton Dickinson）50g。 卵母細胞溶解緩衝液:20mM Tris-HCl（pH7.5）、50mM Na
Cl、0.5％ Triton×100、0.5％デオキシコール酸ナトリ
ウム、0.1％メチオニン、1mMのPMSF。 PBS:8gのNaCl、0.2gのKCl、1.44gのNa₂HPO₄・２H₂O及び
0.2gのKH₂PO₄を含む１溶液。 RPMI1640−培地:Gibcoから入手。 RPMI1640/C−培地:1％ペニシリン−ストレプトマイシン
（Gibco）、１％Ｌ−グルタミン（Gibco）及び15％（v/
v）FCS（Gibco）が補充されたRPMI1640−培地。 RVT−緩衝液:200mM Tris-HCl（pH8.3,42℃）、20mM MgC
l₂、280mM KCl、20mM DTT。 SOC−培地:2％バクトトリプトン（Gibco）、0.5％酵母
エキス（Gibco）、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgC
l₂、5mM MgSO₄、20mMグルコース。 SSC−緩衝液:15mMクエン酸ナトリウム、150mM NaCl。 TBE−緩衝液:0.8gのTris、5.5gの硼酸、0.5mM EDTA（pH
8.0）4mlを含む１溶液。 TE−緩衝液:10mM Tris-HCl（pH7.5）、1mM EDTA。 TNE−緩衝液:10mM Tris-HCl、1mM EDTA、0.1M NaCl;NaO
HによりpH7.8に調整。 洗浄−緩衝液:10mM Tris-HCl（pH7.5）、1mM EDTA、0.5
NaCl、0.2％SDS。 制限酵素の使用及びDNAの単離 すべての制限酵素は、酵素データシートに基づいて供
給者によって推薦されるような緩衝液条件下で使用され
る。一般的に、３ユニットの酵素が、１μｇのDNAを消
化するために使用される。そのインキュベーションは37
℃で２時間維持される。酵素反応を停止するためには、
EDTA及び酢酸ナトリウムが、それぞれ15mM及び200mMの
最終濃度になるように添加される。DNAを抽出するため
にはクロロホルム：フェノールの1:1混合物（TNTにより
あらかじめ飽和された）１体積を添加し、そしてその混
合物を激しく振盪する。有機相および水性相を、5000×
ｇで５分間（室温で）遠心分離することによって分離す
る。その水性相を新しい管に移し、そしてクロロホルム
１体積により抽出する。遠心分離した後、エタノール2.
5体積を添加することによってそのDNAを沈殿せしめる。
そのサンプルを−20℃で少なくとも２時間インキュベー
トし、そして10000×ｇで10分間遠心分離にかける。そ
のDNAペレットを70％エタノールにより１度洗浄し、真
空乾燥機により10分間乾燥せしめ、そして最後に適当な
体積のTE緩衝液中に溶解する。 次の株が使用される： E.コリ株HB101:F^-,hsdS20（r^- _B,m^-Ｂ）,recA13,ara14,p
roA2,lacY1,galK2,,rspL20（Sm′）,xy1-5,mtl-1,supE4
4,λ⁻．（Boyer及びRouland-Dussoix1969;Bolivar及び
Beckman1979）。 RPMI8866セルライン:RPMI8866細胞（ATCC No.CCL107）
は、IgEのためのリセプターを発現するリンパ芽球様Ｂ
セルラインに由来する。この細胞系をP.Ralph博士（Slo
an-Kettering Research Institute,NY,USA）から得た。 次のプラスミドが使用される： pUC-9:Pharmacia,P−L Biochemicals Upsalla,Swedenか
ら入手できる。このpUC-9プラスミドはPBR322由来のア
ンピシリナーゼ遺伝子及びE.コリのlacZ遺伝子の一部に
連結されたDNA複製の起点から成る。ユニーク制限酵素
認識部位を含むDNA挿入部が、このプラスミドのlacZ領
域に組込まれている。 pUC-KO:このプラスミドはpUC-9の誘導体であり、ここで
lacZ遺伝子のプロモーター／オペレーター領域が前記プ
ロモーター配列のちょうど外側のHae II制限部位とHind
III制限部位との間で、ポリリンカー内で削除されてお
り、pUC-9のプラスミドの他の配列が未変化のまま残っ
ている。 pGEM^TM‐1:Promega Biotec,Madison,USAから入手でき
る。このプラスミドは、特別な転写ベクターである。こ
れは、バクテリオファージのSP6プロモーター含有プラ
スミドpSP 64〔Melton,D.A.,など．（16）〕及びバクテ
リオファージのT7プロモーターを用いて構成される。こ
の得られたプラスミドは、多数のクローニング部位を含
むDNA短片によって分離された、２種の相対するプロモ
ーターSP6及びT7を有する。 pIN-III-ompAプラスミド:Gharayebなど．（13）によっ
て記載されている。これらのプラスミドは、E.コリ中に
おける特別な分泌クローニングベクターである。該遺伝
子生成物のアミノ末端に適切なシグナルペプチドを融合
することによって、細胞膜を通してのクローン化された
遺伝子生成物の分泌を行うことができる。これらのプラ
スミドにおいては、ompA蛋白質、すなわちE.コリの主要
外層膜蛋白質のシグナルペプチドをコードするDNAフラ
グメントが、高レベルの発現ベクター中に挿入されてい
る。外来性DNAフラグメントは、前記ompAシグナルペプ
チドのコード配列のすぐ後のユニークEcoR I,Hind III
又はBamH I部位で３種の読み枠のいづれか１つと整合し
てクローン化され得る。タイプ1,2及び３のpIN-III-omp
A−プラスミドは、翻訳のために異なった読み枠を開始
せしめる。 例1:RPMI8866細胞からのmRNAの単離 15％FCS、100ユニット/mlのペニシリン及び100μg/ml
のストレプトマイシンを補充しRPMI1640培地50mlを有す
る組織培養フラスコ（Falcon,175cm²）中でRPMI8866細
胞を増殖せしめる。50個のコンフルエントなフラスコ
（およそ10⁸個の細胞／フラスコ）からの細胞を遠心分
離により集め、そしてPBS 50mlにより１度洗浄する。そ
の細胞ペレット（5g）を、チオシアン酸グアニジウム10
0g、水100ml、1M Tris-HCl 10.6ml（pH7.5）、0.5M EDT
A 4.2ml、20％ N−ラウリルサルコシン21.2ml及び２−
メルカプトエタノール2.1mlから調製された溶液25ml中
に溶解する。クロロホルム：フェノールの1:1混合物の
２体積を添加する。その混合物を激しく１分間振盪し、
そして次に10℃でSorvall遠心分離機により10分間、500
0×ｇで遠心分離する。水性相を回収し、そして抽出を
さらに４度くり返す。２体積のエタノールをその水性相
に添加する。−20℃で15分間冷却し、続いて４℃でSorv
all SS34ローターにより10分間10,000rpmで遠心分離す
ることによって沈殿物を回収する。このペレットを、TE
緩衝液4ml中に溶解する。加熱乾燥されたCsCl（Merck）
7.5g及び0.1NのHCl50μｌを添加し、そしてその溶液を
7.5mlに調整し、そして12mlの遠心管中5.7M CsClのクッ
ション2ml上に重ねる。その管に水を満たし、そしてTST
41ローター（Kontron）により20℃で16時間、29000rpm
で遠心分離する。運転の最後で、ほとんどの上清液を除
去し、そしてその管を、手早く逆にすることによって排
液する。ガラス状のRNAペレットを、1mlのTE緩衝液及び
0.2％SDS溶液中において37℃で攪拌し、そして時折暖め
る（２分間）ことによって溶解する。そのRNAを、Mania
tisなど（１）（ページ461〜462）によって記載されて
いるようにしてエタノールにより沈殿せしめる。乾燥し
たmRNAを溶離緩衝液1ml中に溶解する。68℃で２分間加
熱し、そして氷上で冷却した後、130μｌの5M NaClを添
加し、そしてこの溶液を、洗浄緩衝液により平衡化され
たオリゴ−dTセルロースの2mlカラム（5mlの注入器タイ
プ７、Ｐ−L Biochemicals中、2mlのベッド体積）に適
用する。サンプルを２回続けて適用した後、そのカラム
を洗浄緩衝液15mlにより洗浄し、そして結合されたmRNA
を溶離緩衝液4mlにより溶出する。溶出された材料を68
℃で２分間加熱し、氷上で冷却し、そして0.44mlの5M N
aClを添加する。この溶液を、再平衡化されたオリゴ−d
Tセルロースカラムに２度適用する。洗浄緩衝液15mlに
より洗浄した後、結合されたmRNAを溶離緩衝液4mlによ
り溶離する。mRNAの回収の程度を、260nmでの吸光度を
測定することによって決定する（OD_260nm＝１は、40μg
/mlの濃度に相当する）。mRNA（150μｇ）をエタノール
により沈殿せしめる。その沈殿物を遠心分離することに
よって集め、水0.4ml中に溶解し、そしてエタノールに
より再沈殿せしめる。mRNAのペレットを空気乾燥し、そ
して0.1％SDSを補充したTE緩衝液150μｌ中に溶解す
る。 例2:IgE−リセプター及びIgE-BF関連のポリペプチドを
コードするmRNAの濃縮 例１からのポリA-mRNA（１μg/μｌ）130μｌを、70
℃で５分間加熱し、氷上で冷却し、そして0.1M NaCl、1
0mM Tris-HCl（pH7.5）、1mM EDTA及び0.5％SDSの溶液
中、５〜20％の直線シュークロースグラジェント12ml上
に負荷する。そのグラジェントを、25℃でTST41ロータ
ーにより５時間、41,000rpmで遠心する。30個の画分
（0.4mlの体積／画分）を集め、そして例３に記載して
いるようにして、キセノプス・レービス(Xenopus laev
is）の卵母細胞中に注入する。 例3:キセノプス・レービスの卵母細胞中でのmRNAのイン
ビボ翻訳 成熟した雄及び雌のキセノプス・レービスを、種々の
動物供給業者、たとえばK.Evans（716 Northside,Ann A
rbor,MI48105）から得ることができる。このカエルを、
通気しないで、18〜22℃で任意の水槽で飼育することが
できる。牛の肝臓及び牛の心臓の断片の定期的な供給
（週二度）により、健康なコロニーが維持されるであろ
う。卵母細胞は、健康で、成熟した雌のキセノプスから
得られるべきである。これは、エチルｍ−アミノ安息香
酸の1:1000（w/v）水溶液中で10〜30分間、カエルに麻
酔をかけることによって容易に成し遂げられる。後部腹
側上での小さな切開（1cm）により、カエルの卵巣に容
易に接近することができる。卵巣の切片を摘出した後、
その切開部分を縫合することができ、そしてそのカエル
を、すぐに水中にもどす。卵巣をすぐに、改変Barth生
理的食塩水（MBS-H）中に置き、そして個々の卵母細胞
を、白金のループにより取り出さなければならない。十
分に成長した大きな卵母細胞に、微細マイクロピペッ
ト、マイクロメーター注射器及び任意の標準の解剖用立
体顕微鏡を用いて注入する。適切な注入用ピペットの構
成は、Gurdon（18）によって記載されている。卵母細胞
を顕微鏡スライド上に置き、ペーパータオルにより吸取
り乾燥し、そして次にそのスライドを顕微鏡の載物台上
に置く。ピペットの挿入の前及び挿入の間、その卵母細
胞を、時計屋が使用する鋭利でないピンセットにより固
定することができる。ピペットが卵母細胞を貫通した
後、例２のmRNA溶液（1mg/ml）の30〜50nlのアリコート
をマイクロメーター注射器を用いて供給する。同じ画分
のmRNAを含む40個の卵のグループを、20℃で45時間、６
％FCSを補充したBarth溶液0.5ml中でインキュベートす
る。そのインキュベーション培地を除き、そして卵母細
胞を卵母細胞分解緩衝液900μｌ中でホモジナイズす
る。そのホモジネートを、Eppendorf遠心分離機により1
0分間遠心分離する。上相を回収し、そして例７に記載
しているようにして、50μｌのアリコートをRIAにより
試験する。 例4:FcεＲに対するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマの調製 BALB/cマウスを、４週ごとに５×10⁷個の生存RPMI886
6細胞の腹腔内注射によって免疫感作する。最後の注射
の２日後に集められた個々のマウスの血清サンプルを抗
−FcεＲ活性について試験する。最も高い力価を示す２
匹の動物からの脾臓細胞をプールし、そして次の日、融
合のために使用する。脾臓を掻き裂き、そして個々の融
合のために、１×10⁸個の洗浄された脾臓細胞を、25×1
0⁶個のNSI/1-Ag4/1マウス骨髄腫細胞（American Type T
issue Culture Collectionから得られた）と共に350×
ｇで５分間ペレット化する。その細胞ペレットを、15％
（v/v）ジメチルスルホキシドを含むRPMI1640培地（Gib
co）28ml中に溶解されたPEG 20gから成るポリエチレン
グリコール溶液（PEG-1540,Baker）2ml中に３秒間、穏
やかに再懸濁する。RRMI/c培地8mlを90秒間にわたって
滴下し、続いて追加の培地5mlを急速に添加する。この
細胞懸濁液を、管に逆転することによって混合し、2.5
分間静置し、そして350×ｇで５分間遠心分離する。そ
