JPS61268184A - 組換えプラスミド及び当該プラスミドによる形質転換株 - Google Patents
組換えプラスミド及び当該プラスミドによる形質転換株Info
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- JPS61268184A JPS61268184A JP60246917A JP24691785A JPS61268184A JP S61268184 A JPS61268184 A JP S61268184A JP 60246917 A JP60246917 A JP 60246917A JP 24691785 A JP24691785 A JP 24691785A JP S61268184 A JPS61268184 A JP S61268184A
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、組換えプラスミド及び当該プラスミドによる
形質転換株に関し、さらに詳しくは、生理活性物質をコ
ードする異種遺伝子を効率よく発現する組換えプラスミ
ド及び当該プラスミドによる形質転換株に関する。かく
して、本発明は遺伝子工学による生理活性物質の製造技
術分野において、極めて有用である。
形質転換株に関し、さらに詳しくは、生理活性物質をコ
ードする異種遺伝子を効率よく発現する組換えプラスミ
ド及び当該プラスミドによる形質転換株に関する。かく
して、本発明は遺伝子工学による生理活性物質の製造技
術分野において、極めて有用である。
酵母〔サン力ロマイセスセレビジア(Saccha−r
omyces cerevisiae))には、クリプ
テイク(cryll−tic)プラスミドである2−プ
ラスミド(6,318塩基対)が存在し、その全塩基配
列の決定は、すでになされている〔バートリー及びドネ
ルソン、ネーチャー、第286巻、第860頁、 19
80年(Hartleyand Donelson、
Nature 286.860.1980) ) 、そ
して、この2P、プラスミドを持つ酵母はCrt“株と
、また、これを欠く酵母はCir ”株と呼ばれている
。
omyces cerevisiae))には、クリプ
テイク(cryll−tic)プラスミドである2−プ
ラスミド(6,318塩基対)が存在し、その全塩基配
列の決定は、すでになされている〔バートリー及びドネ
ルソン、ネーチャー、第286巻、第860頁、 19
80年(Hartleyand Donelson、
Nature 286.860.1980) ) 、そ
して、この2P、プラスミドを持つ酵母はCrt“株と
、また、これを欠く酵母はCir ”株と呼ばれている
。
2 P@プラスミドのコピー数は、50〜100と言わ
れており、比較的効率の良いベクターになりうる。また
、2p*プラスミドには、少なくとも4つの遺伝子が存
在することが知られており、ブローチ(Broach)
らは、2P輸プラスミドがコードするベーカー(B
aker)遺伝子(以下、単にB遺伝子)およびチャー
リー(Charlie)遺伝子(以下、単にC遺伝子)
の産物(Rep 1及びRep 2 )が関与してプラ
スミドの複製をさかんにし、コピー数をあげることによ
りその安定性をよくしていると報告している〔セル、第
28巻、第203頁、 1982年(Cel+訃、 2
03.1982)) (セル、第34巻、第95頁、
1983年(Ce1l 34.95.1983) )
、また、菊池は、2P−プラスミドが細胞内で安定に
維持されるためには、Rep l及びRep 2のほか
に、安定分配に関与するSTB遺伝子が必要である旨を
報告している〔細胞、長、 L3L(1983))。さ
らにブローチらは、Rep遺伝子産物を欠くす工°株で
高いコピー数を持つプラスミドとして、全2Pgaプラ
スミドを含むpcV20. pCν21を報告している
〔エンザイモロジイー、第101巻、第307〜325
頁、 1983年(EnzymologyB■、 30
7−325.1983))。
れており、比較的効率の良いベクターになりうる。また
、2p*プラスミドには、少なくとも4つの遺伝子が存
在することが知られており、ブローチ(Broach)
らは、2P輸プラスミドがコードするベーカー(B
aker)遺伝子(以下、単にB遺伝子)およびチャー
リー(Charlie)遺伝子(以下、単にC遺伝子)
の産物(Rep 1及びRep 2 )が関与してプラ
スミドの複製をさかんにし、コピー数をあげることによ
りその安定性をよくしていると報告している〔セル、第
28巻、第203頁、 1982年(Cel+訃、 2
03.1982)) (セル、第34巻、第95頁、
1983年(Ce1l 34.95.1983) )
、また、菊池は、2P−プラスミドが細胞内で安定に
維持されるためには、Rep l及びRep 2のほか
に、安定分配に関与するSTB遺伝子が必要である旨を
報告している〔細胞、長、 L3L(1983))。さ
らにブローチらは、Rep遺伝子産物を欠くす工°株で
高いコピー数を持つプラスミドとして、全2Pgaプラ
スミドを含むpcV20. pCν21を報告している
〔エンザイモロジイー、第101巻、第307〜325
頁、 1983年(EnzymologyB■、 30
7−325.1983))。
本発明の目的は、前記21AIBプラスミドの担持する
遺伝子を利用して、生理活性物質をコードする異種遺伝
子の効率的発現をさせるために、組換えプラスミド及び
