KR970007862B1 - 인체 면역글로불린 e결합인자와 관련된 폴리 펩타이드를 코드화하는 유전자, 이러한 유전자가 삽입된 벡터 pcl2,이러한 벡터로 형질 전환된 에스케리키아콜라이숙주 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

요약 없음

Description

인체 면역글로불린 E결합인자와 관련된 폴리 펩타이드를 코드화하는 유전자, 이러한 유전자가 삽입된 벡터, 이러한 벡터로 형질전환된 숙주 및 이의 제조방법

제 1 도는 플라스미드 pCL-1 및 pCL-2의 작제를 도시한 것이다.

제 2 도는 플라스미드 pCL-1 및 pCL-2의 삽입물 2개를 비교한 도이다.

제 3 도는 플라스미드 pGEM^TM-1/CL 2의 작제 및 이 DNA 삽입물의 mRNA로의 전사를 도시한 도이다.

제 4 도는 플라스미드 pFK-1 및 pFK-2의 작제를 도시한 도이다.

제 5 도는 플라스미드 pPL-BF의 작제를 도시한 도이다.

제 6 도는 플라스미드 pJOB207R/PH05-BF의 작제를 도시한 도이다.

제 7 도는 플라스미드 pCAL5-R/ND 및 pCAL8-BF/ND의 작제를 도시한 도이다.

제 8 도는 플라스미드 pPLPTIS-BF의 작제를 도시한 도이다.

본 발명은 인체 면역글로불린 E 결합인자(IgE-BF)와 관련된 폴리펩타이드를 코드화하는 유전자, 하이브리드 벡터, 이 하이브리드 벡터를 포함하는 숙주 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

알러지성 질환은 발생 빈도가 높고(전 인구의 20 내지 30%), 치료방법이 미흡한 점으로 인하여 아직도 주요한 보건문제로 꼽히고 있다. 통상적으로 치료방법은 항히스타민제를 사용하거나, 또는 다소 효과적인 면역화 방법을 사용하는 것으로 한정되어 있다. 종전 기술의 알러지성 질환 치료 약제는 특히 치료 환자에게 여러 부작용을 야기시키기 때문에 특정 단점을 지닌다. 면역화 방법은 하나 또는 두 개의 알레르겐에 한정되어 있는 반면에, 대부분의 환자들은 다수의 알레르겐에 대해 민감하다. 또한, 제감작(hyposensitization) 치료법은 치료 효과도 방지 효과도 없다.

대부분의 알러지성 질환은 공기전염성 알레르겐(예 : 꽃가루, 짐승의 인설, 진애 진드기, 음식물 항원), 약제(예 : 페니실린) 또는 벌류의 독액에 대해 관련된 면역 글로불린 E(IgE)항체에 의해 매개된다. IgE의 생성-조절기전은 실험용 동물을 사용하여 광범하게 연구되어 왔다[K. Ischizaka, Ann. Rev. Immunol, 2, 159(1984)]. 이들 연구는 동물 모델에서 IgE의 생성을 조절하는 비-항원 특이적이긴 하나 IgE 이소타입 특이적인 기전의 존재를 뚜렷하게 밝혀냈다. 이들 조절 기전의 주요 분자는 IgE에 대한 그들의 친화도에 기인하여 IgE-결합인자(IgE-BF)로 명명하였다. IgE-BF는 IgE-억제인자(IgE-SF) 및 IgE-상승인자(IgE-PF)로 분류될 수 있으며, 이들 분자는 단지 그들의 탄수화물 함량만이 다르다. IgE-PF에 비해 덜 글리코실화 되었다. 동물 모델에서의 실질적 IgE의 생성은 IgE-BF의 이들 두 종류간의 비율로 결정된다.

동일한 세포는 별개의 조절성 T 임파구 아개체군에 의해 분비되는 글리코실화-억제 또는 증진인자의 영향에 따라 IgE-SF 또는 IgE-PF를 분비할 수 있다.

문헌[M. Sarfatiet al., Immunology 53, 197, 207, 783(1984)]에는 IgE-BF를 분비하는 인체 B 세포주의 존재가 설치류 동물에서 기술된 바와 유사한 생물학적 활성을 제공함이 입증되어 있다. 다른 연구자들은 인체 T 세포에 의한 IgE-BF의 생성[T. F. Huff. and K. Ishizaka, Proc. Natl, Acad. Sci.(USA) 81, 1514(1984)] 및 유전공학적 방법에 의한 IgE-BF의 생성[유럽 특허원 제155192호]에 대해 기술하고 있다. T 세포-유래 IgE-BF의 B 세포-유래 IgE-BF 사이의 관계는 아직까지 알려져 있지 않다. 본 발명에 따라 명백해지는 바와 같이, B 세포-유래 IgE-BF는 T 세포-유래 IgE-BF보다 통계학적으로 낮은 상동성을 갖는다.

정제한 IgE-BF는 알러지성 질환 및 그와 관련된 면역조절계 질환의 진단 및 치료에 중요하다. 특히, IgE-억제 활성을 갖는 IgE-BF는 알러지성 질환의 치료에 유용한 반면에 IgE-상승활성을 갖는 IgE-BF는 감염에 대한 내성, 예를 들면 기생충 감염에 대한 내성을 증가시킬 수 있다.

B 세포로부터 IgE-BF의 검출을 위한 검정은 IgE에 대한 수용체(FcεR)를 발현하는 RPMI 8866 세포(임파구 B 세포주)가 IgE-피복된 소의 적혈구와 로제팅하는 로제트 억제 시험을 기초로 한 것이다. IgE-피복된 소의 적혈구를 먼저 IgE-BF와 함께 예비인큐베이션하면, 이들은 RPMI 8866 세포와 더 이상 결합할 수 없게 되어 로제트를 형성하는 세포집단은 감소하게 된다. 이 분석은 정량적이 아니며, 소의 적혈구에 IgE를 커플링시키는데 있어서의 가변성 때문에 정교한 기술을 요하며, 로제트를 현미경으로 관찰해야만 하고, 세포주는 영속적으로 이용 가능해야 하며 IgE-피복된 적혈구는 일정하게 제조되어야 하는 등의 이유 때문에 분석이 복잡하므로 한 사람이 하루에 시험을 단지 20 내지 40회밖에 수행할 수 없다. 보다 편리하고, 정량적이며 용이한 분석을 수행하기 위해 IgE-BF의 교차 반응하는, 임파구는 FcεR에 대한 모노클로날 항체를 사용한다. 이러한 모노클로날 항체는 지. 델레스페쎄(G. Delespesse) 등의 유럽 특허 제868102443호에 의해 제조되었으며, 이를 생성하는 하이브리도마 세포주는 하기기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institute Pasteur, Parks]에 기탁되어 있으며 기탁번호 I-425(클론 208.25 A. 4, 3/135), I-420(클론 208.25 D. 2, 1/176), I-451(클론 207.25 A. 4, 4/30), I-452(클론 207.25 A. 4, 4/45) 및 I-486(클론 208.25 D. 2/94)으로 이용할 수 있다. 상응하는 모노클로날 항체는 각각 Mab-135, Mab-176, Mab-30, Mab-45 및 Mab-94로 명명된다. 이들은 또한 IgE-BFs를 친화성 크로마토그라피에 의해 효과적으로 정제할 수 있도록 한다.

상기 모노클로날 항체의 사용에도 불구하고 아직까지 인체의 천연 B-세포주로부터 분리된 단일 IgE-BF의 아미노산 서열을 결정하지 못하였다. 치료학적 목적을 위해서는, 목적하는 IgE-결합 특성을 갖는 규명된 아미노산 서열을 가지며 대량으로 쉽게 제조될 수 있는 순수한 단일 폴리펩타이드가 매우 바람직하다.

최근 들어 DNA 제조합 방법에 있어서의 급속한 진전으로 상기 목적을 성취하기 위한 일반적인 방법들이 제공되었다. 폴리펩타이드의 구조가 알려지지 않은 경우에, DNA 재조합 기술의 성공 여부는 천연 공급원으로부터 목적하는 폴리펩타이를 코드화하는 mRNA 또는 DNA의 동정에 달려 있다. 적절한 검정방법을 사용하여 mRNA를 동정한 후, 상보적인 DNA를 제조할 수 있다. cDNA를 적절한 벡터에 삽입시켜 수득된 하이브리드 벡터로 적절한 숙주를 형질전환 시키고, 형질전환된 숙주를 선별하고 인큐베이션하여 폴리펩타이드를 제조하여 최종적으로 분리할 수 있다. 목적하는 폴리펩타이드를 코드화하는 cDNA를 분리하고 서열화하여 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 결정할 수 있다. cDNA 또는 그의 일부를 사용하여, 목적하는 폴리펩타이드를 코드화하는 추가의 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 천연 공급원의 mRNA 또는 DNA 게놈을 선별할 수 있다.

따라서, IgE-BF의 구조가 알려져 있지 않으므로 본 발명의 제 1 목적은 제노푸스 래비스(Xenopus laevis)의 난세포를 상기 B-세포의 분획화된 mRNA로 형질전환시키고 상기 모노크로날 항체를 이용하는 검정에 의해 목적하는 mRNA를 함유하는 클론을 결정함으로써 목적하는 폴리펩타이드를 코드화하는 인체 B-세포의 mRNA를 동정 하는데 있다. 다른 목적은 cDNA 및 하이브리드 벡터의 제조, 적절한 숙주의 형질전환 및 최종적으로 이 숙주를 인큐베이션하여 목적하는 폴리펩타이드로 분리하는데 있다. 이 폴리펩타이드는 발현 후에 해독후 변형이 일어날 수 있으므로 천연 폴리펩타이드와 반드시 동일하지는 않다.

본 발명의 목적은 인체 B-세포의 IgE-BF와 관련된 폴리펩타이드, 이 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 서열을 삽입물로서 함유하는 하이브리드 벡터, 이 하이브리드 벡터를 함유하는 형질전환된 숙주, 상기 폴리펩타이드를 코드화하는 RNA 및 DNA 문자 및 상기 폴리펩타이드 유효량을 함유하는 약제학적 제제를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드, 하이브리드 벡터, 형질전환된 숙주, RNA 및 DNA 분자의 제조방법, 약제학적 제제 및 상기 폴리펩타이드의 용도를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 IgE-BF와 관련된 본 발명의 폴리펩타이드 유효량을 투여함으로써 알러지성 질환을 방지 및/또는 치료하기 위한 방법을 제공하는데 있다.

이들 목적은 서열식(I)의 폴리펩타이드 및 그의 단편을 코드화하는 DNA를 제조함으로써 성취할 수 있게 되었다.

본 발명은 다음 서열식(I)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 그의 단편, 돌연변이체 또는 유도체에 관한 것이다.

상기 서열식(I)에서 단일 문자는 자연적으로 생성되는 L-아미노산을 나타낸다. (A)알라닌, (C)시스테인, (D)아스파르트산, (E)글루탐산, (F)페닐알라닌, (G)글리신, (H)히스티딘, (I)이소루이신, (K)라이신, (L)루이신, (M)메티오닌, (N)아스파라긴, (P)프롤린, (Q)글루타민, (R)아르기닌, (S)세린, (T)트레오닌, (V)발린, (W)트립토판, (Y)티로신.

서열식(I)의 폴리펩타이드, 그의 단편, 돌연변이체 및 유도체는 본 명세서에 있어서, "본 발명의 폴리펩타이드"로 통합하여 표현하였다. 이들은 인체 B-세포상의 IgE 수용체 및 막-고정화 서열(membrane anchoring sequence)이 없는 경우에는, 상기 언급한 사르파티(Sarfati) 등의 IgE-BF와 관련된다.

본 발명의 폴리펩타이드의 단편은 서열식(I)에 상응하는 서열중 아미노산을 적어도 10개에서 320개까지를 연속적으로 함유하는 서열식(I)의 완전한 폴리펩타이드의 일부이다. 이러한 단편은 예를 들어, N-말단으로부터 첫번째 아미노산 또는 약 133개 까지의 아미노산이 결실된 서열식(I)의 폴리펩타이드이다. 이러한 결실된 N-말단은 폴리펩타이드를 B-세포의 세포질막에 결합시키는 막-고정화 서열이다. 기타의 단편은 N과 C-말단 사이의 아미노산, 예를 들어 110에서 130번의 아미노산 또는 C-말단에서의 아미노산, 예를 들어 약 250에서 321번의 아미노산이 결실된 서열식(I)의 폴리펩타이드이다.

본 발명은 특히 106에서 127까지의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열이 결실되거나, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 또는 160번 아미노산 중의 한 아미노산으로 개시되어 282 내지 321번 아미노산 중의 하나 바람직하게는 321번 아미노산으로 종결되는 폴리펩타이드들로 이루어지는 그룹중에서 선택됨을 특징으로 하는 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편에 관한 것이다.

서열식(I)의 폴리펩타이드의 바람직한 단편은 119번 아미노산에서 321번 아미노산까지의 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 한다.

서열식(I)의 폴리펩타이드의 또 다른 바람직한 단편은 134번 아미노산에서 321번 아미노산까지의 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 한다.

서열식(I)의 폴리펩타이드의 또다른 바람직한 단편은 148번 또는 150번 아미노산에서 321번 아미노산까지의 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 한다. 이들 두 개의 단편은 RPMI 8866 세포의 상등액중에서 발견될 수 있으므로 자연적으로 생성되는 IgE-BF에 상응한다.

단편이 특히 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서의 발현으로부터 수득된 단편의 경우에 이는 N-말단에 결합된 메티오닌을 함유할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드의 돌연변이체는 하나(포인트 돌연변이체) 또는 그 이상, 약 10개까지의 아미노산이 하나 이상의 다른 아미노산으로 대체됨을 특징으로 한다. 이들은 상이한 코돈을 유도하는 DNA수준에서의 상응하는 돌연변이 결과이다.

본 발명의 폴리펩타이드의 유도체는 작용기, 예를 들어 아미노, 하이드록실, 머캅토 또는 카복실기가 각각 유도화, 예를 들어 글리코실화, 아실화, 아미드화 또는 에스테르화된 것 들이다. 글리코실화 유도체에 있어서, 올리고삭카라이드는 통상적으로 아스파라긴, 세린, 트레오닌 및/또는 라이신에 연결된다. 아실화 유도체는 특히 자연적으로 생성되는 유기 또는 무기산, 예를 들어 아세트산, 인산 또는 황산에 의해 아실화 되며, 아실화는 통상적으로 특히 티로신 또는 세린 각각의 N-말단 아미노 그룹 또는 하이드록시 그룹에서 이루어진다. 에스테르는 자연적으로 생성되는 알코올, 예를 들면 메탄올 또는 에탄올의 에스테르이다.

다른 유도체로는 염, 특히 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들면 알칼리금속 및 알칼리토금속염(예 : 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염 또는 아연염), 또는 저급 알킬아민(예 : 트리에틸아민), 하이드록시-저급 알킬아민(예 : 2-하이드록시에틸아민)과 같은 적절한 유기아민 또는 암모니아와의 암모늄 염이 있다.

서열식(I)의 폴리펩타이드는 로제트 억제 시험 및 IgE-BF에 대해 특이적인 모노클로날 항체(예 : Mab-135 및 Mab-176에 대한 결합에 의해 입증될 수 있는 IgE-결합활성을 갖는다. 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편, 돌연변이체 및 유도체는 IgE-결합활성을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리펩타이드는 이를 코드화하는 mRNA의 동정, DNA 또는 cDNA 하이브리드 벡터의 작제, 상기 벡터의 발현을 가능케 하는 숙주 세포의 형질전환 및 상기 폴리펩타이드의 분리를 포함하는 DNA 재조합 기술에 의해 제조된다.

따라서, 본 발명은 또한 (a) 서열식(I)의 폴리펩타이드, 또는 그의 단편 또는 돌연변이체를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 하이브리드 벡터를 함유하는 형질전환된 숙주를 인큐베이션시키거나, (b)서열식(I)의 폴리펩타이드 또는 그의 단편 또는 돌연변이체를 코드화 하는 mRNA를 적절한 해독 시스템에서 해독하고, 경우에 따라 서열식(I)의 폴리펩타이드 또는 그의 단편 또는 돌연변이체를 그의 유도체로 전환시킴을 특징으로 하는, 서열식(I)의 폴리펩타이드 또는 그의 돌연변이체 또는 유도체의 제조방법에 관한 것이다.

단계(a)에서의 형질 전환된 숙주는 원핵 또는 진핵 세포, 예를 들면 박테리아, 진균(예 : 효모) 또는 인체 세포주를 포함하는 고등 세포 중에서 선택된다. 바람직한 세포로는 이.콜라이 균주(예 : HB 101, BZ 234, B 1472) 또는 삭카로 마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)(예 : RH 971)가 유용하며, 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화하며 적절한 프로모터, 인핸서, 표지물 및 시그날 서열 등을 함유하는 하이브리드 벡터로 이들을 형질전환시킨다.

형질전환된 숙주세포를 본 분야의 공지의 방법, 통상적으로 탄소, 질소 및 무기염의 동화가능한 공급원 및 필요한 경우, 적절한 생육인자를 함유하는 액체 배지에서 인큐베이션 한다.

형질전환된 원핵 및 진핵 미생물의 생육을 위해 다양한 탄소 공급원을 사용할 수 있다. 바람직한 탄소 공급원의 예로는 동화가능한 탄수화물, 예를 들면 글루코즈, 말토즈, 만니를 또는 락토즈 또는 아세테이트가 있으며 이들은 그 자체로 또는 적절한 혼합물로 사용할 수 있다. 적절한 질소 공급원의 예로는 아미노산, 단백질(예 : 트립톤, 펩톤 또는 육즙), 효모 추출액, 맥아 추출액 및 또한 암모늄염(예 : 염화암모늄 및 질산암모늄)이 있으며, 이들은 그들 자체로 또는 적절한 혼합물로 사용할 수 있다.

배지는 또한 미량원소, 예를 들어 K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺, No₃ ^-, So₄ ^2-, HPO₃ ^2-, H₂PO₄ ^-, Cl^-, Bo₃ ^3-및 M₀O₄ ^2-이온을 함유한다. 또한, 선별성을 갖게 하고 발현 벡터를 손실한 세포의 생육을 방지하는 물질을 가하는 것이 바람직하다. 즉, 예를 들어 하이브리드 발현 벡터가 amp^R유전자를 함유하는 경우에는 배지에 암피실린을 가한다. 또한, 항생물질의 첨가는 항생물질에 민감한 오염성 미생물을 생존치 못하게 하는 효과가 있다. 영양 요구성, 예를 들어 필수 아미노산 요구성 효모 균주를 숙주 미생물로서 사용하는 경우, 플라스미드는 숙주의 결점을 보충하는 효소를 코드화 하는 유전자를 함유하는 것이 바람직하다. 효모균주는 상기 아미노산이 결핍된 최소배지에서 배양한다.

척추동물 세포는 대부분의 경우 포유동물의 혈철이 보충된 시판중인 배지(예 : Gibco, Flow Laboratories)를 이용하여 조직 배양 조건하에서 생육시킨다. 대규모적으로 생육시킨 세포는 고체 지지체, 예를 들면 로울러병, 미세담체 및 다공성 유리섬유에 부착시키거나 이들을 적절한 용기 중에서 자유롭게 부유하는 세포로 생육시킨다.

배양 방법은 본 분야의 공지의 방법을 사용하여 수행한다. 배양 조건, 예를 들면 온도, 배지의 pH값 및 발효시간은 본 발명의 폴리펩타이드가 최대 역가를 얻도록 선택한다. 즉, 이.콜라이 또는 효모 균주는 통기조건하, 약 20 내지 40℃ 바람직하게는 약 30℃의 온도 및 4 내지 8, 바람직하게는 약, 7의 pH에서 진탕시키거나 교반시키면서 약 4 내지 30시간 동안, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드가 최고 수율에 도달할 때까지 액침 배양에 의해 배양하는 것이 바람직하다.