のペレットをRPMI/c培地5ml中に再懸濁し、そして50μ
ｌのアリコートを、HAT−培地1mlに１×10⁶個の正常なB
ALB/c脾臓細胞を含む４個のCoster＃3596の24−ウェル
プレートのそれぞれのウェル中に計量分配する。すべて
の培養物を、融合の後５日目から始まって、必要な場合
数日おきにHAT培地の交互の添加又は交換により維持す
る。14日後、HTAをHT培地で交換し、そして28日後RPMI/
cと交換する。個々のウェル（192個の培養物）の上清液
を、融合の後１及び２週間で抗−FcεＲ抗体についてス
クリーンする。目的とする抗体を産生する21個の培養物
を限界希釈法によってクローン化する。すなわちこれら
をRPMI/c中に希釈して10個の生存細胞/mlの濃度にし、
そしてこれらの懸濁液の50μｌアリコートを、HI培地10
0μｌ及び１×10⁵個の正常なBALB/c脾臓細胞を含む、96
−ウェルプレート（Linbro＃76-003-05,Flow Labs）の
ウェル中に添加する。このウェルを顕微鏡により試験
し、増殖性培養物がモノクローナルであることを確認す
る。これらから採取した上清液のサンプルを抗体活性に
ついて試験し、陽性の培養物を選択し、そして大きな培
養容器中で拡張する。必要な特異性を有する抗体を分泌
する14種のモノクローナル細胞系を最終的に得る。３種
のクローン、すなわち207.25.A.4.4/45,208.25A.4.3/13
5及び208.25D.2.1/176を、パリのCollection Nationale
de Cultures de Micro-organismes of Institut Paste
urに寄託し、そしてそれぞれ寄託番号I-452,I-425及びI
-420を得、そして本発明において使用する。これらによ
って産生されたモノクローナル抗体をMab-45,Mab-135及
びMab-176と命名する。 例5:モノクローナル抗体の単離及び精製 Balb/cマウスを、プリスタン（Aldrich）0.5mlにより
腹腔内前処理する。２週間後、例４の５×10⁶個のクロ
ーン化されたハイブリドーマ細胞を腹腔内に注入する。
８〜10日後に腹水を集め、800×ｇで遠心分離し、そし
て−20℃で貯蔵する。解凍された腹水を50,000×ｇで60
分間遠心分離する。表面に浮かぶ脂肪層を注意して除去
し、そして蛋白質濃度を10〜20mg/mlの濃度に調整す
る。粗免疫グロブリンを、０℃での0.9体積の飽和硫酸
アンモニウムの滴下により沈殿せしめ、次に20mM Tris-
HCl/50mM NaCl（pH7.9）中に溶解し、そして同じ緩衝液
に対して透析する。免疫グロブリンＧの画分を、20mM T
ris-HCl/25〜400mM NaCl（pH7.9）の緩衝液グラジェン
トシステムを用いてDEAE-D52セルロース（What-man）ク
ロマトグラフィーによって得る。 例6:¹²⁵Iによりラベルされた抗体Mab-135の調製 Mab-135（例５のPBS溶液）40μｇを、F.C.Greenwood
など．（19）の一般的方法に従って、0.5mCiの¹²⁵Iヨウ
化ナトリウム及びクロラミンＴによりヨウ素化する。ヨ
ウ素化されたMab-135-蛋白質を含む溶液を、１のPBS
−緩衝液に対して４度、それぞれ６時間にわたって透析
する。最終生成物は蛋白質１μｇ当りおよそ２×10⁷cpm
の比活性を有する。¹²⁵Iによりラベルされた抗体Mab-17
6を同じようにして調製する。 例7:細胞上清液及び血清中のIgE-BFの検出のためのラジ
オイムノアッセイ 塩化ビニル製マイクロタイタープレートのウェルを、
５μg/mlの例５のMab-176を含む、0.01M炭酸塩緩衝液
（pH9）150μｌと共に室温で１晩インキュベートする。
次に、そのプレートをPBSにより１度洗浄し、そして10
％ウシ胎児血清（HBSS-FCS）を含むハンクス液200μｌ
と共に室温で２時間反応せしめ、次に再びPBSにより10
度洗浄し、そして室温で８時間、試験サンプル100μｌ
と共にインキュベートする。HBSS-FCSを用いることによ
ってブランクを決定する。プレートをPBSにより10度洗
浄し、そしてウェル当り¹²⁵I‐Mab-135（HBSS-FCS中に
おいて２〜４×10⁵cpm,例６）100μｌと共に室温で一晩
インキュベートし、次にPBSにより10度洗浄し、そして
ガンマカウンターにより計数する。 例8:mRNAから一本鎖cDNAの合成 例７のRIAにより検出された、¹²⁵I‐Mab-135に対して
最っとも高い結合能力を示す例２のmRNA溶液12μｌ（0.
5mg/ml）を、RVT緩衝液25μｌ、dNTP混合物（それぞれ2
0mMのdATP,dTTP及びdGTP）2.5μｌ、1mg/mlのオリゴ‐d
T_12-18（Ｐ−L-BioChemicals）５μｌ、α‐³²P‐dCTP
（10μCi,3000Ci/mモル）１μｌ、RNasin_TM（60ユニッ
ト、Promega Biotec,Madison,USA）３μｌ及び逆転写酵
素（66ユニット、Promega Biotec.）３μｌの溶液に添
加する。放射性dCTPは、その後の合成の段階のすべてに
おいてcDNAの回収率及びその収率の決定を促進するため
にその反応混合物に含まれる。混合物を42℃で1.5時間
インキュベートする。この反応を、0.5M EDTA（pH7.5）
２μｌを添加することによって停止する。25μｌの0.15
M NaOHの添加及び45℃での１時間のインキュベーション
により、mRNAを分解する。この溶液を、1M Tris-HCl（p
H8.0）25μｌ及び1MのHCl 6μｌの添加により中和す
る。２μｌの20％SDSを添加し、そしてその溶液を、フ
ェノール−クロロホルム混合物（TNE緩衝液により平衡
化されたフェノールとクロロホルムとの同体積の混合
物）0.15mlにより抽出する。組み込まれなかったヌクレ
オチド及び分解されたmRNAから新しく合成されたcDNAを
分解するために、水性相をTNE緩衝液により平衡化され
たパストゥールピペット中の2mlのSephadex^R G-50カラ
ムに適用する。それぞれ200μｌの12個の画分を集め、
そしてそれぞれの画分中の放射能をガイガーカウンター
により決定する。放射能を含む、初めの３個の画分をプ
ールする。1.9μｇのManiatisなど、（１）（461〜462
ページ）によって記載しているようにして、一本鎖DNA
を回収し、そしてエタノールにより沈殿せしめる。その
一本鎖DNAを水20μｌ中に溶解する。 例9:二本鎖−cDNAの合成及びS1−消化 得られたss-cDNAを、100mM Hepes（pH6.9）,10mM MgC
l₂,2.5mM DTT,70mM KCl、それぞれ0.5mMずつのdNTP（dA
TP,dCTP,dTTP,dGTP）及び20ユニットのDNAポリマラーゼ
Ｉ大フラグメント、すなわちクレノウ酵素（Boehringer
Mannheim）を含む最終体積100μｌ中において15℃で３
時間インキュベートする。次に、他の20ユニットの前記
同じ酵素を添加し、そしてそのインキュベーションを15
℃で10時間続ける。EDTAの濃度を20mMになるように添加
することによって反応を停止する。Maniatisなど．
（１）（461〜462及び458〜459ページ）によって記載し
ているようにして、この反応混合物をフェノールクロロ
ホルムにより抽出し、そしてエタノールにより沈殿せし
める。その得られた二本鎖DNAを、250mM NaCl,50mM酢酸
ナトリウム（pH4.5）,1mM ZnSO₄,200ユニットのS1ヌク
レアーゼ（Boehringer,Mannheim）を含むインキュベー
ション混合物100μｌ中において30℃で30分間処理す
る。EDTAをその濃度が25mMになるように添加することに
よって反応を停止する。1MのTris-HCl（pH8.0）をその
濃度が100mMになるように添加し、そしてSDSをその濃度
が１％になるように添加した後、この反応混合物をフェ
ノール／クロロホルムにより抽出し、そしてTNE緩衝液
により平衡化されたパストゥールピペット中2ml Sephad
ex G-200カラムを通過せしめる。二本鎖cDNAを含む画分
を、放射能を測定することによって決定し、プールし、
エタノールより沈殿せしめ、そして水15μｌ中に溶解す
る。二本鎖cDNA3.2μｇを得る。 例10:3′−オリゴ（dG）−テイルpUC-KOプラスミド pUC-KOプラスミド20μｇを、50mM Tris-HCl（pH8.
0）,10mM MgCl₂及び50mM NaClの溶液200μｌ中におい
て、50ユニットのPst I（Boehringer,Mannheim）により
切断する。EDTAを20mMまで添加し、そしてその反応混合
物を、等体積のクロロホルム／フェノール（1:1）によ
り抽出する。切断されたプラスミドDNAを、2.5体積のエ
タノールの添加により沈殿せしめ、そして10000×ｇで1
0分間遠心分離することによって回収する。その上清液
を捨て、そしてそのペレットを水50μｌ中に溶解する。
200mMカコジル酸カリウム（pH6.9）,1mM CoCl,2mM DDT,
10μM dGTP及び80ユニットのターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ（Pharmacia P−L Biochem
icals,Upsalla Sweden）を含む溶液150μｌ中に、プロ
ーブを37℃で５分間インキュベートする。反応を停止す
るために、EDTAを10mMまで添加し、そしてこの混合物を
フェノール／クロロホルム（1:1）により１度抽出す
る。DNAをエタノールにより沈殿せしめ、そして10000×
ｇで遠心分離することによって回収する。このDNAペレ
ットをTE緩衝液200μｌ中に溶解し、そして3cmの幅のス
ロットを用いて、TBE緩衝液中水平な0.8％アガロースゲ
ル上に負荷する。1V/cmで16時間にわたり電気泳動した
後、5V/cmで20分間電気溶離することによってDNAを回収
し、そして激しいピペット操作によりバッグから回収す
る。DNAをフェノール−クロロホルムにより抽出し、そ
して例１に記載したようにしてエタノールにより沈殿せ
しめる。遠心分離後、DNAをTE緩衝液中に溶解し、そし
て−20℃で貯蔵する。 例11:IgE−リセプター関連のポリペプチドをコードする
二本鎖cDNAを含むプラスミドの調製及びそれによるE.コ
リHB 101の形質転換 800ngの例９の二本鎖cDNAを、200mMカコジル酸カリウ
ム（pH6.9）,1mM CoCl₂,2mM DTT,100ピコモルの³H‐dCT
P及び12ユニットのターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼ（Ｐ−L Biochemicals）を含む溶液
40μｌ中で37℃で５分間インキュベートする。その反応
を停止するために、EDTAを10mMまで添加する。この混合
物をフェノール／クロロホルムにより抽出し、そしてDN
Aをエタノールにより沈殿せしめる。dC−テイル二本鎖c
DNAを水に溶解し、そして−20℃で貯蔵する。TNE緩衝液
200μｌ中、50ngのdC−テイル二本鎖cDNAと150ngの例10
のdG−テイルpUC-KOとの混合物を、65℃で５分間、55℃
で60分間インキュベートし、そして次に水浴中で３〜５
時間にわたって30℃にゆっくりと冷却する。このアニー
リング混合物の２μｌのアリコートを、200μｌのコン
ピテントE.コリHB 101〔Maniatisなど．（１）（250ペ
ージ）によって記載しているように塩化カルシウムによ
る処理により形質転換のために調製された〕に添加す
る。この混合物を氷上に30分間維持し、そして２分間加
熱して42℃にし、次にSOC−培地1mlにより希釈し、そし
て37℃で１時間インキュベートする。10本の管の内容物
をプールし、そして細胞を2000×ｇで５分間遠心分離す
ることによって集める。おのおのの細胞ペレットを、SO
C−培地1ml中に再懸濁し、そしてLB−培地及び50μg/ml
のアンピシリンを含む10cmの寒天プレート上に広げる。
アンピシリン耐性によって特徴づけられた約5000個の形
質転換されたコロニーを得る。 例12:ハイブリド選択翻訳法によるヒトIgE−リセプター
及びIgE−結合因子関連のポリペプチドをコードする二
本鎖cDNAを含むクローンの同定 例11の個々のコロニーを、100μg/mlのアンピシリン
を含むLB−ブイヨン2ml中で増殖せしめて飽和状態にす
る。96個の培養物をプールし、そしてプラスミドDNAを
アルカリ細胞溶解法〔Maniatis,T.など．（１）（90ペ
ージ）〕を用いて単離する。100μｇのアルカリ変性さ
れたプラスミドDNAを、Seedの方法（20）によって調製
された活性化ATP−セルロース50mgに共有結合せしめ
る。 RPMI8866細胞（例１）からのポリA-mRNA（60μｇ）
を、15mM Pipes（pH6.4）、1.5mM EDTA、600mM NaCl、
及び0.2％SDS、50％ホルムアミドの溶液300μｌ中に溶
解し、そしてゆるやかに攪拌しながら37℃で16時間、セ
ルロースに結合したプラスミド−DNAにハイブリダイズ
せしめる。このセルロースを、50％ホルムアミド、45mM
NaCl、4.5mMクエン酸ナトリウム、20mMプペス（pH6.