当該プラスミドによる形質転換株を提供することにある
。
遺伝子を利用して、生理活性物質をコードする異種遺伝
子の効率的発現をさせるために、組換えプラスミド及び
当該プラスミドによる形質転換株を提供することにある
。
本発明は、前記目的を達成するために、酵母の21、プ
ラスミドに存在するB遺伝子とC遺伝子を含む断片の少
なくとも2個を、生理学的活性物質をコードする遺伝子
を担持するプラスミドに挿入することを特徴とする組換
えプラスミド及び当該プラスミドによる形質転換株から
なる。
ラスミドに存在するB遺伝子とC遺伝子を含む断片の少
なくとも2個を、生理学的活性物質をコードする遺伝子
を担持するプラスミドに挿入することを特徴とする組換
えプラスミド及び当該プラスミドによる形質転換株から
なる。
以下、本発明の個々の構成を詳細に説明する。
[a) 酵母の2−プラスミドの調製バートリー(H
artley) らの方法〔ネーチャー。
artley) らの方法〔ネーチャー。
第286巻、第860頁、 1980年(Nature
286.860゜1980) )に準じて2Pmプラ
スミドが得られる。また、この2−プラスミド由来のB
遺伝子及びC遺伝子を担持するプラスミドとしては、p
JDB219゜pJDB207. pcV20. pc
V21. ps+4があげられる。
286.860゜1980) )に準じて2Pmプラ
スミドが得られる。また、この2−プラスミド由来のB
遺伝子及びC遺伝子を担持するプラスミドとしては、p
JDB219゜pJDB207. pcV20. pc
V21. ps+4があげられる。
Cbl B遺伝子及びC遺伝子を持つ断片の調製ta
+によって得られたB遺伝子及びC遺伝子を担持するプ
ラスミドを制限酵素で切断し、B遺伝子及びC遺伝子を
含む断片を分離・回収する。
+によって得られたB遺伝子及びC遺伝子を担持するプ
ラスミドを制限酵素で切断し、B遺伝子及びC遺伝子を
含む断片を分離・回収する。
この切断は、少なくともB遺伝子とC遺伝子を担持する
遺伝子断片を得るための適当な制限酵素による消化によ
って行われる。制限酵素は特に限定されず、一種または
2種の所望の制限酵素を組み合わせることによって目的
の断片を得ることができる。好適な制限酵素としては、
EcoRIが例示される。なお、断片は、B遺伝子及び
C遺伝子に加えて、STB遺伝子または/および○ri
遺伝子を担持していてもよい。消化処理は、B遺伝子お
よびC遺伝子を担持する原料プラスミドを含む水溶液を
各々の制限酵素に適応した条件に調整後(表1)、各制
限酵素を適当量添加し、1〜2時間処理を行うことによ
ってなされる。目的とするDNA断片の回収は、例えば
、ロバート(Robert)等の電気泳動法[メソッズ
イン エンザイモロジイー、第68巻、第176〜1
82頁、 1979年(Methodsin enzy
mologV 68.176−182.1979)]に
準じて行われる。例えば、EcoRIを用いた消化によ
って約4Kbの断片を得る。B遺伝子及びC遺伝子を担
持することの確認は、各種制限酵素により生ずるDNA
断片のフラグメントの長さによった。〔ザモレキュラー
バイオロジー オブ ザ イースト サン力ロマイセ
ス、′ライフ サイクル アンド インヘリタンス”、
第445〜470頁、 198)年(The Mo1e
cular Biology of the Yeas
t Saccha−romyces、 ” Life
cycle and rnheritance”+ 4
45−470、198) ) )。
遺伝子断片を得るための適当な制限酵素による消化によ
って行われる。制限酵素は特に限定されず、一種または
2種の所望の制限酵素を組み合わせることによって目的
の断片を得ることができる。好適な制限酵素としては、
EcoRIが例示される。なお、断片は、B遺伝子及び
C遺伝子に加えて、STB遺伝子または/および○ri
遺伝子を担持していてもよい。消化処理は、B遺伝子お
よびC遺伝子を担持する原料プラスミドを含む水溶液を
各々の制限酵素に適応した条件に調整後(表1)、各制
限酵素を適当量添加し、1〜2時間処理を行うことによ
ってなされる。目的とするDNA断片の回収は、例えば
、ロバート(Robert)等の電気泳動法[メソッズ
イン エンザイモロジイー、第68巻、第176〜1
82頁、 1979年(Methodsin enzy
mologV 68.176−182.1979)]に
準じて行われる。例えば、EcoRIを用いた消化によ
って約4Kbの断片を得る。B遺伝子及びC遺伝子を担
持することの確認は、各種制限酵素により生ずるDNA
断片のフラグメントの長さによった。〔ザモレキュラー
バイオロジー オブ ザ イースト サン力ロマイセ
ス、′ライフ サイクル アンド インヘリタンス”、
第445〜470頁、 198)年(The Mo1e
cular Biology of the Yeas
t Saccha−romyces、 ” Life
cycle and rnheritance”+ 4
45−470、198) ) )。
(以下余白)
表】
fc) 生理活性物質をコードする遺伝子を担持する
プラスミドの調製 生理活性物質としては、広く既知の物質が例示され、各
種インターフェロン、各種プラスミノゲンアクティベー
ター、HBsAg等、特に限定されるものではない。よ
り好ましくは、HBsAgが例示される。また当該プラ
スミドは、2P−プラスミド由来のOr+、プロモータ
ー、オペレーター、ターミネータ−等の生理活性物質の
