JP2659781B2 - リンパ球機能関連抗原―３（ｌｆａ―３）を製造するためのｄｎａ配列、組換ｄｎａ分子及び方法 - Google Patents

リンパ球機能関連抗原―３（ｌｆａ―３）を製造するためのｄｎａ配列、組換ｄｎａ分子及び方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、DNA配列、組換DNA及びリンパ球機能の会合
した抗原−３（LFA−３）の製造方法に関するものであ
る。更に特別には、本発明は、DNA配列が、CD2、即ちＴ
−リンパ球の表面のレセプターに結合したLFA−３又は
その誘導体に対して、適切な単細胞宿主中の発現にコー
ド付けすることを特徴とするDNA配列に関するものであ
る。更に好適には、本発明のLFA−３及びその誘導体は
Ｔ−リンパ球の表面のCD2に結合する。最も好適には、
これらはまた、Ｔ−リンパ球と標的細胞との間の粘着を
防止する。本発明によると、これらのDNA配列で変換さ
れた単細胞宿主とこれらを含む組換DNA分子は、ヒト起
源の他のタンパクが本質的に無いLFA−３を製造するの
に使用されて良い。それ故にこの新規な抗原は、治療と
診断の組成物において及びこの発明の方法において使用
されて良い。
本発明の背景 Ｔ−リンパ球は、標的細胞及び抗原提示細胞と相互作
用することにより免疫応答に主要な役割を演ずる。例え
ば、標的細胞の致死を仲介するＴ−リンパ球は、細胞溶
解のＴ−リンパ球の標的細胞への粘着を含む多段階工程
である。更に、ヘルパーＴ−リンパ球は、抗原−提示細
胞へ粘着することにより免疫応答を開始する。
Ｔ−リンパ球の標的及び抗原−提示細胞とのこれらの
相互作用は、高度に特異的であって、かつ標的又は抗原
−提示細胞上の抗原は、Ｔ−リンパ球の表面上の多くの
特異的抗原レセプターによる認識に左右される。
Ｔ−リンパ球と他の細胞のレセプター−抗原相互作用
はまた、各種のＴ−リンパ球表面タンパク、例えば、抗
原レセプター複合体のCD3（T3）と補助分子のCD4,LFA−
1,CD8,及びCD2により促進される。それはまた、標的又
は抗原−提示細胞の表面に発現されるLFA−３、ICAM−
１及びMHCのような補助分子に左右される。事実、Ｔ−
リンパ球上の及び標的又は抗原−提示細胞上の補助分子
は、相互作用して細胞間の粘着を仲介すると仮定されて
いる。従って、これらの補助分子は、リンパ球−抗原−
提示細胞とリンパ球−標的細胞との相互作用を促進し、
かつ白血球−内皮細胞相互作用とリンパ球再循環に重要
であると考えられている。
例えば、最近の研究は、CD2（Ｔ−リンパ球補助分
子）とＴ−リンパ球の標的細胞への粘着を仲介するLFA
−３（標的細胞補助分子）の間の特異的相互作用がある
ことを提案している。この粘着は、Ｔ−リンパ球の機能
応答の開始に本質的である「M.L.ダスチン等、「CD2へ
結合した精製したリンパ球機能−会合した抗原−３及び
Ｔ−リンパ球粘着の仲介」、J.EXP.Med．（ジョーナル
エクスペリメンタル メディスン）第165巻、第677−
92頁（1987）；スプリンゲル等、Ann.Rev.Immunol．
（アニュアル レビュー イムノロジー）（1987）（印
刷中）］。更に、LFA−３又はCD2に対するモノクローナ
ル抗体が、細胞溶解Ｔ−リンパ球とヘルパーＴ−リンパ
球依存応答のスペクトルを防止することが示されている
［F.サンヒェツ−マドリド等、「ヒトＴ−リンパ球−仲
介された細胞溶解と抗原会合した３つの異なる抗原:LFA
−1,LFA−2,及びLFA−３」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
（プロシーディング ナショナル アカデミー サイエ
ンス、米国）、第79巻、第7489−93頁（1982）］。
LFA−３は、抗原−提示細胞、及び標的細胞、特に単
球、顆粒球、CTL細胞、Ｂ−リンパ芽球細胞、平滑筋細
胞、血管内皮細胞、及び繊維芽細胞に見いだされる（ス
プリンゲル等、上記文献）。
ヒトLFA−３は、ヒト赤血球から精製されている（ダ
スチン等、上記文献）。これは、糖含有量約50％の分子
量60,000〜70,000の糖タンパク質である。この精製LFA
−３は、Ｔ−リンパ球の表面のCD2へ結合しており、か
つＴ−リンパ球と赤血球の粘着を防止する（ダスチン
等、上記文献）。
しかし、治療と診断における基本的使用に対して、多
量のより安価なLFA−３が、赤血球からの精製で入手さ
れるものよりも要望されている。更に、治療の使用に対
して、Ｂ型肝炎ウイルス又はエイズウイルスのようなウ
イルスで汚染されているかもしれないヒト赤血球と異な
る他の原料からのLFA−３を得ることがより好ましいで
あろう。
発明の摘要 本発明は、これらの問題を解決する。本発明は、CD
2、即ちＴ−リンパ球の表面のレセプターに結合するLFA
−３とその誘導体を多量に提供する。更に好適には、本
発明のLFA−３及びその誘導体は、Ｔ−リンパ球の表面
のCD2へ結合しており、かつこれらはまた、Ｔ−リンパ
球と標的細胞の間の粘着を防止する。更に特別には、本
発明は、可溶性形態のLFA−３に関するものである。本
発明はまた、ヒト起源の他のタンパク質の本質的に無く
かつエイズ又はＢ型肝炎のようなウイルスにより汚染さ
れていない形態のLFA−３を提供する。
本発明は、これらの目的を、適切な単細胞宿主中の発
現にLFA−３又はこれらの誘導体に対してコード付けす
るDNA配列を提供することにより達成するものである。
更に、本発明は、可溶性形態のLFA−３に対する発現に
コード付けすることを特徴とするDNA配列を提供するも
のである。
本発明はまた、これらのDNA配列とこれらで変換され
た単細胞宿主とを含む組換DNA分子を提供するものであ
る。これらの宿主は、広範囲の各種治療及び診断の組成
物と方法に使用するための本発明の新規なLFA−３と誘
導体を多量に製造することを可能とする。
本発明のDNA配列は： （ａ） DNA配列：ファージλHT16に担持されるDNA挿入
断片； （ｂ） 前記DNA配列に対してTm以下の約20〜27℃に等
しい条件下にハイブリッド形成され、かつCD2、即ちＴ
−リンパ球の表面のレセプターへ結合するポリペプチド
に対して発現にコード付けするDNA配列；及び （ｃ） 前記DNA配列のいずれかにより発現に対してこ
れにコード付けされたポリペプチドに対して発現にコー
ド付けするDNA配列 から成る群から選択される。
図面の簡単な説明 第１図は、Ｎ−末端のアミノ酸配列と、免疫親和性ク
ロマトグラフィーを使用してヒト赤血球から精製したヒ
トLFA−３の各種ペプチド断片を表している。
第２図は、ヒト赤血球から精製したヒトLFA−３のア
ミノ酸配列から誘導した化学的に合成したオリゴヌクレ
オチドDNAの２つのプールを表している。
第３図は、ファージλHT16に担持されるDNA挿入断片
のDNA配列を表している。第３図はまた、ヒトLFA−３と
これから推定されるアミノ酸配列に対して発現にコード
付けするcDNAのヌクレオチド配列を表してしる。
第４は、配列決定のプラスミドpNN01の関係部分を表
している。
発明の詳細な説明 発明者等は、２つのライブラリーから本発明のDNA配
列を単離した：白血球泳動＃９からの末梢血液リンパ球
から誘導したλgt10 cDNAライブラリーとヒト扁桃から
誘導したλgt10 cDNAライブラリーである。しかし、発
明者等は、LFA−３を発現する他の細胞から調製したラ
イブラリーも使用することが出来た。これらは、例え
ば、単球、顆粒球、CTL's、Ｂ−リンパ芽球類細胞、平
滑筋細胞、血管内皮細胞及び繊維芽細胞を包含する。発
明者等はまた、ヒトゲノムバンクを使用することも出来
た。
これらのライブラリーをスクリーニングする為に、発
明者等は、一連の化学的に合成した非転写オリゴヌクレ
オチドDNAプローブを使用した。本発明者等は、発明者
等がヒト赤血球から精製したLFA−３を使用して決定し
たLFA−３の各種断片のアミノ酸配列を考慮してこれら
のプローブを選択した。これらの断片は、第１図に表し
ている。発明者等は、最少縮重のオリゴヌクレオチドプ
ローブの構成を可能にするLFA−３の各種領域からアミ
ノ酸を選択した。
発明者等は、プローブの２つのプール:LF1とLF2−５
を調製した。これらのプールを第２図に表している。LF
1は、32−ホールド縮重20−マーであり。かつLF2−５
は、384−ホールド縮重20−マーである。この後者のプ
ールの高い縮重の為に、発明者等は、プールを各々が96
−ホールド縮重の４つのサブプール−−LF2,FL3,LF4及
びLF5−−に細別した。
スクリーニングする為に、発明者等は、プラークハイ
