JP2882775B2 - ヒトーグリア由来神経突起因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】この発明は、グリア系細胞か
ら放出される神経突起促進因子（ｎｅｕｒｉｔｅ−ｐｒ
ｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、神経突起促進活性を
維持している関連蛋白質及びそれらの断片、該神経突起
促進因子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ及びその断
片、この様なＤＮＡを含有するハイブリドベクター、こ
のようなハイブリドベクターにより形質転換された宿
主、前記ＤＮＡベクター及び形質転換された宿主の製造
方法、前記神経突起促進因子、関連蛋白質及びその断片
の製造方法、並びに神経系の傷害を治療するためのこれ
らの使用に関する。 【０００２】 【従来の技術】グリア系細胞は、神経系の傷害の発生及
びその後の経過において本質的な機能を発揮すると考え
られる。このようなグリア−神経相互作用の性質につい
ての知識はインビボ状態で微量に存在する巨大分子の同
定を必要とする。培養されたラットの神経膠腫細胞は、
神経芽細胞腫細胞中で神経突起の伸長を促進する巨大分
子を放出する。このラットのグリア由来神経突起促進因
子（glia-derived neurite-promoting factor; GdNPF)
は同定され、そして特徴付けられている〔J. Guenther,
H. Nick、及びD. Monard, ＥＭＢＯ Ｊ．，４，１９
６３−１９６６（１９８５）〕。 【０００３】これは、神経突起の伸長、並びにウロキナ
ーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、トロンビ
ン及びトリプシンのごときセリンプロテアーゼの効果的
な阻害の両者を惹起する４３，０００の見かけ分子量を
有する蛋白質である。プロテアーゼとラットＧｄＮＰＦ
との間のドデシル硫酸ナトリウム抵抗性複合体の形成は
同じ著者により示されている。ラットＧｄＮＰＦは遊離
の又は腫瘍細胞と会合したプラスミノーゲンアクチベー
ターの活性を阻害し、そして小脳の発達の過程で顆粒細
胞ノイロン（ｇｒａｎｕｌｅ ｃｅｌｌ ｎｅｕｒｏ
ｎ）が移動するのを妨害する。 【０００４】神経突起の伸長を惹起しそしてセリンプロ
テアーゼを阻害するこのような神経突起促進因子は、神
経系の傷害の後の神経繊維の再生を促進し、そして正常
細胞及び腫瘍細胞の移動を妨害することが予想される。
しかしながら、既知のラットＧｄＮＰＦのヒトへの療法
的適用は、ヒトに対するラットＧｄＮＰＦの予想される
抗原性により容赦なく妨害される。この問題はヒトＧｄ
ＮＰＦの使用により克服することができる。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】本願発明の１つの目的
はヒトＧｄＮＰＦを提供することである。ＧｄＮＰＦ、
神経突起促進活性を維持しているその断片、及びＧｄＮ
ＰＦ関連ペプチドの工業的合成の問題は組換ＤＮＡ技法
により解決される。本発明の他の目的は、ＧｄＮＰＦ、
ＧｄＮＰＦ関連ペプチド及びそれらの断片の製造方法；
ＧｄＮＰＦ、ＧｄＮＰＦ関連ペプチド又はそれらの断片
を含有する医薬を提供することである。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明は特に、純粋なヒ
ト−グリア由来神経突起促進因子（ＧｄＮＰＦ）、並び
に神経突起促進活性を維持しているその関連ペプチド及
び断片に関する。これらの化合物は神経突起の伸長及び
セリンプロテアーゼの阻害の両方を惹起する。さらに詳
しくは、本発明は、次の式（Ｉ）： 【０００７】 【化３】【０００８】〔式中、Ｃｙｓは場合によってはジスルフ
ィドの形で存在し；Ｘ₁ は水素、アシル基、例えばホル
ミル基又はアルカノイル基、例えばパルミトイル基、ミ
リストイル基又は低級アルカノイル基、例えばアセチル
基又はプロピニオル基、あるいは次の式（II）：Met(-1
9)-Asn-Trp-His-Leu(-15)-Pro-Leu-Phe-Leu-Leu(-10)-A
la-Ser-Val-Thr-Leu(-5)-Pro-Ser-Ile-Cys(-1)- で表わ
されるペプチド残基、又はカルボキシ末端からの１〜１
８個のアミノ酸を含んで成る式（II）の残基の断片であ
って、これらのペプチド残基は場合によってはアシル化
されており；そしてＸ₂ はＡｒｇ又はＴｈｒ−Ｇｌｙで
ある〕で表わされる、場合によってはグリコシル化され
ているヒトＧｄＮＰＦ；式（Ｉ）の化合物中の１個又は
複数個の、特に１個、２個、３個又は４個の単一アミノ
酸が他のアミノ酸に置き換えられており神経突起促進活
性を維持している関連ポリペプチド；並びに第２９位の
アミノ酸と第３７８位のアミノ酸との間のアミノ酸鎖か
ら選択された１０個以上の連続するアミノ酸、及び場合
によっては１個又は複数個の、例えば１個、２個又は３
個の他のアミノ酸を含んで成る式（Ｉ）の化合物の断片
に関する。 【０００９】 【発明の実施の形態】式（１）のＧｄＮＰＦはグリコシ
ル化されていてもよく、又は炭水化物残基を有していな
くてもよい。典型的には、式（Ｉ）のグリコシル化され
たＧｄＮＰＦは１個又は複数個の炭水化物残基、例えば
アスパラギン（Ａｓｎ）残基にＮ−グリコシド結合した
Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミ
ン含有オリゴサッカライド、及び／又は、セリン（Ｓｅ
ｒ）残基又はスレオニン（Ｔｈｒ）残基にＯ−グリコシ
ド結合しているＮ−アセチルガラクトサミン又はＮ−ア
セチルガラクトサミン含有オリゴサッカライドを含有す
る。 【００１０】式（Ｉ）のＧｄＮＰＦにおいて、システイ
ン残基は示されている様に還元された形態で存在しても
よく、又は酸化された形態すなわちジスルフィド形であ
ってＳ−Ｓ橋を形成していてもよく、この場合好ましく
は式（Ｉ）のいずれか２個のＣｙｓ残基の間で分子内Ｓ
−Ｓ橋を形成している。アシル基Ｘ₁ は天然蛋白質中に
見出される任意のアシル基であることができる。特に、
アシル基Ｘ₁ は低級アルカノイル基、例えばアセチル基
又はホルミル基、好ましくはアセチル基である。 【００１１】式（II）のペプチド残基Ｘ₁ はシグナルペ
プチドである。リボゾーム中で生成した際のＧｄＮＰＦ
は式（II）の全体ペプチド残基Ｘ₁ を含有する。翻訳後
プロセシングがこのシグナルペプチド又はその部分を切
り離す。この発明は、Ｘが式（II）のペプチド残基であ
るか又は前に定義したこの残基の断片、特にアミノ酸−
１８〜−１から成る断片、Pro-Ser-Ile-Cys-（−４〜−
１），Ser-Ile-Cys-（−３〜−１），Ile-Cys-、又はCy
s-のみである式（Ｉ）のＧｄＮＰＦに関する。式（II）
のペプチド残基、又はカルボキシ末端からの１〜１８個
のアミノ酸から成るその断片はそのＮ−末端においてア
シル化、例えばアセチル化又はホルミル化されていても
よい。 【００１２】R. W. Scott 等〔J. Biol. Chem., ２６
０，７０２９−７０３４（１９８５）は、プロテアーゼ
ネクシン（ｎｅｘｉｎ）と呼ばれるポリペプチドを記載
している。このセリンプロテアーゼ阻害剤は培養された
ヒト線維芽細胞から放出される。プロテアーゼネクシン
は４３，０００の見かけ分子量を有し、そして式（Ｉ）
のＧｄＮＰＦのＮ−末端の２８個のアミノ酸と同一の２
８個のアミノ酸から成るＮ−末端アミノ酸配列を有する
ことが報告されている。しかしながら、プロテアーゼネ
クシンと称される公表された蛋白質と本発明のＧｄＮＰ
Ｆとが異る化合物であることを示す明確な証拠が存在す
る。全アミノ酸分析から予想されるこの既知蛋白質のア
ミノ酸組成、及びＸ₁ が水素である式（Ｉ）のＧｄＮＰ
Ｆのアミノ酸組成を第１表に示す。スレオニン（Ｔｈ
ｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン酸及びグルタミン
（Ｇｌｕ／Ｇｌｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、バリン（Ｖ
ａｌ）並びにイソロイシン（Ｉｌｅ）の個数において最
も顕著な差異が見出される。 【００１３】 【表１】 【００１４】本発明はさらに、神経突起促進活性を維持
しているＧｄＮＰＦ関連ポリペプチド、例えば１個又は
複数個の単一アミノ酸が他のアミノ酸により置き換えら
れている式（Ｉ）の化合物を包含する。この様な関連ポ
リペプチドは、ＤＮＡのレベルにおいて自然変異又は化
学的に誘導された変異により、あるいは化学合成による
アミノ酸の置き換えにより形成することができる。この
様な関連ポリぺプチドはさらに、ヒトＧｄＮＰＦを含む
異る動物種に由来する融合断片から成るハイブリドポリ
ペプチドを包含する。 【００１５】本発明の断片は、例えば、Ｎ−末端の少数
個のアミノ酸が欠失している式（Ｉ）の化合物の大断
片、例えば第２位〜第３７８位のアミノ酸、第３位〜第
３７８位のアミノ酸、第４位〜第３７８位のアミノ酸、
第５位〜第３７８位のアミノ酸、第６位〜第３７８位の
アミノ酸、又は第７位〜第３７８位のアミノ酸を含んで
成る断片、あるいはアミノ酸 ³¹⁰Ａｒｇ及びアミノ酸
³¹¹Ｓｅｒ及び／又は ³⁴⁵Ａｒｇ及び ³⁴⁶Ｓｅｒ並びに
場合によっては他のアミノ酸を含んで成る１０個〜５０
個のアミノ酸（セリンプロテアーゼ基質の必須部分であ
ることが知られている組み合せ）から成る小断片であ
る。 【００１６】他の好ましい断片は、アンチトロンビン−
III 又はα１−アンチトリプシンとかなりの相同性を示
す領域を含む断片、例えば第７２位〜第９６位、第１３
４位〜第１４６位又は第１５９位〜第１９５位、及び第
３１４位〜第３７８位のアミノ酸鎖から選択されたアミ
ノ酸、及び場合によっては１個又は複数個の、例えば１
個、２個又は３個の他のアミノ酸を含んで成る断片を含
む。 【００１７】第３２１位〜第３３４位のアミノ酸の間の
１４個のアミノ酸からなる断片、すなわち式：Gln-Lys-
Ala-Lys-Ile-Glu-Val-Ser-Glu-ASp-Gly-Thr-Lys-Ala の
追加の断片；第３２２位〜第３３４位のアミノ酸の間の
１３個のアミノ酸及びＮ−末端のヒスチジン残基から成
る断片、すなわち式：His-Lys-Ala-Lys-Ile-Glu-Val-Se
r-Glu-Asp-Gly-Thr-Lys-Ala の断片；第３４５位〜第３
５４位の間の１０個のアミノ酸及びカルボキシ末端の追
加の-Ser-Phe残基から成る断片、すなわち式：Arg-Ser-
Ser-Pro-Pro-Trp-Phe-Ile-Val-Asp-Ser-Phe の断片；並
びに第１７５位〜第１８８位のアミノ酸の間の１４個の
アミノ酸から成る断片、すなわち式：Lys-Ser-Arg-Phe-
Gln-Pro-Glu-Asn-Thr-Lys-Lys-Arg-Thr-Phe の断片が特
に好ましい。 【００１８】ヒトＧｄＮＰＦ、関連ペプチド及びそれら
の断片は、所望の化合物を生産する細胞からの単離によ
って、又は縮合反応による合成によって製造することが
できる。例えば、ヒトＧｄＮＰＦはこれを生産する神経
膠腫細胞（ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌ）又は他のグリア系
細胞を、適当な培地、例えば最少必須培地、ダルベコの
改変イーグル培地、ＰＲＭＩ １６４０培地等の中で、
場合によっては全血清、例えばウシ胎児血清及び／又は
増殖促進化合物、マイトジエン、抗生物質及び他の補填
物質を補充して、培養することにより得られる。所望の
ＧｄＮＰＦを単離し、そして常法、例えば下に検討する
方法により精製する。 【００１９】ヒトＧｄＮＰＦ、関連ペプチド、及び特に
その断片はまた、化学的方法により、例えばM. Bodansz
ky, Principles of Pepride Synthesis , Springer-Ver
lag,１９８４に記載されている縮合反応により合成する
ことが可能である。断片は例えば固相法により合成さ
れ、この方法においては、アミノ基が保護されたアミノ
酸を適当な樹脂に結合せしめ、保護基を除去し、アミノ
基が保護された第二アミノ酸を第一アミノ酸のアミノ基
と縮合せしめ、脱保護及びアミノ基が保護された次のア
ミノ酸との縮合のサイクルを所望の組成のペプチド残基
が完成するまで反復し、そして最後にこのペプチド残基
を前記樹脂から開裂せしめ、そして脱保護する。 【００２０】特に、ヒトＧｄＮＰＦ、関連ペプチド及び
その断片は、例えば、形質転換された宿主を異種性ポリ
ペプチドの発現を許容する条件下で培養し、そして所望
の化合物を単離することを含んで成る組換ＤＮＡ技法に
より調製することができる。さらに詳しくは、所望の化
合物は、 （ａ）グリア系細胞のｃＤＮＡライブラリー又はゲノム
ＤＮＡライブラリーからＧｄＮＰＦをコードするＤＮＡ
又はその断片を単離しそして場合によっては該ＤＮＡを
変異せしめ、あるいはこの様なＤＮＡを化学的に合成
し； （ｂ）前記ＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し； （ｃ）得られたハイブリドベクターを受容体宿主に形質
転換し； （ｄ）形質転換された宿主のみが生存する条件下で培養
することにより未形質転換宿主から形質転換された宿主
を選択し； （ｅ）前記形質転換された宿主を異種性ポリペプチドの
