JPS6368097A - ヒト免疫グロブリンｅ結合因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ヒト免疫グロブリンＥ結合因子（ＩｇＥ−
ＢＦ）、このポリペプチドをコードするｍＲＮ＾。

ＤＮＡ及びハイブリドベクター、このハイブリドベクタ
ーを含有する宿主、並びに前記ポリペプチド、ｍＲＮＡ
、　ＤＮＡ　、ハイブリドベクター及び宿主の製造方法
に関する。このポリペプチドはアレルギー疾患の予防及
び／又は治療のために使用することができ、そしてそれ
故にこの発明はまた前記ポリペプチドを含有する医薬に
関する。

〔発明の背景〕

アレルギー疾患は、その高い発生率（人口の２０〜３０
％）のため及び治療手段の欠如のためなお主要な健康問
題である。これに対する療法は通常抗ヒスタミン剤の使
用又は幾分有効な免疫化法に限定されている。古典的な
抗アレルギー剤は、これらが特に治療された患者におい
て種々の副作用を生じさせるために、幾つかの欠点を有
する。免疫化法は１又は２種類のアレルゲンに限定され
るが、はとんどの患者は多数のアレルゲンに感受性であ
る。さらに、除感作処置は治癒的でもなく保護的でもな
い。

大多数のアレルギー疾患が、多数の風媒アレルゲン、例
えば花粉、動物のフケ、ホコリダニ、食品抗原、医薬製
剤、例えばペニシリン、又は膜翅目の毒により媒介され
る。ＩｇＥの生産を制御する機構は実験室動物において
広範に研究されている（　Ｋ、ｌ５ｈｉｚａｋａ、Ａｎ
ｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２　＋１５９（Ｉ９８
４））　。

これらの研究は、動物モデルにおいてＩｇＥの生産を制
御する抗原特異的でないがしかしＩｇＥアイソタイプ特
異的な機構を明瞭に示した。これらの制御機構のエフェ
クター分子は、ＩｇＦ、に対するそれらの親和性に基い
てＩｇＥ−結合因子（ＩｇＥ−ＢＦ）と命名された。Ｉ
ｇＥ−ＢＦはＩｇＥ−抑制因子（ＩｇＥ−ｓｕｐｐｒｅ
ｓｓｉｖｅ　ｆａｃｔｏｒ　；　ＩｇＥ−３Ｆ）とＩｇ
Ｅ−増強因子（ＩｇＥ−ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｆ
ａｃｔｏｒ　；　ＩｇＥ−ＰＦ）とに分けられ、これら
の分子はその炭水化物含量によってのみ異る。ＩｇＥ−
３Ｆはグリコジル化されていないか、又は対応するＩｇ
Ｅ−ＰＦよりも少なくグリコジル化されている。動物モ
デルにおけるＩｇＥの実際の生産はこれら２種類のＩｇ
Ｅ−ＢＦ間の比率によって決定される。

同じ細胞が、異るＴリンパ球面集団により分泌されるグ
リコジル化阻害因子又は増強因子の影響に従ってＩｇＥ
−ＳＦ又はＩｇＥ−ＰＥのいずれかを生産することがで
きる。

Ｍ、５ａｒｆａｔｉ等（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５３，
１９７，２０７，７８３（Ｉ９８４）　）は蓋開動物に
おいて記載されているものと類似する生物学的活性を有
するＩｇＥ−８１’を分泌するヒトＢセルラインの存在
を報告している。他の研究者はヒトＴ細胞による（　Ｔ
、Ｆ、Ｈｕｆｆ及びＫ。

ｌ５ｈｉｚａｋａ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、（ＵＳＡ）　８１＋１５１４（Ｉ９８４）　）又
は遺伝子工学的技法による（ヨーロッパ特許出願階１５
５，１９２　）　Ｉｇ［！−ＢＦの生産を記載している
。Ｔ−細胞由来のＩｇＥ−ＢＦとＢ−細胞由来のそれと
の関係は今まで知られていない。本発明から明らかにな
る様に、Ｂ−細胞由来のＩｇＥ−ＢＦはＴ−細胞由来の
ＩｇＥ−ＢＦと統計的な類似性を有しない。

精製されたＩｇＥ−ＢＦはアレルギー性疾患及びこれと
関連する免疫抑制疾患の診断及び療法のために重要であ
る。特に、ＩｇＥ−抑制活性を有するＩｇｌ！−ＢＦは
アレルギー疾患の治療において有用であり、他方ＩｇＥ
−増強活性を有するＩｇＥ−ＢＦは感染に対する耐性、
例えば寄性体感染に対する耐性を増強するであろう。Ｂ
−細胞からのＩｇＥ−ＢＦの検出のためのアッセイはロ
ゼツト阻害試験に基き、この試験においてはＩｇＢのり
セプタ−（Ｐｃ　ｅ　Ｒ）を発現するＲＰＭＩ８８６６
細胞（リンパ芽球様Ｂ−セルライン）がＩｇＥ−コート
ウシ赤血球と共にロゼツト形成される。後者が最初にＩ
ｇＥ−ＢＦと共にブレインキュベートされれば、もはや
ＲＰＭＩ８８６６細胞に結合することができず、そして
それ故にロゼツトを形成する細胞の比率が低下する。こ
のアッセイは定量的ではなく、ウシ赤血球へのＩｇＥの
カップリングの可変性の故に技術的に微妙であり、そし
てロゼツトを顕微鏡観察しなければならないこと、セル
ラインが永久に生存しなければならないこと、ＩｇＥ−
コート赤血球を常に調製しなければならないこと、等の
ために煩雑であり、そのため１日に１人により少数の（
２０〜４０）試験のみが合理的に実施可能である。より
便利で、定量的で且つ実施が容易なアッセイにおいては
、ＩｇＴ！−ＢＦと交差反応する、リンパ球ＦｃεＲに
対するモノクローナル抗体が使用される。この様なモノ
クローナル抗体はＧ、Ｄｅｌｅｓｐｅｓｓｅ等、ＥＰ８
６Ｂ１０２４４．３により調製されており、そしてその
ためのハイブリドーマセルラインはパリのパスツール研
究所のＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｓに寄託されており、そして受託番号隘Ｉ　−４２
５（クローン２０８．２５　Ａ、４．３／１３５）　、
Ｉ　−４２０（クローン２０８．２５ｎ、２．１／１７
６）、ｌ−４５１（クローン２０７．２５＾、４．４／
３０）、Ｉ　−４５２（クローン２０７．２５＾、４．
４／４５）、及びＩ　−４８６（クローン２０８．２５
Ｄ、２／９４）のもとで入手可能である。対応するモノ
クローナル抗体がそれぞれＭａｂ−１３５、Ｍａｂ−１
７６、Ｍａｂ−３０，Ｍａｂ−４５及びＭａｂ−９４と
命名される。これらはまた、アフィニティークロマトグ
ラフィーによるＩｇＥ−ＢＦの効果的な精製を可能にす
る。

上記モノクローナル抗体の使用にもかかわらず、天然ヒ
トＢセルラインから単離された単一１ｇＥ−ＢＦのアミ
ノ酸配列を決定することは不可能であった。

療法目的のため、所望のＩｇＥ−結合性を有し、定義さ
れたアミノ酸配列を有し、そして容易に多量に製造する
ことができる純粋な単一ポリペプチドを手にすることが
非常に望ましい。

近年における組換ＤＮＡ法の急速な進歩がこの目的を達
成するための一般的な方法を提供している。ポリペプチ
ドの構造が未知の場合、組換ＤＮＡ技法の成功は天然源
からの目的ポリペプチドをコードするｄＮＡ又はＤＮＡ
の同定に依存している。

適当なアッセイによるｍＲＮＡの同定の後、相補的Ｄ　
Ｎ　Ａ　（ｃＤＮＡ）を調製することができる。このｃ
ＤＮＡを適当なベクターに導入することができ、得られ
たハイブリドベクターによる適当な宿主の形質転換の後
、形質転換された宿主の選択及び培養がポリペプチドの
生産及び最終的に単離を可能にする。目的のポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡの単離及び配列決定がポリペプ
チドのアミノ酸配列の決定を可能にする。ｃＤＮ＾又は
その部分を用いて目的のポリペプチドをコードする他の
ヌクレオチド配列について天然のｌｌｌＲＮＡ又はＤＮ
Ａゲノムをスクリーニングすることができる。

従って、本発明においては、ＴｇＥ−ＢＦの構造が知ら
れていないため、第一の目的はヒトＢ−細胞の分画され
たｍＲＮＡによりアフリカッメガエル［キセノプス・レ
ービスーσμ四Ｐ徂１ａｅｖｉｓ）　］の卵を形質転換
することにより目的ポリペプチドをコードするヒトＢ−
細胞のｍＲＮＡを同定し、そしてこの目的ｍＲＮＡを含
有するクローンを前記のモノクローナル抗体を用いるア
ッセイによって決定することであった。他の目的は、ｃ
ＤＮＡ及びハイブリドベクターを調製し、適当な宿主を
形質転換し、そして最後に該宿主を培養しそして目的ポ
リペプチドを単離することであった。ポリペプチドの発
現の後に翻訳後修飾が起こり得るため、単離されたポリ
ペプチドは必ずしも天然ポリペプチドと同じではな０゛
°　　　　　　　　　　　　　　　　　　以下余白〔発
明の目的〕 本発明の対象は、ヒ）Ｂ−細胞のＩｇＥ−ＢＦに関連す
るポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列を挿入部として含んで成るハイブリドベクター、該ポ
リペプチドをコードするＲＮＡ及びＤＮＡ、並びに該ポ
リペプチドの有効量を含有する医薬である。

他の対象は、前記ポリペプチド、ハイブリドベクター、
形質転換された宿主、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の製造方法
、医薬、並びに該ポリペプチドの使用である。

この発明の他の目的は、ＩｇＥ−ＢＦに関連する本発明
のポリペプチドの有効量を投与することによるアレルギ
ーの予防及び／又は治療の方法を提供することである。

これらの目的は式（Ｉ）のポリペプチド及びその断片を
コードするＤＮＡの調製により達成され７°　　　　　
　　　　　　　　　　　　　以下余白〔発明の具体的な
記載〕 のポリペプチド 本発明は、次の式（Ｉ）： で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並び
に該ポリペプチドの断片、変異体及び誘導体に関する。

式（Ｉ）中の単一文字は次の天然Ｌ−アミノ酸を示す：
　（Ａ）アラニン、（Ｃ）システィン、（Ｄ）アスパラ
ギン酸、（Ｅ）グルタミン酸、（Ｆ）フェニルアラニン
、（Ｇ）グリシン、（Ｈ）（ヒスチジン）、（Ｉ）イソ
ロイシン、（Ｋ）リジン、（Ｌ）ロイシン、（Ｍ）メチ
オニン、（Ｎ）アスパラギン、（Ｐ）プロリン、（Ｑ）
グルタミン、（Ｒ）アルギニン、（Ｓ）セリン、（Ｔ）
スレオニン、　（■）バリン、　（Ｗ）トリプトファン
、（Ｙ）チロシン。

式（Ｈのポリペプチド、並びに該ポリペプチドの断片、
変異体及び誘導体は“この発明のポリペプチド”なる単
一表現のもとにグループ化される。これらはヒトＢ−細
胞上のＩｇＥリセプターに関連し、そして膜係留配列（
ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｃｈｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ）が無い場合には前記の５ａｒｆａｔｉ等のＩｇＥ−
ＢＦに関連する。

この発明のポリペプチドの断片は式（Ｉ）の完全ポリペ
プチドの部分であって、式（Ｉ）の対応する配列中の１
０個以上で３２０個以下の連続するアミノ酸を有する。

この様な断片は例えば、第一アミノ酸又はＮ−末端から
始まって約１３３個以下のアミノ酸が欠けている式（Ｔ
）のポリペプチドである。この欠けたＮ−末端はこのポ
リペプチドをＢ−細胞の細胞質膜に結合せしめる膜係留
配列である。他の断片は、Ｎ−末端とＣ−末端との間の
アミノ酸、例えばおよそ１１０−１３０のアミノ酸、又
はＣ−末端のアミノ酸、例えばおよそ２５０−３２１の
アミノ酸が欠けている式（Ｉ）のポリペプチドである。

この発明は特に、アミノ酸１０６−１２７を含んで成る
アミノ酸配列が欠けていること、あるいはアミノ酸１２
０．１２１．１２３．１２４．１２５．１２６．１２７
．１２８．１２９゜１３０、１３１　、１３２．１３３
．１３４．１３５．１３６．１３７．１３８．１３９．
１４０゜１４１、１４２．１４３．１４４．１４５．１
４６．１４７．１４８．１４９．１５０．１５１　。

１５２、１５３．１５４，１５５．１５６．１５７．１
５８．１５９又は１６０のいずれかから始まりそして２
８２と３２１の間のアミノ酸のいずれか１つ、好ましく
は３２１において終るポリペプチドから成る群から選択
されることをコードする式（Ｉ）のポリペプチドの断片
に関する。

式（Ｉ）のポリペプチドの好ましい断片はアミノ酸１１
９からアミノ酸３２１までのアミノ酸配列から成ること
をコードする。

式（Ｉ）のポリペプチドの他の好ましい断片はアミノ酸
１３４からアミノ酸３２１までのアミノ酸配列から成る
ことをコードする。

式（Ｔ）のポリペプチドの他の好ましい断片はアミノ酸
１４８又は１５０からアミノ酸３２１までのアミノ酸配
列から成ることをコードする。これら２種類の断片はＲ
ＰＭ　Ｉ　８８６６細胞の上清に見出ずことができ、そ
してそれ故に天然のＩｇＥ−ＢＦに相当する。

これらの断片は、特にＥ、コリでの発現によって得られ
る場合、Ｎ−末端に付加されたメチオニンを有すること
ができる。

この発明のポリペプチドの変異体は、その１個（点変異
）又は複数個であっておよそ１０個までのアミノ酸の１
個又は複数個の他のアミノ酸に対する交換により特徴付
けられる。これらは異るコドンを導＜ＤＮＡレベルでの
対応する変異の結果である。

この発明のポリペプチドの誘導体は、官能基、例えばア
ミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基又はカルボキシ
ル基が誘導体化、例えばそれぞれグリコジル化、アシル
化、アミド化又はエステル化されているものである。グ
リコジル化ｍ１体においては、オリゴサツカライドが通
常、アスパラギン、セリン、スレオニン及び／又はリジ
ンに連結されている。アシル化誘導体は特に、天然有機
酸又は無機酸、例えば酢酸、リン酸又は硫酸によリアシ
ル化されており、このアシル化は通常、それぞれ、Ｎ−
末端アミノ基、又は特にチロシンもしくはセリンのしド
ロキシ基において生ずる。エステルは天然アルコール、
例えばメタノール又はエタノールのエステルである。

他の誘導体は塩、特に医薬として許容される塩、例えば
金属塩、例えばアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩
、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、
カルシウム塩又は亜鉛塩、あるいはアンモニア又は適当
な有機アミン、例えば低級アルキルアミン、例えばトリ
エチルアミン、ヒドロキシ低級アルキルアミン、例えば
２−ヒドロキシエチルアミン等により形成されるアンモ
ニウム塩である。

式（Ｉ）のポリペプチドは、ロゼツト阻害アッセイ、及
びＩｇＥ−ＢＦに特異的なモノクローナル抗体、例えば
Ｍａｂ−１３５及びＭａｂ−１７６への結合によって証
明することができるように、ＩｇＢ＝結合活性を有する
。断片、変異体及び誘導体の内１ｇＥ−結合活性を有す
るものが好ましい。

この発明のポリペプチドは組換ＤＮＡ技法により製造さ
れ、この技法はこのようなポリペプチドをコードするｍ
ＲＮへの定定、ＤＮＡ又はｃｌｌＮＡの調製、ｃＤＮＡ
ハイブリドベクターの造成、該ベクターの発現を許容す
る宿主細胞の形質転換、及び前記ポリペプチドの単離を
含んで成る。

従って、この発明はさらに式（Ｉ）のポリペプチド、並
びに該ポリペプチドの断片、変異体又は誘導体の製造方
法に関し、この方法は、ａ）式（Ｉ）のポリペプチド又
は該ポリペプチドの断片もしくは変異体をコードするＤ
ＮＡ配列を含んで成るハイブリドベクターを含有する形
質転換された宿主を培養し；又は ｂ）式（Ｉ）のポリペプチド又は該ポリペプチドの断片
もしくは変異体をコードするｍＲＮ八を適当な翻訳系に
おいて翻訳し； そして必要であれば、式（Ｉ）のポリペプチド又はその
断片もしくは変異体をそれらの誘導体に転換する； ことをコードする。

ａ）形質転換細胞は原核細胞又は真核細胞、例えば細菌
、真菌、例えば酵母、又は高等細胞、例えばヒト−セル
ラインから選択される。Ｅ、コリの菌株、例えばＥ、コ
リＨＢＩＯＩ　、　ＢＺ２３４又はＢ１４７２、使用可
能なＳ、セレビシェ−（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の
株、例えばＲＩ＋９７１であって、この発明のポリペプ
チドをコードしそして適当なプロモーター、エンハンサ
−、マーカー、シグナル配列等を含有するハイブリドベ
クターにより形質転換されるものである。

形質転換された宿主細胞は、当業界において知られてい
る方法により、通常は資化性炭素源及び窒素源並びに所
望により適当な増殖因子を含有する液体培地中で培養さ
れる。

形質転換された原核微生物及び真核微生物の増殖のため
種々の炭素源を使用することができる。

好ましい炭素源の例として資化性炭水化物、例えばグル
コース、マルトース、マンニトールもしくはラクト−ス
又は酢酸塩が挙げられ、これらはそれ自体として又は適
当な混合物として使用することができる。好ましい窒素
源の例としてアミノ酸、蛋白質、例えばトリプトン、ペ
プトン又は肉エキス、酵母エキス、マルトエキス、そし
てさらにアンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム又は
硝酸アンモニウムが挙げられ、これらはそれ自体として
、又は適当な混合物として使用することができる。

培地はさらに微量要素、例えばＫ”、Ｃａ″′。

Ｍｇ　”、Ｆｅ　”　、Ｍｇ″’　、Ｚｎ　”　、Ｃｕ
″′。

ＮＯ３−、ＳＯａ’−、ＨＰＯ＊−−、ＨｚＰＯ４−、
Ｃ１ｌ　−。

ＢＯｆｆ−ｍ−及びＭＯＯ４−を含有する。さらに、選
択圧を提供しそして発現ベクターを失った宿主の増殖を
防止する物質を添加するのが好ましい。すなわち、例え
ば、バイブリド発現ベクターがａｍｐ”遺伝子を含有す
る場合にはアンピシリンが培地に添加される。抗生物質
の添加はまた、抗生物質感受性の汚染微生物が生存でき
ないという効果を有する。宿主生物として例えば必須ア
ミノ酸について栄養要求性の酵母株が使用される場合、
プラスミドは好ましくは宿主の欠損を補完する酵素をコ
ードする遺伝子を含有する。酵母株の培養は前記アミノ
酸を欠く最少培地において行われる。

動物細胞は、はとんどの場合哺乳類の血清が補充された
市販の培地（例えばギブコ、フローラボラトリーズ）を
用いて組織培養条件下で増殖する。

細胞は固体支持体、例えばローラーボトル、ミクロキャ
リヤー、又は多孔性ガラスフィルターに付着した状態で
、あるいは適当な容器中での自由浮遊細胞として大量に
増殖する。

培養は当業界において知られている方法により行われる
。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び発酵時間は、
この発明のポリペプチドの最高力価が得られる様に選択
される。すなわち、Ｅ、コリ又は酵母株は、好気的条件
下で、振とう又は攪拌を伴う液中培養として、約２０℃
〜４０℃、好ましくは約３０℃の温度において、そして
４〜６、好ましくは約７のｐＨにおいて、約４〜３０時
間、好ましくはこの発明のポリペプチドの最大収量が達
成されるまで培養される。

ｂ）この発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、
適当な翻訳系、例えばアフリカッメガエル豆並並ｕｓ　
　１ａｅｖｉｓ）の卵母細胞中で翻訳されそして発現さ
れ得る。この発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
を雌性カニルー〇μ四以徂１ａｅｖｉｓ）の卵母細胞に
微量注入する。形質転換された卵母細胞を、Ｆｅ２が補
充されたＢａｒｔｈ溶液中で約２０℃にて約４５時間イ
ンキュベートする。インキュベーション培地を除去した
後、卵母細胞を卵母細胞溶解緩衝液中でホモジナイズし
そして遠心する。

モノクローナル抗体を用いるＲＩＡアッセイにより示さ
れるように、上清はこの発明のポリペプチドを含有する
。この発明のポリペプチドを製造するだめのこの方法は
、主として同定目的のために有用である。

この発明のポリペプチドのレベルが最高に達した時、培
養を中断し、そしてポリペプチドを単離することができ
る。ポリペプチドが適切なシグナルペプチド配列と融合
している場合、このものは細胞により直接上清に分泌さ
れる。その他の場合には、細胞をＳＤＳ又はトリトンの
ごとき洗剤で処理することにより破壊するか、又はリゾ
チーム又は同様に作用する酵素により細胞溶解しなけれ
ばならない。宿主微生物として酵母を使用する場合、グ
ルコシダーゼによる酵素的消化によって細胞壁を除去す
ることができる。この方法に代えて、又はこの方法に加
えて、機械的力、例えば剪断力（例えばＸ−プレス、フ
レンチプラス、ダイノミルによる）、又はガラスピーズ
もしくは酸化アルミニウムとの振とう、あるいは例えば
液体窒素中での凍結と解凍との反復、さらには超音波を
使用して細胞を破壊することができる。この発明のポリ
ペプチドを含有する、細胞上滑又は細胞の破壊の後に得
られた混合物を、当業界においてよく知られている方法
、特にポリエチレンイミン処理、遠心分離、及び塩、例
えば硫酸アンモニウム又は亜鉛塩による沈澱によって濃
縮することができる。

追加の精製段階は例えば超遠心分離、ダイアフィルトレ
ージョン、ゲル電気泳動、クロマトグラフ法、例えばイ
オン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラ
フィー、高圧液体クロマトグラフィー（■ＰＬＣ）　、
逆相ＦＩＰＬＣ、ファスト・プレッシャー・液体クロマ
トグラフィー（ＦＰＬＣ）等、適当なゲル濾過カラムに
よる分子サイズに従う混合物の成分の分離、透析、アフ
ィニティークロマトグラフィー、例えば抗体、物にモノ
クローナル抗体、特にＭａｂ−１３５及びＭａｂ−１７
９を用いるアフィニティークロマトグラフィー、並びに
当業界において知られている他の方法である。