(b)의 단계에 있어서 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화 하는 mRNA는 적절한 해독 시스템, 예를 들면 제노푸스 래비스의 난모세포에서 해독 및 발현시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화하는 mRNA를 암컷 개구리 제노푸스 래비스의 난모세포에 미세 주입시킬 수 있다. 형질전환된 난모 세포를 FCS가 보충된 바르트(Barth) 용액중, 약 20℃에서 45시간 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 배지를 제거한 후, 난모세포를 난모세포 용해용 완충액중에서 균질화시켜 원심분리한다. 모노크로날 항체를 이용하는 RIA 검정에 의해 알 수 있는 바와 같이, 상등액은 본 발명의 폴리펩타이드를 함유한다. 이러한 본 발명의 폴리펩타이드의 제조방법은 주로 동정 목적을 위해 유용하다.

본 발명의 폴리펩타이드의 함량이 최고에 도달할 경우에, 배양을 중단시켜 폴리펩타이드를 분리할 수 있다. 폴리펩타이드가 적절한 시그날 펩타이드 서열과 융합되는 경우에, 세포는 폴리펩타이드를 상등액에 직접 분비한다. 그렇지 않은 경우에는, 세포를 예를 들어 세제, 예를 들면 SDS 또는 트리톤으로 처리하여 파괴시키거나 리소자임 또는 유사한 작용을 하는 효소를 사용하여 용해 시켜야만 한다. 효모를 숙주 미생물로서 사용하는 경우에, 글루코시다제를 사용하여 세포벽을 효소분해시켜 제거할 수 있다. 다른 방법으로 또는 추가적으로 전단력(예를 들면 X-프레스, 후렌치(French)-프레스, 다이노 밀(Dyno mill)), 또는 유리비드 또는 산화알루미늄을 이용한 진탕과 같은 기계적인 힘 또는 예를 들어 액체질소 중에서 동결과 해동을 번갈아 하거나 초-음파를 이용하여 세포를 파괴시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 함유하는 세포상등액 또는 세포파괴시 수득된 혼합물의 단백질은 본 분야에 잘 알려진 방법으로, 특히 폴리에틸렌아민 처리, 원심 분리 및 염(예 : 황산암모늄 또는 아연염)과의 침전법으로 정제한다. 추가의 정제 단계로는 예를 들어 초원심분리, 투석 여과, 겔 전기영동, 크로마토 그라피(예 : 이온교환 크로마토그라피, 크기 배제 크로마토 그라피, 고압 액체 크로마토그라피(HPLC), 역상 HPLC, 신속 압력 액체 크로마토그라피(FPLC) 등) 또는 적절한 겔 여과 칼럼, 투석 친화성 크로마토그라피, 예를 들어 항체, 특히 모노클로날 항체(예 : Mab-135 및 Mab-179)를 이용하는 친화성 크로마토그라피를 사용하는 분자 크기에 따른 혼합물 성분의 분리 및 분야의 기타 공지의 방법 등이 있다.

바람직한 양태에 있어서, 세포 상등액을 모노클로날항체 아피겔(affigel), 예를 들면 Mab-45-아피겔을 통해 여과하고, 결합된 IgE-BF 폴리펩타이드를, 예를 들어 pH 2.6의 0.1M 글리신-HCl 완충액으로 용출시키고, 목적하는 폴리펩타이드를 함유하는 분획을 음이온 교환기 칼럼(예 : SynChropak AX 300)상에 적재한 다음, 칼럼을, 예를 들어 트리스-HCl 완충액(pH 7.4)으로 세척하고, 단백질을 예를 들어 염화나트륨 용액(예 : 1M NaCl)로 용출시킨 다음, 목적하는 폴리펩타이드를 함유하는 분획을 투석시키고 동결건조시키고 투석된 분획을, 예를 들어 SynChropak RP-4 칼럼상에서 역상 크로마토그라피하고, 예를 들어 아세토니트릴/0.1% TFA 구배를 사용하여 목적하는 폴리펩타이드를 용출시킴으로써 본 발명의 폴리펩타이드를 세포 상등액으로부터 분리한다.

이 방법은 특히 RPMI 8866 세포 상등액으로부터 천연 IgE-BF를 정제하는데 적합하다. 이 방법에 의해 정제된 천연 IgE-BF는 아미노산 서열 분석에서 사용하기에 충분할 정도로 순수하며, 2개의 단백질로 이루어져 있으며, 하기의 N-말단 아미노산 서열을 갖는 것으로 나타났다.

번호 매김은 서열식(I)의 번호매김에 상응한다. X로 표시된 아미노산은 결정되지는 않았으나, 서열식(II) 또는 (III)의 DNA 서열과 비교하여 다음과 같이 표시될 수 있다. X₁₄₉=R, X₁₅₁=E, X₁₅₅=S, X₁₆₀=C, X₁₆₃=C. 분석결과, 천연 IgE-BF는 L₁₄₈에서 S₃₂₁및 M₁₅₀에서 S₃₂₁로 연장된 아미노산 서열을 갖는 적어도 두 개의 폴리펩타이드서열식(I)로 이루어졌으며, 이는 40 대 60의 비율로 일어난다.

최종적으로, 분리한 단백질의 IgE-결합활성은 본 분야에 잘 알려진 방법, 예를 들어 로제트 억제시험, 항-IgE 항체에 대한 IgE-결합의 차단, 친화성 크로마토그라피 시험 및 알러지성 개체로부터 임파구에 의한 전진적인 시험관내 IgE 합성의 억제를 측정하는 실험에 의해 측정할 수 있다.

정확한 서열을 가지나 부적당한 3차원 폴딩을 갖는 본 발명의 폴리펩타이드는 재생(renaturation) 실험에 있어서 중간체로서 유용하다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라 수득된 각각의 서열식(I)의 폴리펩타이드, 또는 그의 단편, 돌연변이체 또는 유도체에 관한 것이다.

형질전환된 숙주의 제조

본 발명은 또한 (1) 서열식(I)의 폴리펩타이드, 그의 단편, 돌연변이체 또는 유도체를 코드화하는 DNA를 제조하고, (2) 수득된 DNA를 적절한 벡터에 삽입시키며, (3) 수득된 하이브리드 벡터로 적절한 숙주를 형질전환시킨 다음, (4) 형질전환되지 않은 숙주로부터 형질전환된 숙주를 선별하고, 임의로 형질전환된 숙주로부터 하이브리드 벡터를 분리하고 하이브리드 벡터의 코드화 또는 비-코드화 영역을 변형시켜 다시 단계 (3) 및 (4)를 수행함을 특징으로 하여, 본 발명의 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 형질전환된 숙주를 제조하는 다단계의 방법에 관한 것이다.

숙주의 제조에 수반되는 단계는 이하에서 더욱 상세하게 설명된다. 본 발명은 또한 각각의 단일단계에 관한 것이다.

1. 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA의 제조

본 발명은 서열식(I)의 폴리펩타이드, 또는 그의 단편, 돌연변이체 또는 유도체를 코드화하는 DNA 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩타이드를 코드화 하는 DNA는 (a) 분리된 mRNA의 cDNA로의 역전사, (b) 게놈 DNA로부터의 분리 또는 (c) 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다.

본 발명에 있어서, DNA 구조가 알려지지 않은 한 DNA는 게놈 DNA, 또는 mRNA를 통한 cDNA 라이브러리로부터 얻어야만 한다. cDNA 라이브러리는 세포로부터 분리한 mRNA에 대해 상보적인 유전정보로 이루어진다.

(a) 분리된 mRNAdml cDNA로의 역전사

cDNA 라이브러리를 얻기 위해, IgE-결합 활성물을 발현하는 세포, 특히 인체 B-세포 및 그로부터 유도된 세포주로부터 mRNA를 분리한다. 이 mRNA를 이본쇄 cDNA로 전환시킨다. 바람직한 인체 B-세포주는 RPMI 8866이다. 천연 B-세포를 에프스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)를 이용하여 죽지 않게 하여 다른 유용한 B-세포주를 제조할 수 있다. 본 분야에 잘 알려진 표준 방법을 mRNA의 제조에 적용시킨다. 세포막을 파괴시켜 세포 내용물을 유리시키고, 이로부터 mRNA를 분리한다. 세포막은 물리적 방법으로 파괴시키거나, 또는 세제 예를 들면 SDS, 구아니디늄 티오시아네이트, 규정된 염조건 또는 바람직하게는 혼합에 의한 균질화에 의해 용해시켜 파괴시키는 것이 바람직하다. mRNA는 페놀 추출, 에탄올 침전, 원심분리 및 크로마토그라피의 표준 방법, 바람직하게는 몇몇 방법의 조합에 의해 분리한다. 원심분리는 구배물, 예를 들어 CsCl 구배상에서 수행하는 것이 바람직하다. 크로마토그라피의 경우에는 특히 올리고-dT 칼럼을 사용하는 것이 바람직하다.

전체 mRNA를 본 분야의 방법에 따라 ds-cDNA로 직접 전환시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화 하는 mRNA를 몇몇 기술, 예를 들면 전기영동, 크로마토그라피 및 원심분리, 바람직하게는 슈크로즈 구배 원심분리를 이용하여 추가로 농축시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리펩타이드를 코드화 하는 mRNA를 함유하는 분획을 몇몇 방법, 예를 들면 생체내 또는 시험관 내에서 해독한 후, IgE-결합인자 활성을 측정함으로 검출하거나 뉴클레오타이드 서열이 알려진 경우에는 올리고 뉴클레오타이드 프로브와 하이브리드화시켜 검출할 수 있다.

생체내 해독 시스템은 원핵 또는 진핵 시스템일 수 있다. 바람직한 생체내 해독 시스템은 마니아티스등의 문헌(1)에 기술된 바와 같은 제노푸스 래비스 난모세포이다. 시험관내 시스템으로는 예를 들면 밀의 배종 및 토끼의 망상적혈구 용해물이 있으며, 이들 둘다는 시판품으로 구입할 수 있다.

IgE 결합인자 특성을 스크리닝 하기 위한 검출 시스템은 서열식(I)의 폴리펩타이드에 대한 모노클로날 항체, 특히 Mab-135 또는 Mab-176을 사용하는 것이 바람직하다. 다른 가능한 시스템은 통상적인 면역 검정에서의 IgE 타입의 면역 글로불린을 사용한다.

분획화되거나 분획화되지 않은 mRNA로부터 유도된 mRNA의 푸울(pool)로부터 본 분야의 잘 알려진 방법으로 ds-cDNA를 수득할 수 있다. 바람직한 일반적인 방법은 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌(1), 오까야마(Okayama)와 베르그(Berg)의 문헌(2) 및 하이데커(Heidecker) 등의 문헌(3)에 기술되어 있다. 통상적으로, 역전사 효소를 사용하여 mRNA를 우선 ss-cDNA로 전환시킨 다음, 역전사 효소 또는 DNA 폴리머라제 I(클레나우 단편)을 사용하여 이본쇄-cDNA로 전환시킨다. 본 발명의 경우에는 마니아티스 등의 문헌(1)에 기술된 방법에 따라 수행하는 것이 바람직하다. 상기 2가지 방법은 달리는 ds-cDNA의 합성을 가속화시키기 위해 사용한다. 첫번째 방법은 ss-cDNA의 천연 루프 형성법을 이용한다. 두번째 방법은 호모폴리머 테일(tail), 예를 들어 폴리 -dC 또는 폴리 -dT로 ss-cDNA를 테일링(tailing) 시켜 수행한다.

상응하는 폴리펩타이드가 검출 시스템에서 매우 높은 활성을 나타내는 mRNA 분획이 본 분야에 잘 알려진 방법에 의해 상보적인 cDNA로 전사된다. mRNA 및 프라이머로서 올리고 -dT를 혼합한다. 그 다음, 출발물질로 dNTP를 가하고 역전사 효소에 의해 cDNA-mRNA 하이브리드 분자가 합성된다. RNA 분자는 NaOH를 가하여 분해시킨다. DNA 폴리머라제를 바람직하게는 DNA 폴리머라제 I 의 클레나우 단편과 혼합하여, 혼합물을 적당한 온도, 바람직하게는 12 내지 15℃에서 인큐베이션한다. 혼합물을 뉴클레아제 Sl과 인큐베이션 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화 하는 mRNA에 상응하는 ds-cDNA를 수득한다.,

증폭 및 구조를 밝히기 위해, 수득된 ds-cDNA를 적당한 벡터, 예를 들면 플라스미드 pUC-KO에 삽입시켜 수득된 하이브리드 벡터를 적합한 숙주, 예를 들면 이.콜라이 HB 101을 이용하여 증식시키며, 더욱 상세한 것은 상기에 기술하였다. 하이브리드 벡터를 재분리하고 이들로부터 삽입된 cDNA를 회수하여 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA의 구조를 밝힐 수 있다. 수득된 하이브리드 벡터 pCL-2 및 pCL-1은 각각 서열식(II) 및 (III)의 삽입물을 함유한다.

pCL-2 cDNA 삽입물은 다음 서열식(II)의 서열을 갖는다.

서열식(II)의 DNA 서열에서 서열식(I)의 폴리펩타이드의 코드화 영역은 아미노산 기호로 나타냈다. 비-코드화 플랭킹 영역은 또한 분리된 mRNA의 비-코드화 영역의 일부이다. 제한 부위는및로 나타내었다.

mRNA로부터 수득된 다른 cDNA는, 서열식(I)의 폴리펩타이드중의 106번에서 127번까지의 아미노산을 코드화하는 뉴클레오타이드, 즉 서열식(II)의 316번에서 378번까지의 뉴클레오타이드가 결실되거나 달리는 코드화 영역 및 2개의 플랭킹 서열의 일부가 서열식(II)의 DNA 서열과 동일한, 서열식(III)의 서열을 갖는다. 이러한 cDNA 삽입 단편은 pCL-1에서 나타나며 다음 서열식(III)의 서열을 갖는다.

(b) 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화 하는 DNA를 수득하기에 적합한 다른 하나의 방법은 상기 DNA를 조직 또는 세포 배양물의 게놈 DNA로부터 분리하는 것이다. 세포를 바람직하게는 SDS 및 당백질 분해 효소 K로 용해시키고 페놀로 추출을 반복하여 DNA를 탈단백질화시킨다. RNA를 바람직하게는 RNAse로 분해시킨다. 수득된 조 DNA를 적합한 제한 효소, 예를 들면 Hae III 및 Alu I 으로 부분적으로 분해시켜 15 내지 20Kb의 단편을 분리하여 적절한 파아지 또는 코스미드, 예를 들면 Charon 4A 또는 EMBL-3 파아지에서 증식시킨 다음, 예를 들어 방사선 표지된 DNA 프로브를 사용하거나 다른 방법으로는 상기 기술한 바와 같이 목적하는 서열을 검정한다.

(c) 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화 하는 DNA를 제조하기 위한 세번째 방법은 화학적 합성법이다. DNA의 화학적 합성법은 에스.에이.나랑(S. A. Narang)의 문헌(4)에 요약되어 있다. 공지의 합성 기술로 40개 또는 60개까지의 염기쌍의 폴리뉴클레오타이드를 우수한 수율 및 고순도로 비교적 단시간에 제조할 수 있다. 적절하게 보호된 뉴클레오 타이드를 케이.엘.아가왈(K.L. Agarwal) 등의 문헌(5)에 기술된 포스포디에스테르 방법, 씨.비.레셈(C. B. Reesem)의 문헌(6)의 포스포트리에스테르 방법 또는 알.엘.레트싱거(R.L.Letsinger) 등의 문헌(6a)의 포스파이트 트리에스테르 방법으로 연결시킨다. 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드를 적절한 중합체에 결합시키는 고체상 합성법에 의해 간단하게 합성할 수 있다. 유리하게는 DNA 합성용 기계를 사용한다.

실제적인 이본쇄 DNA는 화학적으로 제조된 짧지만 중첩되는 절편으로부터 효소적으로 작제할 수 있다. 예를 들어, 코라나(Khorana) 등의 문헌(7)에 따르면, 양측 DNA 본쇄로부터의 중첩 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용하여, 이를 염기짝지음으로 정확히 배열시킨 다음 DNA 리가제로 화학적으로 연결시킨다. 다른 방법으로는 각각의 경우에 두개의 DNA 본쇄로부터의 하나의 폴리뉴클레오라이드 서열과 짧은 중첩 절편을 필요한 4개의 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA-폴리머라제,예를 들면 DNA-폴리머라제 I, 폴리머라제 I의 클레나우 단편 또는 T₄DNA 폴리머라제, 또는 역전사효소와 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다. 이에 따라 두 개의 폴리 뉴클레오타이드 서열이 염기 짝지음으로 정확히 배열되고 효소에 의해 필요한 뉴클레오타이드가 보충되여 완전한 이본쇄 DNA가 수득된다(S. A. Narang et al(8))

(d) 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편을 코드화하는 DNA의 제조

서열식(II) 또는 (III)의 DNA 또는 이를 함유하는 벡터를 적절한 제한효소 및/또는 적절한 엑소뉴클레아제로 분해시키고, 필요한 경우 수득한 DNA 단편을 화학적 방법으로 합성한 DNA 단편으로 보충하거나, 목적하는 단편을 전부 화학적 방법으로 합성시켜 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편을 코드화하는 DNA를 수득한다.

적절한 제한효소 및 이들의 제한부위는 서열식(II)에 나타내었다. 서열식(I)의 폴리펩타이드 서열 D₁₁₉내지 S₃₂₁내지 S₃₂₁을 코드화하는 DNA 단편을 제조하기 위해서는 Bgl II 및 Rsa I이 적합하다. 폴리펩타이드 서열 A₁₃₄내지 S₃₂₁을 코드화하는 DNA 단편은 Hind III 및 Ras I 으로 제한시켜 수득할 수 있다(참조 : 서열식 II, 제 4 도). DNA 단편은 또한 단계적 합성방법으로 제조할 수 있는데, 먼저 예를 들어 Hinc II 및 Rsa I으로 제한시켜 큰 DNA 단편을 제조하여, 이를 적절한 벡터에 서브클로닝시켜, 이를 각각 Bgl II 및 Bam H I, 또는 Hind III으로 연속적으로 절단 하여 제조할 수 있다(참조 : 제 3 및 제 4 도).

전체적 또는 부분적 화학 합성법으로 제한 효소 및/또는 엑소뉴클레아제를 함께 사용하여 서열식(II)으로 이루어진 목적하는 DNA 단편을 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 서열식(II) DNA의 DNA 단편에 관한 것이다. 이들 단편은 IgE-결합활성을 갖는 폴리펩타이드를 코드화하거나 또는 천연 또는 합성공급원으로부터 이러한 DNA를 동정하기 위한 프로보로서 사용될 수 있다. 바람직한 DNA 단편은 서열식(I)으로 이루어진 바람직한 폴리펩타이드 단편을 코드화 하는 것들이다. DNA 프로브는 서열상에 7개 이상, 바람직하게는 약 15개의 뉴클레오타이드를 갖는다.

2. 하이브리드 벡터의 제조

본 발명의 하이브리드 벡터는 서열식(I)의 폴리펩타이드, 또는 그의 단편, 돌연변이체 또는 유도체를 코드화하는 DNA를 적절한 벡터에 삽입시킴으로써 제조된다.

적합한 벡터는 패신저(passenger) DNA를 이입시키기 위한 운반체이며, 인체 세포를 포함하는 숙주 미생물을 형질 전환시키기 위해 사용할 수 있으며 숙주내에서 복제될 수 있다. 이러한 벡터로는 플라스미드, 피아지 또는 코스미드가 적합하다. 적합한 벡터는 정의된 위치에 삽입 DNA를 갖는다.

일반적으로, 이러한 벡터는 레플리콘 및 조절서열, 즉 프로모터를 포함하며, 이들이 사용되는 숙주세포에 적합한 종으로부터 유도된다. 통상적으로 벡터는 레플리콘 부위 및 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 서열(표시 유전자)을 포함한다. 적합한 표지 유전자는, 예를 들어 숙주에 항생제 또는 중금속에 대한 내성을 부여하거나, 숙주의 유전적 결함을 보상한다. 이러한 벡터에 또한 유용한 서열은 인핸서 및 활성화 서열이다.

