DK172259B1 - Polypeptider samt deres fremstilling og anvendelse - Google Patents

Description

DK 172259 B1

Den foreliggende opfindelse angår polypeptider beslægtet med humane immunoglobulin E bindingsfaktorer (IgE-BFs), mRNA’er, DNA'er og hybridvektorer, som koder for polypep-5 tiderne, værter indeholdende hybridvektorerne samt fremgangsmåder til fremstilling af polypeptiderne, mRNA'eme, DNA'erne, hybridvektorerne og værterne. Polypeptiderne kan anvendes til forebyggelse og/eller behandling af allergi-sygdomme, og i overensstemmelse hermed angår opfindelsen 10 også farmaceutiske præparater, som indeholder polypeptiderne.

Allergisygdomme er stadig et væsentligt sundhedsproblem som følge af deres store hyppighed (20-30% af befolkningen) og på grund af manglen på kurativ behandling. Sæd-15 vanligvis er behandlingen begrænset til anvendelse af antihistaminer eller til mere eller mindre effektive immuniseringsmetoder. De klassiske antiallergiske lægemidler har visse ulemper, især da de fremkalder forskellige bivirkninger hos den behandlede patient.

20 Immuniseringsmetoden er begrænset til et eller to allergener, hvorimod størsteparten af patienterne er følsomme overfor et stort antal allergener. Desuden er hyposensitiseringsbehandling hverken kurativ eller præventiv.

25 Langt størsteparten af allergisygdomme er medieret af immunoglobulin E (IgE)-antistoffer rettet mod et uhyre stort antal luftbårne allergener, f.eks. pollen, dyreskæl, støvmider, fødeantigener, farmakologiske stoffer, f.eks. penicilliner, eller hymenopteragift. Mekanismerne, som 30 regulerer produktionen af IgE, har været genstand for omfattende undersøgelser på laboratoriedyr, jf. K.

Ishizaka, Ann. Rev. Immunol. 2, 159 (1984). Disse undersøgelser har klart indiceret tilstedeværelsen af ikke-antigenspecifikke men igE-isotypespecifikke 35 mekanismer, som regulerer produktionen af IgE i dyreforsøg. Effektormolekylerne i disse reguleringsmekanismer er blevet kaldt IgE-bindings- 2 DK 172259 B1 faktorer (IgE-BFs) som følge af deres affinitet til IgE. IgE-BFs kan opdeles i IgE-suppressive faktorer (IgE-SFs) og IgE-potenserende faktorer (IgE-PFs): Disse molekyler 5 adskiller sig indbyrdes alene ved kulhydratindholdet. IgE-SFs er ikke glycosylerede eller glycosyleret i mindre grad end de tilsvarende IgE-PFs. Den faktiske produktion af IgE i dyreforsøg bestemmes ved forholdet mellem disse to typer IgE-BFs.

10 De samme celler kan udskille enten IgE-SFs eller IgE-PFs afhængigt af indvirkningen af enten glycosyleringsinhibe-ringsfaktorer eller glycosyleringsforstærkende faktorer, som udskilles af særskilte regulatoriske T-lymfocytsubpopulationer .

15 Forekomsten af humane B-cellelinier, som udskiller IgE-BFs med lignende biologiske aktiviteter som de, der er beskrevet for gnavere, er påvist af M. Sarfati et al.. Immunology 53, 197, 207, 783 (1984). Andre forskere har beskrevet produktionen af IgE-BFs af humane T-celler, jf.

20 T.H. Huff og K. Ishizaka, Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 81, 1514 (1984), og ved genteknologiske metoder, jf. europæisk patentansøgning nr. 155.192. Relationerne mellem IgE-BFs stammende fra T-celler og IgE-BFs stammende fra B-celler, har hidtil ikke været kendte. Det fremgår af den fore- 25 liggende opfindelse, at IgE-BF stammende fra B-celler har mindre homologi med IgE-BF stammende fra T-celler end den statistiske.

Renset IgE-BFs er vigtigt til diagnostisering og terapi af allergisygdomme og immunregulationssygdomme forbundet der- 30 med. Især kan IgE-BFs med IgE-suppressiv aktivitet være nyttige ved behandlingen af allergisygdomme, hvorimod IgE-BFs med IgE-potenserende aktivitet kan forøge modstandsevnen mod infektioner, f.eks. modstandsevnen mod parasitin-fektioner.

3 DK 172259 B1

Analyser til påvisning af IgE-BFs fra B-celler er baseret på en rosetteinhiberingstest, ved hvilken RPMI 8866-celler (en lymfoblastoid B-cellelinie), som udtrykker receptorer 5 for IgE (Fc£R) rosetteres med IgE-overtrukne bovine erythrocyter. Når sidstnævnte først præinkuberes med IgE-BFs, er de ikke længere i stand til at binde til RPMI 8866-celler, og forholdet mellem celler, som danner rosetter, bliver derfor formindsket. Denne analyse er ikke 10 kvantitativ, den er teknisk vanskelig som følge af variationen i koblingen af IgE til bovine erythrocyter, og den er besværlig, da rosetter skal undersøges under mikroskop, cellelinier skal være permanent tilgængelige, IgE-overtrukne erythrocyter skal fremstilles regelmæssigt 15 osv., således at kun et lille antal analyser (20-40) med rimelighed kan gennemføres af en person på en dag. Ved mere hensigtsmæssig, kvantitativ og lettere gennemførlig analyse anvendes monoklonale antistoffer til lymfocyt FceR, som krydsreagerer med IgE-BFs. Sådanne monoklonale 20 antistoffer er blevet fremstillet af G. Delespesse et al., EP 86810244.3, og hybridomacellelinierne, som danner disse monoklonale antistoffer, er deponeret i Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institute Pasteur, Paris og er tilgængelige under deponeringsnummeret 1-425 25 (klon 208.25 A.4,3/135), 1-420 (klon 208.25 D.2,1/176), 1-451 (klon 207.25 A.4,4/30), 1-452 (klon 207.25 A.4,4/45) og 1-486 (klon 208.25 D 2/94). De tilsvarende monoklonale antistoffer betegnes henholdsvis Mab-135, Mab-176, Mab-30, Mab-45 og Mab-94. De muliggør endvidere en effektiv rens-30 ning af IgE-BFs ved affinitetskromatografi.

Til trods for anvendelsen af de ovenfor omtalte monoklonale antistoffer har det hidtil ikke været muligt at bestemme aminosyresekvensen i et enkelt Ige-BF isoleret fra en naturlig human B-cellelinie. Til terapeutiske 35 formål ville det være særdeles ønskeligt at have et rent, enkelt polypeptid med en defineret aminosyresekvens med den ønskede IgE-bindingsegenskab, og som let kan frem- 4 DK 172259 B1 stilles i store mængder.

Den hurtige udvikling indenfor rekombinant DNA-teknologien i de senere år har tilvejebragt de almene metoder til 5 opnåelse af dette formål. Når polypeptidets struktur ikke er kendt, afhænger successen af rekombinant DNA-teknologien af identifikationen af et mRNA eller et DNA, der koder for det ønskede polypeptid fra en naturlig kilde.

Efter identificering af et mRNA ved hjælp af en egnet 10 analyse, kan der fremstilles et komplementært DNA. cDNA'et kan inkorporeres i en egnet vektor, hvorefter transformering af en egnet vært med den dannede hybridvektor, selektering og dyrkning af de transformerede værter muliggør fremstilling og til sidst isolering af polypeptidet.

15 Isolering af cDNA’et, som koder for det ønskede polypeptid, og sekvensering muliggør bestemmelse af polypeptidets aminosyresekvens. cDNA'et eller dele deraf kan anvendes til at screene mRNA'et eller DNA-genomet fra den naturlige kilde for andre nucleotidsekvenser, som koder 20 for de ønskede polypeptider.

Da strukturerne af IgE-BFs ikke er kendt, er det følgelig formålet med opfindelsen først at identificere et mRNA fra humane B-celler, som koder for det ønskede polypeptid, ved transformering af æg fra Xenopus laevis med fraktioneret 25 mRNA fra B-cel lerne og bestemme de kloner, som indeholder det ønskede mRNA ved en analyse, der udnytter ovennævnte monoklonale antistoffer. Det er endvidere formålet med opfindelsen at fremstille cDNA'er og hybridvektorer, transformationen af egnede værter og til sidst dyrkningen 30 af værterne og isolering af de ønskede polypeptider. Disse er ikke nødvendigvis identiske med de naturligt forekomnmende polypeptider, da der kan forekomme post-translationelle modifikationer efter ekspression af polypeptidet.

5 DK 172259 B1

Formålet med opfindelsen er at tilvejebringe polypeptider beslægtet med IgE-BFs fra humane B-celler, hybridvektorer, der som en insert indeholder en DNA-sekvens, som koder for 5 polypeptiderne, transformerede værter indeholdende hybridvektorerne, RNA- og DNA-molekyler, som koder for polypeptiderne, samt farmaceutiske præparater, der indeholder virksomme mængder af polypeptiderne.

Det er tillige formålet at tilvejebringe fremgangsmåder 10 til fremstilling af polypeptiderne, hybridvektoreme, transformerede værter, RNA- og DNA-molekyler, farmaceutiske præparater og anvendelsen af polypeptiderne.

Yderligere er det formålet med opfindelsen at tilvejebringe en fremgangsmåde til forebyggelse og/eller behandling 15 af allergi ved administration af en effektiv mængde af et polypeptid ifølge opfindelsen relateret til IgE-BFs.

Dette opnås ved fremstillingen af et DNA, som koder for polypeptidet med formlen I og fragmenter deraf.

Polypeptiderne Ifølge opfindelsen 20 Opfindelsen angår et polypeptid med aminosyresekvensen med formlen 6 DK 172259 B1

1 10 20 30 MEEGQYSEIEELPRRRCCRRGTQIVLLGLV

Ί0 50 60

TAALWAGLLTLLLLWHWDTTQSLKQLEERA

ARNVSQVSKNLESHHGDQMAQKSQSTQISQ

100 110 '120

ELEELRAEQQRLKSQDLELSWNLNGLQADL

SSFKSQELNERNEASDLLERLREEVTKL R5M

E L Q V S S G F V C N I C i E K W I Π Q R K C Y Y F G H

TKQWVHARYACDDMEGQLVSIHSPEEQD F™

TKHASHTGSWIGLRNLDLKGEFIWVDGS H^V

250 260 270

DYSNWAPGEPTSRSQGEDCVMMRGSGRWND

A F C D R K 1 G A W V C D R L A I C Η P A S E G S A E S°M

G P D S R P D P D G R L P I p S A P Tå S , (I) 321 et fragment eller et derivat deraf med samme biologiske virkning som polypeptidet.

De enkelte bogstaver i formlen I repræsenterer de nedenfor 5 anførte naturligt forekommende L-aminosyrer.: (A) alanin, (C) cystein, (D) asparaginsyre, (E) glutamin-syre, (F) phenylalanin, (G) glycin, (H) histidin, (I) isoleucin, (K) lysin, (L) leucin, (M) methionin, (N) asparagin, (P) prolin, (Q) glutamin, (R) arginin, (S) 10 serin, (T) threonin, (V) valin, (W) tryptophan, (Y) tyrosin.

Polypeptiderne med formlen I, fragmenter og derivater deraf sammenfattes i den foreliggende beskrivelse under enhedsbetegnelsen "polypeptider ifølge opfindelsen". De er 15 beslægtede med IgE-receptorerne på humane B-celler og, når 7 DK 172259 B1 de ikke har membranforankringsekvensen, med de af Sarfati et al. omtalte IgE-BFs.

Fragmenter af polypeptiderne ifølge opfindelsen udgør dele 5 af det fuldstændige polypeptid med formlen I med mindst 10 og op til 320 på hinanden følgende aminosyrer i en sekvens, som svarer til formlen I. Sådanne fragmenter er f.eks. polypeptider med formlen I, hvori den første aminosyre eller op til ca. 133 aminosyrer fra N-terminalen er 10 slettede. Denne slettede N-terminal er membranforankringssekvensen, som binder polypeptidet til B-cellernes cytoplasmamembran. Andre fragmenter er polypeptider med formlen I, hvor aminosyrer mellem N- og C-terminalen, f.eks. aminosyrer fra ca. 110 til 130, eller aminosyrer 15 ved C-terminalen, f.eks. aminosyrer fra ca. 250 til 321, er slettede.

Opfindelsen angår især et fragment af polypeptidet med formlen I, som er ejendommeligt ved, at aminosyresekven-sen omfattende aminosyrer 106 til 127 er slettet, eller at 20 det er valgt blandt polypeptider, der starter med en vilkårlig af aminosyrerne 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155,156, 157, 158, 159 eller 160 25 og slutter med en vilkårlig af aminosyrerne mellem 282 og 321, fortrinsvis 321.

Et foretrukket fragment af polypeptidet med formlen I er ejendommeligt ved, at det består af aminosyresekvensen fra aminosyre 119 til aminosyre 321.

30 Et andet foretrukket fragment af polypeptidet med formlen I er ejendommeligt ved, at det består af aminosyresekvensen fra aminosyre 134 til aminosyre 321.

Et yderligere foretrukket fragment af polypeptidet med 8 DK 172259 B1 formlen I er ejendommeligt ved, at det består af aminosy-resekvensen fra aminosyre 148 eller 150 til aminosyre 321. Disse to fragmenter kan findes i supernatanter fra RPMI 5 8866-celler og svarer således til naturligt forekommende IgE-BF.

Fragmenterne kan have en methionin knyttet til N-terminalen, især når de er opnået ved ekspression i Escherichia coli.

10 Derivater af polypeptidet ifølge opfindelsen er sådanne, hvor funktionelle grupper, såsom amino-, hydroxyl-, mer-capto- eller carboxylgrupper, er derivatiserede, f.eks. henholdsvis glycosylerede, acylerede, amiderede eller esterificerede. I glycosylerede derivater er et oligo-15 saccharid sædvanligvis bundet til asparagin, serin, threonin og/eller lysin. Acylerede derivater er især acyleret med en naturligt forekommende organisk eller uorganisk syre, f.eks. eddikesyre, phosphorsyre eller svovlsyre, som sædvanligvis finder sted ved den 20 N-terminale aminogruppe, eller ved hydroxygrupper, især i henholdsvis tyrosin eller serin. Estere er dannet med naturligt forekommende alkoholer, f.eks. methanol eller ethanol.

Andre derivater er salte, især farmaceutisk acceptable 25 salte, f.eks. metalsalte, såsom alkalimetalsalte og jordalkalimetalsalte, f.eks. natrium-, kalium-, magnesium-, calcium- eller zinksalte, eller ammoniumsalte dannet med ammoniak eller en egnet organisk amin, såsom en lavalkylamin, f.eks. triethylamin, en hydroxylavalkyl-30 amin, f.eks. 2-hydroxyethylamin, og lignende.

Endvidere kan derivater omfatte polypeptider ifølge opfindelsen med en (punktmutant) eller flere, op til ca.

10, af aminosyrerne ombyttet med en eller flere andre aminosyrer. Denne ombytning kan være en følge af til 9 DK 172259 B1 svarende mutationer på DNA-niveauet, som fører til forskellige kodoner.

Polypeptider med formlen I og fragmenter og derivater der-5 af har biologisk virkning, der omfatter IgE-bindingsakti-vitet, hvilket kan påvises ved rosetinhiberingsanalysen og bindingen til monoklonale antistoffer, f.eks. til Mab-135 og Mab-176, som er specifik for IgE-BFs.

Polypeptiderne ifølge opfindelsen fremstilles ved rekom-10 binant DNA-teknik, der omfatter identifikation af et mRNA, som koder for et sådant polypeptid, fremstilling af et DNA eller cDNA, konstruktion af en cDNA-hybridvektor, transformation af en værtscelle, som tillader ekspressionen af vektoren, og isolering af polypeptiderne.

15 1 overensstemmelse hermed angår opfindelsen endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid med formlen I, et fragment eller et derivat deraf med samme biologiske virkning som polypeptidet, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man 20 a) dyrker en transformeret vært, som indeholder en hybridvektor omfattende en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid med formlen I eller et fragment deraf, eller b) translaterer mRNA'et, som koder for et polypeptid med formlen I eller et fragment deraf, i et passende transla-25 tionssystem, og, om nødvendigt, transformerer et polypeptid med formlen I eller et fragment deraf til et derivat deraf.

a) Transformerede værtsceller vælges blandt prokaryotiske eller eukaryotiske celler, f.eks. bakterier, svampe, 30 f.eks. gærsvampe, eller højere celler, herunder humane cellelinier. Der foretrækkes tilgængelige Escherichia coli-stammer, f.eks. HB 101, BZ 234 eller B1472, eller 10 DK 172259 B1 tilgængelige Saccharomyces cerevisiae-stammer, f.eks. RH971, som transformeres med en hybridvektor, der koder for et polypeptid ifølge opfindelsen og indeholder 5 passende promotor-, forstærker-, markør- og signalsekvenser, og lignende.

De transformerede værtsceller dyrkes under anvendelse af kendte fremgangsmåder, sædvanligvis i et flydende medium, som indeholder assimilerbare kilder for kulstof, nitrogen 10 og uorganiske salte og, om nødvendigt, passende vækstfaktorer.

Til dyrkningen af transformerede prokaryotiske og eukaryo-tiske mikroorganismer kan der anvendes forskellige kulstofkilder. Eksempler på foretrukne kulstofkllder er 15 assimilerbare kulhydrater, f.eks. glucose, maltose, mannitol eller lactose, eller et acetat, som kan anvendes alene eller i egnede blandinger. Eksempler på egnede nitrogenkilder er aminosyrer, proteiner, såsom trypton, pepton eller kødekstrakter, gærekstrakter, maltekstrakter 20 og tillige ammoniumsalte, f.eks. ammoniumchlorid eller ammoniumnitrat, der kan anvendes enten alene eller i passende blandinger.

Mediet indeholder endvidere sporelementer, f.eks. ionerne K+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, 1*03“, S042-, 25 HPO32-, H2PO4-, Cl~, B03~ og Mo042“. Der tilsættes endvi dere fortrinsvis stoffer, som udøver et selektionstryk og forhindrer væksten af celler, som har mistet ekspressionsvektoren. Eksempelvis tilsættes således ampicillin til mediet, hvis hybridekspressionsvektoren indeholder et 30 ampR-gen. Tilsætningen af antibiotiske stoffer har også den virkning, at kontaminerende antibiotikafølsomme mikroorganismer ikke kan overleve. Hvis en gærstamme, som er auxotrop med hensyn til f.eks. en essentiel aminosyre, anvendes som værtsorganismen, indeholder plasmidet for-35 trinsvis et gen, som koder for et enzym, som kompletterer 11 DK 172259 B1 værtsdefekten. Dyrkningen af gærstammen gennemføres 1 et minimalmedium, som mangler denne aminosyre.

Celler fra hvirveldyr dyrkes under vævsdyrkningsbetingel-5 ser under anvendelse af kommercielt tilgængelige medier (f.eks. Gibco, Flow Laboratories), som i de fleste tilfælde er tilsat serum fra et pattedyr. Cellerne dyrkes i stor målestok enten fæstnet på et fast bæremateriale, såsom rulleflasker, mikrobærematerialer eller porøse 10 glasfibre, eller de kan dyrkes som fritflydende celler i egnede dyrkningsbeholdere.

Dyrkningen gennemføres under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder. Dyrkningsbetingelserne, såsom temperatur, mediets pH-værdi og fermenteringstiden, vælges 15 således, at der opnås en maksimal koncentration af polypeptidet ifølge opfindelsen. En Escherichia coli-stamme eller en gærstamme dyrkes således fortrinsvis under aerobe betingelser i submers kultur under rystning eller omrøring ved en temperatur på fra ca. 20 til ca. 40*C, 20 fortrinsvis ved ca. 30eC, og ved en pH-værdi på 4-8, fortrinsvis ved en pH-værdi på ca. 7, i fra ca. 4 til ca.

30 timer, fortrinsvis indtil der er opnået maksimale udbytter af polypeptidet Ifølge opfindelsen.

b) mRNA'et, som koder for et polypeptid ifølge opfindel-25 sen, kan translateres og udtrykkes i et passende translationssystem, f.eks. oocyterne fra Xenopus laevis. mRNA, som koder for polypeptiderne Ifølge opfindelsen, mikroin-jiceres i oocyter fra hunfrøen Xenopus laevis. De transformerede oocyter inkuberes i Barth-opløsning tilsat FCS 30 ved ca. 20°C i ca. 45 timer. Efter fjernelse af inkuberingsmediet homogeniseres oocyterne i oocytlyse-ringspuffer og centrifugeres. Supernatanten indeholder polypeptiderne ifølge opfindelsen, hvilket kan påvises ved en RIA-analyse under anvendelse af monoklonale 35 antistoffer. Denne fremgangsmåde til fremstilling af 12 DK 172259 B1 polypeptiderne Ifølge opfindelsen er hovedsagelig nyttig til identifikationsformål.