発現制御系をすでに担持するものが好ましく、さらにC
遺伝子及びC遺伝子を担持する断片を入手するために適
した制限酵素部位を、当該プラスミドの発現制御系遺伝
子以外の部分に有することが好ましい。また、適当な制
限酵素部位がなくとも、dCテイル及びdGテイルの付
加方法、リンカ−を用いる方法、S■ヌクレアーゼによ
るFlush end (平滑末端)により連結する方
法を応用することによって利用できる。
プラスミドの調製 生理活性物質としては、広く既知の物質が例示され、各
種インターフェロン、各種プラスミノゲンアクティベー
ター、HBsAg等、特に限定されるものではない。よ
り好ましくは、HBsAgが例示される。また当該プラ
スミドは、2P−プラスミド由来のOr+、プロモータ
ー、オペレーター、ターミネータ−等の生理活性物質の
発現制御系をすでに担持するものが好ましく、さらにC
遺伝子及びC遺伝子を担持する断片を入手するために適
した制限酵素部位を、当該プラスミドの発現制御系遺伝
子以外の部分に有することが好ましい。また、適当な制
限酵素部位がなくとも、dCテイル及びdGテイルの付
加方法、リンカ−を用いる方法、S■ヌクレアーゼによ
るFlush end (平滑末端)により連結する方
法を応用することによって利用できる。
具体例として、好適には、バイオジエン社によって開発
された生理活性物質をコードする遺伝子を担持するプラ
スミド〔特開昭59−48082、英国特許21250
47 : p3111/IP(α−2)、pJり820
?/PH05/118VsΔ14(以下、pHINと呼
ぶ)〕が例示される。
された生理活性物質をコードする遺伝子を担持するプラ
スミド〔特開昭59−48082、英国特許21250
47 : p3111/IP(α−2)、pJり820
?/PH05/118VsΔ14(以下、pHINと呼
ぶ)〕が例示される。
fdl C遺伝子及びC遺伝子断片の生理活性物質を
コードする遺伝子を担持するプラスミドへの連結 常法〔ヨーエン。ニス、エン、ら、プロシーデインダス
オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエンシ
ーズ オブ ザ ニー、ニス。
コードする遺伝子を担持するプラスミドへの連結 常法〔ヨーエン。ニス、エン、ら、プロシーデインダス
オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエンシ
ーズ オブ ザ ニー、ニス。
ニー1.第69巻、第2110頁、 1972年(Co
hen、 S、N。
hen、 S、N。
et at、、 Proceedings of
the National Academyo
f 5ciences of the U、S、A、
69.2110; 1972) )に従い、C遺伝子及
びC遺伝子断片を74DNAリガーゼにより、特定の制
限酵素処理による当該プラスミドの切断部位に結合させ
、組換えプラスミドを構築する。断片は、例えば第1図
番ご示すように同方向に2個以上を、生理活性物質をコ
ードする遺伝子に連結される。
the National Academyo
f 5ciences of the U、S、A、
69.2110; 1972) )に従い、C遺伝子及
びC遺伝子断片を74DNAリガーゼにより、特定の制
限酵素処理による当該プラスミドの切断部位に結合させ
、組換えプラスミドを構築する。断片は、例えば第1図
番ご示すように同方向に2個以上を、生理活性物質をコ
ードする遺伝子に連結される。
(el 宿主の調製
本発明のC遺伝子及びC遺伝子は、酵母の2P−プラス
ミド由来であるため、宿主としては酵母が好ましい。よ
り好ましい宿主は、2P、、プラスミドを持たない酵母
す工°株が例示され、例えば、公知の菌GRF 18の
誘導体であるpho80り工0株がある。当該り10株
の分離と確認は、参考例1に示した。また、この菌株は
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所へ昭和59
年11月30日に微工研菌寄第7970号として受託さ
れている。
ミド由来であるため、宿主としては酵母が好ましい。よ
り好ましい宿主は、2P、、プラスミドを持たない酵母
す工°株が例示され、例えば、公知の菌GRF 18の
誘導体であるpho80り工0株がある。当該り10株
の分離と確認は、参考例1に示した。また、この菌株は
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所へ昭和59
年11月30日に微工研菌寄第7970号として受託さ
れている。
(fl 形質転換
本発明の組換えプラスミドによる宿主の形質転換は、例
えば公知の方法〔ヒンネンら、プロシーデインダス オ
ブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエンシーズ
オブ ザ ニー。ニス。
えば公知の方法〔ヒンネンら、プロシーデインダス オ
ブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエンシーズ
オブ ザ ニー。ニス。
ニー0.第75巻、第1929頁、 1978年(旧n
nen etal。Proceedings of t
he National Academy ofSci
ences of the U、S、A、 75.19
29; 1978))により行う。
nen etal。Proceedings of t
