JPS63102699A - 新規なｄａｆの製造のための核酸 - Google Patents

新規なｄａｆの製造のための核酸

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JPS63102699A
JPS63102699A JP62109623A JP10962387A JPS63102699A JP S63102699 A JPS63102699 A JP S63102699A JP 62109623 A JP62109623 A JP 62109623A JP 10962387 A JP10962387 A JP 10962387A JP S63102699 A JPS63102699 A JP S63102699A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換え細胞培養による、崩壊促進因子〔以下
、　ＤＡＦ　（ｄｅｃａｙ　ａｃｃｅｒｅｌａｔｉｎｇ
ｆａｃｔｏｒ　）と略弥〕の製造方法に関する。さらに
詳しくは、本発明は、医薬または診断に使用するのに適
したＤＡＦの大規模製造に関する。
体液性免疫反応の標的である抗原細胞は、補体の活性化
と称されるプロセスによって溶解される。
このプロセスは、抗原への抗体の結１ｋに似た、一連の
（シリーズの）、またはカスケード的なタンパク分解活
性からなっている。補体の活性化に関与する成分は多く
、複雑であるが、不発明に関して最も重要なものは、Ｃ
４ｂとＣ３ｂである。補体活性化の重要なステップにお
いて、これらの２つのタンパク質は標的細胞の表面に共
有結合的に会合し、このカスケードにおける増幅酵素で
あるＣ３およびＣ５転換酵素（コンバーターゼ）の集合
（アッセンブリ）のためのアンカー（いかり）として作
用する。
補体の活性化は標的シこのみ集中すべきであって、宿主
細胞に対して起きてはならない。しかし、補体活性化の
過程では、多くの形成途上のＣ４ｂ　　およびＣ３ｂ　
　フラグメントが液相に放出される。大多数は水と反応
するが、幾らかは１崗然、近くの宿主縮抱；こ結合し、
それらを損傷させることがある。
この理由で、またはその他の理由で、遊離のおよび結合
したＣ３ｂＥよびＣ４ｂフラグメントは、血清タンパク
質および膜タンパク質の複雑なシステムにより、厳格に
コントロールされている。
最近得られた証拠〔メドフら（Ｍｅｄｏｆ　）　、１９
８２１ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイ
スン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）”１５９：１６６９］に
よると、基質と結合したＣ４ｂおよびＣ３ｂの活性化の
制（ト）は液相フラグメントでのコントロールとは全　
　　　　゛く別異であることが示唆されている。前者の
機能は主としてＣ３ｂ／Ｃ４ｂレセプター（ＣＲＩ）お
よびＤＡＦの２種の嘆タンパク質によってコントロール
されている。ＣＲＩはＣ３およびＣ５転換酵素複合体中
のＣ４ｂおよびＣ３ｂからＣ２とＢ因子（ファクターＢ
）とを解離し、血清酵素Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　　インアクチ
ベータ−（Ｉ）によるＣ３ｂ［メドフら、１９８２＠ジ
ヤーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイスン”、
１５６：１７３９；フェアロン（Ｆｅａｒｏｎ）Ｄ、Ｔ
、（１９７９）”プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・オブ・サイエンセズ（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ”７６：５８６
７；メジカスら（Ｍｅｄｉｃｕｓ）、１９８３°ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・イム７０シイ（Ｅｕｒ、Ｊ
、Ｉｍｍｕｎｏ！、）　”１３　：４６５　；およびロ
スら（Ｒｏｓｓ）、１９８２＠　ジャーナル・オブ・イ
ムノロシイ（Ｊ、Ｉｒｒｒｎｕｎｏｌ、）　−１２９：
２０５１１２よびＣ４ｂ［メドフら、１９８４、ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイスン”１５９
：：１６６９；イイダら（ｌ１ｄａ）　１９８１、ジャ
ーナル・オプ・エクスペリメンタル・メデイスン”１５
３：１１３８）の分解を促進する。また、ＤＡＦはＣ３
転換酵素からの０２とＢ因子の崩壊性の解離を促進する
ことも示された〔ニコルソンーウエラーら（Ｎ１ｃｈｏ
ｌｓｏｎ−Ｗｅｌｌｅｒ）、１９８２、′ジャーナル・
オブ・イムノロシイ、１２９：２０５およびパンバーン
ら（Ｐａｎｇｂｕｒｎ、Ｍ、に、）、　１９８３（ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイスン１５７
：１９７１１゜２種の膜因子の制御作用が見かけ上冗長
である理由、並びにそれらの各々が転換酵素のコントロ
ールにおいて果す役割は不明瞭なままである。ＣＲＩの
異常は、全身紅斑性根１（ＳＬＥ）（ミャカワら（Ｍｉ
　ｙａｋａｗａ　。
Ｙ、）、１９８１　”ランセット’２：４９３；イイダ
ら（ｌ１ｄａ、に、）１９８２　　°ジャーナ／Ｌ／−
オブ・エクスペリメンタル・メデイスン”１５５：１４
２７；ウィルソンら（ｗｉｌｓｏｎ＋　Ｊ、Ｇ、　）１
９８２−ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メ
デイスン（Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、）３０７：９８１
；　　ティラーら（Ｔａｙｌｏｒ　、Ｒ，Ｐ、）　１９
８：３”　　リウマチ様関節炎（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　
Ｒｈｅｔｉｍ、）”２６：７３６］　［免疫コンプレッ
クス（複合体）処理の欠損に伴なう症状〕に認められて
おり、ＤＡＦの異常は発作性夜間ヘモグロビン尿症（Ｐ
ＮＨ）［パンバーンラ（Ｐａｎｇｂｕｒｎ、Ｍ、に、）
　１９８３”ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・
メデイスン″１５７：１９７１；パンバーンら、１９８
３”プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンセス″″２５：５４３０；ニコ
ルソンーウエラーら、１９８３＠プロシーデインゲス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンセ
ス”８０：５０６６］　（血液細胞の溶解性が高められ
た状態）に認められている。
ＤＡＦは、ヒト赤血球ストロマのプールされた抽出物か
ら、シルバー染色した５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で単１の７０
　ｋｄのバンドとして精製された〔メト７ら１ジヤーナ
ル・オブ・エクスペリメンタル・メデイスン”１６０：
１５５８〕。この分子は疎水性であり、モレキュラー・
シーブ・クロマトグラフィーによる測定で＞　１５０ｋ
ｄを示すマルチ”　　（ｍｕＨｉｍｅｒ）を形成する傾
向があった。精製されたＤＡＦは赤血球細胞と再会合し
得る。少数のＤＡＦ分子（（１００）のみが活性化され
た補体の赤血球破壊（溶面性）作用に有意な影響を及ぼ
した。メドフらは、ＤＡＦは本質的に細胞膜内部でのみ
、機能するものであると結論すると共に、ＰＮＨ患者の
細胞膜における欠損をインビトロで是正し得ることを示
唆している。
現在のＤＡＦ取得方法は営利的な製造のためには不満足
なものである。赤血球細胞は極少量しかＤＡＦを含んで
いない。しかも、血液中にはウィルス等の生物学的に活
性な成分であって、受容者または使用者に逆効果を与え
るおそれのある物質が含有されている。
赤血球細胞ＤＡＦは固有の膜結合形（もし存在するなら
天然に存在するアレル番含む）ｌこ限定される。ＤＡＦ
のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するか、
あるいは、Ｃ−末端の脂質を含有しない、プロテアーゼ
に対する抵抗性を有する、あるいはＤＡＦを標的細胞の
膜に運搬する、等の望ましい特徴を示す、アミノ酸また
はグリコシル化変異体を合成する方法が必要である。
従って本発明は、治療上許容し得る供給源から、商業的
な量のＤＡＦを調製することを目的とするものである。
また本発明は、他のヒトタンパク質によって全く汚染さ
れていない供給源からヒ１−ＤＡＦを得ることを目的と
するものである。
さらにまた本発明は、ＤＡＦのアミノ酸配列変異体およ
びグリコシル化変異体を得ることを目的とするものであ
る。
本発明の他の目的は明細書全体から明らかになるであろ
う。
要約 本発明の目的は、ＤＡＦの組換え細胞培養中での発現、
即ち、基本的に、ＤＡＦをコードしている核酸を得、Ｄ
ＡＦをコードしている核酸で宿主細胞を形質転換し、こ
の細胞を宿主細胞培連中でＤＡＦの発現のためｆこ培養
すること、を含む工程により達成された。
本発明方法により、ＤＡＦのアミノ酸配列変異体やグリ
コシル化変異体を含む、新規な形のＤＡＦを得ることが
できる。アミノ酸配列の変異体はＤＡＦアミノ酸残基に
おける１またはそれ以上の欠失、置換および挿入を含む
。また、ＤＡＦを天然のＤＡＦに関連したグリコシル化
を伴なわない形（どんなグリコシル化も伴なっていない
ことを含む）で発現させ、ヘテロローガスな組換え細胞
培養から、ＤＡＦ発現産物として得ることができる。組
換え細胞培養中の成分として含まれるあらゆる形のＤＡ
Ｆは新規である。
意外にも１本発明者は、ＤＡＦｍＲＮＡの細胞プロセッ
シングの研究中に、膜結合形のＤＡＦ（ｍＤＡＦ）のみ
がインビボにおける発現形でないことを見出した。実際
には、ｓＤＡＦと称するもう１つの形のＤＡＦが存在す
る。このＤＡＦは。
１種のｍ　ＲＮ　Ａ　、即ち、その最後の３′イントロ
ンがスプライシングされていないｍＲＮＡにコードされ
ており、その結果、残基３２７までのＣ末端のアミノ酸
配列がｍ　Ｄ　Ａ　Ｆのそれと全く異なるものである。
ｓＤＡＦの新規なＣ末端纂こはイントロンが存在するた
め昏こ、最後のエクソンのリーディングフレームが変化
し、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉ
ｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ　、　ｍ　Ｄ　Ａ　Ｆのための
膜アンカー）の結合囲域が除去されており、その結果、
該タンパク質はインビボで、それが活性である血流に分
泌されると考えられる。この新規な形のＤＡＦは本発明
に係る研究が達成される前には何ら評価されておらず、
これは、抗原的に異なるＣ末端を有する点でｍ　Ｄ　Ａ
　Ｆと相違している。本発明によって、ＰＮＨの診断に
ｓＤＡＦを用い゛、ある人の症状が、全ＤＡＦ遺伝子が
発現されないことによるのか、あるいは、ホスファチジ
ルイノシトール・アンカーに対する翻訳後プロセッシン
グが行われないことによるのかを決定することが可能と
なった。
本発明はまた、新規な核酸であって、＋１１　ＤＡＦを
コードしている核酸であると同定された細胞不含の核酸
（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含む）（２）
翻訳されない介在配列（イントロン）または両側のゲノ
ムＤＮＡを含まない、ＤＡＦをコードしているＤＮＡ、
および（３）ＤＡＦをコードしている核酸の供給源にと
ってホモローガス（同質）な他のタンパク質をコードし
ている核酸を含まない、ＤＡＦをコードしている核酸等
を提供するものである。ＤＡＦをコードしていないが、
ＤＡＦをコードする核酸とハイブリダイズし得る核酸も
本発明の笥囲シこ含まれる。
ＤＡＦをコードしている核酸は、組換え細胞培養中でＤ
ＡＦを発現させるため、あるいは被検試料をＤＡＦをコ
ードしてＱ）る核酸の存在について骨折するのに有用で
ある。その様な分析には、標−識した、ＤＡＦをコード
する核酸またはそれと／１イブリダイズする核酸を用い
る。
組換えＤＡＦを治療上許容し得るビヒクル中ｌこ製剤化
し、ＰＮＨｌあるいは炎症性または細胞溶解性の自己免
疫疾患の治療に用いることができる。
標的細；泡の細胞表面における補体の活性化を阻害する
ためにＤＡＦをそれらの細胞に移行させるよう、ＤＡＦ
フンシュゲートまたはＤＡＦ融合物を調製する。コンジ
ュゲートまたは融合物は同種移植の拒否反応や自己免疫
疾患の改善に有用である。
図面の簡単な記載 第１ａ〜１０図はλ３３　クローン（残基１のＨｉｎｄ
　Ｉ１１部位まで）とλ４７クローン（Ｈｉｎｄ［［か
ら３′末端まで）のｃＤＮＡ配列を示す模式図である。
イントロンが除去されている位置を＊（星φるし）で示
した。予測されるホスファチジルイノシトール誘導体化
部位はＣｙｓ３３０　　であり、推定のトランスメンブ
ラン頭載は残基３３１から３４７に及ぶ。アミノ酸残基
は、Ａｓｐｌの成熟アミノ末端から番号を付けられてい
る。第２ａ〜２０図は残基＋１）までのクローンλ３３
．８よびヒトｓＤＡＦをコードしているλ４１（Ｈｉｎ
ｄｌｌｌから３′末端まで）のｃＤＮＡ配列を示す模式