출발 벡터는 광범위한 진핵 및 원핵 유기체의 숙주 세포에 사용하기에 적합하다. 벡터는 형질전환에 이용할 숙주 세포에 따라 선택한다.

바람직한 출발 벡터는 본 분야에서 구입할 수 있는 플라스미드 DNA 박테리오파아지 DNA이다. 특히 플라스미드 pBR322 및 그의 유도체가 유용하다. 이러한 유도체로는, 예를 들어 플라스미드 pUC-8, pUC-9, pMB-9, pGEM^TM-1 및 pGEM^TM-2가 있다. 박테리오파아지 벡터중 람다파아지의 DNA, 예를 들면 λgt-11의 DNA가 바람직하다. 또한, 적합한 파아지 벡터는 Charon 4A 및 EMBL-3 파아지 이다. 람다 클로닝 시스템은 마니아티스 등의 문헌(1)에 기술되어 있다.

서열식(II) 또는 (III)과 같은 패신저 DNA를 수반하는 벡터를 하이브리드 벡터로 표현한다.

수득된 DNA를 통상적인 방법으로 출발 벡터에 삽입한다.

출발 플라스미드를, 예를 들어 우선 적절한 제한효소로 선형화시킨 다음, 예를 들어 플라스미드 pUC-KO를 Pst I으로 선형화시킨 다음, dGTP 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이 효소의 전재하에서 d/G 테일링시킨다. 이본쇄 cDNA 삽입물을 dCTP 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소의 존재하에서 dc-테이링시킨다. cDNA와 벡터를 혼합하여 하이브리드벡터를 얻는다. 박테리오파아지, 예를 들면 람다 파아지가 게놈 라이브러리를 작제하는데 바람직하다. 람다 클로닝 시스템은 마니아티스 등의 문헌(1)에 기술되어 있다. 적합한 벡터 DNA를 적절한 제반 효소로 완전히 분해시켜 속도 구배 원심분리 및 겔 전기영동에 의해 왼편 및 오른편 암(arm)을 주요 단편으로 분리한다. 다른 방법으로는 왼편 및 오른편 암에 인식부위가 없는 제한 효소로 스터퍼(stuffer) 단편을 분해하는 것이다. 분리한 게님 DNA를 15 내지 20kb 길이의 단편으로 분해한다. 그후, 암의 말단과 조화되는 말단을 갖는 외래 DNA의 단편과 암을 연결한다.

적절한 DNA 삽입물을 최초 클로닝에 사용된 최초의 벡터로부터 적합한 발현 벡터에 재클로닝시킨다. 이 목적을 위해, 적절한 제한효소(제 3 도 및 4 도)를 실제적으로 엑소 뉴클레아제, 특히 Bal31과 혼용하여 목적하는 DNA 단편을 수득한다. 이들 단편을 직접 접착말단을 사용하거나 화학적으로 합성된 적절한 올리고뉴클레오타이드 브릿지를 첨가하여 적절한 발현 벡터에 이입시킨다. 말단의 변형을 위해, 예를 들어 Hind III 및 Bgl II를 사용할 수 있다. 이 발명은 이들의 특정 제한효소로 제한되는 것은 아니다. 적절한 제한효소와 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오라이드를 혼용하여 발현벡터와 DNA 삽입물 사이의 목적하는 위치에서 연결시킬 수 있다.

본 발명은 또한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열식(I)의 폴리펩타이드, 또는 그의 단편, 돌연변이체 또는 유도체를 코드화하는 DNA를 함유하는 하이브리드벡터에 관한 것이다.

발현을 위해 적절한 하이브리드 발현 벡터를 사용한다. 하이브리드 발현 벡터란 용어는 벡터에 함유된 DNA 서열을 발현시킬 수 있는 특정의 벡터를 포함하며, 이러한 서열은 벡터에서 그들을 발현시킬 수 있는 다른 서열, 즉 오퍼레이터, 인핸서 및 프로모터 서열에 작동적으로 연결된다. 요약해보면, 발현 벡터는 벡터에 삽입된 특정 DNA 서열을 발현시킬 수 있는 특정 DNA 서열로 정의되는 작용성에 의해 특징지워진다. 본 발명은 본 분야에 공지된 발현 벡터로부터 제조될 수 있는 모든 형태의 하이브리드 발현 벡터 및 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 삽입물을 함유하는 작용 등가물을 포함하고자 한다.

다수의 발현 조절서열을 사용하여 유전자 발현을 조절할 수 있다. 미생물 발현 벡터는 통상적으로 미생물 숙주에 의해 그 자신의 단백질을 발현시키는데 이용되는 프로모터를 함유한다. 재조합 DNA 작제시 통상적으로 사용되는 프로모터로는 β-락타마제 및 락토즈프로모터 시스템(Chang et al.(9) : Goeddel et al. (10)), 트립토판(trp) 프로모터 시스템(Goeddel et al.(11)) 또는 람다로부터의 P_L프로모터와 같은 박테리오파아지 프로모터 시스템이 있다. 이들이 가장 흔히 사용되지만, 다른 미생물 프로모터도 발견되어 이용되고 있으며, 이들의 뉴클레오타이드 서열에 관한 상세한 사항도 공개되었으며 숙련가들은 이들을 플라스미드 벡터와 작용적으로 연결시킬 수 있다(Siebenlist et al(12)). 원칙적으로, 선택된 숙주에서 본 발명의 폴리펩타이드를 복제하여 발현시키는 모든 벡터가 적합하다. 상기 폴리펩타이드의 발현을 위해 적합한 벡터의 예로는 플로스미드 PKK 223-3, pDR 720 및 pDL-람다, 또는 박테리오파아지 람다의 벡터, 예를 들면 λ-gtll이 있으며, 이들은 모두 시판되고 있다(Pharmacia, Sweden : Promega Biofec, USA). 본 발명의 바람직한 벡터는 pIN-ompA 타입의 발현 및 분비벡터(Gharayeb et al(13)) 및 PL 프로모터를 함유하는 벡터이다.

효모에서의 복제 및 발현을 위해 적합한 벡터는 하나이상, 예를 들면 두 개의 효모 레플리콘 개시물 및 효모에 대한 하나이상의 선별 유전자 표지물을 함유한다. 효모 레플리콘 개시물, 예를 들어 염색체 자기복제 단편(ars¹), 또는 2μ ori를 함유하는 하이브리드 벡터는 형질전환 후에도 효모 세포내에염색체 외적으로 보유되어 자발적으로 복제된다. 효모에 대한 적절한 표지물 유전자는 특히 숙주에 항생제 내성을 부여하는 것들이거나, 또는 영양 요구성 효모 돌연변이체의 경우에는 숙주 병변을 보충하는 유전자이다. 상응하는 유전자는 예를 들어 항생제 사이클로헥스이미드에 대한 내성을 부여하거나 영양요구성 효모 돌연변이체, 예를 들면 URA3, LEU2, HIS3 또는 특히 TRP1 유전자에 영양 비-요구성을 제공한다. 또한, 효모 하이브리드 벡터는 바람직하게는 하이브리드 벡터 및 그들의 중간체를 박테리아 숙주에서도 작제하고 클로닝할 수 있도록, 박테리아 숙주 특히 이. 콜라이에 대한 레플리콘 개시물 및 표지물 유전자를 함유한다(셔틀 벡터). 효모에서의 발현을 위해 적합한 발현 조절 서열은 예를 들어 고도로 발현되는 효모 유전자의 서열이다. 따라서, TRPI 유전자, ADHI 또는 ADHI 유전자, 포스파타제(PHO3 또는 PHO5)유전자 또는 이소치토 크롬 유전자의 프로모터, 또는 해당 과정에 수반되는 프로모터, 예를 들면 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이드 데하이드로게나제(GAPDH) 또는 3-포스포글리 세라트 키나제(PGK)의 프로모터를 사용할 수 있다.

바람직한 벡터는 생육 조건에 따라 개시되거나 개시되지 않을 수 있는 프로모터를 함유한다. 예를 들어, PHO5 프로모터는 단지 배지중의 무기 인산염의 농도를 증가시키거나 감소시킴으로써 억제되거나 탈억제될 수 있다.

이러한 세포에 대한 발현 벡터는 통상적으로 발현될 유전자의 전방부에 위치한 다능한 강령한 인핸서/프로모터 단위를 포함한다. cDNA를 발현시키고자 하는 경우에는, 유전자에 RNA 삽입 부위, 폴리아데닐화 부위 및 마지막으로 전사 터미네이트 서열을 첨가한다. 포유동물 세포에 사용하는 경우에, 발현 벡터에 대한 조절기능은 종종 바이러스 물질에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 인핸서-프로모터 단위는 시미안(Simian) 바이러스(SV 40), 로우스 사르코마(Rous sarcoma) 바이러스, 아데노(Adeno) 바이러스 2, 또는 마우스 및 인체의 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)이다. 특히, 마우스의 사이토메갈로바이러스 인접 초기 유전자의 인핸서 프로모터 및 인체 α-글로빈 프로모터와 조합된 SV40 인핸서가 적합하다. 또한, 유도가능한 프로모터, 예를 들면 열쇼크 또는 메탈로티오닌 유전자로부터 유도된 것들이 유용하다. 또한, 목적하는 유전자 서열과 통상적으로 연결된 프로모터 또는 조절용 서열을 사용할 수 있다. 복제의 기원은, 예를 들면 SV40 또는 기타 바이러스 공급원(예 : Polyoma, Adeno, VSV, SPV 등)으로부터 유도된 외인성-기원을 포함하는 벡터를 작제함으로써 또는 숙주 세포 염색체 복제 기작에 의해 제공될 수 있다. 벡터를 숙주 세포 염색체에 이입시키는 경우에는 후자의 방법이 종종 보다 바람직하다.

클로닝시킨 DNA 삽입물을 함유하는 벡터 DNA의 숙주로부터의 재분리는, 특히 숙주 세포의 용해 및 원심분리, 특히 CsCl 밀도 원심분리 및 페놀/클로로포름 추출에 의한 정제에 의해 성취된다.

본 발명은 또한 서열식(I)의 폴리펩타이드 또는 그의 단편, 돌연변이체 또는 유도체를 코드화하는 DNA 서열을 삽입물로서 함유하는 하이브리드 벡터에 관한 것이다.

특히, 본 발명은, 삽입물이 106번에서 127번까지의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열이 결실된 서열식(I)의 폴리펩타이드 ; 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 또는 160번 아미노산중의 어느 한 아미노산으로 개시하여 282번 내지 321번 아미노산중의 어느 한 아미노산으로 종결되는 폴리펩타이드들로 이루어지는 그룹중에서 선택된 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편 ; 119번에서 321번 아미노산까지의 아미노산 서열로 이루어지는 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편 ; 134번에서 321번 아미노산까지의 아미노산 서열로 이루어지는 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편 ; 148번에서 321번 아미노산까지의 아미노산 서열로 이루어지는 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편 ; 또는 150번에서 321번 아미노산까지의 아미노산 서열로 이루어지는 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편을 코드화함을 특징으로 하여, 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편을 코드화하는 DNA 서열을 삽입물로서 포함하는 하이브리드 벡터에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 서열식(II) 또는 (III)의 DNA 서열, 또는 그의 단편 또는 유도체를 함유하는 하이브리드 벡터에 관한 것이다.

구체적인 하이브리드 벡터로는 pCL2, pCL1, pFK-1, pFK-2, pPL-BF, pJDB 207 R/PHO5-BF, pCAL5-R/ND, pCAL8-BF/ND 및 pPL.PTIS-BF가 있다(참조 : 제 1 내지 8도).

본 발명에 따른 추가의 하이브리드 벡터는 서열식(II)의 삽입물의 일부와 100% 상동인 15개 이상의 핵산의 DNA 서열을 포함한다.

3. 숙주의 형질전환

강력한 발현 벡터에 이어서 본 발명의 목적하는 폴리펩타이드의 발현을 위해 적절한 숙주 세포를 사용한다. 일반적으로, 원핵생물이 DNA 서열을 클로닝하고 벡터를 조립하는데 바람직하다. 조립된 벡터를 적절한 숙주 세포로 옮기는데, 이때 원핵세포 및 진핵세포를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 미생물종으로는 이.클라이, 바실러스 서브티리스(Bacillus subtilis), 바실러스-스타애로써모필러스(Bacillus sterothermophilus) 및 기타 엔테로박테리아세애(Serratia marcesans), 예를 들면 살모넬라 티피무리움(Salmonell typhimurium) 또는 세라티아 마르세산스(Serratia marcesans) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas)종이 있다. 특히 이.콜라이 균주, 예를 들면 이.콜라이 B, HB 101, BZ 234, X1776, W3110, JA 221 및 K12가 유용하다. 물론 이들은 예시하고자 하는 것이며 이들로 제한하고자 하는 것은 아니다.

원핵생물 외에 효모와 같은 진핵 미생물을 사용할 수도 있다. 진핵 미생물 가운데 가장 흔히 사용되는 것은 삭카로 마이세스 세레비지애 또는 통상의 빵 효모이지만, 기타 다른 종도 통상적으로 사용된다. 삭카로마이세스에서 발현시키고자 하는 경우에는, 예를 들어 플라스미드 YRp7(Stinchomb et al. (14), Kingsman et al. (14a), Tschemper et al. (15))을 사용할 수 있다.

미생물 외에, 다세포 유기체로부터 유도된 세포 배양물을 숙주로서 사용할 수도 있다. 근본적으로, 이러한 세포 배양물은 척추동물 또는 무척추동물로부터 얻을 수 있으나 척추동물 세포 배양물이 보다 관심이 있다. 이러한 유용한 숙주 세포주의 예로는 베로(Vero) 및 헬라(Hela) 세포, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary : CHO) 세포주, 보웨스(Bowes) 흑색종 세포주, RPMI 8866 및 Cos-7 세포주가 있다.

수득된 하이브리드 벡터 DNA의 수령체로의 형질전환은 본 분야에 잘 알려진 방법, 예를 들어 마이나티스 등의 문헌(1)에 기술된 방법에 의해 성취된다. 박테리아를 하이브리드 벡터 DNA로 예를 들어 CaCl 형질전환 방법으로 형질전환 시킨다.

벡터로서 람다 파아지의 DNA를 사용하는 경우에 이.콜라이 숙주 박테리아를 형질전환시키기에 적절한 다른 하나의 방법은 하이브리드 벡터 DNA를 시험관내에서 패키징하여 상기 박테리아를 감염시키는 것이다. 시험관내 패키징은 주로 이용가능한 패키징 키트(Pharmacia, Sweden ; Boehringer, Mannheim)를 사용하여 수행한다. 마니아티스의 문헌(1)의 275페이지에 기술된 MgCl₂방법으로 감염시킨다.

효모의 형질전환은, 예를 들어 글루코시다제의 사용에 의한 효모 세포벽의 효소제 제거단계, 수득된 스페로플라스트(spheroplast)를 폴리에틸렌 글리콜 및 Ca²⁺이온의 존재하에서 벡터로 처리하는 단계 및 스페로플라스트를 한천에 끼워 넣어 세포벽을 재생성 시키는 단계로 이루어진다. 바람직하게는, 재생성용 한천은 형질전환된 세포를 재생성시키며 동시에 선별될 수 있도록 하는 방식으로 제조한다.

조직 배양물에서 생육시킨 척추동물 세포의 형질전환은 본 분야에 잘 알려진 여러방법중의 한가지 방법에 의해 성취된다. DNA를 세포핵에 직접 미세주입하거나, 이.콜라이 원형질체를 미래의 숙주 세포와 융합시키거나, DNA와 제 2 인산칼슘 사이의 공침전물을 첨가할 수 있다. 이어서 발현벡터에 공유결합적으로 이입되거나 별개의 실체로서 가해진 선별 표지물을 사용하여 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 선별 표지물로는 항생제, 예를 들면 G418 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자 또는 숙주 세포의 유전적 병변, 예를 들면 티미딘 및 하이포크산틴 포스포리보실 전이효소의 부재를 보완하는 유전자가 있다.

4. 형질전환된 숙주의 선별

벡터에 이입된 선별단위의 특성을 갖는 형질전환된 숙주는 특히 적절한 선별조건하에서 박테리아를 생육시킴으롯 형질전환되지 않은 숙주로부터 선별되며, 형질 전환된 숙주만이 생존하게 된다. 박테리오파아지를 사용한 경우에 또다른 선별 방법으로는 도말된 이.콜라이 숙주 박테리아 상에서의 반점 형성이 있다.

본 발명의 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 서열을 삽입물로서 함유하는 하이브리드 벡터를 함유하는 숙주의 스크리닝은 이러한 폴리펩타이드의 단편을 코드화하는 방사선표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하거나 상기 DNA 삽입물의 폴리펩타이드 생성물을 스크리닝함으로써 성취할 수 있다. 하이브리드화는 특히 mRNA, 또는 본 발명의 폴리펩타이드의 단편을 코드화하는 약 12개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 함유하는 어떠한 올리고뉴클레오타이드프로브로 수행한다.

특히, 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화하는 삽입물을 수반하는 하이브리드 벡터에 의해 형질전환된 이.콜라이 숙주의 선별은 아가로스 평판배지상에 분포되는 cDNA 라이브러리로부터 유도된 레플리카 필터에 올리고뉴클레오타이드 프로브를 하이브리드화시켜 수행할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 T₄키나제 효소를 사용하여³²P-αATP로 5' 말단을 표지허가나 파아지 M13에 클로닝되는 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화하는 cDNA의 단편을 사용하여 클레나우 폴리머라제로 프라이밍 합성에 의해 내부적으로 표지할 수 있다.

스크리닝 목적을 위한 단백질 생성물은 마니아티스 등의 문헌(1)에 기술된 바와 같이 특히 제노푸스래비스 난모세포를 사용하는 생체내 또는 시험관내 해독에 의해 수득된다. 해독된 단백질 생성물은 모토클로날 항체, 예를 들면 Mab-45, Mab-176 및 Mab-135를 사용하거나, 작용성 시험 시스템, 예를 들면 사르파티(Sarfati) 등의 문헌(17)에 의해 로제트 억제 시험에서 수행한 바와 같이 IgE의 폴리펩타이드에 대한 결합을 이용하여 검출할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 서열을 수반하는 재조합 파아지는, 상기 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 단편을 함유하는 방사선 표지된 핵산 서열을 하이브리드화에 사용하여 동정한다. 다른 방법으로는, 이들은 모노클로날 항체, 예를 들면 Mab-135 및 Mab-176을 사용하는 면역학적 스크리닝에 의해 검출된다.

하이브리드 벡터의 코드화 영역 또는 비-코드화 영역의 변형은 예를 들어 상기에 기술된 방법(1d)에 의해 성취된다.

또한 본 발명은 모든 종류의 항원, 예를 들면 꽃가루, 고양이털, 진애진드기 등에 대해 알러지성인 환자의 알러지성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 IgE 결합 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 특히 모유로 키우지 않은 위험성이 높은 새로운 생명체를 포함하여 위독한 상태의 환자의 치료시 특히 중요하다. 본 발명의 폴리펩타이드는 통상적으로 정제, 당의정, 앰풀제, 바이알 또는 좌제와 같은 용량 단위형으로 장내, 예를 들면 비강, 직장내 또는 경구, 또는 비경구, 예를 들면 근육내, 피하 또는 정맥내 투여할 수 있다. 폴리펩타이드의 투여량은 그의 특히 활성, 환자의 체중 및 상태, 질병의 중증도, 투여 방식에 따라 다르며 의사의 판단을 기초로 해야 한다. 통상적으로, 1일 체종 1kg당 약 100㎍ 및 약 5000㎍을 투여할 수 있다.

본 발명은 또한 알러지성 질환을 치료하기에 유효한 양의 IgE-결합 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩타이드를 경구투여, 직장투여, 비강투여 또는 비경구투여(예 : 근육내, 피하 또는 복강내 투여)를 위해 적합하며 활성성분과 유해하게 상호 작용하지 않는 통상의 약제학적으로 허용되는 담체와 임의로 혼합함유하는 약제학적 제제에 관한 것이다.