4）及び1mM EDTAを含む溶液により10度洗浄する。90％
ホルムアミド、0.2％SDS、10mMピペス（pH6.4）、5mM E
DTA、20μg/mlのウシ肝臓tRNAを含む溶液100μｌ中にお
いて65℃で２分間、２度インキュベートすることによっ
て、ハイブリダイズされたmRNAを前記セルロースから溶
出する。溶出されたmRNAを２回エタノール沈澱せしめ
る。おのおののプールから得られた沈殿したポリA-mRNA
を水６μｌに溶解し、そしてキセノプス・レービスの卵
母細胞中への注入のために使用し、そして例３に記載し
たようにして分析する。翻訳された蛋白質を、例７に記
載したようにしてRIAによりスクリーニングする。それ
ぞれ96個のコロニーを有する10個のプールのうち１つが
陽性である。これらの96個のコロニーを、８個のコロニ
ーの12個の新しいプールに一緒にし、そして同じ方法で
スクリーニングする。カエルの卵母細胞におけるmRNAの
翻訳の後、その蛋白質がRIAにより陽性のシグナルを与
える、１つのコロニーを最終的に同定する。そのクロー
ンを、100μg/mlのアンピシリンを含むLB−ブイヨン中
で拡張する。プラスミドDNAをこのコロニーから単離す
る。１μｇのプラスミドDNAを制限酵素Pst Iにより消化
し（該酵素は、DNAベクターとds-cDNA挿入体との間の両
境界で切断する）、そしてcDNA挿入部の配列をSangerな
ど（21）のジデオキシチェインターミネーター配列決定
法を用いて端から端まで決定する。この配列決定は、配
列決定キット（Amersham,N4501及びN4502）に含まれる
試薬を用いて、Amershamハンドブックの“M13クローニ
ング及び配列決定”に詳しく記載されているようにして
行なわれる。二本鎖cDNA挿入部は417bpの長さであり、
そしてその配列は、式（II）中塩基対第878〜塩基対第1
295により示される。IgE−リセプター及びIgE結合因子
のＣ末端部分をコードするこの二本鎖DNAは、ヒトIgE−
リセプター又はIgE結合因子に関連するポリペプチドの
ためのすべてのコード情報を含むより長いcDNAクローン
をハイブリダイゼーションによりスクリーニングするた
めのDNAプローブとして使用される。 例13:ヒトIgE−リセプターのための完全なコード配列を
含むcDNAのクローニング ポリA-mRNAを、例１に記載しているようにしてRPMI88
66細胞から単離する。cDNA合成の第一段階は例２〜８に
従って行なわれる。次に、十分な長さの二本鎖DNAを濃
縮するためにその方法を変える。一本鎖cDNAを水32μｌ
中に溶解する。一本鎖cDNA（2.8μｇ）32μｌ、1Mカコ
ジル酸カリウム（pH7.0）10μｌ、10mM CoCl₂ 5μｌ、1
mM DTT 5μｌ及びｎモルのdCTP1を含む反応混合物中に
おいて、一本鎖cDNAをオリゴ−dC末端により延長する。
37℃で５分間予備インキュベーションした後、３μｌの
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
（81ユニット、Ｐ−L Bioch-emicals）を添加し、そし
てさらに10分間インキュベーションを行なう。TNE緩衝
液50μｌを添加し、そして一本鎖cDNAをクロロホルム／
フェノールにより抽出し、そしてエタノールにより沈殿
せしめる。このペレットを70％エタノールにより洗浄
し、空気乾燥し、そして水15μｌ、RVT緩衝液25μｌ、d
NTP混合物（それぞれ20mMのdATP,dTTP及びdGTP）2.5μ
ｌ及び0.2mg/mlのオリゴdG_12-18（Ｐ−L Biochemical
s）５μｌを含む溶液中に溶解する。３μｌの逆転写酵
素（66ユニット、Promega Biotec）を添加し、そしてそ
の混合物を42℃で90分間インキュベートする。この反応
を0.5M EDTA（pH7.5）２μｌ及びTNE緩衝液50μｌの添
加によって停止し、そしてこの混合物をフェノール−ク
ロロホルム（1:1）0.15mlにより抽出する。その水性相
をSephadex^R G50カラム（TNE緩衝液中2.5ml）上に適用
し、そして1.1μｇの二本鎖cDNAを含む漏出画分（0.4m
l）を集める。この二本鎖cDNAをエタノールにより沈殿
せしめる。その得られたペレットを水32μｌ中に取り、
そしてこの二本鎖cDNAを、例11に記載しているようにし
て、放射性ラベルされたオリゴ−dCテイルにより延長す
る。0.5MのEDTA（pH7.5）１μｌの添加によりこの反応
を停止し、そしてそのサンプルを0.5cmの幅のスロット
を用いてTBE緩衝液中水平の１％アガロースゲル上に負
荷する。平行スロットにおいて、バクテリオファージλ
DNA（EcoR I及びHind IIIにより消化された）１μｇを
サイズマーカーとして役立てるために負荷する。2.5V/c
mで２時間電気泳動にかけた後、二本鎖DNAを染色するた
めに、0.5μg/mlのエチジウムブロミドを含むTBE緩衝液
中にゲルを浸漬する。1.4〜２キロ塩基のおよそのサイ
ズの二本鎖cDNAを含む領域を切断し、そして水中に予備
浸漬された２つのミクロ−コロジウムバック（Sartoriu
s）に入れる。水0.3mlを添加し、そしてそれらのバック
を、半分の濃度のTBE緩衝液を含む水平電気泳動装置（B
io-Rad）に入れる。5V/cmで20分間電気溶離し、そして
激しくピペット操作することによって二本鎖cDNAをバッ
クから回収する。二本鎖cDNAをフェノール−クロロホル
ムにより抽出し、そしてエタノールにより沈殿せしめ
る。遠心分離の後、この二本鎖cDNAをTNE緩衝液100μｌ
中に溶解する。100ngの二本鎖cDNAを回収する。（放射
能の収量から決定された）。 例14:ポリ（dC）テイルを有する二本鎖cDNAに対するポ
リ（dG）テイルを有するdG−テイルUC-KOのアニーリン
グ及び得られたプラスミドによるE.コリの形質転換 40μｌの二本鎖cDNA（例13のサイズ分別された材料40
ng）を、例10からの16μｌ（200ng）のオリゴ−dG_10-20
テイルpUC-KOプラスミドDNA及びTNE緩衝液194μｌと混
合し、そして次に、65℃で10分間、46℃で１時間及び室
温で１時間インキュベートする。このアニールされたDN
Aを用いて、コンピテントE.コリHB101細胞（LM1035株）
（例11に記載しているようにして形質転換のために調製
された）を形質転換する。このアニーリング混合物の２
μｌのアリコートをコンピテント細胞200μｌを含む２
本の管に添加する。この管を氷上に30分間維持する。42
℃での90秒のヒートショック及び氷による２分間の冷却
の後、SOC培地0.8mlをそれぞれの管に添加し、そして次
に37℃で60分間インキュベートする。インキュベートの
後、10本の管の内容物をプールする。2000gで５分間遠
心分離することによって細胞を集め、そて100μg/mlの
アンピシリンを含むマッコンキー寒天プレート（直径15
cm）上に置く。このプレートを37℃で一晩インキュベー
トする。およそ1000個のアンピシリン耐性コロニーを各
プレートから得る。これらをナイロン膜（Pall-Biodyn
e,Glen Cove,New York-USA）上に拾い上げ、そしてその
膜を、コロニーが上向きになるようにマッコンキー寒天
プレート上に押しつける。37℃で５時間のインキュベー
ションの後、２個のレプリカをナイロン膜上で作る。そ
のマスター膜を寒天プレート上で４℃で貯蔵する。0.5M
NaOH、1.5M NaClにより飽和された3MM紙（Whatman Lt
d.,Maidstone,USA）上に５分間、及び0.5M Tris-HCl（p
H8.0）、1.5M NaClにより飽和された3MM紙上に10分間そ
れらのレプリカを次々と置くことによって、これらのレ
プリカをコロニーハイブリダイゼーションのために処理
する。各インキュベーションの中間で、フィルターを乾
燥Whatman 3MMフィルター上で吸い取る。このレプリカ
フィルターを真空オーブンにより80℃で２時間加熱し、
そしてすぐにDNAハイブリダイゼーションのために使用
する。 例15:フィルターのハイブリダイゼーション 例12の陽性クローンから得られたIgE−リセプターの
一部をコードするプラスミド10μｇからのcDNA挿入部
を、Pst I制限エンドヌクレアーゼによる消化によって
調製する。このcDNA挿入部（450bp）を、TBE緩衝液中1.
5％アガロースゲルを通して電気泳動することによってp
UC-KOベクターDNA（2900bp）から分離し、そして電気溶
出することによって回収し、そして例13に記載している
ようにしてエタノールにより沈殿せしめる。純粋なcDNA
挿入部（200ng）、供給者によって与えられた説明書に
従って、Amersham（N.5000）からのニックトランスレー
ション系を用いて放射性にする。この放射性ラベルされ
たcDNAプローブは５×10⁸dpm/μｇの比活性を有する。
この放射性ラベルされたcDNAを、95℃で10分間インキュ
ベートすることによって変性し、そしてすぐに氷上で冷
却する。例14のレプリカフィルターを、0.9M NaCl、0.1
8M Tris-HCl（pH8.0）、6mM EDTA、0.02％Fical 1400、
0.02％ポリビニルピロリドン、0.02％BSA、0.2％SDS及
び50μg/mlの変性されたウシ胸腺DNAを含む溶液100ml中
で２時間、密封されたプラスチックバックの中でプレハ
イブリダイズする。上記からの熱変性された放射性ラベ
ルされたcDNA挿入部を補充された同じ溶液5mlを含む密
封されたプラスチックバック中で、ハイブリダイゼーシ
ョンを一晩行なう。ハイブリダイゼーションの後、その
フィルターを、２×SSC/0.2％SDSにより洗浄し、続いて
65℃で0.2×SSC/0.2％SDS 200mlにより３度洗浄する。
このフィルターを乾燥し、そしてコダックＸ−線フィル
ム（XAR-5）に一晩暴露する。このフィルターに放射性
インクにより印を付け、そのフィルターとオートラジオ
グラムとの整合を可能にする。２個の陽性クローンが見
つけられ、そしてこのDNAは、IgE−リセプターをコード
する放射性ラベルされたDNAフラグメントにハイブリダ
イズする。これらをpCL-1及びpCL-2と命名する。 例16:pCL1-DNA及びpCL2-DNAの単離及び分析 pCL1クローン及びpCL2クローンを増殖せしめ、そして
それらのプラスミドDNAをアルカリ細胞溶解法〔Maniati
s,T.,など（１）（90ページ）〕を用いて単離する。こ
れらのDNAをPst Iにより消化する。この酵素はベクター
DNAとDNA挿入部との間の境界でcDNAを切る。このフラグ
メントを電気泳動により分離し、そして完全なcDNA挿入
部を例13に記載しているようにして電気溶出により単離
する。これらの２個のプラスミドのcDNA挿入部を、Amer
shamのハンドブックに詳しく記載されているSangerなど
（21）の方法を用いて完全に配列決定する。この制限酵
素処理及び配列分析の要約は第２図及び式IIに示され
る。 例17:転写のために適切なプラスミド中へのIgE−リセプ
ター関連のcDNAの移行 10μｇのpCL-2プラスミドDNAを制限酵素Pst I及びHin
c II（Boehringer Mannheim）により消化する。1.5kbの
cDNA挿入部及び2.9kbのプラスミドベクターDNAを、3cm
の幅のスロットを用いて、TBE緩衝液中１％アガロース
ゲル上で分離する。1V/cmで16時間の電気泳動の後、例1
3に記載しているようにして電気溶出によりDNAを回収す
る。平行して、10μｇのプラスミドpGEM^TM‐１をPst I
及びHinc IIにより消化し、フェノール／クロロホルム
により１度抽出し、そしてエタノールにより沈殿せしめ
る。1.5kbのcDNA挿入部10ng及びPst Iにより切断された
pGEM^TM‐１の10ngを、15℃で４時間、10μｌの容積中で
連結する。この反応混合物はさらに、10mM Tris-HCl（p
H7.5）、10mM MgCl₂、2mM DTT、0.1mM ATP及び100ユニ
ットのT₄リガーゼ（Boehringer Mannheim）を含む。こ
の混合物５μｌを用いて、Maniatisなど（１）（250ペ
ージ）によって記載しているようにしてコンピテントE.