図である。ｓＤＡＦをコードしているｃＤＮＡ中。
スプライシングされていないイントロンを角括弧〔〕で
示した。制限酵素は通常の略語で示されている。各ＤＡ
Ｆ種についての推定のアミノ酸配列を、それぞれの分泌
リーダーおよび成熟Ｎ−末端（矢印で示した）と−緒に
示した。
詳しい記述 ＤＡＦとは、前記第１図および第２図に記載のプレアミ
ノ酸配列または成熟アミノ酸配列を有する分子、並び−
こそのアミノ酸配列またはグリコシル化による変異体で
あって、第１または２図に示されている固有のＤＡＦと
共通の生物活性を表わし得る変異体であると定義する。
以後、特に明記しない限り、ＤＡＦという言葉はこれら
の形のいずれか、または両方を指すものとする。固有の
ＤＡＦとは、血清、血液細胞あるいは他の動物の体液ま
たは組織から得られるＤＡＦである。ＤＡＦの生物（学
的な）活性は、（１）固有のＤＡＦの少（とも１個のエ
ピトープとの免疫学的な交差反応性、または（２）固有
のＤＡＦと質的に共通のホルそン作用、制御機能または
エフェクター機能を少くとも１つ有することと定義する
。アンタゴニストまたはアゴニスト活性を有するＤＡＦ
のアミノ酸配列変異体も包含されているので、アミノ酸
配列変異体がＤＡＦに関する定義に適うために、ＤＡＦ
免疫調節作用を表わすことは必須でない。例えば、ある
変異体は、アンタゴニストとして作用し、固有のＤＡＦ
を競合的に阻害するが、それ自体は免疫副部機能を有し
ないかもしれない。あるいは、アンタゴニスト活性や免
疫１１活性を有しないが、固有のＤＡＦに対して惹起さ
れた抗体と交差反応し得る変異体もまた、上記の定義に
あてはまることになる。現在知られているＤＡＦの免疫
調節活性は、例えば、Ｃ４ｂ２ａの機能的な活性に対す
る阻害作用である（メドフら、１９８４、前掲）。
ＤＡＦのアミノ酸配列変異体には、第１または２図に示
したプレＤＡＦまたは成熟ＤＡＦ配列からの欠失、ある
いはそれらへの残基の挿入、または置換が含まれる。ア
ミノ酸配列の欠失は、通常ｔ。
残基１〜１０の範囲であり、一般的に相接したものに起
きる。通常、隣接欠失は偶数の残基について起きるが、
本発明では、単１または奇数残基の欠失をも包含される
。代表的な欠失変異体は〔Ｃｙｓ３３ｏ欠失〕成熟ｍ　
Ｄ　Ａ　Ｆ、〔ｃｙ　５３３０　’ｒｈ　ｒ３４７欠失
〕成熟ｍＤＡＦ、（Ｔｈｒ２　Ｇ１ｙ３２７欠失〕成熟
ｓＤＡＦである。ｍＤＡＦからｃｙｓ３３ｏ−ＴＩＩｒ
３４７　が欠失されたものが特に興味深い。これが膜ア
ンカ一部位とトランスメンブラン鎖酸とを失なっている
ので、ｓＤＡＦと同様に分泌されるが、ｓＤＡＦ特有の
抗原決定基を保持していない分子である。
変異体が成熟ＤＡＦ配列の範囲に入るなら、挿入も＋Ａ
数残基で行うことが好ましいが、通常、約１〜５残基の
範囲の挿入を行う。しかしながら、挿入には、ＤＡＦの
アミノ末端またはカルボキシ末端への１残基から実質上
非制限的な長さのポリペプチドの融合も含まれる。単一
の末端挿入の一例はＮ末端メチオニルを有する成熟ＤＡ
Ｆである。
この変異体は、組換え細）泡培養内でのＤＡＦの直接発
現（即ち、成熟ＤＡＦの分泌または細胞膜との会合を指
令するシグナル配列のない状態での発現）を行うための
生産物である。その他の末端挿入例として以下のものが
ある。
（１）組換え宿主からの成熟ＤＡＦの分泌を促進するこ
とを目的とする、成熟ＤＡＦのＮ末端へのへテロローガ
スなシグナル配列の融合。（２）β−ラクタマーゼ、あ
るいは大楊閑ｔｒｐ遺１云子座醗こコードされている酵
素など、細菌性ポリペプチド等の免疫的なポリペプチド
の融合。（３）ホルモン、成長因子または抗生物質等の
細胞表面結合物質との融合。細胞表面結合物質との融合
物は組換え法で製造される必要なく、ＤＡＦ　（そのホ
スファチジルイノシトール基を含む）との共有結合的な
、または非共有結合的な会合（アソシエーション）によ
り製造され得る。例えば、抗体または種々の領域を有す
るそのフラグメントは、ＤＡＦのＣ末端に対して共有結
合的に結合するか、組換え細胞培養内で、ＤＡＦのＣ末
端への融合物として発現される。同種移植における拒否
反応の改善のためには、ＤＡＦを同種移植片のＨＬＡ抗
原に対する特異抗体と結合させる。抗体とＤＡＦとを共
有結合的に結合させるには、ＥＰ　１７０，６９７Ａの
方法によるが、その他のタンパク質と抗体とを結合させ
る方法は当業者にとって通常のことであり、良く知られ
ている。免疫融合は抗−ＤＡＦ抗体を生成させるワクチ
ンとして適切な免疫原性ＤＡＦ＠を調製するのに有用で
ある。これらは診断薬の裂きに有用である。代表的な挿
入体は、［Ｔｈｒ３゜９ＬｅｕＬｅｕ　Ｃｙｓ３３０］
成熟Ｄ　Ａ　Ｆ　、　（Ａｒｇｌｏｏ　ＨｉｓＡｒｇ１
００］成熟Ｄ　Ａ　Ｆ　、　ＣＬｙＳ１２５　ＧｌｎＬ
ｙｓ１２６Ｇ１ｎＬｙｓ１２７］成熟Ｄ　Ａ　Ｆ　、　
ｌ：Ｐｒｏ１ｇ３ＬｅｕＬｅｕＡ１ａ１９４〕成熟Ｄ　
Ａ　Ｆ　、　［：Ｐｒ０２４７　ＡｓｐＡｓｐＧ１ｕ２
４８］成熟Ｄ　Ａ　Ｆ　、　［Ｔｈｒ２Ｂ２ＳｅｒＳｅ
ｒＴｈｒ２Ｂ３］成熟ＤＡＦ、および〔Ｇ１３’３１６
　ＴｈｒＴｈｒＴｈｒ３１７］成熟ＤＡＦである。
第３番目の変異体のグループは、ＤＡＦ分子から少くと
も１個の残基が除かれ、その場所に別の残基が挿入され
ているものである。その様な置換体は通常、次の表１の
如くに調製される。
表　　１ 元の残基　　　　　置換残基の例 Ａｌａ　　　　　　　　ｇｌｙ；ｓｅｒＡｒｇ　　　　
　　　　１ｙｓ Ａｓｎ　　　　　　　　ｇｉｎ；ｈｉｓＡｓｐ　　　　
　　　　ｇｌｕ Ｃｙｓ　　　　　　　　５ｅｒ Ｇｌｎ　　　　　　　　ａｓｎ Ｇｌｕ　　　　　　　　ａｓｐ Ｇｌｙ　　　　　　　　ａｌａ Ｈｉｓ　　　　　　　　ａｓｎ；ｇｌｎｌｌｅ　　　　
　　　　ｌｅｕ；ｖａｌＬｅｕ　　　　　　　　ｉ　ｌ
ｅ　；ｖａ　ＩＬｙｓ　　　　　　　　ａｒｇ；ｇｉｎ
；ｇｌｕＭｅｔ　　　　　　　　Ｉｅｕ；１ｌｅＰｈｅ
　　　　　　　　ｍｅｔ；ｌｅｕ；ｔｙｒＳｅｒ　　　
　　　　　ｔｈｒ Ｔｈ　ｒ　　　　　　　　ｓ　ｅ　ｒ Ｔｒｐ　　　　　　　　ｔｙｒ Ｔｙｒ　　　　　　　　ｔｒｐ；ｐｈｅＶａｌ　　　　
　　　　ｉｌｅ；ｌｅｕ機能または免疫学的な同一性に
実質的な変化を生ぜしめるには、表１に示した置換より
も保存性の少い置換を選択する。即ち、（（至）置換の
起こる場所のポリペプチド・バックボーン構造、例えば
−シート状またはヘリックス立体配座、（ｂｌ標的部位
の分子の電荷または疎水性あるいは（Ｃ）側鎖の大きさ
くかさ）を維持する作用が著しく異なる残基を選択する
。ＤＡＦの性質の最大の変化は、一般：こ、（ａｌ親水
性残基（例、セリルまたはスレオニル）で（を）疎水性
残基（例、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル
、バリルマタはアラニル）を（で）置換する；（ｂ）シ
スティンまたはプロリンで（を）他の残基を（で）ａ換
する；（Ｃ）電気的に陽性の側鎖を有する残基（例、リ
シル、アルギニルまたはヒスチジル）で（を）電気的に
陰性の残基（例、グルタミルまたはアスパルチル）を（
で）置換する；あるいは（ｄｌかさ高い側鎖を有する残
基（例、フェニルアラニン）で（を）、その様な側鎖を
有しない残基（例、グリシン）を（で）置換することに
より得られると予測される。置換ＤＡＦの代表例を以下
に示す。［Ｃｙｓ３３０　　＞Ｍｅｔ　〕成熟ｍＤＡＦ
　、　〔ｃｙｓ３３０　　＞Ｓｅｔ〕成熟ｍＤＡＦ　、
　［Ｃｙｓ２−）Ｓｅｒｌ成熟Ｄ　Ａ　Ｆ　、　ｌ：Ｌ
−ｙｓ１２５　Ｌｙｓ１２６→Ｇｌｎ〕成熟Ｄ　Ａ　Ｆ
　、　（Ｇ１ｙ１４４　　＞　Ｐｒｏ］成熟ＤＡＦ　。
［１１ｅ１４６　　＞　Ｍｅｔｌ成熟ＤＡＦ　、　［Ｐ
ｈ８１６ｇ　　＞Ｔｙｅ］成熟ＤＡＦ　、　ＣＰｒｏ１
ｇ２　　）Ｇｌｙｌ成熟Ｄ　Ａ　Ｆ　、　［Ｉ　１６２
０１−＞　Ｌｅｕｌ成熟ＤＡＦ　、　［Ａｓｎ２３６Ａ
ｓｎ２３７　　＞ＡｓｐＡｓｐ〕成熟ＤＡＦ　、　（Ｇ
Ｉｕ２３ｇ　　）Ａｓｐ）成熟ＤＡ　Ｆ　、　［５ｅｎ
２５６−＞Ｔｙｅｌ成熟ＤＡＦ　、　（Ｖａ１２６８＞
　Ｐｈｅ〕成熟ＤＡＦ。
１：Ｌｙｓ２８５−＞　Ｇｌｎ〕成熟ＤＡＦ　、　［Ｔ
ｈｒ２ｇ４　　＞　Ｓｅｒ〕成熟ＤＡＦおよび［Ｌｅｎ
３２４　　＞　５ｅｒｌ成熟ＤＡＦ０上記の変異体はｓ
ＤＡＦ、ｍＤＡＦのいずれについても調製される。下記
の変異体はｓＤＡＦの特異なＣ末端に調製される。〔Ｌ
ｙｓ３５゜−＞Ｇｌｎ〕成熟ｓ　Ｄ　Ａ　Ｆ　、　［Ｃ
ｙＳ３３ｇ　　＞　Ｓｅｒ〕成熟ｓ　Ｄ　Ａ　Ｆ　、　
ｃＡｒｇ３９４−＞Ｈｉｓ〕成熟ｓＤＡＦおよび成熟ｓ
　Ｄ　Ａ　Ｆ　［Ｌｅｕ４ｏ３Ｐｈ”４０４１−ｅｕ４
０５−＞　５ｅｒＴｙｒＳｅｒ〕成熟ｓＤＡＦ０本発明
の目的から、明細書に記載した変異体は予め定められた
ものであり、天然に存在するアレルは本発明のＤＡＦ変
異体に含まれない。
ｍ　Ｄ　Ａ　ＦのＣ末端閉域は、翻訳後のプロセッシン
グの過程で脂質が付加される部位を含む。この頭載また
はこれを含んでいるｍＤＡＦのフラグメントは、膜結合
形を調製することが望まれる他のポリペプチドとの融合
物として発現される。例えば、通常は分泌されるホルモ
ンを組換え細胞培養中テｍ　Ｄ　Ａ　ＦのＣ末端頭載と
プレタンパク質のＣ末端融合物として発現させる。この
融合物は分泌されず、細胞膜まで運ばれてホスファチジ
ルコリン・アンカーを介してそこ５こ留まる。そのよう
な組換え細胞はホルモンその他の分泌されるポリペプチ
ドのための免疫原またはワクチンとして有用である。ポ
リペプチドを１摸内に止めておく（隔離する）ことは、
それが培養培地シこ希釈されることを防ぐことにもなる
。最後に、Ｃ末端の脂質を有する融合ポリペプチドは、
この末端脂質がアルキルセファロース、ポリオレフィン
マイクロタイターまたは試験管の表面等の固定化マトリ
ックスに対して好都合な吸着部位となるので、このポリ
ペプチドまたはその抗体の診断分析昼こ有用である。
大多数の欠失および挿入、とりわけ置換は、ＤＡＦ分子
の性質に過激な変化をもたらさないであろう。しかしな
がら、置換、欠失または挿入の正確な効果を実施以＃Ｊ
に予測することが困難な場合、例えばＤＡＦレセプター
結合領域、あるいは、免疫エピトープを修飾する場合に
は、通常のスクリーニングアッセイによって効果を評価
できることは当業者ならば理解できるであろう。例えば
、変異体は一般に、固有のＤＡＦをコードしている核酸
に部位特異的突然変異を誘発し、組換え細胞培養中で変
異体核酸を発現させ、所望により、例えばウサギポリク
ローナル抗−ＤＡＦカラム（少くとも１個の免疫エピト
ープの残存することに基づき変異体を吸着させるため）
にかけてイムノアフ訳こよって得られる。次いで、細・
胞すゼイトまたは精製ＤＡＦ変異体の活性を所望の性質
について適当なスクリーニングアッセイにより、スクリ
ーニングする。例えば、特定の抗体に対する親和性等の
ＤＡＦの免疫学的な特性は、競合型のイムノアッセイで
測定される。免疫調節作用の変化はＣ４ｂ２ａアツセイ
で測定されるが、ｓＤＡＦおよびｍＤＡＦのインビボで
の機能について更に多くのことが分ってくれば、その様
なスクリーニングにおいて、他の測定法がもっと有用に
なるかもしれない。その様なタンパク質の性質の変化、
例えば、酸化還元または熱に対する安定性、疎水性。
タンパク分解的に分解され易いか否か、担体と凝集する
傾向またはマルチマーを形成する傾向における疹飾は、
技術者周知の方法で分析される。
ヒト以外の種、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジおよびブタ
等から得られたＤＡＦも本発明の範囲に含まれる。
ＤＡＦは、組換え細胞培養；こよって合成するのが好ま
しい。そうするためには、まず、ＤＡＦをコードしてい
る核酸を４得する必要がある。本発明者らはＤＡＦをコ
ードしている核酸を同定するために鋭意努力を償ねた。
完全に決定された、ＤＡＦをコードしているヒトｍＤＮ
Ａの配列を第１図に示す。上記の如く、ヘラ（ｈｅｌａ
）細胞から得たｃＤＮＡを研究することしこより第２図
のｓ　ＤＡＦをコードするｃＤＮＡが同定された。一度
ＤＮＡが同定されれば、それを、ヒトＤＮＡのゲノムラ
イブラリィとの核酸ハイブリダイゼーションによって碍
ること、あるいは所望により、他の動物種のＤＡＦをコ
ードするＤＮＡを、該動物種の細胞から得たＤＮＡライ
ブラリィのハイブリダイゼーションにより得ることは、
当該技術者にとって容易なことである。第１および第２
図により、標的ＤＮＡと完全に、または略完全に一致す
る、非常に長い合成プローブを調節することができるの
で、ハイブリダイゼーション分析は、今や平易な事とな
った。
ＤＡＦ核酸の供給源として選択されたｃ　ＤＮＡまたは
ゲノムライブラリィはＤＡＦの全長をコードしている一
本のクローンを含有せず、部分的なりローンのみを含有
しているかもしれない。これらの部分的なりローンまた
はフラグメントの＠なり合う部分を、選択した制限部位
で切断して所望の各７ラグメントを回収し、それらを１
１＆切な順序および方向性でライゲートすることにより
、容易に全長に及ぶＤＮＡを組立てることができる。必
要ならば、オリゴヌクレオチドを調製し、不足する配列
を補充する。
次いで、以後のクローニングまたは発現のために、ＤＡ
Ｆをコードする核酸を複製可能なベクターにライゲート
する。ベクター類は、適合し得る宿主と共同で（宿主−
ベクター系）２つの機能を達成するのに有用である。１
つの機能はＤＡＦをコードしている核酸のクローニング
を促進すること、つまり、使用可能な量の核酸を生産す
ることにある。もう一つの機能はＤＡＦの発現を指令す