Når koncentrationen af polypeptidet ifølge opfindelsen har 5 nået en maksimumværdi, afbrydes dyrkningen, og polypeptidet kan isoleres. Hvis polypeptidet er fusioneret med en egnet signalpeptidsekvens, udskilles det fra cellerne direkte til supernatanten. I modsat fald er det nødvendigt at nedbryde cellerne, f.eks. ved behandling med et 10 detergent, såsom SDS eller "triton", eller cellerne lyseres med lysozym eller et enzym med lignende virkning.

Hvis gær anvendes som værtsmikroorganisme kan cellevæggen fjernes ved enzymatisk nedbrydning med en glucosidase. Der kan eventuelt eller yderligere anvendes mekaniske kræfter, 15 såsom forskydningskræfter (f.eks. X-presse, fransk presse, Dyno-mølle) eller rystning med glasperler eller aluminiumoxid eller skiftevis frysning, f.eks. i flydende nitrogen, og optøning, samt udtralydsbehandling til oplukning af cellerne. Proteinerne i cellesupernatanten 20 eller blandingen opnået ved oplukning af cellerne, herunder polypeptiderne ifølge opfindelsen, opkoncentreres under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder, især ved polyethyleniminbehandling, centrifugering og fældning med salte, f.eks. ammoniumsulfat eller zinksalte.

25 Andre rensningstrin er f.eks. ultracentrifugering, diafiltrering, gelelektroforese, kromatografiske fremgangsmåder, såsom ionbytterkromatografi, størrelsesudelukkelseskromatografi, højtryksvæskekromatografi (HPLC), HPLC med omvendt fase, hurtigtrykvæskekroraatografi 30 (FPLC) og lignende, adskillelse af bestanddelene i blandingen efter molekylstørrelse ved hjælp af en egnet gelfiltreringssøjle, dialyse, affinitetskromatografi, f.eks. affinitetskromatografi under anvendelse af antistoffer, især monoklonale antistoffer, specielt Mab-135 og 35 Mab-179, og andre kendte fremgangsmåder.

13 DK 172259 B1

Ved en foretrukken udførelsesform isoleres polypeptiderne ifølge opfindelsen fra cellesupernatanterne ved filtrering af supernatanten gennem en monoklonal antistofaffigel, 5 f.eks. Mab-45-affigel, eluering af det bundne IgE-BF-poly-peptid, f.eks. med en 0,1 M glycin-HCl-puffer med pH-værdi 2,6, påsætning af fraktionerne indeholdende det ønskede polypeptid på en anionbyttersøjle, f.eks. "SynChropak" AX300, vaskning af søjlen, f.eks. med en Tris-HCl-puffer, 10 pH 7,4, eluering af proteinet, f.eks. med en natriumchlor-idopløsning, såsom 1 M natriumchloridopløsning, dialysering og lyofilisering af fraktionerne, som indeholder det ønskede polypeptid, kromatografi med omvendt fase af de dialyserede fraktioner, f.eks. på en "SynChropak" RP-4-15 søjle og eluering af det ønskede polypeptid, f.eks. med acetonitril/0,1% TFA-gradient.

Denne fremgangsmåde er særlig velegnet til rensning af naturlig IgE-BF fra RPMI 8866 cellesupernatanter. Det naturlige IgE-BF renset ved denne fremgangsmåde er til-20 strækkelig rent til en aminosyresekvensering, som viser, at det består af 2 proteiner med følgende N-terminale aminosyresekvenser: me H9 155 160 163

LXMELQVXSGFVXNTXP

og 150 151 160 163 MXLQV S S GFVXNTXPEK.

Nummereringen svarer til nummereringen i formlen I.

25 Aminosyrerne betegnet med et X er ikke blevet bestemt. Ved sammenligning med DNA-sekvenserne med formlen II eller III kan der imidlertid gives følgende betegnelser: X149 =R, x151 = E, x155 S, Χχ60 = c> X163 = c· Analysen gør det muligt at slutte, at naturlig IgE-BF består af mindst to 30 polypeptider med aminosyresekvenserne fra L^g til S321 og m150 til S321 (formel I), og som forekommer i et forhold på ca. 40:60.

DK 172259 B1 14

Endelig kan IgE-bindingsaktiveteten fra det Isolerede protein bestemmes ved anvendelse af kendte fremgangsmåder, f.eks. ved anvendelse af rosetinhiberingsanaly-5 serne, blokeringen af IgE-binding til anti-IgE-antistof-fer, affinitetskromatografiforsøg og forsøg, hvor man måler undertrykkelsen af den forekommende in vitro IgE-syntese ved hjælp af lymfocyter fra allergiske individer.

Polypeptiderne ifølge opfindelsen, som har den korrekte 10 sekvens men den forkerte tredimensionelle foldning, er nyttige som intermediater i renatureringsforsøg.

Opfindelsen angår også et polypeptid med formlen I, et fragment eller et derivat deraf, som er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

15 Opfindelsen angår også en flertrinsfremgangsmåde til fremstilling af en transformeret vært, som kan udtrykke et polypeptid ifølge opfindelsen, og fremgangsmåden er ejendommelig ved, at man 1. fremstiller et DNA, som koder for et polypeptid med 20 formlen 1, et fragment eller derivat deraf med samme biologiske vrkning som polypeptidet, 2. inkorporerer det dannede DNA i en passende vektor, 3. transformerer en egnet vært med den dannede hybridvektor, og 25 4. selekterer de transformerede værter fra utransforme- rede værter og, om ønsket, isolerer hybridvektoren fra den transformerede vært, modificerer kodningsområdet eller det ikke-kodende område i hybridvektoren og gennemfører trin 3 og 4 igen.

15 DK 172259 B1

De enkelte trin, som indgår i fremstillingen af værterne, beskrives mere detaljeret i det følgende. Opfindelsen angår også de enkelte trin.

5 1. Fremstilling af et DNA, som koder for et polypeptid ifølge opfindelsen

Opfindelsen angår et DNA, som koder for et polypeptid med formlen I, et fragment eller et derivat deraf samt fremgangsmåder til deres fremstilling.

10 DNA'et, som koder for et polypeptid ifølge opfindelsen, kan opnås ved a) revers transskription af isoleret mRNA til cDNA, b) isolering fra genomisk DNA eller c) ved kemisk syntese.

Da DNA-strukturen ikke var kendt, var det ved den forelig-15 gende opfindelse nødvendigt at fremstille DNA’et fra genomisk DNA eller et cDNA-bibliotek via mRNA*et. Et cDNA-bib-liotek omfatter den genetiske information, som er komplementær til mRNA'et isoleres fra celler.

a) Revers transskription af isoleret mRNA til cDNA

20 Til opnåelse af et cDNA-bibliotek isoleres mRNA'et fra celler, som udtrykker IgE-bindingsaktivitet, især humane B-celler, og cellelinier afledt deraf. Dette mRNA omdannes til dobbeltstrenget cDNA. En foretrukken human B-celle-linie er RPMI 8866. Andre nyttige B-cellelinier kan frem-25 stilles ved immortalisering af naturlige B-celler med Epstein-Barr-virus. Velkendte standardmetoder anvendes til fremstillingen af mRNA. Cellemembranen brydes, og celleindholdet frigøres, hvorefter mRNA'et isoleres. Cellemembranen brydes fortrinsvis ved fysiske metoder eller ved 30 lysering med detergenter, såsom SDS, guanidiniumthiocya-nat, fastlagte saltbetingelser eller homogenisering, fortrinsvis ved blanding. mRNA'et isoleres under anvendelse 16 DK 172259 B1 af standardmetoder, såsom phenolekstraktlon, ethanolfældning, centrifugering og kromatografi, fortrinsvis en kombination af flere metoder. Centrifugering gennemføres for-5 trinsvis over gradienter, f.eks. over en CsCl-gradient.

Til kromatografi anvendes fortrinsvis søjler, især oligo-dT-søjler.

Det totale mRNA kan omdannes direkte til ds-cDNA under anvendelse af kendte fremgangsmåder. Fortrinsvis 10 opkoncentreres mRNA'et, som koder for et polypeptid ifølge opfindelsen, yderligere under anvendelse af forskellige teknikker, såsom elektroforese, kromatografi og centrifugering, fortrinsvis saccharosegradientcentrifugering.

Fraktioner, som indeholder mRNA, der koder for et 15 polypeptid ifølge opfindelsen, kan påvises på forskellig måde, f.eks. som in vivo- eller in vitro-translation efterfulgt af påvisning af IgE-bindingsfaktoraktivitet eller, nu da nucleotidsekvensen er kendt, ved hybridise-ring med en oligonucleotidprobe.

20 In vivo-translationssystemerne kan være prokaryotiske eller eukaryotiske systemer. Et foretrukket in vivo-trans-lationssystem er Xenopus laevis oocyt-systemet beskrevet af Maniatis et al. (1). In vitro-systemer er f.eks. hvedekimlysater og kaninreticulocytlysater, som begge er 25 kommercielt tilgængelige.

I påvisningsystemer til screening for IgE-bindingsfaktoregenskab anvendes fortrinsvis monoklonale antistoffer mod polypeptidet med formlen I, især Mab-135 eller Mab-176. 1 et andet brugbart system anvendes immunoglobuliner af IgE-30 typen i konventionelle immunanalyser.

Fra en vilkårlig mRNA-pool afledt af ikke-fraktioneret eller fraktioneret mRNA kan ds-cDNA fremstilles under anvendelse af kendte fremgangsmåder. Foretrukne generelle 17 DK 172259 B1 fremgangsmåder er beskrevet af Maniatis et al. (1),

Okayama og Berg (2) og Heidecker et al. (3). Sædvanligvis omdannes mRNA'et først til ss-cDNA under anvendelse af 5 enzymreverstransskriptase og derpå til dobbeltstrenget cDNA under anvendelse af enzymernes reverstransskriptase eller DNA-polymerase I (Klenow-fragment). Ved den foreliggende opfindelse gennemføres dette fortrinsvis i overensstemmel- se med fremgangsmåden beskrevet af 10 Maniatis et al. (1). Der kan eventuelt anvendes to andre fremgangsmåder til priming af fremstillingen af ds-cDNA'et. Ved den første metode anvendes den naturlige sløjfedannelse (loop formation) af ss-cDNA’et. Ved den anden metode gennemføres såkaldt "tailing" af ss-cDNA*et 15 med en homopolymertail, såsom poly-dC eller poly-dT.

mRNA-fraktionen, hvor det tilsvarende polypeptid udviser den kraftigste aktivitet i detektionssystemet, transskriberes til det komplementære cDNA under anvendelse af kendte fremgangsmåder. mRNA'et og oligo-dt som primer 20 blandes. Derpå tilsættes dNTP'er som udgangsmateriale, og syntesen af cDNA-mRNAhybridmolekylet gennemføres ved hjælp af enzymreverstransskriptase. RNA-molekylerne spaltes ved tilsætning af NaOH. DNA-Polymerase tilblandes, fortrinsvis Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I, og blandingen 25 inkuberes ved en passende temperatur, fortrinsvis 12-15°C. Blandingen inkuberes med nuclease SI og ds-cDNA'et svarende til mRNA'et, som koder for et polypeptid ifølge opfindelsen, opnås.

Til forstærkning og strukturtydeliggørelse splejses det 30 dannede ds-cDNA til en egnet vektor, f.eks. plasmidet pUC-KO, og den dannede hybridvektor formeres ved anvendelse af en egnet vært, f.eks. Escherichia coli HB-101, hvilket beskrives mere detaljeret i det følgende. Reisolering af hybridvektorerne og udvinding af det 35 indsatte cDNA derfra tillader en strukturbestemmelse af DNA'et, som koder for et polypeptid ifølge opfindelsen.

18 DK 172259 B1

De opnåede hybridvektorer pCL-2 og pCL-1 indeholder inserter med formlerne henholdsvis II og III. pCL-2-cDNA-insertet har sekvensen med formlen II: AATCGCTCTGGTC1GACCCCAACACA -145 -140 -130 CTAGGAGGACAGACACAGGCTCCAAACTCCACTAACCAGAGCTGTGATTGTGCCCGCTGA -120 -110 -100 -90 -80 -70 GTGGACTGCGTTGTCAGGGAGTGAGTGCTCCATCATCGGGAGAATCCAAGCAGGACCGCC -60 -50 -40 -30 -20 -10 -1 1 20 MEEGQY SEIEELPRRRCCRR ATGGAGGAAGGTCAATATTCAGAGATCGAGGAGCTTCCCAGGAGGCGGTGTTGCAGGCGT 1 10 20 30 40 50 60 30 40 GTQIVLLGLVTAALWAGLLT GGGACTCAGATCGTGCTGCTGGGGCTGGTGACCGCCGCTCTGTGGGCTGGGCTGCTGACT 70 80 90 100 110 120 50 60 LLLLWHWDTTQSLKQLEERA CTGCTTCTCCTGTGGCACTGGGACACCACACAGAGTCTAAAACAGCTGGAAGAGAGGGCT 130 140 150 160 170 180 70 80 ARNVSQVSKNLESHHGDQMA GCCCGGAACGTCTCTCAAGTTTCCAAGAACTTGGAAAGCCACCACGGTGACCAGATGGCG 190 200 210 220 230 240 90 100 QKSQSTQI SQELEELRAEQQ CAGAAATCCCAGTCCACGCAGATTTCACAGGAACTGGAGGAACTTCGAGCTGAACAGCAG 250 260 270 280 290 300 110 1Z0 RLKSQDLELSWNLNGLQA DL AGATTGAAATCTCAGGACTTGGAGCTGTCCTGGAACCTGAACGGGCTTCAAGCA1GATCTG 310 320 330 340 350 ϋ 360 130 140 SSFKSQELNERNE ASDLLER AGCAGCTTCAAGTCCCAGGAATTGAACGAGAGGAACGAA1GCTTCAGATTTGCTGGAAAGA 370 380 390 400 410 420 150 160 LREEVTKLRMELQVSSGFVC CTCCGGGAGGAGGTGACAAAGCTAAGGATGGAGTTGCAGGTGTCCAGCGGCTTTGTGTGC 430 440 450 460 470 480 170 180 NTCPEKWINFQRKCYYFGKG AACACGTGCCCTGAAAAGTGGATCAACTTCCAACGGAAGTGCTACTACTTCGGCAAGGGC 490 500 510 520 530 540 19 DK 172259 B1 190 200 TKQWVHARYACDDMEGQLVS ACCAAGCAGTGGGTCCACGCCCGGTATGCCTGTGACGACATGGAAGGGCAGCTGGTCAGC 550 560 570 580 590 600 210 220 IHSPEEQDFLXKHASHTGSW ATCCACAGCCCGGAGGAGCAGGACTTCCTGACCAAGCATGCCAGCCACACCGGCTCCTGG 610 620 630 640 650 660 210 2 tt 0 IGLRNLDLKGEFIWVDGSHV AITGGCCTICGGAACTTGGACCIGAAGGGAGAGXTIAICXGGGTGGAIGGGAGCCAIGTG 670 680 690 700 710 720 250 260 DYSNWAPGEPXSRSQGEDCV GACTACAGCAACTGGGCTCCAGGGGAGCCCACCAGCCGGAGCCAGGGCGAGGACTGCGTG 730 740 750 760 770 780 270 280 MMRGSGRWNDAFCDRKLGAW ATGATGCGGGGCTCCGGTCGCTGGAACGACGCCTICTGCGACCGTAAGCTGGGCGCCTGG 790 800 810 820 830 840 290 300 VCDRLATCTPPASEGSAESM GTGTGCGACCGGCTGGCCACATGCACGCCGCCAGCCAGCGAAGGTTCCGCGGAGTCCATG 850 860 870 880 890 900 310 120

GPDSRPDPDGRLPTPSAPLH

GGACCXGAXICAAGACCAGACCCIGACGGCCGCCIGCCCACCCCCICIGCCCCICICCAC· 910 920 930 940 950 960

S

TCXXGAGCAXGGAXACAGCCAGGCCCAGAGCAAGACCCXGAAGACCCCCAACCACGGCCX 970 980 990 1000 1010 1020 AAAAGCCTCXXTGTGGCTGAAAGGTCCCTGTGACAXTXXCXGCCACCCAAACGGAGGCAG 1030 1040 1050 1060 1070 1080 CIGACACAXCXCCCGCXCCTCXAIGGCCCCTGCCXXCCCAGGAGT1ACACCCCAACAGCAC 1090 1100 1110 1120 R 1130 1140 CCICICCAGAIGGGAGIGCCCCCAACAGCACCCICICCAGAIGAGAGI1ACACCCCAACAG 1150 1160 1170 1180 1Ϊ90 1200 CACCCICICCAGAIGCAGCCCCAICTCCICAGCACCCCAGGACCTGAGXATCCCCAGCIC 1210 1220 1230 1240 1250 1260 AGGGIGGXGAGXCCTCCIGICCAGCCXGCAICAAIAAAAIGGGGCAGTGATGGCC 1270 1280 1290 1300 1310 1315 I DNA-sekvensen med formlen II er kodningsområdet for polypeptidet med formlen I markeret ved hjælp af amino-syresymbolerne. De ikke-kodende sideregioner udgør også 5 dele af den ikke-kodende region af det isolerede mRNA. Restriktionsstederne ά OST ά er vist.

20 DK 172259 B1

Det andet cDNA opnået fra mRNA'et har den nedenfor anførte sekvens med formlen III, hvor nucleotiderne, som koder for aminosyrer 106 til 127 i polypeptidet med formlen I, dvs.

5 nucleotider 316 til 378 i formlen II, er slettede, og hvor i øvrigt kodningsområdet og en del af de to sidesekvenser er identiske med DNA-sekvensen med formlen II. cDNA-Insertet er fundet i pCL-1 og har sekvensen med formlen III:

CTAACCACGCTAGTGAGTCAGATTGTAGACTAAACAAAATCAGCCAA

-227 -220 -210 -200 -190

ATCGGCCCCTGAGTGCCACCAAGTCCCAGATGCTATCCTGTCCTGGTAACTAGGGTTTGA

-180 -170 -160 -150 -140 -130

TGGCTCACCCTAACCATCATTAAATTCCAAATCAGCCAGAGCTGTGATIGTGCCCGCTGA

-120 -110 -100 -90 -80 -70

GTGGACTGCGTTGTCAGGGAGTGAGTGCTCCATCATCGGGAGAATCCAAGCAGGACCGCC

-60 -50 -40 -30 -20 -10 -1 1 10 20 MEEGQYSEIEELPRRRCCRR ATGGAGGAAGGTCAATATTCAGAGATCGAGGAGCTTCCCAGGAGGCGGTGTTGCAGGCGT 1 10 20 30 40 50 60 30 <»0 GTQIVLLGLVTAALWAGLLT GGGACTCAGATCGTGCTGCTGGGGCTGGTGACCGCCGCTCTGTGGGCTGGGCTGCTGACT 70 80 90 100 110 120 SO 60 LLLLWHWDTTQSLKQLEERA CTGCTTCTCCTGTGGCACTGGGACACCACACAGAGTCTAAAACAGCTGGAAGAGAGGGCT 130 140 150 160 170 180 70 80 ARNVSQVSKNLESHHGDQMA GCCCGGAACGTCTCTCAAGTTTCCAAGAACTTGGAAAGCCACCACGGTGACCAGATGGCG 190 200 210 220 230 240 90 100 QKSQSIQI SQELEELRAEQQ CAGAAATCCCAGTCCACGCAGATTTCACAGGAACTGGAGGAACTTCGAGCTGAACAGCAG 250 260 270 280 290 300 110 120 RLKSQELNERNEAS DLLERL AGATTGAAATCTCAGGAATTGAACGAGAGGAACGAAGCTTCAGATTTGCTGGAAAGACTC 310 320 330 340 350 360 130 1V0 REEVTKLRMELQVSSGFVCN CGGGAGGAGGTGACAAAGCTAAGGATGGAGTTGCAGGTGTCCAGCGGCTTTGTGTGCAAC 370 380 390 400 410 420 21 DK 172259 B1 150 160 TCPEKWINFQRKCYYFGKGT ACGTGCCCTGAAAAGTGGATCAACTTCCAACGGAAGTGCTACTACTTCGGCAAGGGCACC 430 440 450 460 470 480 170 180 KQWVHARYACDDMEGQLVS I AAGCAGTGGGTCCACGCCCGGTATGCCTGTGACGACATGGAAGGGCAGCTGGTCAGCATC 490 500 510 520 530 540 190 200 HSPEEQDFLTKHASHTGSWI CACAGCCCGGAGGAGCAGGACTTCCTGACCAAGCATGCCAGCCACACCGGCTCCTGGATT 550 560 570 580 590 600 210 220 GLRNLDLKGEFIWVDGSHVD GGCCTTCGGAACTTGGACCTGAAGGGAGAGTITATGTGGGTGGATGGGAGCCATGIGGAC 610 620 630 640 650 660 230 290 YSNWAPGEPTSRSQGEDCVM TACAGCAACTGGGCTCCAGGGGAGCCCACCAGCCGGAGCCAGGGCGAGGACTGCGTGATG 670 680 690 700 710 720 250 260 MRGSGRWNDAFCDRKLGAWV ATGCGGGGCTCCGGTCGCTGGAACGACGCCTTCTGCGACCGTAAGCTGGGCGCCTGGGTG 730 740 750 760 770 780 270 280 CDRLATCTPPASEGSAESMG TGCGACCGGCTGGCCACATGCACGCCGCCAGCCAGCGAAGGTTCCGCGGAGTCCATGGGA 790 800 810 820 830 840 290 300 PDSRPDPDGRLPTPSAPLHS CCTGATTCAAGACCAGATCCTGACGGCCGCCTGCCCACCCCCTCTGCCCCTCTCCACTCT 850 860 870 880 890 900 TGAGCATGGATACAGCCAGGCCCAGAGCAAGACCCTGAAGACCCCCAACCACGGCCTAAA 910 920 930 940 950 960 AGCCTCTTTGTGGCTGAAAGGTCCCTGTGACATTTTCTGCCACCCAAACGGAGGCAGCTG 970 980 990 1000 1010 1020 ACACATCTCCCGCTCCTCTATGGCCCCTGCCTTCCCAGGAGTACACCCCAACAGCACCCr 1030 1040 1050 1060 1070 1080

CTCCAGATGGGAGTGCCCCCAACAGCACCCTCTCCAGATGAGAGTACACCCCAACAGCAC

1090 1100 1110 1120 1130 1140 CCTCTCCAGATGCAGCCCCATCTCCTCAGCACCCCAGGACCTGAGTATCCCCAGCTCAGG 1150 1160 1170 1180 1190 1200 GTGGTGAGTCCTCCTGTCCAGCCTGCATCAATAAAATGGGGCAGTGATGGCC 1210 1220 1230 1240 1250 22 DK 172259 B1 b) En anden egnet metode til fremstilling af DNA'et, som koder for et polypeptid ifølge opfindelsen, består i isolering af DNA'et fra det genomiske DNA fra væv eller en 5 cellekultur. Cellerne lyseres, fortrinsvis med SDS og proteinase K, og DNA'et deproteiniseres ved gentagen phenolekstraktion. RNA'et spaltes fortrinsvis med RNAse.