好ましい態様においては、この発明のポリペプチドは、
モノクローナル抗体アフィゲル（ａＨｉｇｅｌ）、例え
ばＭａｂ−４５−アフィゲルを通して細胞上清を濾過し
、結合したＩｇＥ−ＢＦポリペプチドを、例えばｐｌ＋
２．６の０．１Ｍグリシン−■Ｃ７！緩衝液により溶出
し、目的ポリペプチドを含有する両分を陰イオン交換カ
ラム、例えばシンクロバック（ＳｙｎＣｈｒｏｐａｋ）
八Ｘ３００に負荷し、カラムを例えばＴｒｉｓ　−ＨＣ
Ｉ！緩衝液（ｐ１］７．４）により洗浄し、蛋白質を例
えば塩化すトリウム溶液、例えばＩ　Ｍ　ＮａＣｊ＋に
より溶出し、目的ポリペプチドを含有する両分を透析し
そして凍結乾燥し、透析された両分を逆相クロマトグラ
フィー、例えばシンクロパックＲＰ−４カラム上に負荷
し、そして目的ポリペプチドを例えばアセトニトリル１
０．１％ＴＦＡグラジェントにより溶出することにより
、細胞上清から単離される。

この方法は特に、ＲＰＭ　Ｉ　８８６６細胞上清から天
然ＩｇＥ−ＢＦを精製するために特に適当である。この
方法により精製された天然ＩｇＢ−ＢＦはアミノ酸配列
決定法のために十分な純度を有し、そしてこの配列決定
により、これが次のＮ−末端アミノ酸配列：及び ＭＸＬ　　　ロ　　ν　　５ＳＧＦＶＸを有する２種類
の蛋白質から成ることが明らかになった。

上記の番号は式（Ｉ）の番号に対応する。Ｘで示される
アミノ酸は決定されなかったが、式（Ｉ）又は（ＩＩＩ
）のＤＮＡ配列との比較により次の様に帰属させること
ができる：　Ｘ　＋ａｑ　−Ｒ＋　Ｘ　＋５＋　−Ｅ　
、　Ｘ＋５５＝Ｓ　、　Ｘ＋ｂｏ　＝Ｃ、Ｘｌ６３＝Ｃ
０この分析により、天然１ｇＥ−ＢＦは少なくとも２つ
のポリペプチド、すなわちＬ＋４１１から８３２１に伸
びるアミノ酸配列を有するもの及びＭ　Ｈ５゜からＳ３
２１に伸びるアミノ酸配列を有するもの〔式（Ｉ）にお
いて〕が約４０７６０の比率で存在するという結論が可
能とする。

最後に、単離された蛋白質のＩｇＥ−結合活性は当業界
においてよく知られた方法、例えばロゼツト阻害アッセ
イ、抗−ＩｇＥ抗体へのＴｇＥ−結合のブロック、アフ
ィニティークロマトグラフィー実験、及びアレルギー個
体からのリンパ球によるインビトロＩｇＥ合成の進行の
抑制の測定実験により決定することができる。

正しい配列を有するがしかし三次元的折りたたみが誤っ
ているこの発明のポリペプチドは再生実験における中間
体として有用である。

この発明はまた、この発明の方法により製造される式（
Ｉ）のポリペプチド又はその断片、変異体もしくは誘導
体に関する。

■ｕ朋」 この発明はさらに、この発明のポリペプチドを発現する
ことができる形質転換された宿主の多段階製造方法に関
し、この方法は、 １）式（Ｉ）のポリペプチド又はその断片、変異体もし
くは誘導体をコードするＤＮＡを調製し；２）得られた
ＤＮＡを適当なベクターに導入し；３）得られたハイブ
リドベクターにより適当な宿主を形質転換し； ４）未形質転換宿主から形質転換された宿主を選択し；
そして場合によっては、 形質転換された宿主からハイブリドベクターを単離し、
該ハイブリドベクターのコード領域又は非コード領域を
変形し、そして段階３及び４を再度行う； ことをコードする。

宿主の調製に使用される段階は後でさらに詳細に記載す
る。この発明はまた単一の段階にも関する。

この発明は式（Ｉ）のポリペプチド、又はその断片、変
異体もしくは誘導体をコードするＤ’Ｎ　Ａ、及びその
製造方法に関する。

この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、ａ）単
離されたｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するか、ｂ）ゲノ
ムＤＮＡを単離するか、又はＣ）化学合成する、ことに
より得ることができる。

この発明においては、ＤＮＡの構造が未知であったので
、ＤＮＡをゲノムＤＮＡから、又はＩＩＩＲＮ八を介し
てｃＤＮＡライブラリーから得なければならなかった。

ｃＤＮパライブラリ−は細胞から単離されたｍＲＮＡに
対して相補的な遺伝情報を含む。

ａ）　　　された＋ｎＲＮＡのｃＤＮＡへの゛１云−ｃ
ｌ）ＮＡライブラリーを得るため、ＩｇＥ−結合活性を
発現する細胞、特にヒ）Ｂ−細胞及びこれに由来するセ
ルラインからｍＲＮＡを単離する。このｍＲＮＡを２末
鎖ｃＤＮΔに転換する。好ましいヒトＢ−セルラインは
ＲＰＭ　Ｉ　８８６６である。他の有用なり一セルライ
ンは天然Ｂ−細胞をエプスタイン−バールウィルスによ
り不滅化することによって調製することができる。当業
界においてよく知られている標準的方法がｍＲＮＡの調
製のために使用される。

細胞膜を破壊し、そして細胞内容物を放出せしめ、これ
からｍＲＮＡを単離する。細胞膜は好ましくは、物理的
方法により、又はＳＤＳのごとき洗剤、グアニジニウム
チオシアナート、一定塩濃度又は好ましくは混合による
ホモシネ−ジョンによる細胞溶解により破壊する。フェ
ノール抽出、エタノール沈澱、遠心分離及びクロマトグ
ラフィー、好ましくは幾つかの方法の組合わせの標準的
方法によりｍＲＮＡを単離する。遠心分離は好ましくは
グラジェント、例えばＣｓＣ／ｌグラジェント上で行う
。クロマトグラフィーのため、好ましくはカラム、特に
オリゴ−ｄＴカラムを使用する。

従来技術の方法に従って、全ｍＲＮＡを直接ｄｓ−ｃＤ
ＮＡに転換することができる。好ましくは、幾つかの技
法、例えば電気泳動、クロマトグラフィー及び遠心分離
、好ましくはシュークロースグラジェント遠心分離を用
いて、この発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを
さらに濃縮する。

この発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含有す
る両分を、幾つかの方法、例えばインビボ又はインビト
ロ翻訳とこれに続＜ＩｇＥ−結合因子活性の検出により
、あるいはヌクレオチド配列が知られている場合にはオ
リゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション
により検出することができる。

インビボ翻訳系は原核系又は真核系であることができる
。好ましいインビボ翻訳系はＭａｎｉａｔｉｓ等（Ｉ）
により記載されたアフリカッメガエル７　１ａｅｖｉｓ
）卵母細胞系である。インビＩ・口翻訳系は例えば小麦
胚及びラビット網状赤血球ライセード系であり、いずれ
も市販されている。

ＩｇＥ結合因子性のスクリーニングのための検出系にお
いては、好ましくは式（Ｉ）のペプチドに対するモノク
ローナル抗体、特にＭａｂ−１３５又はＭａｂ−１７６
を用いる。他の可能な系においてはｌ　ｇＥタイプの免
疫グロブリンを常用のイムノアッセイにおいて使用する
。

未分画の又は分画されたｍＲＮＡ由来のｍＲＮＡのプー
ルから、当業界において良く知られている方法によりｄ
ｓ−ｃＤＮＡを得ることができる。好ましい一般的方法
力＜Ｍａｎｉａｔｉｓ等（Ｉ）、Ｏｋａｙａｍａ及びＢ
ｅｒｇ（２）、並びにＨｅ１ｄｅｃｋｅｒ　（３）によ
り記載されている。一般に、ｍＲＮＡを逆転写酵素を使
用してまず５ｓ−ｃＤＮＡに転換し、そして次に逆転写
酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｋｌｅｎｏｗ断片
）を用いて２木鎖ｃＩＩＮＡに転換する。この発明にお
いては、この方法は好ましくはＭａｎｉａｔｉｓ等（Ｉ
）により記載された方法に従って行う。ｄｓ−ｃＤＮＡ
の合成をプライムするために２つの方法のいずれかを使
用することができる。１つの方法においては５ｓ−ｃＤ
ＮＡの天然ループ形成を用いる。第二の方法は５ｓ−ｃ
ＤＮＡをボモボリマーテイル、例えばポリ−ｄＣ又はポ
リ−ｄＴによりテイル形成することにより行う。

その対応するポリペプチドが検出系において最高の活性
を示すｍＲＮＡ画分を当業界においてよく知られている
方法により相補的ｃＤＮＡに転写する。

ｍＲＮＡ及びプライマーとしてのオリゴ−ｄＴを混合す
る。次に、ｄＮＴＰを出発物質として添加し、そしてｃ
ＤＮＡ−ｍＲＮＡバイブリド分子の合成を逆転写酵素に
より実現する。ＲＮＡ分子をＮａ０ｌｌの添加により分
解する。ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡポリメ
ラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を混合し、そしてこの混合
物を適当な温度、例えば１２℃〜１５℃においてインキ
ュベートする。この混合物をヌクレアーゼＳ１と共にイ
ンキュベートし、そしてこの発明のポリペプチドをコー
ドするｍＲＮＡに対応するｄｓ−ｃＤＮＡを得る。

増幅及び構造の解明のため、得られたｄｓ−ｃＤＮＡを
適当なベクター、例えばプラスミドｐＵｃ−ＫＯに連結
し、そして得られたハイブリドベクターを、後でさらに
詳細に記載するように、適当な宿主、例えばＥ、コリＨ
ＢＩＯＩを用いて複製する。ハイブリドベクターの再単
離、及び挿入されたｃＤＮＡの回収により、この発明の
ポリペプチドをコードするＤＮＡの構造決定が可能とな
る。得られたハイブリドベクターｐＣＬ−２及びｐＣＬ
−１はそれぞれ式（Ｉ［）及び式（ＩＩＩ）の挿入部を
含有する。ｐＣＬ−２のｃＤＮＡ挿入部は次の式（ＩＩ
）： ■ で表わされる配列を有する。

式（ＩＩ）のＤＮＡ配列中、式（Ｉ）のポリペプチドを
コードする領域がアミノ酸記号により標示されている。

非コードフランキング領域もまた、単離されたｍＲＮＡ
の非コード領域である。制限部位ｍＲＮＡから得られた
他のｃＤＮＡは式（Ｉ［［）の配列を有し、この場合、
式（Ｉ）のポリペプチドのアミノ酸１０６−１２７をコ
ードするヌクレオチド、すなわち式（［）のヌクレオチ
ド３１６−３７８が欠失しており、そして他のコード領
域及び２つのフランキング配列の部分が式（Ｉ［）のＤ
ＮＡ配列と同一である。このｃＤＮＡ挿入部はｐＣＬ−
１中に見出され、そして次の式（■）： により表わされる配列を有する。

ｂ）゛ツムＤＮＡの゛ この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを得るため
の他の適当な方法は組織又は細胞培養のゲノムＤＮＡか
ら前記ＤＮＡを単離することから成る。細胞を好ましく
はＳＤＳ及びプロテイナーゼＫを用いて溶解し、そして
フェノールによる抽出を反復してＤＮＡの脱蛋白質を行
う。ＲＮＡを好ましくはＲＮＡアーゼにより消化する。

得られた原料ＤＮＡを適当な制限酵素例えばＨａｅｌ［
＋及びＡｌｕｌにより部分消化し、そして１５〜２０ｋ
ｂの断片を単離し、そして適当なファージ又はコスミド
、例えばシャロン４Ａ又はＥＭＢＬ−３フアージ中で増
幅し、そして目的の配列について例えば放射能標識され
たＤＮＡプローブにより、又は前記の他の方法によりア
ッセイする。

Ｃ）−匡凡込！ＨじＬ叡威 この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの第三の調
製方法は化学合成である。ＤＮＡの化学合成はＳ、Ａ、
Ｍａｒａｎｇ（４）により要約されている。

既知の合成法が４０又は６０塩基までのポリヌクレオチ
ドの良好な収量、高純度、且つ比較的短時間での調製を
可能にする。適切に保護されたヌクレオチドをに、　Ｌ
、　Ａｇａｒｗａｌ等（５）のホスホジエステル法、Ｃ
，Ｂ、Ｒｅｅｓｍ（６）のホスホトリエステル法、又は
Ｒルルｅｔｓｉｎｇｅｒ等（６ａ）のホスファイトトリ
エステル法により連結する。オリゴヌクレオチド及びポ
リヌクレオチドの合成の単純化が固相法により可能であ
り、この方法においては核酸鎖が適当なポリマーに結合
される。ＤＮＡ合成機を使用するのが有利である。

実際の２本鎖ＤＮＡは、化学合成された短かいがしかし
オーバーラツプするセグメントから酵素的に構成するこ
とができる。例えば、Ｋｈｏｒａｎａ等（７）によれば
、両ＤＮＡ鎖からのオーバーラツプするポリヌクレオチ
ドが使用され、これらが塩基対合によって正しい配置に
維持され、そして次にＤＮＡリガーゼ酵素により化学的
に連結される。

他の可能性は、各場合において２本のＤＮＡ鎖からの１
つのポリヌクレオチド配列を、ＤＮＡ−ポリメラーゼ、
例えばＤＮＡ−ポリメラーゼ■、ポリメラーゼ■のＫｌ
ｅｎｏｗ断片もしくはＴ４ＯＮＡポリメラーゼ又は逆転
写酵素と共に４種類の必要なデオキシヌクレオシドトリ
ホスフェートの存在下で、短いオーバーラツプするセグ
メントと共にインキュベートする。これによって２本の
ポリヌクレオチド配列が塩基対合によって正しい配置に
維持され、そして必要なヌクレオチドが酵素により補充
されて完全な２本鎖ＤＮＡが得られる（Ｓ、Ａ、Ｎａｒ
ａｎｇｄ）工　（Ｉ　のポリペプチドの　　　コードｊ
一式（Ｉ）のポリペプチドの断片をコードするＤＮＡは
、式（Ｉｆ）もしくは（＋１１）のＤＮＡ又はこれを含
有するベクターを適当な制限酵素及び／又は適当なエキ
ソヌクレアーゼで消化し、そして必要な場合には得られ
たＤＮＡ断片に化学的方法で合成されたＤＮＡ断片を補
充し、あるいは所望の断片を全体として化学合成するこ
とにより得られる。

適当な制限酵素及びその制限部位は式（ＴＩ）に示され
ている。式（Ｉ）のポリペプチド配列Ｄ１，９−８３２
１をコードするＤＮＡ断片の調製のため、Ｂｇｌｌｌ及
びＢｓａＩが適当である。ポリペプチド配列Ａｌ３４　
３３２１をコードするＤＮＡ断片は１ｌｉｎｄ■及びＲ
ｓａＩＣ式（ＩＩ）、第４図を参照のこと〕で制限酵素
処理することにより得られる。ＤＮＡ断片の調製はまた
段階的に達成することができ、この場合まずより大きな
りＮＡ断片を例えばＨｉｎｃ■及びＲｓａＩによる制限
酵素処理により調製し、これを適当なベクターにサブク
ローニングし、次にこれをそれぞれＢｇｌｌｌ及びＢａ
ｍＨＩ　＜又は旧ｎｄＩ［［により切断する（第３図及
び第４図を参照のこと）。

部分的又は全体的化学合成と制限酵素及び／又はエキソ
ヌクレアーゼの使用との組み合わせが、式（ＩＩ）に含
まれる所望のＤＮＡ断片の調製を可能にする。

この発明はまた、式（ＩＩ）のＤＮＡの他のＤＮＡ断片
に関する。これらの断片はＩｇＥ−結合活性を有するポ
リペプチドをコードしており、又は天然もしくは合成に
由来する前記のようなりＮＡを同定するためのプローブ
として使用することができる。好ましいＤＮＡ断片は式
（Ｉ）に含まれ好ましいポリペプチド断片をコードする
ものである。ＤＮＡプローブは７個以上、好ましくは約
１５個以上のヌクレオチドの配列を有する。

２、　バイブ１　′ベタ　−の量。＋１この発明のハイ
ブリドベクターは、式（Ｉ）のポリペプチド又はその断
片、変異体もしくは誘導体をコードするＤＮＡを適当な
ベクターに連結することにより調製される。

適当なベクターは組み込まれたバ・７センジヤーＤＮＡ
のためのキャリヤーであって宿主微生物例えばヒト細胞
を形質転換するために使用することができるものであり
、そして宿主内で複酸することができるものである。プ
ラスミド、ファージ又はコスミドがベクターとして適当
である。適当なベクターは定められた位置にＤＮＡ挿入
部を担持する。

一般に、この様なベクターはレプリコン及び制御配列、
すなわちプロモーターを含有し、これらは、これらが使
用される宿主細胞と適合性の種に由来する。ベクターは
通常、レプリコン部位、及び形質転換された細胞の表現
型選択を行うことができる配列（マーカー遺伝子）を担
持する。適当なマーカーは宿主に抗生物質耐性又は重金
属耐性を付与し、又は宿主の遺伝的欠損を補完する。こ
の様なベクター中の他の有用な配列はエンハンザ−及び
アクチベーター配列である。

出発ベクターは広範囲の原核生物及び真核生物にわたる
宿主細胞において使用するために適当なものである。ベ
クターは形質転換に使用される宿主細胞に依存して選択
される。

好ましい出発ベクターは当業界において入手可能なプラ
スミドＤＮＡ及びバクテリアファージＤＮＡである。特
に、プラスミドｐＢＲ３２２及びその誘導体が有用であ
る。この様な誘導体は例えばプラスミドｐＵＣ−８、ｐ
ＵＣ−９、ｐＭＣ−９、ｐＧＥＭ”　−１及びｐＧＥＭ
”−２である。バタテリオファージベクターの内λファ
ージのＤＮＡ、例えばλファージｇｔ−１１のＤＮＡが
好ましい。他の好ましいファージベクターはシャロン４
Ａ及びＥＭＢＬ−３フアージである。λクローニング系
はＭａｎｉａｔｉｓ等（Ｉ）により記載されている。

例えば式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のパンセンジャーＤＮ
Ａを担持するベクターはハイブリドベクターと称される
。

得られたＤＮＡを常法により出発ベクターに連結する。

出発プラスミドはまず適当な制限酵素により線状化する
。例えばプラスミドｐＵＣ−ＫＯはＰｓｔｌにより線状
化する。次にｄＧＴＰ及びターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフェラーゼの存在下でｄＧテイルを付与
する。２重鎖ｃＤＮＡ挿入部にｄｃＴｒ’及びターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの存在下
でｄＣ−テイルを付与する。

ｃＤＮ＾及びベクターの両者を一緒にしてハイブリドベ
クターを得る。バクテリアファージ、例えばラムダ（λ
）はゲノムライブラリーを造成するために好ましい。λ
クローニング系はＭａｎｉａｔｉｓ等（Ｉ）により記載
されている。適当なベクターＤＮＡを適当な制限酵素に
より完全消化して、そして速度勾配遠心又はゲル電気泳
動により中央断片からレフトアーム及びライトアームを
分離する。他の方法においてはレフトアーム及びライト
アーム内に認識部位を有しない制限酵素により原料断片
の部分を消化する。単離されたゲノムＤＮＡを１５〜２
０ｋｂの長さの断片に部分消化する。この後、アームの
末端と適合する末端を有する外来ＤＮＡの断片とアーム
とを連結する。

適当なりＮＡ挿入部をもとのクローニングのために使用
したもとのベクターから適当な発現ベクターにレクロー
ニングする。この目的のため、適切な制限酵素（第３図
及び第４図）を最終的にはエキソヌクレアーゼ、特にＢ
ａ１３１と組み合わせて使用して所望のＤＮＡ断片を生
じさせる。これらの断片を、平滑末端を直接使用するこ
とにより、又は適当な化学合成されたオリゴヌクレオチ
ド架橋の付加により、適当な発現ベクターに組み込む。

末端の変形のため、例えばＨｉｎｄＩ［及びＢｇｌＩ［
を使用することができる。この方法はこれらの特定の制
限酵素に限定されない。化学合成されたオリゴヌクレオ
チドと組合わせて適当な制限酵素を用いて、発現ベクタ
ーとＤＮＡ挿入部との間の望ましい連結を行うことがで
きる。

この発明はさらにハイブリドベクターに関し、このハイ
ブリドベクターでは式（Ｉ）のポリペプチド又はその断
片、変異体もしくは誘導体をコードするＤＮＡが場合に
よっては発現制御配列に作用可能に連結されている。

発現のために、適当なバイブリド発現ベクターが使用さ
れる。バイブリド発現ベクターなる語は、ＤＮＡ配列が
その発現を行うことができる他の配列、すなわちオペレ
ーター、エンハンサ−及びプロモーター配列に作用可能
に連結されている、ベクター中に含まれるＤＮＡ配列を
発現することができる特定のベクターを包含する。要約
すれば、発現ベクターは機能的定義により特徴付けられ
、その中に含まれる特定のＤＮＡを発現せしめることが
できる任意のＤＮＡ配列を意味する。この発明は、当業
界において知られている発現ベクターから作ることがで
きるすべての形態の発現ベクター、及びこの発明のポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ挿入部を含有する機能的同
等物を包含することが意図される 幾つかの発現制御配列を遺伝子発現の制御のために用い
ることができる。微生物発現ベクターは一般にそれ自体
の蛋白質の発現のために微生物宿主により使用されるプ
ロモーターを含有する。組換Ｄ　Ｎ　Ａ　Ａ成のために
最も一般に使用されるプロモーターにはβ−ラクタマー
ゼ及びラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ等（９）
；　Ｇｏｅｄｄｅｌ等（Ｉ０）　）、トリプトファン（
ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅ−ｄｄｅｌ等（Ｉ１）
　）　、又はバクテリオファージプロモーター系、例え
ばλ由来のＰＬプロモーターが含まれる。これらが最も
一般的に使用されるが、他の微生物プロモーターが見出
されそして使用されており、そしてこれらのヌクレオチ
ド配列に関する詳細が公表されており、当業者はこれら
をプラスミドベクターと機能的に連結することができる
（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ等、（Ｉ２）　）　、原理的に
は、選択された宿主中で複製しそしてこの発明のポリペ
プチドを発現せしめるすべての宿主が適当である。この
発明のポリペプチドの発現のために適当なベクターの例
としてプラスミドｐＫＫ２２２−３　、　ｐＤＲ７２０
及びｐＰＬ−λ、又はλ−ｇｔｌｌのごときバクテリオ
ファージλのベクターを挙げることができ、いずれも市
販されている（ファルマシャ、スエーデン；ブロモか、
パイオフニック、米国）。この発明の好ましいベクター
はタイプｐＩＨ−ｏｍｐＡ　ＣＣｈａｒａｙｅｂ等、（
Ｉ３）　）の発現及び分泌ベクター、及びＰＬプロモー
ターを含有するベクターである。