ることにある。これらの機能の一方または両方が、ベク
ター−宿主系によってなされる。ベクターは、選択され
た宿主細胞と同様、それがなすべき機能に応じて異なる
成分を含有することとなる。
各ベクターは上記ＤＡＦをコードする核酸を含有してい
る０通常、これはそのアミノ末端に分泌シグナルが結合
している成熟した形のＤＡＦをコードしているＤＮＡで
あろう。この分泌シグナルは、インビボにおいて、ヒト
細胞からのＤＡＦの分泌を指令する通常のＤＡＦプレ配
列であることが好ましい。しかしながら、他の動物のＤ
ＡＦに由来するシグナルや、ウィルス性のシグナル、あ
るいは同一種または近縁種の分）必ポリペプチドから得
られるシグナルも適当なシグナルとなり得る。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、該ベクタ
ーを、１またはそれ以上の選択された宿主細胞内で複製
可能ならしめるための核酸配列を含有している。通常、
クローニングベクターにおけるこのまたは、ベクターを
宿主の染色体と独立に複製せしめるものであり、それに
は、複製起源または自律的に複製可能な配列が含まれる
。その様なまたは種々の細菌、酵母およびウィルスにつ
いて良く知られている。周知のプラスミドＰＢＲ３２２
の複製起源は大多数のダラム陰性菌に、２μプラスミド
の複製起源は酵母に適し、様々なウィルス性の複製起源
（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウィルス、ＶＳ■また
はＢＰＶ）は哺乳ｍ細胞内に用いるクローニングベクタ
ーに有用である。
捕乳頌発現ベクターの場合には複製起源゛を必要としな
い（実施例においては、ＳＶ４０複製起源を。
車に、それが初期プロモーターを含有しているという理
由のみで用いる）。多くの発現ベクターは。
１シヤトル”ベクター、即ち、少くとも１クラスの生物
内で複製可能であり、別の生物にトランスフェクトして
発現させることができるベクターである。例えば、ある
ベクターを大腸菌内でクローニングし、さら蚤こ同じベ
クターで酵母または哺乳類細胞をトランスフェクトして
発現させる（たとえ、宿主細胞の染色体と独立して複製
し得ないにしても）。
また、ＤＮＡは、宿主のゲノムに挿入することによって
もクローニングされる。このことは、例えば、バシラス
（ｂａｃｉｌｌｕｓ　）のゲノムＤＮＡ内≦こ見出され
る配列と相補的なりＮＡ配列をベクター内に含有せしめ
ることにより、バシラス種において容易【こ行うことが
できる。このベクターでバシラスをトランスフェクトす
ると、ゲノムとのホモローガス（同質）な組換えが起こ
り、ＤＡＦＤＮＡが挿入されることとなる。しかしなが
ら、ＤＡＦをコードしているゲノムＤＮＡの回収は、Ｄ
ＡＦＤＮＡを取り出すために制限酵素消化を行う必要が
あり、外因的に複製されたベクターの回収よりも複堆で
ある。
通常、宿主ゲノムへのＤＮＡの挿入は、ＤＡＦ発現のた
めの安定なセルラインまたは微生物を渇ることを目的と
して行なわれる。
発現ベクターおよびクローニングベクターは選択遺伝子
（選択可能なマーカーとも称する）を含有していなけれ
ばならない。これは、ベクターで形質転換された宿主細
胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードしてい
る遺伝子である。この遺伝子は、ベクターを欠いている
どんな宿主細胞も、形質転換された宿主よりも有利２こ
増殖または再生されない様にするものである。代表的な
選択遺伝子は、（ａ）抗生物質あるいは他の毒素（例え
ばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまた
はテトラサイクリン）に対する耐性を付与する、または
（ｂｌ栄養要求性の欠失を補正するタンパク質をコード
している遺伝子か、あるいは（ｃ）複合培地から得られ
ない獣要な栄谷素を供給するりンパク質をコードしてい
る遺１云子（例えば、バシルスレことっての、Ｄ−アラ
ニン・ラセマーセヲコードしている遺伝子）である。
酵乳内で用いるのに適した選択遺伝子は酵母プラスミド
ＹＲｐ７中に存在するｔｒｐｌ遺伝子である〔ステイン
チコムら（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ　）、１９７９°ネイ
チヤー（Ｎａｔｕｒｅ　）”２８２：　３９　；　キン
ゲスマンら（Ｋｉｎｇｓｍａｎ　）、　１９７９　＠ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）”７：１４１；またはチェンバーら（
Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ　）１９８０”ジーン°１１０：１
５７］。ｔｒｐｌ　遺伝子はトリプトファン中で増殖す
る能力を欠く酵母の突然変異株（例、ＡＴＣＣ厘４４０
７６またはＰＥＰ４−１　［ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）
、１９７７、°ジエネテイックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）
８５：１２））に選択マーカーを与える。酵母宿主細胞
ゲノムにｔｒｐｌ損傷があると、トリプトファンの非存
在下で形質転換体を増殖させることで形質転換を検出す
るのに有効な環境が得られる。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵
母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８゜６２６）はＬ
ｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドで補償される。
咄乳頌細胞にとって適当な選択マーカーは、例えば、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナー
ゼである。その様なマーカーにより、ＤＡＦ咳酸核酸り
入れるのに適した細１・泡を同定することが可能となる
。哺乳頂線１泡形質転換体を、マーカーを取り込んだこ
とにより、形質転換体のみが特異的に生存Ｉこ適応し得
る選択圧の下ｌこＳく。選択圧は、培地中の選択物質の
濃度が逐字増加されている。連続的な細胞培養中で培養
することにより、選択遺伝子とＤＡＦをコードしている
ＤＮＡとの両者を増幅させることで与えられる。
増面は、増殖≦こ重要なタンパク質を生産する上で。
より必要性の大きい遺伝子が組漠え細胞の後続世代の染
色体中に次々と反復される過程を言う。増幅されたＤＮ
ＡＩこより、ハイブリッドリセプターの合成最が増加さ