Det opnåede rå DNA spaltes delvis med passende restriktionsenzymer, f.eks. HaelII og Alul, og fragmenter på 10 15-20 Kb isoleres og formeres i en egnet fag eller et cosmid, f.eks. i Charon 4A eller EMBL-3-fag, og analyseres fra de ønskede sekvenser, f.eks. med en radioaktivt mærket DNA-probe eller på anden måde som beskrevet ovenfor.

c) En tredje fremgangsmåde til fremstilling af DNA'et, 15 som koder for et polypeptid ifølge opfindelsen, er kemisk syntese. Kemisk syntese af DNA er beskrevet i oversigtsform af S.A. Narang (4). De kendte synteseteknikker tillader fremstillingen af polynucleotider med op til 40 eller 60 baser i godt udbytte, stor renhed og i løbet af 20 relativ kort tid. Passende beskyttede nucleotider sammenkædes ved hjælp af phosphodiestermetoden ifølge K.L. Agarwal et al. (5), phosphotriestermetoden ifølge C.B. Reesem (6) eller phosphittriestermetoden ifølge R.L. Letsinger et al. (6a). Forenkling af syntesen af 25 oligonucleotiderne og polynucleotiderne er mulig ved anvendelse af fastfasemetoden, ved hvilken nucleotidkædeme bindes til en egnet polymer. Der anvendes med fordel en DNA-syntesemaskine.

Det faktiske dobbeltstrengede DNA kan opbygges enzymatisk 30 ud fra kemisk fremstillede korte men overlappende segmen ter. Ifølge Khorana et al. (7) anvendes eksempelvis overlappende polynucleotidsekvenser fra begge DNA-strenge, som holdes sammen i den korrekte stilling ved baseparring og derpå bindes kemisk ved hjælp af enzym-DNA-ligasen. En 35 anden mulighed omfatter inkubering i hvert tilfælde af en polynucleotidsekvens fra de to DNA-strenge med et kort 23 DK 172259 B1 overlappende segment 1 nærværelse af de fire nødvendige deoxynucleosidtriphosphater med en DNA-polymerase, f.eks. DNA-polymerase I, Klenow-fragmentet af polymerase 1 eller 5 T4-DNA-polymerase, eller med revers transskrlptase. De to polynucleotldsekvenser holdes sammen 1 den korrekte stilling ved baseparring og tilføres de nødvendige nucleotider ved hjælp af enzymet til dannelse af et komplet dobbeltstrenget DNA, jf. S.A. Narang et al. (8).

10 d) Fremstilling af DNA’er, som koder for et fragment af polypeptidet med formlen I

DNA'er, som koder for et fragment af polypeptidet med formlen I, fremstilles ved, at DNA'et med formlen II eller III, eller en vektor indeholdende dette DNA, spaltes med 15 et egnet restriktionsenzym og/eller en egnet exonuclease og, om nødvendigt, sættes der til det opnåede DNA-fragment et DNA-fragment fremstillet ved hjælp af kemiske fremgangsmåder, eller det ønskede fragment fremstilles fuldstændigt ved hjælp af kemiske fremgangsmåder.

20 Egnede restriktionsenzymer og deres restriktionssteder er vist i formlen II. Til fremstilling af DNA-fragmenter, som koder for polypeptidsekvensen D^g til S321 i formlen I er Bgl II og Rsa I egnede. DNA-fragmentet, som koder for polypeptidsekvensen A134 til S321 kan opnås ved restrik-25 tion med Hindlll og Rsal (se formlen II, fig. 4). Fremstillingen af DNA-fragmenterne kan også gennemføres trinvis, idet der først fremstilles et større DNA-fragment, f.eks. ved restriktion med Hindi og Rsal, hvorpå dette subkiones i en egnet vektor, som derefter skæres med Bglll 30 og derpå BamHI, eller Hindlll, jf. fig. 3 og 4.

Den kemiske syntese, enten total eller partiel, i kombination med anvendelsen af restriktionsenzymer og/eller exonucleaser, tillader fremstillingen af et vilkårligt ønsket DNA-fragment omfattet af formlen II.

24 DK 172259 B1

Opfindelsen angår endvidere DNA-fragmenter af DNA'et med formlen II. Fragmenterne koder enten for et polypeptid med IgE-bindingsaktivitet eller kan anvendes som prober til 5 identificering af sådant DNA fra naturlige eller syntetiske kilder. Foretrukne DNA-fragmenter er sådanne, som koder for de foretrukne polypeptidfragmenter omfattet af formlen I. DNA-prober har mindst 7, fortrinsvis ca. 15 nucleotider i sekvens.

10 2. Fremstilling af en hybridvektor

En hybridvektor ifølge opfindelsen fremstilles ved at et DNA, som koder for et polypeptid med formlen I, et fragment, en mutant eller et derivat deraf, splejses til en egnet vektor.

15 Egnede vektorer er bærere for integreret passenger-DNA, som kan anvendes til transformering af en værtsmikroorganisme, inklusive humane celler, og som kan replike-re i værten. Som vektorer kan anvendes plasmider, fager eller cosmider. Egnede vektorer bærer det indsatte DNA i 20 en bestemt stilling.

Sædvanligvis indeholder sådanne vektorer en replikon og en kontrolsekvens, dvs. en promotor, som er afledt af arter, som er forenelige med værtscellen, hvori de anvendes. Vektoren bærer sædvanligvis et replikonsted samt sekvenser 25 (markørgener), som kan tilvejebringe phenotypeselektion i transformerede celler. Egnede markørgener bibringer f.eks. resistens mod antibiotika eller tungmetaller til værten, eller de kompletterer en gendefekt hos værten. Andre nyttige sekvenser i sådanne vektorer er forstærker- og 30 aktivatorsekvenser.

Startvektorerne er egnede til anvendelse i værtsceller valgt blandt et bredt spektrum af prokaryotiske og euka-ryotiske organismer. Vektoren vælges afhængigt af de 4 25 DK 172259 B1 værtsceller, som skal anvendes til transformeringen.

Foretrukne startvektorer er plasmid DNA'er og bakteriofag DNA'er, som er tilgængelige. Især anvendes plasmidet 5 pBR322 og derivater deraf. Sådanne derivater er f.eks. plasmiderne pUC-8, pUC-9, pMB-9, pGEM™-l og pGEM™-2. Blandt bakteriofagvektorerne foretrækkes DNA'eme fra x-fagerne, f.eks. DNA'et fra x-fag gt-11. Andre egnede fagvektorer er Charon 4A og EMBL-3-fagen. x-Kloningssy-10 stemerne er beskrevet af Maniatis et al. (1).

En vektor, som bærer en passenger DNA, f.eks. med formlen II eller III, betegnes som hybridvektor.

Det opnåede DNA splejses til startvektoren ved anvendelse af konventionelle fremgangsmåder.

15 Et startpiasmid lineariseres eksempelvis først ved hjælp af et egnet restriktionsenzym, f.eks. plasmidet pUC-KO ved hjælp af Pstl, hvorpå det d/G-tailes i nærværelse af dGTP og terminal deoxynucleotidyltransferase. Det dobbeltstrengede cDNA-insert dC-tailes i nærværelse af dCTP og 20 terminal deoxynucleotidyltransferase. Ved kombination af cDNA og vektor opnås hybridvektoren. Bakteriofager, såsom X, foretrækkes til konstruktion af genom-biblioteker.

X-Kloningssystemerne er beskrevet af Maniatis et al. (1).

Det egnede vektor-DNA spaltes fuldstændigt med det 25 passende restriktionsenzym, og de venstre og højre arme isoleres fra centralfragmenterne ved hjælp af hastighedsgradientcentrifugering eller gelelektroforese. En anden fremgangsmåde er at spalte dele af stufferfragmenterne med restriktionsenzymer, som mangler genkendelsessteder i den 30 venstre og den højre arm. Det isolerede genomiske DNA spaltes delvis til fragmenter med en længde på 15-20 kb. Derefter ligeres armene med fragmenterne af fremmed DNA som har ender, der er forenelige med armenes ender.

26 DK 172259 B1

Det egnede DNA insert reklones fra den oprindelige vektor anvendt til den oprindelige kloning til en egnet ekspressionsvektor. Til dette formål anvendes passende restrik-5 tionsenzymer (fig. 3 og 4), eventuelt i kombination med exonucleaser, især Bal31, til dannelse af de ønskede DNA-fragmenter. Disse fragmenter integreres i en passende ekspressionsvektor ved direkte anvendelse af de kohæsive ender eller ved addition af passende kemisk syntetiserede 10 nucleotidbroer. Til modifikation af enderne kan eksempelvis anvendes Hindlll og Bglll. Fremgangsmåden er ikke begrænset til disse specielle restriktionsenzymer. En vilkårlig ønsket binding kan etableres mellem ekspressionsvektoren og DNA insertet ved anvendelse af egnede 15 restriktionsenzymer i kombination med kemisk fremstillede oligonucleotider.

Opfindelsen angår også en hybridvektor, som omfatter et DNA, der koder for et polypeptid med formlen I, et fragment eller et derivat deraf med samme biologiske virkning 20 som polypeptidet, operativt bundet til en ekspressionskontrolsekvens .

Til ekspressionen anvendes en egnet hybridekspressionsvektor. Udtrykket hybridekspressionsvektor indbefatter særlige vektorer, som er i stand til at udtrykke DNA-25 sekvenser indeholdt deri, hvor sådanne sekvenser er opera-belt bundet til andre sekvenser, som er i stand til at gennemføre deres ekspression, dvs. operator-, forstærker-og promotorsekvenser. Samlet er ekspressionsvektorer karakteriseret ved en funktionel definition: en hvilken 30 som helst DNA-sekvens, som er i stand til at gennemføre ekspression af den specificerede DNA-sekvens anbragt deri. Opfindelsen omfatter alle former for hybridekspressionsvektorer, som kan fremstilles ud fra en kendt ekspressionsvektor og funktionelle ækvivalenter indeholdende DNA 35 inserterne, som koder for et polypeptid ifølge opfindelsen.

27 DK 172259 B1

Adskillige ekspressionskontrolsekvenser kan anvendes til regulering af genekspressionen, de mikrobielle ekspressionsvektorer indeholder normalt promotorer, som anvendes 5 af mikroorganismeværten til ekspression af dens egne proteiner. De promotorer, som oftest anvendes i rekombinant-DNA-konstruktioner, indbefatter β-lactamase og laet osepromotor sy s ternerne, jf. Chang et al. (9), Goeddel et al. (10), tryptophan-(trp)-promotorsystemet, 10 jf. Goeddel et al (11) eller et bakteriofagpromotorsystem, såsom -promotoren fra X. Selv om disse er de mest almindeligt anvendte, har man andre mikrobielle promotorer, som kan anvendes, og detaljer vedrørende deres nucleotidsekvenser er blevet offentliggjort, hvilket 15 muliggør for fagmanden at ligere disse funktionelt med plasmidvektorer, jf. Siebenlist et al. (12). I princippet er alle vektorer, som kan replikere og udtrykke polypeptide rne ifølge opfindelsen i den valgte vært, egnede. Eksempler på vektorer, som er egnede til udtrykkeisen af 20 polypeptiderne, er plasmiderne pKK223-3, pDR720 og pPL-X eller vektorerne fra bakteriofagen x, såsom λ-gtll, der alle er kommercielt tilgængelige (Pharmacia, Sverige, Promega Biofec, USA). De foretrukne vektorer ifølge opfindelsen er ekspressions- og sekretionsvektorer af 25 typen plN-ompA (Gharayeb et al. (13)) og vektorer indeholdende PL-promotoren.

Vektorer, som er egnede til replikation og ekspression i gær, indeholder en eller flere, f.eks. to, gærreplikon-startere og en eller flere selektive genetiske markører 30 for gær. Hybridvektorer, som indeholder en gærreplikonstart, f.eks. et kromosomalt autonomt replicerende segment (ars 1) eller 2μ ori, tilbageholdes ekstrakromosomalt i gærcellen efter transformationen og replikeres autonomt. Egnede markørgener for gær er især 35 sådanne, som tilvejebringer antibiotisk resistens i værten eller, i tilfælde af auxotrope gærmutanter, gener, som kompletterer værtslæsioner. Tilsvarende gener bibringer i 28 DK 172259 B1 f.eks. resistens mod antibiotikumet cycloheximid eller tilvejebringer protophi i en auxotrop gærmutant, f.eks. URA3-, LEU2-, HIS3- eller, især TRPl-genet. Gærhybridvek-5 torer indeholder endvidere fortrinsvis en replikonstart og et markørgen for en bakterievært, især Escherichia coli, således at konstruktionen og kloning af hybridvektoreme og deres intermediater også kan finde sted i en bakterievært (shuttle-vektorer). Ekspressionskontrolsekvenser, som 10 er egnede til ekspression i gær, er f.eks. ekspressionskontrolsekvenser for de meget udtrykte gærgener. Der kan således anvendes promotorerne for TRPl-genet, ADH1-genet eller ADHII-genet, phosphatase (PHO 3 eller PHO 5)-genet, isocytochromgenet eller en promotor involveret i det 15 glycolytiske system, såsom promotoren for enolasen, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) eller 3-phosphoglyceratkinase (PGK).

Foretrukne vektorer indeholder promotorer, som kan tilkobles eller frakobles ved at variere vækstbetingelser-20 ne. F.eks. kan PHO 5-promotoren undertrykkes eller frakobles alene ved at forøge eller formindske koncentrationen af uorganisk phosphat i mediet.

Ekspressionsvektorer for sådanne celler indbefatter sædvanligvis en alsidig og stærk forstærker/promotor-enhed 25 anbragt foran i genet, som skal udtrykkes. Hvis cDNA skal udtrykkes, adderes RNA-splejsningssteder, polyadenyle-ringssteder og eventuelt en transskriptionel terminator-sekvens til genet. Til anvendelse i pattedyrceller tilvejebringes kontrolfunktionerne for ekspressionsvekto-30 rerne ofte ved hjælp af virusmateriale. F.eks. er almindeligt anvendt forstærker-promotor-enheder afledt af simlanvirus 40 (SV40), rous sarcoma-virus, adeno-virus 2 eller muse- og humancytomegalovirus. Der kan især anvendes forstærkerproraotorenheden af det direkte tidlige musecyto-35 megalovirusgen og SV40-forstærkeren kombineret med den humane α-globinpromotor. Desuden kan der anvendes inducer- t 29 DK 172259 B1 bare promotorer, såsom promotorerne afledt af varmechokge-nerne eller metallothioningenerne. Det er endvidere også muligt at anvende promotor- eller kontrolsekvenser, der 5 normalt er forbundet med den ønskede gensekvens. Et replikationsorigin kan tilvejebringes enten ved konstruktion af vektoren, således at den omfatter et exogent område eller origin, f.eks. afledt af SV40 eller fra andre viruskilder, f.eks. Polyoma, Adeno, VSV, SPV, 10 osv., eller tilvejebragt ved hjælp af værtscellens kromosomale replikationsmekanisme. Hvis vektorerne er integreret i værtscellekromosomet, er sidstnævnte metode ofte mere effektiv.

Reisoleringen af vektor-DNA'et indeholdende den klonede 15 DNA-insert fra en vært opnås på kendt måde, især ved lysering af værtscellerne og rensning af DNA’et ved centrifugering, specielt CsCl-vægtfyldecentrifugering og phenol/chloroform-ekstraktion.

\

Opfindelsen angår også hybridvektorer, der som et insert 20 omfatter en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid med formlen I, eller et fragment eller et derivat deraf med samme biologiske virkning som polypeptidet.

Opfindelsen angår især en hybridvektor, der som et insert omfatter en DNA-sekvens, som koder for et fragment af 25 polypeptidet med formlen I, kendetegnet ved, at insertet koder for et polypeptid med formlen I, hvori aminosyresekvensen, som omfatter aminosyrer 106 til 127, er slettet, eller et fragment af polypeptidet med formlen I, som er valgt 30 blandt gruppen bestående af polypeptider startende med en vilkårlig af aminosyrerne 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 30 DK 172259 B1 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 eller 160 og sluttende med en vilkårlig af aminosyrer-5 ne mellem 282 og 321, eller et fragment af polypeptidet med formlen I, som består af aminosyresekvensen fra aminosyre 119 til aminosyre 321, eller et fragment af polypeptidet med formlen I, som består af 10 aminosyresekvensen fra aminosyre 134 til aminosyre 321, eller et fragment af polypeptidet med formlen I, som består af aminosyresekvensen fra aminosyre 148 til aminosyre 321, eller 15 et fragment af polypeptidet med formlen I, som består af aminosyresekvensen fra aminosyre 150 til aminosyre 321.

Opfindelsen angår især en hybridvektor, som omfatter en DNA-sekvens med formlen II eller III, eller et fragment deraf.

20 Specifikke hybridvektorer er pCL2, pCLl, pFK-1, pFK-2, pPL-BF, pJDB207R/PH05-BF, pCAL5-R/ND, pCAL8-BF/ND og pPL.PTIS-BF, jf. fig. 1-8.

3. Transformation af en vært Næst efter en kraftig ekspressionsvektor anvendes en 25 kompatibel værtscelle til ekspressionen af de ønskede polypeptider ifølge opfindelsen. Sædvanligvis foretrækkes prokaryoter til kloning af DNA-sekvenser og samling af vektorerne. De samlede vektorer overføres derpå til egnede 31 DK 172259 B1 værtsceller, og der kan her anvendes prokaryote såvel som eukaryote celler. Anvendelige mlkroorganismestammer indbefatter Escherichia coll, Bacillus subtilis, Bacillus 5 staerothermophilus og andre enterobakteriaceae. Salmonella typhimurium eller Serratia marcesans, og forskellige pseudomonasarter. Især er Escherichia coli-stammer nyttige, f.eks. E. coli B, HB101, BZ234, X1776, W3110, JA221 og K12. Disse eksempler er naturligvis blot 10 illustrerende og har ingen begrænsende virkning.

Foruden prokaryoter kan der også anvendes eukaryoter, såsom gær. Saccharomyces cerevisiae eller almindelig bagergær er den mest almindeligt anvendte eukaryotiske mikroorganisme, skønt der er et antal andre arter, der er 15 almindeligt tilgængelige. Til ekspression i Saccharomyces kan eksempelvis anvendes plasmidet YRp7 (Stinchomb et al.

(14), Kingsman et al. (14a), Tschemper et al. (15).

Foruden mikroorganismer kan der som værter også anvendes cellekulturer afledt af flercellede organismer. Princi-20 pielt kan der anvendes enhver sådan cellekultur, uanset om den er fra et hvirveldyr eller et bløddyr. Imidlertid har hvirveldyreellekulturer størst interesse. Som eksempler på nyttige værtscellelinier kan nævnes Vero- og Hela-celler, kinesisk hamsterovarie (COH)-cellelinier, Bowes melanoma-25 cellelinier, RPMI 8866 og Cos-7-cellelinier.