ブリッド形成スクリーニング検定を利用する発明者等の
cDNAライブラリーに対して、発明者等のオリゴヌクレオ
チドプローブにハイブリッド形成した。発明者等は、幾
つかの発明者等のプローブに対してハイブリッド形成す
るクローンを選択した。更に、選択したクローンのcDNA
挿入断片を単離しかつプラスミド中にサブクローン化し
た後に、発明者等は、これらのヌクレオチド配列を決定
し、かつこれらのヌクレオチド配列から推定したアミノ
酸配列を、発明者等が以前に発明者等の精製したヒトLF
A−３から決定したアミノ酸配列と比較した。これらの
比較の結果として、発明者等は、総ての発明者等が選択
したクローンは、ヒトLFA−３のアミノ酸配列に対して
コードするcDNA挿入断片により特徴ずけられることを決
定した。
発明者等は、これらのcDNAの最長のヌクレオチド配列
（ファージλHT16のDNA挿入断片）とLFA−３とそれから
推定されるアミノ酸配列に対してコード付けするDNA配
列を第３図に表現している。第３図に示すように、この
cDNA挿入断片は、750bpの読取り枠（250アミノ酸）、16
bp 5′翻訳しない領域及び201bp 3′翻訳しない領域を
有する。発明者等がヒト赤血球から精製したLFA−３か
ら決定したＮ−末端アミノ酸配列を有する第３図の推定
アミノ酸配列の比較は、アミノ酸−28〜−１は、信号配
列から成り、かつアミノ酸１〜222は成熟LFA−３のタン
パク質配列から成ることを明示している。
第３図に示されかつ預けたクローンλHT16に含まれる
cDNA配列は、本発明に従って、各種方法で使用される。
これは、その一部、又はこれらの合成又は半合成コピー
は、DNAプローブとして使用して、他のヒトのcDNA又は
動物のcDNA又はゲノムライブラリーをスクリーンして良
く、このゲノムライブラリーは、LFA−３に関する他のD
NA配列を、ハイブリッド形成により選択するためのもの
である。代表的に、普通のハイブリッド形成条件、例え
ば、Tm以下約20〜27℃が、このような選択に適用され
る。しかし、より少ない緊縮条件は、ライブラリーがラ
イブラリーと異なる種からのプローブでスクリーンされ
る場合に、例えば、ヒトプローブでマウスライブラリー
のスクリーンニングする場合必要である。
第３図のcDNA、その一部、又はこれらの合成又は半合
成コピーはまた、各種変異を調製する出発原料として使
用される。このような変異は、どちらかの縮重であって
良く、即ち、変異は、変異コドン又は非縮重によりこれ
に対して暗号化されるアミノ酸配列を変えず、即ち、変
異は、変異したコドンによりこれに対して暗号化される
アミノ酸配列を変える。例えば、これらの変異は、より
容易な精製又はより高いLFA−３活性のような、より高
いレベルの製造を可能にする。
これら総てい理由に対して、本発明のDNA配列は： （ａ） DNA配列：ファージλHT16に担持されるDNA挿入
断片； （ｂ） 前記DNA配列に対してTm以下の約20〜27℃に等
しい条件下にハイブリッド形成され、かつCD2、即ちＴ
−リンパ球の表面のレセプターへ結合するポリペプチド
に対して発現にコード付けするDNA配列；及び （ｃ） 前記DNA配列のいずれかにより発現に対してこ
れにコード付けされたポリペプチドに対して発現にコー
ド付けするDNA配列 から成る群から選択される。
好適には、本発明のDNA配列は、第３図のアミノ酸１
〜222（追加Ｎ−末端メチオニンを有する又は有しな
い）又はこれらの一部に対して示される配列を有するポ
リペプチドに対してコード付けする。更に好適には、本
発明に対するDNA配列は、より小さいタンパク質の製造
を可能にする為に、疎水性トランスメンブラン部分に対
してコード付けするこれらの部分を、それから、例え
ば、約662〜715ヌクレオチドから除去する為に、第３図
のもの（アミノ酸１〜222）に比較して修飾されるだろ
う。最も好適には、本発明のDNA配列は、可溶性タンパ
ク質又はCD2に結合するペプチド、Ｔ−リンパ球の表面
のレセプターに対してコード付けする。更に好適には、
本発明のLFA−３と誘導体は、Ｔ−リンパ球の表面のCD2
に結合する。最も好適には、これらはまた、Ｔ−リンパ
球と標的細胞の間の粘着を防止する。
本発明のDNA配列はまた、LFA−３又はこの誘導体の製
造に有用であり、これらは、これらにより、これらのDN
A配列で変換される単細胞宿主において、発現にコード
付けされる。この分野で周知のように、本発明のDNA配
列の発現に対して、DNA配列は、適切な発現ベクターに
おいて発現制御配列に作用的に結合され、かつ適切な単
細胞宿主を変換する為にこの発明ベクター中にて利用さ
れるべきである。
本発明のDNA配列の発現制御配列に対するこのような
作用的結合は、DNA配列の上流の正しい読取り枠におけ
る翻訳開始信号の提供を含有する。若し発現されるべき
本発明の特別なDNA配列が、例えば、フェニルアラニン
で開始する成熟LFA−３のようにメチオニンで開始され
ないならば、開始信号は別のアミノ酸において起こり−
−メチオニン−−生成物のＮ−末端に位置される。一
方、このようなメチオニル−含有−生成物は、本発明の
組成物と方法に直接に利用されて良いが、使用する前に
メチオニンを除去するのが一般的により望ましい。この
ようなＮ−末端メチオニンをメチオニンで発現されるポ
リペプチドから除去する方法は、技術分野において得ら
れる。例えば、幾らかの宿主と発酵条件により生体内の
Ｎ−末端メチオニンの実質的に総てを除去出来る。他の
宿主は、試験管内においてＮ−末端メチオニンの除去を
必要とする。しかし、このような生体内の及び試験管内
の方法は、この技術分野において周知である。
高範囲の各種宿主／発現ベクター組替えは、本発明の
DNA配列を発現するのに利用される。有用な発現ベクタ
ーは、例えば、染色体の、非染色体の及び合成のDNA配
列の断片から成り、このようなDNA配列は、SV40の各種
誘導体及び公知細菌プラスミド、例えば、co1 E1、pCR
1、pBR322、pMB9及びこれらの誘導体を含む大腸菌から
のプラスミド、高範囲の宿主領域プラスミド、例えば、
RP4、ファージDNAs、例えばファージλの多くの誘導
体、例えば、NM989、及び他のDNAファージ、例えば、M1
3及び繊維状一本鎖DNAファージ、２μプラスミド又はそ
の誘導体のような酵母プラスミド、及びファージDNA又
は他の発現制御配列を利用する為に修飾されたプラスミ
ドのようなファージDNAsである。動物細胞発現に対し
て、発明者等は、好んでプラスミドBG312、アデノウイ
ルス２の主後期プロモーターを含むプラスミドを使用す
る。
更に、どの高範囲の各種発現制御配列−−DNA配列に
作用的に結合する時にこのDNA配列の発現を制御する配
列−−これは本発明のDNA配列を発現する為に、これら
のベクターに使用して良い。このような有用な発現制御
配列は、例えば、SV40又はアデノウイルスの初期と後期
のプロモーター、lacシステム、trpシステム、TAC又はT
RCシステム、ファージλの主オペレーター及びウロモー
ター領域、fdコートタンパク質の制御領域、３−ホスホ
グリセリン酸キナーゼ又は他のグルコース分解酵素の為
のプロモーター、酸ホスファターゼ、例えば、Pho5のプ
ロモーター、イーストα−交配因子のプロモーター、及
び原核細胞又は真核細胞又はこれらの誘導体の遺伝子の
発現を制御するのに公知な他の配列、及び各種のこれら
の配合物を包含する。動物細胞発現に対して、発明者等
は、好んでアデノウイルス２の主後期のプロモーターか
ら誘導した発現制御配列を使用する。
高範囲の各種単細胞宿主細胞も、本発明のDNA配列を
発現するのに有用である。これらの宿主は、大腸菌、シ
ュードモナス、バシラス、ストレプトミセスの菌株、イ
ーストのような真菌、及びCHO及びマウス細胞のような
動物細胞、COS1、COS7、BSC1、BSC40及びBMT10のような
アフリカミドリサル細胞、及びヒト細胞及び組織培養の
植物細胞のような周知の原核細胞と真核細胞宿主を包含
する。動物細胞発現に対して、発明者等はマウスＬ−細
胞を好む。
勿論、総てのベクター及び発現制御配列が、本発明の
DNA配列を発現するのに充分に等しく作用するとは限ら
ないことを理解すべきである。また総ての宿主も、同じ
発現システムで充分に等しく作用しないであろう。しか
し、当業者は、不適切な実験をすることも無く、かつ本
発明の範囲から離間すること無く、これらベクター、発
現制御配列及び宿主の間で選択をすることが出来る。例
えば、ベクターを選択する際に、宿主は、ベクターがそ
の中に複製しなければならないことを考慮されねばなら