れる。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺云子遺伝質転換された細胞は、
ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠く培養培
地中で培養することにより、同定される。この場合、適
当な宿主細、抱はウーラウプ（Ｕｒｌａｕｂ　）および
チャッシン（Ｃｈａｓｉｎ）　１９８０、°プロシーデ
ィンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・
サイエンスイズ（プロナス）（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１
．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ”７７’　：　４
２１６記載の如くにして虐製し、増殖された、ＤＨＦＲ
活性を欠くチャイニーズハムスターノ卵巣（ＣＨＯ）セ
ルラインである。メトトレキセート（ＭＴＸ）耐性の高
い突然変異ＤＨＦＲか特≦こ有用なりＨＦＲである（Ｅ
Ｐ１１７．０６０Ａ）。この選択物質は、内因性のＤＨ
ＦＲが存在していても、それ以外において適切な宿主（
例、ＡＴＣＣ，１５ＣＣＬ６１　　ＣＨＯ−Ｋｌ）であ
れば用い得る。次いで、ＤＨＦＲ不活化剤（例、メトト
レキセートまたはＭＴＸ　）にさらすことによりＤＨＦ
ＲとＤＡＦとを増幅させる。さらに、常に高濃度のＭＴ
Ｘを含む連続系で増殖し得る細胞のみを選択すること］
こよりＤＨＦＲをより多く必要とする細胞（従って、外
因性ＤＮＡを全て増幅する細］包）を確保する。
ＤＡＦをを椎動物の組換え細胞培箋中で合成するのに適
応させ得る他の方法、ベクターおよび宿主細胞は、ゲッ
シングら（Ｍ、　Ｊ　、　Ｇｅｔｈｉｎｇ　）、”ネイ
チャー”２９３：６２０〜６２５（１９８１）、マンテ
ィら（Ｎ、　Ｍａｎｔｅｉ　）、１ネイチヤー”２８１
：４０〜４６およびレビンソンら（Ａ、　Ｌｅｖｉｓｏ
ｎ）、ＥＰ１１７０６．０５８によって記載されている
。
哺乳類細胞培養でＤＡＦを発現させるのに特に有用な出
発プラスミドはｐＥ３４２．ＨＢＶ　Ｅ４００　、Ｄ２
２（ｐＥ３４８ＨＢＶＥ４００Ｄ２２　、　ＥＰ　’１
１７．０５８Ａとも称する）である。
発現ベクターは、クローニングベクターと異なり、宿主
生物によって認識され、ＤＡＦ核酸と機能的に結合して
いるプロモーターを含有していなければならない。プロ
モーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（−役に約
１００〜１０００ｂｐ以内）に位置する翻訳されない配
列であって、そのコントロール下にある核酸の転写およ
び翻訳をコントロールする配列である。一般ニ誘導プロ
モーターと構成プロモーターの２クラス【こ分けること
ができる。誘導プロモーターは培養条件の何らかの変化
、例えば、栄養物の存否、あるいは温度変化等：こ応答
して、そのコントロール下にあるＤＮＡからの転写を、
高レベルで開始させるプロモーターである。今日、様々
な潜在宿主によって認識される多くのプロモーターが良
く知られている。
これらのプロモーターは、それらの供給源遺伝子から制
限酵素消化−こよって得た後、ＤＡＦの開始コドンの５
′側に挿入されることにより、ＤＡＦをコードするＤＮ
Ａと機能的に結合している。このことは、ゲノム性のＤ
ＡＦプロモーターを用いることができないという意味で
はない。しかしながら、通常、ヘテロローガスなプロモ
ーターの方が、より転写が多くなり、発現されるＤＡＦ
の収率も大きい。
核酸は、それが他の核酸配列と機能的【こ関連して位置
している場合には、機能的に結合（ｏｐｅｒａｂｌｙ　
Ｉ　１ｎｋｅｄ　）　している。例えば、プレ配列また
は分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチド
の分泌に与るプレタンパク質とじて発現されるならば、
該ポリペプチド；こ関するＤＮＡと機能的に結合してい
る；プロモーターは、それが結合している暗号配列の転
写に影りを及ぼすものであるならば、該配列と機能的に
結合している；リボゾーム結合部位は、それが結合して
いる暗号配列の翻訳を容易ならしめる位置に存在してい
るならば、該暗号配列と機能約６こ結合している。
一般ｌこ、機能的）こ結合している、ということは近接
（コンテイギュアス）していることを意味し、分泌リー
ダー配列の場合には、近接し、かつ解続相内にあること
を意味する。結合は好都合な制限部位でのライゲーショ
ンによって達成される。その様な部位がなければ、合成
のオリゴヌクレオチド・アダプターやリンカ−を１虞の
方法で用いる。
原核性宿主内で用いるのに好適なプロモータ一には、β
−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系〔チャ
ン（Ｃｈａｎｇ　）ら、１９７８”ネイチャー”、２７
５　：６１５　；およびゲラデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら
、１９７９”　　ネイチャー”２８１：５４４〕、　ト
リプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系〔ゲラデル（Ｇ
ｏｅｄｄｅｌ　）　　ら、１９８０＠ヌクレイツク・ア
シッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ
、）”８：４０５７およびＥＰＯ出願公開番号３６．７
７６］、並びにｔａｃプロモーター［Ｈ，ドウボニル（
Ｈ，Ｄｅ　　Ｂｏｅｒ　）ら、゛プロシーディンゲス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
イズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　）
Ｕ、Ｓ、Ａ、”８０　：　２ｌ−２５（１９８３））　
　等のハイブリッドプロモーター類が含まれる。その他
の既知の細菌性プロモーターも使用し得る。それらのヌ
クレオチドまたは公開されているので、当業者は、必要
な制限部位を供給するためにアダプターまたはリンカ−
を用い、それらをＤＡＦをコードしているＤＮＡと機能
約６こライゲートさせることができる〔シーベンリスト
（５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔ）ら、１９８０、°セル（Ｃｅ
１ｌ）”２０　：２６９］。細菌系で用いるプロモータ
ーは、ＤＡＦをコードしているＤＮＡと機能的に結合し
たシャインーダルガルノ（Ｓ、Ｄ、）配列をも含有して
いてよい。
酵母宿主蚕こ用いる上で好適なプロモーティング配列２