Transformationen af det dannede hybridvektor-DNA til en recipient gennemføres under anvendelse af kendte fremgangsmåder, f.eks. som beskrevet af Maniatis et al. (1). Bakterier transformeres med hybridvektor-DNA, f.eks. ved 30 anvendelse af CaCl-transformationsmetoden.

En anden egnet transformationsmetode for Escherichia coli-værtsbakterier i forbindelse med DNA'et fra λ-fager som en vektor er in vitro-pakning af hybridvektor-DNA'et og infektion af bakterien. In vitro-pakning opnås hovedsagelig DK 172259 Bl 32 ved anvendelse af tilgængelige pakningssæt (Pharmacia, Sverige, Boehringer, Mannheim). Infektionen gennemføres ved hjælp af MgCl2~metoden som beskrevet af Maniatis 5 (1), side 275.

Transformationen af gær omfatter f.eks. trin med enzymatisk fjernelse af gærcellevæggen ved hjælp af glucosidaser, behandling af de opnåede spheroplaster med vektoren i nærværelse af polyethylenglycol og Ca2+-ioner 10 og regenerering af cellevæggen ved indlejring af sphero-plasterne i agar. Regenereringsagaren fremstilles fortrinsvis på en sådan måde, at det er muligt at regenerere og selektere de transformerede celler på samme tid.

15 Transformationen af hvirveldyrceller dyrket i vævskulturer opnås ved anvendelse af en af de adskillige kendte fremgangsmåder. Der kan anvendes direkte mikroinjektion af DNA'et i cellekernen, fusion af Escherichia coli-protopla-ster med den fremtidige værtscelle eller addition af 20 co-precipitater mellem DNA og calciumphosphat. Den efterfølgende selektion af transformerede celler kan gennemføres under anvendelse af en selektionsmarkør, som enten er integreret kovalent i ekspressionsvektoren eller tilsat som en særskilt enhed. Selektionsmarkører indbefat-25 ter gener, som tilvejebringer resistens mod antistoffer, såsom G418 og hygromycin, eller gener, som kompletterer en genlæsion i værtscellen, såsom mangel på thymidinkinase eller hypoxanthin phosphoribosyltransferase.

4. Selektion af transformerede værter 30 Transformerede værter, som bærer egenskaberne ved selektionsenhederne integreret i vektorerne, selekteres fra utransformerede værter, især ved dyrkning af bakterien under passende selektionsbetingelser, hvorved kun de transformerede værter overlever. En anden selektionsmeto- Ϊ t 33 DK 172259 B1 de i forbindelse med bakteriofager er plaguedannelsen på udpladede Escherichia coli-værtsbakterier.

Screeningen for værter, som bærer en hybridvektor, der som 5 et insert indeholder en DNA-sekvens, som koder for et polypeptid ifølge opfindelsen, kan opnås ved anvendelse af radioaktivt mærkede oligonucleotidprober, som koder for et fragment af et sådant polypeptid eller ved screening for polypeptidproduktet fra DNA-insertet. Hybridiseringen 10 gennemføres især med mRNA eller en vilkårlig oligonucleo-tidprobe, som indeholder ca. 12 eller flere på hinanden følgende nucleotider, der koder for et fragment af et polypeptid ifølge opfindelsen.

Især kan selekteringen af Escherichia coli-værter 15 transformeret med hybridvektorer, som bærer et insert, der koder for et polypeptid ifølge opfindelsen, gennemføres ved hjælp af hybridisering af en oligonucleotidprobe til kopifiltre afledt af et cDNA-bibliotek, som er udspredt på agaroseplader. Oligonucleotidet kan mærkes ved 5’-enden 20 med 32p_aA<rp under anvendelse af enzymet T4-kinase eller internt ved hjælp af en primet syntese med Klenow-poly-merase under anvendelse af et vilkårligt fragment af cDNA'et, som koder for et polypeptid ifølge opfindelsen, klonet i fagen M13.

25 Proteinproduktet til screeningsformål opnås ved in vitro-eller in vivo-translation især under anvendelse af Xenopus laevis-oocytsystemet, som beskrevet af Maniatis et al.

(1). Det translaterede proteinprodukt påvises ved anvendelse af monoklonale antistoffer, såsom Mab-45, Mab-176 30 og Mab-135, eller ved anvendelse af et funktionelt testsystem, såsom binding af IgE’et til polypeptidet som ved rosetinhiberingstesten af Sarfati et al. (17).

Rekombinantfager, som bærer en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid ifølge opfindelsen, identificeres ved hybri-

S

DK 172259 Bl 34 disering, hvorved en radioaktivt mærket nucleinsyrese-kvens, som indeholder et fragment af DNA'et, der koder for polypeptidet, anvendes til hybridisering. Eventuelt 5 påvises de ved immunologisk screening under anvendelse af monoklonale antistoffer, såsom Mab-135 og Mab-176.

Modifikation af det kodende eller ikke-kodende område i hybridvektoren opnås eksempelvis ved de ovenfor beskrevne fremgangsmåder, f.eks. under ld).

10 Opfindelsen angår tillige anvendelsen af polypeptiderne ifølge opfindelsen med IgE-bindingsaktivitet til behandling eller forebyggelse af allergitilstande hos patienter, som er allergiske overfor alle typer antigener, f.eks. pollen, katteskæl, husstøvmider og lignende. Særlig stor 15 betydning har behandlingen af højrisikopatienter under kritiske perioder, herunder især nyfødte i højrisikogruppen, som ikke får modermælk. Polypeptideme ifølge den foreliggende opfindelse indgives enteralt, f.eks. nasalt, rektalt eller oralt, eller parenteralt, f.eks.

20 intramuskulært, subkutant eller intravenøst, sædvanligvis i dosisenhedsformer, såsom tabletter, drageer, ampuller, hætteglas eller suppositorier. Mængden af polypeptidet, som skal administreres, afhænger af dets specifikke aktivitet, af patientens vægt og almene tilstand, sygdommens 25 sværhedsgrad og indgiftsmåden og bør baseres på et lægeligt skøn. Sædvanligvis kan det indgives i en dosis på fra ca. 100 /tg til ca. 5000 μg pr. kg kropsvægt pr. dag.

Opfindelsen angår desuden farmaceutiske præparater, som indeholder polypeptideme ifølge opfindelsen med IgE-bin-30 dingsaktivitet i en antiallergisk virksom mængde, eventuelt i forbindelse med konventionelle farmaceutisk acceptable bærestoffer, som er egnede til oral, rektal, nasal eller parenteral, dvs. intramuskulær, subkutan eller intraperitoneal, indgift, og som ikke reagerer på uheldig 35 måde med de aktive bestanddele.

35 DK 172259 B1

De farmaceutiske præparater er egnede tabletter, kapsler, hætteglas indeholdende et fast pulver, eller forstøvere, spraybeholdere, hætteglas, ampuller og lignende, som 5 indeholder infusionsopløsninger, fortrinsvis vandige opløsninger eller suspensioner, som kan fremstilles inden anvendelsen, f.eks. ud fra lyofiliserede præparater, som indeholder den aktive bestanddel alene eller sammen med et bærestof, såsom mannitol, lactose, glucose, albumin og 10 lignende. Det farmaceutiske præparat kan være steriliserede og, om ønsket, blandet med hjælpestoffer, f.eks. konserveringsmidler, stabiliseringsmidler, emulgeringsmidler, opløseliggørende stoffer, puffere og/eller salte til regulering af det osmotiske tryk. Der kan opnås sterilisering 15 ved sterilfiltrering gennem filtre med lille porestørrelse (0,45 μτα diameter eller derunder), hvorefter præparatet om ønsket kan lyofiliseres. Der kan også tilsættes antibiotika for at bevare steriliteten.

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen dispenseres 20 i enhedsdosisformer, f.eks. ampuller, indeholdende 1-2000 mg farmaceutisk acceptabelt bærestof pr. enhedsdosis og ca. 1-100 mg, fortrinsvis ca. 2-50 mg, aktiv bestanddel pr. enhedsdosis.

36 DK 172259 B1 o

Forkortelserne anvendt i nærværende beskrivelse har følgende betydninger: bp basepar 5 BSA bovin serumalbumin

cONA komplementært DNA

cpm tællinger pr. minut (radioaktivt henfald) dA 2'-deoxyadenosin dATP 21-deoxyadenosin-triphosphat 10 dC 2'-deoxycytidin dCTP 2f-deoxycytidin-triphosphat dG 2'-deoxyguanosin dGTP 2'-deoxyguanosin-triphosphat dT 2'-deoxythymidin 15 dTTP 2'-deoxythymidin-triphosphat DNA deoxyribonucleinsyre

dNTP blanding af dATP, dCTP, dGTP og dTTP

ds dobbeltstrenget DTT 1,4-dithiothreitol 20 EDTA ethylendiamintetraeddikesyredinatriumsalt FCS føtalt kalveserum HAT hypox anthin/aminopterin/thymidin HBSS Hanks afbalancerede saltopløsning HT hypoxanthin/aminopterin 25 Hepes N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethensulfonsyre

IgE immunoglobulin E

mRNA messenger RNA

PBS phosphatpufret fysiologisk saltopløsning

Pipes piperazin-Ν,Ν'-bis(2-ethansulfonsyre) 30 PMSF phenylmethylsulfonylfluorid RIA radioimmunanalyse RNA ribonucleinsyre SDS natriumdodecylsulfat ss enkeltstrenget 35 Tris tris(hydroxymethyl)aminomethan 37 DK 172259 B1

tRNA transfer RNA

Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler, hvori der anvendes følgende pufferopløsninger 5 og medier: agar LB-medium tilsat 2% agar eleuringspuffer 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA,

0,2% SDS

LB-medium 1% Bacto-trypton (Difco), 0,5%

10 Bacto gærekstrakt (Difco), 170 mM

NaCl, indstillet på pH 7,5 med NaOH

lyseringsopløsning 0,5 M NaOH, 1,5 N NaCl HBSS 8 g NaCl, 400 mg KCL, 48 mg 15 Na2HP04, 350 mg NaHC03, 60 mg KH2PO4, 100 mg phenolrødt ill h2o HBSS-FCS HBSS tilsat 10% FCS, 0,01% NaN3, 66 mM Tris-HCl pH 7,2 20 HT-medium RPMI/c-medium tilsat 40 μΐ 2-mer- captoethanol, 100 μΜ hypoxanthin, 1 μΜ thymidin HAT-medium HT-medium tilsat 10 μΜ aminopterin

MBS-H 88 mM NaCl, 1 mM KC1, 0,33 mM

25 Ca(N03)2, 0,41 mM CaCl2, 0,82 mM

MgS04, 2,4 mM NaHC03, 10 mM Hepes (pH 7,4)

McConkey-agar 50 g forblandet McConkey agar (Becton Dickinson) pr. 1 destille-30 ret vand oocyter lyseringspuffer 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl

0,5% "Triton" X 100, 0,5% natrium-deoxycholat, 0,1% methionin, 1 mM 35 PMSF

PBS 1 1 indeholdende 8 g NaCl, 0,2 g 1 KC1, 1,44 g Na2HP04.2H20, 0,2 g f i 38 DK 172259 B1 KH2PO4 RPMI 1640-medium fra Gibco RPMI 1640/c-medium RPMI 1640-medium tilsat: 1% peni- 5 cillin-streptomycin (Gibco), 1% L-glutamin (Gibco) og 15% (r/r) FCS (Gibco) RVT-puffer 200 mM Tris-HCl, pH 8,3 ved 420C, 20 mM MgCl2, 280 mM KC1, 20 mM DTT 10 SOC-medium 2% Bacto trypton (Gibco), 0,5% gærekstrakt (Gibco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10 mM MgCl2, 5 mM MgS04, 20 mM glucose SSC-puffer 15 mM natriumtitrat, 150 mM NaCl 15 TBE-puffer 1 1 indeholder 10,8 g Tris, 5,5 g

borsyre, 4 ml 0,5 ml EDTA (pH 8,0) TE-puffer 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA

TNE-puffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,1 M

NaCl, indstillet på pH 7,8 med 20 NaOH

vaskepuffer 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 0,2% SDS.

Anvendelse af restriktionsenzymer og isolering af DNA

Alle restriktionsenzymer anvendes ved de pufferbetingel-25 ser, leverandøren har anbefalet på enzymdatabladet. Sædvanligvis anvendes 3 enheder enzym til nedbrydning eller spaltning af 1 μg DNA. Inkubationsblandingerne henstilles i 2 timer ved 37°C. Enzymreaktionen afbrydes ved tilsætning af EDTA og Na-acetat til slutkoncentratio-* 30 ner på henholdsvis 15 mM og 200 mM. Til ekstraktion af DNA tilsættes 1 rumfang af en l:l-blanding af chloroform og phenol, som er formættet med TNE, og blandingen rystes kraftigt. Den organiske og den vandige fase adskilles ved centrifugering ved 5000 G i 5 minutter (stuetemperatur).

35 Den vandige fase overføres til et nyt rør, og der ekstra-heres med 1 rumfang chloroform. Efter centrifugering fæl- 39 DK 172259 B1 des DNA'et ved tilsætning af 2,5 rumfang ethanol. Prøven inkuberes i mindst 2 timer ved -20°C og centrifugeres ved 10.000 G i 10 minutter. DNA-pelletten vaskes en gang med 5 70% ethanol, tørres i 10 minutter i en vakuumdeksslkkator og opløses til sidst i et passende rumfang TE-puffer.

Der anvendes følgende stammer: E. coli-stamme HB101: F“, hsdS20, (r“ø, bi"b), recA13, aral4, proA2, lacYl, galK2, rspL20(Sm'), xyl-5,mtl-l, 10 supE44,X”. (Boyer og Rouland-Dussoix 1969, Bolivar og Backman 1979).

RPMI 8866 cellelinie: RPMI 8866 celler (ATCC nr. CCL 107) stammer fra en lymfoblastoid B-cellelinie, som udtrykker receptorer for IgE. Cellelinien er leveret af Dr. P.

15 Ralph, Sloan-Kettering Research Institute, NY, USA.

Der anvendes følgende plasmider: pUC-9: Fås fra Pharmacia, P-L-Biochemicals, Upsala,

Sverige. pUC-9-plasmidet består af et pBR322-afledt ampicillinasegen og et origin for DNA-replikation ligeret 20 til en del af lac Z-genet fra Escherichia coli. Et DNA-insert, som indeholder en række entydige restriktionsenzymgenkendelsessteder er blevet indført i lac Z-regionen i dette plasmid.

pUC-KO: Dette plasmid er et derivat af pUC-9, hvor pro- 25 motor/operator-regionen i lac Z-genet er slettet mellem Haell-restriktionsstedet netop uden for promotorsekvensen og Hindlll-restriktionsstedet, inden i polylinkeren, idet de andre sekvenser i pUC-9-plasmidet er uændrede.

pGEM™-l: Fås fra Promega Biotec, Madison, USA. Dette 30 plasmid er en særlig transskriptionsvektor. Den er konstrueret under anvendelse af det bakteriofag SP6-promotor- 40 DK 172259 B1 holdige plasmid pSP64 (D.A. Melton, et al. (16)) og en bakteriofag T7-promotor. Det resulterende plasmid har to modstående promotorer SP6 og T7 adskilt af et kort stykke 5 DNA, som indeholder multiple kloningssteder.

pIN-III-ompA-plasmider: Er beskrevet af Gharayeb et al.

(13). Disse plasmider er særlige sekretionskloningvektorer i Escherichia coli. Sekretionen af et klonet genprodukt over cytopiastmamembranen kan opnås ved at fusionere pas-10 sende signalpeptider til aminoterminalenden af genproduktet. 1 disse plasmider er DNA-fragmentet, som koder for signalpeptidet for ompA-proteinet, et væsentligt ydre membranprotein fra Escherichoa coli, blevet indsat i en højniveauekspressionsvektor. Et fremmed DNA-fragment 15 kan klones i en vilkårlig af de tre af læsningsstrukturer ved de entydige EcoRI-, HindiII eller BamHI-steder umiddelbart efter ompA-signalpeptidkodningssekvensen. pIN-III-ompA-plasmiderne af typen 1, 2 og 3 udløser forskellige aflæsningsstrukturer til translation.

20 Eksempel 1

Isolering af mRNA fra RPMI 8866-celler RPMI 8866-celler dyrkes i vævskulturkolber (Falcon, 175 cm2) med 50 mi rpmi 1640-medium tilsat 15% FCS, 100 enhe-der/ml penicillin og 100 jig/ml streptomycin. Cellerne fra 25 50 sammenflydende kolber (ca. 10& celler/kolbe) samles ved centrifugering og vaskes en gang med 50 ml PBS. Cellepel-letten (5 g) opløses 25 ml opløsning fremstillet af 100 g guanidiniumthiocyanat, 100 ml H2O, 10,6 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5, 4,2 ml 0,5 M EDTA, 21,2 ml 20%' s N-laurylsarcosin 30 og 2,1 ml 2-mercaptoethanol. Cellelysatet homogeniseres i en omnimixer i 90 sekunder ved fuld hastighed. Der tilsættes 2 rumfang l:l-blanding af chlorform og phenol. Blandingen rystes kraftigt i 1 minut, hvorpå den centrifugeres ved 5000 G i 10 minutter i en Sorval-centri- DK 172259 Bl 41 fuge ved 10°C. Den vandige fase udtages, og ekstraktionen gentages fire gange. Til den vandige fase sættes 2 rumfang ethanol. Bundfaldet udvindes ved afkøling til -20eC i 15 5 minutter efterfulgt af centrifugering ved 10.000 o/m ved 4®C i en Sorvall SS34-rotor i 10 minutter. Pelletten opløses i 4 ml TE-puffer. 7,5 g varmetørret CsCl (Merck) og 50 μΐ 0,1 N HC1 tilsættes, og opløsningen indstilles på 7,5 ml og hældes ud på en 2 ml pude af 5,7 M CsCl i et 12 10 ml-centrifugerør. Røret fyldes op med vand, og der centrifugeres i 16 timer ved 29.000 o/m ved 20°C i en TST 41-rotor (Kontron). Ved afslutningen af behandlingen fjernes størsteparten af supematanten, og røret drænes ved at det hurtigt vendes om. Den glasagtige RNA-pellet 15 opløses i 1 ml TE-puffer og 0,2% SDS ved hvirvling og lejlighedsvis opvarmning (2 minutter) ved 37®C. RNA'et fældes med ethanol som beskrevet af Maniatis et al. (1) side 461-462. Det tørrede mRNA opløses i 1 ml eluerings-puffer. Efter opvarmning i 2 minutter ved 68®C og brat 20 afkøling på is tilsættes 130 μΐ 5 M NaCl, og opløsningen sættes til en 2 ml-søjle af oligo-dT-cellulose (2 ml lagrumfang i en 5 ml sprøjte type 7, P-L Biochemical s) ækvilibreret i vaskepuffer. Efter to efterfølgende påsætninger af prøven vaskes søjlen med 15 ml vaskepuffer, og 25 det bundne mRNA elueres med 4 ml elueringspuffer. mRNA-udvindingen bestemmes ved måling af absorptionen ved 260 nm (OD260nm s 1 svarer til en koncentration på 40 pg/ml). mRNA'et (150 μg) fældes med ethanol. Bundfaldet samles ved centrifugering (15 minutter ved 16.000 G), 30 opløses i 0,4 ml vand og genfældes med ethanol. mRNA-pelletten lufttørres og opløses i 160 μΐ TE-puffer tilsat 0,1% SDS.

42

Eksempel 2 DK 172259 B1

Opkoncentrering af mRNA, som koder for IgE-receptor-og IgE-BF-beslaegtede polypeptlder 5 130 μg polyA-mRNA fra eksempel 1 (1 μg/μl) opvarmes i 5 minutter ved 70°C, afkøles på Is og sættes på 12 ml 5-20%'s lineær saccharosegradient i 0,1 M NaCl, 10 mM Trls-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA og 0,5% SDS. Gradienten centrifugeres i 5 timer ved 41.000 o/m i en TST 41-rotor ved 10 25°C. Der udtages 30 fraktioner (rumfang 0,4 ml pr.

fraktion), som analyseres ved injektion i oocyter fra Xenopus laevis som beskrevet i eksempel 3.