he National Academy ofSci
ences of the U、S、A、 75.19
29; 1978))により行う。
fg+ 形質転換株の培養
ff+の工程によって得られた形質転換株は、宿主に適
した自体公知の培地で培養する。培地としては、たとえ
ば、YNB液体培地〔0,7%イーストナイト口ジエン
ヘース(Yeast Nitrogen Ba5e
)(Difco社)2%グルコース、2%寒天〕が好適
に用いられる。培養は、通常15〜32℃で、20〜5
0時間行い、必要により通気や攪拌を行うこともできる
。培養後、公知の方法、例えば、遠心分離法によって菌
体を集め、例えば、適当な緩衝液に懸濁させた後、例え
ば超音波処理後、遠心分離によって上澄みを回収する。
した自体公知の培地で培養する。培地としては、たとえ
ば、YNB液体培地〔0,7%イーストナイト口ジエン
ヘース(Yeast Nitrogen Ba5e
)(Difco社)2%グルコース、2%寒天〕が好適
に用いられる。培養は、通常15〜32℃で、20〜5
0時間行い、必要により通気や攪拌を行うこともできる
。培養後、公知の方法、例えば、遠心分離法によって菌
体を集め、例えば、適当な緩衝液に懸濁させた後、例え
ば超音波処理後、遠心分離によって上澄みを回収する。
この上澄み中に目的とする生理活性物質が産生されてお
り、以下この生理活性物質に応した、例えば、モノクロ
ーナル抗体を用いた固定化カラムや疎水性基によるアフ
ィニティクロマトによって目的物質の精製が行われ得る
。
り、以下この生理活性物質に応した、例えば、モノクロ
ーナル抗体を用いた固定化カラムや疎水性基によるアフ
ィニティクロマトによって目的物質の精製が行われ得る
。
かくして提供された本発明プラスミド及び形質転換株は
、B遺伝子及びC遺伝子を含まないプラスミド及び宿主
にす工゛を用いる所の従来系に比較して、極めて高単位
の生理活性物質の産生を可能とする。
、B遺伝子及びC遺伝子を含まないプラスミド及び宿主
にす工゛を用いる所の従来系に比較して、極めて高単位
の生理活性物質の産生を可能とする。
実験例1
本発明の効果を確認するために、生理活性物質としてH
BsAgを用いて、既知プラスミドと本発明プラスミド
とのHBsAgの産生に関する比較実験をした。実施例
で得られた組換えプラスミドpGB197で形質転換し
て得られた株(pGB197/GRF18珈80り工6
)と、対照としてpHIN (バイオジエン社G321
25047 )で形質転換した酵母〔サン力ロマイセス
セレビジア(Saccharomyces cere
visiae)GRF18珈80り工゛〕を試料とした
。
BsAgを用いて、既知プラスミドと本発明プラスミド
とのHBsAgの産生に関する比較実験をした。実施例
で得られた組換えプラスミドpGB197で形質転換し
て得られた株(pGB197/GRF18珈80り工6
)と、対照としてpHIN (バイオジエン社G321
25047 )で形質転換した酵母〔サン力ロマイセス
セレビジア(Saccharomyces cere
visiae)GRF18珈80り工゛〕を試料とした
。
各菌株は、YNB液体培地(前出)にて、30℃、2日
間振盪培養した(0.0.2.。1.3)。培養液を遠
心分離にて菌体を集め、緩衝液〔50111Mトリス−
塩ell (pH7,5> 、I IM EDTA、
1mM PMSF(フェニル−メチル−スルフォニル−
フルオライド)〕で洗浄後、菌体を等量の同緩衝液に懸
濁し、超音波処理(トミー社製200W、9分間)を行
った。
間振盪培養した(0.0.2.。1.3)。培養液を遠
心分離にて菌体を集め、緩衝液〔50111Mトリス−
塩ell (pH7,5> 、I IM EDTA、
1mM PMSF(フェニル−メチル−スルフォニル−
フルオライド)〕で洗浄後、菌体を等量の同緩衝液に懸
濁し、超音波処理(トミー社製200W、9分間)を行
った。
この溶液を10,000 X gで20分間遠心分離し
て上清を回収した。上清中のHBsAg活性をアンティ
ヘブセル(ミドリ十字社製RPIIA試薬)を用いて測
定し、表2の結果を得た。
て上清を回収した。上清中のHBsAg活性をアンティ
ヘブセル(ミドリ十字社製RPIIA試薬)を用いて測
定し、表2の結果を得た。
表2
この結果、本発明の組換えプラスミドは、従来のものに
比べて、約8倍のHBsAg産生能を有することが確認
された。なお、これらプラスミドのコピー数をリグビー
(R4gby)らのサザン ハイブリダイゼーション(
Southern hybridization) (
ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー、第1
13巻、第237真、1977年(Journal o
f MolecularBiology、 113.2
37.1977))に従って調べたが、プラスミドにお
いては、コピー数の変化は認められなかった。
比べて、約8倍のHBsAg産生能を有することが確認
された。なお、これらプラスミドのコピー数をリグビー
(R4gby)らのサザン ハイブリダイゼーション(
Southern hybridization) (
ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー、第1
13巻、第237真、1977年(Journal o
f MolecularBiology、 113.2
37.1977))に従って調べたが、プラスミドにお