こは、以下のものに対するプロモーターが含まれる：３
−ホスホグリセレート・キナーゼ〔ヒララマン（Ｈｉｔ
ｚｅｍａｎ　）ら、１９８０”ジャーナル・２オブ・バ
イオロジカル・ケミストリイ″２５５：２０７３］また
は二ノ、ラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェー
ト・デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート・
デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコ
ース−６−ホスフェート・インメラーゼ、３−ホスホグ
リセレート・ムターゼ、ピルベート・キナーゼ、トリオ
セポスフエート・インメラーゼ、ホスホグルコース・イ
ンメラーゼ、グルコキナーゼ等の他の解糖酵素類〔ヘス
（Ｈｅ５ｓ　）ら、１９６８、“ジャーナル・オブ°ア
ドバンスイズ・イン・エンザイム・レグ（Ｊ、Ａｄｖ、
Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、）　−７：　１４９；およびホ
ランド（Ｈｏ１ｌａｎｄ　）ら、１９７８、”ハイオヶ
ミストリイ　”１７　：　４９００３゜ その他の酵母プロモーターであって、増殖条件によって
転写がコントロールされるという利点をも有する誘導可
能なプロモーターとして、アルコ−ル・デヒドロゲナー
ゼ２、イソチトクロームＣ１酸ホスフアターゼ、窒素代
謝に関連する減成酵素。
メタロチオナイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェ
ート・デヒドロゲナーゼ、並び娠こマルトースおよびガ
ラクトースの利用に与る酵素類等に関するプロモーター
傾城が含まれる。更ニ、酵母内で発現させる上で好適な
ベクターおよびプロモーターはＲ，ヒララマン（Ｒ、Ｈ
ｉ　ｔｚｅｍａｎ　）らにより、ＥＰ７３，６５７Ａの
中に記述されている。酵母のエンハンサ−項を酵母のプ
ロモーター類と一緒に用いることも好都合である。
哺乳類宿主細胞内でのベクターからのＤＡＦの転写は、
ポリオーマウィルス、サイトメガロウィルス、アデノウ
ィルス２、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスおよび大
多数の好ましいシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のゲ
ノムから得られたプロモーターまたはアクチンプロモー
ターの如きヘテロローがスな哺乳頌のプロモーターによ
ってコントロールされる。ＳＶ４０ウィルスの早期およ
ヒ後Ｊ９］プロモーターはＳＶ４０ウィルスの複製起源
を含有しているＳＶ４０制限フラグメントと同様、都合
間＜得られる〔ファイヤーズら（Ｆｉｅｒｓ）、１９７
８”ネイチャー”２７３：１１３１゜本発明においては
、宿主細胞またはその近縁種から得られたプロモーター
も有用であることは当然である。
より高等な真核細胞による、ＤＡＦをコードするＤＮＡ
の転写は、エンハンサ−配列をベクターに挿入すること
によって増強される。エンハンサ−は、通常、約１０〜
３００ｂｐ　　ヌクレオチド配列であって、比較的、方
向性や位置≦こ係りなく、プロモーターからの転写を増
加させる作用を有する配列である。哨乳順遺伝子由来の
多くのエンハンサ−が知られている（グロビン、エラス
ターゼ、アルブミン、α−７エトプロテインおよびイン
シュリン）。しかしながら、一般に、真核細胞ウィルス
由来のエンハンサ−を用いることになろう。
その様な例としてＳＶ４０の複製起源（ｂｐ　ｔｏ。
〜２７０）の後期部位に存在するエンハンサ−。
サイトメガロウィルスの初期プロモーターのエンハンサ
−、ポリオーマ−の複製起源の後期部位に存在するエン
ハンサ−１並びにアデノウィルスのエンハンサ−が含ま
れる。エンサーは、ベクター内のＤＡＦをコードする配
列の５′または３′側のいずれか；こスプライシングさ
れ得るが、プロモーターの５′側であることが好ましい
。
真核性宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、人間
、またはその他の多核生物由来の有核細、抱）内で用い
る発現ベクターは、転写の終止およびｍＲＮＡの安定化
に必要な配列をも含有するであろう。それらのまたは、
一般に、真核性またはウィルス性ＤＮＡまたはｃＤＮＡ
の５′側、あるいは時として、３′側の非翻訳頭載から
得ることができる。これらの明域にはＤＡＦをコードす
るｍ　ＲＮ　Ａの非翻訳部分に含まれるポリアデニル化
セグメントとして転写される頭載が含有されている。こ
の３′非翻訳函域には転写終止部位も含まれている。
本発明におけるベクターのクローニングまたは発現にと
って好適な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞またはより
高等な真核細胞である。原核細胞には、大１揚菌やバシ
ラスの如き、ダラム陰性またはダラム陽性菌が含まれる
。好ましいクローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ
３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６
（ＡＴＣＣ３１，５３７）、大腸菌Ｗ３１１０　（ＡＴ
ＣＣ２７。
３２５）、シュードモナス種、あるいはセラシア・マー
セサンス（５ｅｒｒａｔｉａ　Ｍａｒｃｅｓａｎｓ　）
等の、池のダラム陰性またはダラム陽性の原核生物も適
する。
原核生物【こ加えて糸状菌や酵母の如き真核微生物もＤ
Ａｌｌｔ’をコードしているベクターの宿主として適す
る。下等な真核性宿主微生物の内、サツ力ロミケス“セ
レビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｖｉｓ
ｉａｅ）または通常のパン酵母が最も普通に用いられる
。
しかしながら、他の多くの属、挿または株も一般に入手
可能であり、本発明に用い得る。
ＤＡＦの発現にとって好適な宿主細胞は多核細弓包生物
から導かれた細胞の培侘物である。ＤＡＦはサイズが大
きい上、分子内ジスルフィド結合を有し、さらにｍ　Ｄ
　Ａ　Ｆの場合における特異的な翻訳後プロセッシング
は、組換えタンパク質が固有（７）ＤＡＦを忠実に示す
適切なコンホメーションを表わすことを期待するならば
、微生物よりも高等な系統樹の宿主細；泡を用いるのが
適当であることを示唆している。しかも、ＤＡＦをグリ
コシル化することが望ましい。これらの機能は全て高等
な真核細胞により、最もよく達成される。原則として、
を椎劾物または無を椎動物の細ｉ泡培養物のいずれでも
よく、あらゆる高等な真核細胞の培遷物がを用であるが