発現を許容する条件下で培養し；そして、 （ｆ）ヒトＧｄＮＰＦ、又はその関連ペプチドもしくは
断片を単離する；ことにより製造される。 【００２１】組換ＤＮＡ技法によるこれらのペプチドの
製造に含まれる段階は後でさらに詳細に検討する。ヒト
ＧｄＮＰＦの製造のため、段階（ａ）のｃＤＮＡライブ
ラリーは好ましくはヒト神経膠腫細胞から、例えば "Cl
lection Nationale de Cultures de Microorganismes"
、パスツール研究所、パリに１９８６年２月５日にＮ
ｏ．Ｉ−５１８として寄託されたヒト神経膠腫（ｇｌｉ
ｏｍａ）セルラインに由来する。段階（ａ）のゲノムＤ
ＮＡライブラリーはヒト胎盤又はヒト胎児肝細胞から調
製することができる。関連ペプチド、例えばラットＧｄ
ＮＰＦの製造のためには、他のグリア系細胞、例えばラ
ット神経膠腫細胞、特にＣ６ラット神経膠腫細胞を使用
してｃＤＮＡライブラリーを調製することができる。 【００２２】この発明はまた、グリア由来神経突起促進
因子（ＧｄＮＰＦ）をコードするＤＮＡ、例えばヒトＧ
ｄＮＰＦ又はラットＧｄＮＰＦをコードするＤＮＡ、こ
れらの変異体、例えば１個又は複数個の、例えば１個、
２個、３個又は４個のヌクレオチドが変異しているＤＮ
Ａ、神経突起促進活性を維持している関連ポリペプチド
をコードするＤＮＡ、並びに１５個以上のヌクレオチド
を含んで成るこれらのＤＮＡの断片に関する。これらの
ＤＮＡは単鎖又は二本鎖であると理解される。特に、こ
の発明は次の式（III)： 【００２３】 【化４】【００２４】 【化５】【００２５】〔式中、Ｙ₁ はアラニン（Ａｌａ）をコー
ドし、そしてGCT,GCC,GCA 又はGCG であり；Ｙ₂ はアル
ギニン（Ａｒｇ）をコードし、そしてCGT,CGC,CGA,CGG,
AGA 又はAGGであり；Ｙ₃ はアスパラギン（Ａｓｎ）を
コードし、そしてＡＡＴ又はＡＡＣであり；Ｙ₄ はアス
パラギン酸（Ａｓｐ）をコードし、そしてＧＡＴ又はＧ
ＡＣであり；Ｙ₅ はシステイン（Ｃｙｓ）をコードし、
そしてＴＧＴ又はＴＧＣであり；Ｙ₆ はグルタミン（Ｇ
ｌｎ）をコードし、そしてＣＡＡ又はＣＡＧであり；Ｙ
₇ はグルタミン酸（Ｇｌｕ）をコードし、そしてＧＡＡ
又はＧＡＧであり；Ｙ₈ はグリシン（Ｇｌｙ）をコード
し、そしてGGT,GGC,GGA 又はGGG であり；Ｙ₉ はヒスチ
ジン（Ｈｉｓ）をコードし、そしてＣＡＴ又はＣＡＣで
あり； 【００２６】Ｙ₁₀はイソロイシン（Ｉｌｅ）をコード
し、そしてATT,ATC 又はATA であり；Ｙ₁₁はロイシン
（Ｌｅｕ）をコードし、そしてTTA,TTG,CTT,CTC,CTA 又
はCTG であり；Ｙ₁₂はリジン（Ｌｙｓ）をコードし、そ
してＡＡＡ又はＡＡＧであり；Ｙ₁₃はメチオニン（Ｍｅ
ｔ）をコードし、そしてＡＴＧであり；Ｙ₁₄はフェニル
アラニン（Ｐｈｅ）をコードし、そしてＴＴＴ又はＴＴ
Ｃであり；Ｙ₁₅はプロリン（Ｐｒｏ）をコードし、そし
てCCT,CCC,CCA 又はCCG であり；Ｙ₁₆はセリン（Ｓｅ
ｒ）をコードし、そしてTCT,TCC,TCA,TCG,AGT 又はAGC
であり；Ｙ₁₇はスレオニン（Ｔｈｒ）をコードし、そし
てACT,ACC,ACA 又はACG であり； 【００２７】Ｙ₁₈はトリプトファン（Ｔｒｐ）をコード
し、そしてＴＧＧであり；Ｙ₁₉はチロシン（Ｔｙｒ）を
コードし、そしてＡＴＡ又はＴＡＣであり；Ｙ₂₀はバリ
ン（Ｖａｌ）をコードし、そしてGTT,GTC,GTA 又はGTG
であり；Ｙ₂₁は終止コドンTAA,TAG 又はTGA であり；Ｙ
₂₂はＹ₂ 又はＹ₁₇−Ｙ₈ であり；Ｚ₁ はプロモーター配
列を含有する１２個又はそれより多数のヌクレオチドか
ら成るフランキングＤＮＡ残基であり；Ｚ₂ は存在しな
いか、又は１個もしくはそれより多数のヌクレオチドか
ら成るフランキングＤＮＡ配列であり；そしてＺ₁ とＺ
₂ は場合によっては連結されている〕 【００２８】で表わされるヒトＧｄＮＰＦをコードする
ＤＮＡ、式(III) のＤＮＡとそれに対して相補的なＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡ（ここでアデニン（Ａ）はチ
ミン（Ｔ）と結合しそして逆も成立し、そしてグアニン
（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と結合しそして逆も成立す
る）、相補的ＤＮＡそれ自体、１個又はそれより多数の
ヌクレオチドが変異しているこれらの変異体、並びに１
５個以上のヌクレオチドを含んで成るこれらのＤＮＡの
断片に関する。この発明は特に、次の式（IV）： 【００２９】 【化６】 【００３０】 【化７】【００３１】 【化８】【００３２】（式中、ＷはＡ又はＡＣＡＧであり、Ｘ₂
はＡｒｇ又はＴｈｒ−Ｇｌｙであり、そしてＺ₃ 及びＺ
₄ はそれぞれ独立に、存在しないか、又は１個もしくは
複数個のヌクレオチドから成るフランキングＤＮＡ残基
であって場合によっては連結されている、）で表わされ
るヒトＧｄＮＰＦをコードするＤＮＡ、式（IV）のＤＮ
Ａとこれに対して相補的なＤＮＡとから成る二本鎖ＤＮ
Ａ、相補的ＤＮＡそれ自体、１個又は複数個のヌクレオ
チドが変異しているこれらの変異体、並びに１５個以上
のヌクレオチドを含んで成るこれらのＤＮＡの断片に関
する。この発明はさらに、次の式（Ｖ）： 【００３３】 【化９】【００３４】 【化１０】【００３５】 【化１１】【００３６】（式中、Ｚ₅ 及びＺ₆ はそれぞれ独立に、
存在しないか、又は１個もしくは複数個のヌクレオチド
から成るフランキングＤＮＡ残基であって場合によって
は連結されている）で表わされるラットＧｄＮＰＦをコ
ードするＤＮＡ、式（Ｖ）のＤＮＡとこれに対して相補
的なＤＮＡとから成る二本鎖ＤＮＡ、相補的ＤＮＡそれ
自体、１個又は複数個のヌクレオチドが変異しているこ
れらの変異体、並びに１５個以上のヌクレオチドを含ん
で成るこれらのＤＮＡの断片に関する。 【００３７】さらに、この発明は、式（Ｉ）のヒトＧｄ
ＮＰＦ又はラットＧｄＮＰＦをコードするＲＮＡ；１個
又は複数個の、特に１個、２個、３個又は４個のヌクレ
オチドが変異しているそれらの変異体；及び１５個以上
のヌクレオチドを含んで成る前記ＲＮＡの断片、特に種
々のＹが前記の意味を有するが、ＤＮＡ残基がＲＮＡ残
基で置き換えられておりそしてデオキシチミジン（Ｔ）
がウリジン（Ｕ）で置き換えられている式(III) のＲＮ
Ａ、及びＴがＵにより置き換えられている式（IV）のＲ
ＮＡ及び式（Ｖ）のＲＮＡに関する。 【００３８】ＧｄＮＰＦをコードするＤＮＡ、その変異
体、神経突起促進活性を維持している関連ポリペプチド
をコードするＤＮＡ、及びこれらのＤＮＡの断片は、例
えば形質転換された宿主を培養しそしてこの培養細胞か
ら所望のＤＮＡを単離するか、又はヌクレオチドの縮合
による化学合成によって調製することができる。 【００３９】特に、これらのＤＮＡは例えば、（ａ）グ
リア系細胞からポリ（Ａ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）を単離し、所望によりＧｄＮＰＦをコードするｍ
ＲＮＡ又はその断片を濃縮し、そして該ｍＲＮＡに対し
て相補的な単鎖ＤＮＡを調整しそして該単鎖ＤＮＡから
二本鎖相補的ＤＮＡ（ｄｓ ｃＤＮＡ）を調製し；ある
いは、（ｂ）適当な細胞からゲノムＤＮＡを単離し、そ
してＤＮＡプローブを用いて所望のＤＮＡを選択し；そ
して、（ｃ）段階（ａ）のｄｓ ｃＤＮＡ、又は段階
（ｂ）のｄｓ ＤＮＡを適当な発現ベクター中に導入
し；（ｄ）得られたハイブリドベクターにより適当な宿
主を形質転換し、（ｅ）ＧｄＮＰＦ ＤＮＡ又はその断
片を含有しない宿主からＧｄＮＰＦ ＤＮＡ又はその断
片を含有する形質転換された宿主を選択し、そして
（ｆ）所望のＤＮＡを単離する；ことにより調製するこ
とができる。 【００４０】ポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡはグ
リア系細胞から既知の方法によって単離される。この方
法は例えば、組織を洗剤及びリボヌクレアーゼ阻害剤、
例えばヘパリン、イソチオシアン酸グアニジン及びメル
カプトエタノールの存在下でホモジナイズし、このホモ
ジネートを遠心分離し、マグネシウム塩、例えば塩化マ
グネシウムを含有する塩混合物により上清からｍＲＮＡ
を沈澱せしめ、沈澱を再懸濁して適当なクロロホルム−
フェノール混合物により、場合によっては洗剤及び／又
は陽イオンキレート化剤の存在下で抽出し、そして残っ
た塩含有水性相からエタノール、イソプロパノール等に
よりｍＲＮＡを沈澱せしめることを含む。 【００４１】別の方法として、ｍＲＮＡは、塩化セシウ
ム勾配中で遠心し、次にエタノールで沈澱せしめること
により直接分離することができる。好ましくは、このよ
うな沈澱したポリ（Ａ）ｍＲＮＡをクロマトグラフ法、
例えばアフィニティークロマトグラフィー、例えばオリ
ゴ（ｄＴ）セルロース又はオリゴ（ｄＵ）セファロース
上でのクロマトグラフィーによりさらに精製する。 【００４２】ｍＲＮＡの単離のために使用するグリア系
細胞は種々の由来のものであることができる。培養にお
いて拡大することができる神経膠腫細胞、例えば樹立さ
れたセルラインからのヒト神経膠腫細胞又はラット神経
膠腫細胞が好ましい。"Collection Nationale de Cultu
res de Microorganismes" ，パスツール研究所、パリ、
にＮｏ．Ｉ−５１８として１９８６年２月５日に寄託さ
れたヒト神経膠腫セルラインＬＮ−３４０からの細胞が
特に好ましい。 【００４３】場合によっては、グリア系細胞から単離さ
れた神経突起促進因子をコードするｍＲＮＡを濃縮す
る。これは例えば、ｍＲＮＡの速度分画又はクロマトグ
ラフ分画、適当な細胞での、例えばカエルの卵母細胞又
は無細胞系、例えば網状赤血球抽出物又は小麦胚抽出物
中での前記画分の翻訳、及び神経突起促進活性、又は神
経突起促進活性と平行する他の任意の性質、例えばプロ
テアーゼ阻害活性についての得られたポリペプチドのス
クリーニングにより行うことができる。得られるポリペ
プチドのスクリーニングは、抗体、例えばポリクローナ
ル抗体又はモノクローナル抗体を用いるイムノアッセ
イ、例えばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセ
イ、又は蛍光マーカーを用いるイムノアッセイにおいて
特に効果的である。これらのイムノアッセイ並びにポリ
クローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製は当業界
においてよく知られており、そしてそれ故にこれらを適
用することができる。 【００４４】スクリーニングはまた、ハイブリダイゼー
ションプローブを用いてｍＲＮＡの段階において行い、
翻訳のための追加の段階を省略することができる。この
ようなハイブリダイゼーションプローブは少なくとも１
７個のヌクレオチドから成る全合成ＤＮＡ、又は天然源
もしくは遺伝子操作された微生物から単離されたＤＮＡ
もしくはＤＮＡ断片であることができる。例えば、Ｇｄ
ＮＰＦをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを適当
な宿主中で増幅し、次に線状化しそしてＤＮＡを単離す
る。この様なＤＮＡに適当なラベル、例えば放射性ラベ
ルを付加した後、このＤＮＡを使用して関連ＧｄＮＰＦ
をコードするｍＲＮＡをスクリーニングする。好ましく
は、ラットＧｄＮＰＦをコードしている放射性ラベルさ
れたＤＮＡから成るハイブリダイゼーションプローブを
用いて、ヒトＧｄＮＰＦをコードするｍＲＮＡの存在に
ついてｍＲＮＡライブラリーをスクリーニングする。 【００４５】ｍＲＮＡ鋳型からの単離ＤＮＡの調製は、
単鎖ＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡの調製と同様、当業界に
おいてよく知られている。ｍＲＮＡ鋳型を、デオキシヌ
クレオシドトリホスフェートの混合物、場合によっては
放射性ラベルされたデオキシヌクレオシドトリホスフェ
ート（反応の結果をスクリーニングできるように）、プ
ライマー配列、例えばｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルとハ
イブリダイズするオリゴ−ｄＴ残基、及び適当な酵素、
例えば逆転写酵素と共にインキュベートする。鋳型ｍＲ
ＮＡを変性せしめた後、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を上
記のごとくデオキシヌクレオシドトリホスフェートの混
合物及び適当な酵素と共にインキュベートして二本鎖Ｄ
ＮＡを得る。 【００４６】適当な酵素は逆転写酵素、Ｅ．コリ（Ｅ．
ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、
又はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼである。場合によって
は、単鎖ＤＮＡをまず同じデオキシヌクレオチドのテイ
ルによって延長することにより相補的な同じデオキシヌ
クレオチドのプライマーの使用が可能となるが、しかし
通常は、ｄｓ ＤＮＡの形成は自然的ヘアピン形成の後
に始まる。ヘアピン形成の結果として得られるこのよう
なｄｓ ＤＮＡを、ヘアピンを切断するＳＩヌクレアー
ゼによりさらに加工する。 【００４７】ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する方法に代