いては、コピー数の変化は認められなかった。
参考例I
酵母り工0株の分離
形質転換の対象宿主の好適なものとして、酵母Cir
’株の分離を行った。
’株の分離を行った。
21、プラスミド由来のB遺伝子およびC遺伝子を担持
するpJI]B 219(前出)のSal f部位に、
トランスポーシン(Tn)903 D N A断片(1
,8にb)を挿入したプラスミドpJDB219−Tn
を作成し、酵母GRF18り工“株を形質転換した。な
お、酵母GRF18以コ株は、バイオジエン社より人手
した(GB2125047)。得られた形質転換株をY
PD液体培地(酵母エキス1%、ポリペプトン2%、ブ
ドウ糖2%)で37℃、4日間振盪培養した。培養菌液
を超音波処理(トミー社製、20W)して、菌が集合せ
ずに1個ずつ存在していることを顕微鏡にてra認後、
YPD寒天平板(YPD液体培地+寒天2%)に単コロ
ニーを形成する様にスブレンドし、30℃、2日間培養
した。この平板をマスク−プレートとしてG418
[2−デオキシストレブタミン(2−deoxystr
eptamin)500 T /ml含有YPD寒天平
板にレプリカしてG418 a受性株をひろった。この
ようにしてpJDB219−Tnプラスミドの脱落した
株230個を得た。得られた230個のpJDB219
−Tn脱落株をカメロン(Cameron) らの方
法〔ヌクレイツク アシノズ リサーチ、第4巻。
するpJI]B 219(前出)のSal f部位に、
トランスポーシン(Tn)903 D N A断片(1
,8にb)を挿入したプラスミドpJDB219−Tn
を作成し、酵母GRF18り工“株を形質転換した。な
お、酵母GRF18以コ株は、バイオジエン社より人手
した(GB2125047)。得られた形質転換株をY
PD液体培地(酵母エキス1%、ポリペプトン2%、ブ
ドウ糖2%)で37℃、4日間振盪培養した。培養菌液
を超音波処理(トミー社製、20W)して、菌が集合せ
ずに1個ずつ存在していることを顕微鏡にてra認後、
YPD寒天平板(YPD液体培地+寒天2%)に単コロ
ニーを形成する様にスブレンドし、30℃、2日間培養
した。この平板をマスク−プレートとしてG418
[2−デオキシストレブタミン(2−deoxystr
eptamin)500 T /ml含有YPD寒天平
板にレプリカしてG418 a受性株をひろった。この
ようにしてpJDB219−Tnプラスミドの脱落した
株230個を得た。得られた230個のpJDB219
−Tn脱落株をカメロン(Cameron) らの方
法〔ヌクレイツク アシノズ リサーチ、第4巻。
第1429頁、 1977年(Nucleic Ac1
ds Re5erch+ 4+1429、1977)
)で2−プラスミドDNAの有無を検討した。YPD
寒天平板に植菌し、30℃、1〜2昼夜培養した。寒天
平板に生育した菌体を白金耳でかきとった。コニカルチ
ューブ(1,5m1)に、0.6miの緩衝液〔501
リン酸緩衝液(pit7.5)−1,2Mソルビトール
−20mM 2−メルカプトエタノール−500mc
g/a+] ザイモリアーゼ(Z4o1yase)
)を入れ、菌体を懸濁した。30℃、90分インキエベ
ートした後、I M EDTA (pH8,0) 、2
M tris、 L O%SDSの各溶液を各々30
μ、ジエチルピロカーボネイトを2μ加え、混合後、6
5℃で40分インキヱベートする。
ds Re5erch+ 4+1429、1977)
)で2−プラスミドDNAの有無を検討した。YPD
寒天平板に植菌し、30℃、1〜2昼夜培養した。寒天
平板に生育した菌体を白金耳でかきとった。コニカルチ
ューブ(1,5m1)に、0.6miの緩衝液〔501
リン酸緩衝液(pit7.5)−1,2Mソルビトール
−20mM 2−メルカプトエタノール−500mc
g/a+] ザイモリアーゼ(Z4o1yase)
)を入れ、菌体を懸濁した。30℃、90分インキエベ
ートした後、I M EDTA (pH8,0) 、2
M tris、 L O%SDSの各溶液を各々30
μ、ジエチルピロカーボネイトを2μ加え、混合後、6
5℃で40分インキヱベートする。
次に氷上で10分間放置し、5M酢酸カリウム160f
ilを加え混合し、氷上で60分以上放置する。これを
卓上遠心in<エンペンドルフ5414)で5分遠心し
、上澄みを新しいコニカルチューブに移し、等量のエタ
ノールを加え、室温10分放置後、10分間遠心する。
ilを加え混合し、氷上で60分以上放置する。これを
卓上遠心in<エンペンドルフ5414)で5分遠心し
、上澄みを新しいコニカルチューブに移し、等量のエタ
ノールを加え、室温10分放置後、10分間遠心する。
得られた沈渣を乾燥し、40tJのTE温溶液10n+
M tris−H(J (pH7,5) −1111
M EDTA 〕にt容解し、RNa5e A (ツー
シントンハイオケミカル社製)を最終10 mcg/+
++1になるように加え、37℃で30分間インキエベ
ートし、DNA試料とした。このDNA試料全量を1%
アガロースゲル電気泳動にかけ、2−プラスミドが存在
するか否かを調べた。230個のG418 i受性株(
pJDB219−Tn脱落株)のうち、70株が前述の
方法で2.、、DNAバンドを欠失していた。この70
株のうち生育、性状等から17株を選んで、前述した方
法とほぼ同様な方法で、YPD液体培地10り+1にて
菌体を培養し、2−プラスミドDNAを測定した。1%
アガロースゲル電気泳動にてpJDB219−Tnおよ