ない。ベクターのコピー番号、このコピー番号を制御す
る能力、及び抗生物質マーカーのようなベクターにより
暗号化されるどの他のタンパク質もまた考慮されなけれ
ばならない。
発現制御配列を選択する際に、各種の因子もまた考慮
されなければならない。これらは、例えば、システムの
相対的強さ、その制御受け易さ、及び本発明の、特に電
位二次構造に関して特別なDNA配列との適合性を含む。
単細胞宿主は、選択されたベクターとの適合性、宿主に
対して本発明のDNA配列により発現にコードされた生成
物の毒性、宿主の分泌特性、タンパク質を正確に折り畳
む宿主の能力、宿主の発酵要件、及び本発明のDNA配列
により発現にコード付けされた生成物の精製の容易さを
考慮することにより選択されなければならない。
これらのパラメーター内で、当業者は、発酵によって
又は大規模の動物細胞、例えば、マウスＬ細胞培養にお
いて、本発明のDNA配列を発現するであろう各種ベクタ
ー／発現制御システム／宿主の組合せを選択して良い。
本発明のDNA配列の発現により製造されたポリペプチ
ドは、発酵又は動物細胞培養から単離され、かつこの技
術分野で周知の各種方法で精製されて良い。このような
単離と精製技術は、各種因子、生成物がいかにして製造
されるか、それが可溶性か不溶性かどうか、及びそれら
が細胞から分泌されるか又は細胞を破壊することにより
単離しなければならないかどうかのような因子に左右さ
れる。しかし、当業者は、本発明の範囲から離間するこ
となく、適切な単離と精製技術を選択して良い。
本発明のDNA配列、例えば、met−LFA−３（第３図の
アミノ酸１−222）又はLFA−３（第３図のアミノ酸１−
222）、これらの好適なより小さく疎水性でない誘導
体、又は更に好適なこれらの可溶性誘導体の発現により
製造されるポリペプチドは、本質的にヒト起源の他のタ
ンパク質を含まず、かつＢ型肝炎ウイルスとエイズウイ
ルスのようなウイルスにより汚染されていない。
これらのポリペプチドは、免疫応答を遮断し又は増大
する組成物と方法に有用である。例えば、本発明のポリ
ペプチドは、標的細胞とのこれらの相互作用を妨げるこ
とにより細胞溶解Ｔ−リンパ球活性を防止するのに活性
である。これらは、ヘルパーＴ−細胞と抗原−提示細胞
の相互作用を妨げる為に、免疫応答に対して同じ効果を
有する。更に、本発明の化合物は、溶菌と免疫抑制の為
の標的特異Ｔ細胞に、又はリンホカインのような分娩薬
に、特異的に標的とするＴ−細胞に使用して良い。更に
好適には、本発明のポリペプチドの可溶性誘導体は、Ｔ
−リンパ球のCD2部位を飽和するのに利用して良く、か
くしてＴ−細胞活性化を防止する。この効果は、移植片
対宿主疾患において、自己免疫疾患、例えば、慢性関節
リウマチにおいて、及び同種異系移植拒絶反応の防止に
おいて明白に大きな有用性がある。更に、本発明のポリ
ペプチドは、これが、ヒト以外の種に起こる抗体である
よりも、ヒトにおける免疫応答を惹起しそうも無い為
に、LFA−３又はCD2に対するモノクロナール抗体以上に
好まれる。本発明の治療組成物は、このようなポリペプ
チドの免疫抑制又は促進に有効量、及び薬学的に受け入
れ可能な担体から代表的に成る。本発明の治療方法は、
これらの組成物により薬学的に受け入れ可能な方法にお
いて患者を治療する段階から成る。
これらの治療に使用する為の本発明の組成物は、各種
形態を取る。これらは、例えば、錠剤、丸剤、粉末、液
体溶液又は分散体、リボソーム、座薬、注射可能な溶
液、熔融可能な溶液のような固体、半固体、及び液体供
与形態を含む。好適な形態は、投与の意図するモード及
び治療的適用に左右される。組成物はまた、好適には、
当業者に公知の従来の薬学的に受け入れ可能な担体と補
助剤を含む。好適には、本発明の組成物は、ユニット用
量の形態であり、かつ普通一日一回又はそれ以上、患者
に投与されるだろう。
一般的に、本発明の治療的組成物は、他の薬学的に重
要なポリペプチド（例えば、α−インターフェロン）に
対して使用されるものと同じ方法と組成物を使用して配
合されかつ投与されて良い。従って、ポリペプチドは、
凍結乾燥形態で貯蔵され、投与直前に殺菌水で戻し、か
つ非経口投与、皮下、静脈内又は病巣内の経路のような
普通の投与経路により投与される。
本発明のポリペプチド又はこれらに対する抗体はま
た、診断組成物と方法にも有用であって、Ｔ−細胞サブ
セット又はCD2＋細胞を検出し、又は自己免疫疾患、移
植片対宿主疾患及び同種異系移植拒絶のような過剰又は
激減Ｔ−細胞を特徴とする疾患の過程をモニターする。
最後に、本発明のポリペプチド又はこれらに対する抗
体は、Ｂ及びＴ細胞を分離するのに有用である。例え
ば、固体担体に結合する時に、本発明のポリペプチド又
はこれらに対する抗体は、ＢとＴ細胞を分離するだろ
う。
本発明がより良く理解される為に、次の実施例を説明
する。これらの実施例は、説明の目的のみのものであ
り、従って、如何なる方法においても、本発明の範囲を
制限するものとして解釈されるべきでない。
実施例 ヒトLFA−３の精製と配列形成： 発明者等は、ヒトLFA−３を精製し、それをダスティ
ン等、前記の方法を改良した方法を使用して、使用期間
を過ぎたヒト赤血球（アメリカ赤十字、ニードマン、マ
サチューセッッから入手）からトリプシン断片を生成
し、かつ第１図に示される部分アミノ酸配列を決定する
のに利用した。
発明者等は、（NH4）2SO4沈澱によるハイブリドーマ
培養とタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー
とによるハイブリドーマ培養上清からモノクロナール抗
体（MAb）TS2/9（サンチェズ−マドリード等、前記）を
精製した。次いで発明者等は、この精製MAbを使用して
次の精製に使用する為の親和性カラムを調製した。
本発明者等は、カトレカサスの方法［マーチ等、Ana
l.Biochem.（アナリティカル バイオケミストリー）第
60巻、第149頁（1974）］の方法の改良によりセファロ
ーズCL−4Bに対して精製MAbを結合した。発明者等は、
洗浄セファローズCL−4B（ファルマシア、ウプサラ、ス
エーデン）を1MNa2CO3中の40mg/ml CNBrで氷上10分間活
性化し、次いでそれを蒸留水と0.1mM HClで洗浄した。
発明者等は、活性化セファローズを濾過して湿ったケー
キとし、次いでそれを0.05M NaClと0.1M NaHCO3（ph8.
4）中の２−4mg/ml IgG（LFA−3 MAb又はマウスIgG）と
共に洗浄抗対溶液へ添加した。次いで発明者等は、この
分散体を回転しながら20時間混合し、次いでエタノール
アミン50mMの添加と１時間の温置により残留反応性基を
封鎖した。発明者等は、280nmにおいて吸光度を測定す
ることにより未結合抗体に対して上清を検査した。結合
は普通90％のオーダーであった。次いで発明者等は、カ
ラム中にMAb−結合セファローズを注ぎ、次いで親和ク
ロマトグラフィーに対して使用する前に、それを１サイ
クルのpH11とpH3緩衝液（下記参照）で洗浄した。
発明者等は、前記の親和クロマトグラフィー（ダスチ
ン等、前記）によりトリトンＸ−100で可溶化した後LFA
−３を精製した。発明者等は、総ての段階を４℃で実施
した。
発明者等は、使用期間を過ぎたヒト赤血球をアメリカ
赤十字（ニードマン、マサチューセッッ）から得た。発
明者等は、２ユニットの全血液からの細胞をPBS（pH7.
2）で３回洗浄した。次いで発明者等は、充填細胞を約5
00mlまで沈澱物とし、次いで撹拌しながら赤血球へ２％
トリトンＸ−100、1mMフェニールメチルスルホニルフロ
ライド、5mMヨードアセトアミド及び0.2トリプシン阻害
剤ユニット/mlアプロチニンを添加した。１時間後、発
明者等は、溶解物を150,000gで２時間遠心分離した。次
いで発明物等は、透明溶解液を流速20ml/hで２つのカラ
ムに順次に通した：（１）幾らかの不純物を吸着しかつ
どの粒状物も濾過する為にマうすIgG−セファローズ
カラム（2mg/mlで2ml）、及び（２）LFA−3 MAB−セフ
ァローズ カラム（2mg/mlで５−10ml）。発明者等は、
LFA−3 MAB−セファローズ カラムを、５カラム容量の
50mM燐酸ナトリウム（pH7.2）、0.25M NaCl、0.1％トリ
トンＸ−100、次いで５カラム容量の20mMトリエチルア
ミン（pH11）、0.25M NaCl、0.1％トリトンＸ−100及び
再び２カラム容量のpH7.2の緩衝溶液で、総て1ml/分の
流速で洗浄した。次いで発明者等は、残留LFA−３を５
カラム容量の50mMグリシンHCl（pH3）、0.25M NaCl、0.