えて、ゲノムＤＮＡを単離し、そして所望のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡについてスクリーニングすること
ができる。ゲノムＤＮＡを当業界において知られている
方法に従って、適当な組織から、例えばヒト胎盤細胞又
はヒト胎児肝細胞から単離する。確立された手法に従っ
て、適当な制限酵素、例えばＡｌｕＩ及びＨａｅIII で
消化し、そしてλシャロンファージ、例えばλシャロン
４Ａに導入することによりゲノムＤＮＡライブラリーを
調製する。ニトロセルロース膜上にレプリカされたゲノ
ムＤＮＡライブラリーを、ＤＮＡプローブ、例えば１７
個以上のヌクレオチドから成る合成ＤＮＡプローブ、又
は所望のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ由来のｃＤ
ＮＡを用いてスクリーニングする。 【００４８】ｍＲＮＡから調製されたｄｓ ＤＮＡ又は
ゲノム由来のｄｓ ＤＮＡの適当なベクターへの導入は
当業界においてよく知られている。好ましくは、適当な
ベクターを切断し、そして同じデオキシヌクレオシドか
ら成るテイルを設ける。次にアニールされるべきｄｓ
ＤＮＡは相補的な同じデオキシヌクレオシドのテイルを
担持していなければならず、これは、対応するデオキシ
ヌクレオシドトリホスフェート及び酵素、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの存在下での
インキュベーションにより達成される。他の方法とし
て、ｄｓ ＤＮＡを、リンカーオリゴヌクレオチドの助
けにより又は平滑末端連結により導入することができ
る。 【００４９】得られたハイブリドベクターによる適切な
宿主の形質転換は当業界においてよく知られている。例
えば、Ｅ．コリを、塩化カルシウムを含有する培地中で
のインキュベーションにより形質転換のために条件調節
し、次にハイブリドベクターにより処理する。形質転換
された宿主を、適当なマーカー、例えば抗生物質耐性マ
ーカー、例えばテトラサイクリン又はアンピシリン耐性
により選択する。ＧｄＮＰＦ ＤＮＡ又はその断片を含
有する形質転換された宿主の選択は幾つかの方法により
行うことができる。例えば、形質転換された宿主のプラ
スミドＤＮＡを単離し、そして常法に従って固定化し、
次に、ｃＤＮＡのための鋳型として最初に使用したグリ
ア系細胞からの全ｍＲＮＡとハイブリダイズせしめる。
ハイブリダイズするＲＮＡを溶出し、そして前記の様に
してインビトロで翻訳する。 【００５０】翻訳の後に得られるポリペプチドを神経突
起促進活性、プロテアーゼ阻害活性、又は抗−ＧｄＮＰ
Ｆ抗体との免疫反応についてスクリーニングし、そして
対応するＤＮＡを含有する形質転換された宿主を選択す
る。他の方法として、形質転換さた宿主の全ＤＮＡをＧ
ｄＮＰＦをコードするＤＮＡとハイブリダイズせしめ
る。例えば、ヒトＧｄＮＰＦをコードしていると予想さ
れる形質転換された宿主のＤＮＡを、ラットＧｄＮＰＦ
をコードしていることが知られているＤＮＡプローブと
ハイブリダイズせしめる。 【００５１】この発明のＤＮＡの製造はまた、化学合成
によっても行うことができる。ＤＮＡを合成するための
適当な方法は、S. A. Narang〔Tetrahedron ，３９，３
（１９８３）〕により要約の形で与えられている。既知
の合成技法が、４０ヌクレオチドまでの長さのポリヌク
レオチドの調製を、良好な収率、高純度及び比較的短い
時間で可能にする。適切に保護されたヌクレオチドを、
ホスホジエステル法〔K. L. Agarwal 等、Angew. Che
m.，８４，４８９（１９７２）〕又はさらに効率的なホ
スホトリエステル法〔C. B. Reese, Tetrahedron , ３
４，３１４３（１９７２）〕、ホスファイトトリエステ
ル法〔R. L. Letsinger 等、J. Am. Chem.Soc. , ９
８，３６５５（１９７６）〕、又はホスホラミダイト法
〔S. L. Beaucage及びM. H. Caruthers, Tetrahedron
Letters , ２２，１８５９（１９８１）〕により相互に
連結する。 【００５２】オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド
の合成の簡素化は固相法によって可能となり、この方法
においてはヌクレオチド鎖を適当なポリマーに結合せし
める。Itakura 等〔J. Am. Chem. Soc. , １０３，７０
６（１９８１）〕は、個々のヌクレオチドの代りにトリ
ヌクレオチドを使用し、そしてこれらをホスホトリエス
テル法により固相合成において連結している。こうし
て、短時間でしかも良好な収率で６７ヌクレオチドまで
のポリヌクレオチドを調製することができる。実際の二
本鎖ＤＮＡは、化学的に合成された、両ＤＮＡ鎖からの
オーバーラップするオリゴヌクレオチドから酵素的に組
み立てることができる。 【００５３】この場合、オリゴヌクレオチドは塩基対合
により正しい配置で保持され、そして酵素ＤＮＡリガー
ゼにより化学的に連結される。他の可能性は、２つのＤ
ＮＡ鎖からのオーバーラップする単一ポリヌクレオチド
配列を、４種類の必要なデオキシヌクレオシドトリホス
フェートの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断
片、又はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと共に、あるいはＡ
ＭＶ（鳥類骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素と共にイン
キュベートすることを含む。これにより、２つのポリヌ
クレオチド配列が塩基対合により正しい配列に保持さ
れ、そして前記酵素により必要なヌクレオチドで補完さ
れ、完全な二本鎖ＤＮＡが得られる〔S. A. Narang等、
Anal. Biochem., １２１，３５６（１９８２）〕。 【００５４】この発明はさらに、ＧｄＮＰＦ、関連ペプ
チド又はこれらの断片をコードするＤＮＡであって、場
合によっては発現制御配列に連結されているものを含ん
で成るハイブリドベクター、及びその製造方法に関す
る。ベクターは、形質転換のために予想される宿主細胞
に依存して選択される。適当な宿主の例は、制限酵素又
は修飾酵素を欠いているか又はその含有量が少ない微生
物、例えば酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）、及び細菌の株、特にエシェリシャ・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の株、例えばＥ．コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）χ１７７６、Ｅ．コリＨＢ１０１、
Ｅ．コリＷ３１１０、Ｅ．コリＨＢ１０１／ＬＭ１０３
５、Ｅ．コリＪＡ２２１又はＥ．コリＫ１２株２９４、
バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）、バシルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ヘ
モフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコ
ッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）等、並びにさら
に高等生物の細胞、特に樹立されたヒト又は動物のセル
ラインである。Ｅ．コリの上記株、例えばＥ．コリＨＢ
１０１及びＥ．コリＪＡ２２１、並びにさらにサッカロ
ミセス・セレビシエーが宿主微生物として好ましい。 【００５５】原理的には、選択された宿主中で複製し、
そしてこの発明のＧｄＮＰＦ遺伝子を発現するすべての
ベクターが適当である。Ｅ．コリの株中でのＧｄＮＰＦ
の発現のために適当なベクターの例として、バクテリオ
ファージ、例えばλバクテリオファージの誘導体、又は
プラスミド、例えば特にプラスミドＣｏｌＥｌ及びその
誘導体、例えばｐＭＢ９，ｐＳＦ２１２４，ｐＢＲ３１
７又はｐＢＲ３２２が挙げられる。この発明の好ましい
ベクターはプラスミドｐＢＲ３２２に由来する。適当な
ベクターは完全なレプリコン、及び発現プラスミドによ
り形質転換された宿主を表現形質に基いて選択しそして
同定することを可能にするマーカー遺伝子を含有する。
適当なマーカー遺伝子は宿主に、例えば貴金属、抗生物
質等に対する耐性を付与する。 【００５６】さらに、この発明の好ましいベクターは、
レプリコン及びマーカー遺伝子領域のほかに制限エンド
ヌクレアーゼのための認識配列を含有し、これによって
ＧｄＮＰＦ遺伝子及び適当な場合には発現制御配列がこ
れらの部位に挿入され得るようになっている。好ましい
ベクターであるプラスミドｐＢＲ３２２及び誘導された
プラスミド、例えばｐＵＣ９は、無傷のレプリコン、テ
トラサイクリン及びアンピシリンに対する耐性を付与す
るマーカー遺伝子（ｔｅｔ^R 及びａｍｐ^R ）、並びに制
限エンドヌクレアーゼ、例えばＰｓｔＩ（ａｍｐ^R 遺伝
子中を開裂せしめ、ｔｅｔ^R 遺伝子を無傷のまま残
す）、ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄII、及びＳａｌＩ（これら
はすべてｔｅｔ^R 遺伝子中を開裂せしめ、ａｍｐ^R 遺伝
子を無傷のまま残す）、ＮｒｕＩ及びＥｃｏＲＩのため
の多くのユニーク認識部位を含有する。 【００５７】遺伝子発現の制御のために幾つかの発現制
御配列を使用することができる。特に、形質転換される
べき宿主の高度に発現される遺伝子の発現制御配列が使
用される。ハイブリドベクターとしてｐＢＲ３２２を使
用し、そして宿主としてＥ．コリを使用する場合、例え
ば、ラクトースオペロン、トリプトファンオペロン、ア
ラビノースオペロン等の発現制御配列（特に、プロモー
ター及びリボゾーム結合部位を含む）、β−ラクタマー
ゼ遺伝子の発現制御配列、ファージλＮ遺伝子及びファ
ージｆｄ−コート蛋白質遺伝子等の対応する配列が適当
である。プラスミドｐＢＲ３２２はβ−ラクタマーゼ遺
伝子（β−ｌａｃ遺伝子）のプロモーターを含有する
が、他の発現制御配列をこのプラスミドに導入しなけれ
ばならない。 【００５８】酵母における複製及び発現のために適当な
ベクターは酵母複製開始点及び酵母用選択遺伝子マーカ
ーを含有する。酵母複製開始点、例えば染色体自律複製
セグメント（ａｒｓ）を含有するハイブリドベクター
は、形質転換の後酵母細胞内で染色体外に保持されそし
て自律複製する。さらに、酵母２μプラスミドと相同な
配列を含有するハイブリドベクターを使用することがで
きる。この様なハイブリドベクターは、細胞中にすでに
存在する２μプラスミドに組換により組み込まれるであ
ろう。２μ配列は高形質転換頻度を有するプラスミドの
ために特に適当であり、そして高コピー数を可能にす
る。この発明の好ましい酵母ベクターはプラスミドｐＪ
ＤＢ２０７である。 【００５９】酵母のための適当なマーカー遺伝子は特
に、宿主に抗生物質耐性を付与するもの、又は栄養要求
酵母変異株の場合には宿主の傷害を補完する遺伝子であ
る。対応する遺伝子は、例えば、抗生物質シクロヘキシ
ミドに対する耐性を与え、又は栄養要求酵母変異株に原
栄養性を与えるものであり、例えばＵＲＡ３，ＬＥＵ
２，ＨＩＳ３、又は特にＴＲＰ１遺伝子である。酵母ハ
イブリドベクターはさらに、好ましくは細菌宿主、特に
Ｅ．コリのための複製開始点及びマーカー遺伝子を含有
し、ハイブリドベクター及びその中間体の造成及びクロ
ーニングを細菌宿主中で行うことができるようにされて
いる。 【００６０】酵母における発現のために適当な発現制御
配列は、例えば高度に発現される酵母遺伝子である。す
なわち、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩ又はＡＤＨII遺伝
子、酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ３又はＰＨＯ５）遺伝
子、イソチトクローム遺伝子の各プロモーター、あるい
は解糖系に関与する酵素の遺伝子のプロモーター、例え
ばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、３−ホスホグリセレ
ートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベート
デカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコ
ース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリ
セレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホ
スフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラー
ゼ及びグルコキナーゼの各遺伝子のプロモーターを使用
することができる。この発明の好ましいベクターは、転
写制御を伴うプロモーター、例えばＰＨＯ５，ＡＤＨII
及びＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターであり、これらは
増殖条件の変化によりターンオン又はターンオフするこ
とができる。例えば、ＰＨＯ５プロモーターは培地中の
無機リン酸塩の濃度を上昇せしめ又は低下せしめるだけ