び2 pg D N Aともに存在しないことを確認し
た。かくして酵母り工°株を調製した(微工研菌寄第7
970号)。
M tris−H(J (pH7,5) −1111
M EDTA 〕にt容解し、RNa5e A (ツー
シントンハイオケミカル社製)を最終10 mcg/+
++1になるように加え、37℃で30分間インキエベ
ートし、DNA試料とした。このDNA試料全量を1%
アガロースゲル電気泳動にかけ、2−プラスミドが存在
するか否かを調べた。230個のG418 i受性株(
pJDB219−Tn脱落株)のうち、70株が前述の
方法で2.、、DNAバンドを欠失していた。この70
株のうち生育、性状等から17株を選んで、前述した方
法とほぼ同様な方法で、YPD液体培地10り+1にて
菌体を培養し、2−プラスミドDNAを測定した。1%
アガロースゲル電気泳動にてpJDB219−Tnおよ
び2 pg D N Aともに存在しないことを確認し
た。かくして酵母り工°株を調製した(微工研菌寄第7
970号)。
更に、サザン ハイブリダイゼーシロン(South−
ern hybridization) (前出)によ
って確認したが、17株すべては、pJDB219−T
n及び2 、All D N Aを脱落していた。尚、
確認のために使用したDNAプローブは、pJ[1B2
19のEcoRI 、DNA断片(4Kb)を二ツク
トランスレーション(nick trans−1ali
on)法によってラヘルした。比活性は、1×108c
、 p、m、 / D N A pgのものを使った。
ern hybridization) (前出)によ
って確認したが、17株すべては、pJDB219−T
n及び2 、All D N Aを脱落していた。尚、
確認のために使用したDNAプローブは、pJ[1B2
19のEcoRI 、DNA断片(4Kb)を二ツク
トランスレーション(nick trans−1ali
on)法によってラヘルした。比活性は、1×108c
、 p、m、 / D N A pgのものを使った。
実施例
■ B遺伝子及びC遺伝子断片の調製
反応液は、100mM tris−H(1! (pH1
,5) 、7mMMgC1、,50mM NaCj!、
7+IIM2−メルカプトエタノールを用い、3Pgの
pJDB219 (前出)、EcoRI5U(宝酒造社
製)を加え、37℃で1時間反応を行い、完全消化した
。反応液は、1%アガロ−ススラフ゛ゲルを用し)、1
麦1對ン(1,(40mごトリズマヘース[相]、20
mM酢酸ナトリウム、I mM EDTA 、酢酸にて
pH,3とする)中75V、4時間電気泳動にかけた。
,5) 、7mMMgC1、,50mM NaCj!、
7+IIM2−メルカプトエタノールを用い、3Pgの
pJDB219 (前出)、EcoRI5U(宝酒造社
製)を加え、37℃で1時間反応を行い、完全消化した
。反応液は、1%アガロ−ススラフ゛ゲルを用し)、1
麦1對ン(1,(40mごトリズマヘース[相]、20
mM酢酸ナトリウム、I mM EDTA 、酢酸にて
pH,3とする)中75V、4時間電気泳動にかけた。
アガロースゲルは、エチジウムブロマイド溶液(0,5
wag/麟l)にて染色後、UV存在下でゲル中の目的
DNA断片(4Kb)を切り出し、電気泳動法にてゲル
からDNAを単離した〔ロパートら、メソッズ イン
エンザイモロジー、第68巻、第176頁、 1979
年(Robert et al、、 Methodsi
n enzymology 6B 176、1979)
。
wag/麟l)にて染色後、UV存在下でゲル中の目的
DNA断片(4Kb)を切り出し、電気泳動法にてゲル
からDNAを単離した〔ロパートら、メソッズ イン
エンザイモロジー、第68巻、第176頁、 1979
年(Robert et al、、 Methodsi
n enzymology 6B 176、1979)
。
■ 生理活性物質をコードする遺伝子を担持するプラス
ミドの調製 プラスミドpHIN(8,7Kb) (前出)の消化を
、EcoRlで行った。反応液は■と同じものを用い、
pHlNDNA35g、 EcoRI I U (宝酒
造社製)を加え、37℃で15分間反応させた。反応液
を0.8%低融点アガロース(low melting
point agarose )(BRLinc、
)を用いて■に示した如く電気泳動した。
ミドの調製 プラスミドpHIN(8,7Kb) (前出)の消化を
、EcoRlで行った。反応液は■と同じものを用い、
pHlNDNA35g、 EcoRI I U (宝酒
造社製)を加え、37℃で15分間反応させた。反応液
を0.8%低融点アガロース(low melting
point agarose )(BRLinc、
)を用いて■に示した如く電気泳動した。
EcoRIによって1ケ所のみ切断されているpHIN
(8,7Kb) DNAバンドを切り出し、倍量のTE
緩衝液を加えて65℃にて溶解し、フェノール処理を行
って、倍量のエタノールにて、pHrNDNAを沈澱さ
せた。得られたDNAは緩衝液50mM tris−)
ICn 、0.1mM EDTA (pH18,0)中
アルカリホスファターゼ1.U(ベーリンガーマンハイ
ム社製)を加え、37℃、300分間反応せ、5゛末端
リン酸を除去し、フェノール処理をして、エタノールに
てDNAを沈澱させた。
(8,7Kb) DNAバンドを切り出し、倍量のTE
緩衝液を加えて65℃にて溶解し、フェノール処理を行