1％トリトンＸ−100で20ml/時間の流速にて溶出した。
発明者等は、溶出LFA−３を1Mトリス−HCl（pH8.6）、
0.1％トリトンＸ−100中に集めることにより中和した。
本発明者等が、LFA−３を溶出する為にオクチル−β
−Ｄ−グルコピラノサイド（OG）（カルビオケミー）を
使用した時に、総ての段階は、高pH洗浄の後まで同じで
あった。この時点で、発明者等は、カラムを５倍量の燐
酸塩緩衝液（pH7.2）、１％OGを含む0.15M NaCl、で洗
浄し、次いでグリシン緩衝液（pH3）、0.15M NaCl、１
％OGを使用してLFA−３を溶出した。溶出プロフィル
は、トリトンＸ−100で得たものと同じであった。発明
者等は、続いてこのLFA−３を125−LFA−3 MAbで「ドッ
ト ブロート」検定法［ハウケス等、Anal.Biochem．
（アナリティカル バイオケミストリー）第119巻、第1
42頁、（1982）］を使用して半定量的方法で精製した。
トリプシン消化とアミン酸配列決定に対して精製LFA
−３を調製する為に、発明者等は、Ｎ−グリコシダーゼ
Ｆを使用して、供給者（ゲンザイム、ボストン マサチ
ューセッッ）の指示に従って、僅かに改良した方法で脱
グリコシレートした。先ず発明者等は、エタノール沈澱
（トリトンＸ−100）又は限外濾過（OG）によりデター
ジェントからLFA−３を分離した。次いで発明者等は、L
FA−３を25μの0.5％SDS、0.2M 2−メルカプトエタノ
ールと共に５分間沸騰することにより変性した。次いで
発明者等は、変性LFA−３を、最終容量50μにおい
て、３％トリトンＸ−100と10mMの1,10−フエナントレ
ロンを含む50mMトリス−HCl（pH8.6）中の5U/nモルのＮ
−グルカナーゼと37℃で20時間処理し、次いでエタノー
ル中の脱グリコシレートしたLFA−３（NG−LFA−３）を
沈澱させた（５容量の100％エタノール中−20℃で一
晩）。
発明者等は、調製用SDS−PAGEと電気泳動溶出によりL
FA−３（25Kd）を処理して高度に精製したＮ−グルカナ
ーゼを調製した。発明者等は、アルゴン下100℃で５分
間、Ｎ−グルカナーゼ−処理LFA−３（約350pモル）を2
50mMのｎ−エチルモロホリンアセテート中の5mMDDT、1m
MEDTA、0.2％SDS（pH8.25）で還元し、次いでそれを暗
所で23℃にて30分間、11mMヨード酢酸ナトリウムでアル
キル化した。発明者等は、生成物（CM−NG−LFA−３）
を、0.2％SDS、250mM N−エチルモルホリンアセテート
（pH8.25）で平衡させたセファデックスＧ−25Mでゲル
濾過することにより脱塩し、それを凍結嵌挿した。次い
で発明者等は、凍結乾燥したLM−NG−LFA−３を10mlの
無水エタノールに分散し、−20℃で７日間貯蔵し、LFA
−３を４℃で30分間6000xgにて遠心分離することにより
戻した。発明者等は、沈澱物を400μの0.1MNH4HCO3中
に溶解し、次いでそれをペピンスキー等、JBC（ジヤー
ナル バイオロジカル ケミストリー）第261巻、第423
9頁、（1986）に記載のようにしてTPCK−トリプシン（1
5％w/w）で消化した。発明者等は、消化物を蟻酸で最終
蟻酸濃度20％まで酸性とし、直ぐに狭い口径C8カラム
（アクアポーレRP300、0.21×10cm、ブラウンリー フ
ァブス）で逆相高圧液体クロマトグラフィーにより断片
を分画した。発明者等は、得られたペプチドを、流速0.
3ml/分（0.5分の分画を収集）で0.1％トリ弗素酢酸中の
アセトニトリル（０−75％）勾配で溶出した。発明者等
は、214nmと280nmの両方でカラム溶出物をモニターし
た。
発明者等は、各々の無傷LFA−３（300pモル）、NG LF
A−３（50pモル）及びCM−NG LFA−３（５−50pモル）
のトリプシンの断片を、ポリブレンの存在下らアプライ
ド バイオシステムズ470Aガス相シークエンサーを使用
する自動エドマン分解［ヘビック等、JBC、（ジャーナ
ル バイオロジカル ケミストリー）第256巻、第7990
頁、（1981）］に付した。発明者等は、アプライド バ
イオシステムズ120A PTH分析機を使用するオンラインで
PTH−アミノ酸を同定した。無傷タンパク質の配列決定
は、第１図に示すように38個のアミノ酸の配列を与え
た。
オリゴヌクレオチド プローブの合成 本発明者等は、最少核酸縮重により特徴ずけられるLF
A−３のアミノ酸末端配列（第１図の下線部参照）から
の領域に対してコード付けする非転写オリゴヌクレオチ
ドDNAプローブの２つのプールを、アプライド バイオ
システムズ30A DNA合成機により化学的に合成した。各
々の選択したアミノ酸配列に対して、発明者等は、総て
の可能なコドンへ相補のプローブのプールを合成した。
発明者等は、mRNAのみならずDNAの対応配列へこれらの
ハイブリツド形成を可能にする非転写プローブを合成し
た。本発明者等は、［γ−32P］−ATPとポリヌクレオチ
ド キナーゼ［マックスマとギルバート、Proc.Natl.Ac
ad.Sci．（プロシーデイング ナチュラル アカデミー
サイエンス）第74巻、第560頁（1977）］を使用して
発明者等のオリゴヌクレオチドプローブに標識した。
第２図に示すように、オリゴヌクレオチドプールLF1
は、32−ホールド縮重を有する20−マーであった。プロ
ーブプールLF2−５は、384−ホールド縮重を有する20−
マーであった。しかし、その縮重を縮小する為に、発明
者等は、Glyに対する縮重したコドンを各々のサブプー
ルに対してその４つの可能なヌクレオチドの一つに開裂
することにより、96−ホールド縮重の４個のサブプール
の各々の中にこのプールを合成した。次に発明者等は、
前記したように、ヒト扁桃mRNAを含有するノーザン ブ
ロット法に対して［ウオルナー等、Nature（ネイチャ
ー）、第320巻、第77−81頁（1986）］、各々のサブプ
ールのハイブリツド形成により、不正確な配列を含む３
個のプールから正確な配列を含むサブプールを選択し
た。ヒト無傷RNA中の1300ヌクレオチド転写に対してハ
イブリツド形成されたオリゴヌクレオチドプローブサブ
プールLF2は、正確な配列を含んだことを暗示した。従
って、発明者等は、発明者等の各種ライブラリーをスク
リーニングする為に、それとプールLF1を使用した。
λgt10末梢血液リンパ球cDNAライブラリーの構成 発明者等の末梢血液リンパ球（PBL）DNAライブラリー
を調製する為に、発明者等は、単球を除去する一巡の吸
収を介して白血球泳動＃９によりPBLを操作した。次い
で発明者等は、非粘着細胞をIFN−γ1000U/mlと10μg/m
lPHAで24時間刺激した。発明者等は、フェノール抽出を
使用してこれらの細胞からRNAを単離し［マニアティス
等、分子クローン化、第187頁（コールト スプリング
ハーバー ラボラトリー）（1982）］次いで一巡のオ
リゴdTセルローズ クロマトグラフィーによりポリA+mR
NAを調製した。発明者等は、このRNAをエタノール沈澱
し、それを高速真空乾燥し、次いでこのRANを10μH2O
（0.5μg/μ）中に再分散した。発明者等は、CH3HgOH
（5mM最終濃度）及びβ−メルカプトエタノール（0.5μ
g/μ）中で室温にて10分間処理した。次いで発明者等
は、メチル水銀処理したRNAを、43℃で0.1Mトリス−HCl
（pH8.3）、0.01M DTT、2mMバナジル複合体、５μｇオ
リゴdT12-18′20mMKCl、1mMdCTP、dGTP、dTTP、0.5mM d
ATP、20mM KCl、1mM dCTP、dGTP、dTTP、0.5mM dATP、
総容量50μ中の２μCi［α−32P］dATP及び30U1.5μ
AMV逆転写酵素（セイカガク アメリカ）へ添加し
た。発明者等は、混合物を３分間室温にて、次いで３時
間44℃にて培養し、次いで0.5M EDTAの2.5μを添加す
ることにより反応を停止させた。
発明者等は、反応混合物を等容量のフェノール：クロ
ロホルム（1:1）で抽出し、水溶液層を0.2容量の10M NH
4Acと2.5容量のEtOHで２回沈澱させ、次いで真空下に乾
燥した。cDNAの収率は1.5μｇであった。
発明者等は、合成中にDNAポリメラーゼＩ大型断片を
使用した以外は、オカヤマとベルグ［Mol.Cell.Biol．
（モレキュラ セルラー バイオロジカル）第２巻、第
161頁、（1982）及びグブラーとホフマン（遺伝子、第2
5巻、第263頁、（1983）］の方法に従って第２鎖を合成
した。
発明者等は、80μTA緩衝液［0.033Mトリスアセテー
ト（pH7.8）;0.066M酢酸カリ;0.01M酢酸マグネシウム;
0.001M DTT;50μg/mlBSA］、５μg RナーゼＡ、４ユニ
ットのＲナーゼＨ、50μM βNAD、８ユニットの大腸菌
リガーゼ、0.3125mMdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、12ユ
ニットのT4ポリメラーゼ中にDNAを再分散し、次いで1/2
0容量の0.5MEDTAを添加して37℃で90分間反応混合物を
培養することにより日本鎖cDNAを平滑末端とし、次いで
フェノール：クロロホルムで抽出した。発明者等は、0.