Eksempel 3

In vivo-translation af mRNA i Xenopus laevis-oocyter 15 Voksne Xenopus laevis af hankøn og hunkøn kan fås fra forskellige dyreleverandører, herunder K. Evans (716, Northside, Ann Arbor, MI 48105). Frøerne kan holdes i en hvilken som helst type vandbeholder uden beluftning ved 18-22°C. Regelmæssig fodring (to gange om ugen) med 20 stykker af okselever og oksehjerte vil hjælpe til at opretholde en sund bestand. Oocyter bør udtages fra sunde, voksne hunfrøer. Dette gøres let ved at anæstetisere frøen i en 1:1000 (v/r)-opløsning af ethyl-m-aminobenzoat i vand i 10-30 minutter. Et lille indsnit (1 cm) på den bageste 25 del af bugsiden giver let adgang til frøens ovarie. Efter udtagning af et stykke af ovariet kan indsnittet sys sammen, og frøen vil hurtigt komme sig i vand. Ovariestykket bør straks anbringes i modificeret Barth-saltop-løsning (MBS-H), og enkelte oocyter udtages ved hjælp af 30 en platinpudenål. Store fuldvoksne oocyter injiceres under anvendelse af en fin mikropipette, en mikrometersprøjte og et vilkårligt standarddissektionsstereomikroskop. Konstruktionen af en egnet injektionspipette er beskrevet 43 DK 172259 B1 af Gurdon (18). Oocyter anbringes på et mikroskopglas, tørres ved aftrykning med et papirshåndklæde, hvorefter glasset anbringes på mikroskopbordet.. Før og under 5 indsætningen af pipetten kan oocyterne anbringes ved hjælp af en stump urmagerpincet. Når pipetten er trængt ind i oocytterne afgives en 30-50 ni alikvot af mRNA-opløsningerne (1 mg/ml) fra eksempel 2 under anvendelse af mikrometersprøjten. Grupper på 40 æg indeholdende mRNA’et 10 fra den samme fraktion inkuberes i 0,5 ml Barth-opløsning tilsat 6% FCS i 45 timer ved 20eC. Inkuberingsmediet fjernes, og oocyterne homogeniseres i 900 μΐ oocyt-lyse-ringspuffer. Homogenatet centrifugeres i en Eppendorf-centrifuge 1 10 minutter. Den øvre fase udvindes, og 15 alikvoter på 50 μΐ testes i en RIA som beskrevet 1 eksempel 7.

Eksempel 4

Fremsrtilling af hybridomaceller, som producerer mono-klonale antistoffer mod FC,R

20 BALB/c-mus immuniseres ved hjælp af tre intraperitoneale injektioner af 5 x 10? levende RPMI 8866-celler i PBS med 4 ugers mellemrum. Der udtages serumprøver fra hver enkelt mus 2 dage efter den sidste injektion, og de testes for anti-FCeR-aktivitet. Miltceller fra 2 dyr, som viser de 25 højeste koncentrationer, blandes og anvendes til fusion den efterfølgende dag. Miltene opkradses, og til hver fusion pelletteres 1 x 10& vaskede miltceller med 25 x 10^ NSI/-lAg4/l-musemyelomaceller (udleveret fra the American type Tissue culture collection) i 5 minutter ved 350 G.

30 Cellepelletten resuspenderes forsigtigt i 30 sekunder i 2 ml polyethylenglycolopløsning (PEG-1540, Baker) bestående af 20 g PEG opløst i 28 ml RPMI 1640-medium (Gibco) indeholdende 15% (r/r) dimethylsulfoxid.

8 ml RPMI/c-medium tilsættes dråbevis i løbet af 90 sekun- 44 DK 172259 B1 der, hvorpå der hurtigt tilsættes yderligere 5 ml. Cellesuspensionen blandes ved at vende glasset, som henstår i 2,5 minutter, hvorpå der centrifugeres ved 350 G i 5 5 minutter. Pelletten resuspenderes i 5 ml RPMI/c-medium, og 50 μΐ alikvoter anbringes i hvert enkelt hul i 4 Costar 24-hullers plade nr. 3596, som også indeholder 1 x 10® normale BALB/c miltceller i 1 ml HAT-medium. Alle kulturer opretholdes ved skiftevis tilsætning eller ombytning af 10 HAT-mediet med få dages mellemrum efter behov, idet man starter den 5. dag efter fusionen. Efter 14 dage erstattes HAT med HT-medium, og efter 28 dage med RPMl/c. Superna-tanter fra de enkelte huller (192 kulturer) screenes for antl-FceR-antistoffer en og to uger efter fusionen. 21 15 kulturer, som producerer de ønskede antistoffer, klones ved begrænsningsfortynding, de fortyndes i RPMI/c til en koncentration på 10 levende celler/ml, og 50 μΐ alikvoter af disse suspensioner anbringes i huller på en 96-hullers plade (Linbro nr. 76-003-05, Flow Labs), som indeholder 20 100 μΐ HT-medium og 1 x 10® normale BALB/c-miltceller.

Hullerne undersøges mikroskopisk for at sikre, at de voksende kulturer er monoklonale. Prøver af supematanter udtages derfra og testes for antistofaktivitet. Positive kulturer udvælges og propageres i store dyrkningsbehol-25 dere. Der fås til sidst 14 monoklonale cellelinier, som udskiller antistoffer med den ønskede specificitet. Der anvendes tre kloner med betegnelsen 207.25.A-4-4/45, 208.25A.4.3/135 og 208.25D.2.1/176 deponeret i Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institute 30 Pasteur, Paris, og tilgængelige under deponeringsnumrene henholdsvis 1-452, 1-425 og 1-420. De derved fremstillede monoklonale antistoffer betegnes Mab-45, Mab-135 og

Mab-176.

45

Eksempel 5 DK 172259 B1

Isolering og rensning af monoklonale antistoffer

Balb/c mus forbehandles intraperitonealt med 0,5 ml 5 pristane (Aldrich). 2 uger senere foretages intraperito-neal injektion af 5 x 10^ klonede hybridomaceller fra eksempel 4. Efter 8-10 dages forløb udtages aseitesvæske, som centrifugeres ved 800 G og opbevares ved -20°C. Optøet ascitesvæske centrifugeres ved 50.000 G i 60 minutter. Et 10 fedtlag, som flyder på overfladen, fjernes forsigtigt, og proteinkoncentrationen indstilles på en koncentration på 10-12 mg/ml. Råt immunoglobulin fældes ved dråbevis tilsætning af 0,9 rumfang ækvivalenter mættet ammoniumsul-fatopløsning ved 0°C og opløses derpå i 20 mM Tris-HCl/50 15 mM NaCl (pH 7,9) og dialyseres mod den samme puffer. Der fås en immunoglobulin G-fraktion ved kromatografi på DEAE-D52-cellulose (Whatman) under anvendelse af et puffergra-dientsystem af 20 mM Tris-HCl/25-400 mM NaCl, pH 7,9.

Eksempel 6 20 Fremstilling af l^Sj-mærket antistof Mab-135 40 μg Mab-135 (PBS-opløsning fra eksempel 5) ioderes med 0,5 mCi Qg chloramin T under anvendelse af den almene fremgangsmåde ifølge F.C. Greenwood et al.

(19). Opløsningen, som indeholder ioderes Mab-135-protein, 25 dialyseres fire gange i 6 timer pr. gang mod 1 1 PBS-puffer. Det færdige produkt har en specifik aktivitet på ca. 2 x 10? cpm/^g protein. 125j mærket antistof Mab-176 fremstilles på tilsvarende måde.

46

Eksempel 7 DK 172259 B1

Radloimmunanalyse til påvisning af IgE-BF 1 cellesuperaa-tanter og serum 5 Huller på polyvinylchloridmikrotiterplader Inkuberes natten over ved stuetemperatur med 150 μΐ 0,01 M carbonat-puffer, pH 9, Indeholdende 5 Mg/ml Mab-176 fra eksempel 5. Pladerne vaskes derpå en gang med PBS og omsættes 1 2 timer ved stuetemperatur med 200 μΐ Hanks afbalancerede 10 saltopløsning Indeholdende 10% føtal kalveserum (HBSS-FCS), hvorpå der Igen vaskes ti gange med PBS og Inkuberes med 100 μΐ prøve 1 8 timer ved stuetemperatur. Blindprøven bestemmes ved at anvende HBSS-FCS. Pladerne vaskes ti gange med PBS og Inkuberes natten over ved 15 stuetemperatur med 100 μΐ 125x-Mab-135 (2-4 x 10^ cpra i HBSS-FCS, eksempel 6) pr. hul, hvorpå der vaskes ti gange med PBS og foretages tælling med en gamma-tæller.

Eksempel 8

Syntese af ss-cDNÅ fra mRNA

20 12 μΐ (0,5 mg/ml) af den 1 eksempel 2 fremstillede mRNA- opløsning med den største bindingskapacitet for 125i_Mab-135, påvist ved hjælp af RIA i eksempel 7, sættes til 25 μΐ RVT-puffer, 2,5 μΐ dNTP-blanding (20 mM dATP, dTTP og dGTP), 5 μΐ 1 mg/ml oligo-dTi2-18 (P-L-Biochemi-25 cals), 1 μΐ a-32p_dCTP (10 μΟί, 3000 Ci/mmol), 3 μΐ "RNasin"® (60 enheder, Promega Biotec, Madison, USA) og 3 μΐ revers transskrlptase (66 enheder, Promega Blotec.).

Til reaktionsblandingen sættes radioaktivt dCTP for at lette genvindingen og bestemmelsen af udbyttet af cDNA'et 30 i alle efterfølgende trin i syntesen. Blandingen inkuberes 1 1,5 timer ved 42*0. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af 2 μΐ 0,5 M EDTA pH 7,5. mRNA'et spaltes ved tilsætning af 25 μΐ 0,15 M natriumhydroxidopløsning og inkubering ved 47 DK 172259 B1 45°C i 1 time. Opløsningen neutraliseres ved tilsætning af 25 /il 1 M Tris-HCl (pH 8,0) og 6 /ti 1 M HC1. Der tilsættes 2 /il 20%'s SDS, og opløsningen ekstraheres med 0,15 ml 5 phenol-chloroformblånding (lige store rumfang phenol og chloroform ækvilibreret med TNE-puffer). Den vandige fase sættes på en 2 ml "Sephadex”® G-50-søjle i en pasteurpi-pette ækvilibreret med TNE-puffer for at adskille det ny-fremstiIlede cDNA fra de ikke-inkorporerede nucleotider og 10 det nedbrudte mRNA. 12 fraktioner hver på 200 /ti opsamles, og den omtrentlige radioaktivitet i hver fraktion bestemmes ved hjælp af en geigertæller. De første tre fraktioner indeholdende radioaktivitet hældes sammen. 1,9 /tg ss-cDNA udvindes, og der foretages ethanol fældning som 15 beskrevet af Maniatis et al. (1), side 461-462. ss-cDNA’et opløses i 20 /ti vand.

Eksempel 9 ds-cDNA-syntese og Sl-spaltning

Det dannede ss-cDNA inkuberes i 100 μΐ siutrumfang 100 mM 20 Hepes, pH 6,9, 10 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 70 KC1, 0,5 mM af hvert d-NTP (dATP, dCTP, dTTP,dGTP) og 20 enheder DNA-polymerase I stort fragment, Klenow-enzym (Boehringer, Mannheim) i 3 timer ved 15°C. Derefter tilsættes yderligere 20 enheder af samme enzym, og inkuberingen 25 fortsættes i 10 timer ved 15°C. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af EDTA til 20 mM. Blandingen ekstraheres med phenol-chloroform og fældes med ethanol som beskrevet af Maniatis et al. (1), s. 461-462 og s. 458-459. Det dannede ds-cDNA behandles i en 100 /il inkuberingsblanding 30 indeholdende 250 mM NaCl, 50 mM natriumacetat, pH 4,5, 1 mM ZnS04, 200 enheder SI nuclease (Boehringer, Mannheim) ved 30eC i 30 minutter. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af EDTA til 25 mM Efter tilsætning af 1 M Tris-HCl, pH

8,0, til 100 mM og SDS til 1%, ekstraheres reaktionsbian-35 dingen med phenol/chloroform og ledes gennem en 48 DK 172259 B1 "Sephadex"® G-200-søjle i en pasteurpipette med et rumfang på 2 ml ækvilibreret med TNE-puffer. Fraktioner indeholdende ds-cDNA bestemmes ved måling af radioaktiviteten, 5 hældes sammen, hvorpå der fældes med ethanol, og bundfaldet opløses i 15 fil H2O. Der fås 3,2 μg dc-cDNA.

Eksempel 10 3'-oligo(dG)-tailing af pUC-KO-plasmid 20 μg pUC-KO-plasmid skæres med 50 enheder PstI 10 (Boehringer, Mannheim) i 200 μΐ 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl2 og 50 mM NaCl. Der tilsættes EDTA til 20 mM, og reaktionsblandingen ekstraheres med et ligeså stort rumfang chloroform/phenol (1:1). Det skårne plasmid-DNA fældes ved tilsætning af 2,5 rumfang ethanol og udvindes 15 ved centrifugering ved 10.000 G i 10 minutter. Superna-tanten hældes bort, og pelletten opløses i 50 μΐ H2O. Proben inkuberes i 150 μΐ af en opløsning indeholdende 200 mM kaliumcacodylat, pH 6,9, 1 mM CoCl, 2 mM DTT, 10 mM dGTP og 80 enheder terminal deoxynucleotidyltransferase 20 (Pharmacia P-L-Biochemicals, Upsala, Sverige) i 5 minutter ved 37®C. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af EDTA til 10 mM, og blandingen ekstraheres en gang med phenol/ chloroform (1:1). DNA'et fældes med ethanol og udvindes ved centrifugering ved 10.000 G. DNA-pelletten opløses i 25 200 μί TE-puffer og sættes på en horisontal 0,8% agarosegel i TBE-puffer under anvendelse af en spalte med en bredde på 3 cm. Efter elektroforese i 16 timer ved 1 V/cm, udvindes DNA1 et ved elektroeluering ved 5 V/cm i 20 minutter og udvindes fra posen ved kraftig pipettering.

30 DNA'et ekstraheres med phenol-chloroform og fældes med ethanol som beskrevet i eksempel 1. Efter centrifugering opløses DNA'et i TE-puffer og opbevares ved -20eC.

Eksempel 11 49 DK 172259 B1

Fremstilling af et plasmid, som Indeholder ds-cDNA, der koder for IgE-receptorbeslægtet polypeptid, og transfor-5 mation af Escherichia coli HB101 dermed 800 ng ds-cDNA fra eksempel 9 inkuberes i 40 μΐ af en opløsning indeholdende 200 mM kaliumcacocylat, pH 6,9, 1 mM C0CI2» 2 mM DTT, 100 pmol ^H-dCTP og 12 enheder terminal deoxynucleotidyltransferase (P-L Blochemicals) i 5 10 minutter ved 37°C. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af EDTA til 10 mM. Blandingen ekstraheres med phenol/chloro-form, og DNA’et fældes ethanol. Det dc-tailede ds-cDNA opløses i H2O og opbevares ved -20eC. En blanding af 50 ng dC-tailet ds-cDNA og 150 ng dG-tailet pUC-KO fra eksempel 15 10 i 200 μΐ TNE-puffer inkuberes i 5 minutter ved 65eC, i 60 minutter ved 55°C, hvorpå der langsomt afkøles til 30°C i et vandbad over et tidsrum på 3-5 timer. 2 μΐ alikvoter af denne annelleringsblanding sættes til 200 μΐ kompetent Escherichia coll HB101, som er blevet præpareret til 20 transformation ved behandling med calciumchlorid som beskrevet af Maniatis et al. (1), side 250. Blandingerne opbevares på is i 30 minutter og opvarmes til 42°C i 2 minutter, hvorpå der fortyndes med 1 ml SOC-medium og inkuberes ved 37eC i 1 time. Indholdet af 10 rør hældes 25 sammen, og cellerne samles ved centrifugering ved 2000 G i 5 minutter. Hver cellepellet resuspenderes i 1 ml SOC-medium og udspredes på en 10 cm agarplade indeholdende LB-medium og 50 /tg/ml ampicillin. Pladerne inkuberes ved 37eC i 16 timer. Der opnås ca. 5000 transformerede kolo-30 nier, som er karakteriseret ved ampicillinresistens.

Eksempel 12 50 DK 172259 B1

Identifikation af kloner Indeholdende ds-cDNA, der koder for human IgE-receptor og igE-bindingsfaktorbeslægtet 5 polypeptid, ved hybridselekteret translation

Individuelle kolonier fra eksempel 11 dyrkes til mætning i 2 ml LB-medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin. 96 kulturer hældes sammen, og plasmid-DNA'et isoleres ved anvendelse af den basiske lyseringsmetode, jf. T. Maniatis 10 et al., side 90 (1). 100 μg basedenatureret plasmid-DNA er bundet kovalent til 50 mg aktiveret ATP-cellulose fremstillet ved fremgangsmåden ifølge Seed (20).

60 μg polyA-mRNA fra RPMI 8866-celler (eksempel 1) opløses i 300 μΐ 15 mM Pipes, pH 6,4, 1,5 mM EDTA, 500 mM NaCl, 15 0,2% SDS, 50% formamid og hybridiseres til det cellulose- bundne plasmid-DNA ved 37°C i 16 timer med forsigtig omrøring. Cellulosen vaskes 10 gange i 50%’s formaldehyd, 45 mM NaCl, 4,5 mM natriumcitrat, 20 mM Pipes, pH 6,4, og 1 mM EDTA. Det hybridiserede mRNA elueres fra cellulosen ved 20 inkubering to gange ved 65°C i 2 minutter i 100 μΐ 90%’ s formamid, 0,2% SDS, 10 mM Pipes, pH 6,4, 5 mM EDTA, 20 μg/ml kalvelever tRNA. Det eluerede mRNA fældes to gange med ethanol. Det fældede polyA-mRNA fra hver enkelt parti opløses i 6 fil vand og anvendes til injektion i Xenopus 25 laevis oocyter og analyseres som beskrevet i eksempel 3.

De translaterede proteiner screenes ved hjælp af den i eksempel 7 beskrevne RIA. Ud af 10 blandinger med 96 kolonier i hver er en positiv. Disse 96 kolonier kombineres til 12 nye blandinger af otte kolonier og 30 screenes på samme måde. Til sidst identificeres en enkelt

koloni, hvor proteinet giver et positivt signal i RIA

efter translationen af mRNA’et i frøoocyter. Klonen ekspanderes i LB-medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin. Plasmid-DNA'et isoleres fra denne koloni. 1 μg af plasmid-35 DNA'et spaltes med restriktionsenzymet PstI, som er et 51 DK 172259 B1 enzym, der spalter ved begge grænser mellem vektor-DNA'et og ds-cDNA-insertet, og sekvensen for cDNA-insertet bestemmes fra ende til ende under anvendelse af dldeoxy-5 kædetermineringssekvenserlngsmetoden Ifølge Sanger et al.

(21). Sekvenseringen gennemføres som beskrevet detaljeret 1 Amersham's håndbog "M13 cloning and sequencing" under anvendelse af de reagenser, som findes 1 sekvenseringssættet (Amersham, N 4501 og N 4502). ds-cDNA-insertet har en 10 længde på 417 bp, og dets sekvens er vist 1 formel II mellem bp no. 1295 og bp no. 1295. Dette ds-DNA, som koder for den C-terminale del af IgE-receptor og IgE-bindings-faktor, anvendes som DNA-probe til screening ved hybridi-sering for en længere cDNA-klon, som indeholder hele 15 kodningsinformationen for polypeptiderne beslægtet med human IgE-receptor eller IgE-bindingsfaktor.

Eksempel 13

Kloning af et cDNA, som indeholder den fuldstændige kodningsekvens for den humane IgE-receptor 20 PolyA-mRNA'et isoleres fra RPMI 8866-celler som beskrevet i eksempel 1. De første trin 1 cDNA-syntesen gennemføres i overensstemmelse med fremgangsmåden beskrevet i eksempel 2-8. Derefter ændres fremgangsmåden med henblik på berigelse med fuld længde ds-cDNA. ss-cDNA'et opløses 1 32 25 /il H20. ss-cDNA'et forlænges med oligo-dC-ender i et reaktionsmedium indeholdende 32 μΐ ss-cDNA (2,8 /tg), 10 μΐ 1 M kaliumcacodylat, pH 7,0, 5 /ti 10 mM C0CI2, 5 /1 1 nM DTT og 1 nmol dCTP. Efter preinkubering 1 5 minutter ved 37°C tilsættes 3 μΐ terminal deoxynucleotldyltransferase 30 (81 enheder, P-L Biochemicals), og der inkuberes i 10 minutter. Derpå tilsættes 50 μΐ TNE-puffer, og ss-cDNA'et ekstraheres med chloroform/phenol og fældes med ethanol. Pelletten vaskes med 70%'s ethanol, lufttørres og opløses i 15 /il H2O, 25 /il RVT-puffer, 2,5 /il dNTP-blanding (20 mM 35 af henholdsvis dATP, dTTP og dGTP) og 5 /il 0,2 mg/ml 52 DK 172259 B1 oligo-dGi2-18 (P“L Biochemicals). Der tilsættes 3 fil revers transskriptase (66 enheder, Promega Biotec), og blandingen inkuberes ved 42°C i 90 minutter. Reaktionen 5 afbrydes ved tilsætning af 2 jtl 0,5 M EDTA, pH 7,5, og 50 μΐ TNE-puffer, og blandingen ekstraheres med 0,15 mrnol phenol-chloroform (1:1). Den vandige fase sættes på en "Sephadex"® G50-søjle (2,5 ml i TNE-puffer), og gennem-brydningsfraktionen (0,4 ml) indeholdende 1,1 μg ds-cDNA 10 opsamles. ds-cDNA'et fældes med ethanol. Den dannede pellet optages i 32 μΐ H2O, og ds-cDNA'et forlænges med radioaktivt mærkede oligo-dc-ender (tails) som beskrevet i eksempel 11. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af 1 μΐ 0,5 M edta, pH 7,5, og prøven sættes på en horisontal 1% 15 agarosegel i TBE-puffer under anvendelse af spalter med en bredde på 0,5 cm. I en parallelspalte tilsættes 1 μg bak-teriofag X-DNA (spaltet med EcoRl og Hindlll) som størrelsesmarkør. Efter elektroforese i 2 timer ved 2,5 V/cm, udblødes gelen i TBE-puffer indeholdende 0,5 μg/ml ethidi-20 umbromid til farvning af ds-DNA'et. Området Indeholdende ds-cDNA med passende størrelse mellem 1,4 og 2 kilobaser udskæres og anbringes i to mikrocollodiumposer (Sartorius), som forinden er udblødt i vand. Der tilsættes 0,3 ml vand, og poserne anbringes i et 25 horisontalt elektroforeseapparatur (Bio-Rad) Indeholdende halvkoncentreret TBE-puffer. ds-cDNA'et elektroelueres ved 5 V/cm i 20 minutter og udvindes fra posen ved kraftig pipettering. ds-cDNA'et ekstraheres med phenol-chloroform og fældes med ethanol. Efter centrifugering opløses 30 ds-cDNA'et i 100 μΐ TNE-puffer. Der fås 100 ng ds-cDNA (bestemt ud fra radioaktivitetsudbyttet).