酵母における複製及び発現のために適当なベクターは１
又は複数の、例えば２個の酵母レプリコン開始部及び１
又は複数の酵母用選択マーカーを含有する。酵母レプリ
コン開始部、例えば染色体自律複製セグメン）　（ａｒ
ｓｌ）又は２μｏｒｉを含有するハイブリドベクターは
形質転換の後酵細胞内で染色体外に維持されそして自律
複製する。酵母のための適当なマーカー遺伝子は特に、
抗生物質耐性を宿主に付与するもの、あるいは栄養要求
性酵母変異株の場合には宿主の欠損を補完する遺伝子で
ある。対応する遺伝子は、例えば抗生物質シクロヘキシ
ミドに対する耐性を付与し、又は栄養要求変異株におい
て原栄養性を提供する遺伝子、例えばＵＲＡ３　、　Ｌ
ＥＵ２　、　ＨＩＳ３、又は特にＴＲＰ　ｎ遺伝子であ
る。酵母ハイブリドベクターはさらに、好ましくは、ベ
クター又はその中間体の造成及びクローニングを細菌宿
主中でも行うことができるように、細菌、特にＥ、コリ
のレプリコン開始部及びマーカー遺伝子を含有すること
ができる（シャトルベクター）。酵母での発現のために
適当な発現制御配列は、例えば高度に発現される酵母遺
伝子の発現制御配列である。すなわち、ＴＲＰ　ｎ遺伝
子、＾Ｄ■■又はＡＤＨｎ遺伝子、ホスファターゼ（Ｐ
Ｈ０３又はＰＨ０５）遺伝子、イソチトクローム遺伝子
のそれぞれのプロモーター、又は解糖系に関与するプロ
モーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３
−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）又は３
−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）のプロモータ
ーを使用することができる。好ましいベクターは増殖条
件の変化によってターンオン又はターンオフされ得るプ
ロモーターを含有する。

例えば、Ｐｌ＋０５プロモーターは、培地中の無機リン
酸イオンの濃度を上昇又は低下せしめるだけで抑制又は
抑制解除することができる。

このような細胞のための発現ベクターは、発現されるべ
き遺伝子の前に位置する多才な（ｖｅｒｓａｔｉｌｅ）
そして強力なエンハンサー−プロモーターユニットを含
有する。ｃＤＮＡが発現されるべき場合、ＲＮＡスプラ
イス部位、ポリアデニル化部位及び最後に転写停止配列
が遺伝子に付加される。哺乳類細胞において使用するた
め、発現ベクター上の制御機能はしばしばウィルス材料
によって提供される。

例えば、一般に使用されるエンハンサーープロモーター
ユニットはシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）、ラウ
ス肉腫ウィルス、アデノウィルス２、又はマウス及びヒ
ト−サイトメガロウィルスに由来する。

特に、マウス−サイトメガロウィルスの直接初期遺伝子
（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｇｅｎｅ）のエン
ハンサー−プロモーターユニット、及びヒトα−グロビ
ンプロモーターと組合わされたＳＶ４０のエンハンサ−
が適当である。さらに、誘導性プロモーター、例えば、
ヒートショック遺伝子又はメタロチオネイン遺伝子由来
のプロモーターも有用である。さらに、・目的遺伝子配
列に通常関連しているプロモーター又は制御配列を使用
することもできる。複製開始点は、例えばＳＶ４０又は
他のウィルス起因（例えばポリオーマウィルス、アデノ
ウィルス、ｖｓｖ　、　ｓｐｖ等）の外来開始点を含有
するようにベクターを造成することにより提供され、又
は宿主細胞染色体複製機構により提供される。ベクター
が宿主細胞染色体に組込まれる場合、後者の方法が一層
効果的である。

クローン化されたＤＮＡ挿入部を含有するベクターＤＮ
Ａの宿主からの再単離は常法に従って、特に宿主細胞の
溶解、並びに遠心分離、特にＣ５Ｃｊ！密度遠心分離及
びフェノール／クロロホルムによるＤＮＡの精製により
達成される。

この発明はまた、式（Ｉ）のポリペプチド又はその断片
、変異体もしくは誘導体をコードするＤＮＡ配列を挿入
部として含有するハイブリドベクターに関する。

特に、この発明は、挿入部が、アミノ酸１０６４２７を
含んで成るアミノ酸配列が欠けている式（Ｉ）のポリペ
プチド；あるいは アミノ酸１２０．１２Ｌ　１２２．１２３．１２４．１
２５．１２６．１２７゜１２８、１２９．１３０．１３
１　、１３２．１３３．１３４．１３５．１３６．１３
７．１３８゜１３９、１４０．１４１　、１４２．１４
３．１４４．１４５．１４６．１４７．１４８．１４９
゜１５０、１５１．１５２．１５３．１５４．１５５．
１５６．１５７．１５８．１５９又は１６０のいずれか
から始まりそしてアミノ酸２８２と３２１との間のいず
れかのアミノ酸で終るポリペプチドから成る群から選択
される式（Ｉ）のポリペプチドの断片；あるいは、 アミノ酸１１９からアミノ酸３２１までのアミノ酸配列
から成る式（Ｉ）のポリペプチドの断片；あるいは、 アミノ酸１３４からアミノ酸３２１までのアミノ酸配列
から成る式（Ｉ）のポリペプチドの断片；あるいは、 アミノＭ１４８からアミノ酸３２１までのアミノ酸配列
から成る式（Ｉ）のポリペプチドの断片；あるいは、 アミノ酸１５０からアミノ酸３２１までのアミノ酸配列
から成る式（Ｉ）のポリペプチドの断片；をコードして
いることをコードする、式（Ｉ）のポリペプチドの断片
をコードしているＤＮＡ配列を挿入部として含んで成る
ハイブリドベクターに関する。

特に、この発明は式（ＩＩ）もしくは（ＴＩＴ）のＤＮ
Ａ配列又はその断片もしくは変異体を含んで成るハイブ
リドベクターに関する。

特定のハイブリドベクターは、Ｉ）Ｃｌ３　、　ｐｃＬ
ｌ　。

ｐＦＭ−１，ｐＰＨ−２，ｐＰＬ−ＢＦ、　ｐＪＤＢ２
０７Ｒ／ＲＨＯ５−ＢＦ、　ｐＣＡＬ５−Ｒ／ＮＤ、　
ｐＣＡＬ８−ＢＦ／ＮＤ及びｐＰＬ、ＰＴＩＳ−ＢＦで
ある（第１図〜第８図）。

この発明の他のハイブリドベクターは、式（Ｉ［）の挿
入部の一部分に１００％相同である少な（とも１５ヌク
レオチドのＤＮＡ配列を含んで成る。

３、　０）　云 強力な発現ベクターに続き、適合性の宿主細胞が、この
発明の目的ポリペプチドの発現のために使用される。一
般に、ＤＮＡ配列のクローニング及びベクターの組立て
のためには原核生物が好ましい。組立てられたベクター
は次に適当な宿主細胞に形質転換され、この場合原核細
胞及び真核細胞を使用することができる。使用すること
ができる微生物種にはＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　、
バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ）　、バシルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍｏ　ｈｉ
ｌｕｓ）　、及び他のエンテロバクテリアソセー（Ｅｎ
’ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモ
ネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　　垣
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）−又はセラチア・マルセセン（Ｓｅ
ｒｒａｔｉａ　　ｍａｒｃｅｓ’ａ■０、及び色々なシ
ュードモナス（ハ堕動μ〃ｕの種が含まれる。特に、Ｅ
、コリの株、例えばＥ、コリＢ、　ＨＢ　１０１．ＢＺ
　２３４．　Ｘ１７７６、　Ｗ３１１０．Ｊ＾２２１及
びに１２が有用である。これらの例は言うまでもなく限
定的なものではなく例示的なものである。

原核生物に加えて、真核微生物、例えば酵母を使用する
こともできる。真核微生物の間ではサッカロミセス・セ
レビシエー１又は通常のパン酵母が最も一般的に使用さ
れるが、他の多くの種も利用可能である。サツカロミセ
スでの発現のため、例えばプラスミドＹＲｐ７　（Ｓｔ
ｉｎｃｈｏｍｂ等（Ｉ４）　　；Ｋｉｎｇｓｍａｎ等（
Ｉ４ａ　）　；　Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ等（Ｉ５）　）を
使用することができる。

微生物のほかに、多細胞生物由来の細胞培養物を宿主と
して使用することもできる。原理的にはを推動物又は無
を推動物のいずれからの任意の細胞培養物が有効である
が、しかしなからを推動物の細胞培養物が最も興味深い
。この様な有用なセルラインの例としてＶｅｒｏ細胞、
Ｈｅ１ａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＯＨ）
セルライン、Ｂｏｗｅｓメラノーマセルライン、ＲＰＭ
Ｉ８８６６、及びＣｏ５−７セルラインが挙げられる。

得られたハイブリドベクターＤＮＡの受容体への形質転
換は、例えばＭａｎｉａｔｊｓ等（Ｉ）により記載され
ているような、当業界において良く知られている方法に
より達成される。細菌はハイブリドベクターＤＮＡによ
り、例えばＣａＣｊ２形質転換法により形質転換される
。

ベクターとしてのλファージのＤＮＡとの組合わせにお
けるＥ、コリ宿主細菌のための他の適当な形質転換法は
ハイブリドベクターＤＮＡのインビトロパッケージング
及び前記細菌の感染である。

インビトロパッケージングは主として入手可能なパソケ
ージングキソト（ファルマシア、スエーデン：ベーリン
ガー、マンハイム）を用いることにより達成される。感
染はＭａｎｉａｔｉｓ　（Ｉ）、　２７５頁、により記
載されているＭｇＣ７！２法により行われる。

酵母の形質転換は、グルコシダーゼによる酵母細胞壁の
酵素的除去、得られたスフェロプラストのポリエチレン
グリコール及びＣａ＋＋イオンの存在下でのベクターに
よる処理、並びに寒天へのスフェロプラストの包埋によ
る細胞壁の再生を含んで成る。好ましくは、再生寒天は
再生及び形質転換された細胞の選択が同時に可能なよう
に調製される。

組織培養で増殖したを推動物細胞の形質転換は当業界に
おいてよく知られている幾つかの方法の１つを用いて達
成することができる。細胞核へのＤＮＡの直接注入、Ｅ
、コリのプロトプラストと他の宿主細胞との融合、又は
ＤＮＡとリン酸カルシウムとの間の同時沈澱物の添加を
用いることができる。これに続く、形質転換された細胞
の選択は、発現ベクター中に共有結合により組み込まれ
ているか又は別個に添加される選択マーカーを用いて行
うことができる。選択マーカーは０４１８及びハイガロ
マイシンのごとき抗生物質に対する耐性を付与する遺伝
子、又は宿主の遺伝的欠損、例えばチミジンキナーゼ又
はヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼの
欠損を補完する遺伝子を包含する。

４、７　云　された　主の゛ ベクターに組み込まれ選択ユニットの性質を担持する形
質転換された宿主は、形質転換された宿主のみが生存す
る適当な選択条件下で細菌を増殖せしめることにより未
形質転換宿主から選択される。バタテリオファージとの
組合わせにおける他の選択方法は、プレートされたＥ、
コリ宿主細菌上でのプラーク形成である。

この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入
部として含有するハイブリドベクターを担持する宿主の
スクリーニングは、その様なポリペプチドの断片をコー
ドする放射能標識されたオリゴヌクレオチドプローブを
用いることにより、又は前記ＤＮＡ挿入部のポリペプチ
ド生成物についてスクリーニングすることにより達成す
ることができる。ハイブリダイゼーションは特に、この
発明のポリペプチドの断片をコードする約１２個又はそ
れより多くの連続するヌクレオチドを含有するｍＲＮＡ
又は任意のオリゴヌクレオチドプローブを用いて行われ
る。

特に、この発明のポリペプチドをコードする挿入部をコ
ードするハイブリドベクターにより形質転換されたＥ、
コリ宿主の選択は、アガロースプレート上に拡げられた
ｃＤＮＡライブラリーに由来するレプリカフィルターへ
のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーショ
ンにより行うことができる。オリゴヌクレオチドプロー
ブは、Ｔ４−キナーゼ酵素を用いて３２ｐ−α＾ＴＰに
より５′−末端において、又はファージＭ１３にクロー
ン化されたこの発明のポリペプチドをコードするｃＤＮ
＾の任意の断片を用いるＫｌｅｎｏｗポリメラーゼによ
るプライム合成により内部的にラベルすることができる
。

スクリーニング目的のための蛋白質生成物はインビトロ
又はインビボ翻訳、Ｍａｎｉａｔｉｓ等（Ｉ）に記載さ
れているように、特にアフリカッメガエル■旦並翌１ａ
ｅｖｉｓ）の卵母細胞系を用いて得られる。翻訳された
蛋白質生成物はモノクローナル抗体、例えばＭａｂ−４
５、Ｍａｂ−１７６及びＭａｂ−１３５を用いることに
より、あるいは機能的試験系、例えば５ａｒｆａｔｉ等
（Ｉ７）によるロゼツト阻害試験において行われるよう
なポリペプチドへのＩｇＥの結合を用いることにより出
検される。

この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を担持
する組換ファージは、ハイブリダイゼーションのために
前記ポリペプチドをコードするＤＮＡの断片を含んで成
る放射能標識されたヌクレオチド配列を用いるハイブリ
ダイゼーションにより同定される。この方法に代えて、
これらはＭａｂ−１３５及びＭａｂ４７６のごときモノ
クローナル抗体を用いる免疫学的スクリーニングにより
検出される。

ハイブリドベクターのコード領域又は非コード領域の変
形は例えばｌｄ）において前記した方法により達成され
る。

この発明はさらに、例えば花粉、ネコのフケ、家庭のホ
コリダニ等あらゆる種類の抗原に対してアレルギー性で
ある患者におけるアレルギー状態の治療又は予防のため
に、ＩｇＥ結合活性を有するこの発明のポリペプチドを
使用することに関する。母乳が提供されない特に危険性
の高い新生児を含む、危険期間中の高危険患者の治療が
特に重要であろう。この発明のポリペプチドは経腸的に
、例えば鼻内に、直腸に、又は経口的に、あるいは非経
口的に、例えば筋肉内に、皮下に又は静脈内に、通常は
投与単位形として、例えば錠剤、火剤、アンプル、バイ
アル又は生薬として適用される。

投与されるべきポリペプチドの量はその比活性、患者の
体重及び一般的症状、疾患の重症度、投与の態様等に依
存し、そして医師の判断に基かなければならない。一般
に、体重１　ｋｇ　１日当り１１００Ｊｔ〜５０００■
の量が投与される。

この発明はさらに、抗アレルギー的に有効な量のＩｇＥ
−結合活性を有するこの発明のポリペプチドを、経口投
与、直腸投与、鼻内投与又は非経口投与、すなわち筋肉
内投与、皮下投与、又は腹腔内投与のために適当な医薬
として許容される常用のキャリヤーと共に含んで成る医
薬に関する。

適当な錠剤、カプセル、固体粉末を含有するバイアル、
又はネブライザー、スプレー、バイアル、アンプル、及
び等であって、注入溶液、好ましくは水溶性又は懸濁液
を含有する類似のものが存在し、これらは使用前に、例
えば活性成分をキャリヤー、例えばマンニトール、グル
コース、アルブミン等と共に含有する凍結乾燥調製物か
ら調製することができる。医薬製剤は無菌化することが
でき、そして所望により助剤、例えば防腐剤、安定剤、
乳化剤、溶解剤、緩衝剤、及び／又は浸透圧調節塩を混
合することができる。無菌化は小孔サイズ（０，４５１
Ｍ以下の直径）のフィルターを通して無菌濾過すること
により達成することができ、次に所望により凍結乾燥を
行うことができる。無菌性を維持するために抗生物質を
添加することもできる。

この発明の医薬調製物は、単位投与当り１〜２０００■
の医薬として許容される担体、及び単位投与当り好まし
くは２〜５０■の活性成分を含んで成る単位投与剤、例
えばアンプルに調製することができる。

この発明はまた、この発明のポリペプヂ１′を医薬とし
て許容される担体と混合することを特許とする医薬の製
造方法に関する。

この薬剤は、それ自体公知の方法により、例えば常用の
混合、溶解、凍結乾燥等の方法により製造され、そして
約０．１％〜１００％、特に約１％〜５０％の活性物質
を含有する。

この発明の新規なポリペプチドの、人体の予防的及び治
療的処置のための使用もこの発明の対象である。

この明細書を通して使用される略号は次の意味を有する
。

ｂｐ　　　　塩基対 ＢＳ＾　　ウシ血清アルブミン ｃＤＮＡ　　　相補的ＤＮＡ ｃｐｍ　　　分当たりカウント（放射性崩壊）ｄＡ　　
　　２’−デオキシアデノシンｄＡＴＰ　　　２’−デ
オキシアデノシントリホスフェート ｄＣ２’−デオキシシチジン ｄＣＴＰ　　　２’−デオキシシチジントリホスフェー
ト ｄＧ　　　　２’−デオキシグアノシンｄＧＴＰ　　　
２’−デオキシグアノシントリホスフェート ｄＴ　　　　２’−デオキシチミジン ｄＴＴＰ　　　２’−デオキシチミジントリホスフェー
ト ＤＮ八　　デオキシリポ核酸 ｄＮＴＰ　　　ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴ
ＴＰの混合物ｄｓ　　　　２本鎖 ＨＴ７　　　１．４−ジチオスレイトールＥＤＴへ　　
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムＦＣ５ウシ胎児血
清 ＨＡＴ　　　ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジ
ン ＨＢＳＳ　　　１ｌａｎｋの平衡塩溶液ＨＴ　　　　ヒ
ポキサンチン／アミノプテリンＨｅｐｅｓ　　Ｎ　　２
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスル
ホン酸 ＩｇＥ　　　免疫グロブリンＥ ｍＲＮＡ　　　メツセンジャ−ＲＮＡ ｌｌ１ｉｎ分 ＰＢＳ　　　リン酸緩衝化生理的塩溶液Ｐｉｐｅｓ　　
ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸） ＰＭＳＦ　　　フェニルメチルスルホニルフルオリドＲ
Ｉ＾　　ラジオイムノアッセイ ＲＮＡ　　　　リボ核酸 ｒｐｔｎ　　　分当り回転数 ＳＤＳ　　　　ドデシル硫酸ナトリウムｓｓ　　　　単
鎖 Ｔｒｉｓ　　　）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン ｔＲＮＡ　　　）ランスファーＲＮＡ 河　　　マイクログラム 撒」」■γ詑託 プラスミドｐＣＬ−２を含有するエラセリシャ・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ旦）　ＨＢ１０１／ｐ
ＣＬ−２は、１９８６年７月３０日に、Ｄ−３４００ゲ
ツチンゲン・グリセバッハストラッセ８のＤｅｕｔｓｃ
ｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｆｕｒ　Ｍｉｋｒｏ−ｏｒｇ
ａｎ　１ｓｌＩｌｅｎに受託番号ＤＳＭ３８０７として
寄託された。

次の例は、本発明を例示するものであって、限定するも
のではない。

■ 次の緩衝溶液及び培地が使用される： 寒天；２％寒天が補充されたＬＢ−ブイヨン。

溶離緩衝液：　１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐ
Ｈ７，５，１ｍＭのＥＤＴＡ、　　０．２％ＳＯ３。

ＬＢ−プロス：１％バタトートリプトン（Ｄｉｒｃｏ）
、０．５％バクト酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、１７０ｍ
ＭのＭａｃｅ　；　ＮａＯＨによりｐＨ７，５に調整。

細胞溶解溶液：　０．５Ｍ　　ＮａＯＨ，１，５Ｎ　　
ＮａＣｊ！。

ＨＢＳＳ　：水１１中８ｇのＮａ（Ｊ、４００■のＫｃ
Ｊ　、４８■のＮａｚＨＰＯ’、３５０■のＮａＨＣＯ
，１１６０ｍｇのＫＨ２ＰＯ４，１００■のフェノール
レッド。

ＨＢＳＳ−Ｆｅ２　：　１０％のＦｅ２　、０．０１％
ＮａＮｉ、６ｈＭ　　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩｌ（ｐＨ７，
２）を補充したｌｌＢｓ５゜ＩＴ−培地：２−メルカプ
トエタノール４０μ！、１００岸ヒポキサンチン、１囲
デミジンが補 充されたＲＰＭＩ／Ｃ−培地。

ＨＡＴ−培地：１０岸アミノプテリンが補充された１１
Ｔ−培地。

ＭＢＳ−Ｈ：　８８ｍＭ　　ＮａｆＪ、１ｍＭ　　ＫＣ
ｊ！　、　０．３３ｍＭＣａ（ＮＯ３）ｚ、０．４ｂｎ
Ｍ　　ＣａＣｌ２．０．８２ｎ＋ＭＭｇＳＯａ　、２．
４ｎ＋Ｍ　　ＮａＨＣＯｉ　、１０ｍＭ　　Ｈｅｐｅｓ
（ｐ）１７．４）。

マツコンキー寒天：蒸溜水１１当り予備混合されたマツ
コンキー寒天（Ｂｅｃｋｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）　５０　ｇ　。

卵母細胞溶解緩衝液：２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−１１（Ｊ
！　（ｐＨ７，５）、５０＋ｎＭ　　Ｎａ（Ｊ！　、　
　０．５％ＴｒｉＬｏｎＸＩＯ０、０，５％デオキシコ ール酸ナトリウム、０．１％ メチオニン、１ｍＭのＰＭＳＦ。

ＰＢＳ：８ｇのＮａ（４、０，２ｇのＫＯ２，１，４４
ｇのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２０及び０．２　ｇのＫＨ２
ＰＯ４を含む１１溶液。

ＲＰＭ１１６４０−培地：　　Ｇｉｂｃｏから入手。

ＲＰＭ１１６４０／Ｃ−培地：１％ペニシリン−ストレ
プトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）　、１％Ｌ− グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び１５％ （ｖ／ｖ）　Ｆｅ２　（Ｇ　１ｂｃｏ）が補充されたＲ
ＰＭ１１６４０−培地。

ＲＶＴ−緩衝液：　２００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨｆＪ　
（ｐＨ８，３、４２℃）、２０ｍＭ　ＭｇＣＩｌ　ｚ、
２８０ｍＭ　　ＫＣｊ２　、２０ｍＭＤＴＴ　。

５ＯＣ−培地：２％バタトトリプトン（Ｇｉｂｃｏ）　
、０．５％酵母エキス（Ｇｉｂｃｏ）　、１０ｍＭ　　
ＮａＣｊ！、２．５ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣβ２
．５ＩＩＩＭＭｇＳＯ４，２０ｍＭ　　グルコース。

５ＳＣ−緩衝液：　１５ｍＭ　　クエン酸ナトリウム、
１５０ｍＭａＣＩ１６ ＴＢＥ−緩衝液：　０．８ｇのＴｒｉｓ、　　５．５　
ｇの硼酸、０．５ｍＭＥＤＴ八（ｐＨ８，０）　　４ｄ
を含む１１溶液。

ＴＥ−緩衝液：　１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ，ｌ　（
ｐＨ７，５）　、１ｍＭＥＤＴＡ。

ＴＨＥ−緩衝液：　１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＩＣＩｌ、
１　ｍＭ　　ＨＤ’ｒＡ、０、ＩＭ　Ｎａ（Ｊ　　；　
ＮａＯＨによりｐ１１７．８に調整。