적합한 제제로는 정제 ; 캅셀제 ; 고체 분말을 함유하는 바이알 ; 또는 주입용액, 바람직하게는 수용액 또는 현탁액을 함유하는 연무제, 분무제, 바이알, 앰풀제 등이 있으며, 이들은, 예를 들어 활성성분을 단독으로 함유하거나 담체(예 : 만니톨, 락토즈, 글루코즈, 알부민 등)와 함께 함유하는 동결건조시킨 제제로부터 사용하기 전에 제조할 수 있다. 약제학적 제제는 멸균시킬 수 있으며, 경우에 따라 보조제, 예를 들면 보존제, 안정화제, 유화제, 가용화제, 완충액 및/또는 삼투압 조절용 염과 혼합시킬 수 있다. 멸균은 작은 구멍 크기(0.45㎛ 또는 보다 작은 직경)의 여과기를 통해 멸균여과함으로써 성취 되며, 경우에 따라 멸균시킨 후 제제를 동결건조시킬 수 있다. 또한, 항생제를 가하여 멸균성을 유지시킬 수도 있다.

본 발명에 따른 약제학적 제제는 용량단위형, 예를 들면 단위용량당 1 내지 2000mg의 약제학적으로 허용되는 담체 및 단위용량당 약 1 내지 100mg, 바람직하게는 약 2 내지 50mg의 활성성분을 함유하는 앰풀제로 조제한다.

또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합시킴을 특징으로 하는 약제학적 제제의 제조 방법에 관한 것이다.

공지의 방법 그 자체, 예를 들면 통상적인 혼합, 용해, 동결건조 등의 방법을 수행하여 활성물질 약 0.1% 내지 100% 특히 약 1% 내지 50%를 함유하는 약제학적 제제를 수득한다.

인체의 질환을 치료하고 예방하기 위한 본 발명의 신규한 폴리펩타이드의 사용도 본 발명의 목적이다.

본 명세서에 사용된 약어는 다음과 같은 의미를 갖는다.

bp : 염기쌍, BSA : 소의 혈철 알부민, cDNA : 상보성 DNA cpm : 분당 계수(방사성 붕괴), dA : 2'-데옥시아데노신, dATP : 2'-데옥시아데노신 트리포스페이트, dC : 2'-데옥시시티딘, dCTP : 2'-데옥시시티딘 트리포스페이트, dG : 2'-데옥시구아노신, dGTP : 2'-데옥시구아노신 트리포스페이트, dT : 2'-데옥시티미딘, dTTP : 2'-데옥시티미딘 트리포스페이트, DNA : 데옥시리보헥산, dNTP : dATP, dCTP, dGTP와 dTTP의 혼합물, ds : 이본쇄, dTT : 1,4-디티오트레이톨, EDTA : 에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨염, FCS : 태아 송아지 혈청, HAT : 하이포크산틴/아미노프테린/티미딘, HBSS : 한크(Hank)균형 염 용액, HT : 하이포크산틴/아미노프테린, Hepes : N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에텐설폰산, IgE : 면역 글로불린, mRNA : 전령 RNA, min : 분, PBS : 인산염 완충 생리염수, Pipes : 피페라진-N, N'-비스(2-에탄설폰산), PMSF : 페닐메틸설포닐 플루오라이드, RLA : 방사선 면역 검정, RNA : 리보헥산, rpm : 분당-회전수, SDS : 나트륨 도데실설페이트, SS : 일본쇄, Tris : 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, tRNA : 전달 RNA, ㎍ : 마이크로그램

다음 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며 이들로 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

사용되는 완충용액 및 배지는 다음과 같다.

한천 : 2% 한천으로 보충시킨 LB-브로쓰, 용출-완충액 : 10mM 트리스-HCl(pH 7.5) 1mM EDTA, 0.2% SDS, LB-브로쓰 : 1% 박토-트립톤(Difco), 0.5% 박토 효모 추출물(Difco), 170mM NaCl(NaOH로 pH 7.5로 조정), 용해-용액 : 0.5M NaOH, 1.5N NaCL, HBSS : 8g NaCi, 400mg KCL, 48mg Na₂HPO₄, 350mg NaHCO₃, 60mg KH₂PO₄, H₂O 1ℓ중의 페놀레드 100mg, HBSS-FCS : 10% FCS, 0.01% NaN₃, 66mM 트리스-HCl로 보충시킨 HBSS(pH 7.2), HT-배지 : 40㎕ 2-머캅토에탄올, 100μM 하이포크산틴, 1μM 티미딘으로 보충시킨 RPMI/c-배지, HAT-배지 : 10μM 아미노프테린으로 보충시킨 HT-배지, MBS-H : 88mM NaCl, 1mM KCl, 0.33mM Ca(NO₃)₂0.41mM CaCl₂, 0.82mM MgSO₄, 2.4mM NaHCO₃, 10mM Hepes(pH 7.4), 맥 콘키(Mc Conkey)한천 : 증류수 1ℓ당 50g의 예비 혼합된 맥 콘키 한천(Becton Dickionson), 난모세포 용해-완충액 : 20mM 트리스-HCl(pH 7.5), 50mM NaCl, 0.5% 트리톤×100, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% 메티오닌, 1mM PMSF, PBS : 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na₂HPO₄·2H₂O, 0.2g KH₂PO₄를 함유하는 1ℓ, RPMI 1640-배지 : Gibco사로부터 구입, RPMI 1640/c-배지 : 1% 페닐실린-스트렙토마이신(Gibco), 1% L-글루타민(Gibco) 및 15%(V/V) FCS(Gibco)로 보충시킨 RPMI 1640-배지, RVT-완충액 : 200mM 트리스-완충액(42℃에서 pH 8.3), 20mM MgCl₂280mM KCl, 20mM DTT, SOC-배지 : 2% 박토 트립톤(Gibco), 0.5% 효모 추출물(Gibco), 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl₂, 5mg MgSO₄, 20mM 글루코즈, SSC-완충액 : 15mM 나트륨 시트레이트, 150mM NaCl, TBE-완충액 : 10.8g, 트리스, 5.5g 붕산, 4ml 0.5% EDTA(pH 8.0)를 함유하는 1ℓ, TE-완충액 : 10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA, TNE-완충액 : 10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, 0.1M NaCl(NaOH로 pH 7.8로 조정), 세척-완충액 : 10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA, 0.5M NaCl, 0.2% SDS

제한 효소의 사용 및 DNA의 분리

모든 제한효소는 효소 데이터 시트에 대해 제공자들에 의해 추천된 바와 같은 완충상태에서 사용한다. 일반적으로, DNA 1㎍을 분해시키기 위해 효소 3단위가 사용된다. 인큐베이션은 37℃에서 2시간동안 계속한다. EDTA 및 Na-아세테이트를 각각 15mM 및 200mM 최종 농도로 가하여 효소 반응을 중단시킨다. TNE로 예비포화시킨 클로로포름/페놀의 1 : 1 혼합물 1 용적을 가하고 혼합물을 격렬하게 진탕시켜 DNA를 추출한다. 5000g에서 5분동안 원심분리하여 유기상 및 수상을 분리한다(실온). 수상을 새 튜브에 옮겨 클로로포름 1용적으로 추출한다. 원심분리한 후, 에탄올 2.5용적을 가하여 DNA를 침전시킨다. 샘플을 -20℃에서 적어도 2시간 동안 인큐베이션시킨 다음 10000g에서 10분 동안 원심분리한다. DNA 펠렛을 70% 에탄올로 1회 세척하고, 진공건조기 중에서 10분 동안 건조시킨 다음 최종적으로 TE 완충액의 적절한 용적중에 용해시킨다.

사용되는 균주는 다음과 같다.

이. 콜라이 균주 HB 101 : F^-, hsdS20(r^-β, m^-B), recA13, ara14, proA2, lacY1, galK2, rspL20(Sm'), xyl-5, mtl-1, supE44, λ^-(Boyer and Rouland-Dussoix 1969 : Bolivar and Backman 1979).

RPMI 8866 세포주 : RPMI 8866 세포(ATCC No. CCL 107)는 IgE에 대한 수용체를 발현하는 림프아구 B 세포주로부터의 것이다. 이 세포주는 Dr. P. Ralph(Sloan-Kettering Research Institute, NY, USA)로부터 수령한 것이다.

사용되는 플라스미드는 다음과 같다.

pUC-9 : Pharmacia(P-L Biochemicals Upsalla, Sweden)으로부터 구입. pUC-9 플라스미드는 pBR322 유도된 암피실린아제 유전자 및 이.콜라이의 lacZ 유전자의 일부에 연결된 DNA 복제 기원으로 구성된다. 독특한 제한 효소 인지 부위의 정렬을 갖는 DNA 삽입물이 이 플라스마디의 lacZ 영역에 도입되었다.

pUC-KO : 프로모터 바로 옆의 Hae III 제한 부위와 Hind III 제한 부위 사이의 lacZ 유전자의 프로모터/오퍼레이터 영역이 결실되고, pUC-9의 나머지 다른 서열은 변하지 않은 pUC-9 플라스미드의 유도체이다.

pGEM^TM-1 : Promega Biotec(Madison, USA)로부터 구입. 특정의 전사벡터이며 박테리오파아지 SP6프로모터-함유 플라스미드 pSP64(Melton, D.A., et al, (16)) 및 박테리오파아지 T7 프로모터를 이용하여 제작되었다. 수득된 플라스미드는 여러개의 클로닝 부위를 갖는 DNA의 작은 조각에 의해 분리된 두 개의 마주 보는 SP6 및 T7 프로모터를 갖는다.

PIN-MMM-ompA 플라스미드 : 문헌(Gharayeb et. al. (13))에 기술되어 있다. 이 플라스미드는 이.콜라이에서의 특정 분비 클로닝 벡터이다. 세포질막을 통한 클로닝된 유전자 생성물의 분비는 적절한 시그날 펩타이드를 유전자 생성물의 아미노-말단에 융합시킴으로써 성취할 수 있다. 이들 플라스미드에서, 이.콜라이의 외부막 주단백질인 ompA 단백질의 시그날 펩타이드를 코드화하는 DNA 단편을 고도 발현 벡터에 삽입시켰다. 외래 DNA 단편을 ompA 시그날 펩타이드 코드화 서열바로 다음의 독특한 EcoRI, Hind III 또는 BamH I 부위에서 3개의 판독 프레임 중위 어느 하나에 클로닝시킬 수 있다. 타입 1, 2 및 3의 pIn-III-ompA-플라스미드는 해독용의 상이한 프레임을 제공한다.

실시예 1

RPMI 8866 세포로부터 mRNA의 분리

15% FCS, 페니실린 100단위/ml 및 스트렙토마이신 100㎍/ml로 보충시킨 RPMI 1640 배지 50ml를 함유하는 조직배양 프라스크(Falcon, 175cm²)에서 RPMI 8866 세포를 생육시킨다. 원심분리하여 50개의 합류식 플라스크로부터 세포를 모아(대략 10⁸개 세포/플라스크) 50ml PBS로 1회 세척한다. 세포 펠렛(5g)을 구아니디늄 티오시아네이트 100g, H₂O, 100ml, 1M 트리스-HCl 10.6ml(pH 7.5), 0.5M EDTA 4.2ml, 20% N-라우릴 사르코신 21.2ml 및 20-머캅토에탄올 2.1ml로부터 제조된 용액 25ml중에 용해시킨다. 세포 용해물을 다능혼합기에서 90분 동안 전속력으로 균질화시킨다. 그 다음, 클로로포름과 페놀의 1 : 1 혼합물 2용적을 가한다. 혼합물을 1분 동안 격렬하게 진탕시킨 다음 10℃에서 소르발(Sorvall) 원심분리기로 5000g에서10분 동안 원심분리한다. 수상을 회수하고 추출을 4회 더 반복한다. 수상에 에탄올 2용적을 가한다. 15분 동안 -20℃로 냉각시켜 침전을 회수한 다음, 10분 동안 4℃에서 소르발 SS34 로우터로 10000rpm에서 원심분리한다. 펠렛을 TE 완충액 4ml중에 용해시킨다. 베이킹한 CsCl(Merck) 7.5g 및 0.1N HCl 50㎕를 가하고 용액을 7.5ml로 조정한 후 원심 분리용 12ml 튜브중의 5.7MCsCl의 완충액 2ml에 충화시킨다. 튜브를 물로 충전시켜 20℃에서 TST 41 로우터(Kontron)로 29000rpm에서 16시간 동안 원심분리한다. 수행 말기에, 대부분의 상등액을 제거하고 튜브를 빠르게 역위시켜 비운다. 유리같은 RNA 펠렛을 볼텍싱시키고 때로는 37℃에서(2분 동안) 가온하여 TE 완충액 및 0.2% SDS 1ml에 용해시킨다. 문헌(1)의 페이지 461 내지 462에 기술된 바와 같이, RNA를 에탄올로 침전시킨다. 건조시킨 mRNA를 용출 완충액 1ml에 용해시킨다. 68℃에서 2분 동안 가열하고, 얼음상에서 냉각시킨 후, 5M NaCl 130㎕를 가하고 용액을 세척 완충액으로 평형화된 올리고-dT 셀룰로즈(5ml 주사기 제7형 중의 2ml 베드 용적, P-L Biochemicals)의 2ml 칼럼에 적용한다. 샘플을 2회 연속 적용시킨후, 컬럼을 세척완충액 15ml로 세척하고 결합된 mRNA를 용출 완충액 4ml로 용출시킨다. 용출된 물질을 68℃에서 2분 동안 가열하고 얼음 상에서 냉각시킨 후 5M NaCl 0.44ml를 가한다. 재-평형화시킨 올리고-dT 셀룰로즈 칼럼에 용액을 2회 적용시킨다. 세척 완충액 15ml로 칼럼을 세척한 후, 결합된 mRNA를 용출완충액 4ml로 용출시킨다. 260nm에서 흡광도(40㎍/ml의 농도에 따른 OD_260nm=1)을 측정하여 mRNA의 회수율을 계산한다. mRNA(150㎍)을 에탄올로 침전시킨다. 원심분리(16000g에서 15분)하여 침전물을 모아 물 0.4ml에 용해 시켜 에탄올로 재침전 시킨다. cDNA-펠렛을 공기건조시키고 0.1% SDS로 보충시킨 TE 완충액 150㎕에 용해시킨다.

실시예 2

IgE-수용체 및 IgE-BF 관련 폴리펩타이드를 코드화하는 mRNA의 정제

실시예 1로부터 수득한 폴리 A-mRNA 130㎍(1㎍/㎕)을 70℃에서 5분 동안 가열하고 얼음 상에서 냉각시켜 0.1M NaCl, 10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA 및 0.5% SDS중의 5 내지 20% 선형 구배의 슈크로즈 12ml상에 로딩 시킨다. 구배물을 25℃에서, TST 41 로우터로 41000rpm으로 5시간 동안 원심분리한다. 30개의 분획(용적 : 0.4ml/분획)을 모아 실시예 3에 기술된 바와 같이, 제노푸스 래비스의 난모세포에 주입하여 검정한다.

실시예 3

제노푸스 래비스 난모세포에서 mRNA의 생체내 해독

성숙한 숫컷 및 암컷 제노푸스 래비스를 케이. 에반스(K. Evans, 716 Northside, Ann Arbor, Mi 48105)를 포함하여 여러 동물 공급자로부터 얻는다. 개구리를 18 내지 22℃에서 통기시키지 않으면서 특정 형태의 물탱크중에 방치한다. 소의 간 및 심장의 단편을 일정하게 공급하면(1주일에 2회) 왕성한 클로니가 유지될 것이다. 난모세포는 반드시 건강한 성숙한 암컷 제노푸스로부터 얻어야 한다. 이는 개구리를 물중의 에틸-m-아미노벤조에이트 1 : 1000(w/v) 용액중에서 10 내지 30분 동안 마취시킴으로써 쉽게 얻을 수 있다. 개구리의 난소를 꺼내기 위해 복후부측을 조금 절개한다(1cm). 난소 절편을 적출한 후, 절개부를 봉합하면 개구리는 물속에서 빨리 살아날 수 있다. 난소를 즉시 변형된 바르트(Barth) 염수(MBS-H)중에 놓고 개개의 난모세포를 백금이로 분리시킨다. 완전하게 자란 거대 난모세포를 미세마이크로피펫, 마이크로미터 주사기 및 해부용 표준 입체 현미경을 사용하여 주입한다. 적절한 주입용 피펫의 제작은 구르돈(Gurdon)의 문헌(18)에 기술되어 있다. 난모세포를 종이타월로 닦아 마르게한 현미경 슬라이드 상에 놓고 슬라이드를 현미경에 놓는다. 피펫을 삽입하기 전 또는 삽입도중에 난모세포를 위치메이커의 겸자로 고정시킨다. 피펫을 난모세포에 꽂은후, 실시예 2의 mRNA용액(1mg/ml 30 내지 50ml 분취량을 마이크로미터 주사기를 사용하여 주입한다. 동일한 분획의 mRNA를 함유하는 40개의 난세포 그룹을 6% FCS로 보충된 바르트 용액 0.5ml중 20℃에서 45시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 배지를 제거하고 난모세포를 난모세포 용해 완충액 900㎕중에서 균질화시킨다. 균질물을 에펜도르프 원심 분리기에서 10분 동안 원심분리한다. 상부상을 회수하여 50㎕의 분취량으로 실시예 7의 기술하는 바와 같이 RIA로 시험한다.

실시예 4

FcεR에 대한 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포의 제조

BALB/c 마우스에 PBS중의 5×10⁷개의 RPMI 8866 생세포를 4주 간격으로 3회 복강내 주사하여 면역화시킨다. 마지막 주사한지 2일후, 개개의 마우스 혈청 샘플을 모아 항-FcεR 활성을 시험한다. 최고 역가를 나타내는 두 마리의 동물로부터의 비장 세포를 모아 다음날 융합에 사용한다. 비장을 잘게 자르고 각각의 융합을 위해 세척한 비장 세포 1×10⁸개를 350xg에서 50분 동안 NSI/1-Ag4/1 마우스 골수종세포(아메리칸 타입-컬쳐 컬렉션으로부터 얻음) 25×10⁶개와 함께 펠렛화시킨다. 세포 펠렛을 15%(v/v) 디메틸설폭 사이드를 함유하는 RPMI 1640 배지(Gibco) 28ml에 용해된 PEG 20g으로 이루어진 폴리에틸렌 글리콜 용액(PEG-1540, Baker) 2ml중에 30초동안 재현탁시킨다.

RPMI/c 배지 8ml를 90초에 걸쳐 적가한 다음, 추가의 5ml를 신속하게 첨가한다. 튜브를 역위시켜 혼합시킨 다음, 2.5분 동안 정치시키고 350xg에서 5분 동안 원심분리한다. 펠렛을 5ml RPMI/c 배지에 재현탁시키고 HAT-배지 1ml중 BALB/c 정상 비장 세포 1×10⁶개를 함유하는 4 Costar #359624-웰플레이트의 각각의 웰에 분취량 50㎕를 분산시킨다. 융합시킨 후 5일째부터 시작하여 필요에 따라 며칠마다 HAT 배지를 가하거나 대체하여 완전한 배양물을 유지시킨다. 14일후, HAT를 HT 배지로 대체하고 28일후 RPMI/c로 대체한다. 융합시킨지 1 내지 2주일후, 각각 웰(192개의 배양물)의 상등액을 항(I)FcεR 항체에 대해 스크리닝한다. 목적하는 항체를 생성하는 배양물 21개를 제한 희석시켜 클론화시킨다. 배양물을 RPMI/c에서 희석하여 ml당 10개의 생세포 농도가 되게 하여 이들 현탁액 50㎕ 분취량을 100㎕ HT 배지 및 1×10⁵개의 BALB/c 정상 비장 세포를 함유하는 96-웰 플레이트(Linbro #76-003-05, Flow Labs)의 웰에 놓는다. 생육한 배양물에 모노클로날이 존재하는가를 확인하기 위해 웰을 현미경으로 관찰한다. 이로부터 취한 상등액의 샘플을 항체 활성에 대해 시험한다. 양성 배양물을 선별하여 보다 큰 배양용기로 옮긴다. 바람직한 특이성의 항체를 분비하는 모노 클로날 세포주 14개를 최종적으로 얻는다. 본 발명에 사용되는 3개의 클론은 각각 207.25. A.4.4/45, 208.25A.4.30135 및 208.25D. 2.1/176으로 명명되고 기관[Collection Nationale de Cutures de Microoryanismes of the Institut Pasteur, Paris]에 기탁되어 있으며, 기탁번호는 각각 I-452, I-425 및 I-420이다. 이에 따라 생성된 모노클로날 항체는 Mab-45, Mab-135 및 Mab-176으로 명명된다.