コリHB101（LM1035株）を形質転換する。約100個のアン
ピシリン耐性コロニーを得る。24個のコロニーを増殖せ
しめ、そしてその培養物からプラスミドDNAを単離す
る。おのおのの培養物からのプラスミドDNA約１μｇをH
ind IIIにより消化し、そしてこの消化されたDNAフラグ
メントの長さを、Hind IIIにより消化されたλDNA（Pha
rmacia,Sweden）をサイズマーカーとして用いて、１％
アガロースゲル上で分析する。いくつかのコロニーの消
化されたプラスミドDNAは、1.0kb及び3.3kbの長さを有
するDNAフラグメントを与える。これらのプラスミドをp
GEM^TM‐1/CL2と命名する（第３図を参照のこと）。これ
らは、pGEM^TM‐１ベクターDNA上のT₇ポリマラーゼプロ
モーターの近くにIgE−リセプターのアミノ末端を含
む。 例18:IgE−リセプター関連のcDNAの転写 10μｇの例17のプラスミドpGEM^TM‐1/CL2を制限酵素R
sa I（Boehringer,Mannheim）により消化する。５μｌ
の0.5M EDTAを添加し、そしてこの混合物をフェノール
／クロロホルム（1:1,V:V）により１度そしてクロロホ
ルムにより１度抽出する。DNAをエタノールによる沈殿
によって濃縮し、そしてTE緩衝液20μｌ中に溶解する。
このDNA溶液４μｌを40mM Tris-HCl（pH7.5）、6mM MgC
l₂、2mMスペルミジン、1mM NaCl、10mM DTT、１ユニッ
ト／μｌのRNasin、0.5mM dNTP及び20ユニットのRibopr
obe T₇RNAポリメラーゼ（Promega Biotec）を含む溶液1
00μｌに添加する。この混合物を37℃で１時間インキュ
ベートする。RNA合成反応に続いて、２ユニットのRQI T
M DNAse（Promega Biotec）を添加し、そしてそのイン
キュベーションを37℃で１時間続ける。この混合物をフ
ェノール／クロロホルムにより１度、そしてクロロホル
ムにより１度抽出し、そして新しく合成されたRNAを、
エタノールによる沈殿により回収する。このRNAペレッ
トを、70％エタノールにより洗浄し、そして最終的に水
20μｌに溶解する。 例19:カエルの卵母細胞におけるプラスミド由来のIgE−
リセプターmRNAの翻訳及びIgE−リセプター蛋白質の検
出 例18において得られたmRNAを、例３において記載して
いるようにして、カエルの卵母細胞中への注入のために
直接使用する。IgE−リセプター蛋白質の合成を、例７
に記載したようにしてRIAにより試験する。例１からの
ポリA-mRNAを対照サンプルとして使用する。その結果
を、次の表に挙げる。 例20:IgE−結合因子活性を有するポリペプチドのE.コリ
における発現のためのプラスミドpFK-1及びpFK-2の組立
て この例においては、IgE結合因子に関連するポリペプ
チドのE.コリにおける産生及び分泌を可能にするプラス
ミドを造成し、この場合、膜係留部を含む位置Met₁から
Ala₁₁₈又はGlu₁₃₃までのアミノ末端領域を除去する。10
μｇのpCL-2プラスミドDNAを制限酵素Hinc II及びRsa I
により消化する。1.6,1.25,0.72,0.46及び0.23kbのフラ
グメントを得、そしてTBE緩衝液中１％アガロースゲル
による電気泳動により分離する。1.25kbのDNAフラグメ
ントを例13に記載したようにして回収する。同時に、10
μｇのプラスミドpGEM^TM‐１を10mM Tris-HCl（pH7.
6）、50mM NaCl、10mM MgCl₂及び5mM DTTの溶液50μｌ
中で20ユニットのHinc II（Boehringer）により線状化
する。37℃で２時間のインキュベーションの後、この反
応混合物に1M Tris-HCl（pH8.5）50μｌ、水10μｌ及び
20ユニットのウシ腸アルカリホスファターゼ（Boehring
er）を補充し、そして37℃で30分間インキュベーション
をさらに続ける。その混合物をフェノール−クロロホル
ムにより３度抽出し、そして次にTBE緩衝液中１％アガ
ロースゲルにより電気泳動にかける。このプラスミドDN
Aを、例13に記載しているようにして電気溶出により前
記ゲルから回収する。1.25kbのcDNAフラグメント10ng及
びHinc IIにより切断されたpGEM_TM‐１（10ng）を、15
℃で10時間、10μｌの容積において連結する。この反応
混合物は、さらに10mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgC
l₂、2mM DTT、0.5mMATP及び100ユニットのT₄−リガーゼ
（Boehringer）を含む。その混合物５μｌを用いて、Ma
niatisなど（１）（250ページ）によって記載されてい
るようにしてコンピテントE.コリHB101細胞を形質転換
する。細菌を100μg/mlのアンピシリンを補充し寒天プ
レート上に置く。約50個のアンピシリン耐性コロニーを
得る。24個のコロニーを増殖せしめ、そしておのおのの
培養物からプラスミドDNAを単離する。おのおのの培養
物からのプラスミドDNA約１μｇをHind IIIにより消化
し、そしてこの消化されたDNAフラグメントの長さを、
サイズマーカーとしてHind IIIにより消化されたλDNA
（Pharmacia,Sweden）を用いて、％アガロースゲル上で
分析する。いくつかのコロニーの消化されたプラスミド
DNAは、フラグメントの挿入の２つの可能性ある方向に
対応して、0.5kb及び3.6kbの長さのDNAフラグメントを
もたらし、そして他のいくつかは0.7kb及び3.4kbの長さ
のフラグメントをもたらす。これらのプラスミドを、そ
れぞれpCAL-3及びpCAL-4と命名する。（第４図）。１つ
のpCAL-3クローン及び１つのpCAL-4クローンを増殖せし
め、そしてこれらのプラスミドDNAをManiatisなど
（１）（90ページ）によって記載されているようにして
アルカリ細胞溶解法を用いて単離する。10μｇのpCAL-4
プラスミドDNAをHind IIIにより消化し、そして10μｇ
のpCAL-3プラスミドDNAをBgl II及びBamH I制限酵素に
より消化する。そのフラグメントを電気泳動により分離
し、そしてBgl II-BamH Iの0.8kbフラグメント及びHind
III-Hind IIIの0.75kbのフラグメントを、例13に記載
しているようにして電気溶出することによって回収す
る。同時に、10μｇのpIN-III-ompA-2プラスミドDNA〔G
harayebなど（５）〕及び10μｇのpIN-III-ompA-3プラ
スミドDNAをそれぞれHind III及びBamH Iにより消化す
る。これらの２種のプラスミドは、E.コリにおける良く
知られた分泌クローニングベクターであり、OmpA蛋白質
のシグナルペプチドをコードする配列に２つのリーディ
ングフレームで融合される外来性DNAフラグメントのク
ローニングを可能にする。次に、線状化されたプラスミ
ドをウシの腸からのアルカリホスファターゼにより処理
し、そしてその線状DNAを、上記のようにして0.8％アガ
ロースゲル上で精製する。Hind IIIにより切断されたpI
N-III-ompA-2（10ng）及び0.8kbのHind III-Hind IIIフ
ラグメント（10ng）（混合物１）、並びに0.75kbのBgl
II-BamH Iフラグメント（10ng）及びBamH Iにより切断
されたpIN-III-ompA-3（10ng）（混合物２）を含む２種
の連結混合物を、20μｌの体積で調製する。これらの反
応混合物はさらに、10mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgC
l₂、2mM DTT、0.1mM ATP及び100ユニットのT₄リガーゼ
（Boehringer Mannheim）を含む。15℃で12時間のイン
キュベーションの後、この混合物５μｌを用いてManiat
isなど（１）（250ページ）によって記載されているよ
うにしてコンピテントE.コリHB101細胞を形質転換す
る。混合物１及び２から50〜100個のアンピシリン耐性
コロニーを得る。それぞれの混合物からの12個のコロニ
ーを増殖せしめ、そしてそのプラスミドDNAを培養物か
ら単離する。それぞれの培養物からのプラスミドDNA約
１μｇを、Pst I及びEcoR I（混合物１）及びBamH I及
びEcoR I（混合物２）により消化する。そのDNAフラグ
メントの長さを、サイズマーカーとしてHind IIIにより
消化されたλDNA（Pharmacia,Sweden）を用いて１％ア
ガロースゲル上で分析する。混合物１に由来されるいく
つかのプラスミドは0.75kbのフラグメントを産生する。
これらのプラスミドをpFK-2と命名する。これらは、Omp
Aシグナル配列に融合されたIgE−リセプターのアミノ酸
Ala₁₃₄〜Ser₃₂₁をコードするDNAを含む。同様に、混合
物２に由来するいくつかのプラスミドは、0.8kbのフラ
グメントを産生する。これらのプラスミドをpFK-1と命
名する。これらは、OmpAシグナル配列に融合されたアミ
ノ酸Asp₁₁₉〜Ser₃₂₁をコードするDNAを含む。 例21:プラスミドpFK-1及びpFK-2を担持するE.コリ株に
おけるIgE-結合因子関連のポリペプチドの検出 プラスミドpFK-1、pFK-2、及び対照としてのプラスミ
ドpIN-III-ompA-2（10ng）を用いて、コンピテントE.コ
リBZ234細胞及びE.コリB1472細胞をトランスフェクトす
る。コンピテント細胞を、Maniatisなど（１）（250ペ
ージ）によって記載されているようにして調製し、そし
てトランスフェクトする。それぞれのトランスフェクシ
ョンから100個以上のアンピシリン耐性コロニーを得
る。１つのコロニーを100μg/mlのアンピシリンを補充
したLB−ブイヨン2ml中に移し、そして37℃で一晩増殖
せしめる。この培養物1mlを100μg/mlのアンピシリンを
補充したLB−ブイヨン100ml中に移す。この細胞を37℃
で激しく振盪（250rpm）しながら増殖せしめる。4,7,10
及び24時間後、10mlのアリコートを取り出す。これらの
アリコートをすぐに処理する。室温で10分間1000×ｇで
遠心分離にかけることによって細胞を集める。その上清
液を捨て、そして細胞を0.1MのTris-HCl（pH8.0）中20
％シュークロース2.5ml中に懸濁する。この混合物を室
温で20分間放置し、そして細胞を遠心分離にかけること
によって再び集める。その上清液を捨て、そして細胞を
氷により冷却された水1.5ml中に懸濁する。この混合物
を20分間氷上でインキュベートし、そして４℃で10分
間、12000×ｇで遠心分離する。この上清液５μｌをHBS
S-FCS 100μｌに添加し、そしてこれらのサンプルを例
７に記載したRIAにより分析する。pIN-III-ompA-2を対
照として使用する。次の結果を得る。 値は、例７に記載したRIAにおいて、ウェル当り測定さ
れたcpmとして与える。ウェル当りの放射能のインプッ
トは325,000cpmである。 例22:IgE結合因子蛋白質の精製のためのイムノアフィニ
ティゲルの調製 Aff-Gel^R 10材料（Bio-Rad）を、製造業者によって指
示されているようにして、冷蒸留水及びカップリング緩
衝液（pH8.0）（0.1M NaHCO₃溶液）により洗浄する。カ
ップリング緩衝液2ml中50％の濃度のゲル懸濁液をプラ
スチック管に入れ、そして10mgのMab-135又はMab-176を
含む同じ体積の溶液と混合し、そしてこの混合物を室温
で４時間、回転混合せしめる。このゲルをカップリング
緩衝液により再び洗浄する。なお遊離している活性部位
をブロックするため、このゲルを1Mエタノールアミン−
HCl（pH8.0）0.1mlにより室温で２時間処理し、次に10m
Mアジ化ナトリウムを含むPBSにより洗浄し、そして４℃
でその中に保持する。 例23:形質転換された細胞による発酵及び細菌培養から
のIgE結合因子蛋白質の単離 例20からのプラスミドpFK-1を含むE.コリBZ234の１つ
のコロニーを、アンピシリン（100μg/ml）を補充したL
B−ブイヨン培地10ml中に移し、そして激しく振盪しな
がら一晩、37℃で増殖せしめる。この培養物の1mlのア
リコートを、６個のフラスコ〔おのおののフラスコは、
アンピシリン（100μg/ml）を補充したLB−ブイヨン800
mlを含む〕に移す。細胞を37℃で８時間激しく振盪（25
0rpm）しながら増殖せしめ、そして室温で10分間1000×
ｇで遠心分離することによって集める。その上清液を捨
て、そして20％シュークロース、30mM Tris-HCl（pH8.