01Mトリス−HCl（pH7.5）、0.1M NaCl、0.001M EDTA中
のG150セファデックス カラムで水溶液相をクロマトグ
ラフし、次いで二本鎖cDNAを含む先行ピークを収集し、
これをエタノール沈澱させた。収率:605μgcDNA。
発明者等は、標準方法を使用して、二本鎖cDNAをリン
カー35/36に結合した。
次いで発明者等は、S500セフアクリル カラムで800b
P用のcDNAとより長い断片に大きさ分別し、それをECoR
I培養λgt10に結合した。発明者等は、製造者の協定付
随書に従ってギガパク（計画遺伝子）中に結合反応物の
一定量を充填した。発明者等は、充填ファージを使用し
て、大腸菌BNN102細胞を感染させ、次いで増幅の為に細
胞を塗布した。得られたライブラリーは、1.125×106の
独立組換え体を含んでいた。
ライブラリーのスクリーニング 発明者等は、ヒト扁桃λgt10cDNAライブラリー［ウォ
ング等、Proc.Natl.Acad.Sci．（プロシーディング ナ
チュール アカデミー サイエンス）、第82巻、第7711
−775頁、（1985）］、及びベントンとディビス［Scien
ce、（サイエンス）、第196巻、第180頁、（1977）］の
プラーク ハイブリッド形成スクリーンニング技術を使
用して、上記調製したPBL cNNAライブラリーをスクリー
ンした。
発明物等は、Ｌ培養液と0.2％マルトース中で、BNN10
2細胞の一晩培養物をペレットとし、それを等容量のSM
緩衝液［50mMトリス−HCl（pH7.5）、100mM NaCl、10mM
MgSO4、及び0.01％ゼラチン］中で再分散した。続い
て、発明者等は、9mlの細胞を、室温で15分間1.5×106
のファージ粒子で予備吸収し、これらを30LB MGプレー
トに塗布した。
37℃で８時間培養した後、発明者等は、プレートから
フィルターを引き上げ、これらを0.5N NaOH/1.5M NaCl
のプールに５分間置くことにより溶解し、次いでこれら
を同じ緩衝液中に５分間浸漬した。発明者等は、これら
を0.5Mトリス−HCl（pH7.4）、1.5M NaCl中に、５分間
づつ２回浸漬することによりフィルターを中和し、これ
らを1M NH4OAc中で２分間洗浄し、次いでフィルターを
乾燥し、次にこれらを80℃で２時間ベークした。
発明者等は、0.2％ポリビニルピロリドン、0.2％フィ
コル（MW400,000）、0.2％牛血清アルブミン、0.05Mト
リス−HCl（pH7.5）、1M塩化ナトリウム、0.1％ピロ燐
酸ナトリウム、１％ SDS、10％硫酸デキストラン（MW50
0,000）及び100μg/ml tRNA中で、オリゴヌクレオチド
プローブLFIに対してフィルターに予備ハイブリッド
形成及びハイブリッド形成した。発明者等は、オートラ
ジオグラフィーによりハイブリッド形成するλ−cDNA配
列を検出した。
発明者等は、PBLライブラリーから26正ファージをか
つ扁桃ライブラリーから12正ファージを始めに選択し
た。次いで発明者等は、これらのクローンと、同じプロ
ーブを使用して低い密度でこれらを精製したプローブを
再スクリーンした。
発明者等は、こりらクローンから単離したDNAをEcoR
Iで消化し、次いでこれらをサザン ブロート技術［E.
M.サザン、J.Mol.Biol．（ジャーナル モレキュラ バ
イオロジー）第98巻、第503−18頁（1975）］を使用し
てオリゴマー プローブLF1及びLF2に対してこれらにハ
イブリッド形成した。次いで発明者等は、更に扁桃ライ
ブラリーの２つのクローン（λHT16とλHT12）からのDN
AとPBLライブラリーからの２つのクローン（λP26とλP
24）からのDNAをDNA配列決定分析により性質を調べた。
cDNAクローンの配列決定 発明者等は、配列分析を促進する為に、クローンλHT
16とλP26からのEcoR I消化したDNAを、pNN01中にサブ
クローン化した。＊λHT16は、２EcoR I断片を有してお
り、発明者等は、プラスミドpHT16HとpHT16Lに終わるpN
N01中に前記断片をサブクローン化した。λP26の総ての
挿入断片は、単一Not I断片上に含まれている。サブク
ローン化の為に、本発明者等は、普通に使用される技術
を使用してベクターのEcoR I部位又はSma I部位を使用
した。＊ 発明者等は、制限消化により合成ポリリンカーpUC8
を除去し、かつそれを新しい合成断片で置換することに
より配列決定プラスミドpNN01を構成した。pUCプラスミ
ドに共通な2.5kb背骨は、複製開始点を付与し、かつア
ンピシリン抵抗性を与えるものであるが、変化なかっ
た。pNN01の新規な合成部分は第４図に示されている。
発明者等は、マックサムとギルバートの方法［Meth.E
nzymology、（酵素学方法）1980］により発明者等のサ
ブクローンのDNA配列を大部分決定した。しかし、幾つ
かの断片に対して、発明者等は、チャーチとギルバート
の関連方法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA（プロシーディン
グ ナチュラル アカデミー サイエンス米国）第81
巻、第1991頁、（1984）］を使用した。pNN01の構成
は、Not I消化と４つの20−ヌクレオチド長プローブ:NN
−A,NN−B,NN−C,及びNN−Ｄを使用する挿入した断片の
末端の配列決定をチャーチ−ギルバート研究法により可
能にする。第５図参照のこと。
２つの重要な配列決定の結果が、チャーチ−ギルバー
ト方法により発明者等のサブクローンからえられた。一
つの実験において、発明者等は、224bp EcoR I断片を結
合するEcoR I部位を越えて配列を決定する為に、LF10と
LF11（第５図）に関係無くλHT16からPVu II消化DNAを
証明した。このことは、このファージの２つのEcoR Iサ
ブクローン（pHT16HとpHT16L）の分析は、小さいEcoR I
断片への５′又は２つのEcoR I断片の間の５′のいずれ
かの配列を見落としていた可能性を直接的に反論した。
発明者等はまた、このEcoR I部位を無傷に有するNot I
サブクローン形成したpP26の分析によりこの結果を確認
した。発明者等はまた、PVu IIでpP26を消化し、かつハ
イブリッド形成プローブとしてLF10（第５図）を使用す
るチャーチ−ギルバート方法により断片の配列を決定し
た。このことは、挿入断片の５′末端はλHT16の５′末
端と全く同じであったことを証明した。
第３図は、ファージλHT16のcDNA挿入断片のDNA配列
を示している。これはまた、LFA−３に対してコード付
けするDNA配列とこれから推定したアミノ酸配列を表し
ている。この後者のcDNA、例えばLFA−３に対してコー
ド付けするものは、発明者等が、Ｎ−末端領域とヒト赤
血球から精製したLFA−３の４トリプシン断片に対して
決定したアミノ酸配列に対して、コード付けするDNA配
列を含んだ。
CHO細胞中にLFA−3 HT16 cDNAの発現 下記p24HT16LFA3＃８の960bp Nco I−Mae I断片を、B
G8発現ベクターを与える為に、BG312発現ベクターのSma
I部位中に挿入する。ベクターBG8は、イン ビトロ
インターナショナル カルチャー コレクション、611
P.ハモンドス フェリーRd.、リンチカム、マリーラン
ド、21090 5月24日、1988年で預けられており、かつ受
け入れ番号IVI−10170で譲渡されている。BG312［ケイ
ト等、Cell（細胞）、第45巻、第685頁、（1986）］に
おいて、挿入断片DNA配列の発現は、アデノウイルス２
後期プロモータの制御下にある。p24HT16LFA3＃８は、p
HT16の800bpEcoR I断片をプラスミド部分を含むp24の大
型EcoR I断片と結合することにより構成された。p24のE
coR I断片のDNA配列は、第３図の塩基対１−223のDNA配
列に一致する。安定なHT16−CHO細胞系を確立する為
に、発明者等は、１×107CHO（DHFR-）細胞［カジンと
ウルバン、Proc.Natl.Acad.Sci．（プロシーディング
ナチュラル アカデミイー サイエンス）、第77巻、第
4216頁（1980）］を、180λｇのXmn I線状化BG8 DNA、2
0λきのStu I線状化pAdD26 DNA［カウフマンとシャー
プ、Mol.Cell.Biol．（モレキュラー セル バイオロ
ジー）、第２巻、第1304頁、（1982）］、及び960μFD
に設定したキャパシタンスで0.29UVにてピオラド（リッ
チモンド、カルホルニア）遺伝子パルサーを使用して、
エレクトロポレーションによる200λｇの音波処理サケ
***DNAキャリアーと共に共移入した。次に発明者等
は、エレクトロポレーションしたCHO細胞を、３日間、
非選択性アルファ＋（改良イーグル培地（MEM）中に塗
布し、次に100mmプレート当たり１×105細胞の細胞密度
にて４日間アルファーMEM培地に変えた。次に細胞は、
アルファー−MEMプラス200nM、400nM又は600nMメトトレ
キセートのいずれか中にて成長させた。コロニーは、20
0nMメトトレキセート中で最も良く成長し、このコロニ
ーから、発明者等は、個々のコロニーを単離し、蛍光活
性化細胞ソーター（FACS）（ベクトン ディキンソン、
マウンティンビュー、カルホルニア）で間接的免疫蛍光
の強度を測定することによりLFA−３の発現に対して、
かつ下記のようにロゼティング（細胞粘着）に対して検
定する為に、100mmプレート当たり１×106細胞までこれ
らを成長させた。
FACSにより分析する為に、各HT16−CHOメトトレキセ