で抑制又は抑制解除され得る。 【００６１】哺乳動物細胞での複製及び発現のために適
当なベクターは好ましくは、ウイルス、例えばシミアン
ウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳ
Ｖ）、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰ
Ｖ）、パポバウイルス（ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓ）ＢＫ
変異株（ＢＫＶ）、又はマウスもしくはヒトサイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）からのＤＮＡを有する。好ましく
は、この様なベクターは、真核生物転写制御配列と共
に、Ｅ．コリ中での増幅のための複製開始点及び抗生物
質耐性遺伝子を含有する。特に、いわゆるシャトルベク
ターをｐＢＲ３２２Ｅ．コリ・プラスミドとＳＶ４０及
び／又はＣＭＶエンハンサー及びプロモーター領域とか
ら造成することができる。 【００６２】例えば、プラスミドはマウス又はヒト・サ
イトメガロウイルス主要初期遺伝子（ｍａｊｏｒ ｉｍ
ｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ）のエンハンサ
ーユニット、ヒトα−グロビンプロモーターと組み合わ
されたＳＶ４０エンハンサー、及び／又はさらに、誘導
性プロモーター、例えばヒートショック遺伝子又はメタ
ロチオネイン遺伝子由来のプロモーターを含有すること
ができる。さらに、目的遺伝子配列に通常関連している
プロモーター又は制御配列を使用することができる。複
製開始点は、異種性複製開始点、例えばＳＶ４０又は他
のウイルス起源からの複製開始点を含有する様にベクタ
ーを造成することにより、あるいは宿主細胞の染色体複
製機構により与えられる。ベクターが宿主細胞染色体に
組み込まれる場合、後者の方法が一層効果的である。 【００６３】好ましい態様において、この発明は、宿主
株中での複製及び表現型選択が可能なハイブリドベクタ
ーに関し、このベクターはプロモーター、及びＧｄＮＰ
Ｆ、関連ペプチド又はこれらの断片をコードするＤＮＡ
を含んで成り、このＤＮＡは転写開始及び停止シグナル
並びに翻訳開始及び終止シグナルと共に該ハイブリドベ
クター中に前記プロモーターの制御のもとに、形質転換
された宿主中でそれが発現されポリペプチドが生産され
る様に配置されている。この発明はさらに形質転換され
た宿主の製造方法に関し、この方法は宿主を発現制御配
列により制御されるこの発明のＤＮＡを含有する発現ベ
クターで形質転換することを含んで成る。この発明はさ
らに、形質転換された宿主それ自体に関する。 【００６４】適当な宿主の例は前記の微生物、例えばサ
ッカロミセス・セレビシエー、バシルス・ズブチリス、
及びエシェリシャ・コリである。この発明の発現プラス
ミドによる形質転換は例えば文献に記載されているよう
にして行われる。Ｓ．セレビシエーについてはA. Hinne
n 等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ７５，１９２９
（１９７８）にＢ．ズブチリスについてはAnagnostopou
los 等、J. Bacteriol.，８１，７４１（１９６１）
に、そしてＥ．コリについてはM. Mandel 等、J. Mol.
Biol. , ５３，１５９（１９７０）に記載されている。 【００６５】すなわち、Ｅ．コリ細胞の形質転換方法は
ＤＮＡの取り込みを可能にするための細胞のＣａ⁺⁺処
理、及びハイブリドベクターとのインキュベーションを
含む。親細胞から形質転換された細胞を分離することを
可能にする選択増殖培地に細胞を移す。ベクターを含有
しない細胞はこの様な増地中で生存しないであろう。酵
母の形質転換は、例えば、（１）グルコシダーゼによる
酵母細胞壁の酵素的除去、（２）ポリエチレングリコー
ル及びＣａ⁺⁺イオンの存在下でのベクターによるスフェ
ロプラストの処理、及び（３）スフェロプラストを寒天
に包埋することによる細胞壁の再生、の各段階を含む。
好ましくは、再生寒天は、形質転換された細胞の再生と
選択を同時に可能にする様に調製される。 【００６６】適当な宿主の他の例は哺乳動物細胞、例え
ばＣＯＳ−７細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、チャイニー
ズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は胎児肺細胞Ｌ−
１３２である。ベクターは、ヘルパー化合物、例えばジ
エチルアミノエチルデキストラン、ジメチルスルホキシ
ド、グリセリン、ポリエチレングリコール等の存在下
で、又はベクターＤＮＡをリン酸カルシウムと共沈せし
めて、トランスフェクションにより哺乳動物細胞に導入
される。他の適当な方法は、細胞核へのベクターＤＮＡ
の微量注入、及びエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、すなわち細胞膜の透過性を増
加せしめる短パルスによるＤＮＡの導入を包含する。 【００６７】これに続く形質転換された細胞の選択は、
発現ベクターに共有結合的に組み込まれているか又は別
途加えられた選択マーカーを用いて行うことができる。
選択マーカーには抗生物質、例えばＧ−４１８（ネオマ
イシン）又はハイグロマイシンに対する耐性を付与する
遺伝子、又は宿主の傷害、例えばチミジンキナーゼもし
くはヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ
の不存在を補完する遺伝子が含まれる。形質転換された
宿主細胞は、資化性の炭素及び窒素源並びに無機塩を含
有する液体培地中で当業界において知られている方法で
培養する。 【００６８】この発明の形質転換された宿主の培養のた
めに種々の炭素源を使用することができる。好ましい炭
素源の例として、資化性炭水化物、例えばグルコース、
マルトース、マンニトールもしくはラクトース、又は酢
酸塩であり、これらは単独で又は適当な混合物として使
用することができる。適当な窒素源の例としてアミノ
酸、例えばカザミノ酸、ペプチド及び蛋白質並びにこれ
らの分解生成物、例えばトリプトン、ペプトン又は肉エ
キス、そしてさらに酵母エキス、マルトエキス、さらに
アンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム又は硝酸アンモニウムが挙げられ、これらは単独
で、又は適当な混合物として使用することができる。使
用することができる無機塩は、例えば、ナトリウム、カ
リウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、塩化
物、リン酸塩及び炭酸塩である。 【００６９】培地はさらに、例えば、増殖促進物質、例
えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等、及び好ま
しくは、選択圧を発揮しそして発現プラスミドを喪失し
た細胞の増殖を防止する物質を含有する。すなわち、例
えば、発現プラスミドがａｍｐ^R 遺伝子を含有する場合
には培地にアンピシリンを添加する。抗生物質のこのよ
うな添加はまた、抗生物質感受性の汚染微生物が除去さ
れるという効果を有する。例えば、必須アミノ酸栄養要
求性である酵母株が宿主微生物として使用される場合、
プラスミドは好ましくは宿主の欠陥を補完する酵素をコ
ードする遺伝子を含有する。酵母株の培養は前記アミノ
酸を欠く最少培地中で行われる。 【００７０】脊椎動物細胞は、増殖促進物質及び／又は
哺乳類血清が補充されている場合がある市販培地を用い
て組織培養条件下で増殖せしめる。細胞を固体支持体、
例えばマイクロキャリヤー又は多孔性ガラスファイバー
に付着させて、あるいは適当な培養容器中に自由浮遊さ
せて増殖せしめる。培養は当業界において既知の方法に
より行う。培養条件、例えば温度、培地のpH地、及び発
酵時間は、この発明のポリペプチドの最高力価が得られ
るように選択する。すなわち、Ｅ．コリ又は酵母株は好
ましくは振とう又は攪拌を伴う深部培養により好気的条
件下で、約２０℃〜４０℃、好ましくは約３０℃の温度
において、そして４〜８、好ましくは約７のpH値におい
て、約４〜３０時間、好ましくはこの発明のポリペプチ
ドの最大収量が達成されるまで培養する。 【００７１】細胞密度が十分な値に達した時、培養を停
止しそしてポリペプチドを単離する。ポリペプチドが適
当なシグナルペプチド配列と融合している場合、これは
細胞により上清に直接分泌される。これ以外の場合に
は、洗剤、例えばＳＤＳ，ＮＰ−４０、トリトン又はデ
オキシコール酸で処理することにより細胞を破砕する
か、あるいはリゾチームもしくは類似の作用を有する酵
素又は超音波により細胞を溶解しなければならない。宿
主微生物として酵母を使用する場合、グルコシダーゼを
用いる酵素的消化によって細胞壁を除去することができ
る。これに代えて又はこれに加えて、機械的力、例えば
剪断力（例えばＸ−プレス、フレンチプレス、ダイノミ
ル）、又はガラスビーズもしくは酸化アルミニウムとの
振とう、あるいは、例えば液体窒素中での凍結と例えば
３０℃〜４０℃での解凍との反復を用いて細胞を破壊す
ることができる。 【００７２】細胞を破壊した後に得られる混合物の遠心
分離の後に得られる、蛋白質、核酸及び他の細胞成分を
含有する細胞上清又は溶液を、それ自体既知の方法によ
り、この発明のポリペプチドを包含する蛋白質について
濃縮する。すなわち、例えば非蛋白質性成物のほとんど
をポリエチレンイミン処理により除去し、そしてこの発
明のポリペプチドを包含する蛋白質を例えば硫酸アンモ
ニウム又は他の塩による飽和によって沈澱せしめる。他
の方法においては、細胞上清又は溶解物をクロマトグラ
フ法により直接前精製することができる。 【００７３】追加の精製段階は例えば、限外濾過、ダイ
アフィルトレーション、ゲル電気泳動、クロマトグラフ
法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除
クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、固定ポリペプチド液体クロマ
トグラフィー（ＦＰＬＣ）等、適当なゲル濾過カラムに
よる分子サイズに従う混合物の成分の分離、透析、アフ
ィニティークロマトグラフィー、例えば、抗体、特にモ
ノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラ
フィー、並びに当業界において知られている他の方法を
包含する。この発明はさらに、この発明の方法により調
製されたＧｄＮＰＦ、関連ペプチド及びそれらの断片に
関する。この発明は特に、例に記載されたハイブリドベ
クター、形質転換された宿主細胞、ヒトＧｄＮＰＦ、及
びそれらの製造方法に関する。 【００７４】この発明のＧｄＮＰＦ、関連ペプチド及び
それらの断片の神経突起促進性及びセリンプロテアーゼ
阻害性のため、これらのポリペプチドは神経系の傷害の
後の神経線維の再生の促進のために有用であり、好まし
くは、療法的有効量の活性成分を無機又は有機の個体又
は液体の非経口投与のために適当な医薬として許容され
るキャリヤーと共に含んで成る医薬製剤の形で使用され
る。非経口剤は特に、種々の方法で、例えば静脈内、筋
肉内、腹腔内、鼻内、皮内又は皮下への投与において有
効な注射液である。このような液剤は、好ましくは、活
性成分を単独で又は医薬として許容されるキャリヤーと
共に含有する凍結乾燥調製物から使用前に調製すること
ができる等張水溶液又は懸濁液である。医薬製剤は無菌
化されていてもよくそして／又は助剤、例えば防腐剤、
安定剤、湿潤剤及び／又は乳化剤、安定剤、浸透圧調整
塩及び／又は緩衝剤を含有することができる。 【００７５】この発明の医薬製剤は、所望により他の薬
理学的に価値がある物質を含有し、そしてそれ自体既知
の方法で、例えば常用の溶解又は凍結乾燥法により製造
され、そして約０．１〜１００％、特に約１％〜約５０
％の活性成分を含有し、そして凍結乾燥物の場合には１
００％までの活性成分を含有する。この発明はまた、こ
の発明の薬学的に活性な化合物を医薬として許容される
キャリヤーと混合することを特徴とする医薬製剤の製造
方法に関する。特性の投与方法及び投与量は、患者の状
態、疾患の種類及び疾患の状態を考慮して医師により選
択されるであろう。例えば、神経系の傷害は、毎日１回
又は毎日２回数日〜数週間にわたる０．００１〜１mg／
kg体重の投与により治療される。次に、例によりこの発
明をさらに具体的に説明するが、これによりこの発明の
範囲を限定するものではない。例において使用する略号