って、倍量のエタノールにて、pHrNDNAを沈澱さ
せた。得られたDNAは緩衝液50mM tris−)
ICn 、0.1mM EDTA (pH18,0)中
アルカリホスファターゼ1.U(ベーリンガーマンハイ
ム社製)を加え、37℃、300分間反応せ、5゛末端
リン酸を除去し、フェノール処理をして、エタノールに
てDNAを沈澱させた。
■ 遺伝子組換え
■で得られた2つのDNA断片を緩衝液(66)1M
tris −HCJ (pH7,6)、 6.6mM
MgC1g 、 10taM DTT、 1 m
M ATP)中においてT4DNAリガーゼ5単位(宝
酒造製)を加え、16℃−夜反応させた。反応産物で大
腸菌を形質転換し、次にこの大腸菌を2 Or/mlア
ンピシリンを含むし寒天(1%ポリペプトン、0.5%
酵母エキス、1%NaCj!、1.5%寒天)上にまき
、37℃−夜培養した。生じたアンピシリン耐性コロニ
ー中、B遺伝子、C遺伝子を組み込んだpl(INプラ
スミドをもつ大腸菌は、アルカリ抽出法〔バーンポイン
、エイチ。
tris −HCJ (pH7,6)、 6.6mM
MgC1g 、 10taM DTT、 1 m
M ATP)中においてT4DNAリガーゼ5単位(宝
酒造製)を加え、16℃−夜反応させた。反応産物で大
腸菌を形質転換し、次にこの大腸菌を2 Or/mlア
ンピシリンを含むし寒天(1%ポリペプトン、0.5%
酵母エキス、1%NaCj!、1.5%寒天)上にまき
、37℃−夜培養した。生じたアンピシリン耐性コロニ
ー中、B遺伝子、C遺伝子を組み込んだpl(INプラ
スミドをもつ大腸菌は、アルカリ抽出法〔バーンポイン
、エイチ。
シー、およびドーリ−、ジェイ、ヌクレイノクアシソズ
リサーチ、第7巻、第1513頁、1979年(Bi
rnboim、 H,C,and Doly、 J
、 Nucleic Ac1dsResearch、
71513.1979))によってプラスミドを単
離し、制限酵素による分解パターンを調べた。
リサーチ、第7巻、第1513頁、1979年(Bi
rnboim、 H,C,and Doly、 J
、 Nucleic Ac1dsResearch、
71513.1979))によってプラスミドを単
離し、制限酵素による分解パターンを調べた。
かくして、B遺伝子及びC遺伝子を担持したHBsAg
BsAg発現プラスミドルG17(約16.7にb)を
構築した。
BsAg発現プラスミドルG17(約16.7にb)を
構築した。
このプラスミドは、11)I IllのIeu 2のE
coR1部位にはpJDB 219の4Kb断片は入っ
ておらず、さらに、この断片は、同方向に2個連結して
、pHINに挿入されていた。
coR1部位にはpJDB 219の4Kb断片は入っ
ておらず、さらに、この断片は、同方向に2個連結して
、pHINに挿入されていた。
■形質転換
参考例1で得られたGRF]8 pho80り工0株を
、■によって得られたプラスミドを用いて、ヒンネン(
旧nnen)等の方法(前出)に従って、ロイシンを含
まないYNB寒天平板を用いて形質転換した。
、■によって得られたプラスミドを用いて、ヒンネン(
旧nnen)等の方法(前出)に従って、ロイシンを含
まないYNB寒天平板を用いて形質転換した。
かくして、pGB 197/GRF 18 pho80
C4r ’株を得た。
C4r ’株を得た。
■tl B s A gの産生
11のYNB液体培地に、IIGB 197/GRF
18 ph。
18 ph。
80り工°を接種し、30℃、2日間振盪培養した。
この培養液を実験例と同様に処理して、l(BsAg含
有上清を得た。
有上清を得た。
第1図は、pJDB 219 (12,4Kb)とp)
IIN (8,7Kb)の連結のフローシートである。 図において、EはEcoRIを、Xは 珈1、Pstは
Pst I SRamは加旧、HはHindlllの
各々制限酵素部位を示し、TRはインバーテンド リピ
ート (Inverted re−pea t)、 l
eu 2は2−イソプロビルーマレートデハイドロゲナ
ーゼ遺伝子、Bはベーカー遺伝子、Cはチャーシー遺伝
子、但噌5はリプレッシブルアシンド ホスファターゼ
遺伝子、Pはプロモーター、llBsAgは肝炎ウィル
ス表面抗原遺伝子、oriは複製開始点、Apはアンピ
シリン耐性遺伝子、Tはターミネータ−を示す。
IIN (8,7Kb)の連結のフローシートである。 図において、EはEcoRIを、Xは 珈1、Pstは
Pst I SRamは加旧、HはHindlllの
各々制限酵素部位を示し、TRはインバーテンド リピ
ート (Inverted re−pea t)、 l
eu 2は2−イソプロビルーマレートデハイドロゲナ
ーゼ遺伝子、Bはベーカー遺伝子、Cはチャーシー遺伝
子、但噌5はリプレッシブルアシンド ホスファターゼ
遺伝子、Pはプロモーター、llBsAgは肝炎ウィル
ス表面抗原遺伝子、oriは複製開始点、Apはアンピ
シリン耐性遺伝子、Tはターミネータ−を示す。
Claims (10)
- (1)酵母の2−プラスミドに存在するベーカー(Ba
ker)遺伝子とチャーリー(Charlie)遺伝子
を含む断片の少なくとも2個を、生理学的活性物質をコ
ードする遺伝子を担持するプラスミドに連結することを
特徴とする組換えプラスミド。 - (2)当該断片の2個を同方向に連結した特許請求の範
囲第(1)項記載の組換えプラスミド。 - (3)断片が、EcoR I によって切断された特許請
求の範囲第(1)又は(2)項記載の組換えプラスミド