Eksempel 14

Annellering af dG-tailet pUC-KO med poly(dG)-ender til ds-cDNA med poly(dC)-ender og transformation af Esche-35 richia coli med det dannede plasmid 40 μΐ ds-cDNA (40 ng størrelsesfraktioneret materiale fra 53 DK 172259 B1 eksempel 13) blandes med 16 μΐ (200 ng) oligo-dGxo«20“ tallet pUC-KO-plasmid-DNA fra eksempel 10 og 194 μΐ TNE-puffer, hvorpå der foretages sekvensvis Inkuberlng ved 5 65°C i 10 minutter, ved 46eC 1 1 time og ved stuetempera tur i 1 time. Det annellerede DNA anvendes til transformation af kompetente Escherichia coli HBlOl-celler (stamme LM 1035), som er blevet præpareret med henblik på transformation som beskrevet 1 eksempel 11. Alikvoter på 2 10 μΐ af annelleringsblandingen sættes til parallelrør, som Indeholder 200 μΐ kompetente celler. Rørene henstilles på is i 30 minutter. Efter et varmechok i 90 sekunder ved 42°C og afkøling i is i 2 minutter, tilsættes 0,8 ml S0C-medium pr. rør, som derpå inkuberes i 60 minutter ved 15 37°C. Efter inkuberingen hældes indholdet af 10 rør sammen. Cellerne samles ved centrifugering ved 2000 G i 5 minutter og udplades på McConkey agarplader (diameter = 15 cm) indeholdende 100 μg/ml ampicillin. Pladerne inkuberes natten over ved 37eC. Der opnås ca. 1000 ampicillinresi-20 stente kolonier pr. plade. De overføres til nylonmembraner (Pall-Biodyne, Glen Cove, New York, USA), og membranerne anbringes på McConkey agarplader, således at kolonierne vender opad. Efter inkubering i 5 timer ved 37eC fremstilles to kopier på nylonmembraner. Mastermembranen opbevares 25 ved 4*C på en agarplade. Kopierne behandles med henblik på kolonihybridisering, idet de først anbringes på 3 MM-papir (Whatman Ltd., Maidstone, USA) mættet med 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl i 5 minutter og derpå med 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0, 1,5 M NaCl i 10 minutter. Mellem hver inkubering aftrykkes 30 filtrene på tørre Whatman 3MM-filtre. Kopifiltrene opvarmes ved 80°C i en vakuumovn i 2 timer, hvorefter de umiddelbart anvendes til DNA-hybridisering.

Eksempel 15

Filterhybridlserlng 35 cDNA-insertet fra 10 μg plasmid, som koder for en del af 54 DK 172259 B1

IgE-receptoren opnået £ra den positive klon ifølge eksempel 12, fremstilles ved spaltning med Pstl-restrik-tionsendonuclease. cDNA-insertet (450 bp) adskilles fra 5 pUC-KO-vektor DNA (2900 bp) ved elektroforese gennem en 1,5% agarosegel i TBE-puffer og udvindes ved elektro-eluering og ethanolfældning som beskrevet i eksempel 13.

Det rene cDNA-insert (200 ng) gøres radioaktivt under anvendelse af et nicktranslationssystem fra Amersham 10 (N.5000) under anvendelse af leverandørens instruktioner.

Den radioaktivt mærkede cDNA-probe har en specifik aktivitet på 5 x 10® dpm/pg. Det radioaktivt mærkede cDNA denatureres ved inkubering ved 95eC i 10 minutter, hvorpå det umiddelbart derefter afkøles på is. Kopifiltrene fra 15 eksempel 14 prehybridiseres i en forseglet plasticpose i 2 timer i 100 ml af en opløsning indeholdende 0,9 M NaCl, 0,18 M Tris-HCl, pH 8,0, 6 mM EDTA, 0,02% Ficoll 400, 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,02% BSA, 0,2% SDS og 50 jtg/ml denatureret kalvethymus-DNA. Hybridiseringen gennemføres 20 natten over i en forseglet plastpose, som indeholder 5 ml af den samme opløsning tilsat det ovenfor fremstillede varmedenaturerede radioaktivt mærkede cDNA-insert. Efter hybridiseringen vaskes filtrene i 2 x SSC/0,2% SDS, hvorpå de vaskes tre gange ved 65eC med 200 ml 0,2 x SSC/0,2% 25 SDS. Filtrene tørres og anbringes foran en Kodak røntgenfilm (XAR-5) natten over. Filtrene markeres med radioaktivt blæk for at muliggøre sammenligning af filtrene med autoradiogrammet. Der findes to positive kloner, hvis DNA'er hybridiserer til det radioaktivt mærkede DNA-frag-30 ment, som koder for IgE-receptor. De betegnes pCL-1 og pCL-2.

Eksempel 16

Isolering og analyse af pCLl- og pCL2-DNA

pCLl- og pCL2-klonerne dyrkes, og deres plasmid-DNA’er 35 isoleres under anvendelse af den basiske lyseringsmetode 55 DK 172259 B1 ifølge T. Maniatis et al. (1), side 90. DNA'et spaltes med PstI, som er et enzym, der skærer cDNA'et ved grænserne mellem vektor-DNA'et og DNA-inserterne. Fragmenterne 5 adskilles ved elektroforese, og de komplette cDNA-inserter Isoleres ved elektroeluering, som beskrevet i eksempel 13. cDNA-inserterne fra disse to plasmider sekvenseres ende mod ende under anvendelse af fremgangsmåden Ifølge Sanger et al. (21) beskrevet detaljeret i håndbogen fra Amersham.

10 Et sammendrag af restriktions- og sekvensanalysen er vist i fig. 2 og formel II.

Eksempel 17

Overføring af det IgE-receptorbeslaegtede cDNA til et plasmid, som er egnet til transskription 15 10 pg af pCL2-plasmid DNA'et spaltes med restriktionsenzy merne PstI og Hindi (Boehringer, Mannheim). 1,5 kb cDNA-insertet og 2,9 kb plasmidvektor DNA'et adskilles på en 1%'s agarosegel i TBE-puffer under anvendelse af en spaltebredde på 3 cm. Efter elektroforese i i 16 timer ved 20 1 V/cm, udvindes DNA'et ved elektroeluering som beskrevet

i eksempel 13. Parallelt hermed spaltes 100 /tg af plasmi-det pGEM®-l med PstI og Hindi, ekstraheres en gang med phenol/chloroform og fældes med ethanol. 10 ng af 1,5 kb cDNA-insertet o 10 ng af det PstI-spaltede pGEM®-l ligeres 25 i et rumfang på 10 μΐ i 4 timer ved 15°C. Reaktionsblandingen indeholder desuden 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM

MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM ATP og 100 enheder T4-ligase (Boehringer, Mannheim). 5 μΐ af blandingen anvendes til at transformere kompetent Escherichia coli HB101 (stamme LM 30 1035) som beskrevet af Maniatis et al. (1), side 250. Der

fås ca. 100 ampicillinresistente kolonier. 24 kolonier dyrkes, og plasmid-DNA isoleres fra kulturerne. Ca. 1 μg plasmid-DNA fra hver kultur spaltes med Hindlll, og længden af de spaltede DNA-fragmenter analyseres på en 1%'s 35 agarosegel under anvendelse af Hindlll-spaltet X-DNA

56 DK 172259 B1 (Pharmacia, Sverige) som en størrelsesmarkør. Det spaltede psmid-DNA fra forskellige kolonier giver DNA-fragmenter med længder på 1,0 kb og 3,3 kb. Disse plasmider betegnes 5 pGEM®-l/CL2 (se fig. 3). De indeholder aminoendedelen af IgE-receptoren proximalt til T7-polymerasepromotoren på pGEM®-l-vektor DNA*et.

Eksempel 18

Transskription af det IgE-receptorbeslægtede cDNA

10 10 μg af plasmidet pGEM®-l/CL2 fra eksempel 17 spaltes med restriktionsenzymet Rsal (Boehringer, Mannheim). 5 μΐ 0,5 M EDTA tilsættes, og blandingen ekstraheres en gang med phenol/chloroform (1:1, r:r) og en gang med chloroform.

DNA'et koncentreres ved ethanolfældning og opløses i 20 μΐ 15 TE-puffer. 4 μΐ af DNA-opløsningen sættes 100 μΐ af en opløsning, som indeholder 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl2, 2 mM spermidin, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 1 enhed/μΐ rNasin, 0,5 mM dNTP og 20 enheder riboprobe T7-RNA-polymerase (Promega Biotec). Blandingen inkuberes i 1 time ved 20 37eC. Efter RNA-syntesereaktionen tilsættes 2 enheder RQI

TM DNAse (Promega Biotec), og inkuberingen ved 37eC fortsættes i 1 time. Blandingen ekstraheres en gang med phenol/chloroform og en gang med chloroform, og det nysyntetiserede RNA udvindes ved ethanolfældning. RNA-pelletten 25 vaskes med 70%'s ethanol og opløses til sidst i 20 μ1 H2O.

Eksempel 19

Translation af det plasmidafledte IgE-receptor mRNA i frøoocyter og påvisning af IgE-receptorprotein mRNA'et fremstillet i eksempel 18 anvendes direkte til 30 injektion i frøoocyter som beskrevet i eksempel 3. Syntesen af IgE-receptorprotein testes i en RIA som beskrevet i eksempel 7. PolyA-mRNA fra eksempel 1 anvendes 57 DK 172259 B1 som kontro1prøve. Resultaterne er anført i nedenstående tabel.

Tabel

5 mRNA-type injiceret i 135i-Mab-135 bundet i RIA

frøoocyterne (input 3 x 10^ cpm) plasmidafledt mRNA 15% (eksempel 18) 10 polyA-mRNA (eksempel 1) 1,5% intet RNA 0,1%

Eksempel 20

Samling af plasmid pFK-1 og pFK-2 til ekspressionen i Escherichia coli af et polypeptid med en IgE-bindings-15 faktoraktivitet 1 dette eksempel konstrueres plasmider, som tillader fremstillingen og udskillelsen af polypeptider beslægtet med IgE-bindingsfaktor i Escherichia coli, hvorved aminotermi-nalområdet fra stillingerne Meti til Alang eller GIUX33, 20 som indbefatter membranankeret, slettes. 10 μg pCL2-plas-mid-DNA spaltes med restriktionsenzymerne Hindi og Rsal.

Der opnås fragmenter på 1,6, 1,25, 0,72, 0,46 og 0,23 kb, som adskilles ved elektroforese på en 1%'s agarosegel i TBE-puffer. 1,25 kb DNA-fragmentet udvindes som beskrevet 25 i eksempel 13. Parallelt hermed lineariseres 10 pg af plasmidet pGEM®-l med 20 enheder Hindi (Boehringer) i 50 μΐ 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2 og 5 mM DTT. Efter 2 timer ved 37eC sættes 50 /ti 1 H Tris-HCl, pH

8,5, 10 μΐ H2O og 20 enheder alkalisk kalvemavephosphatase 30 (Boehringer) til reaktionsblandingen, og inkuberingen fortsættes i 30 minutter ved 37*C. Blandingen ekstraheres tre gange med phenol-chloroform, hvorpå den elektroforese- 58 DK 172259 B1 behandles gennem en 1%'s agarosegel i TBE-puffer. Plasmid-DNA 'et udvindes fra gelen ved elektroeluerlng som beskrevet i eksempel 13. 10 ng af 1,25 kb cDNA-fragmentet 5 og 10 ng af det HincII-spaltede pGEM®-l ligeres t et rumfang på 10 μΐ i 10 timer ved 15°C. Reaktionsblandingen indeholder desuden 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,5 mM ATP og 100 enheder T4~ligase (Boehringer).

5 μΐ af blandingen anvendes til at transformere kompetente 10 Escherichia coli HBlOl-celler som beskrevet af Maniatis et al. (1), side 250. Bakterierne udplades på agarplader tilsat 100 μg/ml ampicillin. Der opnås ca. 50 ampicillinre-sistente kolonier. 24 kolonier dyrkes, og plasmid-DNA'et isoleres fra hver kultur. Ca. 1 μg plasmid-DNA fra hver 15 kultur spaltes med Hindlll, og længden af de spaltede DNA-fragmenter analyseres på en 1%'s agarosegel under anvendelse af Hindlll-spaltet λ-DNA (Pharmacia, Sverige) som størrelsesmarkør. Det spaltede plasmid-DNA fra flere kolonier giver DNA-fragmenter med en længde 0,5 kb og 3,6 20 kb, flere andre med en længde på 0,7 kb og 3,4 kb, svarende til de to mulige orienteringer af fragmentindsæt-ningsdelene. Disse plasmider betegnes henholdsvis pCAL-3 og pCAL-4 (fig. 4). En pCAL-3-klon og en pCAL-4-klon dyrkes, og plasmid-DNA'erne isoleres under anvendelse af 25 den basiske lyseringsmetode beskrevet af Maniatis et al.

(1), side 90. 10 μg af pCAL-4-plasmid-DNA'et spaltes med Hindlll, og 10 μg af pCAL-3-plasmid-DNA spaltes med BglXI og BamHl restriktionsenzym. Fragmenterne adskilles ved elektroforese, og 0,8 Bglll til BamHl og 0,75 kb Hindlll 30 til HindiII-fragmenterne udvindes ved elektroeluering som beskrevet i eksempel 13. Parallelt hermed spaltes 10 μg pIN-lII-ompA-2 plasmid-DNA (Gharayeb et al. (5)) og 10 μg plN-III-ompA-3 plasmid-DNA med henholdsvis Hindlll og BamHl. Disse to plasmider er kendt for at udskille klo-35 ningsvektorer i Escherichia coli, som tillader kloningen af fremmede DNA-fragmenter i to aflæsningsstrukturer fusioneret til sekvenser, der koder for signalpeptidet for ompA-proteinet. Derpå behandles de lineariserede plasmider 59 DK 172259 B1 med alkalisk phosphatase fra kalvemaver, og det lineari-serede DNA renses på en 0,8%'s agarosegel som beskrevet ovenfor. Der fremstilles to ligeringsblandinger med et 5 rumfang på 20 μΐ indeholdende 10 ng Hindlll-spaltet pIN-III-ompA-2 og 10 ng 0,8 kb Hindlll til Hindlll-frag-ment (blanding 1), og 10 ng 0,75 kb Bglll til BamHI-frag-ment sammen med 10 ng BamHI-spaltet pIN-III-ompA-3 (blanding 2). Reaktionsblandingerne indeholder desuden 10 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM ATP og 100 enheder T4~ligase (Boehringer, Mannheim). Efter 12 timer ved 15° C anvendes 5 μΐ af blandingerne til at transformere kompetente Escherichia coli HBlOl-celler som beskrevet af Maniatis et al. (1), side 250. Der opnås 50 15 til 100 ampicillinresistente kolonier fra blanding 1 og blanding 2. 12 kolonier fra hver blanding dyrkes, og plas-mid-DNA'et isoleres fra kulturerne. Ca. 1 pg af plasmid-DNA'et fra hver kultur spaltes med Pstl og EcoRI (blanding 1) og med BamHX og EcoRI (blanding 2). Længden 20 af DNA-fragmenterne analyseres på en 1%'s agarosegel under anvendelse af HindiIl-spaltet x-DNA (Pharmacia, Sverige) som størrelsesmarkør. Adskillige plasmider afledt fra blanding 1 danner et 0,75 kb-fragment. Disse plasmider betegnes pFK-2. De indeholder DNA'et, som koder for amino-25 syrer Alai34 til Ser32i i IgE-receptoren fusioneret til OmpA-signalsekvensen. Analogt hermed danner adskillige plasmider afledt af blanding 2 et 0,8 kb-fragment. Disse plasmider betegnes pFK-1. De indeholder DNA'et, som koder for aminosyrer Aspug til Ser32i fusioneret til OmpA-sig-30 nalsekvensen.

Eksempel 21 Påvisning af IgE-bindingsfaktorbeslægtet polypeptid i Escherichia coli-stammer, som bærer plasmider pFK-1 og pFK-2 35 10 ng plasmid pFK-1, pFK-2 og plasmid pIN-IIl-ompA-2 som 60 DK 172259 B1 t kontrol anvendes til transficering af kompetente Escherichia coli BZ 234- og Echerichia coli B1472-celler. Der fremstilles kompetente celler, som transficeres som 5 beskrevet af Maniatis et al. (1), side 250. Ved hver transfection opnås over 100 ampicillinresistente kolonier.

En koloni overføres til 2 ml LB-substrat tilsat 100 μg ampicillin/ml og dyrkes ved 37eC natten over. 1 ml af kulturerne overføres til 100 ml LB-substrat tilsat 100 μg 10 ampicillin/ml. Cellerne dyrkes under kraftig rystning (250 o/m) ved 37°C. 10 ml alikvoter udtages efter henholdsvis 4, 7, 10 og 24 timer. Alikvoterne oparbejdes straks.

Cellerne samles ved centrifugering ved 1000 G ved stuetemperatur i 10 minutter. Supernatanten hældes bort, og 15 cellerne suspenderes i 2,5 ml 20%'s saccharose, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0.

Blandingerne henstilles ved stuetemperatur 1 20 minutter, og cellerne samles atter ved centrifugering. Supernatan-terne hældes bort, og cellerne suspenderes i 1,5 ml 20 iskoldt H2O. Blandingerne inkuberes på is i 20 minutter og centrifugeres ved 4°C ved 12.000 G i 10 minutter. 5 /il af supernatanterne sættes til 100 μΐ HBSS-FCS, og disse prøver analyseres ved hjælp af den i eksempel 7 beskrevne RIA. pIN-III-ompA-2 anvendes som kontrol. Der opnås 25 følgende resultater:

Dyrk- BZ 234 BZ 234 BZ 234 B 1472 B 1472 B 1472 nings- +pFK-l +pFK-2 +pIN-III- +pFK-l +pFK-2 +pIN-III-tid ompA-2 ompA-2 (timer)_ 30 4 4355 3516 - 3432 2255 50 7 6869 5066 120 4853 2754 0 10 8396 5706 - 6084 5281 0 24 7890 5206 89 5595 5088 76 Værdierne er anført som cpm målt pr. hul i RIA'en som 61 DK 172259 B1 beskrevet 1 eksempel 7. Inputtet af radioaktivitet pr. hul er 325.000 cpm.

Eksempel 22 5 Fremstilling af en immunoaffinitetsgel til rensningen af IgE-bindingsfaktorproteinet "Affi-Gel"®10-materiale (Bio-Rad) vaskes som anvist af producenten med koldt destilleret vand og koblingspuffer pH 8,0 (0,1 M NaHC03-opløsning). En suspension af gelen 10 med en styrke på 50% i 2 ml koblingspuffer sættes til et plastrør og blandes med det samme rumfang af en opløsning, som indeholder 10 mg Mab-135 eller Mab-176, og blandingen roteres i 4 timer ved stuetemperatur. Gelen vaskes igen med koblingspuffer. For at blokere de aktive steder, som 15 stadig er fri, behandles gelen i 2 timer ved stuetemperatur med 0,1 ml 1 M ethanolamin-HCl, pH 8,0, hvorpå der vaskes med PBS, som indeholder 10 mM natriumazid, og der foretages opbevaring deri ved 4°C.