は次の意味を有する。 【００７６】 ｂｐ 塩基対 ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ｃＤＮＡ 相補的ＤＮＡ ｃｐｍ カウント／分（放射能崩壊） ｄＡ ２′−デオキシアデノシン ｄＡＴＰ ２′−デオキシアデノシントリホスフェート ｄＣ ２′−デオキシシチジン ｄＣＴＰ ２′−デオキシシチジントリホスフェート ｄＧ ２′−デオキシグアノシン ｄＧＴＰ ２′−デオキシグアノシントリホスフェート ＤＭＥＭ ドルベコの改変イーグル培地 ＤＮＡ デオキシリボ核酸 ｄＮＴＰ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの混合物 ｄｐｍ 崩壊／分（放射能崩壊） ｄｓ ＤＮＡ 二本鎖ＤＮＡ 【００７７】 ｄＴ ２′−デオキシチミジン ＤＴＴ １，４−ジチオスレイトール ｄＴＴＰ ２′−デオキシチミジントリホスフェート ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＦＣＳ ウシ胎児血清 ＧｄＮＰＦ グリア由来神経突起促進因子 Ｈｅｐｅｓ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスル ホン酸 ｍＲＮＡ メッセンジャーＲＮＡ ＰＢＳ リン酸緩衝化生理的塩溶液 Ｐｉｐｅｓ ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸） ＰＭＳＦ フェニルメチルスルホニルフルオリド ＲＮＡ リボ核酸 ｒｐｍ 回転数／分 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＴＦＡ トリフルオロ酢酸 Ｔｒｉｓ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ｔＲＮＡ トランスファーＲＮＡ 【００７８】下記の緩衝液及び培地を使用する。 溶出緩衝液 １０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．５，１mM ＥＤＴＡ， ０．２％ ＳＤＳ。 免疫緩衝液 ５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．５，１mM ＥＤＴＡ， １５０mM，ＮａＣｌ，０．１％トウィーン−２０^TM。 Ｌａｅｍｍｌｉの ６２．５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH６．８，２％ ＳＤＳ， サンプル緩衝液 １０％グリセリン、５％２−メルカプトエタノール、 ０．００１％ブロモフェノールブルー。 ＬＢ−培地 １％バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ），０．５％バクト酵母 エキス（ディフコ）、１７０mM ＮａＣｌ，ＮａＯＨにより pH７．５に調整。 【００７９】 ＲＶＴ緩衝液 ２００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH８．３ ａｔ ４２℃， ２０mM ＭｇＣｌ₂ ，２８０mM ＫＣｌ，２０mM ＤＴＴ。 ＳＳＣ緩衝液 １５mMクエン酸ナトリウム、１５０mM ＮａＣｌ，ＮａＯＨ によりpH７．０に調整。 ＴＢＥ緩衝液 ８９mM Ｔｒｉｓ（ＴＲＩＺＭＡ（登録商標）塩基）、 ８９mM硼酸１mM ＥＤＴＡ。 ＴＮＥ緩衝液 １０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH８．０，１mM ＥＤＴＡ， ０．１Ｍ ＮａＣｌ。 洗浄緩衝液 １０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．５，１mM ＥＤＴＡ， ０．５Ｍ ＮａＣｌ，０．２％ ＳＤＳ。 【００８０】例１． ラットＣ６神経膠腫細胞からのｍ
ＲＮＡの単離 ラットＣ６神経膠腫細胞（ＡＴＣＣ No. ＣＣＬ １０
７）を、１０％ウシ胎児血清を補充した１５mlのダルベ
コ改変イーグル培地（ギブコ）を収容した１０cmの組織
培養皿中で増殖せしめる。１２０個のコンフルエント状
態の培養皿（皿当り約２．５×１０⁷ 個のラット神経膠
腫細胞）を使用して、Ｒ．Ｄ．Ｐａｌｍｉｔｅｒ〔Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３，３６０６−３６１５（１
９７４）〕により記載された方法によりｍＲＮＡを濃縮
する。マグネシウム沈澱により得られたｍＲＮＡ画分を
さらにＭ．Ｅｄｍｏｎｄｓ等〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６８，１３３６─１３４０
（１９７１）〕の方法に従ってオリゴ（ｄＴ）セルロー
ス上で精製する。 【００８１】例２． ラットＧｄＮＰＦについてのｍＲ
ＮＡの濃縮 例１からの６００μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡ（１μｇ／μ
ｌ）を７０℃にて５分間加熱し、氷水中で迅速に冷却
し、そして１０mM Ｈｅｐｅｓ pH７．５／１mMＥＤＴ
Ａ／１００mM ＮａＣｌ中５〜２０％シュークロース線
状グラジエント上に負荷し、そして２０℃のＳＷ２７ロ
ーター中で２０００rpm にて２３時間遠心する。２０画
分を集め、そして−２０℃にて一夜エタノールにより沈
澱せしめる。ｍＲＮＡをＳＳ−３４ローター中で１５０
００rpm にて２０分間遠心し、７５％エタノール中で１
回洗浄し、そして最後に水に１μｇ／μｌの濃度に溶解
する。 【００８２】個々の画分を、次の様にしてカエルの卵母
細胞に注入することによりアッセイする。試験される各
ｍＲＮＡ画分５０ｎｌを１個の卵母細胞に注入する。同
じｍＲＮＡを含有する３個の卵から成る群を１００μｌ
のＢａｒｔｈ溶液中で２２℃にて２４時間インキュベー
トする。インキュベーション培地を除去し、そしてＪ．
Ｇｕｅｎｔｈｅｒ等〔ＥＭＢＯ Ｊ．，４，１９６３−
１９６６（１９８５）〕により記載されているカゼイン
分解におけるプロテアーゼ阻害活性（これはＧｄＮＰＦ
活性と平行する）についてアッセイする。要約すれば、
ミルク粉末の懸濁液、ヒトウロキナーゼ、精製されたヒ
トプラスミノーゲン、及び試験されるべき溶液の混合物
を適当な緩衝液混合物中でインキュベートし、そして４
０５nmにおける濁度の低下を測定することによりカゼイ
ン分解をモニターする。次の結果が得られる。 【００８３】 【表２】 画分１３及び１４をプールし、そしてｃＤＮＡ合成のた
めに使用した（例３）。 【００８４】例３． ラットＧｄＮＰＦをコードするｄ
ｓ ｃＤＮＡの調製 例２のラットＧｄＮＰＦをコードする濃縮されたｍＲＮ
Ａを鋳型として使用して、Maniatis Handbook 〔T. Man
iatis, E.F. Fritsch 及びJ. Sambrook,“Molecular Cl
oning, A Laboratory Manual”、コールドスプリングハ
ーバーラボラトリー、１９８２〕に記載されているのと
実質的に同じ方法により二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ ＤＮＡ）
を調製する。 【００８５】３．１． 第一鎖の合成 １００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．２、４２℃に
て），７０mM ＫＣｌ，１０mM ＭｇＣｌ₂ ，１mM Ｄ
ＴＴ，１mMずつのｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ，
０．４mM ｄＡＴＰ，５０μCi α−³²Ｐ−ｄＡＴＰ
（アメルシャム、３０００Ci／mmol），５０μｇ／mlオ
リゴｄＴ（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）、１００μｇ／ml
ｍＲＮＡ（例２）、及び５０ユニットの鳥類骨髄芽球
症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素（ステーリン、バーゼ
ル、スイス）を含有する反応混合物１００μｌを４２℃
にて６０分間インキュベートする。この溶液を１０mM
ＥＤＴＡに調整することにより反応を停止する。この混
合物を、１Ｍ ＮａＯＨを０．２Ｍの最終濃度に加える
ことにより５２℃にて９０分間加水分解する。１Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）、及び１Ｍ ＨＣｌで中和
した後、反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出
する。 【００８６】有機相を、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
８．０）／１mM ＥＤＴＡ／１００mM ＮａＣｌにより
１回逆抽出する。プールされた水相をセファデックスＧ
−５０カラムに適用する。１００μｌずつの画分を集
め、セレンコス計数〔Ｐ．Ｗ．Ｊ．Ｒｉｇｂｙ等、Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１３，２３７−２５１（１９７
７）〕により放射能をモニターする。ｃＤＮＡ含有画分
をプールし、そしてエタノールで沈澱せしめる。単鎖ｃ
ＤＮＡの収量は４．６μｇである。３０mM ＮａＯＨ／
１mM ＥＤＴＡ中２％アルカリ性アガロースゲルでの電
気泳動移動度から決定した場合、ｃＤＮＡのサイズは７
００〜２０００ヌクレオチドの長さである。 【００８７】３．２． 第二鎖の合成およびＳ１消化 得られたｃＤＮＡを、１００μｌの最終容量の１００mM
Ｈｅｐｅｓ（pH６．９），１０mM ＭｇＣｌ₂ ，２．
５mM ＤＴＴ，７０mM ＫＣｌ，０．５mMずつのｄＮＴ
Ｐ，５．８μCi ³Ｈ−ｄＧＴＰ、及び３２ユニットのＤ
ＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ断片、ベーリンガー・
マンハイム）中で２０℃にて１５０分間インキュベート
する。１６ユニットの酵素を加え、そしてインキュベー
ションを３７℃にて６０分間続ける。ＥＤＴＡを１０mM
に添加することにより反応を停止せしめる。この混合物
をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノー
ルで沈澱せしめる。 【００８８】生ずるＤＮＡを、２５０mM ＮａＣｌ，５
０mM酢酸ナトリウム（pH４．５）、１mM ＺｎＳＯ₄ 、
及び５００ユニット／mlのＳ１エンドヌクレアーゼ（ベ
ーリンガーマンハイム）を含有するインキュベーション
混合物１００μｌ中で３７℃にて３０分間インキュベー
トする。ＥＤＴＡを１０mMに添加することにより反応を
停止する。１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）を１０
０mMに添加した後、反応混合物をフェノール／クロロホ
ルムにより抽出する。ｃＤＮＡをエタノールにより−７
０℃にて３０分間沈澱せしめる。遠心分離の後、得られ
たｄｓ ｃＤＮＡを、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．４），７mM ＭｇＣｌ₂ ，１mM ＤＴＴ，１mMずつ
のｄＮＴＰ、及び１．５ユニットのＫｌｅｎｏｗ断片を
含有する溶液２０μｌ中に溶解する。 【００８９】反応混合物を２２℃にて３０分間インキュ
ベートし、そして次にＥＤＴＡを１０mMに添加すること
により反応を停止する。抽出、及び１０mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．５）／１mM ＥＤＴＡ／３００mM Ｎａ
Ｃｌ中セファデックスＣＬ−４Ｂカラムへの通過の後、
ｃＤＮＡ含有画分のアリコートを２％アガロースゲル上
でアッセイする。６００bp以上の分子を含む画分をプー
ルし、エタノールで沈澱せしめ、そして１０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH７．５）／１mM ＥＤＴＡ中に溶解す
る。０．６μｇのｄｓ ｃＤＮＡが得られる。 【００９０】例４． ラットＧｄＮＰＦをコードするｄ
ｓ ｃＤＮＡを含有する、プラスミドｐＢＲ３２２由来
のベクターの調製、及びＥ．コリＨＢ１０１の形質転換 ４．１． ポリ（ｄＣ）テイルを有するｄｓ ｃＤＮＡ
の調製 ５４０ngの例３のｄｓ ｃＤＮＡを、２００mMカコジル
酸カリウム（pH６．９），１mM ＣｏＣｌ₂ ，２６０pm
ol ³Ｈ−ｄＣＴＰ、及び６ユニットのターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｐ−Ｌバイオケ
ミカルス）を含有する溶液１００μｌ中で３７℃にて５
分間インキュベートする。反応を停止するためにＥＤＴ
Ａを１０mMに加える。この混合物をフェノール／クロロ
ホルムで抽出し、そしてＤＮＡをエタノールで沈澱せし
める。ｄＣ−テイルを有するｃＤＮＡを１０ng／μｌで
−２０℃にて貯蔵する。 【００９１】４．２． ポリ（ｄＧ）テイルを有する切
断されたｐＢＲ３２２とポリ（ｄＣ）テイルを有するｄ
ｓ ｃＤＮＡとのアニーリング、及び得られるベクター
によるＥ．コリの形質転換 ３３ngの例４．１からのｄＣ−テイルを有するｃＤＮＡ
と１７０ngのｄＧ−テイルを有するｐＢＲ３２２（Ｐｓ
ｔＩにより切断したもの、ベーリンガーマンハイム）と
の混合物を２００μｌの１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５）／１００mM ＮａＣｌ／１mM ＥＤＴＡ中で、
６５℃にて５分間、及び５５℃にて６０分間インキュベ
ートし、そして次に水浴中で２２℃に冷却する。４０μ
ｌのこのアニーリング混合物を、Ｍａｎｉａｔｉｓのハ
ンドブックに記載されているようにして形質転換のため
に調製された２００μｌのコンピテントＥ．コリＨＢ１
０１細胞に加える。 【００９２】この混合物を３０分間氷上に保持し、そし
て２分間４２℃に加熱し、次に１mlのＬＢ−培地で処理
し、そして３７℃にて３０分間インキュベートする。こ
の混合物（プレート当り２００μｌ）を、ＬＢ−培地及
び２０μｇ／mlのテトラサイクリンを含有する８cmの天
然プレート上に拡げる。プレートを３７℃にて１６時間
インキュベートする。約５０００個のテトラサイクリン