。 - (4)生理学的活性物質が、HBsAgである特許請求
の範囲第(1)、(2)又は(3)項記載の組換えプラ
スミド。 - (5)酵母の2μmプラスミドに存在するベーカー遺伝
子とチャーリー遺伝子を含む断片の少なくとも2個を、
生理学的活性物質をコードする遺伝子を担持するプラス
ミドに連結した組換えプラスミドによる形質転換株。 - (6)当該断片の2個を同方向に連結した特許請求の範
囲第(5)項記載の形質転換株。 - (7)断片が、EcoR I によって切断された特許請
求の範囲第(5)又は(6)項記載の形質転換株。 - (8)生理学的活性物質が、HBsAgである特許請求
の範囲第(5)、(6)又は(7)項記載の形質転換株
。 - (9)形質転換株が酵母である特許請求の範囲第(5)
、(6)、(7)又は(8)項記載の形質転換株。 - (10)組換えプラスミドによって酵母の2−プラスミ
ド脱落株(¥Cir¥株)を形質転換することからなる
特許請求の範囲第(5)、(6)、(7)、(8)又は
(9)項記載の形質転換株。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23268384 | 1984-11-05 | ||
JP59-232683 | 1984-11-05 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61268184A true JPS61268184A (ja) | 1986-11-27 |
Family
ID=16943153
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60246917A Pending JPS61268184A (ja) | 1984-11-05 | 1985-11-01 | 組換えプラスミド及び当該プラスミドによる形質転換株 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4757021A (ja) |
EP (1) | EP0180958B1 (ja) |
JP (1) | JPS61268184A (ja) |
KR (1) | KR860004148A (ja) |
CA (1) | CA1264687A (ja) |
DE (1) | DE3577215D1 (ja) |
ES (1) | ES8800350A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0254249B1 (en) * | 1986-07-22 | 1992-08-19 | Ciba-Geigy Ag | Preparation of binding factor related polypeptides |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4615974A (en) * | 1981-08-25 | 1986-10-07 | Celltech Limited | Yeast expression vectors |
DE3381619D1 (de) * | 1982-08-16 | 1990-07-05 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Pendelvektor. |
-
1985
- 1985-11-01 JP JP60246917A patent/JPS61268184A/ja active Pending
- 1985-11-04 CA CA000494519A patent/CA1264687A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-05 ES ES549114A patent/ES8800350A1/es not_active Expired
- 1985-11-05 EP EP85114047A patent/EP0180958B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-05 US US06/795,144 patent/US4757021A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-11-05 DE DE8585114047T patent/DE3577215D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-05 KR KR1019850008250A patent/KR860004148A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES8800350A1 (es) | 1987-11-16 |
KR860004148A (ko) | 1986-06-18 |
EP0180958B1 (en) | 1990-04-18 |
US4757021A (en) | 1988-07-12 |
CA1264687A (en) | 1990-01-23 |
DE3577215D1 (de) | 1990-05-23 |
EP0180958A1 (en) | 1986-05-14 |
ES549114A0 (es) | 1987-11-16 |
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