ート クローン当たり１×106細胞と制御CHO細胞は、４
℃で15分間、ハンクのBSS（スペルアウト）緩衝液、0.5
M EDTAと共に培養することにより、組織培養皿から除去
された。次に分離した細胞は、ペレットとされ、50μ
のPBN緩衝液（１×PBS、0.5％BSA、0.1％ナトリウムア
ジド）中に再分散し、45分間氷上で100μモノクロナ
ール抗体TS2/9（1.2mg/ml）（スム スプリンゲルの贈
り物）で培養した。次に発明者等は、1mlのPBN緩衝液で
２回細胞を洗浄し、遠心分離器でペレットとした。この
細胞ペレットを、PBN中の1:50希釈FCI［蛍光共役親和精
製Ｆ（ab′）２断片ヒツジ アンチマウスIgG（カペ
ル、バイオケミカル、ペンシルバニア）］の100μ中
に再分散し、次いで30分間氷上で培養した。細胞を遠心
分離器でペレットとし、過剰のFDIを細胞ペレットを、1
mlのPBN（スペルアウト）緩衝液中に２回再分散するこ
とにより除去した。次いで発明者等は、細胞を１×PBS8
00μ中に再分散し、次いでFACSにより蛍光強度を決定
した。５つのクローンが、対照CHO細胞とLFA−３発現に
関して均一細胞集団よりもより高い蛍光を示した。
次ぎに発明者等は、CHO細胞中に発現した組換えLFA−
３が、ロゼット形成分析によりCD2発現細胞に粘着出来
るかどうか試験した。発明者等は、対照CHO細胞と、ウ
エル当たり３×105細胞の細胞密度で６ウエル組織培養
プレートの9.6cm2ウエル中でLFA−３（HT16−CHO＃30）
を発現するCHO細胞とを増殖させた。プレートを、４℃
でソルバール遠心分離器中で２分間400rpmで回転した
た。細胞を２時間４℃で培養した後、細胞をPRMI1060メ
ディウムで洗浄して過剰のジュルカツト細胞を除去し
た。ジュルカツト細胞は、顕微鏡下に決定した時に、LF
A−３発現のHT16−CHO＃30細胞とロゼット形成した。
発明者等は、HT16−CHO＃30中のLFA−３の表面発現の
レベルをJY Bリンパ芽球的の細胞（チム スプリンゲル
の贈り物）の発現レベルと、2.5×106JY細胞、CHO細胞
及びHT16−CHO＃30細胞を使用して、前記したようにFAC
S分析を使用して両方の細胞系の相対的蛍光強度を比較
することにより比較した。HT16−CHO細胞は、JY細胞よ
り６培高い蛍光強度を示した。
R1.1細胞中にLFA−3 HT16 cDNAの発現 2.6×107R1.1細胞を、前記したような90μgNru I線状
化した発現ベクターBG8、10μg Nru I線状化したプラス
ミドpTCF DNA［F.グロスベルト等、Nucleic Acid Res．
（核酸レサーチ）、第10巻、第6715頁（1982）］、及び
前記したようにエレクトロポレーション（280ボルト、9
60μFD）により300μｇ音波処理したサケ***DNAと共に
共移入した。RPMI1060プラスlmg−ml G418中の移入細胞
を選択した後に、発明者等は、200μ RPMI 1060メデ
ィウム プラスlmg/ml G418を含む、96ウエル マイク
ロタイター プレート中、ウエル当たり103細胞まで希
釈することによりクローンを単離した。８つの耐性クロ
ーンを繁殖させ、前記したようにFACS分析によりLFA−
３表面発現に対して検定した。発明者等は、総ての８つ
のTH16−R1.1クローンが、R1.1対照より約25倍のレベル
でLFA−３を発現したが、しかし総てはLFA−３発現に関
して均一細胞集団を示したことを見いだした。
更に発明者等は、FACSの高い発現用の２つのクローン
−−＃13と＃15−−を選別した。各々のクローンの１×
106HT16−R1.1細胞を、PBN緩衝液（１×PBS、0.5％BS
A、0.1％ナトリウムアジド）中、氷上で45分間、100μ
TS2/9 Mabで培養した。細胞をペレットとした後に、
発明者等は、1ml PBN緩衝液中に再分散することによ
り、ペレットを２回洗浄し、次いで細胞ペレットを100
μの1:50希釈FCI中に再分散した。氷上に30分間置い
た後に、細胞を洗浄し、次いで800μ 1×PBS中に再分
散した。HT16−R1.1＃13と＃15の選別した均一集団中で
LFA−３の表面発現は、JY細胞のものの10％である。
次ぎに発明者等は、R1.1細胞中に発現したようなHT16
−cDNAからのLFA−３が、CD2 cDNA（L114）（キャサリ
ン ヘションの贈り物）を発現するＬ−細胞と、かつHT
16−CHOに対して前記したような同じ方法を使用するジ
ュルカット細胞（チム スプリンゲルの贈り物）とロゼ
ット形成することにより他の細胞へ粘着するかどうか試
験した。発明者等は、ロゼット形成を観察した。このロ
ゼット形成は、LFA−３（TS2/9）に対するMab、又はCD2
（TS2/18）（チム スプリンゲルの贈り物）に対するMa
bで防止され得た。このことは、LFA−３が、ジュルカッ
ト細胞上の天然に発現されたCD2レセプターと、又はマ
ウスＬ−細胞上に発現されたCD2と相互作用可能とする
配座中でR1.1細胞の細胞表面上に発現されることを示し
た。HT16−R1.1細胞又は未移入R1.1細胞は、未移入マウ
スＬ−細胞とロゼット形成せず、これらの細胞の相互作
用の特異性を示すものである。
Ｌ−細胞中にLFA−3 HT16 cDNAの発現 発明者等は、１×107L（tk-）細胞［C.P.テルホルス
ト、J.Immun．（ジョーナル イムノロジー）、第131
巻、第2032頁（1983）］を、前記90μきXmn I線状化BG8
プラスミドDNA、10μg Sca I線状化pOPFプラスミドDNA
（グロスベルト等、上記文献）（移入細胞を選別するの
に使用出来るチミジン キナーゼ担持プラスミド）、及
び前記エレクトロポレーションにより音波処理したサケ
***DNA300μｇと共に共移入した。細胞を洗浄し、次い
で100mmペトリー皿に移した後に、発明者等は、これら
を48−72時間、非選択的メディウム（DMEM）中で増殖さ
せた。次いで移入された細胞を、100mm皿当たり１×105
細胞の細胞密度で、DMEM＋ヒポキサンチン アミノプテ
リン チミジン（HAT）中で選択した。発明者等は、14
日後に13クローン発現するチミジンキナーゼを拾い上
げ、これらを100mmプレート当たり１×106まで引き伸ば
し、前記したようにFACS分析によりLFA−３発現に対し
て検定した。11個のHT16−Ｌクローンが、対照CHO細胞
より10〜20倍高い表面蛍光を示した。
発明者等はまた、蛍光顕微鏡下に直接に可視化された
免疫蛍光により、LFA−３表面発現に対してHT16−Ｌク
ローンを検定した。発明者等は、４つのクローン−−HT
16L ＃73,1,7,及び27−−が高度に蛍光性であり、LFA−
３発現の高度なレベルを示すことを見いだした。次ぎに
発明者等は、前記のようにFACS上の高い発現細胞に対す
る４つのクローン総てを分離したが、その理由は、これ
らクローンは、LFA−３発現の均一細胞集団を示したか
らである。HAT−DMEMメディウム中に選択された６つの
クローン−−HT16−L ＃1A,1B,1C,7,27,及び107−−
は、FACS分析によりLFA−３発現に対して検定された。
発明者等は、対照CHO細胞の蛍光強度より35倍高かった
クローンHT16−Ｌ−1C以外は、20〜30倍の蛍光強度を示
す総てのクローンを見いだした。
発明者等はまた、HT16 cDNAからのLFA−３が、Ｌ−細
胞中に発現された時に、R1.1細胞中に発現されたLFA−
３に対して上記同じロゼット形成の検定を使用して、他
の細胞に粘着するかどうか試験した。発明者等はロゼッ
ト形成を観察した。
大腸菌中にLFA−３の発現 大腸菌中にLFA−3 cDNAを発現する為に、発現ベクタ
ーpLFA3trclを構成した。このベクター（pKK233−２の
誘導体）は、成熟LFA−３タンパク質を発現する。シグ
ナル配列に対してコード付けするTH16 cDNA配列は、削
除された。pLFA3trclを構成する為に、プラスミドpKK23
3−２［E.アマンとJ.ブロフィウス、Gene、（遺伝
子）、第40巻、第183頁、（1985）］を制限酵素NcolとH
id IIIで消化し、かつpLFA3HT16の単離700塩基対Ava2/H
ind3の断片と２本鎖リンカーLF21−22へ結合した。この
リンカーは、HT16 cDNAの塩基対101〜175（Ava2部位
へ）の間の配列を置換する（第１表）。
発明者等は、得られた組換え発現ベクターでJA221細
胞を形質転換した。pLFA3trclで形質転換した大腸菌をO
D5501.0へ成長させ、続いて２時間1mM IPTGで誘導し、
かつ遠心分離器により細胞を収集した。細胞をLB中に再
分散し、当量の0.2OD550を除去した。次いで発明者等
は、遠心分離器によりペレットとし、この細胞ペレット
をSDS−ゲルを有する緩衝液50μ中に際分散し、次い
で３分間沸騰した。25μの試料を、電気泳動によりタ
ンパク質を分離する為に、SDS−変性ポリアクリルアミ
ドゲルに装填した。LFA−３を検出する為に、タンパク
質をニトロセルロース膜へ電気転移させ、続いて抗体の
ｈ−LFA−3,K64（チム スプリングゲルの贈り物）に対
する1:1000希釈で膜を培養した。発明者等は、抗−LFA
−３（K64）抗対は25kdタンパク質を検出した。形質転
換細胞がLFA−３を発現したことを示したことを観察し
た。
次ぎに細胞は、37℃でOD5500.1まで１ LB＋50μg/m
lアンピシリン中で増殖させた。LFA−３の発現は、２時
間2mM IPTGで誘導された。細胞は、30分間4000rpm/4℃
でペレツトとされた。発明者等は、このペレツトを、10
mlトリス緩衝液当たり1gm際ペレツト25mMトリス（pH7.