실시예 5

모노클로날 항체의 분리 및 정제

Bal b/c 마우스를 0.5ml 프리스탄(Aldrich)으로 복강내 예비처리한다. 2주일후, 실시예 4 의 클로닝된 하이브리도마세포 5×10⁶개를 복강내 주사한다. 8 내지 10일후, 복수액을 모아 800xg에서 원심분리한 다음 -20℃에서 보관한다. 해동시킨 복수액을 50,000xg에서 60분 동안 원심분리 한다. 표면에 부유하는 지방층을 주의해서 제거하고 단백질 농축물을 10 내지 12mg/ml의 농도로 조정한다. 0℃에서 포화 황상 암모늄 0.9 용적 당량을 적가하여 조 면역글로불린을 침전시킨 다음, 20mM 트리스-HCl/50mM NaCl(pH 7.9)에 용해 시키고 동일한 완충액에 대해 투석시킨다. pH 7.9의 20mM 트리스-HCl/25 내지 400mM NaCl의 완충구배 시스템을 사용하여 DEAE-D52 셀룰로즈(Whatman) 크로마토그라피하여 면역 글로불린 G분획을 수득한다.

실시예 6

¹²⁵I 표지된 항체 Mab-135의 제조

에프. 씨. 그린우드(F. C. Greenwood) 등의 문헌(19)의 일반공정에 따라 Mab-135 40㎍(실시예 5의 PBS 용액)을 0.5mCi¹²⁵I 요오드화나트륨 및 클로로아민 T로 요오드화 시킨다. 요오드화된 Mab-135-단백질을 함유하는 용액을 PBS-완충액 1ℓ에 대해 각각 6시간, 4회 투석시킨다. 최종 생성물은 대략 2×10⁷cpm/㎍ 단백질의 특이활성을 갖는다. 유사하게¹²⁵I 표지된 항체 Mab-176을 제조한다.

실시예 7

세포 상등액 및 혈청중의 IgE-BF 검출을 위한 방사선 면역 검정

폴리비닐 클로라이드 미세역가 플레이트의 웰을 실시예 5의 Mab-176 5㎍/ml을 함유하는 pH 9의 0.01M 탄산염 완충액 150㎕와 함께 20℃에서 밤새 인큐베이션한다. 그 다음, 플레이트를 PBS로 1회 세척하고 이를 실온에서, 10%의 태아 송아지 혈청을 함유하는 한크 균형 염 용액(HBSS-FCS) 200㎕와 반응시킨 다음, 다시 PBS로 10회 세척하여 시험 샘플 100㎕와 함께 실온에서 8시간 동안 인큐베이션한다. HBSS-FCS를 사용하여 블랭크를 결정한다. 플레이트를 PBS로 10회 세척하고 웰당¹²⁵I-Mab-135(실시예 6, HBSS-FCS중의 2 내지 4×10⁵cpm) 100㎕와 함께 실온에서 밤새 인큐베이션한 다음, PBS로 10회 세척하고 감마 계수기에서 계수한다.

실시예 8

mRNA로부터 ss-cDNA의 합성

실시예 7의 RIA에서 검출된¹²⁵I-Mab-135에 대한 최대 결합능을 나타내는 실시예 2의 mRNA 용액 12㎕(0.5mg/ml)를 25㎕ RVT 완충액, 2.5㎕ dNTP 혼합물(각각 20mM dATP, dTTP 및 dGTP), 1mg/ml 올리고 -dT_12-18(P-L-Biochemicals 5㎕, 1㎕ α-³²P-dCTP(10μCi, 3000Ci/mmol), 3㎕ RNasin^TM(60단위, Promega Biotec, Madison, USA) 및 3㎕ 역전사 효소(66단위, Promega Biotec)에 가한다. 합성 단계후의 cDNA의 회수 및 수율 측정이 양호하도록 반응혼합물에 방사성 dCTP를 가한다. 혼합물을 42℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션한다. pH7.5의 0.5M EDTA-2㎕를 가하여 반응을 중단시킨다. 0.15M NaOH 25㎕를 가한 다음 45℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 mRNA를 분해시킨다. 1M 트리스-HCl(pH 8.0)25㎕ 및 1M HCl 6㎕를 가하여 용액을 중화시킨다. 20% SDS 2㎕를 가하고 용액을 페놀-클로로포름 혼합물(TNE-완충액으로 평형화시킨 동일한 용적의 페놀 및 클로로포름) 0.15ml로 추출한다. 수상을 TNE-완충액으로 평형화시킨 세파덱스 G-50 컬럼에 파스퇴르 피펫으로 적용시켜 혼합되지 않은 뉴클레오타이드 및 분해 mRNA로부터 새로 합성된 cDNA를 분리한다. 각각 200㎕의 12개의 분획을 모아 각각 분획의 방사능을 가이거(Geiger) 계수기로 대략 측정한다. 방사능을 갖는 3개의 분획을 모은다. ss-cDNA 1.9㎍을 회수하여 문헌(1)의 461 내지 462 페이지에 기술된 바와 같이 에탄올-침전시킨다. ss-cDNA를 물 20㎕중에 용해시킨다.

실시예 9

ds-cDNA-합성 및 Sl-분해

수득된 SS-cDNA를 pH 6.9의 100mM Hepes, 10mM MgCl₂, 2.5mM DTT, 70KCl, 각각 0.5mM의 dNTP(dATP, dCTP, dTTP, dGTP) 및 DNA 폴리머리제 I 거대단편 20단위, 클레나우 효소(Boehringer Mannheim)의 최종 용적 100㎕중, 15℃에서 3시간 동안 인큐베이션한다. 그 다음, 동일한 효소의 또다른 20 단위를 가하여 15℃에서 10시간 동안 인큐베이션을 계속한다. EDTA를 20mM까지 가하여 반응을 종결시킨다. 혼합물을 페놀-클로로포름으로 추출하고 문헌(1)의 461 내지 462 및 458 내지 459 페이지에 기술된 바와 같이 에탄올로 침전시킨다. 생성된 ds-cDNA를 250mM NaCl, pH 4.5의 50mM 나트륨 아세테이트, 1mM ZnSO₄, SI 뉴클레아제(Boehringer Mannheim) 200단위를 함유하는 인큐베이션 혼합물 100㎕중, 30℃에서 30분 동안 처리한다. EDTA를 25mM까지 가하여 반응을 중단시킨다. pH 8.0의 1M 트리스-HCl을 100mM 및 SPS를 1%까지 가한 후, 페놀/클로로포름으로 추출하고 TNE완충액으로 평형화시킨 용적 2밀의 파스퇴르 피펫내 세파덱스 G-200 컬럼을 통해 통과시킨다. 방사능을 측정하여 ds-cDNA를 함유하는 분획을 결정하여, 이를 모아, 에탄올로 침전시킨 다음 물 15㎕중에 용해시킨다. ds-cDNA 3.2㎍을 수득한다.

실시예 10

pUC-KO 플라스미드의 3'-올리고(dG)-테일링

pUC-KO 플라스미드 20㎍을 200㎕의 pH 8.0의 50mM 트리스-HCl, 100mM MgCl₂및 50mM NaCl 중의 PstI(Boehringer Mannheim) 50단위로 절단한다. EDTA를 20mM까지 가하여 반응혼합물을 동일 용적의 클로로포름/페널(1 : 1)로 추출한다. 절단 플라스미드-DNA를 에탄올 2.5 용적을 가하여 침전시키고 10000g에서 10분 동안 원심분리하여 회수한다. 상등액은 버리고 펠렛은 물 50㎕에 용해시킨다. 프로브를 pH 6.9의 200mM 칼륨 카코딜레이트, 1mM CoCl, 2mM DDT, 10μM dGTP 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(Pharmacta P-L Biochemicals, Upsalla Sweden) 80단위를 함유하는 용액 150㎕중, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션한다. EDTA를 10mM까지 가하여 반응을 중단시키고 혼합물을 페놀/클로로포름(1 : 1)로 1회 추출한다. DNA를 에탄올로 침전시키고 10000g에서 원심분리하여 회수한다. DNA 펠렛을 TE 완충액 200㎕중에 용해 시키고 폭 3cm의 슬롯을 사용하여 TBE 완충액중의 0.8% 수평 아가로즈겔상에 로딩한다. 1V/cm에서 16시간 동안 전기영동시킨 후, 5V/cm에서 20분 동안 전기용출시키고 격렬하게 피펫팅하여 백으로부터 DNA를 회수한다. DNA를 페놀-클로로포름으로 추출하고 실시예 1에 기술된 바와 같이 에탄올-침전시킨다. 원심분리 후, DNA를 TE완충액중에 용해시켜 -20℃에서 보관한다.

실시예 11

IgE-수용체와 관련된 폴리펩타이드를 코드화하는 ds-cDNA를 함유하는 플라스미드의 제조 및 이를 사용한 이.콜라이 HB 101의 형질전환

실시예 9의 ds-cDNA 800ng를 pH 6.9의 200mM 칼륨 카로딜레이트, 1mM CoCl₂, 2mM DTT, 100pmol³H-dCTP 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(P-K Biochemicals) 12단위를 함유하는 용액 40㎕중, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션한다. EDTA를 10mM까지 가하여 반응을 중단시킨다. 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고 DNA를 에탄올로 침전시킨다. dc-테일링된 ds-cDNA를 물중에 용해시켜 -20℃에서 보관한다. TNE 완충액 200㎕중의 dC-테일잉된 ds-cDNA 50mg과 실시예 10의 dG-테일링된 pUC-KO 150mg의 혼합물을 65℃에서 5분, 55℃에서 60분 동안 인큐베이션한 다음 수욕 중에서 3 내지 5시간에 걸쳐 30℃로 서서히 냉각시킨다. 문헌(1)의 250페이지에서 기술된 바와 같이 염화칼슘으로 처리하여 형질전환을 위해 제조한 적당한 이.콜라이 HB 101 200㎕에 상기 어닐링 혼합물의 2㎕분취량을 가한다. 혼합물을 얼음상에 30분 동안 유지시킨 다음 2분 동안 42℃로 가열하고, SOC-배지 1ml로 희석시켜 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 10개 튜브의 내용물을 모아 2000xg에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 모은다. 각각의 세포 펠렛을 SOC-배지 1ml중에 재현탁시키고 LB-배지 및 50㎍/ml 암피실린을 함유하는 10cm의 한천 플레이트상에 분포시킨다. 플레이트를 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션한다. 형질전환된 클로니 약 5000개를 수득하며, 이들은 암피실린 내성을 갖는 것으로 특징지워진다.

실시예 12

인체 IgE-수용체 및 IgE-결합인자 관련-폴리펩타이드를 코드화하는 ds-cDNA를 함유하는 클론의 하이브리드-선별 해독에 의한 동정

실시예 11의 개개의 클로니를 100㎍/ml의 암피실린을 함유하는 Lb-브로쓰 2ml중에 포화 상태로 생육시킨다. 배양물 96개를 모아 알칼리 용해 방법(Maniatis, T, et al., p. 90(1)을 이용하여 플라스미드-DNA를 분리한다. 일칼리 변성된 플라스미드-DNA 100μg을 시드(Seed)의 문헌(20)의 방법에 따라 제조된 활성화된 ATP-셀룰로즈 50mg에 공유결합시킨다.

RPMI 8866 세포로부터의 polyA-mRNA(60μg)(실시예 1)을 300μl의 pH 6.4의 15mM EDTA, 600mM NaCl, 0.2% SDS 및 59% 포름아미드중에 용해시키고 온화하게 교반하면서 37℃에서 셀룰로즈-결합된 플라스미드-DNA에 16시간 동안 하이브리드화시킨다. 셀룰로즈를 50% 포름 아미드, 45mM NaCl, 4.5mM 나트름 시트레이트, pH 6.4의 20mM Pipes 및 1mM EDTA중에서 10회 세척한다. 100μl의 90% 포름아미드, 0.2% SDS, pH 6.4의 10mM Pipes, 5mM EDTA, 송아지 간 tRna 20μg/ml중, 65℃에서 2분 동안 2회 인큐베니션함으로써 하이브리드화 mRNA를 셀룰로즈로부터 용출시킨다. 용출된 mRNA를 엔탄올로 2회 침전시킨다. 각각의 푸울로부터 수득한 침전된 poly-mRNA를 물 6μl에 용해시켜 제노푸스 래비스 난모세포에 주입시 사용하며 실시예 3에 기술된 바와 같이 분석한다. 해독된 단백질을 실시예 7에 기술된 바와 같이 RIA로 스크리닝한다. 각각 96개의 클로니를 갖는 10개의 클로니를 갖는 10개의 푸울중 하나만이 양성이다. 이들 96개의 클로니를 8개의 클로니를 갖는 새로운 12개의 푸울과 조합하여 동일한 방법으로 스크리닝한다. 최종적으로, 개구리 난모 세포에서의 mRNA를 해독후 단백질이 RIA에서 양성 시그날을 나타내는 단일 콜로니를 동정한다. 이 클론을 100μg/ml의 암피실린을 함유한 LB-액체배지중에서 증식시킨다. 이 클로니로부터 플라 미드-DNA를 분리한다. 벡터 DNA와 ds-cDNA 삽입물사이의 양쪽 경계선을 절단하는 제한 효소인 Pstl으로 플라스미드 DNA 1μg을 분해시키고, 생거(Sanger)등의 문헌(21)의 디데옥시 쇄 말단 서열화 방법을 이용하여 cDNA 삽입물의 서열을 결정한다. 서열화는 서열화 키트(Amersham, N 4501 and N 4502)중에 함유된 시약을 사용하여, 문헌[Amersham handbook "M 13 cloning and sequenClng]에 상세하게 기술된 바에 따라 수행한다. ds-cDNA 삽입물의 길이는 417bp이며 그의 서열은 bp 878번 내지 bp 1395번의 서열식(Ⅱ)에 나타나있다. IgE-수용체 및 IgE-결합인자의 C-말단부를 코드화하는 ds-DNA는, 인체 IgE-수용체 또는 IgE-결합인자와 관련된 폴리펩타이드에 대한 모든 코드화 정보를 갖는 보다 긴 cDNA 클론을 제조하기 위해 하이브리드화시켜 스크리닝하는데 있어 DNA 프로브로서 사용된다.

실시예 13

인체 IgE-수용체에 대한 완전한 코드화 서열을 갖는 cDNA의 클로닝

실시예 1에 기술한 바와 같이, polyA-mRNA를 RPMI 8866 세포로부터 분리한다. cDNA 합성의 제 1단계는 실시예 2 내지 8에 따라 수행된다. 그 다음, 전체 길이의 ds-cDNA를 제조하기 위해 실험 공정을 변화시킨다. ss-cDNA를 물 32μl에 용해시킨다. ss-cDNA를 ss-cDNA 32μl(2.8μg),pH 7.0의 1M칼륨 카코딜레이트 10μl, 10mM CoCl_{2 5}μl, 1mM DTT 5μl 및 dCTP 1nmol을 함유하는 반응 혼합물 중에서 올리고-dc 테일로 연장시킨다. 37℃에서 5분 동안 예비인큐베이션한 후, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(81 단위, P-L Biochemicals) 3μl를 가하여 10분 동안 인큐베이션한다. TNE 완충액 50μl를 가하고 ss-cDNA를 클로로포름/페놀로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 공기건조시킨 다음, H₂O 15μl, RVT 완충액 25μl, dNTP 혼합물(각각 20mM의 dATP, dTTP 및 dGTP) 2.5μl 및 0.2mg/ml 올리고 dG_12-18(P-L Biochemicals) 5μl중에 용해 시킨다. 역전사효소(66단위, Promega biotec) 3μl를 가하여 혼합물을 42℃에서 90분 동안 인큐베이션한다. pH 7.5의 0.5M EDTA 2μl 및 TNE 완충액 50μl를 가하여 반응을 중단시키고 혼합물을 페놀-클로로포름(1 : 1) 0.15ml로 추술한다. 수상을 세파덱스 G50 컬럼(TNE 완충액중의 2.5ml)상에 적용시켜 ds-cDNA 1.1μl을 함유하는 통과 분획(0.4ml)를 모은다. ds-cDNA를 에탄올 침전시킨다. 생성된 펠렛을 물 32μl중에 용해시키고 ds-cDNA를 실시예 11에 기술된 바와 같이 방사선 표지된 올리고-dc 테일로 연장시킨다. pH 7.5의 0.5M EDTA 1μl를 가하여 반응을 중단시키고, 폭 0.5cm의 슬롯을 사용하여 샘플을 TBE 완충액중의 1% 수평 아가로즈 겔상에 로딩한다. 평행 슬롯에 박테리오 파아지 람다 DNA(EcoRI 및 Hind Ⅲ로 분해) 1μg을 로딩하여 이를 크기 표지물로 한다. 2.5V/cm에서 2시간 동안 전기영동 한 후, 겔을 애티듐 브로마이드 0.5μg/ml를 함유하는 TBE 완충액에 침지시켜 ds-DNA를 염색시킨다. 대략 1.4 내지 2킬로 베이스 크기의 ds-cDNA를 함유하는 영역을 절단하여 물에 미리 침지시킨 2개의 마이크로-콜로듐 백(Sar-torius)에 넣는다. 물 0.3ml를 가하고 반-농축 TBE 완충액을 함유하는 수평 전기 영동 장치(Bio-Rad)상에 백을 위치시킨다. ds-cDNA를 5V/cm에서 20분 동안 전기 용출시키고 격렬하게 피펫팅하여 백으로부터 ds-cDNA를 회수한다. ds-cDNA를 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 원심분리한 후, ds-cDNA를 TNE 완충액 100μl중에 용해시켜 ds-cDNA 100ng을 수득한다(방사능으로부터 측정 ).

실시예 14

poly(dC) 테일을 갖는 ds-cDNA에 poly(dG) 테일을 갖는 dG-테일링된 pUC-KO의 어닐링 및 수득된 하이브리드를 사용한 이. 콜라이의 형질전환

ds-cDNA 40μl(실시예 13의 크기-분획화된 물질 40ng)를 실시예 10으로부터 수득한 올리고-dG_10-20테일링된 pUC-KO 플라스미드-DNA 16μl(200ng) 및 TNE 완충액 194μl와 혼합하여 65℃에서 10분, 46℃에서 1시간 및 실온에서 1시간 동안 연속적으로 인큐베이션한다. 어닐링된 DNA를 사용하여, 실시예 11에 기술된 바와 같이 형질전환을 위해 제조한 컴피턴트 이.콜라이 HB 101 세포(균주 LM 1035)를 형질전환시킨다. 어닐링 혼합물 2μl의 분취량을 컴피턴트 세포 200μl를 함유하는 평행 튜브에 가한다. 튜브를 얼음상에 30분 동안 방치한다. 42℃에서 90초 동안 열쇼크를 가한 후 얼음 상에서 2분 동안 냉각시키고, 튜브당 SOC 매질 0.8ml를 가한 다음 37℃에서 60분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션한 후, 10개의 튜브로 부터의 내용물을 모은다. 2000g에서 5분동안 원심분리하여 세포를 모아 암피실린 100μg/ml를 함유하는 맥 콘키 한천 플레이트(직경 15cm)상에 도말한다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션한다. 평판당 약 1000개의 암피실린 내성 콜로니를 얻는다. 이들을 나일론 막(Pall-Biodyne, Glen Cove, New York-USA)상에 옮기고 콜로니가 위를 향하도록 나일론 막을 맥콘키 한천 플레이트 상에 적재한다. 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션한 후, 나일론 막 상에서 두 개의 레플리카를 만든다. 기본 막을 4℃에서 한천 플레이트상에 보관한다. 클로니 하이브리드화를 위해, 레플리카를 0.5M NaOH, 1.5M NaCl로 포화시킨 3MM 페이퍼(Whatman Ltd., Maidstone,U.S.A)상에 5분 동안 및 pH 8.0의 0.5M 트리스-HCl, 1.5M NaCl로 포화시킨 페이퍼상에 10분 동안 연속적으로 위치시켜 처리한다. 각각의 인큐베이션 사이에 필터를 Whatman 3MM 건조 필터상에 블로팅한다. 레플리카 필터를 진공 오븐중 80℃에서 베이킹하여 즉시 DNA 하이브리드화에 사용한다.