Eksempel 23 20 Fermentering af transformerede celler og isolering af IgE-bindingsfaktorprotein fra bakteriekulturen

En koloni Escherichia coli BZ 234, som Indeholder plasmidet pFK-1 fra eksempel 20, overføres til 10 ml LB-substrat tilsat ampicillin (100 μg/ml) og dyrkes ved 25 37eC under kraftig rystning natten over. 1 ml alikvoter af kulturen overføres til 6 kolber, som hver indeholder 800 ml LB-substrat tilsat ampicillin (100 pg/ml). Cellerne dyrkes under kraftig rystning (250 o/m) ved 37eC i 8 timer og samles ved centrifugering ved 1000 G ved stuetemperatur 30 i 10 minutter. Supernatanten hældes bort, og cellerne suspenderes i 300 ml af en opløsning, som indeholder 20% saccharose, 30 mM Tris-HCl, pH 8,0, og 1 mM EDTA. Suspen- 62 DK 172259 B1 sionen henstår ved stuetemperatur i 20 minutter, og cellerne samles atter ved centrifugering. Supernatanten hældes bort, og cellerne suspenderes i 200 ml iskoldt H2O.

5 Suspensionen inkuberes på is i 20 minutter og centrifugeres ved 4°C med 10.000 G i 15 minutter i en rotor eller en Sorvall-centrifuge. Supernatanten (ca. 180 ml) udtages omhyggeligt, tilsættes natriumazid (0,1 mg/ml) og filtreres gennem en "Nalgene"®-steriliseringsfilterenhed 10 (0,2 mikron, Nalge Company, Rochester, N.Y., USA). Den filtrerede opløsning sættes på en 2 ml-søjle af "Affi-Gel"®10 koblet med Mab-135 eller Mab-176, fremstillet som beskrevet i eksempel 22, ved en strømningshastighed på 50 ml/time. Gelen vaskes først med 20 15 rumfang PBS tilsat 0,5 % NaCl og 0,05% "Tween"®20, 5 rumfang PBS og 5 rumfang NaCl, 0,9%. Proteinindhodlet i vaskeopløsningerne screenes ved måling af absorbansen med 280 nm for at sikre fuldstændig fjernelse af ikke-bundne proteiner. Søjlen elueres derefter med alikvoter med et 20 rumfang på 1 ml indeholdende 0,1 M glycin-HCl, 0,1 M NaCl, pH 2,6. De proteinholdige fraktioner hældes sammen og neutraliseres med 1 M Tris.

De koncentrerede opløsninger af et renset polypeptid ifølge opfindelsen opnås ved behandling med et ISCO elek-25 troforetisk koncentreringsapparatur model 1750 (Isco Inc.) og en "Spectrapor"®-membran (Spectrum Medical Industries) med 3,5 KD afskæring. Opløsningerne dialyseres mod 25 mM ammoniumacetat, pH 8,3, hvorved de koncentreres til et rumfang på 0,2 ml.

30 Det rensede protein analyseres på følgende måde: Fraktioner inkuberes med Laemmli-puffer, hvorpå der foretages adskillelse i de enkelte proteiner ved hjælp af 12% SDS-PAGE og sølvfarvning som beskrevet i BioRad-hånd-bogen. Der påvises proteiner med en omtrentlig molekyl-35 vægt på 25 KD. De overføres elektroforetisk i 4 timer ved 0,12 amp med transferpuffer til en nitrocellulosemembran.

63 DK 172259 B1

Membranen blokeres med Tris-pufret natriumchloridopløs-ning indeholdende 10% FCS. Membranen skæres i strimler, som omsættes hver for sig med Mab-135 og Mab-176, begge i 5 en mængde på 10 μg/ml. Efter 6 timers inkubering vaskes strimlerne, hvorpå de omsættes natten over med peberrods-peroxidase-gedeantimuse-IgG. Strimlerne vaskes og fremkaldes med 4-chlor-l-naphthol (peroxidasesubstrat) som beskrevet detaljeret i BioRad-håndbogen. De Mab-135- og 10 Mab-176-monoklonale stoffer reagerer begge med 25 KD-proteinfragmentet.

Eksempel 24

Ekspression af polypeptid med IgE-bindingsfaktoraktivitet i Escherichia coli under kontrol af promotoren Pr. fra fag 15 X

24.1 Konstruktion af ekspressionsplasmid;

Plasmid pHRil48 (europæisk patentansøgning nr. 146.785) anvendes som en intermediær vektor. 10 μg af pHRil48-plasmid-DNA spaltes med Ncol, behandles derpå med Klenøvr-20 polymerase og dNTP (50 μΜ) for at gøre enderne korte eller stumpe. DNA'et spaltes endvidere med BamHI og behandles med alkalisk phosphatase. 4,3 kb vektor-DNA*et isoleres ved agarosegelelektroforese. Parallelt hermed spaltes 10 μg pCAL3-plasmid-DNA (eksempel 20) med Bglll og behandles 25 derpå med Klenow-polymerasse og dNTP (50 μΜ). DNA'et spaltes yderligere med BamHI, og 0,78 kb insert-DNA-frag-mentet isoleres ved agarosegelelektroforese. 10 ng renset vektor og 3 ng renset insert-DNA ligeres, og blandingen anvendes til at transformere kompetente Escherichia coli 30 HBlOl-celler. En klon med det korrekte rekombinantplasmid udvælges på basis af restriktionsenzymanalyser (fig. 5).

10 μg DNA fra et korrekt plasmid spaltes med BamHI og EcoRI. 0,79 kb insert-DNA*et isoleres ved agarosegel- 64 DK 172259 B1 elektroforese. Parallelt hermed spaltes 10 pg pPLc24-plasmid DNA [E. Remaut et al., (1981), GENE 15, 81-93] med EcoRI og BamHI, hvorpå der behandles med alkalisk phos-5 phatase, og 2,9 kb vektor-DNA'et renses ved agarosegel-elektroforese. 10 ng af 2,9 kb vektor-DNA'et og 3 ng af 0,79 kb insert-DNA'et ligeres og anvendes derpå til transformation af kompetente Escherichia coli K12-celler.

Der gennemføres standardrestriktionsanalyse til udvælgelse 10 af et korrekt plasmid (pPL-BF, fig. 5). Dette plasmid bærer DNA-sekvensen med formlen II, som koder for aminosyrer 119 til 321 i polypeptidet med formlen I downstream for den varmeinducerbare PL-promotor. Foran aminosyre 119 findes et methionin, som er blevet adderet 15 under det intermediære kloningstrin i plasmid pHR1148.

Plasmid pPL-BF anvendes til at transformere Escherichia coli-stammer W3110 og HB101, som begge indeholder XcI857 (E. Remaut et al., loc. cit.). Transformenterne udplades på LB-plader, som indeholder 40 /xg/ml kanamycin og 20 ampicillin, og dyrkes ved inkubering ved 30°C i 24 timer. Dannede rekombinantkolonier anvendes til fermentering.

24.2 Fermentering

Rekombinant Escherichia coli-stammer dannet i eksempel 24.1 dyrkes ved 30°C natten over i LB-medium indehol-25 dende 40 Mg/ml ampicillin og kanamycin. Kulturerne fortyndes i forholdet 1:5 med det samme medium, og der inkuberes ved 42°C i 4 timer. Cellerne samles ved centrifugering.

24.3 Rensning af polypeptider med IgE-bindingsaktivitet 30 22,5 ml af en cellesuspension (ODgso = 20) i 50 mM Hepes, pH 8,0, 30 mM NaCl og 0,1% ethanolamin, fremstillet ud fra en bakteriepellet fra eksempel 24.2, blandes med 18 g urinstof. Suspensionen lydbehandles i 3 x 30 sekunder med 65 DK 172259 B1 30 sekunders mellemrum med en "MSE Soniprep"® 150 under anvendelse af en 9,5 mm sonde og en amplitude på 24 mikron. Lysatet klares til centrifugering ved 17.000 o/m i 5 en Sorvall SS34-rotor i 30 minutter ved 20eC. Supernatan-ten dialyseres ved 4°C mod tre ændringer af 10 mM Hepes, pH 7,5, og 130 mM NaCl. Dialysatet klares ved centrifugering i 30 minutter ved 17.000 o/m i en SS34-rotor (Sorvall) ved 4°C, og til supernatanten sættes natriumazid 10 (0,1 mg/ml). Polypeptiderne med IgE-bindingsaktivitet renses yderligere og analyseres som beskrevet ovenfor, f.eks. i eksempel 22 og 23.

Eksempel 25

Ekspression af et polypeptid med IgE-bindingsfaktorakti-15 vitet i gæren Saccharomyces cerevisiae 25.1 Konstruktion af ekspressionsplasmid pJDB207R/ PH05-BF (fig. 6)

Til fremstilling af vektor-DNA'et spaltes 10 μg af plasmid-DNA pJDB207R/PH05-TPA(12-2) (europæisk patent-20 ansøgning nr. 143.081) fuldstændigt med BamHI. Det spaltede DNA behandles med alkalisk phosphatase. Det store 6,5 kb BamHI-fragment adskilles fra det lille fragment på en 1%'s agarosegel i TBE-puffer, og 6,85 kb DNA-fragmentet udvindes fra gelen ved elektroeluering. Et DNA-fragment, 25 som koder for den inducerbare PH05-promotor og PH05- signalsekvensen afledes fra plasmid pJDB207R/PH05-TPA18 (europæisk patentansøgning nr. 143.081). 50 μg af dette plasmid spaltes fuldstændigt med BamHI og Hindlll, og 2,3 kb-fragmentet isoleres. 5 μg af dette fragment spaltes 30 yderligere med Ball, og 0,58 kb-fragmentet isoleres. 20 ng af det ovenfor beskrevne vektor-DNA, 4 ng af 0,58 kb-fragmentet, 8 ng af 0,8 kb Bglll/BamHI cDNA-fragmentet afledt af pCAL3 (eksempel 20) og 0,1 ng af en kemisk syntetiseret dsDNA-linker med nucleinsyresekvensen 5'-pCCAATGCA-3'/3?-35 GGTTACGTCTAGp-5' blandes og ligeres i 24 timer ved 15eC i 66 DK 172259 B1 et rumfang på 20 μΐ. Det ligerede DNA anvendes til transformation af kompetente Escherichia coll HB101-celler. Plasmid-DNA'et fra ca. 100 ampicillinresistente kolonier 5 analyseres ved restriktionsenzymspaltning. Der findes nogle få kolonier, som har optaget alle tre insert-DNA-fragmenter i den ønskede orientering (plasmid pJDB207R/ PH05-BF, fig.6). Den korrekte struktur af konstruktionen ved samlingerne mellem PH05-signalsekvensen, det kemisk 10 syntetiserede linker-DNA og IgE-BF cDNA'et verificeres ved sekvensering.

25.2 Transformation og fermentering af gær

Plasmid pJDB207R/PH05-BF transformeres til Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 (a, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, 15 leu 2-112, kanR) under anvendelse af transformationsprotokollen beskrevet af Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 1978, 75, 1979). Transformerede gærceller selekteres på plader med minimal gærmedium, som mangler leucin. Enkelte transformerede gærkolonier isoleres og betegnes 20 Saccharomyces cerevisiae GRF18 [ pJDB207R/PH05-BF ]. Sådanne transformerede gærceller dyrkes i 50 ml minimal gærmedium (Difco Yeast Nitrogen Base uden aminosyrer), hvortil der er sat 2% glucose, 20 mg/l L-histidin og 10 g/1 L-aspara-gin, under rystning ved 30eC i 25 timer til en tæthed på 3 25 x lO^-celler/ml. Cellerne vaskes i 0,9%'s natriumchlorid-opløsning og anvendes til inokulering af 100 ml lav P^-minimalmedium fremstillet under anvendelse af formuleringen for Difco Yeast Nitrogen Base-medium (uden aminosyrer) med 0,03 g/1 KH2PO4, 1 g/1 KC1, 10 g/1 L-asparagin i 30 stedet for (NH4)2S04, 2% og 1 g/1 L-histidin. Mediet ino-kuleres til en start OD600“værdi 0,25. Cellerne dyrkes ved 30°C i op til 48 timer og høstes ved en OD gQQ-værdi på ca. 10.

Celler fra 35 ml lav P^-medium samles ved centrifugering 35 og resuspenderes i et samlet rumfang på 4 ml kold 66 mM

67 DK 172259 B1 natriumphosphatpuffer, pH 7,4, og 0,1% (r/r) "Triton X-100"®. Cellesuspensionen overføres til et 30 ml Corex-rør. Der tilsættes 8 g glasperler (0,4 mm i diame-5 ter), og suspensionen rystes på et hvirvelblandeapparatur (Scientific Instruments Inc., USA) ved fuld hastighed i 4 minutter, hvorpå det afkøles i et isbad. Mere end 90% af cellerne er oplukket ved denne behandling. Cellerester og glasperler aflejres ved centrifugering i 10 minutter ved 10 8000 o/m ved 4°C i en Sorvall HB4-rotor. Polypeptider med

IgE-bindingsfaktoraktivitet oprenses fra supematanterne under anvendelse af affinitetskromatografi som beskrevet 1 eksemplerne 22 og 23.

Eksempel 26 15 Samling af plasmider pCAL5-R/ND og pCAL8-BF/ND til ekspressionen af polypeptider med IgE-bindingsakti-vitet i dyrkede pattedyrceller I dette eksempel beskrives konstruktionen af plasmider pCALS-R/ND og pCAL8-BF/ND (se fig.7). De tillader frem- 20 stillingen af membranbundet IgE-receptor eller udskilt IgE-bindingsfaktor i pattedyrcellekulturer. Endvidere er disse plasmider udformet til selektionen af genforstærk-ning i værtscellerne, der er en proces, som fører til høje udbytter af det ønskede polypeptid.

25 26.1 Konstruktion af plasmid pCAL5

Plasmid pSV2911neo [F.A.M. Asselbergs, et al., (1986) J. Mol. Biol. 189, 401-411] anvendes til fremstilling af vektor-DNA* et. Det spaltes med restriktionsenzymerne Hindlll og Sall. Der opnås fragmenter på 3,9 og 1,8 kb.

30 Blandingen behandles med alkalisk phosphatase, og 3,9 kb-fragmentet isoleres efter elektroforese gennem en 1% agarosegel.

68 DK 172259 B1

Parallelt hermed fremstilles to DNA-inserter, som koder for henholdsvis IgE-receptoren og 3'-halvdelen af kanin /3-globingenet. Endvidere spaltes 10 pg plasmid pCAL3 5 (eksempel 20, fig. 4) partielt med Hindlll og fuldstændigt med BamHl. cDNA-insertet på 1,26 kb isoleres ved agarose-gelelektroforese og geleluering. Desuden spaltes 10 μg plasmid pUØ [F. Weber og W. Schaffner, (1985) Nature 315, 75-77] fuldstændigt med BamHl og Sall. 1,2 kb DNA-fragmen-10 tet isoleres. Det indeholder det store intron og poly(A)-slgnalet fra kanin β-globingenet.

10 ng af det ovenfor fremstillede vektor-DNA og 10 ng af hvert insert-DNA ligeres. Det dannede DNA anvendes til transfection af kompetente Escherichia coli HBlOl-celler.

15 Et rekombinantplasmid (pCAL5, fig. 7) udvælges, som viser det restriktionsmønster, som måtte forventes efter optagelsen af de to DNA-inserter i vektor-DNA'et.

26.2 Konstruktion af plasmid pCAL5-R/ND

10 ng pCAL5-plasmid-DNA spaltes partielt med Sall.

20 DNA-molekyler, som kun er skåret en gang, og derfor repræsenterer fuldlængde lineære, renses ved agarose-gelelektroforese. Parallelt hermed spaltes 10 pg pND2-plasmid-DNA (asselbergs et al., loc. cit.) fuldstændigt med Xhol og Sall. Dette plasmid indeholder to 25 selektionsmarkører, neomycin (neo) og dihydrofolatreduc-tase (dhfr), som muliggør selektering fra henholdsvis integrering og amplifikation af et fremmed DNA i genomet for pattedyrværter. Det spaltede pND2 DNA behandles med alkalisk phosphatase. Derpå blandes og ligeres 10 ng SalX-30 spaltet pCAL5 og 10 ng SalI/Xhol-spaltet pND2 plasmid-DNA.

Det dannede DNA anvendes til at transformere kompetente Escherichia coli HBlOl-celler. De transformerede celler udspredes på en agarplade, som indeholder LB-substrat og 50 /ig/ml kanamycin. Et rekombinant plasmid (pCAL5-R/ND, 35 fig. 7), som udviser det forventede DNA-restriktions- 69 DK 172259 B1 mønster, vælges til ekspressionen af IgE-receptoren i pattedyrværter. Det indeholder neo- og dhfr-selektions-markører downstream for IgE-receptor cDNA'et. Transskrip-5 tionsretningen er identisk for alle tre gener.

26.3 Konstruktion af plasmid pCAL8-BF/ND

Plasmidet pCAL8-BF/ND er et derivat af plasmidet pCAL5-R/ND beskrevet ovenfor, hvori DNA-sekvensen, som koder for aminosyrer 1 til 147 i polypeptidet med formlen 10 I, er erstattet med en ny DNA-sekvens, som koder for signalsekvensen for avianinfluenza hemagglutinin. Denne ændring muliggør sekretionen af IgE-bindingsfaktorer indeholdende aminosyrer 148 til 321 i polypeptidet med formlen I.

15 Til dette formål foretages kemisk syntetisering af et dsDNA-fragment ifølge standardmetoderne beskrevet i litteraturhenvisningerne 4, 5, 6, 6a, 7 og 8, med formlen

5' -pAGCTTACCATGGCTACCCAGATCTTGGTGTTCGCTCTGGTGGCCGTCATTCCTACAAACGCGC

ATGGTACCGATGGGTCTAGAACCACAAGCGAGACCACCGGCAGTAAGGATGTTTGCGCGATTP-5' 0,2 ng af dette DNA ligeres med 10 ng vektor-DNA og 2 ng 20 af et 0,7 kb Ddel/Xbal cDNA-insert. Vektoren er opnået fra pCAL5-plasmid-DNA ved (a) fuldstændig spaltning med Xbal nd Hindlll, (b) dephosphorylering med alkalisk phosphatase og (c) agarosegelrensning af 5,9 kb vektor-DNA'et.

0,7 kb cDNA-insertfragmentet er afledt af pCAL3 (eksempel 25 20). 30 μg pCAL3-plasmid-DNA spaltes med Hindlll og Xbal, og 0,8 kb cDNA-insertet isoleres ved rensning på agarose-gel. 3 μg af dette 0,8 kb-f ragment spaltes med Ddel, hvorved der produceres DNA-fragmenter på 0,1 og 0,7 kb.

Til sidst isoleres 0,7 kb DNA-fragmentet ved agarose-30 gelelektroforese og rensning.

70 DK 172259 B1

Det ligerede DNA anvendes til at transformere kompetente Escherichia coli HBlOl-celler. Der vælges et rekombinant-plasmid (pCAL8, fig. 7), som udviser de restriktionsfrag-5 menter, der forventes efter integreringen af DNA-insertet i vektor-DNA'et.

10 μg pCAL8-plasmid-DNA spaltes fuldstændig med Sall. De lineære DNA-molekyler renses ved agarosegelelektroforese.

10 ng Sall-spaltet pCAL8 ligeres med 10 ng Sall/Xhol-10 spaltet pND2-plasmid (eksempel 26.2). Det ligerede DNA anvendes til at transformere kompetente Escherichia coli HBlOl-celler, som udplades på en agarplade indeholdende LB-substrat tilsat 50 jig/ml kanamycin. Et rekombinant plasmid (pCAL8-BF/ND, fig. 7) udvælges til ekspressionen 15 og produktionen af IgE-BFs i transformerede pattedyrværter.

Eksempel 27

Selektering af transformerede pattedyrcellelinier, som udtrykker polypeptider med IgE-bindingsaktivitet 20 Metoderne, som anvendes til transfeetionen af DNA til pattedyrceller samt til selekteringen af transformerede celler og selekteringen for genforstærkning, er beskrevet detaljeret, jf. US-patentskrift nr. 4.399.216, J.R. Kaufman og P.A. Sharp (1982), J.Mol.Biol. 159, 601-621], 25 og disse metoder er velkendte for fagfolk, en dihydrofo-latreductasenegativ mutant (dhfr~) af en kinesisk hamster-ovariecellelinie anvendes som vært, jf. cellelinie DUKX-Bl, L.A. Chasin og 6. Urlaub, (1980) Proc. Nat. Acad.

Sci. USA 77, 4216-4220. Cellerne holdes i MEM-medium 30 (Gibco, Paisley, Scotland) tilsat 5% dialyseret FCS og 0,1 mg/ml gentamycin (Gibco). Subkonfluente CHO-celler trans-ficeres med 10 μg pCAL5-R/ND eller pCAL8-BF/ND plasmid-DNA under anvendelse af calciumphosphatcofældningsmetoden. De transficerede celler dyrkes i α-MEM-medium tilsat 5% FCS, 35 gentamycin og 0,5 mg/ml G418 (Gibco).