0）中に再分散し、細胞圧力12,000−14,000psiでフラン
ス プレッシャー セル プレス中に溶解させた。次ぎ
に膜分画を、４℃で30分間10,000rpmにてSS34ソルバー
ル中で遠心分離により可溶性タンパク質から分離した。
膜ペレツトを、25mMトリスpH7.0の1ml、μアリコート
の上清中に再分散させ、次ぎに膜ペレツトを、15％SDS
−変性PAG上で電気泳動させた。膜ペレツトをSDS緩衝液
に溶解し、タンパク質は、SDS−PAGE、汚染クーマシー
及びサブシークエントタンパク質の配列決定用のゲルか
ら切除されたLFA−３とにより分離された。発明者等の
アミノ酸配列決定は、MFSQQIYGVVYGNVT−LFA−３とFSQQ
IYGVVYGNVT−LFA−３としてＮ−末端配列を確認し、こ
れはヒト赤血球から精製したヒトLFA−３に対して決定
したＮ−末端配列に一致した［バルナー等、J.Exp.Me
d．（ジャーナル エクスピャリアンスメディスン）、
第166巻 第923頁（1987）］。従って、この構成により
製造した生成物は、メチオニンを有する又は有しないＮ
−末端を有する。
発明者等はまた、疎水性トランスメンブラン領域のタ
ンパク質をDNA配列から削除する為に、LFA−３を暗号化
するDNA配列を修飾して、可溶性形態のLFA−３の高いレ
ベルの発現を得た。発明者等は、第３図に表したように
トランスメンブラン領域を含むLFA−３に対してコード
付けするpHT16からの発明者等のLFA−3cDNAを使用し
た。
LFA−3M17欠失 50μｇのプラスミドpHT16LFA3 DNAを、37℃で１時間
制限酵素Scalの100ユニットで消化した。発明者等は、
１％アガロースゲル上電気泳動により未カットプラスミ
ドから線状化プラスミドを分離し、ゲルから切除し、電
気溶出した。他のアリコートの50μｇのpHT16LFA3プラ
スミドDNAを、100ユニットEcoR Iと100ユニットHind II
Iで37℃にて１時間消化して、このプラスミド中の大部
分のLFA−3 cDNA配列を切除した。次いでベクターを、
１％アガロースゲル上で電気泳動によりEcoRi/Hd III断
片から分離し、切除し、次いで電気溶出した。
発明者等は、欠失を導入する為に、オリゴヌクレオチ
ドLF17を使用した。これは、第３図に表したHT16cDNA配
列の塩基対632で開始する21ヌクレオチドと塩基対764位
置で開始する22ヌクレオチドに相当する43mer（第II表
に表す）である。
このオリゴヌクレオチドが、一本鎖HT16cDNAに対して
ハイブリッド形成される時に、これはHT16cDNAの111塩
基対の外にループ形成するだろう。電気溶出Scalの20p
モルとEcoR I/Hind III断片の20pモルは、燐酸化LF17の
20pモルと混合され、次いで、100mM NaCl、6mMトリス
（pH7.6）及び8mM MgCl2中で５分間90℃にて変性され、
37℃で１時間、４℃で１時間、次いで氷上で10分間培養
することにより再変性された。反応混合物の半分に、発
明者等は、0.5μ T4リガーゼ、1mM ATP、１μクレ
ノウ及び5mM NTPを添加し、次いで混合物を一晩15℃で
培養した。反応混合物の他の半分を、MC1061適格細胞中
に転移させた。欠失LFA−3 cDNAを含むコロニーを、次
のように、LF17にハイブリッド形成することにより同定
した。形質転移したMC1061コロニーを、ニトロセルロー
スフィルターに移し、溶解し次いでDNAを0.5N NaOHで処
理することにより変性した。ニトロセルロースフィルタ
ーは、一晩65℃で、１×105cpm/ml32P−キナーゼ オリ
ゴヌクレオチドLF17を含むPSB中でハイブリッド形成さ
せた。フィルターを0.1×SSC（0.015M塩化ナトリウム、
0.0015Mクエン酸ナトリウム）中で洗浄し、Ｘ−線フィ
ルムに露光させた。正コロニーを、拾い上げ次いで37℃
で増殖し、次いで溶解した。次いで発明者等は、DNAを
調製した［マニアティス等、“分子クローン化；実験室
マニュアル”コールド スプリング ハーバー（1982）
参照］。正確な欠失を証明する為に、DNAをEcoR IとHin
d IIIで消化した。４つのpLFA3M17コロニーが、正確な
制限パターンを有した。一つのクローンの正確なDNA配
列を、マクスマとギルバートの方法（前記文献）を使用
してDNA配列決定により確認した。
LFA−3M16 プラスミドpLFA3M16−２−4Hを、欠失を導入する為に
オリゴヌクレオチドLF16（第II表）を使用した以外は、
LFA−3M17に対して本質的に記載したようにして構成し
た。LF16は、21ヌクレオチドが塩基対632〜652（第３
図）に対して相同であり、かつ21ヌクレオチドがLF16 c
DNAの塩基対716〜736（第３図）に対して相同であると
ころの42mer（マー）である。オリゴヌクレオチドLF16
による変位誘発は、LFA−３の疎水性電位膜貫通領域に
対してコード付けする63塩基対配列を除去して、細胞質
の領域を無傷のままにされた。発明者等は、プラスミド
pLFA3M16を分離し、かつ上記のようにその正確な配列を
証明した。
LFA−3M23 プラスミドpLFA3M23をpLFA3M17に対して記載した方法
により構築した。変位誘発に対して使用したオリゴヌク
レオチドは、LF23（第II表）であって、その41マーは、
21ヌクレオチドが塩基対641〜661（第３図）に対して相
同であり、かつ20ヌクレオチドがHT16 cDNAの塩基対767
〜786（第３図）に対して相同であるところの41マーで
ある。LF23による変位誘発は、電位膜貫通領域及びHT16
−LFA−３の細胞質領域を除去した。
次ぎに発明者等は、総ての除去したLFA−3 cDNAsを、
選択標識を更に担持する発現ベクター中に挿入した。発
明者等は、組込み中にLFA−３遺伝子に近接する同じプ
ラスミド上に、選択標識を有することは、これら２つの
遺伝子の共組込みと、従って、これらの共選択を確実に
するであろうことを信じる。発明者等は、発現ベクター
pJOD−ｓを使用した。ベクターpJOD−ｓは、1988年５月
26日に、メリーランド州、リン チカムのイン ビトロ
インターナショナル インク．カルチャー コレクシ
ョンに預けられ、受け入れ番号IVI−10171が譲渡されて
いる。LFA−3M17、M16及びM23の構築の為に、pJOD−ｓ
ベクターを制限酵素Sal Iにより線状化し、クレノーに
より平滑−末端とし、クレノー−ブラント末端Not I断
片のpLFA3M17,pLFA3M16又はpLFA3M23により連結した。
次ぎに夫々の連結反応混合物を、MC1061中に形質転換
し、夫々のDNAを含むコロニーを、オリゴヌクレオチド
プローブ（第II表参照）、HT16 cDNAの塩基対20〜49
に相同の30マーへLF28 PSB中にて65℃でハイブリッド形
成することにより選択し、65℃で0.5×SSC（0.75M NaC
l、0.075M NaCl）にて洗浄した。正コロニーを拾い上
げ、LB−amp 50μg/ml中で一晩増殖させ、かくしてDNA
を調製した。挿入断片の正確な大きさは、制限酵素マッ
ピングにより証明された。pLFA3M17の４つのクローン、
pLFA3M16の３つのクローン及びpLFA3M23の一つのクロー
ンは、正確な制限酵素パターンを示した。DNAを、pLFA3
M17、pLFA3M16、及びpLFA3M23のクローンから調製し、
かつ正確なDNA配列を、マックスマとギルバートの方法
（上記文献）を使用してDNA配列決定により確認した。
安定なCHO細胞系を確立する為に、PVu Iで線状化され
たpLFA3M17の10μｇを、燐酸カルシウム法と前記エレク
トロポレーションによりCHO細胞中に移入した。同じ方
法を、pLFA3M16とpLFA3M23で安定CHO細胞系を確立する
為に使用した。
pLFA3M17で移入されたCHO細胞は、35Sメチオニンで代
謝標識化することにより可溶性LFA−３の分泌に対して
検定された。６ウエルプレートのウエル当たり５×105
細胞が、35Sメチオニンで18時間標識化され、かつ35S−
LFA−３をMab TS2/9で沈澱させた。発明者等は、M17/CH
OがLFA−３を分泌したことを観察した。このことは、よ
り高い発現を得る為に、M17/CHOはメトトレキセートの
高い濃度中で増幅されて、LFA−３遺伝子を増幅するの
が良いことが理解されるべきである。
上記の発明を更に可能にする為に、発明者等は、この
発明のLFA−3 DNA配列を担持する次のファージを、メリ
ーランド州、リンチカムのイン ヒドロ インターナシ
ョナル イミク．カルチャー コリクションに1987年５
月28日に預けた： λHT16［λgt10/LFA−３］ このファージは、受け入れ番号IVI 10133が付与され
た。
以上、発明者等は、本発明の多くの実施態様を提示し
てきたが、発明者等の基本的構成は、変更することによ
り本発明の方法と組成物を利用する他の実施態様を付与
出来ることは明らかである。従って、本発明の範囲は、
実施例により提示された特定の実施態様によるよりも、
添付される請求の範囲により規定されるべきことは理解