耐性コロニーが得られる。 【００９３】例５． ハイブリダイゼーション選択され
た翻訳による、ラットＧｄＮＰＦをコードするＤＮＡを
含有するクローンの同定 ５．１． ハイブリダイゼーション 例４の個々のコロニーを、２０μｇ／mlのテトラサイク
リンを含有する２００μｌのＬＢ−培地中で飽和まで増
殖せしめる。４８コロニーのプールを得るため、５０μ
ｌの各前培養物を２０μｇ／mlのテトラサイクリンを含
有する１００mlのＬＢ−培地にピペット移送する。プー
ルを一夜増殖せしめる。Ｍａｎｉａｔｉｓのハンドブッ
クに記載されているアルカリ溶菌法を用いてＤＮＡを単
離する。プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩにより線状化
し、抽出し、そして１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５）／１mM ＥＤＴＡ中に０．１μｇ／μｌの濃度に溶
解する。１００μｌのこの溶液を２０μｌずつ、未処理
のジーン・スクリーン（商標）フィルター（ニューイン
グランドニュークレア、１cm）上にピペット移送し、そ
して各段階の間乾燥する。 【００９４】このフィルターを、０．５Ｍ ＮａＯＨ／
１．５Ｍ ＮａＣｌ中に浸漬された３ＭＭ（商標）ペー
パー（ワットマン）上に１分間ずつ４回置く。この方法
を、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）／２倍濃度Ｓ
ＳＣ緩衝液に浸漬した３ＭＭペーパー上で、そして最後
に２倍濃度のＳＳＣ緩衝液中にのみ浸漬された３ＭＭペ
ーパー上で反復する。次に、フィルターを２倍濃度のＳ
ＳＣ緩衝液中で穏やかに攪拌し、真空ストープ中で８０
℃にて２時間ベーキングする。使用前に、フィルターを
沸騰水中に１分間置く。ラットＣ６神経膠腫細胞からの
全ＲＮＡ（例１）を３０％ホルムアミド／２０mM Ｐｉ
ｐｅｓ（pH７．５）／５００mM ＮａＣｌ／２mM ＥＤ
ＴＡ／０．４％ＳＤＳ中に２〜３mg／mlの濃度で溶解す
る。フィルター当り１３０μｌのこの溶液を使用して、
穏やかに攪拌しながら４２℃にて１７時間ハイブリダイ
ズせしめる。 【００９５】フィルターをＳＳＣ緩衝液／０．１％ＳＤ
Ｓ中で６０℃にて１０回、そして５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（pH７．５）／１mM ＥＤＴＡ中６０℃にて１回洗浄
する。ハイブリダイズしたＲＮＡをフィルターから、２
００μｌの５mM ＫＣｌ／１０μｇ／ml＋ＲＮＡ（ベー
リンガーマンハイム、フェノール抽出したもの）中での
煮沸及びこれに続くドライアイス−エタノール中での迅
速な凍結から成る２サイクルにより溶出する。解凍の
後、溶出液をプールし、そしてＲＮＡをエタノールによ
り−２０℃にて一夜沈澱せしめる。沈澱を遠心分離し、
そして７５％エタノール中で洗浄する。各プールから得
られたポリ（Ａ）ＲＮＡを４μｌの水に溶解し、そして
インビトロ翻訳及び抗−ＧｄＮＰＦ抗体による免疫沈澱
のために使用する。 【００９６】５．２． ラビット網状赤血球溶解物中で
のインビトロ翻訳 ラビット網状赤血球溶解物（アメルシャム、Ｎ．９０）
を³⁵Ｓ−メチオニン（アメルシャム、１０００Ci／mmo
l）及び例５．１のポリ（Ａ）ＲＮＡにより氷上で稀釈
して、細胞溶解物７０％、³⁵Ｓ−メチオニン２μCi／μ
ｌ及びＲＮＡ ４μｇ／mlの最終濃度とする。混合物を
３０℃にて１時間インキュベートする。１μｌのアリコ
ートをそれぞれ０分及び６０分で取り出し、そしてＧＦ
／Ｃフィルター（ワットマン）上にスポットし、そして
Ｍａｎｉａｔｉｓのハンドブックによるトリクロロ酢酸
沈澱のために使用する。 【００９７】ゲル電気泳動のため、２〜４μｌの細胞溶
解物混合物を２０μｌのＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液
で稀釈し、２分間煮沸し、そして１０％アクリルアミド
ゲル上で分析する〔Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕ
ｒｅ，２２７，６８０ （１９７０）〕。ゲルを３０〜
４０mAの一定電流において３〜４時間泳動にかける。固
定した後、ゲルをフルオログラフ溶液〔ＥＮＬＩＧＨＴ
ＮＩＮＧ（商標）、ニューイングランドニュークレア〕
と３０分間反応せしめ、乾燥し、そして前フラッシュし
たコダックＸ−５フィルムに室温にて一夜暴露する。 【００９８】５．３． ラットＧｄＮＰＦに対して特異
的なポリクローナル抗体の調製 約５０μｇの精製ラットＧｄＮＰＦ〔Ｊ．Ｇｕｅｎｔｈ
ｅｒ等、ＥＭＢＯ Ｊ．，４，１９６３−１９６６（１
９８５）〕を完全フロインドアジュバンド（シグマ）中
で皮下注射及び筋肉注射することによりラビットを免疫
感作する。不完全フロインドアジュバンド中約５０μｇ
の精製ラットＧｄＮＰＦの追加免疫注射を４週間の間隔
で行う。各追加免疫注射の１０日後に血清を集め、そし
てＲ．Ｈａｎｋｅｓ等〔Ａｍｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１
１９，１４２−１４７（１９８２）のイムノブロット法
を用いて抗−ＧｄＮＰＦ抗体について験検する。第２追
加免疫注射の後に陽性の血清が得られる。陽性の血清の
免疫グロブリンを濃縮し，そしてＨ．Ｈｊｅｌｍ等〔Ｆ
ＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ，２８，７３−７６ （１９７
２）〕に従う標準的プロテインＡ−セファロースＣＬ−
４８（ファルマシア）クロマトグラフィーを用いて精製
する。 【００９９】５．４． インビトロ翻訳により合成され
たラットＧｄＮＰＦの免疫沈澱 例５．２のインキュベートされたインビトロ細胞溶解混
合物１５μｌを例５．３の抗−ＧｄＮＰＦ抗体１０μｇ
と１mM ＰＭＳＦを含有する１５０μｌの免疫緩衝液中
で混合する。混合物をシリコン処理されたエッペンドル
フチューブ中で４℃にて１７時間インキュベートする。
プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシ
ア）を、これの粉末をＰＢＳ中に２〜３時間膨潤せし
め、２mg／ml ＢＳＡ（ペンタックス、画分Ｖ）を含有
する免疫緩衝液中で３回洗浄し、そしてＢＳＡを含有し
ない同じ緩衝液中で２回洗浄することにより新しく調製
する。このセファロースを免疫緩衝液により１：２で稀
釈し、その１５μｌを、細胞溶解物混合物及びポリクロ
ーナル抗体を収容するエッペンドルフチューブに加え、
そしてこの懸濁液を室温にて６０分間穏やかに攪拌す
る。 【０１００】このセファロースを０．５〜１％のトウィ
ーン−２０を含有する免疫緩衝液により３回洗浄する。
最終洗浄の後、２０μｌのＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝
液を乾燥セファロースペレットにピペット移送する。懸
濁液を室温にて１０分間インキュベートし、そして最後
に４分間煮沸する。氷上で冷却し、そして遠心分離した
後、２０μｌの上清を１０％ポリアクリルアミドゲルに
負荷する。ゲル電気泳動を行い、そして例５．２に前記
した方法により発色せしめる。４８コロニーのプール
（例５．１）の中１つが陽性である。この１プールの４
８コロニーを８コロニーの新たな６プールと一緒にし、
そして同様に処理する。最終的に、翻訳後に陽性の免疫
沈澱を与える単一コロニーを同定する。このクローンを
２０μｇ／mlのテトラサイクリンを含有するＬＢ−培地
中で拡大する。 【０１０１】５．５． ラットＧｄＮＰＦ ｃＤＮＡの
配列決定 例５．４の陽性クローンのｃＤＮＡをＳａｎｇｅｒの一
般的方法を用いて配列決定する。９μｌの水中ｐＢＲ３
２２由来の組換プラスミド（例４．２）１．５μｇを、
ｐＢＲ３２２由来ベクターのＰｓｔＩエンドヌクレアー
ゼ開裂部位のすぐ前に相補的なプライマー１μｌ（０．
５pmol）と混合する。ＤＮＡを沸騰水中で３分間加熱す
ることにより変性せしめ、ドライアイス／エタノール中
で１分間凍結し、室温にて解凍し、そして１μｌの１０
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）／５０mM ＭｇＣ
ｌ₂ と混合する。このアニーリング混合物を３７℃にて
３０分間インキュベートする。アメルシャムの配列決定
マニュアル（Ｍ１３ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋ、アメルシャム）中
に記載されている様にして配列決定反応を行う。見出さ
れた配列を式（Ｖ）に示す。 【０１０２】例６． ヒトＧｄＮＰＦ ｃＤＮＡのクロ
ーニング ６．１． ヒト神経膠腫細胞 E.H. Macintype及びN. de Tribolet両博士〔J.P. Perki
ns等、Life Sciences，10，1069-1080 (1971)；B. De M
uralt等、Eur. J. Cancer Clin. Oncol. ，21，207-216
(1985)〕により樹立された５個のヒト神経膠腫セルラ
インを、ナサンブロットにより、例５の陽性ラットＧｄ
ＮＰＦ ｃＤＮＡクローンのインビトロ−ニックトラン
スレーションにより³²ＰでラベルされたＤＮＡプローブ
とハイブリダイズするｍＲＮＡの存在について分析す
る。レーン当り１０μｇの全細胞質ＲＮＡを使用する。
ハイブリダイゼーションは４２℃にて１５時間、１×１
０⁶cpm ／mlのニックトランスレーションプローブを用
いて行う。 【０１０３】フィルターを、３０mMクエン酸ナトリウム
（pH７．０）／３００mM ＮａＣｌ／０．１％ＳＤＳ中
で室温にて５分間ずつ４回、及び１．５mMクエン酸ナト
リウム（pH７．０）／１５mM ＮａＣｌ／０．１％ＳＤ
Ｓ中で６０℃にて１５分間ずつ２回、洗浄する。“Coll
ection Nationale de Cultures de Microorganisme
s”、パスツール研究所、パリ、に１９８６年２月５日
にNo. Ｉ−５１８として寄託されているセルラインＬＮ
−３４０が強いハイブリダイゼージインを与える。これ
を４０個の１０cm組織培養皿中でコンフルエントまで増
殖せしめる。 【０１０４】６．２． ｍＲＮＡの単離 約１０⁸ 個の細胞を含有するヒト神経膠腫細胞ＬＮ−３
４０のペレット１mlを、１００ｇのチオシアン酸グアニ
ジン、１００mlの水、１０．６mlの１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH７．５）、４．２mlの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、２
１．２mlの２０％Ｎ−ラウリルサルコシン及び２．１ml
の２−メルカプトエタノールから調製された濾過された
溶液６ml中に溶解する。激しく振とうした後２．７ｇの
乾熱したＣｓＣｌを加え、そしてこの溶液を１２mlの遠
心チューブ中０．１Ｍ ＥＤＴＡ（pH７．５）中５．７
Ｍ ＣｓＣｌから成るクッション溶液２ml上に重層す
る。このチューブを水で満たし、そしてＴＳＴ４１ロー
ター（コントロン）中で２０℃にて、２９０００rpm で
１６時間遠心する。 【０１０５】この運転の終りにほとんどの上清を除去
し、そしてチューブを手早く液切りする。ガラス状のＲ
ＮＡペレットを０．４mlの１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH７．５）及び０．２％ＳＤＳ中に滑動及び時々の加
温（２分間、３７℃）により溶解する。１mlのエタノー
ルを添加し、そしてエッペンドルフ中で５分間遠心分離
することによりＲＮＡを沈澱せしめる。ＲＮＡ（１．１
mg）を空気乾燥し、そして０．５mlの溶出緩衝液に溶解
する。６８℃にて２分間加熱しそして氷上で冷却した
後、５５μｌの５Ｍ ＮａＣｌを添加し、そしてこの溶
液を洗浄緩衝液中で平衡化したオリゴ−ｄＴセルロース
（タイプ７、Ｐ−Ｌバイオケミカルス）の２mlカラムに
適用する。 【０１０６】サンプルを次々と３回適用した後、カラム
を１５mlの洗浄緩衝液で洗浄し、そして結合したＲＮＡ
を４mlの溶出緩衝液により溶出する。溶出された材料を
６８℃にて２分間加熱し、冷却し、そして０．４４mlの
５Ｍ ＮａＣｌを加える。この溶液を再平衡化されたオ
リゴ−ｄＴセルロースカラム（３Ｘ）に適用する。１５
mlの洗浄緩衝液で洗浄した後、結合したＲＮＡを４mlの
溶出緩衝液により溶出する。０．２５mlの３Ｍ酢酸ナト
リウム（pH５．５）及び１０mlのエタノールの添加によ
り−２０℃にて一夜ＲＮＡを沈澱せしめる。沈澱（７６
μｇ）を遠心分離（１６０００×ｇにて１５分間）によ
り集め、０．４mlの水に溶解し、そして２５μｌの３Ｍ
酢酸ナトリウム及び１mlのエタノールの添加により再沈
澱せしめる。ドライアイス中で１０分間冷却した後、エ
ッペンドルフ中で５分間遠心分離することによりＲＮＡ
を集める。ペレットを空気乾燥しそして７５μｌの水に
溶解する。 【０１０７】６．３． ｃＤＮＡの調製 １０μｌ（１mg／ml）のＲＮＡ溶液を、２５μｌ ＲＶ
Ｔ緩衝液、２．５μｌｄＮＴＰ混合物（２０mMずつのｄ
ＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰ）、５μｌの
１mg／mlオリゴ−ｄＴ_12-18 （Ｐ−Ｌバイオケミカル
ス）、１μｌのα−³²Ｐ−ｄＣＴＰ（１０μCi，３００
０／mmol）、３μｌのＲＮａｓｉｎ（商標）（６０ユニ