실시예 15

필터 하이브리드화

실시예 12의 양성 클론으로부터 수득된 IgE-수용체의 일부를 코드화하는 플라스미드 10을 Pst I 제한 엔도 뉴클레아제로 분해시켜 cDNA 삽입물을 제조한다. TBE완충액중의 1.5% 아가로즈 겔을 통해 전기영동시켜 cDNA 삽입물(450bp)을 pUC-KO 벡터 DNA(2900bp)로부터 분리한 다음 실시예 13에 기술된 바와 같이 전기용출 시키고 에탄올로 침전시켜 이를 회수한다. Amersham(N.5000)으로부터 공급된 닉크(nick) 해독 시스템을 사용하여 공급자에 의해 주어진 지시사항에 따라 순수한 cDNA 삽입물(200ng)을 방사선 표지한다. 방사선 표지된 cDNA 프로브는 5×10⁸dpm/μg의 특이 활성을 갖는다. 방사선 표지된 mRNA를 95℃에서 10분 동안 인큐베이션하고 즉시 얼음 상에서 냉각시켜 변성시킨다. 실시예 14의 레플리카 필터를 밀봉 플라스틱 백 속에서 0.9M NaCl, pH 8.0의 0.18M 트리스-HCl, 6mM EDTA, 0.02% 피콜(Ficoll) 400, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% BSA, 0.2% SDS 및 변성된 송아지 흉선 DNA 50μg/ml를 함유하는 용액 100ml로 2시간 동안 예비하이브리드화시킨다. 열-변성된 방사선 표지된 cDNA 삽입물로 보충시킨 동일한 용액 5ml를 함유하는 밀봉 플라스틱 백 속에서 밤새 하이브리드화시킨다. 하이브리드화시킨 후, 필터를 2xSSC/0.2% SDS 중에서 세척한 다음 65℃에서 0.2xSSC/0.2% SDS 200ml로 3회 세척한다. 필터를 건조 시키고 코닥 X-선 필름(XAR-5)에 밤새 노출시킨다. 필터를 자동 방사선 사진으로 배열할 수 있도록 필터를 방사능 잉크로 표지한다. 두 개의 야성 클론이 발견되며, 이들의 DNA를 IgE-수용체를 코드화하는 방사선 표지된 DNA 단편에 하이브리드화 시킨다. 이들은 pCL-1 및 pCL-2로 명명된다.

실시예 16

pCL1-및 pCL2-DNA의 분리 및 분석

pCL1 alc pCL2 클론을 생육시킨 다음, 알칼리 용해 방법(Maniatis. T., et al.m, (1) p. 90)을 이용하여 이들의 플라스미드 DNA를 분리한다. 벡터 DNA 및 DNA 삽입물 사이의 경계선에서 cDNA를 절단하는 Pst I 효소로 DNA를 분해시킨다. 전기 영동시켜 단편을 분리하고 실시예 13에 기술된 바에 따라 전기 용출시켜 완전한 삽입물을 분리한다. 문헌(Amersham handbook)에 상세하게 기술된 생거 등의 방법(21)을 이용하여 이들 두 개의 플라스미드의 cDNA 삽입물을 완전하게 서열화 한다. 제한 분석 및 서열 분석이 제 2도 및 서열식(Ⅱ)에 요약되어 있다.

실시예 17

IgE-수용체와 관련된 cDNA의 전사에 적합한 플라스미드로의 이동

pCL-2 플라스미드 DNA 10μg를 제한 효소 Pst I 및 Hinc Ⅱ (Boehringer Mannheim)으로 분해시킨다. 1.5Kb cDNA 삽입물 및 2.9kb 플라스미드 벡터 DNA를 폭 3cm의 슬롯을 사용하여 TBE 완충액중의 1% 아가로즈 겔 상에서 분리한다. 1V/cm에서 16시간 동안 전기영동시킨 후, 실시예 13에 기술된 바와 같이 전기용출시켜 DNA를 회수한다. 이와 병행하여 플라스미드 pGEM^TM-1을 Pst I 및 Hinc Ⅲ 으로 분해시키고, 페놀/클로로포름으로 1회 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 1.5Kb cDNA 삽입물 10ng과 Pst I으로 절단된 pGEM^TM-1 10ng을 10μl의 용적으로 15℃에서 4시간 동안 연결시킨다. 반응 혼합물은 pH 7.5의 10mM 트리스-HCl 외에 10mM Mgcl₂, 2mM DTT, 0.1mM ATP 및 T₄리가제(Boehringer Mannheim) 100 단위를 함유한다. 혼합물 5μl를 사용하여, 문헌(1)의 250페이지에 기술된 바와 같이 컴피턴트 이.콜라이 HB101(균주 LM 1035)을 형질전환시킨다. 약 100개의 암피실린 내성 콜로니를 얻는다. 24개의 콜로니를 생육시키고 플라스미드 DNA를 배양물로부터 분리한다. 각각의 배양물로부터의 플라스미드 약 1μg을 Hind Ⅲ로 분해시키고, Hind Ⅲ로 분해 시킨 람다 DNA(PharmaCla, Sweden)를 크기 표지물로서 사용하여, 분해된 DNA 단편의 길이를 1% 아가로즈 겔 상에서 분석한다. 다수의 콜로니의 플라스미드 DNA를 분해하여 1.0Kb 및 3.3Kb 길이의 DNA 단편을 얻는다. 이들 플라스미드는 pGEM^TM-1/CL2로 명명된다(참조 : 제 3)도. 이들은 pGEM^TM-1 벡터 DNA상에 T₇폴리머라제 프로모터에 인접한 IgE-수용체의 아미노 말단을 갖는다.

실시예 18

IgE-수용체와 관련된 cDNA의 전사

실시예 17의 플라스미드 pGEM^TM-1/CL2 10μg을 재한 효소 Rsa I (Boehringer, Mannheim)으로 분해시킨다. 0.5M EDTA 5μl을 가하여 혼합물을 페놀/클로로포름(1 : 1, V : V)으로 1회 및 클로로포름으로 1회 추출한다. DNA를 에탄올로 침전시켜 농축시키고 TE 완충액 20μt중에 용해시킨다. pH 7.5dml 40mM 트리스-HCl, 6mM MgCl₂, 2mM 스퍼미딘, 10mM Nacl, 10mM DTT, 1단위/μl RNasin, 0.5mM dNTP 및 리보프로브 T₇RNA 폴리머라제(Promega Biotec) 20단위를 함유하는 용액 100μl에 DNA 용액 4μl을 가한다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. RNA 합성 반응시킨 후, RQI TM DNAse(Promega Biotec) 2단위률 가하여 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 혼합물을 페놀/클로로포름으로 1회 및 클로로포름으로 1회 추출하고 에탄올로 침전시켜 새로 합성된 RNA를 회수한다. RNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 최종적으로 물 20μl중에 용해시킨다.

실시예 19

개구리 난모세포에서 플라스미드-유도된 IgE-수용체 mRNA의 해독 및 IgE-수용체 단백질의 검출

실시예 18에서 수득한 mRNA를 사용하여 실시예 3에 기술된 바와 같이 개구리의 난모 세포에 직접 주입한다. 실시예 7에 기술된 바와 같이 RIA로 IgE-수용체 단백질의 합성을 시험한다. 실시예 1의 poly-mRNA를 대조용 샘플로 사용한다. 그 결과가 다음 표에 나타나 있다.

실시예 20

IgE-결합인자 활성을 갖는 폴리펩타이드의 이.콜라이에서의 발현을 위한 플라스미드 pFK-1과 pFK-2의 조립

IgE 결합인자와 관련된 폴리펩타이드를 이.콜라이에서 생성시키고 분비하는 플라스미드를 작제하여, 막 고정체를 포함하는 위치 Met₁에서 Ala₁₁₈또는 Glu₁₃₃의 아미노 말단 영역을 결실시킨다. pCL-2 플라스미드-DNA 10μg을 제한효소 Hinc Ⅱ 및 Rsa I 으로 분해시킨다. 1.6, 1.25, 0.72, 0.46 및 0.23KB의 단편을 수득하여 TBE 완충액중의 1% 아가로즈 겔을 통해 전기영동시켜 분리한다. 실시예 13에 기술된 바와 같이, 1.25Kb DNA 분획을 회수한다. 이와 병행하여, 플라스미드 pGEM_TM-1 10μg을 50μl pH 7.6의 10mM 트리스-HCl, 50mM NaCl, 10mM MgCl₂및 5mM DTT중의 Hinc Ⅱ (Boehringer) 20단위로 선형화시킨다. 37℃에서 2시간후, 반응 혼합물을 pH 8.5의 1M 트리스-HCl 50μl, H₂O 10μl 및 송아지의 장으로 부터 얻은 알칼리 포스파타제(Boehringer) 20단위로 보충시켜 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 혼합물을 페놀-클로로 포름으로 3회 추출한 다음, TBE 완충액중의 1% 아가로즈 겔을 통해 전기영동시킨다. 실시예 13에 기술된 바와 같이, 전기 영동시켜 플라스미드 DNA를 겔로부터 회수한다. 1.25Kb의 cDNA 단편 10ng 및 Hinc Ⅱ로 절단된 pGEM^TM-1 10ng을 15℃에서 10μl의 용적으로 10시간 동안 연결시킨다. 반응 혼합물은 pH 7.5의 10mM 트리스-HCl 외에 10mM MgCl₂, 2mM DTT, 0.5mM ATP 및 T₄-리가제(Boehringer) 100단위를 함유한다. 혼합물 5μl을 사용하여 문헌(1)의 250페이지에 기술된 바와 같이, 컴피턴트 이.콜라이 HB 101 세포를 형질 전환시킨다. 박테리아를 100μl/ml의 암피실린으로 보충시킨 한천 플레이트 상에 도달한다. 암피실린 내성 콜로니를 약 50개 얻는다. 24개의 클로니를 증식시켜 각각의 배양물로부터 플라스미드 DNA를 분리한다. 각각의 배양물로부터의 플라스미드 DNA 약 1μg을 Hind Ⅱ으로 분해시키고 크기 표지물로서 Hind Ⅲ 분해된 람다 DNA(PharmaCla, Sweden)를 사용하여 분해된 DNA 단편의 길이를 분석한다. 몇몇 클로니의 분해된 플라스미드 DNA는, 단편 삽입의 두 개의 가능한 배향에 상응하는 0.5kb 및 3.6kb의 DNA 단편과 0.7kb 및 3.4kb의 몇몇 다른 단편을 제공한다. 이들 플라스미드를 각각 pCAL-3 및 pCAL-4로 명명하였다(제 4도). pCAL-3은 클론 하나와 pCAL-4 클론 하나를 생육시켜 문헌(1)의 90페이지에 기술된 바와 같이, 알칼리 용해 방법을 사용하여 플라스미드 DNA를 분리한다. pCAL-4 플라스미드 DNA 10μg을 Hind Ⅲ으로 분해시키고 pCAL-3 플라스미드 DNA 10μg을 BgⅢ 및 BamH I 제한 효소로 분해시킨다. 전기영동시켜 단편을 분리하고 실시예 13에 기술된 바와 같이 전기용출시켜 0.8kb Bgl Ⅱ 내지 BamH I 및 0.75kb Hind Ⅲ 내지 Hind Ⅲ 단편을 회수한다. 이와 병행하여, pIN-Ⅲ-ompA-2 플라스미드 DNA(Gharayeb et al. (5)) 10μg 및 pIN-Ⅲ-ompA-3 플라스미드 DNA 10μg을 각각 Hind Ⅲ 및 BamH I 으로 분해시킨다. 이들 두 개의 플라스미드는 ompA 단백질의 시그날 펩타이드를 코드화 하는 서열에 융합된 2개의 판독 프레임으로 외래 DNA 단편의 클로닝을 가능케 하는 이.콜라이 에서의 잘 알려진 분비 클로닝 벡터이다. 그 다음, 선형화된 플라스미드를 송아지의 장으로부터 얻은 알칼리 포스파타제로 처리하고 상기 기술한 바와 같이 선형 DNA를 0.8% 아가로즈 겔상에서 정제한다. Hind Ⅲ 으로 절단된 pIN-Ⅲ-ompA-2 10ng 및 0.8kb의 Hind Ⅲ 내지 Hind Ⅲ 단편 10ng(혼합물 1), 및 0.75kb의 Bgl Ⅱ 내지 BamH I 10ng과 함께 BamH I으로 절단된 pIN-Ⅲ-ompA-3(혼합물 2)을 함유하는 두개의 결합 혼합물을 20μl의 용적으로 고정시킨다. 반응 혼합물은 pH 7.5의 10mM 트리스-HCl 외에 10mM MgCl₂, 2mM DTT, 0.1mM ATD 및 T₄리가제(Boehringer mannbein) 100단위를 함유한다. 15℃에서 12시간 후, 혼합물 5μl를 사용 하여 문헌(1)의 250페이지에 기술된 바와 같이 컴피턴트 이.콜라이 HB 101 세포를 형질전환시킨다. 암피실린 내성 클로니 50 내지 100개를 혼합물(1) 및 혼합물(2)로부터 수득한다. 각각의 혼합물로부터의 12개의 콜로니를 생육시키고 플라스미드 DNA를 배양물로부터 분리한다. 각각의 배양물로부터의 플라스미드 DNA 약 1μg을 Pst I 및 EcoR I (혼합물 1의 경우) 및 BamH I 및 EcoR I (혼합물 2의 경우)으로 분해시킨다. DNA 단편의 길이를 크기 표지물로서 Hind Ⅲ 분해된 람다 DNA(PharmaCla, Sweden)를 사용하여 1% 아가로즈 겔상에서 분석한다. 혼합물(1)로부터 유도된 몇몇 플라스미드는 0.75Kb 단편을 생성한다. 이들 플라스미드를 pFK-2로 명명하였다. 이들은 ompA 시그날 서열에 융합된 IgE-수용체의 아미노산 Ala₁₃₄내지 Ser₃₂₁을 코드화하는 DNA를 함유한다. 유사하게 혼합물(2)로부터 유도된 몇몇 플라스미드도 0.8kb 단편을 생성한다. 이들 플라스미드를 pFK-1으로 명명하였다. 이들은 ompA 시그날 서열에 융합된 아미노산 Asp₁₁₉내지 Ser₃₂₁을 코드화하는 DNA를 함유한다.

실시예 21

플라스미드 pFK-1 및 pFK-2를 수반하는 이.콜라이에서 IgE-결합인자와 관련된 폴리펩타이드의 검출

대조용으로 플라스미드 pFK-1, pFK-2 및 플라스미드 pIN-Ⅲ- ompA-2 10ng을 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 BZ 234 및 이.콜라이 B1472를 형질감염시킨다. 문헌(1)의 250페이지에 기술된 바와 같이 컴피턴트 세포를 제조하여 형질감염시킨다. 형질감염된 각각의 세포로부터 암피실린 내성 콜로니 100개 이상을 수득한다. 하나의 콜로니를 암피실린 100μg/ml로 보충시킨 LB-브로쓰 2ml에 옮겨 37℃에서 밤새 생육시킨다. 배양물 1ml를 암피실린 100μg/ml로 보충시킨 LB-브로쓰에 옮긴다. 37℃에서 격렬하게 진탕시키면서(250rpm) 세포를 생육시킨다. 4,7,10 및 24시간 후, 분취량 10ml를 제거한다. 분취량을 즉시 처리한다. 실온, 1000g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 모은다. 상등액은 버리고 세포를 20% 슈크로즈 2.5ml, pH 8.0의 0.1M xmfltm-HCl에 현탁시킨다.

혼합물을 실온에서 20분 동안 방치하고 다시 원심분리하여 세포를 모은다. 상등액은 버리고 세포를 빙-냉수 1.5ml에 현탁시킨다. 혼합물을 얼음상에서 20분 동안 인큐베이션시키고 4℃, 12000g에서 10분 동안 원심분리한다. 상등액 5μl를 HBSS-FCS 100μl에 가하고 이들 샘플을 실시예 7에 기술된 바와 같이 분석한다. 대조용으로 pIN-Ⅲ-ompA-2를 사용한다. 그 결과는 다음과 같다.

상기 값은 실시예 7에 기술된 바와 같이 RIA로 측정된 웰당 cpm이다. 웰당 방사능 입력은 325000cpm 이다.

실시예 22

IgE 결합인자 단백질 정제용 면역친화성 겔의 제조

Affi-Gel^R10물질(Bio-Rad)을 냉증류수 및 pH 8.0의 커플링 완충액(0.1M NaHCO₃용액)으로 제조업자에 의해 지시된 사항에 따라 세척한다. 커플링 완충액 2ml중의 50% 겔현탁액을 플라스틱 튜브에 도입시켜 Mab-135 또는 Mab-176을 함유하는 동일 용적의 용액과 혼합하여 혼합물을 실온에서 4시간 동안 회전시킨다. 겔을 커플링 완충제로 다시 세척한다. 유리된 활동 부위를 차단하기 위해, 겔을 실온에서 pH 8.0의 1M 에탄올아민-HCl 0.1ml로 처리하고, 10mM 나트륨 아지드를 함유하는 PBS로 세척하여 4℃로 유지시킨다.

실시예 23

형질전환된 세포의 발효 및 박테리아 배양물로부터 IgE 결합인자 단백질의 분리

실시예 20으로부터 수득한 플라스미드 pFK-1을 함유하는 이.콜라이 BZ 234의 콜로니 하나를 암피실린(100μg/ml)으로 보충시킨 LB-브로쓰 10ml에 옮겨 37℃에 서 밤새 격렬하게 진탕시키면서 증식시킨다. 배양물 1ml 분취량을 각각 암피실린(100μg/ml)으로 보충시킨 LB-브로쓰 800ml를 함유하는 6개의 플라스크에 옮긴다. 세포를 37℃에서 격렬하게 진탕시키면서(250rpm) 8시간 동안 생육시키고 실온에서 1000g으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 모은다. 상등액은 버리고 세포는 20% 슈크로즈, pH 8.0의 30mM 트리스-HCl 및 1mM EDTA를 함유하는 용액 300ml에 현탁 시킨다. 현탁액을 실온에서 20분 동안 방치한 다음 다시 원심분리하여 세포를 모은다. 상등액은 버리고 세포는 빙-냉수 200ml에 현탁시킨다. 현탁액을 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션하고, 소르발 원심 분리기의 로우터로 4℃에서 10000xg으로 15분 동안 원심분리한다. 상등액을 주의해서 회수하여(약 180ml) 나트륨 아지드(0,1mg/ml)로 보충시켜 날겐(Nalgene^R) 멸균 필터 단위(0.2마이크론 : Nalge Company, Rochester, N. Y., USA)를 통해 여과한다. 여액을 실시예 22에 기술된 바와 같이 수득된 Mab-135 또는 Mab-176 커플링 Affi-Gel^R10의 칼럼 2ml상에 50ml/시간의 유속으로 로딩한다. 겔을 0.5% NaCl 및 0.05% 트윈 20으로 보충시킨 PBS 20용적, PBS 5용적 및 0.9% NaCl 5용적으로 연속적으로 세척한다. 280nm에서 흡광도를 측정하여 세척 용액중의 단백질 함량을 스크리닝함으로써 결합되지 않은 단백질을 완전히 제거한다. 그 다음, 각각 0.1M 글리신-HCl, pH 2.6의 0.1M HCl을 함유하는 용액 1ml 분취량으로 컬럼을 용출시킨다. 단백질을 함유하는 용액을 모아 1M 트리스로 중화시킨다.