されるであろう。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (73)特許権者 999999999 ウォルナー，バーバラ ピー アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02139、ケンブリッジ、センター スト リート ７ (73)特許権者 999999999 スプリンガー，ティモシー エイ アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02167、ニュートン、モナドノック ロ ード 28 (73)特許権者 999999999 ヘッション，キャサリン アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02190、サウス ウェイマウス、６、フ ァンテイン レーン 96 (73)特許権者 999999999 ティザード，リチャード アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02139、ケンブリッジ、ナンバー デ ー‐３、ハーバード ストリート 334 (73)特許権者 999999999 マタリアノ，ロバート アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02158、ニュートン、イースト サイド パークウェイ 114 (73)特許権者 999999999 ダスティン，マイケル エル アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02215、ボストン、アパートメント 23、 パーク ドライブ 231 (72)発明者 ウォルナー，バーバラ ピー アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02139、ケンブリッジ、センター スト リート ７ (72)発明者 スプリンガー，ティモシー エイ アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02167、ニュートン、モナドノック ロ ード 28 (72)発明者 ヘッション，キャサリン アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02190、サウス ウェイマウス、６、フ ァンテイン レーン 96 (72)発明者 ティザード，リチャード アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02139、ケンブリッジ、ナンバー デ ー‐３、ハーバード ストリート 334 (72)発明者 マタリアノ，ロバート アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02158、ニュートン、イースト サイド パークウェイ 114 (72)発明者 ダスティン，マイケル エル アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02215、ボストン、アパートメント 23、 パーク ドライブ 231 (56)参考文献 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．165 （1987．３） Ｐ．677−692 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．79 （1982） Ｐ．7489−7493

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）ヌクレオチド配列： を有するファージλHT16中に担持されるDNA挿入物、 （ｂ）Tmより約20℃〜27℃低い温度と1M塩化ナトリウム
    溶液中とに相当する条件下で上記（ａ）のLFA−3DNA配
    列とハイブリッド形成し、かつＴリンパ球の表面にある
    レセプターCD2に結合するポリペプチドをコードするDNA
    配列、および （ｃ）上記（ａ）、（ｂ）のDNA配列のいずれかと縮重
    関係にあるDNA配列 より成る群から選択されるDNA配列。
  2. 【請求項２】前記（ｂ）のDNA配列が、Ｔリンパ球の表
    面のCD2に結合し且つＴリンパ球と標的細胞との間の結
    合を阻害するポリペプチドをコードする、請求項１記載
    のDNA配列。
  3. 【請求項３】前記ポリペプチドが可溶性である、請求項
    ２記載のDNA配列。
  4. 【請求項４】前記DNA配列が、 式： を有するDNA配列、 式： を有するDNA配列、 式： を有するDNA配列、 式： を有するDNA配列、 式： を有するDNA配列、 式： を有するDNA配列、 式： を有するDNA配列、 式： を有するDNA配列、 式： を有するDNA配列、および 上記DNA配列のいずれかと縮重関係にあるDNA配列 より成る群から選択される、請求項１記載のDNA配列。
  5. 【請求項５】前記DNA配列が、 式： を有するDNA配列、 式： を有するDNA配列、および 上記のDNA配列のいずれかと縮重関係にあるDNA配列 より成る群から選択される、請求項１記載のDNA配列。
  6. 【請求項６】組換DNA分子であって、分子中において発
    現制御配列に機能的に結合された請求項１乃至５のいず
    れかに記載のDNA配列から成る組換DNA分子。
  7. 【請求項７】前記発現制御配列が、SV40またはアデノウ
    ィルスの初期または後期プロモータ、lac系、trp系、TA
    C系、TRC系、ファージλの主オペレータおよびプロモー
    タ領域、fdコート蛋白の制御領域、３−ホスホグリセリ
    ン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモータ、酸ホス
    ファターゼのプロモータ、および酵母のα−接合因子の
    プロモータより成る群から選択される、請求項６記載の
    組換DNA分子。
  8. 【請求項８】BG8（ATCC68791,以前はIVI 10170）からな
    る群から選択される、請求項６記載の組換DNA分子。
  9. 【請求項９】組換DNA分子によって形質転換された単細
    胞宿主であって、前記組換DNA分子は、分子中において
    発現制御配列に機能的に結合された請求項１乃至５のい
    ずれかに記載のDNA配列から成る、単細胞宿主。
  10. 【請求項１０】大腸菌株、シュードモナス菌株、バチル
    ス菌株、ストレプトミセス菌株、真菌株、動物細胞株、
    植物細胞株、および組織培養のヒト細胞株より成る群か
    ら選択される、請求項９記載の宿主。
  11. 【請求項１１】動物細胞が、CHO、R1.1およびＬ−Ｍ（t
    K-）より成る群から選択される、請求項10記載の単細胞
    宿主。
  12. 【請求項１２】請求項１乃至５に記載のDNA配列より成
    る群から選択されるDNA配列によってコードされるポリ
    ペプチドであって、実質的にヒト由来の他の蛋白質を含
    有しないポリペプチド。
  13. 【請求項１３】前記ポリペプチドが、 式： のアミノ酸配列、 式： のアミノ酸配列、 式： のアミノ酸配列、 式： のアミノ酸配列、 式： のアミノ酸配列、 式： のアミノ酸配列、 式： のアミノ酸配列、 式： のアミノ酸配列、 式： のアミノ酸配列、および 式： のアミノ酸配列 より成る群から選択されるアミノ酸配列を有している、
    請求項12記載のポリペプチド。
  14. 【請求項１４】請求項９に記載の単細胞宿主を培養する
    ことから成るLFA−３ポリペプチドを製造する方法。
  15. 【請求項１５】形質転換された宿主が、CHO（BG8）、R
    1.1（BG8）およびＬ−Ｍ（tK-）（BG8）より成る群から
    選択され、ここでBG8は、寄託番号ATCC68791（以前はIV
    I 10170）で同定される、請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】免疫抑制または増強をもたらす薬学的組
    成物であって、請求項12または13に記載のポリペプチド
    より成る群から選択されるポリペプチドおよび薬学的に
    許容され得る担体からなることを特徴とする薬学的組成
    物。
  17. 【請求項１７】請求項16に記載の薬学的組成物を製造す
    る方法。
  18. 【請求項１８】in vitroにてＴ細胞サブセットのような
    CD2+細胞を検出する、或いはin vitroにてCD2+T細胞の
    過剰または枯渇によって特徴づけられる疾病の経過を監
    視するための診断用組成物であって、請求項12または13
    に記載のポリペプチドより成る群から選択される診断的
    に有効量のポリペプチドから成る診断用組成物。
  19. 【請求項１９】Ｔ細胞サブセットのようなCD2+細胞を検
    出する、或いはCD2+T細胞の過剰または枯渇によって特
    徴づけられる疾病の経過を監視するin vitroにおける方
    法であって、請求項18に記載の診断用組成物を使用する
    行程から成る、in vitroにおける方法。
  20. 【請求項２０】in vitroにてＴ細胞サブセットのような
    CD2+細胞を検出する、或いはin vitroにてCD2+T細胞の
    過剰または枯渇によって特徴づけられる疾病の経過を監
    視するための診断キットであって、請求項18に記載の診
    断用組成物から成る、診断キット。
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