洗浄−緩衝液：１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＩＣＩｌ　（ｐ
Ｈ７，５）　、１ｍＭＥＤＴＡ、　０．５　　ＮａＣｊ
２．０．２％ＳＯＳ　。

、の　　　びＤＮＡの゛ すべての制限酵素は、酵素データシートに基づいて供給
者によって推薦されるような緩衝液条件下で使用される
。一般的に、３ユニツトの酵素が、１■のＤＮＡを消化
するために使用される。そのインキュベーションは３７
℃で２時間維持される。

酵素反応を停止するためには、ＥＤＴＡ及び酢酸ナトリ
ウムが、それぞれ１５ｍＭ及び２００ｍＭの最終濃度に
なるように添加される。ＤＮＡを抽出するためにはクロ
ロホルム：フェノールの１：ｌ混合物（ＴＮＴによりあ
らかじめ飽和された）１体積を添加し、そしてその混合
物を激しく振盪する。有機相及び水性相を、５０００Ｘ
ｇで５分間（室温で）遠心分離することによって分離す
る。その水性相を新しい管に移し、そしてクロロホルム
１体積により抽出する。遠心分離した後、エタノール２
．５体積を添加することによってそのＤＮＡを沈殿せし
める。そのサンプルを一２０℃で少な（とも２時間イン
キュベートし、そして１１００００Ｘで１０分間遠心分
離にかける。そのＤＮＡベレットを７０％エタノールに
より１度洗浄し、真空乾燥機により１０分間乾燥せしめ
、そして最後に適当な体積のＴＥ緩衝液中に溶解する。

゛の　が　　される： Ｅ、　ｍｌ　’　　ＨＢ　１０１：　Ｆ−、ｈｓｄｓ２
０　（ｒ−Ｂ　。

ｍ−Ｂ）、　ｒｅｃＡ１３　＋　ａｒａ１４　＋　ｐｒ
ｏＡ２　＋　１ａｃＹ１　＋ｇａｌＫ２．．　ｒｓｐＬ
２０　（Ｓｍ　’　）、　ｘｙｌ−５、ｍｔｌ−１、５
ｕｐＥ４４１λ−、（Ｂｏｙｅｒ及びＲｏｕｌａｎｄ−
Ｄｕｓｓｏｉｘ　１９６９；　Ｂｏｌｉｖａｒ及びＢｅ
ｃｌｖａｎ　１９７９）。

＋１ＰＭ１８８６６（！　）ｋ　−４７：　ＲＰＭＩ８
８６６細胞（ＡＴＣＣＮａＣＣＬ１０７）は、ＩｇＨの
ためのりセプターを発現するリンパ芽球様Ｂセルライン
に由来する。この細胞系をＰ。

Ｒａ１ｐｈ博士（Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　　’ＮＹ、Ｕ
ＳＡ）から得た。

゛のプラスミドが　　される： 戚岨工：　Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ　Ｕｐｓａｌｌａ。

Ｓｗｅｄｅｎから入手できる。このｐＵＣ−９プラスミ
ドはＰＢＲ３２２由来のアンピシリナーゼ遺伝子及びＥ
、コリの１ａｃＺ遺伝子の一部に連結されたＤＮＡ複製
の起点から成る。ユニーク制限酵素認識部位を含むＤＮ
Ａ挿入部が、このプラスミドの１ａｃＨＪｆ域に組込ま
れている。

■Ω皿：このプラスミドはｐｕｃ−９の誘導体であり、
ここで１ａｃＺ遺伝子のプロモーター／オペレーター領
域が前記プロモーター配列のちょうど外側のＨａｅＩ［
制限部位と旧ｎｄｌｌ［制限部位との間で、ポリリンカ
ー内で削除されており、ｐＵＣ−９のプラスミドの他の
配列が未変化のまま残っている。

劇辻ｒ二」２：　Ｐｒｏｍｅｇａ　ＢｉｏｔｅＣ＋　Ｍ
ａｄｉｓｏｎ＋　ＵＳ八から入手できる。このプラスミ
ドは、特別な転写ベクターである。これは、バクテリオ
ファージのＳＰ６プロモーター含有プラスミドｐＳＰ　
６４　（Ｍｅｌｔｏｎ。

Ｄ、Ａ、、など、（Ｉ６）　）及びバクテリオファージ
のＴ７プロモーターを用いて構成される。この得られた
プラスミドは、多数のクローニング部位を含むＤＮＡ短
片によって分離された、２種の相対するプロモーターＳ
Ｐ６及びＴ７を有する。

ＩＮ−Ｉ［Ｉ−ｏｎ＾プラスミド：　Ｇｈａｒａｙｅｂ
など、　（Ｉ３）によって記載されている。これらのプ
ラスミドは、Ｅ、コリ中における特別な分泌クローニン
グベクターである。該遺伝子生成物のアミノ末端に適切
なシグナルペプチドを融合することによって、細胞膜を
通してのクローン化された遺伝子生成物の分泌を行うこ
とができる。これらのプラスミドにおいては、ｏｍｐＡ
蛋白質、すなわちＥ、コリの主要外層膜蛋白質のシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントが、高レベ
ルの発現ベクター中に挿入されている。外来性ＤＮＡフ
ラグメントは、前記ｏｍｐＡシグナルペプチドのコード
配列のすぐ後のユニークＥｃｏＲＩ　、　Ｈｉｎｄｌｌ
ｌ又はＢａｍＨＩ部位で３種の読み枠のいづれか１つと
整合してクローン化され得る。タイプ１，２及び３のｐ
ＩＮ−ｍ　−ｏｍｐＡ−プラスミドは、翻訳のために異
なった読み枠を開始せしめる。

１　：　ＲＰＭＩ８８６６　　　か゛のｍＲＮＡの゛　
−１５％Ｆ　ＣＳ　、　　１００ニーｙト／　ｍｅのペ
ニシリン及び１１００Ｊ１／−のストレプトマイシンを
補充しＲＰＭ１１６４０培地５０−を有する組織培養フ
ラスコ（Ｆａｌｃｏｎ、　１７５ｃｊ）中でＲＰＭＩ８
８６６細胞を増殖せしめる。５０個のコンフルエントな
フラスコ（およそ１０８個の細胞／フラスコ）からの細
胞を遠心分離により集め、そしてＰＢＳ　５０−により
１度洗浄する。その細胞ペレット（５ｇ）を、チオシア
ン酸グアニジニウム１００ｇ、水１００−１Ｉ　Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ−１１Ｃｊ！１０．６ｄ　　（ｐＨ７，５）　　
、　０．５　　Ｍ　　ＥＤＴ八　４．２−１　２０　％
Ｎ−ラウリルサルコシン２１．２−及び２−メルカプト
エタノール２，１−から調製された溶液２５ｍ１中に溶
解する。クロロホルム：フェノールの１：１混合物の２
体積を添加する。その混合物を激しく１分間振盪し、そ
して次に１０℃で５ｏｒｖａｌｌ遠心分離機により１０
分間、５０００Ｘｇで遠心分離する。

水性相を回収し、そして抽出をさらに４度くり返す。２
体積のエタノールをその水性相に添加する。

一２０℃で１５分間冷却し、続いて４℃で５ｏｒｖａｌ
ｌＳＳ３４０−ターにより１０分間１０．　ＯＯＯｒｐ
ｍで遠心分離することによって沈殿物を回収する。この
ペレットを、ＴＥ緩衝液４　ｍｅ中に溶解する。加熱乾
燥されたＣ５ＣＪ！　（Ｍｅｒｃｋ）　　７．５　ｇ及
び０．ＩＮのＨｃ７！　５０ｐｉを添加し、そしてその
溶液を７．５艷に調整し、そして１２ｍの遠心管中５．
７　Ｍ　ＣｓＣ１のクッション２ｍｌ上に重ねる。その
管に水を満たし、そしてＴＳＴ　４１０−ター（Ｋｏｎ
ｔｒｏｎ）により２０℃で１６時間、２９００Ｏｒｐｍ
で遠心分離する。運転の最後で、はとんどの上滑液を除
去し、そしてその管を、手早く逆にすることによって排
液する。ガラス状のＲＮＡペレットを、１−のＴＦ、緩
衝液及び０．２％ＳＤＳ溶液中において３７℃で攪拌し
、そして時折暖める（２分間）ことによって溶解する。

そのＲＮＡを、Ｍａｎｉａｔｉｓなど（Ｉ）（ページ４
６１〜４６２）によって記載されているようにしてエタ
ノールにより沈殿せしめる。乾燥したｍＲＮＡを溶離緩
衝液１−中に溶解する。６８℃で２分間加熱し、そして
氷上で冷却した後、１３０Ｉｌｌの５ＭＮａＣｊ！を添
加し、そしてこの溶液を、洗浄緩衝液により平衡化され
たオリゴ−ｄＴナセルースの２ＩＩ１１！カラム（５−
の注入器タイプ７　、Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ中、’１ｍｌのベッド体積）に適用する。サンプルを
２回続けて適用した後、そのカラムを洗浄緩衝液１５−
により洗浄し、そして結合されたｍＲＮＡを溶離緩衝液
４−により溶出する。溶出された材料を６８℃で２分間
加熱し、氷上で冷却し、そして０．４４ｍＪ！の５ＭＮ
ａＣｊ！を添加する。この溶液を、再平衡化されたオリ
ゴ−ｄＴセルロースカラムに２度適用する。

洗浄緩衝液１５−により洗浄した後、結合されたｍＲＮ
Ａを溶離緩衝液４−により溶離する。ｍＲＮＡの回収の
程度を、２６０■ｍでの吸光度を測定することによって
決定する（ＯＤ　Ｚ６０−−−１は、４０ｔｔｇ／ｍｌ
の濃度に相当する）。ｍＲＮＡ　（Ｉ５０■）をエタノ
ールにより沈殿せしめる。その沈殿物を遠心分離するこ
とによって集め、水０．４　ｍｌ中に溶解し、そしてエ
タノールにより再沈殿せしめる。ｍＲＮＡのペレットを
空気乾燥し、そして０．１％ＳＤＳを補充したＴＥ緩衝
液１５０１１１中に溶解する。

２：Ｉ　Ｅ−リセプター　びＩＥ−ＢＦ゛のポリ例１か
らのポリＡ　−ｍＲＮＡ　（Ｉｇ／　ｐｆ）１３０■を
、７０℃で５分間加熱し、氷上で冷却し、そして０、１
　Ｍ　ＮａＣｊ！　、　１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−■ＣＪ
　（ｐＨ７，５）　、１ｍＭＥＤＴ八及び０．５％ＳＤ
Ｓの溶液中、５〜２０％の直線シュークロースグラジェ
ント１２艷上に負荷する。そのグラジェントを、２５℃
でＴＳＴ　４１０−ターにより５時間、４１．ＯＯＯｒ
ｐｍで遠心する。３０個の両分（０，４−の体積／画分
）を集め、そして例３に記載しているようにして、キセ
ノブス・レービス（Ｘｅｎ亜ｕｓ　　１ａｅｖｉｓ）の
卵母細胞中に注入する。

成熟した雄及び雌のキセノプス・レービスを、種々の動
物供給業者、たとえばに、Ｅｖａｎｓ　（７１６Ｎｏｒ
ｔｈｓｉｄｅ、八ｎｎ　Ａｒｂｏｒ、　Ｍ１４８−１０
５）から得ることができる。このカエルを、通気しない
で、１８〜２２℃で任意の水槽で飼育することができる
。牛の肝臓及び牛の心臓の断片の定期的な供給（週二度
）により、健康なコロニーが維持されるであろう。

卵母細胞は、健康で、成熟した雌のキセノブスから得ら
れるべきである。これは、エチルｍ−アミノ安息香酸の
１　：　１０００　（Ｗ／Ｖ）水溶液中で１０〜３０分
間、カエルに麻酔をかけることによって容易に成し遂げ
られる。後部腹側上での小さな切開（ＩＧ）により、カ
エルの卵巣に容易に接近することができる。卵巣の切片
を摘出した後、その切開部分を縫合することができ、そ
してそのカエルを、すぐに水中にもどす。卵巣をすぐに
、改変Ｂａｒｔｈ生理的食塩水（ＭＢＳ−Ｈ）中に置き
、そして個々の卵母細胞を、白金のループにより取り出
さなければならない。十分に成長した大きな卵母細胞に
、微細マイクロピペット、マイクロメーター注射器及び
任意の標準の解剖用立体顕微鏡を用いて注入する。適切
な注入用ピペットの構成は、Ｇｕｒｄｏｎ　（Ｉ８）に
よって記載されている。卵母細胞を顕微鏡スライド上に
置き、ペーパータオルにより吸取り乾燥し、そして次に
そのスライドを顕微鏡の載物台上に置く。ピペットの挿
入の前及び挿入の間、その卵母細胞を、時計屋が使用す
る鋭利でないピンセットにより固定することができる。

ピペットが卵母細胞を貫通した後、例２のｍＲＮＡ溶液
（Ｉ■／−）の３０〜５０ｒｌのアリコートをマイクロ
メーター注射器を用いて供給する。同じ画分の１ＩＩＲ
ＮＡを含む４０個の卵のグループを、２０℃で４５時間
、６％ＦＣ３を補充したＢａｒｔｈ溶液０．５−中でイ
ンキュベートする。そのインキュベーション培地を除き
、そして卵母細胞を卵母細胞分解緩衝液９００ｐｌ中で
ホモジナイズする。そのホモジネートを、Ｅｐｐｅｎｄ
ｏｒｆ遠心分離機により１０分間遠心分離する。上相を
回収し、そして例７に記載しているようにして、５０ｐ
１のアリコートをＲＩＡにより試験する。

［ＩＡＬＢ／ｃマウスを、４週ごとに５Ｘ１０７個の生
存ＲＰＭＴ８８６６細胞の腹腔内注射によって免疫感作
する。最後の注射の２日後に集められた個々のマウスの
血清サンプルを抗−ＦＣＣＲ活性について試験する。最
も高い力価を示す２匹の動物からの肺臓細胞をプールし
、そして次の日、融合のために使用する。肺臓を掻き裂
き、そして個々の融合のために、ｌＸｌ０”個の洗浄さ
れた肺臓細胞を、２５　Ｘ　１０６個のＮＳＩ／１−Ａ
ｇ４／１マウス骨髄腫細胞（＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ
ｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎから得られた）と共に３５０Ｘｇで５分間ペレット
化する。その細胞ペレットを、１５％（Ｖ／Ｖ）ジメチ
ルスルホキシドを含むＲＰＭ１１６４０培地（Ｇｉｂｃ
ｏ）２８−中に溶解されたＰＥＧ２０ｇから成るポリエ
チレングリコール溶液（ＰＥＧ−１５４０，Ｂａｋｅｒ
）　　２−中に３秒間、穏やかに再懸濁する。ＲＲＭＩ
／ｃ培地８　ｍｌを９０秒間にわたって滴下し、続いて
追加の培地５−を急速に添加する。この細胞懸濁液を、
管に逆転することによって混合し、２．５分間静置し、
そして３５０Ｘｇで５分間遠心分離する。そのペレット
をＲＰＭＩ／ｃ培地５−中に再懸濁し、そして５０ｐｌ
のアリコー゛トを、ＨＡＴ−培地１　ｍｌにｌＸｌ０６
個の正常なりＡＬＢ／Ｃｌ１ｌｉｉ細胞を含む４個のＣ
ｏｓ　ｔａｒ　＃３５９６の２４−ウェルプレートのそ
れぞれのウェル中に計量分配する。すべての培養物を、
融合の後５日目から始まって、必要な場合数日おきにＨ
ＡＴ培地の交互の添加又は交換により維持する。

１４日後、ＨＴ　ＡをＨＴ培地で交換し、そして２８日
後ＲＰＭＩ／ｃと交換する。個々のウェル（Ｉ９２個の
培養物）の上清液を、融合の後１及び２週間で抗−Ｆｃ
εＲ抗体についてスクリーンする。目的とする抗体を産
生ずる２１個の培養物を限界希釈法によってクローン化
する。すなわちこれらをＲＰＭＩ／ｃ中に希釈して１０
個の生存細胞／−の濃度にし、そしてこれらの懸濁液の
５０ｐｌアリコートを、ＨＩ培地１００ｉｌｌ及び１×
１０５個の正常なりＡＬＢ／ｃｌｌＱ！臓細胞を含む、
９６−ウェルプレート（Ｌｉｎｂｒｏ＃７６−００３−
０５．Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ）のウェル中に添加する。こ
のウェルを顕微鏡により試験し、増殖性培養物がモノク
ローナルであることを確認する。

これらから採取した上清液のサンプルを抗体活性につい
て試験し、陽性の培養物を選択し、そして大きな培養容
器中で拡張する。必要な特異性を有する抗体を分泌する
１４種のモノクローナル細胞系を最終的に得る。３種の
クローン、すなわち２０７．２５．Ａ、４．４／４５．
２０８．２５Ａ、４．３／１３５及び２０８．２５０゜
２、１／１７６を、パリのＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａ
ｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃ
ｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ　ｏｆ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ
Ｐａｓｔｅｕｒに寄託し、そしてそれぞれ寄託番号１−
４５２　、　ｌ−４２５及びｌ−４２０を得、そして本
発明において使用する。これらによって産生されたモノ
クローナル抗体をＭａｂ−４５、Ｍａｂ−１３５及びＭ
ａｂ−１７６と命名する。

５：モノクロ−ル　　の　　　び゛ｌ Ｂａ１ｂ／ｃマウスを、プリスタン（Ａｌｄｒｉｃｈ）
　０．５　ｍｌにより腹腔内部処理する。２週間後、例
４の５×１０６個のクローン化されたハイブリドーマ細
胞を腹腔内に注入する。８〜１０日後に腹水を集め、８
ＯＯＸｇで遠心分離し、そして−２０℃で貯蔵する。解
凍された腹水を５０，０ＯＯＸ　ｇで６０分間遠心分離
する。表面に浮かぶ脂肪層を注意して除去し、そして蛋
白質濃度を１０〜２０■／ｍの濃度に調整する。粗免疫
グロブリンを、０℃での０．９体積の飽和硫酸アンモニ
ウムの滴下により沈殿せしめ、次に２０ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−Ｈ（Ｊ　１５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ　（ｐＨ７，９）中
に溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析する。免疫グ
ロブリンＧの両分を、２Ｏｎ＋Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
　／２５〜４００ｍＭ　　ＮａＣｊ！　（ｐＨ７，９）
の緩衝液グラジェントシステムを用いてＤＩ！ＡＩ！−
０５２セルロース（Ｗｈａｔ−ｍａｎ）クロマトグラフ
ィーによって得る。

１：　　”’Ｉによ　−ベルされた　　Ｍａｂ−１３５
（７）■盟 Ｍａｂ−１３５（例５のＰＢＳ溶液）４ＯＮを、Ｆ、Ｃ
。

Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ　ｆＬ　Ｅ　、　（Ｉ９）の一般的
方法に従って、０．５ｍＣ１の１２Ｊヨウ化ナトリウム
及びクロラミンＴによりヨウ素化する。ヨウ素化された
Ｍａｂ−１３５−蛋白質を含む溶液を、１１のＰＢＳ−
緩衝液に対して４度、それぞれ６時間にわたって透析す
る。

最終生成物は蛋白質１　ｐｇ当りおよそ２Ｘ１０７ｃｐ
ｍの比活性を有する。ＩＺＪによりラベルされた抗７：
　　上−′　び血−のＩＥ−ＢＦの　′Ｊ勿太塩化ビニ
ル製マイクロタイタープレートのウェルを、５履／−の
例５のＭａｂ−１７６を含む、０．０１．Ｍ炭酸塩緩衝
液（ｐｌ（９）１５０ＩＪ１と共に室温で１晩インキエ
ベートする。次に、そのプレートをＰＢＳにより１度洗
浄し、そして１０％ウシ胎児血清（■Ｂ５５−ＦＣ５）
を含むハンクス液２００ＩＪｌと共に室温で２時間反応
せしめ、次に再びＰＢＳにより１０度洗浄し、そして室
温で８時間、試験サンプル１００Ｉと共にインキュベー
トする。）ＩＢｓｓ−Ｆｅ３を用いることによってブラ
ンクを決定する。プレートをＰＢＳにより１０度洗浄し
、そしてウェル当り”’　Ｉ−Ｍａｂ−１３５（ＨＢＳ
Ｓ−Ｆｅ２中において２〜４×１０５ｃｐｍ、例６）１
００ｍと共に室温で一晩インキユベートし、次にＰＢＳ
により１０度洗浄し、そしてガンマカウンターにより計
数する。

８　：　ｍＲＮＡ　１−　　　　”ｃＤＮＡの入側７の
ＲＩＡにより検出された、”’　Ｉ　−Ｍａｂ−１３５
に対して最っとも高い結合能力を示す例２のｍＲＮＡ溶
液１２パ（０，５■／ｄｌ）を、ＲＶＴ緩衝液２５μ！
、ｄＮＴＰ混合物（それぞれ２０ｍＭのｄＡＴＰ　、　
ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰ）　２．５ｍ、　１■／＃＋ｌの
オリゴ−ｄＴ、□−Ｉ８（Ｐ−１，−ＢｉｏＣｈｅｍｉ
ｃａｌｓ）　５　ｔｄ、α−”Ｐ　−ｄＣＴＰ　（Ｉ０
／ｊ　Ｃ（、３０００Ｃ４／ｍモル）１ｐ１、ＲＮａｓ
ｉｎｉＭ（６０ユニツト、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅ
ｃ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　ＵＳ＾）３Ｊ及び逆転写酵素
（６６ユニソト、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、）　
３Ｉの溶液に添加する。放射性ｄＣＴＰは、その後の合
成の段階のすべてにおいてｃＤＮＡの回収率及びその収
率の決定を促進するためにその反応混合物に含まれる。

混合物を４２℃で１．５時間インキュベートする。この
反応を、０．５　Ｍ　ＲＤＴＡ　（ｐＨ７，５）　　２
　ｐｉを添加することによって停止する。２５１１１の
０．１５Ｍ　ＮａＯＨの添加及び４５℃での１時間のイ
ンキュベーションにより、ｍＲＮＡを分解する。この溶
液を、Ｉ　Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ（ｐＨ８，０）　
　２５　ｐｌ及びＩＭのＨ（Ｊ６μｌの添加により中和
する。２Ｉの２０％ＳＤＳを添加し、そしてその溶液を
、フェノール−クロロホルム混合物（ＴＮＥ緩衝液によ
り平衡化されたフェノールとクロロホルムとの同体積の
混合物）０．１５−により抽出する。組み込まれなかっ
たヌクレオチド及び分解されたｍＲＮＡから新しく合成
されたｃＤＮＡを分解するために、水性相をＴＨＥ緩衝
液により平衡化されたバストウールピペット中ノ２−の
５ｅｐｈａｄｅｘ”　Ｇ−５０カラムに適用する。それ
ぞれ２００　ｍの１２個の両分を集め、そしてそれぞれ
の両分中の放射能をガイガーカウンターにより決定する
。放射能を含む、初めの３個の両分をプールする。１．
９ｎのＭａｎｉａｔｉｓなど、＜　１　）　（４６１〜
４６２ページ）によって記載しているようにして、−末
鎖ＤＮＡを回収し、そしてエタノールにより沈殿せしめ
る。その−末鎖ＤＮＡを水２０μ！中に溶解する。