ット、バイオテック）、３μｌの逆転写酵素（６６ユニ
ット、ゼノフィット）及び２μｌの水を含む溶液中でイ
ンキュベートする。この混合物を４２℃にて１．５時間
インキュベートし、そして次に２μｌの０．５Ｍ ＥＤ
ＴＡ（pH７．５）を添加することにより反応を停止す
る。 【０１０８】２５μｌの０．１５Ｍ ＮａＯＨを添加し
そして６５℃にて１時間インキュベートすることにより
ＲＮＡを分解する。この溶液を、２５μｌの１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）及び６μｌの１Ｍ ＨＣｌを
添加することにより中和する。２μｌの２０％ＳＤＳを
加え、そしてこの溶液を０．１５mlのフェノール／クロ
ロホルム混液〔同容量のフェノール及びクロロホルム、
０．１％δ−ヒドロキシキノリン；１０mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH８．０）、１mM ＥＤＴＡ及び０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌにより平衡化したもの〕により抽出する。 【０１０９】水相を、パスツールピペット中ＴＮＥ緩衝
液により平衡化されたセファデックスＧ−５０カラム２
mlに適用する。３μｇのｃＤＮＡを含有する通過画分
（０．４ml）を集め、そして１mlのエタノールを加えそ
してドライアイス中で１０分間冷却することによりｃＤ
ＮＡを沈澱せしめる。遠心分離（エッペンドルフ、５分
間）の後、空気乾燥したペレットを３２μｌの水に溶解
する。ｃＤＮＡを、３２μｌのｃＤＮＡ（２．８μ
ｇ）、１０μｌの１Ｍカコジル酸カリウム（pH７．
０）、５μｌの１０mM ＣｏＣｌ₂ 、５μｌの１mM Ｄ
ＴＴ及び１０μCiの ³Ｈ−ｄＣＴＰ（２０Ci／mmol、１
０μｌ凍結乾燥）を含有する反応混合物中でオリゴ−ｄ
Ｃテイルにより延長する。 【０１１０】３７℃にて５分間の前インキュベーション
の後、３μｌのターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼ（８１ユニット、Ｐ−Ｌバイオケミカル
ス）を添加し、そして１０分間インキュベートする。５
０μｌのＴＮＥ緩衝液を添加し、そして溶液を０．１ml
のフェノール／クロロホルム混液で抽出する。０．１ml
のエタノールの添加及びドライアイス中での冷却により
ｃＤＮＡを沈澱せしめる。遠心分離の後、ペレットを７
０％エタノールで洗浄し、空気乾燥し、そして１３μｌ
の水に溶解する。 【０１１１】６．４． ｓｄ ｃＤＮＡの調製 １３μｌの水、２５μｌのＲＶＴ緩衝液、２．５μｌの
ｄＮＴＰ混合物（２０mMずつのｄＡＴＤ，ｄＣＴＰ，ｄ
ＴＴＤ及びｄＧＴＰ）、５μｌの０．２mg／mlオリゴ−
ｄＧ_12-18 （Ｐ−Ｌバイオケミカルス）、３μｌのα−
³²Ｐ−ｄＣＴＰ（１０mCi ／ml、３０００Ci／mmol）、
及び３μｌの逆転写酵素（６６ユニット、ゼオフィッ
ト）中ｃＤＮＡの上記の溶液を４２℃にて１．５時間イ
ンキュベートする。２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（pH
７．５）及び５０μｌのＴＮＥ緩衝液の添加により反応
を停止せしめ、そしてこの混合物を０．１５mlのフェノ
ール／クロロホルム混液により抽出する。 【０１１２】水相をセファデックスＧ−５０カラム（Ｔ
ＮＥ緩衝液中２．５ml）に適用し、そして１．８μｇの
ｄｓ ｃＤＮＡを含有する通過画分を集める。１mlのエ
タノールを添加し、そしてドライアイス中で冷却するこ
とによりＤＮＡを沈澱せしめる。生ずるペレットを３２
μｌの水に溶解し、そして単鎖ｃＤＮＡについて例６．
３に記載したのと同様にしてＤＮＡをオリゴ−ｄｓテイ
ルにより延長する。１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（pH
７．５）を添加することにより反応を停止し、そして
０．５cm幅のスロットを用いてＴＢＥ緩衝液中水平１％
アガロースゲル上にサンプルを負荷する。５Ｖ／cmにて
１時間の電気泳動の後、１．５〜２Kbの適切なサイズの
ｃＤＮＡを含有する領域を切り出し、そして２マイクロ
−コロジオンバッグ（サルトリウス）に入れ、そして水
中に前浸漬する。 【０１１３】０．３mlの水を加え、そしてこのバッグ
を、１／２濃度のＴＢＥ緩衝液を含有する電気泳動装置
中に置く。ＤＮＡを５Ｖ／cmの電極距離で２０分間電気
泳動し、そして激しいピペット処理によりバッグから回
収する。０．６mlのフェノール／クロロホルム混液によ
り抽出した後、４０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（pH５．
５）及び１．２mlのエタノールを添加し、そして溶液を
ドライアイス中で１０分間冷却する。遠心分離（エッペ
ンドルフ遠心機、５分間）の後、９０ngのｄs ｃＤＮＡ
を回収し、そして２０μｌの１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH８．０）及び１mM ＥＤＴＡ中に溶解する。 【０１１４】６．５． ポリ（ｄＧ）テイルを有する切
断されたｐＵＣ９とポリ（ｄＣ）テイルを有するｄｓ
ｃＤＮＡとのアニーリング、及び得られたプラスミドに
よるＥ．コリの形質転換 ２０μｌのｃＤＮＡ（例６．４のサイズ分画された材料
９０ng）を８μｌ（１００ng）のオリゴ−ｄＣ_10-18 テ
イルを有するＰＵＣ９ ＤＮＡ（ファルマシア）及び１
７２μｌのＴＮＥ緩衝液と混合し、そして６５℃にて１
０分間、４６℃にて１時間、３７℃にて１時間及び室温
にて１時間、逐次的にインキュベートする。アニールさ
れたｃＤＮＡ−プラスミドＤＮＡを使用して、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓのハンドブックに記載されている様にして形質
転換のために調製されたコンピテントＥ．コリＨＢ１０
１細胞（ＬＭ１０３５株）を形質転換する。 【０１１５】１μｌのアニールされたＤＮＡを２００μ
ｌのコンピテント細胞に加え、そして３０分間氷上に置
く。この方法を６０回行う。９０秒間のヒートショック
及び２分間の氷冷の後、チューブ当り０．８mlのＳＯＣ
培地を加え、このチューブを３７℃にて６０分間インキ
ュベートする。ＳＯＣ培地は２％バクトトリプトン、
０．５％酵母エキス（いずれもギブコ製）、１０mM Ｎ
ａＣｌ，２．５mM ＫＣｌ，１０mM ＭｇＣｌ₂ ，５mM
ＭｇＳＯ₄ 及び２０mMグルコースを含有する。インキ
ュベーションの後、すべてのチューブを一緒にし、そし
て５０μｇ／mlのアンピシリンを含有する。 【０１１６】マッコンキー寒天プレート（１５cm）３枚
上にプレートする。これらのプレートを３７℃にて一夜
インキュベートする。プレート当り生ずる２５００個の
組換体をナイロン膜上に取り上げ、そして２枚のレプリ
カを作る。マスタープレートを寒天プレート上で４℃に
て貯蔵し、そしてレプリカＭａｎｉａｔｉｓのハンドブ
ックに記載されているようにしてコロニーハイブリダイ
ゼーションのために処理する。 【０１１７】例７． 神経膠腫細胞由来ヒトｃＤＮＡ
と、ラットＧｄＮＰＦをコードするｃＤＮＡとのハイブ
リダイゼーション 例５の陽性クローンから得られたラットＧｄＮＰＦをコ
ードするプラスミド１μｇからのｃＤＮＡ挿入部を、Ｐ
ｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化、アガロース
ゲル電気泳動及びゲル溶出により取り出す。純粋なｃＤ
ＮＡ挿入部（１００ng）を、アメルシャムからのニック
トランスレーションキット（Ｎ．５０００）を用いて供
給者からの指示に従って放射性にする。この放射性ｃＤ
ＮＡプローブは５×１０⁸ dpm ／μｇの比活性を有す
る。 【０１１８】レプリカフィルター（例６．５）を、０．
９Ｍ ＮａＣｌ，０．１８Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
８．０），６mM ＥＤＴＡ，０．０２％フィコール４０
０，０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ＢＳ
Ａ，０．２％ＳＤＳ及び５０μｇ／ml変形ウシ胸腺ＤＮ
Ａを含有する溶液１００ml中で２時間プレハイブリダイ
ズせしめる。ハイブリダイゼーションは、密封されたプ
ラスチックバッグ内で、ニックトランスレーションされ
熱変性されたｃＤＮＡプローブを含有する同じ溶液１ml
中で一夜行う。 【０１１９】ハイブリダイゼーションの後、フィルター
を０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．１８ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH８．０），６mM ＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳを含
む２００mlの溶液中で６５℃にて２回洗浄し、次に０．
４５Ｍ ＮａＣｌ，０．０９ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
８．０），３mM ＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳを含有す
る２００mlの溶液で２回、及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ，
０．０３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０），１mM Ｅ
ＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳを含有する２００mlの溶液で
２回洗浄する。フィルターをＸ−線フィルムに一夜暴露
する。両レプリカフィルター上に陽性が現われる。 【０１２０】１１個の陽性コロニーを増殖せしめ、そし
てこれらのプラスミドＤＮＡを制限分析のために単離す
る。約１．５×１０³ ヌクレオチドの挿入部を含有する
２個の組換体プラスミドを選択して、Ｍａｎｉａｔｉｓ
のハンドブックに記載されている制限分析、及びＳａｎ
ｇｅｒ（Ｍ１３ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋ、アメルシャム）の方法
を用いる全コード配列の決定を行う。制限分析及び配列
分析の概要を第１図に示す。式（IV）に全配列を記載す
る。１つのクローンはＷがＡである（従ってＸ₂ がＡｒ
ｇ）である式（IV）のＤＮＡをもたらし、そして他のク
ローンはＷがＡＣＡＧである（従ってＸ ₂ がＴｈｒ−Ｇ
ｌｙである）式（IV）のＤＮＡをもたらす。 【０１２１】例８． ヒトＧｄＮＰＦをコードするプラ
スミドを含有するＥ・コリによるヒトＧｄＮＰＦの合成 式（IV）のＤＮＡ配列を含有することが示される例７の
２個のクローンの内の１個をトリプトン培地中で約１の
光学濃度（ＯＤ₆₅₀ ）に増殖せしめる。細胞を得、そし
て３０mM ＮａＣｌ及び５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
８．０）を含有する水性溶液０．５ml中に再懸濁する。
リゾチーム（シグマ）を１mg／mlに添加する。 【０１２２】０℃にて３０分間の後、懸濁液を液体窒素
中で凍結し、そして３７℃にて解凍し、これを７回反復
し、次にＳＳ３４ソルバルローター中で４℃にて、２
０，０００rpm で２０分間遠心分離する。例２のカゼイ
ン分解アッセイ及び例９の神経突起アウトグロース（ｏ
ｕｔｇｒｏｗｔｈ）アッセイを用いて上清を試験する。
ヒトＧｄＮＰＦを、ラットＧｄＮＰＦについてＧｕｅｎ
ｔｈｅｒ等〔ＥＭＢＯＪ． ４，１９６３−１９６６
（１９８５）〕により記載されているようにして、ヘパ
リン−セファロースＣＬ−６Ｂ上でのクロマトグラフィ
ー及びこれに続くアフィゲル−ブルー上でのクロマトグ
ラフィーにより精製する。 【０１２３】例９． 神経突起アウトグロースアッセイ 培養皿（３５mm）に４０，０００個のＥＤＴＡ−除去さ
れたマウス神経芽細胞腫細胞クローンＮＢ₂ Ａ（ＡＴＣ
Ｃ細胞寄託番号ＣＣＬ １３１）を接種し、そして１０
％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で１０％ＣＯ₂ を含有す
る加湿雰囲気下で３７℃にてインキュベートする。１６
〜１８時間後に培地を、０．９％ＮａＣｌ溶液に対して
十分に透析され次にフィルターで無菌化しそして凍結さ
れたＦＣＳ（熱不活性化されていない）０．５％を含有
するＤＭＥＭにより置換する。２２時間後、最終容量
２．０mlのＤＭＥＭ中例８の細胞懸濁１００μｌを添加
する。４時間後にＰＢＳ中２．５％グルタルアルデヒド
により細胞を固定することによってアッセイを停止す
る。形態学的分化の程度を、Ｄ．Ｍｏｎａｒｄ等〔Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７０，１８
９４−１８９７（１９７３）〕に記載されているように
して位相差顕微鏡により決定する。 【０１２４】例１０． 新規のヒトＧｄＮＰＦと既知の
ラットＧｄＮＰＦとの間の関係 約２５０μｇのラットＧｄＮＰＦ〔Ｊ．Ｇｕｅｎｔｈｅ
ｒ等、ＥＭＢＯ Ｊ．，４，１９６３−１９６６（１９
８５）〕を、Ｖ．Ｔ．Ｒｕｅｇｇ等〔Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，４７，１１１−１１６