0）及び1mM EDTAを含む溶液300ml中に細胞を懸濁する。
この懸濁液を室温で20分間放置し、そして遠心分離する
ことによって細胞を再び集める。上清液を捨て、そして
細胞を氷により冷却された水200ml中に懸濁する。この
懸濁液を氷上で20分間インキュベートし、そして４℃で
15分間10000×ｇでSorvall遠心機のローターにより遠心
分離する。この上清液（約180ml）を注意して回収し、
アジ化ナトリウム（0.1mg/ml）を補充し、そしてNalgen
e 殺菌フィルターユニット（0.2ミクロン;Nalge Compa
ny,Rochester,N.Y.,USA）を通して濾過する。濾過され
た溶液を、例22に記載のようにして得られたMab-135又
はMab-176結合Affi-Gel^R 10の2mlカラム上に流速50ml/
時で負荷する。ゲルを、0.5％ NaCl及び0.05％Tween
20を補充した20体積のPBS、５体積のPBS及び５体積の0.
9％ NaClにより次々と洗浄する。洗浄溶液の蛋白質内容
物を、280nmでの吸光度を測定することによってスクリ
ーニングして非結合蛋白質の完全な除去を確保する。次
にカラムを、0.1Mグリシン−HCl、0.1M NaCl（pH2.6）
をそれぞれ含む１体積の溶液のアリコートにより溶出す
る。蛋白質を含む画分をプールし、そして1M Trisによ
り中和する。 本発明の精製されたポリペプチドの濃縮溶液を、ISCO
電気泳動濃縮機モデル1750（Isco Inc.）及び3.5KDカッ
ト−オフのSpectrapor 膜（Spectrum Medical Industr
ies）による処理によって得る。その溶液を25mMの酢酸
アンモニウム（pH8.3）に対して透析し、そしてそれに
よって0.2mlの体積に濃縮する。 精製された蛋白質を次の方法により分析する。画分を
Laemmli緩衝液と共にインキュベートし、次に12％ SDS-
PAGEにより個々の蛋白質に分離し、そしてBioRadマニュ
アルに記載のようにして銀染色する。およそ25KDの分子
量を有する蛋白質が検出される。それらを、トランスフ
ァー緩衝液を用いて0.12アンペアで４時間電気泳動する
ことによりニトロセルロース膜に移す。この膜を、10％
FCSを含むTris緩衝化塩溶液によりブロックする。スト
リップを切り出し、そしてそれぞれMab-135及びMab-176
（それぞれ10μg/ml）と反応せしめる。６時間のインキ
ュベーションの後、これらのストリップを洗浄し、そし
てホースラジィシュペルオキシダーゼヤギ抗−マウスIg
Eと一晩反応せしめる。このストリップを洗浄し、そし
てBioRadの指針マニュアルに記載しているようにして４
−クロロ−１−ナフトール（ペルオキジダーゼ基質）に
より発色せしめる。Mab-135及びMab-176モノクローナル
抗体のそれぞれは25KDの蛋白質フラグメントと反応せし
める。 例24:ファージλのプロモーターP_Lの制御下でのIgE結合
因子活性を有するポリペプチドのE.コリ中での発現 24.1 発現プラスミドの造成： プラスミドpHRi148（ヨーロッパ特許出願EP146785）
を中間ベクターとして使用する。10μｇのpHRi148プラ
スミドDNAをNco Iにより消化し、次に末端を平滑端にす
るためにクレノウポリマラーゼ及びdNTP（50μＭ）によ
り処理する。このDNAをBamH Iによりさらに消化し、そ
してアルカリホスファターゼにより処理する。4.3kbの
ベクターDNAをアガロースゲル電気泳動により単離す
る。同時に、pCAL3プラスミドDNA（例20）10μｇをBgl
IIにより切断し、次にクレノウポリマラーゼ及びdNTP
（50μＭ）により処理する。このDNAをBamH Iによりさ
らに切断し、そして0.78kbの挿入部DNAフラグメントを
アガロースゲル電気泳動により単離する。精製されたベ
クター10ng及び精製された3ngの挿入部DNAを連結し、そ
してその混合物を用いてコンピテントE.コリHB101細胞
を形質転換する。正しい組換えプラスミドを有するクロ
ーンを制限酵素分析に基づいて選択する（第５図）。 正しいプラスミドの10μｇのDNAをBamH I及びEcoR I
により消化する。0.79kbの挿入部DNAをアガロースゲル
電気泳動により単離する。同時に、10μｇのpPLc24プラ
スミドDNA〔Remaut,E.など．（1981）、Gene 15、81〜
93〕をEcoR I及びBamH Iにより消化し、次にアルカリホ
スファターゼにより処理し、そして2.9kbのベクターDNA
をアガロースゲル電気泳動により精製する。10ngの2.9k
bのベクターDNA及び3ngの0.79kbの挿入部DNAを連結し、
そして次にこれを用いてコンピテントE.コリK12細胞を
形質転換する。標準的な制限分析を行ない、正しいプラ
スミド（pPL-BF;第５図）を選択する。このプラスミド
は、熱誘導性P_Lプロモーターの下流に式（Ｉ）のポリペ
プチドのアミノ酸119〜321をコードする式（II）のDNA
配列を担持する。中間のクローニング段階の間にプラス
ミドpHRi148に付加されたメチオニンがアミノ酸119の前
に存在する。 プラスミドpPL-BFを用いて、E.コリ株W3110及びHB101
〔両者はλcI857（Remautなど.,loc.cit.）を含む〕を
形質転換する。この形質転換体を、40μg/mlのカナマイ
シン及びアンピシリンを含むLB−プレート上に移し、そ
して30℃で24時間インキュベートすることによって増殖
せしめる。得られた組換え体コロニーを発酵のために使
用する。 24.2 発酵 例24.1において得られた組換え体E.コリ株を、40μg/
mlアンピシリン及びカナマイシンを含むLB−ブイヨン中
において30℃で増殖せしめる。この培養物を同じ培地に
より1:5に希釈し、そして42℃で４時間インキュベート
する。遠心分離することによって細胞を集める。 24.3 IgE結合活性を有するポリペプチドの精製 例24.2の細菌ペレットから調製された、50mM Hepes
（pH8.0）、30mM NaCl及び0.1％エタノールアミンを含
む溶液中細胞懸濁液（OD₆₅₀＝20）22.5mlを、尿素18gと
混合する。この懸濁液を、9.5mmのプローブ及び24ミク
ロンの振幅を用いて、MSE Soniprep^R 150により30秒間
隔で３×30秒間音波処理する。この細胞溶解物を、20℃
で30分間Sorvall SS34ローターにより17000rpmで遠心分
離することによって透明にする。その上清液を、４℃
で、10mM Hepes（pH7.5）及び130mM NaClを含む溶液に
対して３度透析する。この透析物を、４℃で30分間、SS
34ローター（Sorvall）により17000rpmで遠心分離する
ことによって透明にし、そしてその上清液にアジ化ナト
リウム（0.1mg/ml）を補充する。IgE結合活性を有する
ポリペプチドをさらに精製し、そして例22及び23に記載
しているようにして分析する。 例25:酵母サッカロマイセスセレビシアエ（Saccharomyc
es cerevisiae）におけるIgE結合因子活性を有するポリ
ペプチドの発現 25.1 発現プラスミドpJDB207R/PH05-BF（第６図）の造
成 ベクターDNAを調製するために、10μｇのプラスミドD
NA pJDB207R/PH05‐TPA（12-2）（ヨーロッパ特許出願E
P143081）をBamH Iにより完全に消化する。この消化さ
れたDNAをアルカリホスファターゼにより処理する。6.8
5kbのBamH I大フラグメントを、TBE緩衝液中１％アガロ
ースゲル上で小フラグメントから分離し、そしてその6.