９：二　ｖ′−ｃＤＮＡの入　　び５１−ｔ゛ヒ得れた
ｓｓ　−ｃＤＮＡを、１００ｍＭ　　１ｌｅｐｅｓ（ｐ
Ｈ６，９）　。

Ｉ　ＱｍＭ　Ｍｇ（Ｊｔ　、　　２．５ｗ＋Ｍ　　ＤＴ
Ｔ　、　　７０ｍＭ　　ＫＣｊ！　。

それぞれ０．５ｍＭずつのｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ　、　
ｄＣＴＰ　、　ｄＴＴＰ　。

ｄＧＴＰ）及び２０ユニツトのＤＮＡポリマラーゼ■大
フラグメント、すなわちフレノウ酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎ
−ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む最終体積１００ｐ
Ｚ中において１５℃で３時間インキュベートする。次に
、他の２０ユニツトの前記同じ酵素を添加し、そしてそ
のインキュベーションを１５℃で１０時間続ける。

ＥＤＴ＾の濃度を２０ｍＭになるように添加することに
゛よって反応を停止する。Ｍａｎｉａｔｉｓなど、（Ｉ
）（４６１〜４６２及び４５８〜４５９ページ）によっ
て記載しているようにして、この反応混合物をフェノー
ルクロロホルムにより抽出し、そしてエタノールにより
沈殿せしめる。その得られた二本鎖ＤＮＡを、２５０ｍ
Ｍ　　ＮａＣ４、５０＋＋Ｍ　　酢酸ナトリウム（ｐＨ
４，５）。

１　ｍＭ　　Ｚｎ５Ｏ＊、２００ユニツトの８１ヌクレ
アーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
を含むインキュベージコン混合物１００〆中において３
０℃で３０分間処理する。ＥＤＴＡをその濃度が２５１
Ｍになるように添加することによって反応を停止する。

ＩＭのＴｒｉｓ　−ＩＩＧ７！（ｐＨ８，０）をその濃
度が１００ｍＭになるように添加し、そしてＳＤＳをそ
の濃度が１％になるように添加した後、この反応混合物
をフェノール／クロロホルムにより抽出し、そしてＴＮ
Ｅ緩衝液により平衡化されたバストウールピペット中２
ｍｆｆ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２００カラムを通過せし
める。二本鎖ｃＤＮＡを含む両分を、放射能を測定する
ことによって決定し、プールし、エタノールより沈殿せ
しめ、そして水１５ｍ中に溶解する。二本鎖ｃＤＮＡ　
３．２　ｔｒｇを得る。

ｐＵｃ−ＫＯプラスミド２０■を、５０ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−ｌｌｃ６（ｐＨ８，０）、　１０ｍＭ　ＭｇＣ＃　
ｚ及び５０　ｍＭ　Ｎａ（４の溶液２００１１１中にお
いて、５０ユニツトのＰｓｔＴ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
＋　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により切断する。ＩＥＤＴＡを
２０ｍＭまで添加し、そしてその反応混合物を、等体積
のクロロホルム／フェノール（Ｉ：　１）により抽出す
る。切断されたプラスミドＤＮＡを、２．５体積のエタ
ノールの添加により沈殿せしめ、そして１００ＯＯＸ　
ｇで１０分間遠心分離することによって回収する。その
上滑液を捨て、そしてそのペレットを水５０Ｉ１１中に
溶解する。２００ｍＭカコジル酸カリウム（ｐＨ６，９
）、　１ｍＭ　ＣｏＣＡ　、　　２ｍＭ　　ＤＤＴ。

１（ｌｄＧＴＰ及び８０ユニツトのターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａＰ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｕｐｓａｌｌ
ａ　Ｓｗｅｄｅｎ）を含む溶液１５０ｐｌ中に、プロー
ブを３７℃で５分間インキュベートする。反応を停止す
るために、ＥＤＴＡを１０１まで添加し、そしてこの混
合物をフェノール／クロロホルム（Ｉ：　１）により１
度抽出する。

ＤＮＡをエタノールにより沈殿せしめ、そして１１００
００ｘで遠心分離することによって回収する。

このＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液２００Ｉ中に溶解し、
そして３Ｇの幅のスロットを用いて、ＴＢＥ緩衝液中水
平な０．８％アガロースゲル上に負荷する。ＩＶ／ｃｍ
で１６時間にわたり電気泳動した後、５Ｖ／ａｎで２０
分間電気溶離することによってＤＮＡを回収し、そして
激しいピペット操作によりバッグから回収する。ＤＮＡ
をフェノール−クロロホルムにより抽出し、そして例１
に記載したようにしてエタノールにより沈殿せしめる。

遠心分離後、ＤＮＡをＴＥ緩衝液中に溶解し、そして１
１：■　Ｅ−リセプ　−　−のポリペプチド８００ｎｇ
の例９の二本鎖ｃＤＮＡを、２００ｍＭカコジル酸カリ
ウム（ｐＨ６，９）、　１ｍＭ　ＣｏＣｊ！２．　２ｎ
＋Ｍ　ＤＴＴ。

１００ピコモルの’Ｈ−ｄＣＴＰ及び１２ユニツトのタ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（
Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む溶液４０ｐ
ｌ中で３７℃で５分間インキュベートする。その反応を
停止するために、ＥＤＴＡを１０ｍＭまで添加する。こ
の混合物をフェノール／クロロホルムにより抽出し、そ
してＤＮＡをエタノールにより沈殿せしめる。ｄＣ−テ
イル二本鎖ｃＤＮＡを水に溶解し、そして−２０℃で貯
蔵する。ＴＮＥ緩衝液２００ＩＩｌ中、５０ｎｇのｄＣ
−テイル二本鎖ｃＤＮＡと１５０ｎｇの例１０のｄＧ−
テイルｐＵｃ−ＫＯとの混合物を、６５℃で５分間、５
５℃で６０分間インキュベートし、そして次に水浴中で
３〜５時間にわたって３０℃にゆっくりと冷却する。こ
のアニーリング混合物の２Ｉのアリコートを、２００ｐ
！のコンピテントＥ。

コリＨＢ　１０１　（Ｍａｎｉａｔｉｓなど、（Ｉ）　
（２５０ページ）によって記載しているように塩化カル
シウムによる処理により形質転換のために調製された〕
に添加する。この混合物を氷上に３０分間維持し、そし
て２分間加熱して４２℃にし、次に５ＯＣ−培地１−に
より希釈し、そして３７℃で１時間インキュベートする
。１０本の管の内容物をプールし、そして細胞を２００
０Ｘｇで５分間遠心分離することによって集める。おの
おのの細胞ペレットを、５ＯＣ−培地１−中に再懸濁し
、そしてＬＢ−培地及び５０ｐｇ／−のアンピシリンを
含む１０ｃｍの寒天プレート上に広げる。アンピシリン
耐性によって特徴づけられた約５０００個の形質転換さ
れたコロニーを得る。

ピシリンを含むＬＢ−ブイ３フｚｇｄ中で増殖せしめて
飽和状態にする。９６個の培養物をプールし、そしてプ
ラスミドＤＮＡをアルカリ細胞溶解法（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ＋Ｔ、など、（Ｉ）（９０ページ）〕を用いて単離す
る。１００■のアルカリ変性されたプラスミドＤＮＡを
、５ｅｅｄの方法（２０）によって調製された活性化Ａ
ＴＰ−セルロース５０■に共有結合せしめる。

ＲＰＭＩ８８６６細胞（例１）からのポリＡ−ｍＲＮ＾
（６０ｕｇ）を、１５ｍＭ　Ｐｉｐｅｓ（ｐＨ６，４）
　、１．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　６００ｍＭＮａ（Ｊ　、
及び０．２％ＳＯ３，５０％ホルムアミドの溶液３００
ｐＺ中に溶解し、そしてゆるやかに攪拌しなから３７℃
で１６時間、セルロースに結合したプラスミド−ＤＮＡ
にハイブリダイズせしめる。このセルロースを、５０％
ホルムアミド、４５ｍＭＮａＣ（Ｉ、４，５ｍＭクエン
酸ナトリウム、２０ｍＭプベス（ｐ）１６．４）及び１
ｍＭｌ１！ＤＴＡを含む溶液により１０度洗浄する。９
０％ホルムアミド、０．２％ＳＯ３。

１０ｍＭピペス（ｐＨ６，４）　、５ｍＭ　ＥＤＴＡ　
、２０　ｔｒｇ／ｍｌのウシ肝ｌ１ＩｉｔＲＮＡを含む
溶液１００ｐｌ中において６５℃で２分間、２度インキ
ュベートすることによって、ハイブリダイズされたｍＲ
ＮＡを前記セルロースから溶出する。溶出されたｍＲＮ
Ａを２回エタノール沈澱せしめる。おのおののプールか
ら得られた沈殿したポリＡ−ｍＲＮＡを水６１１１中に
溶解し、そしてキセノプス・レービスの卵母細胞中への
注入のために使用し、そして例３に記載したようにして
分析する。翻訳された蛋白質を、例７に記載したように
してＲＩＡによりスクリーニングする。それぞれ９６個
のコロニーを有する１０個のプールのうち１つが陽性で
ある。これらの９６個のコロニーを、８個のコロニーの
１２個の新しいプールに一緒にし、そして同じ方法でス
クリーニングする。

カエルの卵母細胞におけるｍＲＮＡの翻訳の後、その蛋
白質がＲＩＡにより陽性のシグナルを与える、１つのコ
ロニーを最終的に同定する。そのクローンを、１００■
／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−ブイヨン中で拡張す
る。プラスミドＤＮＡをこのコロニーから単離する。ｌ
／ＩＩｒのプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔｌにより
消化しく該酵素は、ＤＮＡベクターとｄｓ　−ｃＤＮＡ
挿入体との間の両境界で切断する）、そしてｃＤＮＡ挿
入部の配列をＳａｎｇｅｒなど（２１）のジデオキシチ
ェインターミネータ−配列決定法を用いて端から端まで
決定する。この配列決定は、配列決定キット（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ、　Ｎ４５０１及びＮ４５０２）に含まれる試
薬を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍハンドブックの“Ｍ１３
クローニング及び配列決定”に詳しく記載されているよ
うにして行なわれる。二本鎖ｃＤＮＡ挿入部は４１７ｂ
ｐの長さであり、そしてその配列は、式（ＩＩ）中塩基
対第８７８〜塩基対第１２９５により示される。ＩｇＥ
−リセプター及びＩｇＢ結合因子のＣ末端部分をコード
するこの二本鎖ＤＮＡは、ヒトＩｇＥ−リセプター又は
ＩｇＥ結合因子に関連するポリペプチドのためのすべて
のコード情報を含むより長いｃＤＮ＾ＤＮＡプローブブ
リダイゼーションによりスクリーニングするためのＤＮ
Ａプローブとして使用される。

てＲＰＭＩ８８６６細胞から単離する。ｃＤＮ八合への
第一段階は例２〜８に従って行なわれる。次に、十分な
長さの二本鎖ＤＮＡを濃縮するためにその方法を変える
。−末鎖ｃＤＮＡを水３２ｄ中に溶解する。−末鎖ｃＤ
ＮＡ（２，８ｇ）　３２Ｊ１１．１Ｍカコジル酸カリウ
ム（ｐＨ７，０）１０Ｉｌ１１１０ｍＭ　ＣｏＣｆｆ　
ｚ　５　Ｉｌｌ、１ｍＭＤＴＴ５Ｉ１１及びｎモルのｄ
ｃＴＰｌを含む反応混合物中において、−末鎖ｃＤＮＡ
をオリゴ−ｄ’Ｃ末端により延長する。

３７℃で５分間予備インキュベーションした後、３　ｔ
ｔｌのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼ（８１ユニツト、Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈ−ｅｍｉｃ
ａｌＳ）を添加し、そしてさらに１０分間インキュベー
ションを行なう。ＴＮＥ緩衝液５０ＩＪｌを添加し、そ
して−末鎖ｃＤＮＡをクロロホルム／フェノールにより
抽出し、そしてエタノールにより沈殿せしめる。このペ
レットを７０％エタノールにより洗浄し、空気乾燥し、
そして水１５Ｉｌｌ、ＲＶＴ緩衝液２５　ｐｌ、　ｄＮ
ＴＰ混合物（それぞれ２０ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ
及びｄＧｔＰ）２．５１１１及び０．２＋ｗ／ｍ１のオ
リゴｄＧ＋ｚ−＋＋＋（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ）　５　ｐｌを含む溶液中に溶解する。

３Ｉの逆転写酵素（６６ユニツト、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂ
ｉｏｔｅｃ）を添加し、そしてその混合物を４２℃で９
０分間インキュベートする。この反応を０．５　Ｍ　Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ７，５）　２　Ｑ及びＴＨＥ緩衝液５０ｐ
！の添加によって停止し、そしてこの混合物をフェノー
ル−クロロホルム（Ｉ：１）０．１５−により抽出する
。その水性相を５ｅｐｈａｄｅｘ”　Ｇ５０カラム（Ｔ
ＮＥ緩衝液中２．５ａり上に適用し、そして１．１　ｔ
ｒｇの二本鎖ｃＤＮＡを含む漏出画分（０，４ｍ１）を
集める。この二本鎖ｃＤＮＡをエタノールにより沈殿せ
しめる。その得られたベレットを水３２ｐ！中に取り、
そしてこの二本鎖ｃＤＮＡを、例１１に記載しているよ
うにして、放射性ラベルされたオリゴ−ｄＣテイルによ
り延長する。０．５ＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）　１
　ｐｌの添加によりこの反応を停止し、そしてそのサン
プルを０．５　ｃｍの幅のスロットを用いてＴＨＥ緩衝
液中水平の１％アガロースゲル上に負荷する。平行スロ
ットにおいて、バタテリオファージλＤＮＡ（ＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄＩ［により消化された）Ｉｇをサイズマ
ーカーとして役立てるために負荷する。２．５Ｖ／印で
２時間電気泳動にかけた後、二本鎖ＤＮＡを染色するた
めに、０．５Ｉ１ｇ／−のエチジウムプロミドを含むＴ
ＢＥ緩衝液中にゲルを浸漬する。１．４〜２キロ塩基の
およそのサイズの二本鎖ｃＤＮＡを含む領域を切断し、
そして水中に予備浸漬された２つのミクローコロジウム
バック（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に入れる。

水０．３　ｍｌを添加し、そしてそれらのバックを、半
分の濃度のＴＢＥ緩衝液を含む水平電気泳動装置（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ）に入れる。５Ｖ／ｃｍで２０分間電気溶離
し、そして激しくピペット操作することによって二本鎖
ｃＤＮＡをバックから回収する。二本鎖ｃＤＮＡをフェ
ノール−クロロホルムにより抽出し、そしてエタノール
により沈殿せしめる。遠心分離の後、この二本鎖ｃＤＮ
Ａｔ−Ｔ　Ｎ　Ｅ緩衝液１００Ｉ中に溶解する。１００
ｎＨの二本鎖ｃＤＮＡを回収する（放射能の収量から決
定された）。

以下余白 １４：ボＩ　（ｄＣ）−イルを　　る二　′ｃＤＮ１４
０ｍの二本鎖ｃＤＮＡ　（例１３のサイズ分別された材
料４０ｎｇ）を、例１０からの１６　ｐｌ　（２００ｎ
ｇ）のオリゴ−ｄＧ、。−２゜ラベルｐＵｃ−［０プラ
スミドＤＮＡ及びＴＮＥ緩衝液１９４〆と混合し、そし
て次に、６５℃で１０分間、４６℃で１時間及び室温で
１時間インキュベートする。このアニールされたＤＮＡ
を用いて、コンピテント一旦エエ１」−ＨＢ　１０１細
胞（ＬＭ１０３５株）（例１１に記載しているようにし
て形質転換のために調製された）を形質転換する。

このアニーリング混合物の２１１Ｉのアリコートをコン
ピテント細胞２００１１１を含む２本の管に添加する。

この管を氷上に３０分間維持する。４２℃での９０秒の
ヒートショック及び氷による２分間の冷却の後、ＳＯＣ
培地０．８−をそれぞれの管に添加し、そして次に３７
℃で６０分間インキュベートする。インキュベーション
の後、１０本の管の内容物をプールする。２０００　ｇ
で５分間遠心分離することによって細胞を集め、そて１
００■／ｍｌのアンピシリンを含むマツコンキー寒天プ
レート　（直径１５ＣＩｌ）上に置く。このプレートを
３７℃で一晩インキユベートする。およそ１０００個の
アンピシリン耐性コロニーを各プレートから得る。これ
らをナイロン膜（Ｐａｉｌ−Ｂｉｏｄｙｎｅ、Ｇｌｅｎ
　Ｃｏｖｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ−ＵＳＡ）上に拾い上げ
、そしてその膜を、コロニーが上向きになるようにマツ
コンキー寒天プレート上に押しつける。３７℃で５時間
のインキュベーションの後、２個のレプリカをナイロン
膜上で作る。

そのマスター膜を寒天プレート上で４℃で貯蔵する。０
．５　Ｍ　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　ＮａＣｊ！により飽和
された３ＭＭ紙（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｌｔｄ、、Ｍａｉｄ
ｓｔｏｎｅ＋ＵＳＡ）上に５分間、及び０．５　Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（＋）■８．０）　、１．５　Ｍ　Ｎ
ａＣＪ！により飽和された３ＭＭ紙上に１ａ分間それら
のレプリカを次々と置くことによって、これらのレプリ
カをコロニーハイブリダイゼーションのために処理する
。各インキュベーションの中間で、フィルターを乾燥Ｗ
ｈａｔｍａｎ３　ＭＭラフイルター上吸い取る。このレ
プリカフィルターを真空オーブンにより８０℃で２時間
加熱し、そしてすぐにＤＮＡハイブリダイゼーションの
ために使用する。

１５：フィル　−のバイブ１　゛イゼーション例１２の
陽性クローンから得られたＩｇＥ−リセプターの一部を
コードするプラスミド１０ｐｇからのｃＤＮＡ挿入部を
、Ｐｓｔｌ制限エンドヌクレアーゼによる消化によって
調製する。このｃＤＮＡ挿入部（４５０ｂｐ）を、ＴＨ
Ｅ緩衝液中１．５％アガロースゲルを通して電気泳動す
ることによってｐＵｃ−ＫＯベクターＤＮＡ　（２９０
０ｂｐ）から分離し、そして電気溶出することによって
回収し、そして例１３に記載しているようにしてエタノ
ールにより沈殿せしめる。純粋なｃＤＮＡ挿入部（２０
０ｎｇ）を、供給者によって与えられた説明書に従って
、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｎ、５０００）からのニックトラ
ンスレーション系を用いて放射性にする。この放射性ラ
ベルされたｃＤＮＡプローブハ５　Ｘ　１０　”ｄｐｍ
／　ｔｔｇＯ比活性を有する。この放射性ラベルされた
ｃＤＮＡを、９５℃で１ｏ分間インキュベートすること
によって変性し、そしてすぐに氷上で冷却する。例１４
のレプリカフィルターを、０、９　Ｍ　ＮａＣｊ！　、
　０．１８Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ４（ｐＨ８，０）　、６
ｍＭＥＤＴＡ　、　０．０２％Ｆｉｃａｌ１４００．０
．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ＢＳＡ、０
．２％ＳＤＳ及び５０℃１ｇ／ｍｌの変性されたウシ胸
腺ＤＮＡを含む溶液１００　ｍｌ中で２時間、密封され
たプラスチックバックの中でプレパイプリダイズする。

上記からの熱変性された放射性ラベルされたｃＤＮＡ挿
入部を補充された同じ溶液５−を含む密封されたプラス
チックバック中で、ハイブリダイゼーションを一晩行な
う。ハイブリダイゼーションの後、そのフィルターを、
２　ｘＳＳＣ／　０．２％ＳＤＳにより洗浄し、続いて
６５℃で０．２　Ｘ５ＳＣ１０，２％ＳＤＳ　　２００
ｍ１により３度洗浄する。このフィルターを乾燥し、そ
してコグツクＸ−線フィルム（ＸＡＲ−５）に−晩暴露
する。このフィルターに放射性インクにより印を付け、
そのフィルターとオートラジオダラムとの整合を可能に
する。２個の陽性クローンが見つけられ、そしてこのＤ
ＮＡは、ＩｇＥ−リセプターをコードする放射性ラベル
されたＤＮＡフラグメントにハイブリダイズする。これ
らをｐＣＬ−１及びｐｃｔ、−２と命名する。

１６　：　ＣＬＩ−ＤＮＡ　　びＣｌ３−ＤＮＡの゛び
へｐｃＬ１クローン及びｐＣＬ２クローンを増殖せしめ
、そしてそれらのプラスミドＤＮＡをアルカリ細胞溶解
法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、など（Ｉ）（９０ページ
）〕を用いて単離する。これらのＤＮＡをＰｓｔＩによ
り消化する。この酵素はベクターＤＮＡとＤＮＡ挿入部
との間の境界でｃＤＮＡを切る。このフラグメントを電
気泳動により分離し、そして完全なｃＤＮＤＮＡ挿入部
１３に記載しているようにして電気溶出により単離する
。これらの２個のプラスミドのｃＤＮＡ挿入部を、Ａｍ
ｅｒｓｈａｍのハンドブックに詳しく記載されているＳ
ａｎｇｅｒなど（２１）の方法を用いて完全に配列決定
する。この制限酵素処理及び配列分析の要約は第２図及
び式■に示される。

Ｐｓｔｌ及び旧ｎｃＩ［（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａ
ｎｎｈｅｉ＋ｎ）により消化する。１．５　ｋｂのｃＤ
ＮＡ挿入部及び２．９ｋｂのプラスミドベクターＤＮＡ
を、３ｃＩ１１の幅のスロットを用いて、ＴＢＥ緩衝液
中１％アガロースゲル上で分離する。ＩＶ／ａｍで１６
時間の電気泳動の後、例１３に記載しているようにして
電気溶出によりＤＮＡを回収する。平行して、１０ｇの
プラスミドｐＧＥＭ７＋″−１をＰｓｔＩ及び旧ｎｃＩ
Ｉにより消化し、フェノール／クロロホルムにより１度
抽出し、そしてエタノールにより沈殿せしめる。１．５
　ｋｂのｃＤＮＡ挿入部１０ｎｇ及びＰｓｔＩにより切
断されたｐＧＥＭＴｌ″−１のＬｏｎｇを、１５℃で４
時間、１ｏ１１１の容積中で連結する。この反応混合物
はさらに、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）
　、１０ｎ＋Ｍ　ＭｇＣ１ｔ　、２ｍＭ　ＤＴＴ、　０
．１ｍＭＡＴＰ及び１００ユニツトのＴ４リガーゼ（Ｂ
ｏ’ｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を含む。この
混合物５Ｉを用いて、Ｍａｎｉａｔｉｓなど（Ｉ）　（
２５０ページ）によって記載しているようにしてコンピ
テントＥ、コリ■ＢＩＯＩ（ＬＭ１０３５株）を形質転
換する。約１００個のアンピシリン耐性コロニーを得る
。２４個のコロニーを増殖せしめ、そしてその培養物か
らプラスミドＤＮＡを単離する。おのおのの培養物から
のプラスミドＤＮＡ約１ｎを旧ｎｄｌＩにより消化し、
そしてこの消化されたＤＮＡフラグメントの長さを、Ｈ
４ｎｄｌ［［により消化されたλＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をサイズマーカーとして用いて
、１％アガロースゲル上で分析する。いくつかのコロニ
ーの消化されたプラスミドＤＮＡは、１．０ｋｂ及び３
．３　ｋｂの長さを有するＤＮＡフラグメントを与える
。これらのプラスミドをｐＧＥＭ”−１／ＣＬ２　ト命
名する（第３図を参照のこと）。これらは、ｐＧＥＭＴ
ｌ″−１ベクターＤＮＡ上のＴ、ポリマラーゼプロモー
ターの近くにＩｇＢ−リセブターのアミノ末端を含む。