본 발명의 정제된 폴리펩타이드를 ISCO 전기영동 농축기 모델 1750(Isco Inco 및 3.5KD를 차단하는 스펙트라포르(Spectrapor^R) 막(Spectrum Medical Industries)으로 처리하여 농축액을 수득한다. 용액을 pH 8.3의 25mM 암모늄 아세테이트에 대해 투석시키고, 농축시켜 0.2ml 용적이 되게 한다. 정제된 단백질을 다음과 같이 분석한다. 분획을 라엠리(Laemmli) 완충액과 함께 인큐베이션한 다음, 12% SDS-PAGE를 사용하여 개개의 단백질로 분리하여 BioRad 조작법에 따라 은 염색시킨다. 분자량 약 25KD의 단백질이 검출된다. 이들을 0.12 암페어에서 전달 완충액으로 4시간 동안 전기영동시켜 니트로셀룰로즈 막에 옮긴다. 막을 10% FCS를 함유하는 트리-완충 염수로 차단시킨다. 스트립을 절단하고 각각 10μg/ml에서 Mab-135 및 Mab-176과 반응시킨다. 6시간 동안 인큐베이션시킨후, 스트립을 세척하고 양고추냉이 퍼옥시다제염소 항-마우스 IgE와 밤새 반응시킨다. 스트립을 세척하여 BioRad 조작법에 따라 4-클로로-1-나프롤(퍼옥시다제 기질)로 전개시킨다. 각각의 Mab-135 및 Mab-176 모노클로날 항체가 25KD 단백질 단편과 반응한다.

실시예 24

파이지 λ의 프로모터 P_L의 조절하에 이.콜라이에서 IgE-결합인자 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현

24. 1

발현 플라스미드의 작제

중간 벡터로서 플라스미드 pHRi148(유럽 특허원 제EP146785호)을 사용한다. pHRi148 플라스미드 DNA 10μg을 NcoI으로 분해시킨 다음, 클레나우 폴리머라제 및 dNTP(50μM)로 처리하여 말단을 무디게 한다. DNA를 BamH I으로 더 분해시키고 알칼리 포스타파제로 처리한다. 아가로즈 겔 전기영동시켜 4.3Kb 벡터 DNA를 분리시킨다. 이와 병행하여 pCAL3 플라스미드 10μg(실시예 20)을 Bdl Ⅱ 로 절단시킨 다음, 클레나우 폴리머라제 및 dNTP(50μM)로 처리한다. DNA를 BamH I 으로 더 절단시키고 아가로즈 겔 전기영동시켜 0.78Kb 삽입 DNA 단편을 분리한다. 정제된 벡터 10ng 및 정제된 삽입 DNA 3ng을 결합시켜 이 혼합물을 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 HB 101 세포를 형질전환시킨다. 정확한 재조합 플라스미드를 갖는 클론을 제한 효소 분석을 기초로하여 선별한다(제 5도).

정확한 플라스미드 DNA 10μg을 BamH I 및 EcoR I 으로 분해시킨다. 아가로즈 겔 전기영동시켜 0.79Kb 삽입물 DNA를 분리한다. 이와 병행하여 pPLc24 플라스미드 DNA[Remaut. E. et al., (1981), GENE, 81-93] 10μg을 EcoR I 및 BamH I으로 분해시킨 다음, 알칼리 포스파타제로 처리하고 아가로즈 겔 전기영동시켜 2.9Kb 벡터 DNA를 정제한다. 2.9Kb 벡터 DNA 10ng 및 0.79Kb 삽입 DNA 3ng을 연결시켜 이를 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 K12 세포를 형질전환시킨다. 표준 제한 분석을 수행하여 정확한 플라스미드를 선별한다(pPL-BF 제 5 도). 이 플라스미드는 열 유도성 P_L프로모터의 아래에 서열식(I)의 폴리펩타이드의 아미노산 119번에서 321번을 코드화하는 서열식(Ⅱ)의 DNA 서열을 함유한다. 플라스미드 pHRi148에서의 중간 클로닝 단계중에 가해진 메티오닌이 119번 아미노산의 앞에 온다.

플라스미드 pPL-BF를 사용하여 λCl857을 수반하는 이. 콜라이 균주 W3110 및 HB101를 형질전환시킨다(Remaut et at., 상기 참조). 형질전환체를 카나마이신 및 암피실린 40μg/mg을 함유하는 LB-플레이트에 도말하고 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션하여 생육시킨다. 생성된 재조합 콜로니를 사용하여 발효시킨다.

24. 2

발효

실시예 24. 1에서 수득한 재조합 이.콜라이 균주를 암피실린 및 카나마이신 40μg/ml을 함유하는 LB-브로쓰중, 30℃에서 밤새 생육시킨다. 배양물을 동일한 동일 배지로 1 : 5로 회석시켜 42℃에서 4시간 동안 인큐베이션한다. 원심분리하여 세포를 모은다.

24. 3

IgE-결합 활성을 갖는 폴리펩타이드의 정제

실시예 24. 2의 박테리아 펠렛으로부터 제조한, pH8.0의 Hepes 50mM, NaCl 30mM 및 0.1% 에탄올아민중의 세포현탁액(OD₆₅₀=20) 22.5ml를 우레아 18g과 혼합한다. 현탁액을 9.5mm 프로브 및 24마이크론 진폭을 사용하여 MSE 소니 프레프(Soniprep^R) 150으로 30초 간격으로 3×30초간 초음파 처리한다. 용해물을 소르발 SS34 로우터로 20""으로 17000rpm으로 30분 동안 원심분리시켜 청명하게 한다. 상등액 4℃에서 pH 7.5의 10mM Hepes 및 130mM NaCl의 3가지 변화물에 대해 투석시킨다. 투석물을 SS34 로우터(Sorvall)로 4℃에서 17000rpm로 원심분리시켜 청명하게하여 상등액을 나트륨 아지드(0.1mg/ml)로 보충시킨다. IgE-결합 활성을 갖는 폴리펩타이드를 더 정제하여 상기 실시예 22 및 23에 기술된 바와 같이 분석한다.

실시예 25

효모 삭카로마이세스 세레비지애에서의 IgE-결합인자 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현

25. 1

발현 플라스미드 pJDB 297R/PH0.5-BF의 작제(제 6 도)

벡터 DNA를 제조하기 위해, 플라스미드 DNA pJDB 207R/PH0.5-TPA(12-2)(유럽 특허원 제 EP143081호) 10μg을 BamH I 으로 완전히 분해시킨다. 분해된 DNA를 알칼리 포스파타제로 처리한다. 커다란 6.85Kb BamH I 단편을 TBE 완충액중의 1% 아가로즈 겔상에서 작은 단편으로부터 분리하고 전기영동시킨 6.85Kb DNA 단편을 겔로부터 회수한다. 유도성 PH0.5 프로모터 및 PH0.5 시그날 서열을 코드화 하는 DNA 단편을 플라스미드 pJDB207/PH0.5-TPA 18(유럽 특허원 제143081호)로부터 유도한다. 이 플라스미드 50μg을 BamH I 및 Hind Ⅲ로 완전히 분해시켜 2.3Kb 단편을 분리한다. 단편 5μg을 Bal I 으로 더 분해시켜 0.58Kb 단편을 분리한다. 상기 기술한 벡터 DNA 20ng, 0.58K 단편 4mg, pCAL3으로 부터 유도된 0.8Kb Bgl Ⅱ/BamH I cONA 단편(실시예 20) 8ng 및 헥산 서열 5' pCCAATGCA-3'/3'GCTTACGTCTAGp-5'을 갖는 화학적으로 합성한 ds DNA 링커 0.1ng을 혼합하여 20μl 용적으로 15℃에서 24시간 동안 연결시킨다. 연결된 DNA를 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 HB101 세포를 형질전환시킨다. 암피실린-내성 콜로니 약 200개의 플라스미드 DNA를 제한 효소 분해시켜 분석한다. 목적하는 배향으로 세개의 삽입 DNA 단편 모두을 갖는 몇몇 콜로니가 발견되었다(플라스미드 pJDB207R/PH0.5-BF, 제 6 도). PH0.5 시그날 서열 사이의 접합점에서의 작제물, 화학적 합성링커 DNA 및 IgE-BF cDNA의 정확학 구조물을 서열화에 의해 입증한다.

25. 2

효모의 형질전환 및 발효

힌넨(Hinnen) 등의 문헌(Pro. Natl. Acad. SCl. USA 1978, 75, 1979)에 기술된 형질전환 프로토콜을 이용하여, 플라스미드 pJDB207R/PH0.5-BF를 삭카로마이세스 세레비지애균주 GRF18로 형질전환시킨다. 형질전환된 효모 세포를 루이신 결핍 효모 최소 배지 플레이트에서 선별한다. 단일 형질전환된 효모 콜로니을 분리하여 이를 삭카로마이세스 세레비지애 GRF18[pJDB207R/PH0.5-BF]로 칭한다. 형질 전환된 효모세포를 2% 글루코즈, L-히스티딘 20mg/l 및 L-아스파라긴 10g'l을 가한 효모 최소 배지(아미노산이 없는 Difco Yeast Nitrogen Base) 5ml에서 30℃에서 진탕시키면서 25시간 동안 생육시켜 3×10⁷개 세포/ml 밀도가 되게한다. 이 세포를 0.9% NaCl 중에서 세척한 다음, 디프코 효모 질소 염기(Difco Yeast Nitogen Base) 배지(아미노산 없음)의 배합에 따라 0.03g/1 KH₂PO₄, 1g/l KCl, (NH₄)₂SO₄대신 10g/l의 L-아스파라긴, 2% 및 1g/1 L-히스피딘을 포함하는 낮은 Pi 최소 배지 100ml에 접종시킨다. 배지를 출발시 OD₆₀₀이 0.25가 되게 접종시킨다. 세포를 30℃에서 48시간까지 생육시켜 약 10의 OD₆₀₀에서 수거 한다.

낮은 Pi 배지 35ml의 세포를 원심분리하여 모아 pH 7.4의 냉각된 66mM 인산나트륨 완충액 및 0.1%(V/V) 트리톤 X-l00^R의 총용적 4ml중에 재현탁시킨다. 세포현탁액을 30ml 코렉스(Corex) 듀브에 옮긴다. 유리비드(직경 0.4mm) 8g을 가하고 현탁액을 보텍스 믹서(Vortex Mixer, SClentific Instruments Inc., USA) 상에서 전속력으로 4분 동안 진탕시킨 다음 빙욕 중에서 냉각시킨다. 이 공정으로 세포 90% 이상이 파괴된다. 세포 파편 및 유리 비드를 소르발 HB 4 로우터로 8000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 침강시킨다. 실시예 22 및 23에 기술된 바와 같이 친화성 크로마토그라피를 이용하여, IgE-결합인자 활성을 갖는 폴리펩타이드를 상등액으로부터 정제한다.

실시예 26

IgE-결합 활성을 갖는 폴리펩타이드 발현용 플라스미드 pCAL5-R/ND 및 pCAL8-BF/ND의 배양된 포유동물 세포에서의 조립

플라스미드 pCAL5-R/ND 및 pCAL8-BF/ND의 작제를 기술한다(참조 : 제 7도). 이 플라스미드는 배양된 포유동물 세포에서 막-결합된 IgE 수용채 또는 분비되는 IgE-결합 인자의 생성을 가능하게 한다. 또한, 이들 플라스미드는 숙주 세포에서 유전자 증폭의 선별을 위해 고안되었으며 이로써 목적하는 폴리펩타이드를 고수율로 생성한다.

26. 1

플라스미드 pCAL5의 작제

플라스미드 pSV2911neo[Asselbergs, F.A.M. et al., (1986) J. Mol. Biol, 189, 401-411]을 사용하여 베터 DNA를 제조한다. 이를 제한효소 Hind Ⅲ 및 Sal I 으로 분해시켜 3.9 및 1.8Kb의 단편을 수득한다. 혼합물을 알칼리 포스타파제로 처리하고 1% 아가로즈 겔을 통해 전기영동한 후, 3.9Kb 단편을 분리한다.

이와 병행하여, 각각 IgE 수용체 및 래비트 베타-글로빈 유전자의 3'-절반을 코드화하는 두 개의 DNA 삽입물을 제조한다. 한편으로는, 플라스미드 pCAL3(실시예 20, 제 4 도) 10μg을 Hind Ⅲ로 부분적으로 분해시키고 BamH I 으로 완전히 분해시킨다. 아가로즈 겔 전기영동 및 겔 용출시켜 1.26Kb의 cDNA 삽입물을 분리한다. 한편으로는, 플라스미드 pUβ[Weber, F. and Schaffner, w. (1985) Nature 315, 75-77] 10μg을 BamH I 및 Sal I으로 완전히 분해시킨다. 1.2Kb DNA단편을 분리한다. 이 단편은 거대 인트론 및 래비트 베타-글로빈 유전자의 poly(A) 시그날을 함유한다.

상기 벡터 DNA 10ng과 각각의 삽입 DNA 10ng을 결합시킨다. 생성된 DNA을 사용하여 컴피턴트 이. 콜라이 HB 101을 형질감영시킨다. 두 개가 DNA 삽입물을 벡터 DNA에 삽입시킨 후 예상되는 바와 같은 제한 패턴을 나타내는 재조함 플라스미드(pCAL 5, 제 7 도)을 선별한다.

26. 2

플라스미드 pCAL5-R/ND의 작제

pCAL5 플라스미드 DNA 10ng을 Sal I 으로 분해시킨다. 단 1번 절단시켜 완전한 길이를 나타내는 DNA 분자를 아가로즈 겔 전기영동시켜 정제한다. 이와 병행하여, pND2 플라스미드 DNA 10μg(Asselbergs et at., 상기 참조)을 Xho I 및 Sal I으로 완전히 절단한다.

이 플라스미드는 포유동물 숙주의 게놈상에 외래 DNA의 이입 및 증폭을 각각 선별할 수 있게 하는 두 개의 선별 표지물인 네오마이신(neo) 및 다하이드로 폴레이트 환원효소(dhfr)를 함유한다. 절단된 pND2 DNA를 알칼리 포스파타제로 처리한 다음, Sal I -절단된 pCAL5 10ng 및 Sal I /Xho I -절단된 pND2를 플라스미드 DNA 10ng을 혼합하여 연결시킨다. 생성된 DNA를 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 HB101 세포를 형질전환시킨다. 형질전환된 세포를 LB-브로쓰 및 50μg/ml 카나마이신을 함유하는 한천 플레이트상에 분포시킨다. 포유동물 숙주에서 IgE-수용체를 발현 시키기 위해 예측되는 DNA 제한 패턴을 나타내는 재조합 플라스미드(pCAL5-R/ND, 제 7 도)를 선택한다. 이 플라스미드는 IgE-수용체 cDNA의 하부에 neo- 및 dhfr-선별 표지물을 함유한다. 전사 방향은 방법은 3개의 유전자 모두에서 동일하다.

26. 3

플라스미드 pCAL8-BF/ND의 작제

플라스미드 pCAL-BF/ND는 상기 기술한 플라스미드 pCAL5-R/ND의 유도체로서 서열식( I )의 폴리펩타이드의 1번에서 147번 아미노산을 코드화하는 DNA 서열이 조류의 인플루엔자 헤마그글루티닌의 시그날 서열을 코드화하는 새로운 DNA 서열로 대체되었다. 이 변화로 서열식(I) 폴리펩타이드의 148번 아미노산에서 321번 아미노산으로 이루어지는 IgE-결합인자를 분비할 수 있게 된다. 이 목적을 위해, 참조문헌(4),(5),(6),(6a),(7),(8)에 기술된 표준 방법에 따라 서열식 : 5'-pAGCTTACCATGGCTACCCAGATCTTGGTGTTCGCTCTGGTGGCCGTCATTCCTACAAACGCGCATGGTACCGATGGGTCTAGAACCACAAGCCAGACCACCGGCAGTAAGGATGTTTGCGCGATTP-5' 를 갖는 ds DNA 단편을 화학적으로 합성한다. 이 DNA 0.2ng을 벡터 DNA 10ng 및 0.7Kb Dde I /Xba I cDNA 삽입물 2ng과 연결시킨다. pCAL5 플라스미드 DNA를 (a) Xba I 및 Hind Ⅱ 으로 완전하게 분해시키고 (b) 알칼리 포스파타제로 탈포스포릴화시켜 (c) 5.9K 벡터 DNA를 아가로즈 겔을 통해 정제시켜 벡터를 수득한다. 0.7Kb cDNA 삽입 단편은 pCAL3(실시예 20)으로부터 유도된다. pCAL3 플라스미드 DNA 30μg을 Hind Ⅲ 및 Xba I 으로 분해시키고, 아가로즈 겔 정제하여 0.8Kb cDNA 삽입물을 분리한다. 0.8Kb 단편 3μg을 Dde I 으로 분해시켜 0.1 및 0.7Kb DNA 단편을 수득한다. 최종적으로, 아가로즈 겔 전기영동시키고 정제하여 0.7Kb DNA 단편을 분리한다. 연결된 DNA를 사용하여 컴피턴트 이. 콜라이 HB101 세포를 형질전환시킨다. DNA 삽입물을 벡터 DNA에 이입시킨 후 예측되는 바와 같이 예측된 제한 단편을 생성하는 재조합 플라스미드(pCAL8 : 제 7 도)를 선별한다.

실시예 27

IgE-결합활성을 갖는 폴리펩타이드를 발현시키는 형질전환된 포유동물 세포주의 선별

포유동물 세포에 DNA를 형질감염시키는 방법, 형질 전환된 세포의 선별 및 유전자 증폭을 위한 선별 방법은 문헌[미합중국 특허 제4,399,216(1983)호 ; Kaufman, R. J. and Sharp, p. A. (1982). J. Mol. Biol., 601-621]에 상세히 기술되어 있으며 본 분야의 숙련가들에게 잘 알려져 있다. 차이니즈 햄스터 난소 세포주의 디하이드로폴레이트 환원효소 음성 돌연변이체(dhfr^-)를 숙주로 사용한다[세포주 DUKX-Bl ; Chasin. L.A. and Urlaub, G., (1980) Proc. Nai. Acad. SCl. USA 77, 4216-4220]. 세포를 5% 투석된 FCS 및 0.1mg/ml 겐타마이시니(Gibco)으로 보충시킨 MEM 배지(Gibco, Paislay, Scotland) 중에 유지시킨다. Ca-포스페이트 공침전 방법을 이용하여 서브 유착 CHO 세포를 pCAL5-R/ND 또는 pCAL8-BF/ND 플라스미드 DNA 10μg으로 형질감염시킨다. 형질감염시킨 세포를 5% FCS, 겐타마이신 및 0.5mg/ml G4l8(Gibco)로 보충시킨 알파-MEM 배지에서 생육시킨다.

2주일 후, G418-내성세포의 단일 콜로니가 생긴다. 콜로니 48개를 각각 24-웰 미세역가 플레이트의 웰에 옮겨 상기 기술한 선별용 배지에서 유착되게 생육시킨다. 그 다음, 일정량의 배지를 제거하고 실시예 7에 기술된 RIA로 IgE-결합활성의 존재 여부를 시험한다. 콜로니의 약 50%는 양성이며, ml당 재조합 폴리펩타이드 약 0.1 내지 10ng을 생성한다. 플라스미드 pCAL8-BF/ND로부터 유도된 형질전환된 콜로니는 통상적으로 플라스미드 pCAL5-R/ND에 의해 수득된 것들보다 더 고수율적 생산자이다. 최고 수율성 콜로니 5개를 메토 트렉세이트(Kaufman and Sharp 상기 참조)을 사용하여 유전자 증폭시킨다. 수회의 증폭 후, 재조합 폴리펩타이드 1μg/ml를 생성시키는 세포주를 수득한다. 최고 수율성 세포주 CHO-BF/ND를 거대 배양으로 생육시킨다. 선별용 배지 50ml를 함유하는 조직 배양 플라스크(Falcon, 175cm²)당 약 3×10⁶개의 세포를 시딩한다. 세포층이 유착된 후, 배지를 제거시키고 1% FCS 및 0.1mg/ml 겐타마이신으로 보충시킨 알파-MEM 배지 50ml로 대체한다. 배지를 1주일에 2번씩 수주일 동안 모은다. 그 다음, 5000xg에서 10분 동안 원심분리하여 -20℃에서 보관한다. 최종적으로, IgE-결합 활성을 갖는 재조합 폴리펩타이드를 상기 실시예 22 및 23에 기술된 바와 같이 친화성 크로마토그라피하여 혼합 상등액으로부터 정제한다.