85kbのDNAフラグメントを電気溶出によってゲルから回
収する。誘導性PH05プロモーター及びPH05シグナル配列
をコードするDNAフラグメントは、プラスミドpJDB207/P
H05-TPA18（ヨーロッパ特許出願143′081）に由来す
る。このプラスミド50μｇをBamH I及びHind IIIにより
完全に消化し、そして2.3kbのフラグメントを単離す
る。このフラグメント５μｇをBal Iによりさらに消化
し、そして0.58kbのフラグメントを単離する。上記の20
ngのベクターDNA、0.58kbのフラグメント4ng、pCAL3
（例20）に由来する0.8kbのBgl II/BamH I cDNAフラグ
メント8ng、及び核酸配列:5′pCCAATGCA-3′/3′‐GGTT
ACGTCTAGp-5′を有する化学的に合成された二本鎖DNAリ
ンカー0.1ngを混合し、そして15℃で24時間、20μｌの
体積において連結する。その連結されたDNAを用いてコ
ンピテントE.コリHB101細胞を形質転換する。約100個の
アンピシリン耐性コロニーからプラスミドDNAを制限酵
素による消化によって分析する。目的とする方向にすべ
ての３種の挿入体DNAフラグメントを有する数個のコロ
ニーが見出される（プラスミドpJDB207R/PH05-BF;第６
図）。PH05シグナル配列、化学的に合成されたリンカー
DNA及びIgE-BF cDNAの間の接合点でこの造成物における
正しい構造を配列決定によって確かめる。 25.2 酵母の形質転換及び発酵 プラスミドpJDB207R/PH05-BFを、Hinnenなど（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA1978,75,1979）によって記載されてい
る形質転換法を用いて、サッカロマイセス セレビシア
エ株GRF18（α、his 3-11、his 3-15、leu 2−３、le
u 2-112、kan^R）に形質転換する。形質転換された酵母
細胞を、ロイシンを欠く酵母最少培地プレート上で選択
する。１つの形質転換された酵母コロニーを単離し、そ
してサッカロマイセス セレビシアエGRF18〔pJDB207R/
PH05-BF〕と称する。そのような形質転換された酵母細
胞を、50mlの酵母最少培地（アミノ酸を含まないDifco
Yeast Nitrogen Base培地に２％グルコース、20mg/lの
Ｌヒスチジン及び10g/lのＬ−アスパラギンを添加した
もの）中で、30℃にて25時間振として増殖せしめ、３×
10⁷個の細胞/mlの密度にする。この細胞を0.9％ NaCl中
で洗浄し、そしてこれを、0.03g/lのKH₂PO₄、1g/lのKC
l、(NH₄)₂SO₄の代わりに10g/lのＬ−アスパラギン、２
％及び1g/lのＬ−ヒスチジンを含有するDifco Yeast Ni
trogen Base培地（アミノ酸を含まない）の配合に従っ
て調製された低Pi最少培地100ml中に接種する。この細
胞を30℃で48時間増殖せしめ、そして約10のOD₆₀₀で収
得する。 低Pi培地35mlの細胞を遠心分離することによって集
め、そして66mMの冷リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）
及び0.1％（v/v）Triton X-100^Rの合計体積4ml中に再懸
濁する。この細胞懸濁液を30mlのCorex管に移す。ガラ
スビーズ（0.4mmの直径）8gを添加し、そしてこの懸濁
液を十分な速度で４分間、ボルテックスミキサ（Vortex
Mixer）（Scientrfic Instruments Inc.,USA）上で振
盪し、そして次に氷浴中で冷却する。この方法によって
90％以上の細胞が破壊される。細胞破片及びガラスビー
ズを、４℃で10分間、8000rpmでSorval HB4ローターに
より遠心分離することによって沈降せしめる。IgE結合
因子活性を有するポリペプチドを、例22及び23に記載し
ているようにしてアフィニティクロマトグラフィーを用
いて前記上清液から精製する。 例26:培養された哺乳類細胞におけるIgE結合活性を有す
るポリペプチドの発現のためのプラスミドpCAL5-R/ND及
びpCAL8-BF/NDの組立て この例においては、プラスミドpCAL5-R/ND及びpCAL8-
BF/NDの造成を記載する（第７図を参照のこと）。これ
らは、培養された哺乳類細胞において膜−結合IgEリセ
プター又は分泌されるIgE結合因子の産生を可能にす
る。さらに、これらのプラスミドは、目的とするポリペ
プチドの高収率を導びく１つの方法である宿主細胞中で
の遺伝子の増幅の選択のために設計される。 26.1 プラスミドpCAL5の造成 プラスミドpSV2911neo〔Asselbergs,F.A.M.,など（19
86）J.Mol.Biol．189 ,401〜411ページ〕を用いてベク
ターDNAを調製する。これを制限酵素、Hind III及びSal
Iにより消化する。3.9kb及び1.8kbのフラグメントを得
る。この混合物をアルカリホフファターゼにより処理
し、１％アガロースゲルを用いる電気泳動にかけた後そ
して3.9kbのフラグメントを単離する。 同時に、IgEリセプター及びウサギβ−グロビン遺伝
子の３′−半分をそれぞれコードする２種類の挿入部を
調製する。一方では、プラスミドpCAL3（例20:第４図）
10μｇをHind IIIにより部分消化し、そしてBamH Iによ
り完全消化する。1.26kbのcDNA挿入部をアガロースゲル
電気泳動及びゲル溶離により単離する。他方では、10μ
ｇのプラスミドpUβ〔Weber,F.及びSchaffner,W.（198
5）Nature 315 ,75〜77ページ〕をBamH I及びSal Iに
より完全消化する。1.2kbのDNAフラグメントを単離す
る。これは大イントロン及びウサギβ−グロビン遺伝子
のポリ（Ａ）シグナルを含む。 上記からの10ngのベクターDNA及びそれぞれの10ngの
挿入部DNAを連結する。得られたDNAを用いてコンピテン
トE.コリHB101をトランスフェクトする。ベクターDNA中
への両DNA挿入部の取込みの後予測されるような、予定
された制限パターンを示す組換えプラスミド（pCAL5;第
７図）を選択する。 26.2 プラスミドpCAL5-R/NDの造成 10ngのpCAL5プラスミドDNAを、Sal Iにより部分消化
する。１度だけ切断され、そしてそれ故に十分な長さの
直線を示すDNA分子を、アガロースゲル電気泳動により
精製する。同時に、pNDプラスミドDNA（Asselbergsな
ど.;loc.cit.）10μｇをXho I及びSal Iにより完全に切
断する。このプラスミドは、２種の選択マーカー、すな
わちネオマイシン（neo）及びジヒドロ葉酸レダクター
ゼ（dhfr）を含み、そしてこれらはそれぞれ、哺乳類宿
主のゲノムにおける外来DNAの組込み及び増幅について
の選択を可能にする。切断されたpND2 DNAをアルカリホ
スファターゼにより処理する。次に、Sal Iにより切断
されたpCAL5（10ng）及びSal I/Xho Iにより切断された
pND2プラスミドDNA（10ng）を混合し、そして連結す
る。その得られたDNAを用いてコンピテントE.コリHB101
細胞を形質転換する。この形質転換された細胞を、LB−
ブイヨン及び50μg/mlのカナマイシンをふくむ寒天プレ
ート上に広げる。予定されたDNA制限パターンを示す組
換えプラスミド（pCAL5-R/ND、第７図）を、哺乳類宿主
におけるIgEリセプターの発現のために選択する。この
ものは、IgEリセプターDNAの下流にneo−及びdhfr選択
マーカーを含む。転写の方向はすべての３種の遺伝子で
同一である。 26.3 プラスミドpCAL8-BF/NDの造成 プラスミドpCAL8-BF/NDは上記プラスミドpCAL5-R/ND
の誘導体であり、このプラスミドにおいては式（Ｉ）の
ポリペプチドのアミノ酸１〜147をコードするDNA配列
が、鳥類のインフルエンザヘマグルチニンのシグナル配
列をコードする新DNA配列によって取り替えられてい
る。この変化は、式（Ｉ）のポリペプチドのアミノ酸14
8〜321を含んで成るIgE結合因子の分泌を可能にする。
このために、下記の式を有する二本鎖DNA、フラグメン
トを、参考文献4,5,6,6a,7,8に記載されている標準的方
法に従って化学的に合成する。 この0.2ngのDNAを、10ngのベクターDNA及び0.7kbのDde
I/Xba I cDNA挿入部2ngと連結する。このベクターは、
（ａ）Xba及びHind IIIによる完全な消化、（ｂ）アル
カリホスファターゼによる脱リン酸化及び（ｃ）5.9kb
のベクターDNAのアガロースゲル精製によってpCAL5プラ
スミドDNAから得られる。0.7kbのcDNA挿入部フラグメン
トはpCAL3（例20）に由来する。30μｇのpCAL3プラスミ
ドDNAをHind III及びXba Iにより消化し、そして0.8kb
のcDNA挿入部をアガロースゲル精製により単離する。こ
の0.8kbのフラグメント３μｇをDde Iにより消化し、そ
れによって0.1及び0.7kbのDNAフラグメントを得る。最
後に、0.7kbのDNAフラグメントをアガロースゲル電気泳
動及び精製により単離する。連結されたDNAを用いてコ
ンピテントE.コリHB101細胞を形質転換する。ベクターD
NA中へのDNA挿入部の組込みの後、予測されるような、
予定された制限フラグメントを示す組換え体プラスミド
（pCAL8;第７図）を選択する。10μｇのpCAL8プラスミ
ドDNAをSal Iにより完全に消化する。その線状DNA分子
をアガロースゲル電気泳動により精製する。Sal Iによ
り切断されたpCAL8（10ng）と、Sal I/Xho Iにより切断
されたp ND2プラスミド（例26.2）10ngとを連結する。
この連結されたDNAを用いて、50μg/mlのカナマイシン
を補充したLB培地を含む寒天プレート上にプレートされ
たコンピテントE.コリHB101細胞を形質転換する。組換
え体プラスミド（pCAL8-BF/ND;第７図）を、形質転換さ
れた哺乳類宿主におけるIgE-BFの発現及び産生のために
選択する。 例27:IgE結合活性を有するポリペプチドを発現する形質
転換された哺乳類細胞系の選択 哺乳類細胞中へのDNAのトランスフェクションのため
に使用される方法、並びに形質転換された細胞の選択及
び遺伝子増幅のための選択は詳しく記載されており〔ア
メリカ特許第4.399.216号（1983）;Kaufman,R.J.及びSh
arp,P.A.（1982），J.Mol.Biol． 159,601〜621ペー
ジ〕、そして当業者によく知られている。チャイニーズ
ハムスターの卵巣セルラインのジヒドロ葉酸レダクター
ゼ陰性突然変異体（dhfr^-）〔Cell line DUKX-B1:Chasi
n,L.A.及びUrlaub,G.,（1980）Proc.Nat.Acad.Sci.USA
77,4216〜4220ページ〕を宿主として使用する。この
細胞を、透析された５％ FCS及び0.1mg/mlのゲンタマイ
シン（Gibco）を補充したMEM培地（Gibco,Paislay,Scot
land）に保持する。半コンフルエントCHO細胞を、Ca−
ホスフェート同時沈殿法を用いて10μｇのpCAL5-R/ND又
はpCAL8-BF/NDプラスミドDNAによりトランスフェクトす
る。このトランスフェクトされた細胞を、５％ FCS、ゲ
ンタマイシン及び0.5mg/mlのG418（Gibco）を補充した
α‐MEM培地中で増殖せしめる。２週間後、G418耐性細
胞の単一のコロニーが増殖する。48個のコロニーのそれ
ぞれを24ウェルのマイクロタイタープレートのウェル中
に移し、そして上記の選択培地中でコンフルエントに増
殖せしめる。次に、この培地のアリコートを取り、そし
て例７に記載のRIAを用いてIgE結合活性の存在について
試験する。コロニーの約50％が陽性であり、そして1ml
当り約0.1〜10ngの組換体ポリペプチドを産生する。プ
ラスミドpCAL8-BF/NDに由来する形質転換されたコロニ
ーは、一般的に、プラスミドpCAL5-R/NDにより得られた
コロニーよりもより高い生産体である。５個の最良の産
性コロニーを、メトトレキセート（Kaufman and Sharp
op.cit.）と共に遺伝子増幅のために使用する。数回の
増幅の後、１μg/mlまでの組換体ポリペプチドを産生す
る細胞系を得る。最良の生産体、すなわちセルラインCH
O-BF/NDを大きな培養物に増殖せしめる。選択培地50ml
を含む組織培養フラスコ（Falcon,175cm²）およそ３×1
0⁶個の細胞を接種する。細胞層がコンフルエントになっ
た後、その培地を除去し、そして１％ FCS及び0.1mg/ml
のゲンタマイシンを補充したα‐MEM培地50mlと取り換
える。培地を１週当り２度、数週間にわたり集める。こ
れを5000gで10分間、遠心分離し、そして−20℃で貯蔵
する。最後に、IgE結合活性を有する組換体ポリペプチ
ドを、たとえば例22及び23に記載しているようにしてア
フィニティクロマトグラフィーによって、集められた上
清液から精製する。 RPMI8866細胞からの天然のIgE-BFの精製及び配列の分析 次の例Ｂ〜Ｄに従って、IgE-BFを含むRPMI8866細胞上
清液の画分（EP86810244.3）を精製することによって、
配列決定するために十分に純粋であるIgE-BFを得、そし
てそのアミノ末端を決定することが可能である。 例A:IgE-BFのエンザイム−リンクド−イムノソーベント
アッセイ（ELISA） 画分を次の方法でIgE-BFについて分析する。PVC製マ
イクロタイヌープレートのウェルを、室温で湿潤チャン
バー中で一晩、Mab-176（PBS中５μg/ml;ウェル当り100
μｇ）により被覆する。PBSにより２度洗浄した後、非
特異的な結合部位を、0.2％ゼラチンを含むPBSによりブ
ロックする（150μl/ウェル;37℃で１時間）。プレート
をPBSにより再び２度洗浄する。クロマトグラフィー実
験からの画分をPBSにより1/50に希釈し、ウェルに添加
し（100μl/ウェル）、そして湿潤チュンバー中におい
て室温で一晩インキュベートする。プレートをPBSによ
り４度洗浄する。結合されたIgE-BFを、ビオチンが共有
結合しているMab-135（例19、EP86810244.3）（0.2％ゼ
ラチンを含むPBS中、0.5μg/ml;100μl/ウェル）を添加
することによって検出し、そして温潤チャンバー中にお
いて37℃で４時間、インキュベートする。PBSにより４
度洗浄した後、そのプレートを、0.2％ゼラチンを含むP
BS中アビジン及びとアルカリホスファターゼとの接合体
（Sigma Cat.No.A2527、0.5μg/ml）100μｌと共に37℃
で２時間インキュベートする。さらにPBSにより洗浄し
た後、基質緩衝液（100mgのMgCl₂×6H₂O、200mgのNa
N₃、水800ml中に溶解されたジエタノールアミン97ml、3
7％ HClによりpH9.8に調整）中、1mg/mlのｐ−ニトロフ
ェニルホスフェート二ナトリウムによりそのプレートを
発色せしめる。37℃で20〜40分の後、黄色の反応が最適
である。次に、ウェル当り50μｌのNaOH（1M）により反
応を停止する。モデル2550EIA Reader（Bio-Rad）を用
いて、405mmで光学濃度を決定する。 例B:イムノアフィニティクロマトグラフィーによるヒト
Ｂ−細胞上清液からのIgE-BFの精製 RPMI8866細胞からの培養上清液10lを、Mab-45-affige
lの20mlカラム（EP86810244.3の例）に通して120ml/時
の流速で濾過する。このゲルをPBSにより洗浄する。流
出液の蛋白質含有量を、Uvicord_Rスペクトロメーターに
よって280nmでのオンラインの吸光度によりモニター
し、結合されなかった蛋白質が完全に除去されたことを
確かめる。このカラムを0.1Mのグリシン−HCl（pH2.6）
50mlにより溶出する。1M Tris-HCl（pH8.0）及び0.5％
Tween20の等量を含む管に画分を集める。IgE-BF含有の
画分をプールし、そして10mMのTris-HCl（pH7.4）に対
して透析する。 例C:イオン交換クロマトグラフィーによるIgE-BFの精製 例Ｂの精製されたIgE-BFをSynChropak AX300陰イオン
交換カラム（SynChrom Inc.,Liaden,IN）上に負荷す
る。このカラムを10mM Tris-HCl（pH7.4）により洗浄
し、そして蛋白質を、1ml/分の流速で100分間にわたっ
て、０〜1MのNaClのグラジェントにより溶出する。この
溶出を254nmでUV吸光度によりモニターする。この画分
を１％オクチルピラノグルコシド（Sigma）中に集め、
そして例Ａに記載のようにしてIgE-BFについて検定す
る。 例D:逆相クロマトグラフィーによるIgE-BFの追加の精製 例Ｃの50mlのIgE-BFを、0.5lのPBSに対して透析し、
そして0.1％オクチルピラノグルコシドを含む0.5lのPBS
に対して２度透析する。凍結乾燥した後、IgE-BFを水1.