71 DK 172259 B1

Efter to ungers forløb vokser enkeltkolonier af G418-reslstente celler ud. 48 kolonier overføres Individuelt til hullerne 1 en 24 hullers mlkrotlterplade og dyrkes til 5 sammenflydnlng 1 det ovenfor beskrevne selektionsmedium. Derefter udtages alikvoter af mediet og test for tilstedeværelsen af IgE-bindlngsaktivitet under anvendelse af den 1 eksempel 7 beskrevne RIA. Ca. 50% af kolonierne er positive og producere ca. 0,1-10 ng rekombinant 10 polypeptld pr. ml. De transformerede kolonier afledt af plasmid pCAL8-BF/ND producerer generelt større mængder end kolonierne afledt af plasmid pCal5-R/ND. De fem bedst producerende kolonier anvendes til genforstærkning med methotrexat, jf. Kaufman og Sharp op. clt. Efter flere 15 forstærkningsrunder opnås cellelinier, som producerer op til 1 μο/πιΐ rekomblnantpolypeptid. Den bedste producent, cellelinie CHO-BF/ND, dyrkes i bulk-kulturer. Ca. 3 x lO^-celler podes pr. vævskulturkolbe (Falcon, 175 cm^) med 50 ml selektionsmedium. Når cellelaget har nået sammen-20 flydning, fjernes mediet og erstattes med 50 μΐ o-MEM-me-dium tilsat 1% FCS og 0,1 mg/ml gentamycin. Mediet udtages to gange om ugen i flere uger. Det centrifugeres i 10 minutter ved 5000 G og opbevares ved -20eC. Til sidst renses rekombinantpolypeptider med IgE-bindlngsaktivitet 25 fra de kombinerede supernatanter ved affinitetskromatografi som beskrevet ovenfor, f.eks. i eksemplerne 22 og 23.

Rensning af naturlig IgE-BF fra RPMI 8866-celler og sekvensanalyse 30 Ved rensning af IgE-BF-holdige fraktioner af RPMI 8866- cellesupernatanter (EP 86810244.3) 1 overensstemmelse med de efterfølgende B til D er det muligt at opnå et IgE-BF, som er tilstrækkeligt rent til sekvensering og bestemmelse af aminoterminalen.

72 DK 172259 B1

Eksempel A: Enzymbundetimmunosorbentanalyse (ELISA)

af IgE-BF

Fraktionerne analyseres for IgE-BF på følgende måder 5 PVC-mikrotiterpladehuller overtrækkes med Mab-176 (5 mg/ml 1 PBS, 100 mg pr. hul) natten over 1 et fugtighedskammer ved stuetemperatur. Pladerne vaskes to gange med PBS, Inden uspecifikke bindingssteder blokeres med PBS indeholdende 0,2% gelatine (150 ml/hul, 1 time ved 37°C).

10 Pladerne vaskes igen to gange med PBS. Fraktioner fra kro-matografiforsøg fortyndes 1 forholdet 1:50 i PBS, sættes til hullerne (100 μΐ/hul) og inkuberes natten over ved stuetemperatur i et fugtighedskammer. Pladerne vaskes fire gange med PBS. Bundet XgE-BF påvises ved tilsætning af 15 Mab-135, hvortil der kovalent er bundet biotin (eksempel 19, EP 86810244.3) (0,5 Mg/ml i PBS indeholdende 0,2% gelatine, 100 μΐ/hul) og inkuberes i 4 timer ved 37eC i et fugtighedskammer. Efter vaskning med PBS (fire gange) inkuberes pladerne med 100 μΐ af et konjugat af avidin og 20 alkalisk phosphatase (Sigma Cat. No. Λ 2527 0,5 μg/ml) i PBS indeholdende 0,2% gelatine i 2 timer ved 37eC. Efter yderligere vaskning med PBS fremkaldes pladerne med 1 mg/ml p-nitrophenylphosphatdinatrium i substrapuffer (100 mg MgCl2 x 6 H2O, 200 mg NaNø, 97ml diethanolamin opløst i 25 800 ml H2O, pH-værdien indstillet på 9,8 med 37%'s saltsyre). Den gule farvereaktion er optimal efter 20-40 minutter ved 37°C. Derefter afbrydes reaktionen med 50 μΐ natriumhydroxidopløsning (1 M) pr. hul. Den optiske tæthed bestemmes under anvendelse af en ElA-læsermodel 2550 (Bio-30 Rad) ved 405 nm.

Eksempel B: Rensning af IgE-BF fra humane B-cellesuper- natanter ved immunaffinitetskromatografi 10 1 kultursupernatant fra RPMI 8866-celler filtreres gennem en 20 ml-søjle af Mab-45-affigel (eksempel 10 i EP 35 86810244.3) med en strømningshastighed på 120 ml/time.

73 DK 172259 B1

Gelen vaskes med PBS. Proteinindholdet: i gennemstrømnings-væsken måles ved on-line absorbans ved 280 nm ved hjælp af et "Uvicord"® spektrofotometer for at sikre fuldstændig 5 fjernelse af ikke-bundne proteiner. Søjlen elueres med 50 ml 0,1 M glycin-HCl, pH 2,6. Fraktioner opsamles i rør, som indeholder en lige så stor mængde 1 M Tris-HCl, pH 8,0 og 0,5% "Tween"® 20. IgE-BF-holdige fraktioner hældes sammen og dialyseres mod 10 mM Tris-HCl, pH 7,4.

10 Eksempel C: Rensning af IgE-BF ved ionbytterkromatografi

Renset IgE-BF fra eksempel B sættes på en "SynChropak" AX 300 anionbyttersøjle (SynChrom Inc., Linden, IN). Søjlen vaskes med 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, og proteinet elueres med en gradient fra 0 til 1 M NaCl i 100 minutter ved en 15 strømningshastighed på 1 ml/min. Elueringen overvåges ved hjælp af UV-absorbansen ved 254 nm. Fraktionerne opsamles i 1%'s octylpyranoglucosid (Sigma) og analyseres for IgE-BF som beskrevet i eksempel A.

Eksempel D: Yderligere rensning af IgE-BF ved kromato- 20 grafi med omvendt fase 50 ml IgE-BF fra eksempel C dialyseres mod 0,5 I PBS og to gange mod 0,5 1 PBS indeholdende 0,1% octylpyranoglucosid. Efter lyofilisering solubiliseres IgE-BF'et i 1,5 ml vand og dialyseres igen mod 2 x 0,5 1 PBS indeholdende 0,1% 25 octylpyranoglucosid. Kromatografi med omvendt fase gennemføres på en "SynChropak" RP-4-søjle (SynChrom) i 0,1% TFA (Pierce) og 5% acetonitril (Merck). Eluerlng af IgE-BF gennemføres ved anvendelse af en gradient på 5-60% acetonitril i 0,1% TFA i løbet af 30 minutter ved en 30 strømningshastighed på 0,5 ml/min. Elueringen følges ved hjælp af UV-absorbans ved 254 nm. 1 ml fraktioner opsamles i 0,05% SDS og analyseres for IgE-BF som beskrevet i eksempel A. Renheden af IgE-BF kontrolleres ved SDS-PAGE med efterfølgende sølvfarvning (EP86810244.3, eksempel 35 22).

74 DK 172259 B1

Eksempel E: Aminosyresekvensanalyse af IgE-BF

Det rensede IgE-BF fra eksempel D underkastes N-terminal aminosyresekvensanalyse under anvendelse af en positiv 5 faseproteinsekvenser model 470 (Applied Biosystems) i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge M.W. Hunkapillar og L.E. Hood, Methods in Enzymology 91, 399 1983. Amino-thiozolinonderivaterne omlejres til phenyl-thiohydantoin (PTH) aminosyrer ved behandling med 25% 10 vandig TFA ved 50eC. PTH-aminosyrerne analyseres på en "Zorbax CN"® HPLC-søjle (DuPont, 200 x 4,6 mm), jf. R. Knecht et al., Anal. Biochem. 130, 65, 1983. Følgende N-terminale aminosyresekvens findes for 40% af materialet: me 11(9 1 5 S 160 163

LXMELQVXSGFVXNTXP

15 X149, X3.55, x160 °9 x163 repræsenterer ubestemte amino syrer. Denne sekvens er i overensstemmelse med sekvensen for IgE-receptoren bestemt ved cDNA-analyse begyndende ved aminosyre nr. 148 i receptoren.

Følgende N-terminale aminosyresekvens findes for 60% af 20 materialet: 150 151 160 163 mxlqvssgfvxntxpek x151' x160 °SF x163 repræsenterer ubestemte aminosyrer.

Denne sekvens stemmer overens med sekvensen for IgE-receptoren bestemt ved cDNA-analyse begyndende ved aminosyre 25 nr. 150 i receptoren.

Høj ekspression 1 Escherichia coll af et polypeptld med

IgE-bindingsfaktoraktivitet DK 172259 B1 75

Eksempel 28 5 28.1 Konstruktion af ekspressionspiasmid 10 ng af det rensede 2,9 kb vektor-DNA fra eksempel 24.1 (plasmid pPLc24 skåret med EcoRI og BamHI) blandes med 0,1 ng af oligonucleotidet 5'-pAATTTGGAGGAAAAAATTATG (Pharmacia, No. 27-4878-01) og 0,1 ng af oligonucleotidet 10 5'-pGATCCATAATTTTTTCCTCCA (Pharmacia, No. 27-4898-01) i 20 μΐ af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 2 mM DDT, 0,1 mM ATP og 100 enheder T4-DNA-li-gase (Boehringer, Mannheim). Efter 16 timer ved 4°C anvendes blandingen til transformering af kompetente 15 Escherichia coli K12-celler. Individuelle kolonier vokser op, og plasmid-DNA isoleres derfra. Der foretages standardrestriktionsanalyse til udvælgelse af et korrekt plasmid (pPl.PTIS, se fig. 8), som skæres med BamHI men ikke med EcoRI. Den korrekte indsættelse af oligonucleo-20 tiderne bekræftes ved DNA-sekvensering. Det nyindsatte DNA-fragment koder for et transporterbart translationsinitieringssted (PTIS, Pharmacia).

10 /tg pPL.PTIS plasmid-DNA spaltes med BamHI, hvorpå det behandles med alkalisk phosphatase, og det lineære 2,9 kb 25 vektor-DNA renses ved agarosegelelektroforese. 10 ng af dette vektor-DNA ligeres med 3 ng 0,8 kb Bglll til BamHI-fragment afledt af plasmid pCAL3 (eksempel 20) og anvendes derefter til transformering af kompetente Escherichia coli K12-celler. Plasmid-DNA isoleres fra individuelle 30 kolonier, og der foretages standardrestriktionsanalyse til udvælgelse af et plasmid, pPL.PTIS-BF, som har 0,8 kb insertet i den korrekte orientering (fig. 8).

Plasmid pPL.PTIS-BF anvendes til transformering af Esche- 76 DK 172259 B1 richia coli-stanune W3110 og HB101, som begge indeholder XI857 (Remaut et al., loc. cit.). Transformanterne udplades på LB-plader indeholdende 40 /ig/ml kanamycin og 5 ampicillin og dyrkes ved inkubering ved 30°C i 24 timer. Dannede rekombinantkolonier anvendes til fermentering.

28.2 Fermentering:

Rekombinante Escherichia coli-stammer opnået i eksempel 28.1 dyrkes som beskrevet i eksempel 24.2. Efter 3 timers 10 induktion ved 42°C afkøles kulturerne i 30 minutter i et is/vand-bad og samles derpå ved centrifugering.

28.3 Rensning af polypeptider med IgE-bindingsaktivitet;

Cellepelletten opnået fra 1 1 varmeinduceret kultur resuspenderes i 20 ml 0,5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA 15 ved 4°C. Cellesuspensionen behandles med lyd under konstant afkøling på is (MSE "Soniprep"® 150, 9,5 mm-sonde, 24 mikron aplitude) i 4 x 30 sekunder med 1 minuts mellemrum. Suspensionen centrifugeres derpå i 10 minutter (Sorvall-centrifuge, HB-4-rotor, 9000 o/m, 4°C). Pelletten 20 resuspenderes i 20 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA ved 4°C og underkastes lydbehandling i 30 sekunder som beskrevet ovenfor. Suspensionen centrifugeres som beskrevet ovenfor, og vaskeprocessen gentages yderligere to gange.

25 Kort beskrivelse af tegningens figurer Fig. 1:

Fremstilling af plasmider pCL-1 og pCL-2, der som insert inderholder ds-cDNA fra mRNA isoleret fra RPMI 8866 B-celler. Insert cDNA'et koder for polypeptider beslægtet 30 med IgE-receptorer og IgE-bindingsfaktorer.

77 DK 172259 B1

Flg. 2:

Sammenligning af de to inserter af plasmidernr pCL-1 og pCL-2 viser, at kodningsområderne er identiske for de to 5 inserter, de ikke-kodende områder er identiske for de to inserter, kodningsområde kun til stede i pCL-2 og ikke-kodningsområder forskellig i begge inserter, samt nogle restriktionssteder.

Fig. 3: 10 Konstruktion af plasmidet pGEM™-l/CL2 fra pCL-2 og pGEM™-l og transskription af DNA-insertet til mRNA.

Fig. 4:

Konstruktion af piasmiderne pFK-1 med insertet kodende for aminosyresekvens Aspug til Ser32i og pFK-2 kodende for 15 aminosyresekvensen for Alai34 til Ser32i i formlen I startende fra plasmidet pCL-2.

5:

Konstruktionen af plasmid pBL-BF til ekspression af IgE-BF i Escherichia coli W3110 og HB101. Aminosyrer 119 til 321 20 under P^-promotoren i fag X udtrykkes.

Flg. 6:

Konstruktion af plasmid pJDB207R/PH05-BF til ekspression af IgE-BF i Saccharomyces cerevisiae. Der udtrykkes aminosyrer 119 til 321 under PH05-promotoren.

25 Fig. 7:

Konstruktion af plasmider pCAL5-R/ND og pCAL8-BF/ND til ekspressionen af henholdsvis membranbunden IgE-receptor 78 DK 172259 B1 eller udskilt IgE-BF 1 dyrkede pattedyrceller (kinesisk hamsterovarieceller).

Flg. 8; 5 Konstruktion af plasmid pPL.PTIS-BF til transformering og ekspression af IgE-BF i Escherichia coli.

Signaturforklaring: Restriktionsenzymer

A = Hael I G = BglUI

B = BamHI H = HindliI

10 C = Hindi N = Ncol

E = Eco RI P * PstI

R = Rsal 1 sekvens som koder for polypeptid beslægtet med IgE-receptorer og/eller IgE-BFs 15 I:::: I kodningssekvens specifik for pCL-2 (fig. 2) 1 ikke-kodende sekvens, forskellig io pCL-1 og pCL-2 I////1 ikke-kodende sekvens, identisk i pCl-1 og pCL-2 (fig. 2)

20 jwuvuuwuwii roRNA

Deponering af mikroorganisme:

Escherichia coli HB101/pCL-2, som indeholder plasmidet pCL-2, er deponeret i Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen, Griesebachstrasse 8, D-3400 Gottingen, Forbunds-25 republikken under deponeringsnummeret DSM 3807.

i / 79 DK 172259 B1

Referencer I. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) 5 2. Okayama og Berg, Molecular and Cellular Biology 2, 161-170 (1982) 3. Heldecker og Messing, Nucleic Acids Research 11, 4891-4906 (1983) 4. S.A. Narang et al., Anal. Biochem. 121, 365 (1982) 10 5. K.L. Agarwal et al., Angew. Chem. 84, 489 (1972) 6. C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143 (1972) 6a. R.L. Letsinger et al., J.Am.Chem.Soc. 98, 3655 (1976) 7. Khorana et al., J.Biol.Chem. 251, 565 (1976) 15 8. S.A. Narang, Tetrahedron 39, 3 (1983) 9. Chang et al., Nature, 275:615 (1978) 10. Goedell et al., Nature, 281:544 (1979) II. Goedell et al., Nucleic Acid Res., 8: 4057 (1980) 12. Siebenlist et al., Cell 20: 269 (1980) 20 13. J. Gharayeb et al., The ΕΜΒ0 Journal, Vol. 3, 2437-2442 (1984) 14. Stinchomb et al., Nature, 282: 39 (1979) 14a. Klngsman et al., Gene, 7: 141 (1979) 15. Tschemper et al., Gene, 10, 157 (1980) 25 16. D.A. Melton et al., (1984) Nucleic Acids Research 12, 7035-7056 17. M. Sarfati et al., Immunology, 1984, 53, 197-205 18. J.B. Gurdon, The control of gene expression in animal development, Clarenton Press, Oxford, 1974 30 19. F.C. Greenwood et al., Biochem. J. 89, 114 (1963) 20. B. Seed, Nucleic Acids Res. 10, 1799-1810 (1982) 21. F. Sanger et al., Proc.Nat.Acad.Sci. USA 74.

5463-5467

Claims (16)

80 DK 172259 B1

1. Polypeptid, kendetegnet ved, at det har aminosy-resekvensen med formlen 10 20 30 MEEGQYSEIEELPRRRCCRRGTQIVL L G L V 40 so 60 TAALWAGLLTLLLLWHWDTTQSLKQLEERA 70 80 90 ARNVSQVSKNLESHHGDQMAQKSQSTQISQ 100 110 120 ELEELRAEQQRLKSQDLELSWNLNGLQADL 130 140 150 S SFKSQELNERNEASDLLERLREEVTKLRM 160 170 180 ELQVSSGFVCNTCPEKWINFQR K C YYFGKG 190 200 210 TKQWVHARYACDDMEGQLVSIHSPEEQDFL 220 230 240 TKHASHTGSWIGLRNLDLKGEFIWVDGSHV 250 260 270 DYSNWAPGEPTSRSQGEDCVMMRGSGRWND 280 290 300 AFCDRKLGAWVCDRLATCTPPASEGSAESM 310 320 GPDSRPDPDGRLPTPSAPLHS , (I) 321 og et fragment eller et derivat deraf med samme biologiske virkning som polypeptidet.

2. Fragment af et polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at aminosyresekvensen omfattende aminosyrer 10 106 til 127 er slettet.

3. Fragment af et polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det består af aminosyresekvensen fra aminosyre 119 til aminosyre 321, fra aminosyre 134 til aminosyre 321, fra aminosyre 148 til aminosyre 321 eller 81 DK 172259 B1 fra aminosyre 150 til aminosyre 321.

4. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid med formlen I, et fragment eller et derivat deraf med 5 samme biologiske virkning som polypeptidet, kendetegnet ved, at man a) dyrker en transformeret vært indeholdende en hybridvektor omfattende en DNA-sekvens, som koder for et polypeptid med formlen I eller et fragment deraf, eller 10 b) translaterer mRNA’et, som koder for et polypeptid med formlen I eller et fragment deraf, i et passende translationssystem, og, om nødvendigt, transformerer et polypeptid med formlen I eller et fragment deraf til et derivat deraf.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af en transforme ret vært, som kan udtrykke et polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man 1. fremstiller et DNA, som koder for et polypeptid med formlen I, et fragment eller et derivat deraf med samme 20 biologiske virkning som polypeptidet, 2. inkorporerer det dannede DNA i en egnet vektor, 3. transformerer en egnet vært med den dannede hybridvektor, 4. selekterer de transformerede værter fra ikke-transfor-25 merede værter og, om ønsket, isolerer hybridvektoren fra den transformerede vært, modificerer det kodende eller ikke-kodende område i hybridvektoren og gennemfører trin 3 og 4 igen.

6. Hybridvektor, kendetegnet ved, at den som en 30 insert omfatter en DNA-sekvens, som koder for et polypeptid med formlen I ifølge krav 1 eller et fragment eller et derivat deraf med samme biologiske virkning som polypeptidet.

7. Hybridvektor ifølge krav 6 indeholdende som en 35 insert en DNA-sekvens, der koder for et fragment af poly- 82 DK 172259 B1 peptidet ifølge krav 1, kendetegnet ved, at insertet koder for et polypeptid med formlen I, hvori aminosyresekven-sen omfattende aminosyre 106 til 127 er slettet.

8. Hybridvektor ifølge krav 6 omfattende som et insert en DNA-sekvens, der koder for et fragment af polypeptidet med formlen I, kendetegnet ved, at insertet koder for et fragment af polypeptidet med formlen I, som består af aminosyresekvensen fra aminosyre 119 til amino-10 syre 321, af aminosyresekvensen fra aminosyre 134 til aminosyre 321, af aminosyresekvensen fra aminosyre 148 til aminosyre 321 eller af aminosyresekvensen fra aminosyre 150 til aminosyre 321.

9. Hybridvektor ifølge krav 6, kendetegnet ved, at 15 den er pCL2.

10. Hybridvektor ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den er pCLl.

11. Hybridvektor ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den er pPL-BF.

12. Hybridvektor ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den er pCAL8-BF/ND.

13. Hybridvektor ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den er pPL.PTIS-BF.

14. Vært transformeret med en hybridvektor ifølge et 25 hvilket som helst af kravene 6-13.

15. Vært ifølge krav 14, kendetegnet ved, at den er valgt blandt Escherichia coli HB101, Escherichia coli BZ234, Escherichia coli B1472 og Escherichia coli W3110, Saccharomyces cerevisiae-stammer, f.eks. GRF18, eller 30 pattedyrcellelinier, f.eks. kinesisk hamsterovariecelle- 83 DK 172259 B1 linie DUKX-B1.

16. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en terapeutisk virksom mængde af et polypeptid 5 ifølge krav 1.