１８：Ｉ　Ｅ−リセプ　−　漣勿昶」Ω転写１０ｎの例
１７のプラスミドｐＧＥＭ”−１／ＣＬ２を制限酵素Ｒ
ｓａ　Ｉ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）により消化する。５１１１の０．５　Ｍ　ＥＤＴＡを
添加し、そしてこの混合物をフェノール／クロロホルム
（Ｉ：　１　。

Ｖ　：　Ｖ）により１度そしてクロロホルムにより１度
抽出する。ＤＮＡをエタノールによる沈殿によって濃縮
し、そしてＴＥ緩衝液２０ｍ中に溶解する。このＤＮＡ
溶液４　ｐｌを４０＋＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐ
Ｈ７，５）、６ｍＭ　ＭｇＣｌ１２．２ｍＭスペルミジ
ン、１ｍＭＮａＣｌ！、　１０ｍＭ　ＤＴＴ、　　１ユ
ニツト／ＩのＲＮａｓｉｎ。

０．５ｍＭ　ｄＮＴＰ及び２０ユニツトのＲｉｂｏｐｒ
ｏｂｅ　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂ
ｉｏｔｅｃ）を含む溶液１ｏａｐｌに添加する。この混
合物を３７℃で１時間インキュベートする。ＲＮＡ合成
反応に続いて、２ユニツトのＲＱＩ　ＴＭ　ＤＮＡ５ｅ
　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）を添加し、そして
そのインキュベーションを３７℃で１時間続ける。この
混合物をフェノール／クロロホルムにより１度、そして
クロロホルムにより１度抽出し、そして新しく合成され
たＲＮＡを、エタノールによる沈殿により回収する。こ
のＲＮＡペレットを、７０％エタノールにより洗浄し、
そして最終的に水２０ｔ！ｌに溶解する。

記載しているようにして、カエルの卵母細胞中への注入
のために直接使用する。ＩｇＥ−リセプター蛋白質の合
成を、例７に記載したようにしてＲＩＡにより試験する
。例１からのポリＡ　−ｍＲＮ＾を対照サンプルとして
使用する。その結果を、次の表に挙げる。

ポリＡ−ｍＲＮＡ（例１　）　　　　　　　１．５％Ｒ
ＮＡなし　　　　　　　　　　　０．１％この例におい
ては、ＩｇＥ結合因子に関連するポリペプチドのＥ、コ
リにおける産生及び分泌を可能にするプラスミドを造成
し、この場合、脱係留部を含む位置Ｍｅｔ＋からＡ１ａ
＋＋ｅ又はＧ１ｔｌ＋＋＋までのアミノ末端領域を除去
する。１０■のｐＣＬ−２プラスミドＤＮＡを制限酵素
器ｎｃＩＩ及びＲｓａＩにより消化スル。１．、、６　
、１．２５　、０．７２　、０．４６及び０．２３ｋｂ
（７）フラグメントを得、そしてＴＢＥ緩衝液中１％ア
ガロースゲルによる電気泳動により分離する。

１．２５ｋｂのＤＮＡフラグメントを例１３に記載した
ようにして回収する。同時に、１０ｇのプラスミドｐＧ
ＥＭＴＭ−１を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨｆＪ！　（ｐＨ
７，６）、５０ｎ＋ＭＮａ（Ｊ！　、　１０ｍＭ　Ｍｇ
ＣＪ　ｚ及び５ｍＭＤＴＴの溶液５０１１１中で２０ユ
−ットの旧ｎｃ　ＩＩ　　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）に
より線状化する。３７℃で２時間のインキュベーション
の後、この反応混合物にＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ＃　（
ｐＨ８，５）５０ｔｄ、　水１０　ｐｌ及び２０ユニツ
トのウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ）を補充し、そして３７℃で３０分間インキュベー
ションをさらに続ける。その混合物をフェノール−クロ
ロホルムにより３度抽出し、そして次にＴＢＥ緩衝液中
１％アガロースゲルにより電気泳動にかける。このプラ
スミドＤＮＡを、例１３に記載しているようにして電気
溶出により前記ゲルから回収する。

１　、２５ｋｂのｃｌｌＮＡフラグメント１０ｎｇ及び
１ｌｉｎｃｌｌにより切断されたｐＧＥＭ”−１（Ｉ（
ｌｒ＋ｇ）を、１５℃で１０時間、１０ｐｌの容積にお
いて連結する。この反応混合物は、さらに１０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＪ！　（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭＭｇＣ
ｌ１ｔ　、２ｍＭ　（ＩＴＴ、　　０．５ｍＭ＾ＴＰ及
び１００ユニツトのＴ、−リガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ）を含む。その混合物５１１１を用いて、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓなど（Ｉ）（２５０ページ）によって記載され
ているようにしてコンピテントＥ、コリｎＢｔｏｔ細胞
を形質転換する。細菌を１１００ａ／−のアンピシリン
を補充し寒天プレート上に置く。約５０個のアンピシリ
ン耐性コロニーを得る。２４個のコロニーを増殖せしめ
、そしておのおのの培養物からプラスミドＤＮＡを単離
する。おのおのの培養物からのプラスミドＤＮＡ約１ｎ
を旧ｎｄｌｌｌにより消化し、そしてこの消化されたＤ
ＮＡフラグメントの長さを、サイズマーカーとしてＨｉ
ｎｄｌｌ［により消化されたλＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ。

Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、％アガロースゲル上で分析す
る。いくつかのコロニーの消化されたプラスミドＤＮＡ
は、フラグメントの挿入の２つの可能性ある方向に対応
して、０．５ｋｂ及び３．６ｋｂの長さのＤＮＡフラグ
メントをもたらし、そして他のいくつかは０．７　ｋｂ
及び３．４ｋｂの長さのフラグメントをもたらす。これ
らのプラスミドを、それぞれｐＣＡＬ−３及びｐＣＡＬ
−４と命名する（第４図）。１つのｐＣＡＬ−３クロー
ン及び１つのｐＣＡＬ−４クローンを増殖せしめ、そし
てこれらのプラスミドＤＮＡをＭａｎｉａｔｉｓなど（
Ｉ）（９０ページ）によって記載されているようにして
アルカリ細胞溶解法を用いて単離する。

１０■のｐＣＡＬ−４プラスミドＤＮＡを旧ｎｄｌ［［
により消化し、そして１０硝のｐＣＡＬ−３プラスミド
ＤＮＡをＢｇｌｌｌ及びＢａｍ）Ｉ　Ｉ制限酵素により
消化する。そのフラグメントを電気泳動により分離し、
そしてＢｇｌ　Ｕ　−ＢａｍＨＩの０．８ｋｂフラグメ
ント及び旧ｎｄＩｌｒ−旧ｎｄｌｒの０．７５ｋｂフラ
グメントを、例１３に記載しているようにして電気溶出
することによって回収する。同時に、１ＯＮのｐＩＮ−
ｍ−ｏｍｐＡ−２プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　（Ｇｈａｒａ
ｙｅｂなど（５）〕及び１０ｐｇのｐＩＮ−ｍ−ｏｍｐ
Ａ−３プラスミドＤＮＡをそれぞれ旧ｎｄ■及びＢａｍ
ＨＩにより消化する。これらの２種のプラスミドは、Ｅ
、コリにおける良く知られた分泌クローニングベクター
であり、Ｏｍｐ＾蛋白質のシグナルペプチドをコードす
る配列に２つのリーディングフレームで融合される外来
性ＤＮＡフラグメントのクローニングを可能にする。次
に、綿状化されたプラスミドをウシの腸からのアルカリ
ホスファターゼにより処理し、そしてその線状ＤＮＡを
、上記のようにして０．８％アガロースゲル上で精製す
る。旧ｎｄｌ［Ｉにより切断されたｐｌＮ−ｍ　−ｏｍ
ｐＡ−２（Ｉ０硝ｇ）及び０．８ｋｂの旧ｎｄｌ［［−
旧ｎｄＨ［フダグメン）（Ｉ０硝ｇ）（混合物１）、並
びに０．７５ｋｂのＢｇｌｌｌ−ＢａｍＨＩフラグメン
ト（Ｉ０硝ｇ）及びＢａｍＨＩにより切断されたｐＩＮ
−ｍ−ｏｍｐ＾−３（Ｉ０硝ｇ）（混合物２）を含む２
種の連結混合物を、２０ｔｔｌの体積で調製する。これ
らの反応混合物はさらに、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃ
β（ｐＨ７，５）　　、　１０ｍＭ　　ＭｇＣｊ！　ｔ
　　、　２ｍＭ　　ＤＴ？、　０．１　ｍＭ　　ＡＴＰ
及び１００ニー’−７トのＴ４リガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を含む。１５℃で１２時間
のインキュベーションの後、この混合物５Ｉｌｌを用い
てＭａｎｉａｔｉｓなど（Ｉ）（２５０ページ）によっ
て記載されているようにしてコンピテントＥ、コリＦＩ
ＢＩＯＩ細胞を形質転換する。混合物１及び２から５０
〜１００個のアンピシリン耐性コロニーを得る。それぞ
れの混合物からの１２個のコロニーを増殖せしめ、そし
てそのプラスミドＤＮＡを培養物から単離する。それぞ
れの培養物からのプラスミドＤＮＡ約１■を、ＰｓｔＩ
及びＥｃｏＲＩ　　（混合物１）及び３ａｍＨＩ及びＥ
ｃｏＲＩ（混合物２）により消化する。そのＤＮＡフラ
グメントの長さを、サイズマーカーとしてＢｉｎｄＩｌ
［により消化されたλＩＩＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、
Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて１％アガロースゲル上で分析す
る。混合物１に由来されるい（つかのプラスミドは０．
７５ｋｂのフラグメントを産生する。これらのプラスミ
ドをｐＦＫ−２と命名する。これらは、ＯｍｐＡシグナ
ル配列に融合されたＩｇＥ−リセプターのアミノ酸Ａｌ
ａｔｚａ〜５ｅｒ３□をコードするＤＮＡを含む。同様
に、混合物２に由来するいくつかのプラスミドは、０．
８ｋｂのフラグメントを産生する。これらのプラスミド
をｐＦＫ−１と命名する。これらは、ＯｍｐＡシグナル
配列に融合されたアミノ酸Ａｓｐ　１１９〜Ｓｅｒ＋□
１をコードするＤＮＡを含む。

プラスミドｐＦＫ−１、ｐＦＫ−２、及び対照としての
プラスミドｐＩＮ−ｍ−ｏｍｐＡ−２（Ｉ０ｎｇ）を用
いて、コンピテントＥ、コリＢＺ２３４細胞及びＥ、コ
リＢ１４．７２細胞をトランスフェクトする。コンピテ
ント細胞を、Ｍａｎｉａｔｉｓなど（Ｉ）（２５０ペー
ジ）によって記載されているようにして調製し、そして
トランスフェクトする。それぞれのトランスフェクショ
ンから１００個以上のアンピシリン耐性コロニーを得る
。１つのコロニーを１００ｘ／−のアンピシリンを補充
したＬＢ−ブイヨン２Ｔｎｌ中に移し、そして３７℃で
一晩増殖せしめる。この培養物１ｍＺを１００Ｊ！ｇ／
−のアンピシリンを補充したＬＢ−ブイヨン１００−中
に移す。この細胞を３７℃で激しく振盪（２５Ｏｒｐｍ
）　Ｌなから増殖せしめる。４．７゜１０及び２４時間
後、１０Ｔｎｌのアリコートを取り出す。これらのアリ
コートをすぐに処理する。室温で１０分間１１００Ｏｘ
で遠心分離にかけることによって細胞を集める。その上
清液を捨て、そして細胞を０．１　Ｍ＋７１　Ｔｒｉｓ
４１（Ｊ　（ｐＨ８，０）中２０％シュークロース２．
５ｄ中に懸濁する。この混合物を室温で２０分間放置し
、そして細胞を遠心分離にかけることによって再び集め
る。その上滑液を捨て、そして細胞を氷により冷却され
た水１．５　ｍｌ中に懸濁する。この混合物を２０分間
氷上でインキュベートし、そして４℃で１ｏ分間、１２
０００Ｘ　ｇで遠心分離する。この上清液５　、Ｉｌｌ
をＨＢＳＳ−Ｆｅ２１００ｐ！ニ添加し、そしてこれら
のサンプルを例７に記載したｔＡにより分析する。ｐｌ
Ｎ−ｍ−ｏｍｐＡ−２を対照として使用する。次の結果
を得る。

値は、例７に記載したＲＩＡにおいて、ウェル当り測定
されたｃｐＩｌｌとして与える。ウェル当りの放射能の
インプットは３２５．０００ｃｐｍである。

Ａｆｆ−Ｇｅ１”　１０材料（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、製
造業者によって指示されているようにして、冷蒸留水及
びカップリング緩衝液（ｐＨ８，０）　（０，ＩＭ　Ｎ
ａ）ＩＣＯ３溶液）により洗浄する。カップリング緩衝
液２ｖｄ中５０％の濃度のゲル懸濁液をプラスチック管
に入れ、そして１０ｍｇのＭａｂ−１３５又はＭａｂ−
１７６を含む同じ体積の溶液と混合し、そしてこの混合
物を室温で４時間、回転混合せしめる。このゲルをカッ
プリング緩衝液により再び洗浄する。なお遊離している
活性部位をブロックするため、このゲルを１Ｍエタノー
ルアミン−〇（Ｊ　　（ｐＨ８，０）　０．１艷により
室温で２時間処理し、次に１０ｍＭアジ化ナトリウムを
含むＰＢＳにより洗浄し、そして４℃でその中２３：ノ
　−　された　　による　　　び例２０からのプラスミ
ドｐ１４−１を含むＥ、コリＢＺ２３４の１つのコロニ
ーを、アンピシリン（Ｉ００■／−）を補充したＬＢ−
ブイヨン培地１〇−中に移し、そして激しく振盪しなか
ら一晩、３７℃で増殖せしめる。この培養物の１−のア
リコートを、６個のフラスコ〔おのおののフラスコは、
アンピシリン（Ｉ００ｘ／ｍｆ）を補充したＬＢ−ブイ
ヨン８００ｍ１を含む〕に移す。細胞を３７℃で８時間
激しく振盪（２５Ｏｒｐｍ）　シなから増殖せしめ、そ
して室温で１０分間１１０００Ｘで遠心分離することに
よって集める。その上清液を捨て、そして２０％シュー
クロース、３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　（ｐＨ８，
０）及び１ｍＭＥＤＴ＾を含む溶液３０〇−中に細胞を
懸濁する。この懸濁液を室温で２０分間放置し、そして
遠心分離することによって細胞を再び集める。上滑液を
捨て、そして細胞を氷により冷却された水２００　ｍＺ
中に懸濁する。この懸濁液を氷上で２０分間イン１キユ
ベートし、・そして４℃で１５分間１００００Ｘ　ｇで
５ｏｒｖａｌｌ遠心機のローターにより遠心分離する。

この上***（約１８０ｎＪ）を注意して回収し、アジ化
ナトリウム（０，１■／ｍりを補充し、そしてＮａ１ｇ
ｅｎｅＯ殺菌フィルターユニット（０，２ミクロン；　
Ｎａｌｇｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、Ｎ
、Ｙ、、ＵＳＡ）を通して濾過する。濾過された溶液を
、例２２に記載のようにして得られたＭａｂ−１３５又
はＭａｂ−１７６結合Ａｆｆｉ−Ｇｅｌｌ′１０の２−
カラム上に流速５０−７時で負荷する。ゲルを、０．５
％ＮａＣｌ１及び０．０５％ＴｗｅｅｎＯ２０を補充し
た２０体積のＰＢＳ、５体積のＰＢＳ及び５体積の０．
９％ＮａＣｊ！により次々と洗浄する。洗浄溶液の蛋白
質内容物を、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによ
ってスクリーニングして非結合蛋白質の完全な除去を確
保する。次にカラムを、０．１Ｍグリシン−ＨＣｊ２　
、０．１　Ｍ　ＮａＣｊ！（ｐＨ２，６）をそれぞれ含
む１体積の溶液のアリコートにより溶出する。蛋白質を
含む両分をプールし、そしてＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓにより中
和する。

本発明の精製されたポリペプチドの濃縮溶液を、ｌ５Ｃ
Ｏ電気泳動濃縮機モデル１７５０（Ｉｓｃｏ　Ｉｎｃ、
）及び３．５［）カット−オフの５ｐｅｃｔｒａｐｏｒ
＠膜（ＳｐｅｃｔｒｕｍＭｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉｅｓ）による処理によって得る。

その溶液を２５ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ１８，３
）に対して透析し、そしてそれによって０．２　ｍＺの
体積に濃縮する。

精製された蛋白質を次の方法により分析する。

画分をＬａｅｍｍｌｔ緩衝液と共にインキュベートし、
次に１２％５ＤＳ−ＰＡＧＥにより個々の蛋白質に分離
し、そしてＢｉｏＲａｄマニュアルに記載のようにして
銀染色する。およそ２５ＫＤの分子量を有する蛋白質が
検出される。それらを、トランスファー緩衝液を用いて
０．１２アンペアで４時間電気泳動することによりニト
ロセルロース膜に移す。この膜を、１０％ＦＣ３を含む
Ｔｒｉｓ緩衝化塩溶液によりブロックする。

ストリップを切り出し、そしてそれぞれＭａｂ−１３５
及びＭａｂ−１７６（それぞれ１０ｘ／ｍ／）と反応せ
しめる。６時間のインキュベーションの後、これらのス
トリップを洗浄し、そしてホースラジイシュペルオキシ
ダーゼヤギ抗−マウスＩｇＧと一晩反応せしめる。この
ストリップを洗浄し、そしてＢｉｏＲａｄの指針マニュ
アルに記載しているようにして４−クロロ−１−ナフト
ール（ペルオキシダーゼ基質）により発色せしめる。Ｍ
ａｂ−１３５及びＭａｂ−１７６モノクロ一ナル抗体の
それぞれは２５ＫＯの蛋白質フラグメントと反応せしめ
る。

プラスミドｐＨＲ１１４８（ヨーロッパ特許出願１１！
Ｐ１４６７８５）を中間ベクターとして使用する。１０
ｎのｐＨＲ１１４８プラスミドＤＮＡをＮｃｏｌにより
消化し、次に末端を平滑端にするためにタレノウポリマ
ラーゼ及びｄＮＴＰ　（５０ｍ）により処理する。この
ＤＮＡをＢａｍＨＩによりさらに消化し、そしてアルカ
リホスファターゼにより処理する。４．３　ｋｂのベク
ターＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により単離する。

同時に、ｐＣＡＬ３プラスミドＤＮＡ　（例２０）１０
ｇをＢｇｌＩＩにより切断し、次にタレノウポリマラー
ゼ及びｄＮＴＰ　（５０ｍ）により処理する。

このＤＮＡをＢａｍＨＩによりさらに切断し、そして０
．７８ｋｂの挿入部ＤＮＡフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動により単離する。精製されたベクター１０ｎ
ｇ及び精製された３ｎｇの挿入部ＤＮＡを連結し、そし
てその混合物を用いてコンピテントＥ。

コリＨＢＩＯＩ細胞を形質転換する。正しい組換えプラ
スミドを有するクローンを制限酵素分析に基づいて選択
する（第５図）。

正しいプラスミドの１１０１ｒのＤＮＡをＢａｍＨＩ及
びＥｃｏＲＩにより消化する。０．７９ｋｂの挿入部Ｄ
ＮＡをアガロースゲル電気泳動により単離する。同時に
、ＬＯｔｔｇのｐＰＬｃ２４プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　（
Ｒｅｍａｕｔ、Ｅ。

など、　（Ｉ９８１）、Ｇｅｎｅ　　１５．８１〜９３
）をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、次にアル
カリホスファターゼにより処理し、ｉして２．９ｋｂの
ベクターＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により精製す
る。１０Ｂの２．９ｋｂのベクターＤＮＡ及び３ｎｇの
０．７９ｋｂの挿入部ＤＮＡを連結し、そして次にこれ
を用いてコンピテントＥ、コリに１２細胞を形質転換す
る。

標準的な制限分析を行ない、正しいプラスミド（＋）Ｐ
Ｌ−ＢＦ、第５図）を選択する。このプラスミドは、熱
誘導性ＰＬプロモーターの下流に式（Ｉ）のポリペプチ
ドのアミノ酸１１９〜３２１をコードする式（ｎ）のＤ
ＮＡ配列を担持する。中間のクローニング段階の間にプ
ラスミドｐＨＲ１１４８に付加されたメチオニンがアミ
ノ酸１１９の前に存在する。

プラスミドｐＰＬ−ＢＦを用いて、一旦エユッＪ−株Ｗ
３１１０及びＨＢＩＯＩ　　Ｃ両者はλｃ１８５７（Ｒ
ｅｍａｕｔなど、、ＩＯＣ。

ｃｉ　ｔ、　）を含む〕を形質転換する。この形質転換
体を、４０ｇ／−のカナマイシン及びアンピシリンを含
むＬＢ−プレート上に移し、そして３０℃で２４時間イ
ンキュベーションす東ことによって増殖せしめる。得ら
れた組換え体コロニーを発酵のために使用する。

Ｕ」−全一■ 例２４．１において得られた組換え体Ｅ、コリ株を、４
０■／−のアンピシリン及びカナマイシンを含むＬＢ−
ブイヨン中において３０℃で増殖せしめる。この培養物
を同じ培地により１：５に希釈し、そして４２℃で４時
間インキュベートする。遠心分離することによって細胞
を集める。

２４．３　■　Ｅ′ｋＡ′　を　するポリペプチドの製 例２４．２の細菌ペレットから調製された、５０ｍＭ１
１ｅｐｅｓ　（ｐＨ８，０）、３０ｍＭ　ＮａＣ＃及び
０．１％エタノールアミンを含む溶液中細胞懸濁液（Ｏ
Ｄ６ｓ。−２０）　２２．５−を、尿素１８ｇと混合す
る。この懸濁液を、９．５ｍのプローブ及び２４ミクロ
ンの振幅を用いて、ＭＳＥ　５ｏｎｉｐｒｅｐ”　１５
０により３０秒間隔で３×３０秒間音波処理する。この
細胞溶解物を、２０℃で３０分間５ｏｒｖａｌｌ　５Ｓ
３４０−ターにより１７０００ｒｐｍで遠心分離するこ
とによって透明にする。その上清液を、４℃で、１０ｍ
Ｍ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７，５）及び１３０ｍＭ　ＮａＣ
ｊ！を含む溶液に対して３度透析する。