5ml中に溶解し、そして0.1％オクチルピラノグルコシド
を含む２×0.5lのPBSに対して再び透析する。逆相クロ
マトグラフィーを、0.1％ TFA（Pierce）及び５％アセ
トニトリル（Merck）中SynChropak RP-4（SynChrom）カ
ラム上で行なう。0.5ml/分の流速で30分間、0.1％ TFA
中５〜60％アセトニトリルのグラジェントを適用するこ
とによって、IgE-BFの溶出を行う。この溶出を254nmで
のUV吸光度によりモニターする。1mlの画分を0.05％ SD
S中に集め、そして例Ａに記載のようにしてIgE-BFにつ
いて分析する。IgE-BFの純度をSDS-PAGEによって制御
し、そして続いて銀染色を行なう（EP86810244.3、例2
2）。 例E:IgE-BFのアミノ酸配列分析 M.W.Hunkapillar及びL.E.Hoad,Method in Enzymolog
y，91,399ページ、（1983）の方法に従って、例Ｄの精
製されたIgE-BFを、ポジティブ・フェーズ・プロテイン
・スクエンサーモデル470（Applied Biosystems）を用
いてＮ−末端のアミノ酸配列分析にかける。アミノ−チ
オゾリン誘導体を、50℃で25％水性TFAによる処理によ
って、フェニルチオビタントイン（PTH）アミノ酸に転
換する。このPTHアミノ酸をZorbaxCN^R HPLCカラム（Du
Pont,200×4.6mm）上で分析する（R.Knechtなど.,Anal.
Biochem． 130,65ページ、1983）。次のＮ−末端のア
ミノ酸配列が、材料の40％で見出される： 〔配列中、X₁₄₉、X₁₅₅、X₁₆₀及びX₁₆₃は、決定されなか
ったアミノ酸を表わす〕。この配列は、cDNA分析によっ
て決定されたIgE−リセプターの配列に従えば、該リセ
プターの第148番目のアミノ酸から始まる。 次のＮ−末端のアミノ酸配列が、材料の60％で見出さ
れる： 〔配列中、X₁₅₁、X₁₆₀及びX₁₆₃は決定されなかったアミ
ノ酸を表わす〕。この配列は、cDNA分析によって決定さ
れたIgEリセプターの配列に従えば、該リセプターの第1
50番目のアミノ酸から始まる。 例28:IgE−結合因子活性を有するポリペプチドのE.コリ
における高レベルの発現 28.1 発現プラスミドの構成 例24.1の精製された2.9kbのベクターDNA（EcoR I及び
BamH Iにより切断されたプラスミドpPLc24）10ngを、0.
1ngのオリゴヌクレオチド ５′‐pAATTTGGAGGAAAAAATTATG（Pharmacia,No.27-4878
-01）及び0.1ngのオリゴヌクレオチド ５′‐pGATCCATAATTTTTTCCTCCA（Pharmacia,No.27-4898
-01）と共に、10mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl₂、2
mM DDT、0.1mM ATP及び100ユニットのT₄ DNAリガーゼ
（Boehringer,Mannheim）を含む溶液20μｌ中で混合す
る。４℃で16時間後、その混合物を用いてコンピテント
E.コリK12細胞を形質転換する。個々のコロニー増殖せ
しめ、そしてそのプラスミドを単離する。標準的制限酵
素分析を行ない、BamH Iによっては切断されるが、しか
しEcoR Iによっては切断されない正しいプラスミド（pP
L.PTIS;第８図を参照のこと）を選択する。オリゴヌク
レオチドの正しい挿入をDNA配列決定により確認する。
新しい挿入されたDNAフラグメントはポータブル翻訳開
始部位（PTIS,Pharmacia）をコードする。 10μｇのpPL.PTISプラスミドDNAをBamH Iにより消化
し、次にアルカリホスファターゼにより処理し、そして
線状の2.9kbベクターDNAをアガロースゲル電気泳動によ
り精製する。10ngのこのベクターDNAを、プラスミドpCA
L-3（例20）に由来する0.8kbのBgl II-BaH Iフラグメン
ト3ngに連結し、そして次に、これを用いてコンピテン
トE.コリK12細胞を形質転換する。個々のコロニーから
プラスミドDNAを単離し、そして標準的制限酵素分析を
行なって、正しい方向に0.8kbの挿入体を有するプラス
ミドpPL.PTIS-BF（第８図）を選択する。プラスミドpP
L.PTIS-BFを用いてE.コリ株W3110及びHB101〔両者はλI
857（Remautなど.,loc.cit.）を含む〕を形質転換す
る。この形質転換体を、40μg/mlのカナマイシン及びア
ンピシリンを含むLB−プレート上に広げ、そして30℃で
24時間インキュベートすることによって増殖せしめる。
得られた組換体コロニーを発酵のために使用する。 28.2 発酵 例28.1で得られた組換え体E.コリ株を例24.2に記載の
ようにして増殖せしめる。42℃で３時間のインキュベー
ションの後、その培養物を氷／水浴中で30分間冷却し、
そして遠心分離することによって細胞を集める。 28.3 IgE−結合活性を有するポリペプチドの精製 熱誘導された培養物1mlから得られた細胞のペレット
を、50mM Tris-HCl（pH7.5）及び1mM EDTAを含む溶液20
ml中に４℃で再懸濁する。この細胞懸濁液を、１分間隔
で４×30秒間、氷上で常に冷却しながら音波処理する
（MSE Soniprep^R 150、9.5mmのプローブ、24ミクロンの
振幅）。次に、この懸濁液を10分間遠心分離にかける
（Sorvall遠心機、HB−４ローター、900rpm、４℃）。
このペレットを50mM Tris-HCl（pH7.5）及び1mM EDTAを
含む溶液20ml中に４℃で再懸濁し、そして上記のように
して30秒間音波処理する。その懸濁液を上記のように遠
心分離にかけ、そして洗浄サイクルをさらに２度、くり
返す。 文献 1.Maniatis等,Molecular Cloning,A Laboratory Manua
l,Cold Spring Harbor Laboratory（1982）。 2.Okayama及びBerg,Molecular and Cellular Biology
2,161-170（1982）。 3.Heidecker及びMessing,Nucleic Acids Research 11,4
891-4906（1983）。 4.S.A.Narang等,Anal.Biochem.121 ,365（1982）。 5.K.L.Agarwal等,Angew.Chem.84,489（1972）。 6.C.B.Reese,Tetrahedron 34,3143（1972）。 6a.R.L.Letsinger等,J.Am.Chem.Soc.98,3655（1976）。 7.Khorana等,J.Biol.Chem.251 ,565（1976）。 8.S.A.Narang,Tetrahedron 39,3（1983）。 9.Chang等,Nature,275:615（1978）。 10.Goedell等,Nature,281:544（1979）。 11.Goedell等,Nucleic Acid Res.,8:4057（1980）。 12.Siebenlist等,Cell 20:269（1980）。 13.J.Gharayeb等,The EMBO Journal,Vol.3,2437-2442
（1984）。 14.Stinchomb等,Nature,282:39（1979）。 14a.Kingsman等,Gene,7:141（1979）。 15.Tschemper等,Gene,10,157（1980）。 16.Melton,D.A.等（1984）Nucleic Acids Research 12,
7035-7056。 17.M.Sarfati等,Immunology,1984,53,197-205。 18.J.B.Gurdon,The control of gene expression in an
imal development,Clarenton Press,Oxford,1974。 19.F.C.Greenwood等,Biochem.J.89,114（1963）。 20.B.Seed,Nucleic Acids Res.10,1799-1810（1982）。 21.F.Sanger等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 74,5463-5467。

【図面の簡単な説明】 第１図はRPMI8866B−細胞から単離されたmRNAからのds-
cDNAを挿入部として含有するプラスミドpCL-1及びpCL-2
の調製を示す。挿入部cDNAはIgE−リセプター、及びIgE
−結合因子に関連するポリペプチドをコードしている。 第２図はプラスミドpCL-1及びpCL-2の２つの挿入部の比
較を示し、両挿入部に共通のコード領域、両挿入部に共
通の非−コード領域、pCL-2中にのみ存在するコード領
域及び両挿入部において異る非コード領域、並びに若干
の制限部位が示されている。 第３図は、pCL-2及びpGEM^TM‐１からのプラスミドpGEM
^TM‐1/CL2の造成、並びにmRNAへのDNA挿入部の転写を示
す。 第４図は、プラスミドpCL-2から、アミノ酸配列Asp₁₁₉
‐Ser₃₂₁をコードする挿入部を有するプラスミドpFK-
1、及び式（Ｉ）のAla₁₃₄‐Ser₃₁₂のアミノ酸配列をコ
ードするpFK-2を造成する過程を記す。 第５図はE.コリW3110及びHB101中でIgE-BFを発現するた
めのプラスミドpBL-BFの造成を示す。ファージλのP_Lプ
ロモーターのもとでアミノ酸119-321が発現される。 第６図はサッカロミセス・セレビシエーにおいてIgE-BF
を発現するためのプラスミドpJDB207R/PH05-BFの造成を
示す。PH05プロモーターのもとでアミノ酸119-321が発
現される。 第７図は培養された哺乳類細胞（チャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞）中でそれぞれ膜結合IgEリセプター又は分
泌されるIgE-BFを発現するためのプラスミドpCAL-5及び
pCAL8-BF/NDの造成を示す。 第８図はE.コリ中でのIgE-BFの発現及び形質転換のため
のプラスミドpPL.PTIS-BFの造成を示す。 図中の記号は次の意味を有する： Ａ＝HaeI I Ｇ＝Bgl III Ｂ＝BamH I Ｈ＝Hind III Ｃ＝Hinc II Ｎ＝Nco I Ｅ＝EcoR I Ｐ＝Pst I Ｒ＝Rsa I

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．ヒト免疫グロブリンＥ結合因子の生物学的活性を有
   するポリペプチドであって、下記（１）〜（６）に定義
   されるポリペプチド： 次のアミノ酸配列（Ｉ）： において、 （１）上記アミノ酸配列（Ｉ）の全配列から成るポリペ
   プチド； （２）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、アミノ酸残基
   106〜110中のアミノ酸からアミノ酸残基127〜130中のア
   ミノ酸までのアミノ酸配列が除去されているポリペプチ
   ド； （３）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、アミノ酸残基
   119〜160中のアミノ酸からアミノ酸残基282〜321中のア
   ミノ酸までのアミノ酸配列から成るポリペプチド； （４）上記ポリペプチド（１）〜（３）から選択される
   ポリペプチドにおいて、１〜10個のアミノ酸残基が他の
   アミノ酸残基により置き換えられているポリペプチド； （５）上記（１）〜（４）から選択されたポリペプチド
   において、アミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基及
   び／又はカルボキシル基がグリコシル化、アシル化、ア
   ミド化及び／又はエステル化されているポリペプチド；
   あるいは （６）上記（１）〜（５）から選択されるポリペプチド
   において、塩の形態であるポリペプチド 〔但し、下記のポリペプチドを除く： 免疫グロブリンＥ（IgE）抑制因子（IgE-SF）活性を有
   する実質的に純粋なヒト免疫グロブリンＥ結合因子（Ig
   E-BF）であって、 （１）IgEのためのリンパ球リセプター（FcεＲ）に対
   するモノクローナル抗体により認識されそして結合され
   るヒト由来の場合によってグリコシル化されている蛋白
   質を含有し、 （２）SDSポアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）
   により測定する場合25〜28KD（キロ−ダルトン、kg/mol
   e）の概略見かけ分子量を有する分子、及び場合によっ
   ては、FcεＲに対して特異的なモノクローナル抗体に結
   合する他の蛋白質から成り、 （３）アガロースゲル結合IgEへの吸着及びそこからの
   可能な回収により決定する場合、IgEに可逆的に結合
   し、 （４）FcεＲを発現するRPMI8866細胞へのIgE被覆ラテ
   ックス粒子の結合の阻害により決定する場合、IgEのた
   めのリセプターを担持する細胞のIgEの結合をブロック
   し、 （５）放射能標識されたIgE及びそれに対するモノクロ
   ーナル抗体であってマイクロタイタープレート上に固定