（１９７７）〕に従って還元しそしてカルボキシメチル
化する。反応混合物を０．１％ＴＦＡに対して透析し、
サーバント・スピード・バック濃縮機により１mlに濃縮
し、そして逆相高圧液体クロマトグラフィーにより脱塩
する。 【０１２５】サンプルを広孔Ｃ₈ −ＲＰカラム０．４×
２５cm（バッカーボンドＲＰ ７１０５−０，Ｊ．Ｔ．
Ｂａｋｅｒ）上に注入し、そして４０％〜５０％に水性
アセトニトリルのグラジエント中０．１％ＴＦＡにより
３０分間処理する。蛋白質を含有する画分からアセトニ
トリルを除去し、そして０．５mlに濃縮する（サーバン
ト・スピード・バック濃縮機）。得られた溶液、１２０
μｌの１Ｍ ＮＨ₄ ＨＣＯ₃ 、及び１０μｌの１０^-3Ｍ
ＨＣｌ中２μｇのトリプシン（ウオーシントン）を３
７℃にて２４時間インキュベートする。反応混合物をＴ
ＦＡによりpH２に酸性化し、そして上記の同じカラム上
での高圧液体クロマトグラフィーにより精製する。 【０１２６】サンプルを０．１％水性ＴＦＡ、そして次
に０％〜５０％水性アセトニトリル中０．１％ＴＦＡの
グラジエントで９０分間処理する。クロマトグラフィー
の前半において明瞭に分離された５種類の異るポリペプ
チドを含有する各画分を集め、そして２０μｌに濃縮
し、次に市販の気一液相シーケンサー（アプライド・バ
イオシステムス）上で配列決定する。次の配列が見出さ
れる。 【０１２７】１）Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ヒトＧｄＮＰＦの配列
１８７〜１９４に関連し、Ａｌａが ⁵Ｇｌｙと置き代っ
ている）； ２）Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ
−Ｌｙｓ（ヒトＧｄＮＰＦの配列１７８〜１８４と同一
である）； ３）Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ又はＴｈ
ｒ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ｌｙｓ（ヒトＧｄＮＰＦの配列２５７〜２６８と関連
する）； ４）Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（ヒトＧ
ｄＮＰＦの配列７９〜８３と同一である）；及び ５）Ａｌａ−Ａｓｎ─Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ヒトＧ
ｄＮＰＦの配列３０３〜３０７と同一である）。 これらの結果は、単離されたヒトｃＤＮＡが確かにＧｄ
ＮＰＦのコード配列に対応し、そして人工物を代表しな
いことを示している。 【０１２８】例１１． ＧｄＮＰＦ断片の合成 Merrifield〔A. Marglin及びR.B. Merrifield, Ann. R
ev. Biochem.，39，841-866 (1970)〕により開発された
固相法を用いて、これに２つのわずかな変更を加えてペ
プチドを合成する。すなわち、ｔｅｒｔ−ブトキシカル
ボニルで保護されたアミノ酸をジシクロヘキシルカルボ
ジイミド及びヒドロキシベンゾトリアゾールの添加によ
り活性化し〔Ｗ．Ｋｏｅｎｉｇ及びＧｅｉｇｅｒ，Ｃｈ
ｅｍ．Ｂｅｒ．１０３，７８８−７９８（１９７
９）〕、そして樹脂を膨潤性溶剤及び収縮性溶剤により
交互に洗浄する〔L. Corley, D.M. Sachs 及びC.B. Anf
insen,Biochem. Biophys. Res. Commun. ，47，1353-1
359 (1972)〕。 【０１２９】１１．１． ペプチド合成法 Ｂ．Ｆ．Ｇｉｓｉｎ〔Ｈｅｌｖ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔ
ａ．，５６，１４７６−１４８２（１９７３）〕の方法
に従って、Ｃ−末端アミノ酸をクロロメチル化ポリスチ
レン樹脂（メリフィールドポリマー、フルカ、ブッチ
ュ、スイス）に縮合せしめる。Ｍ．Ａ．Ｊｕｉｌｌｅｒ
ａｔ（ネステックＳＡ、スイス）により設計された反応
器中でペプチド合成を手動で行なう。混合は反応器に窒
素を吹き込むことにより行う。 【０１３０】反応サイクルは次の段階から成る。 （ａ）５０％ＴＦＡ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 、５分間； （ｂ）５０％ＴＦＡ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 、２５分間； （ｃ）ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 、２分間３回； （ｄ）ＣＨＣｌ₃ 、２分間３回； （ｅ）トリエチルアミン／ＣＨＣｌ₃ １：９、５分間２
回； （ｆ）ＣＨＣｌ₃ 、２分間３回； （ｇ）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２分間３回； （ｈ）ＤＭＦ中チモル量のｔｅｒｔ−ブトキシカルボニ
ルで保護されたアミノ酸及びチモル量の１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール、１分間後、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 中４倍量
のジシクロヘキシルカルボジイミド、６０分間； （ｉ）ＤＭＦ、２分間２回； （ｊ）ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 、２分間２回； （ｋ）ＣＨ₃ ＯＨ、５分間２回； （ｌ）ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 、２分間３回； （ｍ）２．５モル量の同じ保護されたアミノ酸との第２
回目のカップリング、段階（ｄ）〜（ｅ）； （ｎ）ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 中１％Ｎ−アセチルアミダゾール及
び１０％無水酢酸、３０分間。 【０１３１】下記のＮα−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニ
ル（Ｎ−ＢＯＣ）−Ｌ−アミノ酸〔バッヘム（Ｂａｃｈ
ｅｍ）・ファイン・ケミカルス、ブーベンドルス、スイ
ス〕を使用する。 Ｎ−ＢＯＣ−Ｌ−アラニン Ｎα−ＢＯＣ−ＮωニトロＬ−アルギニン Ｎ−ＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン酸−β−シクロヘキシル
エステル Ｎ−ＢＯＣ−Ｌ−グルタミン Ｎ−ＢＯＣ−Ｌ−グルタミン酸−γ−ベンジルエステル Ｎ−ＢＯＣ−Ｌ−グリシン Ｎα−ＢＯＣ−Ｎ^im−トシル−Ｌ−ヒスチジン Ｎ−ＢＯＣ−Ｌ−イソロイシン Ｎα−ＢＯＣ−Ｎε−２−クロロベンジルオキシカルボ
ニル−Ｌ−リジン Ｎ−ＢＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン Ｎ−ＢＯＣ−Ｌ−プロリン Ｎ−ＢＯＣ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン Ｎ−ＢＯＣ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニン Ｎ−ＢＯＣ−Ｌ−トリプトファン Ｎ−ＢＯＣ−Ｌ−バリン。 【０１３２】ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルで保護され
たアミノ酸アパラギン、グルタミン、イソロイシン、プ
ロリン及びスレオニンについては段階（ｈ）及び（ｍ）
のカップリングにおいて６〜８モル量の大過剰を使用す
る。サイクル中、トリプトファン残基の付加の後、脱保
護段階（ａ）及び（ｂ）に２％の１，２−エタンジチオ
ール（フルカ）を加えることによりインドール環の酸化
を回避する。グルタミンのカルボジイミド官能基の脱水
を、段階（ｈ）に添加する前に１−ヒドロキシベンゾト
リアゾールエステルを前形成せしめる（０℃、１５分
間）ことにより最少にする。 【０１３３】１１．２． Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌ
ｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ：反応器に３．５
５ｇ（１．９２mmol）のアラニル置換樹脂（０．５４mm
ol／ｇ樹脂）を仕込み、そして対応するアミノ酸を用い
て１３サイクルを行なう。小アリコートのニンヒドリン
分析によりペプチド合成をモニターする。最終ペプチド
−樹脂を３５mlの弗化水素／アニソール（１０：１Ｖ／
Ｖ）により０℃にて１時間処理する。弗化水素を減圧下
０℃にて除去する。樹脂を酢酸エチルにより３回洗浄
し、次に５０mlずつの５０％酢酸により３回抽出する。
抽出物を凍結乾燥し、そして残渣を、ワットマン分取用
カラム・パルチシル１０ ＯＤＳ−３、２５mlを用いる
高圧液体クロマトグラフィーにより、０．１％ＴＦＡを
用い（１０分間）、次に０〜５０％アセトニトリルのグ
ラジエント中０．１％ＴＦＡを用いて（６０分間）精製
する。純粋な生成物を市販の気一液相シーケンサー（ア
プライドバイオシステムズ）上でのアミノ酸配列決定に
より特徴付ける。 【０１３４】１１．３． Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌ
ｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ：この蛋白質を例
１１．２と完全に同様にして調製する。但し、最終サイ
クルにおいてグルタミンをヒスチジンに変える。 １１．４． Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−
Ｐｈｅ：反応器に３．０ｇ（１．２９mmol）のフェニル
アラニル置換された樹脂（０．４３mmol／ｇ樹脂）を仕
込み、そして対応するアミノ酸を用いて１１サイクルを
行う。生成物の開裂、脱保護及び精製を例１１．２に記
載した方法により行う。但し、さらに２％１，２−エタ
ンジチオールを含有する弗化水素／アニソール混合物を
使用する。 １１．５． Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ：この蛋白質を例１１．４と同
様の方法で調製する。対応するアミノ酸を使用して１３
サイクルを行う。 【０１３５】例１２． 非経口投与用医薬製剤 ２００μｇのヒトＧｄＮＰＦを３mlの５Ｎヒト血清アル
ブミン中に溶解する。得られる溶液を細菌学的フィルタ
ーに通し、そして濾過された溶液を無菌条件下で１０バ
イアルに分割する。バイアルを好ましくは冷所、例えば
−２０℃にて貯蔵する。

【図面の簡単な説明】 【図１】図１はヒトＧｄＮＰＦをコードする二本鎖ｃＤ
ＮＡの制限分析及び配列分析の概要を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 セルジオ グロール スイス国，4052 バーゼル，シャウエン ブルガーシュトラーセ 26 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/09 A61K 38/00 C07K 14/48 C12N 1/21 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．次の式（Ｉ）： 【化１】〔式中、Ｃｙｓは場合によってはジスルフィドの形で存
   在し；Ｘ₁ は水素、アシル基、次の式（II）：Met(-19)
   -Asn-Trp-His-Leu(-15)-Pro-Leu-Phe-Leu-Leu(-10)-Ala
   -Ser-Val-Thr-Leu(-5)-Pro-Ser-Ile-Cys(-1)-
   （II） （式中、１〜４個のアミノ酸が他のアミノ酸により置き
   換えられていてもよい）で表わされるペプチド残基、又
   はカルボキシ末端からの１〜１８個のアミノ酸を含んで
   成る式（II）のペプチド残基の断片であって、これらの
   ペプチド残基は場合によってはアシル化されており；そ
   してＸ₂ はＡｒｇ又はＴｈｒ−Ｇｌｙである〕で表わさ
   れ場合によってはグリコシル化されているヒトグリア由
   来神経突起促進因子又はその関連ペプチド。 ２．Ｃｙｓが場合によってはジスルフィドの形で存在
   し、そしてＸ₁ が水素、アセチル基、式（II）のペプチ
   ド残基、又はカルボキシ末端からの１〜１８個のアミノ
   酸を含んで成る式（II）の残基の断片である式（Ｉ）の
   請求項１に記載のヒトグリア由来神経突起促進因子又は
   その関連ペプチド。 ３．Ｃｙｓが場合によってはジスルフィドの形で存在
   し、そしてＸ₁ が水素、式（II）のペプチド残基、式
   （II）の−１８位〜−１位のアミノ酸を含んで成る断
   片、Pro-Ser-Ile-Cys-, Ser-Ile-Cys-, Ile-Cys-、又は
   Cys-である特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の式
   （Ｉ）のヒトグリア由来神経突起促進因子又はその関連
   ペプチド。 ４．Ｘ₂ がＡｒｇである特許請求の範囲第１項、第２項
   又は第３項に記載のヒトグリア由来神経突起促進因子又
   はその関連ペプチド。 ５．Ｘ₂ がＴｈｒ−Ｇｌｙである特許請求の範囲第１
   項、第２項又は第３項に記載のヒトグリア由来神経突起
   促進因子又はその関連ペプチド。