この透析物を、４℃で３０分間、５Ｓ３４０−ター（Ｓ
ｏｒｖａｌｌ）により１７０００ｒｐｍで遠心分離する
ことによって透明にし、そしてその上滑液にアジ化ナト
リウム（０，１■／ｍｌ）を補充する。ＩｇＥ結合活性
を有するポリペプチドをさらに精製し、そして例２２及
び２３に記載しているようにして分析する。

ベクターＤＮＡを調製するために、１０Ｉｇのプラスミ
ドＤＮＡ　ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＲ並−ＴＰ＾（Ｉ２−
２）　（ヨーロッパ特許出願ＥＰ１４３０８１）をＢａ
ｍＨＩにより完全に消化する。この消化されたＤＮＡを
アルカリホスファターゼにより処理する。６．８５ｋｂ
ＯＢａｍｌｌｌ大フラグメントを、ＴＢＥ緩衝液中１％
アガロースゲル上で小フラグメントから分離し、そして
その６．８５ｋｂのＤＮＡフラグメントを電気溶出によ
ってゲルから回収する。誘導性ＰＨ０５プロモーター及
び円１０５シグナル配列をコードするＤＮＡフラグメン
トは、プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ１
８　（ヨーロッパ特許出願１４３　’　０８１）に由来
する。このプラスミド５０ｘをＢａｍＨＩ及び旧ｎｄｎ
［により完全に消化し、そして２．３ｋｂのフラグメン
トを単離する。このフラグメント５■をＢａ１Ｉにより
さらに消化し、そして０．５８ｋｂのフラグメントを単
離する。上記の２０ｎｇのベクターＤ　Ｎ　Ａ　、　０
．５８ｋｂのフラグメント４ｎｇ、　ｐＣＡＬ３（例２
０）に由来する０、８ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ　
ｃＤＮＡフラグメント８　ｎｇ、及び核酸配列：５　’
　　ｐｃｃ八八へへＣＡ−３’　　／３　’　　−ＧＧ
ＴＴＡＣＧＴＣＴＡＧｐ−５’　　を有する化学的に合
成された二本鎖ＤＮＡリンカ−０，１ｎｇを混合し、そ
して１５℃で２４時間、２０Ｉの体積において連結する
。その連結されたＤＮＡを用いてコンピテントＥ、コリ
ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換する。約１００個のアンピシ
リン耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを制限酵素によ
る消化によって分析する。目的とする方向にすべての３
種の挿入体ＤＮＡフラグメントを有する数個のコロニー
が見出される（プラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５
−ＢＦ；第６図）。ＰＨ０５シグナル配列、化学的に合
成されたリンカ−ＤＮＡ及びＩｇＢ−ＢＦ　ｃＤＮΔの
間の接合点でこの造成物における正しい構造を配列決定
によって確かめる。

２５．２　　　のノ　−　び プラスミドｐＪＤ８２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＢＦを、１ｌ
ｉｎｎｅｎなど（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ１９７８．、：フル１９７９）によって記載
されている形質転換法を用いて、サソカロマイセスセレ
ビシアエ株Ｇ１１Ｆ１８（α、ｈｉｓ　　３−１１、ｈ
ｉｓ　３−１５、−し＝ｕ　２−３、ｌｅｕ　２−１１
２、ｋａｎ”　）に形質転換する。形質転換された酵母
細胞を、ロイシンを欠く酵母最少培地プレート上で選択
する。

１つの形質転換された酵母コロニーを単離し、そしてサ
ツカロマイセス　セレビシアエＧＲＦ１８（ｐＪＤＢ２
０７Ｒ／ＰＨ０５−ＢＦ　）と称する。そのような形質
転換された酵母細胞を、５０−の酵母最少培地（アミノ
酸を含まないＤｉｆｃｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅ
ｎ　Ｂａ５ｅ培地に２％グルコース、２０■／βのしヒ
スチジン及びｌ　Ｏｇ　／　１のＬ−アスパラギンを添
加したもの）中で、３０℃にて２５時間振として増殖せ
しめ、３Ｘ１０７個の細胞／＋ｎＺの密度にする。この
細胞を０．９％ＮａＣ１中で洗浄し、そしてこれを、０
．０３ｇ／βのＫＨ２ＰＯ４，１ｇ　／　ｌのＭＣＩ　
、　（ＮＩ＋、、）２ＳＯ４の代わりに１０ｇ／ｊ！の
し一アスパラギン、２％及び１　ｇ　／　１２のし一ヒ
スチジンを含有するＤｉｆｃ。

Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ培地（アミノ
酸を含まない）の配合に従って調製された低Ｐｉ最少培
地１００ｎ４中に接種する。この細胞を３０℃で４８時
間増殖せしめ、そして約１０の００６゜。で収得する。

低Ｐｉ培地３５ｍ１の細胞を遠心分離することによって
集め、そして６６ｍＭの冷リン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）及びｏ、ｉ％（ｖ　／　Ｖ　）　Ｔｒｉｔｏ
ｎ　Ｘ−１０ＯＲの合計体積４−中に再懸濁する。この
細胞懸濁液を３０艷のＣｏｒｅｘ管に移す。ガラスピー
ズ（０，４ｖｚの直径）８ｇを添加し、そしてこの懸濁
液を十分な速度で４分間、ポルテックスミキサ（Ｖｏｒ
ｔｅｘ　Ｍｉｘｅｒ）（Ｓｃｉｅｎｔｒｆｉｃ　Ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、＋ＵＳＡ）上で振盪し、そ
して次に水浴中で冷却する。

この方法によって９０％以上の細胞が破壊される。

細胞破片及びガラスピーズを、４℃で１０分間、８００
０ｒｐｍで５ｏｒｖａｌ　ＨＢ４０−ターにより遠心分
離することによって沈降せしめる。ＩｇＥ結合因子活性
を有するポリペプチドを、例２２及び２３に記載してい
るようにしてアフィニティクロマトグラフィーを用いて
前記上清液から精製する。

この例においては、プラスミドｐＣＡＬ５−Ｒ／ＮＤ及
びｐＣＡＬ８−ＢＦ／ＮＤの造成を記載する（第７図を
参照のこと）。これらは、培養された哺乳類細胞におい
て膜−結合ＩｇＥリセプター又は分泌されるＩｇＥ結合
因子の産生を可能にする。さらに、これらのプラスミド
は、目的とするポリペプチドの高収率を導びく１つの方
法である宿主細胞中での遺伝子の増幅の選択のために設
計される。

２６．１　　ブースミドＣＡＬ５の′ プラスミドｐｓＶ２９１１ｎｅｏ　（Ａｓｓｅｌｂｅｒ
ｇｓ＋Ｆ、八３Ｍ、。

？、Ｃ＆（Ｉ９８６）Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１８９
．４０１〜４１１ページ〕を用いてベクターＤＮＡを調
製する。これを制限酵素、旧ｎｄＩ［［及び５ａｌｌに
より消化する。３．９ｋｂ及び１．８　ｋｂのフラグメ
ントを得る。この混合物をアルカリホフファターゼによ
り処理し、１％アガロースゲルを用いる電気泳動にかけ
た後そして３．９ｋｂのフラグメントを単離する。

同時に、ＴｇＦ、リセプター及びウサギβ−グロビン遺
伝子の３′−半分をそれぞれコードする２種類の挿入部
を調製する。一方では、プラスミドｐｃＡＬ３　（例２
０；第４図）１ＯＮを旧ｎｄｌ［［により部分消化し、
そしてＢａｍＨＩにより完全消化する。

１．２６ｋｂのｃＤＮＡ挿入部をアガロースゲル電気泳
動及びゲル溶離により単離する。他方では、１０ｇのプ
ラスミドｐＵβ［Ｗｅｂｅｒ、Ｆ、及び５ｃｈａｆｆｎ
ｅｒ、　Ｗ、　（Ｉ９８５）Ｎａｔｕｒｅ　　３１５　
ｒ　７５〜７７ページ〕をＢａｍ１　Ｉ及び５ａｌＩに
より完全消化する。１．２　ｋｂのＤＮＡフラグメント
を単離する。これは大イントロン及びウサギβ−グロビ
ン遺伝子のポリ　（Ａ）シグナルを含む。

上記からの１ＯＮｇのベクターＤＮＡ及びそれぞれの４
０ｎＨの挿入部ＤＮＡを連結する。得られたＤＮＡを用
いてコンピテントＥ、コリＨＢＩＯＩをトランスフェク
トする。ベクターＤＮＡ中への両ＤＮＡ挿入部の取込み
の後予測されるような、予定された制限パターンを示す
組換えプラスミド（ｐＣＡＬ５　；第７図）を選択する
。

２６．２　　ブースミド　ＣＡＬ５−ＲＮＤの′１０ｎ
ｇのｐＣＡＬ５プラスミドＤＮＡを、５ａｌＴにより部
分消化する。１度だけ切断され、そしてそれ故に十分な
長さの直線を示すＤＮＡ分子を、アガロースゲル電気泳
動により精製する。同時に、ｐＮＤプラスミドＤＮＡ　
（Ａｓｓｅｌｂｅｒｇｓ？、Ｃ＆、；Ｉｏｃ。

ｃｉｔ、）　　１０ＲをＸｈｏＩ及び５ａｌＩにより完
全に切断する。このプラスミドは、２種の選択マーカー
、すなわちネオマイシン（ｎｅｏ）及びジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（ｄｈｆｒ）を含み、そしてこれらはそれぞ
れ、哺乳類宿主のゲノムにおける外来ＤＮＡの組込み及
び増幅についての選択を可能にする。切断されたＲＮＤ
２　ＤＮＡをアルカリホスファターゼにより処理する。

次に、５ａｌＩにより切断されたｐＣＡＬ５（Ｉ０Ｒｇ
）及び５ａｌＩ／ＸｈｏＩにより切断されたｐＮＤ２プ
ラスミドＤ　Ｎ　Ａ　（Ｉ０Ｒｇ）を混合し、そして連
結する。その得られたＤＮＡを用いてコンピテントＥ、
コリ）ＩＢＩＯＩ細胞を形質転換する。この形質転換さ
れた細胞を、ＬＢ−ブイヨン及び５０ｇ／−のカナマイ
シンを含む寒天プレート上に広げる。予定されたＤＮＡ
制限パターンを示す組換えプラスミド（ｐＣＡＬ５−Ｒ
／ＮＤ、第７図）を、哺乳類宿主におけるＩｇＥリセブ
ターの発現のために選択する。このものは、ＩｇＥリセ
プターＤＮＡの下流にｎｅｏ−及びｄｈｆｒ選択マーカ
ーを含む。転写の方向はすべての３種の遺伝子で同一で
ある。

２６．３　　ブースミドＣＡＬ８−ＢＦＮＤの°告プラ
スミドｐＣＡＬ８−ＢＦ／ＮＤは上記プラスミドｐＣＡ
Ｌ５−Ｒ／ＮＤの誘導体であり、このプラスミドにおい
ては弐〇＞のポリペプチドのアミノ酸１〜１４７をコー
ドするＤＮＡ配列が、鳥類のインフルエンザへマグルチ
ニンのシグナル配列をコードする新ＤＮＡ配列によって
取り替えられている。この変化は、式（Ｉ）のポリペプ
チドのアミノ酸１４８〜３２１を含んで成るＩｇＥ結合
因子の分泌を可能にする。このために、下記の式を有す
る二本鎖ＤＮＡ、フラグメントを、参考文献４　、５　
、６゜（ｉａ、７．８に記載されている標準的方法に従
って化学的に合成する。

この０．２ＲｇのＤＮＡを、１０ｎＨのベクターＤＮＡ
及び０．７　ｋｂのＤｄｅ　Ｉ　／　Ｘｂａ　Ｉ　ｃＤ
Ｎ＾挿入部２ｎｇと連結する。このベクターは、（ａ）
Ｘｂａ及びｌ１ｉｎｄ■による完全な消化、（ｂ）アル
カリホスファターゼによる脱リン酸化及び（Ｃ）５．９
ｋｂのベクターＤＮＡのアガロースゲル精製によってｐ
ＣＡＬ５プラスミドＤＮＡから得られる。０．７ｋｂの
ｃＤＮＡ挿入部フラグメントはｐＣＡＬ３　（例２０）
に由来する。３０にのｐＣＡＬ３プラスミドＤＮＡを旧
ｎｄｌｌ及びＸｂａＩにより消化し、そして０．８ｋｂ
のｃＤＮＡ挿入部をアガロースゲル精製により単離する
。この０．８ｋｂのフラグメント３ＮをＤｄｅＩにより
消化し、それによヮて０．１及び０．７　ｋｂのＤＮＡ
フラグメントを得る。

ｉｔに、０．７ｋｂのＤＮＡフラグメントをアガロース
ゲル電気泳動及び精製により単離する。連結されたＤＮ
Ａを用いてコンピテントＥ、コリ■旧０１細胞を形質転
換する。ベクターＤＮＡ中へのＤＮＡ挿入部の組込みの
後、予測されるような、予定された制限フラグメントを
示す組換え体プラスミド（ｐＣＡＬ８；第７図）を選択
する。１０■のｐＣＡＬ８プラスミドＤＮＡを５ａｌｌ
により完全に消化する。

その線状ＤＮＡ分子をアガロースゲル電気泳動により精
製する。５ａｌＩにより切断されたｐＣＡＬ８　（Ｉ０
Ｒｇ）と、５ａｌＩ／ＸｈｏＩにより切断されたｐＮＤ
２プラスミド（例２６．２）　　１０Ｒｇとを連結する
。この連結されたＤＮＡを用いて、５０１Ｉｇ／ａｆの
カナマイシンを補充したＬＢ培地を含む寒天プレート上
にプレートされたコンピテントＥ、コリＩＢＩＯＩ細胞
を形質転換する。組換え体プラスミド（ｐＣＡＬ８−Ｂ
Ｆ／ＮＤ　；第７図）を、形質転換された哺乳類宿主に
おけるＩｇＥ−ＢＦの発現及び産生のために選択する。

Ｊ訳 哺乳類細胞中へのＤＮＡのトランスフェクションのため
に使用される方法、並びに形質転換された細胞の選択及
び遺伝子増幅のための選択は詳しく１５Ｂ） く記載されており　〔アメリカ特許第４．３９９．２１
６号（Ｉ９８３）　；Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｒ，Ｊ、及び
５ｈａｒｐ、Ｐ、Ａ、　（Ｉ９８２）。

Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　　１５９，６０１〜６２１ペ
ージ〕、そして当業者によく知られている。チャイニー
ズハムスターの卵巣セルラインのジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ陰性突然変異体（ｄｈｆｒ−）　　［Ｃｅ１ｌ　１
ｉｎｅ　ＤＬＩＫＸ−Ｂｌ：Ｃｈａｓｉｎ、　Ｌ、Ａ、
及びＵｒｌａｕｂ＋Ｇ、、　（Ｉ９８０）Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ、八ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７７．４２１６〜４２２０ページ〕
を宿主として使用する。この細胞を、透析された５％Ｆ
Ｃ３及び０．１■／ｍ１のゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ
）を補充したＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｐａ１ｓｌａｙ
、５ｃｏｔｌａｎｄ）に保持する。半コンフルエントＣ
ＨＯ細胞を、Ｃａ−ホスフェート同時沈殿法を用いて１
０■のｐＣＡＬ５−Ｒ／ＮＤ又はｐＣＡＬ８−ＢＦ／Ｎ
ＤプラスミドＤＮＡによりトランスフェクトする。この
トランスフェクトされた細胞を、５％ＦＣ３，ゲンタマ
イシン及び０．５■／−のＧ４１８　（Ｇｉｂｃｏ）を
補充したａｔ−ＭＥＭ培地中で増殖せしめる。２週間後
、Ｇ４１８耐性細胞の単一のコロニーが増殖する。４８
個のコロニーのそれぞれを２４ウエルのマイクロタイタ
ープレートのウェル中に移し、そして上記の選択培地中
でコンフルエントに増殖せしめる。次に、この培地のア
リコートを取り、そして例７に記載のＲＩＡを用いてＩ
ｇＥ結合活性の存在について試験する。

コロニーの約５０％が陽性であり、そして１ｍＺ当り約
０．１〜１０ｎｇの組換体ポリペプチドを産生ずる。プ
ラスミドｐＣＡＬ８−ＢＦ／ＮＤに由来する形質転換さ
れたコロニーは、一般的に、プラスミドｐＣＡＬ５−Ｒ
／ＮＤにより得られたコロニーよりもより高い生産体で
ある。５個の最良の産性コロニーを、メトトレキセート
（Ｋａｕｆｍａｎ　ａｎｄ　５ｈａｒｐ　ｏｐ、ｃｉｔ
、）と共に遺伝子増幅のために使用する。数回の増幅の
後、１ｇ／ｆａｌまでの組換体ポリペプチドを産生ずる
細胞系を得る。最良の生産体、すなわちセルラインＣＨ
Ｏ−ＢＦ／ＮＤを大きな培養物に増殖せしめる。選択培
地５０ｍＺを含む組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ、　
１７５ｃｄ＞およそ３Ｘ１０６個の細胞を接種する。細
胞層がコンフルエントになった後、その培地を除去し、
そして１％ＦＣ３及び０．１■／Ｔｎ１のゲンタマイシ
ンを補充したα−ＭＢＭ培地５０−と取り換える。培地
を１週当り２度、数週間にわたり集める。これを５００
０　ｇで１０分間、遠心分離し、そして−２０℃で貯蔵
する。最後に、ＩｇＢ結合活性を有する組換体ポリペプ
チドを、たとえば例２２及び２３に記載しているように
してアフイニテイクロマトグラフィーによって、集めら
れた上清液から精製する。

次の例Ｂ〜Ｄに従って、Ｉｇｔ！−ＢＦを含むＲＰＭＩ
８８６６細胞上清液の画分（ＥＰ８６８１０２４４．３
）を精製することによって、配列決定するために十分に
純粋であるＩｇＥ−ＢＦを得、そしてそのアミノ末端を
決定することが可能である。

両分を次の方法でＩｇｌ！−ＢＦについて分析する。

ＰｖＣ製マイクロタイタープレートのウェルを、室温で
湿潤チャンバー中で一晩、Ｍａｂ−１７６（Ｐ　Ｂ　Ｓ
中５■／−；ウェル当り１００ｇ）により被覆する。

ＰＢＳにより２度洗浄した後、非特異的な結合部位を、
０．２％ゼラチンを含むＰＢＳによりブロックする（Ｉ
５０ｐ！／ウェル；３７℃で１時間）。プレートをＰＢ
Ｓにより再び２度洗浄する。クロマトグラフィー実験か
らの画分をＰＢＳにより１１５０に希釈し、ウェルに添
加しく１００ｍ／ウェル）、そして温潤チャンバー中に
おいて室温で一晩インキユベートする。プレートをＰＢ
Ｓにより４度洗浄する。結合されたＩｇｌ！−ＢＦを、
ビオチンが共有結合しているＭａｂ−１３５（例１９、
ＥＰ８６Ｂ１０２４４．３）　（０，２％ゼラチンを含
むＰＢＳ中、０．５■／ａｆ、　　１００ｍ／ウェル）
を添加することによって検出し、そして温潤チャンバー
中において３７℃で４時間、インキュベートする。ＰＢ
Ｓにより４度洗浄した後、そのプレートを、０．２％ゼ
ラチンを含むＰＢＳ中アビジン及びとアルカリホスファ
ターゼとの接合体（ＳｉｇＩＩｌａ　Ｃａｔ、ＮａＡ２
５２７．０．５　ｔｒｇ／　ｍり１００ｍと共に３７℃
で２時間インキュベートする。さらにＰＢＳにより洗浄
した後、基質緩衝液（Ｉ００■のＭｇＣｆ１２ｘｅｕｔ
ｏ、２００■のＮａＮ、、水８０〇−中に溶解されたジ
ェタノールアミン９７ｍ！、　３７％ＨＣＩＡによりｐ
ｌ＋９．８に調整）中、１■／−のｐ−ニトロフェニル
ホスフェートニナトリウムによりそのプレートを発色せ
しめる。３７℃で２０〜４０分の後、黄色の反応が最適
である。次に、ウェル当り５０ｐｌのＮａＯｌｌ（ＩＭ
）により反応を停止する。モデル２５５０ＥＩＡＲｅａ
ｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、４０５鶴で光学濃
度を決定する。

製 ＲＰＭＩ８８６６細胞からの培養上***１ＯＮを、Ｍａ
ｂ−４５−ａｆｆｔｇｅｌの２０−カラム（Ｉ！Ｐ８６
８１０２４４．３の例）に通して１２０ｎｔｆ／時の流
速で濾過する。このゲルをＰＢＳにより洗浄する。流出
液の蛋白質含有量を、Ｕｖｉｃｏｒｄ”スペクトロメー
ターによって２８０＋ｍでのオンラインの吸光度により
モニターし、結合されなかった蛋白質が完全に除去され
たことを確かめる。このカラムを０．１Ｍのグリシン−
１１Ｃ７！（ｐＨ２，’６）　５０ｍ１により溶出する
。Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ｃｊ！（ｐＨ８，０）及び０
．５％７ｅ＋ｅｅｎ２０の等量を含む管に両分を集める
。Ｉｇ＋！−ＢＦ金含有両分をプールし、そして１０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＪ！　（ｐＨ７，４）に対して透析
する。

例Ｂの精製されたＩｇＥ−ＢＦを５ｙｎＣｈｒｏｐａｋ
　ＡＸ３００陰イオン交換カラム（ＳｙｎＣｈｒｏｍ　
Ｉｎｃ、、Ｌｉａｄｅｎ、ＩＮ）上に負荷する。このカ
ラムを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃｌ（ｐＨ７，４）に
より洗浄し、そして蛋白質を、１−７分の流速で１００
分間にわたって、０〜ＩＭのＮａＣＲのグラジェントに
より溶出する。この溶出を２５４＋ｍでＵＶ吸光度によ
りモニターする。この両分を１％オクチルピラノグルコ
シド（Ｓｔｇｍａ）中に集め、そして例Ａに記載のよう
にしてＩｇＥ−ＢＦについて検定する。

例Ｃの５０−のＩｇＥ−ＢＦを、０．５１のＰＢＳに対
して透析し、そして０．１％オクチルピラノグルコシド
を含む０．５＃のＰＢＳに対して２度透析する。

凍結乾燥した後、ＩｇＥ−ＢＦを水１．５　ｍＺ中に溶
解し、そして０．１％オクチルピラノグルコシドを含む
２×０．５βのＰＢＳに対して再び透析する。逆相クロ
マトグラフィーを、０．１％ＴＦＡ　（Ｐ　ｉ　ｅｒｃ
ｅ）及び５％アセトニトリル（Ｍｅｒｃｋ）中５ｙｎＣ
ｈｒｏｐａｋ　ＲＰ−４（ＳｙｎＣｈｒｏｍ）カラム上
で行なう。０．５ｙｄ／分の流速で３０分間、０．１％
ＴＦＡ中５〜６０％アセトニトリルのグラジェントを適
用することによって、ＩｇＥ−ＢＦの溶出を行う。この
溶出を２５４＋ｍでのＵＶ吸光度によりモニターする。