   されたものを用いて決定する場合、IgEに対して特異的
   なモノクローナル抗体へのIgEの結合をブロックし、そ
   して （６）IgEのためのリセプターを発現するヒトＢ細胞（F
   cεR⁺）の培養上清又はヒト初乳中に存在する、 ことを特徴とする当該IgE-BF; 前記IgE-BFの場合によってはグリコシル化されている個
   々の蛋白質；あるいは前記の場合によってはグリコシル
   化されている個々の蛋白質の断片であって、 （１）IgEのためのリンパ球リセプター（FcεＲ）に対
   するモノクローナル抗体により認識されそして結合さ
   れ、 （２）アガロースゲル結合IgEへの吸着及びそこからの
   可能な回収により決定する場合、IgEに可逆的に結合
   し、 （３）FcεＲを発現するRPMI8866細胞へのIgE被覆ラテ
   ックス粒子の結合の阻害により決定する場合、IgEのた
   めのリセプターを担持する細胞へのIgEの結合をブロッ
   クし、 （４）放射能標識されたIgE及びそれに対するモノクロ
   ーナル抗体であってマイクロタイタープレート上に固定
   されたものを用いて決定する場合、IgEに対して特異的
   なモノクローナル抗体へのIgEの結合をブロックし、 （５）SDS-PAGE又はゲル濾過高圧液体クロマトグラフィ
   ーのごとき蛋白質分析の常法に従えば均一であり、そし
   て （６）SDS-PAGEにより測定する場合、10〜20KDの見かけ
   分子量を有する、ことを特徴とする当該断片〕。 ２．アミノ酸106〜127を含んで成るアミノ酸配列が除去
   されていることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
   載のポリペプチド。 ３．アミノ酸120,121,123,124,125,126,127,128,129,13
   0,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,
   143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,15
   5,156,157,158,159又は160のいずれかから始まりそして
   アミノ酸321で終るポリペプチドから成る群から選択さ
   れることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のポ
   リペプチド。 ４．アミノ酸120,121,123,124,125,126,127,128,129,13
   0,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,
   143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,15
   5,156,157,158,159又は160のいずれかから始まりそして
   282と321との間のアミノ酸のいずれかで終るポリペプチ
   ドから成る群から選択されることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ５．アミノ酸119からアミノ酸321までのアミノ酸配列か
   ら成ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
   ポリペプチド。 ６．アミノ酸134からアミノ酸321までのアミノ酸配列か
   ら成ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
   ポリペプチド。 ７．アミノ酸148からアミノ酸321までのアミノ酸配列か
   ら成ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
   ポリペプチド。 ８．アミノ酸150からアミノ酸321までのアミノ酸配列か
   ら成ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
   ポリペプチド。 ９．ヒト免疫グロブリンＥ結合因子の生物学的活性を有
   するポリペプチドであって、下記（１）〜（６）に定義
   されるポリペプチド： 次のアミノ酸配列（Ｉ）： において、 （１）上記アミノ酸配列（Ｉ）の全配列から成るポリペ
   プチド； （２）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、アミノ酸残基
   106〜110中のアミノ酸からアミノ酸残基127〜130中のア
   ミノ酸までのアミノ酸配列が除去されているポリペプチ
   ド； （３）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、アミノ酸残基
   119〜160中のアミノ酸からアミノ酸残基282〜321中のア
   ミノ酸までのアミノ酸配列から成るポリペプチド； （４）上記ポリペプチド（１）〜（３）から選択される
   ポリペプチドにおいて、１〜10個のアミノ酸残基が他の
   アミノ酸残基により置き換えられているポリペプチド； （５）上記（１）〜（４）から選択されたポリペプチド
   において、アミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基及
   び／又はカルボキシル基がグリコシル化、アシル化、ア
   ミド化及び／又はエステル化されているポリペプチド；
   あるいは （６）上記（１）〜（５）から選択されるポリペプチド
   において、塩の形態であるポリペプチド、 〔但し、下記のポリペプチドを除く： 免疫グロブリンＥ（IgE）抑制因子（IgE-SF）活性を有
   する実質的に純粋なヒト免疫グロブリンＥ結合因子（Ig
   E-BF）であって、 （１）IgEのためのリンパ球リセプター（FcεＲ）に対
   するモノクローナル抗体により認識されそして結合され
   るヒト由来の場合によってグリコシル化されている蛋白
   質を含有し、 （２）SDSポアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）
   により測定する場合25〜28KD（キロ−ダルトン、kg/mol
   e）の概略見かけ分子量を有する分子、及び場合によっ
   ては、FcεＲに対して特異的なモノクローナル抗体に結
   合する他の蛋白質から成り、 （３）アガロースゲル結合IgEへの吸着及びそこからの
   可能な回収により決定する場合、IgEに可逆的に結合
   し、 （４）FcεＲを発現するRPMI8866細胞へのIgE被覆テラ
   ックス粒子の結合の阻害により決定する場合、IgEのた
   めのリセプターを担持する細胞のIgEの結合をブロック
   し、 （５）放射能標識されたIgE及びそれに対するモノクロ
   ーナル抗体であってマイクロタイタープレート上に固定
   されたものを用いて決定する場合、IgEに対して特異的
   なモノクローナル抗体へのIgEの結合をブロックし、そ
   して （６）IgEのためのリセプターを発現するヒトＢ細胞（F
   cεR⁺）の培養上清又はヒト初乳中に存在する、 ことを特徴とする当該IgE-BF; 前記IgE-BFの場合によってはグリコシル化されている個
   々の蛋白質；あるいは前記の場合によってはグリコシル
   化されている個々の蛋白質の断片であって、 （１）IgEのためのリンパ球リセプター（FcεＲ）に対
   するモノクローナル抗体により認識されそして結合さ
   れ、 （２）アガロースゲル結合IgEへの吸着及びそこからの
   可能な回収により決定する場合、IgEに可逆的に結合
   し、 （３）FcεＲを発現するRPMI8866細胞へのIgE被覆ラテ
   ックス粒子の結合の阻害により決定する場合、IgEのた
   めのリセプターを担持する細胞へのIgEの結合をブロッ
   クし、 （４）放射能標識されたIgE及びそれに対するモノクロ
   ーナル抗体であってマイクロタイタープレート上に固定
   されたものを用いて決定する場合、IgEに対して特異的
   なモノクローナル抗体へのIgEの結合をブロックし、 （５）SDS-PAGE又はゲル濾過高圧液体クロマトグラフィ
   ーのごとき蛋白質分析の常法に従えば均一であり、そし
   て （６）SDS-PAGEにより測定する場合、10〜20KDの見かけ
   分子量を有する、ことを特徴とする当該断片〕。 の製造方法であって、 ａ）前記のポリペプチドをコードするDNAを含んで成る
   ハイブリドベクターを含有する形質転換された宿主を培
   養し；又は ｂ）前記ポリペプチドをコードするmRANを適当な翻訳系
   において翻訳し；そして所望により 前記ポリペプチドを前記の他のポリペプチドに転換す
   る； ことを特徴とする方法。 １０．ヒト免疫グロブリンＥ結合因子の生物学的活性を
   有するポリペプチドであって、下記（１）〜（６）に定
   義されるポリペプチド： 次のアミノ酸配列（Ｉ）： において、 （１）上記アミノ酸配列（Ｉ）の全配列から成るポリペ
   プチド； （２）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、アミノ酸残基
   106〜110中のアミノ酸からアミノ酸残基127〜130中のア
   ミノ酸までのアミノ酸配列が除去されているポリペプチ
   ド； （３）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、アミノ酸残基
   119〜160中のアミノ酸からアミノ酸残基282〜321中のア
   ミノ酸までのアミノ酸配列から成るポリペプチド； （４）上記ポリペプチド（１）〜（３）から選択される
   ポリペプチドにおいて、１〜10個のアミノ酸残基が他の
   アミノ酸残基により置き換えられているポリペプチド； （５）上記（１）〜（４）から選択されたポリペプチド
   おいて、アミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基及び
   ／又はカルボキシル基がグリコシル化、アシル化、アミ
   ド化及び／又はエステル化されているポリペプチド；あ
   るいは （６）上記（１）〜（５）から選択されるポリペプチド
   において、塩の形態であるポリペプチド； 〔但し、下記のポリペプチドを除く： 免疫グロブリンＥ（IgE）抑制因子（IgE-SF）活性を有
   する実質的に純粋なヒト免疫グロブリンＥ結合因子（Ig
   E-BF）であって、 （１）IgEのためのリンパ球リセプター（FcεＲ）に対
   するモノクローナル抗体により認識されそして結合され
   るヒト由来の場合によってグリコシル化されている蛋白
   質を含有し、 （２）SDSポアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）
   により測定する場合25〜28KD（キロ−ダルトン、kg/mol
   e）の概略見かけの分子量を有する分子、及び場合によ
   っては、FcεＲに対して特異的なモノクローナル抗体に
   結合する他の蛋白質から成り、 （３）アガロースゲル結合IgEへの吸着及びそこからの
   可能な回収により決定する場合、IgEに可逆的に結合
   し、 （４）FcεＲを発現するRPMI8866細胞へのIgE被覆ラテ
   ックス粒子の結合の阻害により決定する場合、IgEのた
   めのリセプターを担持する細胞のIgEの結合をブロック
   し、 （５）放射能標識されたIgE及びそれに対するモノクロ
   ーナル抗体であってマイクロタイタープレート上に固定
   されたものを用いて決定する場合、IgEに対して特異的
   なモノクローナル抗体へのIgEの結合をブロックし、そ
   して （６）IgEのためのリセプターを発現するヒトＢ細胞（F
   cεR⁺）の培養上清又はヒト初乳中に存在する、 ことを特徴とする当該IgE-BF; 前記IgE-BFの場合によってはグリコシル化されている個
   々の蛋白質；あるいは前記の場合によってはグリコシル
   化されている個々の蛋白質の断片であって、 （１）IgEのためのリンパ球リセプター（FcεＲ）に対
   するモノクローナル抗体により認識されそして結合さ
   れ、 （２）アガロースゲル結合IgEへの吸着及びそこからの
   可能な回収により決定する場合、IgEに可逆的に結合
   し、 （３）FcεＲを発現するRPMI8866細胞へのIgE被覆ラテ
   ックス粒子の結合の阻害により決定する場合、IgEのた
   めのリセプターを担持する細胞へのIgEの結合をブロッ
   クし、 （４）放射能標識されたIgE及びそれに対するモノクロ
   ーナル抗体であってマイクロタイタープレート上に固定
   されたものを用いて決定する場合、IgEに対して特異的
   なモノクローナル抗体へのIgEの結合をブロックし、 （５）SDS-PAGE又はゲル濾過高圧液体クロマトグラフィ
   ーのごとき蛋白質分析の常法に従えば均一であり、そし
   て （６）SDS-PAGEにより測定する場合、10〜20KDの見かけ
   分子量を有する、ことを特徴とする当該断片〕。 を含んで成る抗アレルギー剤。 １１．ヒト又は動物に対する予防又は治療法において使
   用するための特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチ
   ド。