RPMI 8866 세포로부터 천연 IgE-BF의 정제 및 서열분석

하기 실시예 B 내지 D에 따라 RDMI 8866세포 상등액의 IgE-BF-함유 분획을 정제하여(EP 86810244.3) 아미노 말단을 서열 결정하기에 충분히 순수한 IgE-BF를 수득할 수 있다.

실시예 A

IgE-BF의 효소-결합된-면역 -흡착-검정 (ELISA)

분획을 IgE-BF에 대해 다음과 같이 검정한다. PVC 미세역가 플레이트 웰을 실온에서 Mab-176(PBS중 5μg/ml ; 웰당 100μg)으로 습윤 챔버에서 밤새 피복시킨다. 플레이트를 PBS로 2회 세척한 후, 비특이성 결합 부위를 0.2% 젤라틴을 함유하는 PBS로 차단시킨다(150μl/웰, 37℃에서 1시간). 플레이트를 PBS로 2회 다시 세척한다. 크로마토그라피 실험으로부터의 분획을 PBS중 1/50로 회석시켜 웰에 가한 다음(100μl/웰), 실온의 습윤 챔버에서 밤새 인큐베이션 한다. 플레이트를 PBS로 4회 세척한다. 바이오틴이 공유결합된 Mab-135(실시예 19, EP 86810244.3)(0.2% 젤라틴을 함유하는 PBS중의 0.5μg/ml : 100ml/웰)을 가하고 습윤 챔버에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하여 결합된 IgE-BF를 검출한다. PBS 4회 세척한 후, 플레이트를 0.2% 젤라틴을 함유하는 PBS중의 아비딘과 알칼리 포스파타제의 결합물(SigmaCat. No. A 2527 0.5μg/ml) 100μl와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다. PBS로 더 세척한 후, 플레이트를 가질 완충액(물 800ml중의 MgCl₂×6H₂O 100mg, NaN₃200mg 및 디에탄올아민 97ml, 37% HCl로 pH를 9.8로 조정)중의 p-니트로페닐 인산이나트륨 1mg/ml로 전개시킨다. 37℃에서 20 내지 40분후 황색 반응이 최적 상태가 된다. 그 다음, 웰당 NaOH(1M) 50μl로 반응을 중단시킨다. 모델 2550EIA 판독기(Bio-Rad)를 사용하여 405nm에 흡광도를 측정한다.

실시예 B

면역친화성 크로마토그라피로 인체 B-세포 상등액으로부터 IgE-BF의 정제

RPMI 8866 세포로부터의 배양 상등액 10ℓ를 Mab-45-아피겔(EP 86810244.3의 실시예 10)의 20ml 컬럼을 통해 유속 120ml/h로 여과한다. 겔을 PBS로 세척한다. 결합되지 않은 단백질을 완전히 제거하기 위해 유비코드(Uvicord^R) 분광광도계을 사용하여 280nm에서 흡광도를 온라인 측정하여 유출액중의 단백질 함량을 모니터링한다. 컬럼을 pH 2.6의 0.1M 글리신-HCl 50ml로 용출시킨다. pH 8.0의 1M 트리스-HCl 및 0.5% 트윈 20을 동량으로 함유하는 튜브에 분획을 모은다. IgE-BF 함유 분획을 모아 pH 7.4의 10mM 트리스-HCl에 대해 투석시킨다.

실시예 C

이온 교환 크로마토그라피에 의한 IgE-BF의 정제

실시예 B의 정제된 IgE-BF를 신크로팩(SynChropak) AX 300 음이온 교환기 컬럼(Synchrom Inc., Linden, IN)상에 로딩한다. 컬럼을 pH 7.4의 10mM 트리스-HCl로 세척하고 단백질을 0 내지 1M NaCl 구배를 사용하여 유속 1ml/분으로 100분 동안 용출시킨다. 용출물을 254nm에서의 UV 흡광도 측정으로 모니터링한다. 분획을 1% 옥틸피라노글루코사이드(Sigma)에 모아 실시예 A에 기술된 바와 같이 IgE-BF에 대해 검정한다.

실시예 D

역상 크로마토그라피에 의한 IgE-BF의 추가 정제

실시예 C의 IgE-BF 50ml를 0.5ℓ PBS에 대해 1회 및 0.1% 옥틸피라노글루코사이드를 함유하는 0.5ℓ PBS에 대해 2회 투석시킨다. 동결 건조시킨 후, IgE-BF를 물 1.5ml중에 용해 시키고 0.1% 옥틸피라노글루코사이드를 함유하는 0.5ℓ PBS에 대해 2회 투석시킨다. 0.1% TFA(Pierce) 및 5% 아세토니트릴(Merck)중의 신크로팩 RP-4(Synchrom) 컬럼상에서 역상 크로마토그라피한다. 0.1% TFA중의 5 내지 60% 아세토니트릴 구배를 사용하여 0.5ml/분의 유속으로 30분 동안 용출시켜 IgE-BF 용출액을 수득한다. 용출액을 254nm에서 UV 흡광도를 측정하여 모니터링한다. 1ml 분획율 0.05% SDS에 모아 실시예 A에 기술된 바와 갈이 IgE-BF에 대해 검정한다. IgE-BF의 순도를 SDS-PAGE에 의해 조절한 다음 이어서 은 염색시킨다(EP 86810244.3의 실시예 22).

실시예 E

IgE-BF의 아미노산 서열 분석

포지티브상 단백질 서열기 모델 470(Applied Biosystems)을 사용하여, 실시예 D의 정제된 IgE-BF를 문헌[M. W. Hunkapillar and L. E. Hood, Methods in Enzymology, 399. 1983]의 방법에 따라 N-말단 아미노산 서열 분석한다. 아미노-티오졸리논 유도체를 50℃에서 25% 수성 TFA로 처리하여 페닐티오 히단토인(PTH) 아미노산에 PTH 아미노산을 조르스(Zorbox) CN^R-HPLC 컬럼(Dupont, 200×4.6mm)상에서 분석한다. 40%의 물질에 대해 다음과 같은 N-말단 아미노산 서열이 밝혀졌다.

X₁₄₉, X₁₅₅, X₁₅₀및 X₁₅₃은 결정되지 않은 아미노산을 나타낸다. 이 서열은 cDNA 분석에 의해 결정된 IgE-수용체의 서열을 따르고 이 수용제의 148번 아미노산에서 개시된다.

60%안의 물질에 대해 다음과 갈은 N-말단 아미노산 서열이 밝혀졌다.

X₁₅₁, X₁₅₀, 및 X₁₆₃은 결정되지 않은 아미노산을 나타낸다. 이 서열은 cDNA 분석에 의해 결정된 IgE-수용체의 서열을 따르고 이 수용체의 150번 아미노산에서 개시된다.

실시예 28

IgE-결합 인자 활성을 갖는 폴리펩타이드의 이.콜라이에서의 고도발현

28. 1

발현 플라스미드의 작제

실시예 24.1의 정제된 2.9Kb 벡터 DNA(EcoR I 및 BamH I 로 절단된 플라스미드 pPLc 24) 10ng을 pH 7.5의 10mM 트리스-HCl, 10mM MgCl₂, 2mM DDT, 0.1mM ATP 및 T₄DNA 리가제(Boehringer, Mannheim) 100단위를 함유하는 용액 20μl중의 올리고뉴클레오타이드 5'-pAATTTGGAGGAAAAAATTAATG(Pharmacia, No. 27-4878-01) 0.1ng 및 올리고뉴클레오타이드 5'-pGATCCATAATTTTTTCCTCCA(Pharmacia, No. 27-4898-01) 0.1ng과 혼합한다. 4℃에서 16시간 후, 혼합물을 사용하여 컴피턴트 이. 콜라이 Kl2 세포를 형질전환시킨다. 개개의 콜로니를 생육시켜 플라스미드 DNA를 분리한다. 표준 제한 분석을 수행하여 EcoR I 에 의해서는 절단되지 않고 BaMH I 에 의해서만 절단되는 정확한 플라스미드(pPL. PTIS, 참조 : 제 8 도)를 선별한다. DNA 서열분석에 의해 올리고뉴클레오타이드의 정확한 삽입물을 확인한다. 새로 삽입된 DNA 단편은 이동가능한 해독 개시 부위(PTIS, Pharmacia)를 코드화한다.

pPL. PTIS 플라스미드 DNA 10μg을 BamH I 으로 분해한 다음, 알칼리 포스파타제로 처리하고 아가로즈 겔 전기 영동시켜 2.9Kb선형 벡터 DNA를 정제한다. 이 벡터 DNA 10ng을 플라스미드 pCAL-3(실시예 20)으로부터 유도된 0.8Kb BglH 내지 BamH I 단편 3ng과 연결시킨 다음 이를 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 Kl2 세포를 형질전환시킨다. 플라스미드 DNA를 개개의 콜로니로부터 분리하여 표준 제한 분석에 의해 정확한 배향으로 0.8Kb 삽입물을 갖는 pPL. PTIS-BF 플라스미드를 선별한다(제 8 도).

플라스미드 pPL. PTIS-BF를 사용하여 λ1857을 수반하는 이.콜라이 균주 W3110 및 HB101을 형질전환시킨다(Remaut et at., 상기 참조). 형질전환체를 카나마이신 및 암피실린 40μg/ml를 함유하는 LB-플레이트 배지상에 도말하고 30℃에서 24시간동안 인큐베이션한다. 생성된 재조합 콜로니를 발효에 사용한다.

28. 2

발 효

실시예 28. 1에서 수득한 재조합 이. 콜라이 균주를 실시예 24. 2에 기술된 바와 같이 생육시킨다. 42℃에서 3시간 동안 유도한 후, 배양물을 빙/수욕 중에서 30분 동안 냉각시킨 다음 원심분리하여 모은다.

28. 3

IgE-결합 활성을 갖는 폴리펩타이드의 정제

열-유도된 배양물 1ℓ로부터 수득된 세포 펠렛을 4℃에서 20ml의 pH 7.5의 50mM 트리스-HCl, 1mM EDTA중에 재현탁 시킨다. 세포 현탁액을 얼음 상에서 게속 냉각시키면서 4×30초 동안 1분 간격으로 초음파처리한다(MSE Soniprep^R150, 9.5mm 프로브, 24마이크론 진폭). 그 다음 현탁액을 10분 동안 원심 분리한다(Sorvall Centrifuge HB-4 로우터, 9000rpm, 4℃). 펠렛을 4℃에서, 20ml의 pH 7.5의 50mM 트리스-HCl, 1mM EDTA 중에 재현탁시킨 다음 상기 기술한 바와 같이 30초 동안 초음파처리한다. 현탁액을 상기 기술한 바와 같이 원심분리하고 2회 더 세척한다.

제 1 도는 RPMI 8866B-세포로부터 분리된 mRNA로 부터의 ds-cDNA를 삽입물로서 함유하는 플라스미드 pCL-1 및 pCL-2의 작제를 도시한 도이다. 삽입 cDNA는 IgE-수용체 및 IgE-결합 인자와 관련된 폴리펩타이드를 코드화한다.

제 2 도는 플라스미드 pCL-1 및 pCL-2의 두 개의 삽입물을 비교한 것으로, 두 개의 삽입물에서 동일한 코드화 영역, 두 개의 삽입물에서 동일한 비-코드화 영역, pCL-2에만 있는 코드화 영역 및 두 개의 삽입물에서 상이한 비-코드화 영역뿐 아니라 제한 부위를 나타낸다.

제 3 도는 pCL-2 및 pGEM^TM-1으로부터 플라스미드 pGEM^TM-1/CL2의 작제 및 DNA 삽입물의 mRNA로의 전사를 도시한 도이다.

제 4 도는 플라스미드 pCL-2로부터 개시하여, 서열식(I)의 아미노산 서열 Asp 119 내지 Ser 321을 코드화하는 삽입물을 갖는 플라스미드 pFK-1 및 아미노산 Ala 134 내지 Ser 321의 아미노산 서열을 코드화하는 pFK-2의 작제를 도시한 도이다.

제 5 도는 이.콜라이 W3110 및 HB101에서 IgE-BF를 발현시키기 위한 플라스미드 pBL-BF의 작제를 도시한 도이다. 파아지 λ의 P_L프로모터하에 119번에서 321번 아미노산이 발현된다.

제 6 도는 삭카로마이세스 세레비지애에서 IgE-BF를 발현시키기 위한 플라스미드 pJDB207R/PH0.5-BF의 작제를 도시한 도이다. PH0.5 프로모터하에 119번에서 321번 아미노산이 발현된다.

제 7 도는 배양된 포유동물 세포(차이니즈 햄스터 난소세포)에서 각각 막-결함된 IgE-수용체 또는 분비되는 IgE-BF를 발현시키기 위한 플라스미드 pCLA5-R/ND 및 pCAL8-BF/ND의 작제를 도시한 도이다.

제 8 도는 이.콜라이에서 IgE-BF를 형질전환 및 발현시키기 위한 플라스미드 pPL.PTIS-BF의 작제를 도시 한 도이다.

부호 및 기호 설명

제한효소 : A=Hae Ⅱ, B=BamH I, C=Hinc Ⅱ, E=EcoR I, G=Bal Ⅲ, H=Hind Ⅲ, N=Nco I, P=Pst I, R=Rsa I

: IgE-수용체 및/또는 IgE-BF와 관련된 폴리펩타이드를 코드화하는 서열

: pCL-2에 대한 특이적인 코드화 서열(제2도)

: pCL-1 및 pCL-2에서 상이한 비-코드화 서열

: pCL-1 및 pCL-2에서 동일한 비-코드화 서열

(제 2 도)

: mRNA

미생물 기탁

플라스미드 pCL-2를 함유하는 이.콜라이 HB 101/pCL-2는 1986년 6월30일자로 기관[독일연방공화국 데-3400 괴팅겐 그리세바 흐스트라세 8 소재의 Deutsche Sammlung fr Mikroorganismen]에 기탁번호 DSM 3807로 기탁되었으며, 또한 1988년 1월26일자로 한국종균협회에 기탁번호 KFCC-10503으로 기탁 되었다.

참조문헌

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10. Goedell et at., Nature, 281 : 544(1979)

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12. Siebenlist et al., Cell 20 : 269(1980)

13. J. Gharayeb et al., The EMBO Journal, Vol.3, 2437-2442(1984)

14. Stinchomb et at., Nature, 282 : 39(1979)

14a. Kingsman et al., Gene, 7 : 141(1979)

15. Tschemper et al., Gene, 10, 157(1980)

16. Melton, D.A. et al.(1984) Nucleic Acids Research 12, 7035-7056

17. M.Sarfati et al., Immunology, 1984,, 197-205

18. J.B. Gurdon, The control of gene expression in animal development, Clarenton Press, Oxford. 1974

19. F.C. Greenwood et al., Biochem. J., 114(1963)

20. B. Seed, Nucleic Acids Res. 10, 1799-1810(1982)

21. F. Sanger et al., Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 5463-5467

Claims (19)

1. (1) 서열식(I)의 폴리펩타이드, 또는 106번에서 127번까지의 아미노산 서열이 결실된 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편 또는 119번에서 160번까지의 아미노산 중 하나의 아미노산으로부터 개시하여 282번에서 321번까지의 아미노산중 하나의 아미노산으로 종결된 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편을 코드화하는 DNA를 제조하고, (2) 수득된 NDA를 적절한 벡터에 삽입시키며, (3) 적절한 숙주를 수득 된 하이브리드 벡터로 형질 전환시키고, (4) 형질 전환된 숙주를 형질 전환되지 않은 숙주로부터 선별하고, 임의로 하이브리드 벡터을 형질 전환된 숙주로부터 분리하고 하이브리드 벡터의 코드화 영역 또는 비-코드화 영역을 변형시켜 다시 단계(3) 및 (4)를 수행함을 특징으로 하여, 상기한 서열식(I)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 발현시킬 수 있는 형질 전환된 숙주를 제조하는 방법.
2. 제 1 항에 나타낸 폴리펩타이드를 코드화 하는 DNA.
3. 제 2 항에 있어서, 다음 서열식(Ⅱ)를 갖는 DNA.
4. 제 2 항에 있어서, 다음 서열식(Ⅲ)을 갖는 DNA.
5. 제 2 항에 있어서, 서열식(I)의 아미노산 서열 D₁₁₉내지 S₃₂₁을 갖는 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA.
6. 제 2 항에 있어서, 서열식(I)의 아미노산 서열 A₁₃₄내지 S₃₂₁을 갖는 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA.
7. 제 2 항에 있어서, 서열식(I)의 아미노산 서열 L₁₄₈내지 S₃₂₁을 갖는 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA.
8. 제 2 항에 있어서, 서열식(I)의 아미노산 서열 M₁₅₀내지 S₃₂₁을 갖는 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA.
9. 제 1 항에 나타낸 서열식(I)의 폴리펩타이드, 또는 106번에서 127번까지의 아미노산 서열이 결실 된 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편 또는 119번에서 160번까지의 아미노산 중 하나의 아미노산으로 부터 개시하여 282번에서 321번까지의 아미노산 중 하나의 아미노산으로 종결된 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편을 코드화하는 DNA 서열을 삽입물로서 함유하는 하이브리드 벡터 pCL-2.
10. 제 9항에 있어서, 106 내지 127번 아미노산 서열이 결실된 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편을 코드화하는 DNA 서열을 삽입물로서 함유하는 하이브리드 벡터 pCL-2.
11. 제 9 항에 있어서, 120번에서 160번까지의 아미노산 중 하나의 아미노산으로부터 개시하여 321번 아미노산으로 종결된 폴리펩타이드로 이루어지는 그룹중에서 선택된 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편을 코드화하는 DNA 서열을 삽입물로서 함유하는 하이브리드 벡터 pCL-2.
12. 제 9 항에 있어서, 120에서 160번까지의 아미노산 중 하나의 아미노산으로부터 개시하여 282번에서 321번 까지의 아미노산 중 하나의 아미노산으로 종결된 폴리펩타이드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편을 코드화하는 DNA 서열을 삽입물로서 함유하는 하이브리드 벡터 pCL-2.
13. 제 9 항에 있어서, 119번 내지 321번 아미노산의 아미노산 서열로 이루어지는 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편을 코드화하는 DNA 서열을 삽입물로서 함유하는 하이브리드 벡터 pCL-2.
14. 제 9 항에 있어서, 134번 내지 321번 아미노산의 아미노산 서열로 이루어지는 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편을 코드화하는 DNA 서열을 삽입물로서 함유하는 하이브리드 벡터 pCL-2.
15. 제 9 항에 있어서, 148번 내지 321번 아미노산의 아미노산 서열로 이루어지는 서열식(I)의 폴리펩타이드의 단편을 코드화하는 DNA 서열을 삽입물로서 함유하는 하이브리드 벡터 pCL-2.
16. 제 9 항에 있어서, 150번 내지 321번 아미노산의 아미노산 서열로 이루어지는 서열식( I )의 폴리펩타이드의 단편을 코드화하는 DNA 서열을 삽입물로서 함유하는 하이브리드 벡터 pCL-2.
17. 제 9 항에 있어서, 서열식(Ⅱ) 또는 (Ⅲ)의 DNA 서열을 함유하는 하이브리드 백터 pCL-2.
18. 제 9 항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 따른 하이브리드 벡터 pCL-2로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 숙주.
19. 제18항에 있어서, 에스케리키아 콜라이 HB101, 에스케리키아 콜라이 BZ234. 에스케리키아 콜라이 B1472 및 W3110 중에서 선택된 에스케리키아 콜라이 숙주.