１ｄの画分を０．０５％ｓｎｓ中に集め、そして例Ａに
記載のようにしてＩｇＥ−ＢＦについて分析する。　Ｉ
ｇｆ！−ＢＦの純度を５ＤＳ−ＰＡＧＥによって制御し
、そして続いて銀染色を行なう　　（ＵＰ８６Ｂ１０２
４４．３、　例２２）　。

Ｅ：ＩＥ−ＢＦのアミノ Ｍ、１１．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ及びり、Ｅ、Ｈｏａ
ｄ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎハ鉦艶旦■、９Ｌ３９９ペー
ジ、（Ｉ９８３）の方法に従って、例りの精製されたＩ
ｇｌ！−ＢＦを、ポジティブ・フェーズ・プロティン・
スフエンサーモデル４７０（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）を用いてＮ−末端のアミノ酸配列分析に
かける。アミノ−チオゾリン誘導体を、５０℃で２５％
水性ＴＦＡによる処理によって、フェニルチオビタント
イン（ＰＴＨ）アミノ酸に転換する。このＰＴＨアミノ
酸をＺｏｒｂａｘＣＮ”）ＩＰＬＣカラム（Ｄｕ　Ｐｏ
ｎｔ、２００Ｘ４．６　ｍ）上で分析する（Ｒ，Ｋｎｅ
ｃｈｔなど、＋Ａｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１３０
＋　６５ページ、１９８３）。次のＮ−末端のアミノ酸
配列が、材料の４０％で見出される： ＬＸＭＥＬＱＶＸＳＧＦ ＸＮＴＸＰ 〔配列中、ＸＩ４９　、Ｘ＋ｓｓ　、Ｘ＋ｈｏ及びＸ、
６．は、決定されなかったアミノ酸を表わす〕。この配
列は、ｃＤＮＡ分析によって決定されたＩｇＥ−リセブ
ターの配列に従えば、該リセプターの第１４８番目のア
ミノ酸から始まる。

次のＮ−末端のアミノ酸配列が、材料の６０％で見出さ
れる二　　　　　　　　　　　　以下余白ＭＸＬＱＶＳ
ＳＧＦＶＸ ＮＴＸＰＥＫ 〔配列中、Ｘ、６．　、Ｘ、、。及びＸｌ、、、は決定
されなかったアミノ酸を表わす〕。この配列は、ｃＤＮ
八分へによって決定されたＩｇＥリセプターの配列に従
えば、該リセプターの第１５０番目のアミノ酸から始ま
る。

例２４．１の精製された２、９ｋｂのベクターＤＮＡ　
（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより切断されたプラスミ
ドｐＰＬｃ２４）１０ｎｇを、０．１　ｎｇのオリゴヌ
クレオチド５”　　−ｐＡＡＴＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ
ＡＡＴＴＡＴＧ　　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　　Ｎｏ、
２７−４８７８−Ｏｆ）及び０．１ｎｇのオリゴヌクレ
オチド５　’−ｐＧＡＴＣＣＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＣＣ
ＴＣＣ＾（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＋　Ｎａ２７−４８９８
−０１）と共に、１０ＩＩＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　
（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭＭｇ１！ｚ　、２ｍＭ　Ｄ
ＤＴ、　０．１ｍＭ＾ＴＰ及び１００ユニツトの７４Ｄ
ＮＡ　リガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ）を含む溶液２０ｄ中で混合する。４℃で１６時
間後、その混合物を用いてコンピテントＥ、コリＫ　１
２細胞を形質転換する。個々のコロニーを増殖せしめ、
そしてそのプラスミドを単離する。標準的制限酵素分析
を行ない、Ｂａ＋ｎＨＩによっては切断されるが、しか
しＥｃｏＲＩによっては切断されない正しいプラスミド
（ｐＰＬ、ＰＴＩＳ；第８図を参照のこと）を選択する
。オリゴヌクレオチドの正しい挿入をＤＮＡ配列決定に
より確認する。新しく挿入されたＤＮＡフラグメントは
ポータプル翻訳開始部位（ＰＴＩＳ。

Ｐｈａｒ＋ｗａｃｉａ）をコードする。

１０ａｇのｐＰＬ、ＰＴＩＳプラスミドＤＮＡをＢａｍ
ＨＩにより消化し、次にアルカリホスファターゼにより
処理し、そして線状の２．９ｋｂベクターＤＮＡをアガ
ロースゲル電気泳動により精製する。１０ｎＨのこのベ
クターＤＮＡを、プラスミドｐＣＡＬ−３（例２０）に
由来する０、８ｋｂのＢｇｌ　Ｉ［−Ｂａｔ（Ｉフラグ
メント３ｎｇに連結し、そして次に、これを用いてコン
ピテントＥ、コリに１２細胞を形質転換する。個々のコ
ロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、そして標準的制
限酵素分析を行なって、正しい方向に０、８　ｋｂの挿
入体を有するプラスミドｐＰＬ．ＰＴＩＳ−１１１’（
第８図）を選択する。プラスミドρＰＬ、ＰＴＩＳ−Ｂ
Ｆを用いて１４２１株Ｗ３１１０及び）ＩＢＩＯＩ　　
（両者はλ１８５７（Ｒｅｍａｕｔなど、＋１ｏｃ、ｃ
ｉｔ、）を含む）を形質転換する。この形質転換体を、
４０１！ｇ／−のカナマイシン及びアンピシリンを含む
ＬＢ−プレート・上に広げ、そして３０℃で２４時間イ
ンキュベートすることによって増殖せしめる。得られた
組換体コロニーを発酵のために使用する。

■、１１−醒 例２８．１で得られた組換え体Ｅ、コリ株を例２４．２
に記載のようにして増殖せしめる。４２℃で３時間のイ
ンキュベーションの後、その培養物を氷／水浴中で３０
分間冷却し、そして遠心分離することによって細胞を集
める。

２８．３　■　Ｅ−八ゞ　　　するポリペプチドの■製 熱誘導された培養物１ｄから得られた細胞のベレットを
、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，５）及び１
　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む溶液２〇−中に４℃で再懸濁す
る。この細胞懸濁液を、１分間隔で４×３０秒間、氷上
で常に冷却しなから音波処理する（ＭＳＥ　５ｏｎｉｐ
ｒｅｐ”１５０．９．５　ｆｉのプローブ、２４ミクロ
ンの振幅）。

次に、この、懸濁液を１０分間遠心分離にかける（Ｓｏ
ｒｖａ１１遠心機、）ＩＢ−４０−ター、９０００ｒｐ
ｍ　、　４℃）。

このペレットを５０ｍＭ　Ｔｒｔｓ−■（Ｊ！　（ｐＨ
７，５）及びＩＩＩＩＭＥＤＴＡを含む溶液２〇−中に
４℃で再懸濁し、そして上記のようにして３０秒間音波
処理する。その懸濁液を上記のように遠心分離にかけ、
そして洗浄サイクルをさらに２度、くり返す。

文−献 １、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ＋Ａ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ
、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａ−ｔｏｒｙ　（Ｉ９８２）。

’１．Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　ａｎｄ　ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　２．１
６１−１７０（Ｉ９８２）。

３、　　Ｈｅ１ｄｅｃｋｅｒ及びＭｅｓｓｉｎｇ＋Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ−５ｅａｒｃｈ　ＬＬ　
４８９１−４９０６（Ｉ９８３）。

４、Ｓ、＾、　Ｎａｒａｎｇ等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、１２１　＋３６５（Ｉ９８２）　　。

５、　　Ｗ、Ｌ、Ａｇａｒｗａｌ等、Ａｎｇｅｗ、Ｃｈ
ｅ＋１１．８４，４８９（Ｉ９７２）。

６、　　Ｃ，Ｂ、Ｒｅｅｓｅ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
　　３４，３１４３（Ｉ９７２）　　。

６ａ、Ｒルルｅｔｓｉｎｇｅｒ等、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ
、Ｓｏｃ、　９８．３６５５（Ｉ９７６）　　。

７、　　Ｋｈｏｒａｎａ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
　２５１．５６５（Ｉ９７６）。

８　、　　Ｓ、Ａ、Ｎａｒａｎｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ　３９＋３（Ｉ９８３）ｅ９、　　Ｃｈａｎｇ等、
Ｎａｔｕｒｅ、２７５：６１５（Ｉ９７８）。

１０、　　Ｇｏｅｄｅｌｌ等、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：
５４４（Ｉ９７９）。

１１、　　Ｇｏｅｄｅｌｌ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ
１ｄ　　Ｒｅｓ、、８：４０５７（Ｉ９８０）。

１２、　５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔ等、Ｃｅ１ｌ　２０：２
６９（Ｉ９８０）。

１３、　　Ｊ、Ｇｈａｒａｙｅｂ等、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ
Ｊｏｕｒｎａｌ、Ｖｏｌ、３＋２４３７−２４４２（Ｉ
９８４）。

１４、　　Ｓｔｉｎｃｈｏｍｂ等、Ｎａｔｕｒｅ、２８
２：３９（Ｉ９７９）。

１４ａ、　Ｋｉｎｇｓ＋ｍａｎ等、Ｇｅｎｅ、７：１４
１（Ｉ９７９）。

１５、　　Ｔｓｃｈｅ＋ｍｐｅｒ等、　Ｇｅｎｅ、　１
０．１５７　（Ｉ９８０）。

１６、　　　Ｍｅｌｔｏｎ、Ｄ、Ａ、等（Ｉ９８４）Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１２
．７０３５−７０５６　　。

１７、　　Ｍ、５ａｒｆａｔｉ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ、１９Ｂ４．５３．１９７−２０５゜１８、　　Ｊ、
Ｂ、Ｇｕｒｄｏｎ、Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　　ｏｆ　
　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓ−ｓｉｏｎ　　ｉｎ　ａｎｉ
ｍａｌ　　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ＋Ｃ１ａｒｅｎｔｏ
ｎＰｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ＋１９７４゜１９、　　Ｆ
、Ｃ，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ等、Ｂｉｏｃ、ｈｅｍ、Ｊ、
　８９，１１４（Ｉ９６３）。

２０、　　Ｂ、５ｅｅｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　　Ｒｅｓ、１０．１７９９−１８１０（Ｉ９８２）　
　。

２１、　　　Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ　　等、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　　　７４＋５４６３−
５４６７゜

【図面の簡単な説明】

第１図はＲＰＭＩ８８６６Ｂ−細胞から単離されたｍＲ
Ｎ八からのｄｓ　−ｃＤＮＡを挿入部として含有するプ
ラスミドｐＣＬ−１及びｐｃｔ、−２の調製を示す。挿
入部ｃＤＮＡはＩｇＥ−リセブター、及びＩｇＥ−結合
因子に関連するポリペプチドをコードしている。 第２図はプラスミドｐＣＬ−１及びｐｃｔ、−２の２つ
の挿入部の比較を示し、再挿入部に共通のコード領域、
再挿入部に共通の非−コード領域、ｐｃｔ、−２中にの
み存在するコード領域及び再挿入部において異る非コー
ド領域、並びに若干の制限部位が示されている。 第３図は、ｐｃｔ、−２及びｐＧｔ！Ｍ７Ｍ−１からの
プラスミドｐＧＥＭ丁’−１／ＣＬ２の造成、並びにｍ
ＲＮ八へのＤＮＡ挿入部の転写を示す。 第４図は、プラスミドｐｃｔ−２から、アミノ酸配列Ａ
ＳＩ）＋１９　５ｅｒｓｚ＋をコードする挿入部を有す
るプラスミドｐＦＫ−１、及び式（Ｉ）の八Ｉａｒｓａ
−５ｅｒｓ＋ｔのアミノ酸配列をコードするｐＦＫ−２
を造成する過程を示す。 第５図はＥ、コリＷ３１１０及びＩＩＢＩＯＩ中でＩｇ
ｌ！−ＢＦを発現するためのプラスミドｐＢＬ−ＢＦの
造成を示す。 ファージλのＰＬプロモーターのもとてアミノ酸１１９
−３２１が発現される。 第６図はサッカロミセス・セレビシエーにおいてＩｇＢ
−ＢＦを発現するためのプラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／
ＰＨ０５−ＢＦの造成を示す。ＰＨ０５プロモーターの
もとてアミノ酸１１９−３２１が発現される。 第７図は培養された哺乳類細胞（チャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞）中でそれぞれ膜結合ＩｇＥリセプター又は
分泌されるＩｇＥ−ＢＦを発現するためのプラスミドｐ
ＣＡＬ−５及びｐＣＡＬ８−ＢＦ／ＮＤの造成を示す。 第８図はＥ、コリ中でのＩｇＥ−ＢＦの発現及び形質転
換のためのプラスミドｐＰＬ、Ｐｊｌｓ−ＢＦの造成を
示す。 図中の記号は次の意味を有する： ＡｍＨａｅｌｌ　　　Ｇ＝Ｂｇｌｌ［［Ｂ　＝Ｂａｎ＋
ＨＩ　　　　　Ｈ＝Ｈｉｎｄｌ［［Ｃ＝ＨｉｎｃＩＩ　
　　　　Ｎ＝ＮｃｏｌＥ＝ＥｃｏＲＩ　　　　　Ｐ＝Ｐ
ｓｔＩＲ＝Ｒｓａｌ −］［ＩｇＥ−リセブター及び／又は ＩｇＥ−ＢＦに関連するポリペプチドをコードする配列
。 Ｍ　　　ｐＣＬ−２（第２）に特異的なコード配列。 コ＝コー　　ｐＣＬ−ｉ及びｐＣＬ−２において異る非
コード配列。 二Ｅ■ＨｐＣＬ−１及びｐＣＬ−２（第２図）に共通の
非コード配列。 □　　ｍＲＮＡ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の式（ I ）： 【遺伝子配列があります】（ I ） で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並び
   に該ポリペプチドの断片、変異体及び誘導体。 ２、アミノ酸１０６−１２７を含んで成るアミノ酸配列
   が除去されていることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項に記載のポリペプチドの断片。 ３、アミノ酸１２０、１２１、１２３、１２４、１２５
   、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、
   １３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１
   ３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４
   ４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０
   、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、
   １５７、１５８、１５９又は１６０のいずれかから始ま
   りそしてアミノ酸３２１で終るポリペプチドから成る群
   から選択されることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   に記載の式（ I ）のポリペプチドの断片。 ４、アミノ酸１２０、１２１、１２３、１２４、１２５
   、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、
   １３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１
   ３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４
   ４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０
   、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、
   １５７、１５８、１５９又は１６０のいずれかから始ま
   りそして２８２と３２１との間のアミノ酸のいずれかで
   終るポリペプチドから成る群から選択されることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載の式（ I ）のポリ
   ペプチドの断片。 ５、アミノ酸１１９からアミノ酸３２１までのアミノ酸
   配列から成ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   記載の式（ I ）のポリペプチドの断片。 ６、アミノ酸１３４からアミノ酸３２１までのアミノ酸
   配列から成ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   記載のポリペプチドの断片。 ７、アミノ酸１４８からアミノ酸３２１までのアミノ酸
   配列から成ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   記載のポリペプチドの断片。 ８、アミノ酸１５０からアミノ酸３２１までのアミノ酸
   配列から成ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   記載のポリペプチドの断片。 ９、特許請求の範囲第２項〜第８項のいずれかに記載の
   断片の変異体又は誘導体。 １０、次の式（ I ）： 【遺伝子配列があります】（ I ） で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
   該ポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体の製造方
   法であって、 ａ）前記式（ I ）のポリペプチド又は該ポリペプチド
   の断片もしくは変異体をコードするＤＮＡを含んで成る
   ハイブリドベクターを含有する形質転換された宿主を培
   養し；又は、 ｂ）前記式（ I ）のポリペプチド又は該ポリペプチド
   の断片もしくは変異体をコードするｍＲＮＡを適当な翻
   訳系において翻訳し、そして 必要であれば、式（ I ）のポリペプチド又は該ポリペ
   プチドの断片もしくは変異体をその誘導体に転換する； ことを特徴とする方法。 １１、次の式（ I ）： 【遺伝子配列があります】（ I ） で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
   該ポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体を発現す
   ることができる形質転換された宿主の製造方法であって
   、 １）前記式（ I ）のポリペプチド又は該ポリペプチド
   の断片、変異体もしくは誘導体をコードするＤＮＡを用
   意し； ２）得られたＤＮＡを適当なベクターに導入し； ３）得られたハイブリドベクターにより適当な宿主を形
   質転換し； ４）未形質転換宿主から形質転換宿主を選択し；そして
   場合によっては、該形質転換宿主からハイブリドベクタ
   ーを単離し、該ハイブリドベクターのコード領域又は非
   コード領域を変形し、そして段階３）及び４）を再度行
   う； ことを特徴とする方法。 １２、次の式（ I ）： 【遺伝子配列があります】（ I ） で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
   該ポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体をコード
   しているＤＮＡ。 １３、次の式（II）： 【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ、
   又はその断片もしくは変異体。 １４、次の式（III）： 【遺伝子配列があります】 で表わされる特許請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ、
   又はその断片もしくは変異体。 １５、式（ I ）のＤ＿１＿１＿９−Ｓ＿３＿２＿１の
   アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている特
   許請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ。 １６、式（ I ）のＡ＿１＿３＿４−Ｓ＿３＿２＿１の
   アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている特
   許請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ。 １７、式（ I ）のＬ＿１＿４＿８−Ｓ＿３＿２＿１の
   アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする特許請
   求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ。 １８、式（ I ）のＭ＿１＿５＿０−Ｓ＿３＿２＿１の
   アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている特
   許請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ。 １９、次の式（ I ）： 【遺伝子配列があります】（ I ） で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
   該ポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体をコード
   するＤＮＡ配列を挿入部として含んで成るハイブリドプ
   ラスミド。 ２０、アミノ酸１０６−１２７を含んで成るアミノ酸配
   列が除去されている式（ I ）のポリペプチドを前記挿
   入部がコードしていることを特徴とする、式（ I ）の
   ポリペプチドの断片をコードしているＤＮＡ配列を挿入
   部として含んで成る特許請求の範囲第１９項に記載のハ
   イブリドベクター。 ２１、アミノ酸１２０、１２１、１２２、１２３、１２
   ４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０
   、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、
   １３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１
   ４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４
   ９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５
   、１５６、１５７、１５８、１５９又は１６０のいずれ
   かから始まりそしてアミノ酸３２１で終るポリペプチド
   から成る群から選択される式（ I ）のポリペプチドの
   断片を前記挿入部がコードしていることを特徴とする、
   式（ I ）のポリペプチドの断片をコードしているＤＮ
   Ａ配列を挿入部として含んで成る特許請求の範囲第１９
   項に記載のハイブリドベクター。 ２２、アミノ酸１２０、１２１、１２２、１２３、１２
   ４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０
   、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、
   １３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１
   ４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４
   ９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５
   、１５６、１５７、１５８、１５９又は１６０のいずれ
   かから始まりそして２８２と３２１との間のアミノ酸の
   いずれかで終るポリペプチドから成る群から選択される
   式（ I ）のポリペプチドの断片を前記挿入部がコード
   していることを特徴とする、式（ I ）のポリペプチド
   の断片をコードしている配列を挿入部として含んで成る
   特許請求の範囲第１９項に記載のハイブリドベクター。 ２３、アミノ酸１１９からアミノ酸３２１までのアミノ
   酸配列から成る式（ I ）のポリペプチドの断片を前記
   挿入部がコードしていることを特徴とする、式（ I ）
   のポリペプチドの断片をコードするＤＮＡ配列を挿入部
   として含んで成る特許請求の範囲第１９項に記載のハイ
   ブリドベクター。 ２４、アミノ酸１３４からアミノ酸３２１までのアミノ
   酸配列から成る式（ I ）のポリペプチドの断片を前記
   挿入部がコードしていることを特徴とする、式（ I ）
   のポリペプチドの断片をコードしているＤＮＡ配列を挿
   入部として含んで成る特許請求の範囲第１９項に記載の
   ハイブリドベクター。 ２５、アミノ酸１４８からアミノ酸３２１までのアミノ
   酸配列から成る式（ I ）のポリペプチドの断片を前記
   挿入部がコードしていることを特徴とする、式（ I ）
   のポリペプチドの断片をコードしているＤＮＡ断片を挿
   入部として含んで成る特許請求の範囲第１９項に記載の
   ハイブリドベクター。 ２６、アミノ酸１５０からアミノ酸３２１までのアミノ
   酸配列から成る式（ I ）のポリペプチドの断片を前記
   挿入部がコードしていることを特徴とする、式（ I ）
   のポリペプチドの断片をコードしているＤＮＡ配列を挿
   入部として含んで成る特許請求の範囲第１９項に記載の
   ハイブリドベクター。 ２７、次の式（II）： 【遺伝子配列があります】 もしくは次の式（III）： 【遺伝子配列があります】 又はこれらの断片もしくは変異体を含んで成る特許請求
   の範囲第１９項に記載のハイブリドベクター。 ２８、ｐＣＬ２である特許請求の範囲第１９項に記載の
   ハイブリドベクター。 ２９、ｐＣＬ１である特許請求の範囲第１９項に記載の
   ハイブリドベクター。 ３０、ｐＰＬ−ＢＦである特許請求の範囲第１９項に記
   載のハイブリドベクター。 ３１、ｐＣＡＬ８−ＢＦ／ＮＤである特許請求の範囲第
   １９項に記載のハイブリドベクター。 ３２、ｐＰＬ．ＰＴＩＳ−ＢＦである特許請求の範囲第
   １９項に記載のハイブリドベクター。 ３３、次の式（ I ）： 【遺伝子配列があります】（ I ） で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
   該ポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体をコード
   するＤＮＡ配列を挿入部として含んで成るハイブリドプ
   ラスミドにより形質転換された宿主。 ３４、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲
   第３３項に記載の宿主。 ３５、Ｅ．コリＨＢ１０１、Ｅ．コリＢＺ２３４、Ｅ．
   コリＢ１４７２及びＥ．コリＷ３１１０から選択される
   特許請求の範囲第３３項に記載の宿主。 ３６、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒ
   ｏｍｙｓｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株、例えばＧＲ
   Ｆ１８である特許請求の範囲第３３項に記載の宿主。 ３７、哺乳類セルライン、例えばチャイニーズハムスタ
   ー卵巣セルラインＤＵＫＸ−１３１である特許請求の範
   囲第３５項に記載の宿主。 ３８、特許請求の範囲第１０項に記載の方法により製造
   された特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ３９、次の式（ I ）： 【遺伝子配列があります】（ I ） で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
   該ポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体を含んで
   成る医薬。 ４０、ヒト又は動物の療法的処置のための方法において
   使用するための特許請求の範囲第１項に記載のポリペプ
   チド。 ４１、抗アレルギー剤として使用する特許請求の範囲第
   １項に記載のポリペプチド。 ４２、医薬の製造のために使用する特許請求の範囲第１
   項に記載のポリペプチド。