、ヒト等の哺乳類の細胞が好ましい。培養中でのその様
な細胞の増殖は自体既知である〔組織培養（Ｔｉ５ｓｕ
ｅｃｕｌｔｕｒｅ　）、アカデミツク・プレス、クルス
（Ｋｒｕｓｅ　）およびパターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏ
ｎ　）編（１９７３）参照〕。有用なｓ乳ａｇ主のセル
ラインには例えば、ＶＥＲＯ細）泡、Ｈｅ１ｌａ細胞、
チャイニーズハムスターの卵巣細；泡セルライン、Ｗｌ
　３８．ＢＨＫ、ＣＯ５−７およびＭＤＣＫの各セルラ
インが含まれる。
宿主細胞を上記の発現またはクローニングベクターで形
質転換し、プロモーターの誘導または増幅された遺伝子
を含有する形質転換体の選択に適する様改良された通常
の栄養培地中で培養する。
適当な温度やｐＨ等の培養条件は、その場合に応じて、
クローニングまたは発現のために選択された宿主細胞に
ついて以前に用いられた条件でよく。
通常の技術者にとって自明であろう。
ｓＤＡＦは、分泌シグナルが無（、直接発現された場合
には宿主細胞のリゼイトから回収されるが、分泌タンパ
ク質として培養培地から回収されるのが好ましい。第一
工程として、培養培地またはリゼイトを遠心して粒状の
細胞破片を除く。また、分画カラム（例、Ｃｏｎ　Ａ）
に吸着させて選別し、抗−ｓＤＡＦまた（ｉ抗−ｍ　Ｄ
　Ａ　Ｆイムノアフイニテイ力ラムに吸着させ、溶離す
ることにより、ＤＡＦを混在する可溶性タンパク質から
精製する。
別法として、アルキルセファロース、シリカ、あるいは
アニオンまたはカチオン交換樹脂を用いたクロマトグラ
フィー法、あるいはゲル電気泳動法を用いて不純物から
ＤＡＦを分離する。ｍ　Ｄ　Ａ　Ｆは、メドフらの方法
（１９８４、前掲）を用いて形質転換細胞の膜から回収
される。疎水性のトランスメンブラン領域および／また
はｍ　Ｄ　Ａ　Ｆホスファチジルイノシトール結合残基
が欠失または置換されているｍ　Ｄ　Ａ　ＦはｓＤＡＦ
と同様にして回収されるが、トランスメンブラン領域が
無傷のまま残っている変異体は形質転換体の細胞膜から
回収される。
固有のＤＡＦはある条件の下で凝集する傾向があるので
、分離液中に微量の非イオン界面活性剤（Ｔｗｅｅｎま
たはポリエチレングリコール）を加え、マルチマーの凝
集状態を安定化することは有用であろう。また、精製を
行う間のタンパク分解的な分解を阻止するのに、ＰＭＳ
Ｆの如きプロテアーゼ阻害剤が有用であり、さらに、偶
発的な混在物の増殖を防止するためシこ抗生物質を含有
させてもよい。
当業者ならば理解し得ることだが、組換え細胞培養中で
発現される際にＤＡＦまたはその変異体の性質が変化す
ることを考慮して固有のＤＡＦにＪ４　Ｌ、た精製法を
改良する必要があるであろう。例えば、原核性の細胞培
養中で生産されたＤＡＦはグリコシル化されていないで
あろう故に、Ｃｏｎ　−４Ａセフアロースに吸着しない
と思われる。この場合には、ゲル電気泳動法、イオン交
換法またはイムノアフイニテイ法等の池のｆｉｌ製法を
採用すべきである。同様に、ｓＤＡＦ脂質不含Ｃ末端を
有するｍＤＡＦ変異体はｍ　Ｄ　Ａ　Ｆはど、容易に疎
水性の吸着剤に吸着されないであろう。特定の組換えＤ
ＡＦの特徴に応じた、適切な精製法は当業者シことって
自明である。
ＤＡＦは、ナトリウム、カリウム、ホスフェート、塩素
等のイオンの、無毒な塩の形で調製される。通常、ＤＡ
Ｆは、りん酸緩衝化食塩水中に保存するか、糖アルコー
ル（例、マンニトールまたはソルビトール）、単糖＠（
例、グルコース、マンノース、ガラクトースまたはフル
クトース）、オリゴ糖（例、マルトース、ラクトースま
たはスクロース）、並びにヒトｌｆｎ清アルブミンの如
きタンパク質頌等の賦形剤の存在下、凍結乾燥しておい
てもよい。
前記の賦形剤は水中保存時に、ＤＡＦを不活化または沈
降會こ対して安定化することにも寄与し得るが、自体既
知の通常の他の安定化剤を併用してもよい。その様な安
定化剤にはキレート剤（例、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例
、アスコルベートまたはジチオトレイトール）、アミノ
酸類、およびポリエチレングリコールまたはポリエチレ
ンとポリプロピレングリコールとのブロック共重合体の
如き非イオン界面活性剤が含まれる。
ＤＡＦは、免疫機能障δまたは指令障害（ミスディレク
ション）から生ずる様々な異常、とりわけホルモン性免
疫応答の欠損を改善するためにヒトまたは動物に投与さ
れる。その様な例・こは、ＰＮＨ１炎症性腸疾患（大腸
炎）、リウマチ様関節炎、同種移植拒否反応等が含まれ
る。ＤＡＦＩこよる処置は、その様な異常の発現明朗に
行われるべきである。
治療用ＤＡＦ組成物は治療有効量のＤＡＦを薬学上許容
し得る担体中、こ含有せしめてなる。用量、担体および
投与経路は、様々な因子の内、処置すべき異常または症
状、患者の状聾、望まれる投与経路、並びに選択された
ＤＡＦの活性に基づいて選択される。これは治療の経過
中、医師により、容易に決定され、監視される。
ＤＡＦの注入または注射のための担体は減菌した等優性
水溶液であり、例えば、注射用食塩水または５％デキス
トロースである。これらの製剤は。
鼻腔内、皮下、静脈内、腹腔内、その他通常の投与経路
から注射または注入される。また、これらｉ１＋を、関
節のシノニアル（５ｙｎｏｎｉａｌ　）　ｉ中Ｉコ注射
することもできる。
また、ＤＡＦは、徐放性（５ｕｓｔａｉｎｅｄ　ｒｅｌ
ｅａｓｅ）担体中に製剤化して提供され得る。適当な例
には、坐薬やマイクロカプセルの如く、成形された半透
性ポリマーマトリックスが含まれる。移植可能な形、ま
たはマイクロカプセル形の徐放性マトリックスには、ポ
リエチレン（米国特許３，７７３，９１９欧州特許５８
，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とＴ−エチル−Ｌ−グル
タミン酸の共重合体〔シトマンら（Ｕ　、　Ｓｉｄｍａ
ｎ　）、１９８３°バイオポリマーズ（Ｂｉｏｐｏｌｙ
ｍｅｒｓ）’　２２　（１）：５４７〜５５６］、ポリ
（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）〔ランガー
ら（Ｒ、Ｌａｎｇｅｒ　）、１９８１°ジエイ・バイオ
メト・マター・レス（Ｊ　、　Ｂｉｏｍｅｄ、Ｍａｔｅ
ｒ。
Ｒｅｓ、）“１５：１６７〜２７７およびＲ，ランガー
、１９８２＠ケミカル−チクノロシイ（Ｃｈｅｍ、　Ｔ
ｅｃｈ）　　’１２　：９８〜１０５］、エチレンビニ
ルアセテート［Ｒ，ランガーら（前掲）］または］ポリ
ーＤ−→−３−ヒドロキシ酪般（欧州特許１３３，９８
８Ａ）か含まれる。徐放性ＤＡＦ組成物は、リポソーム
内≦こ封入されたＤＡＦをも含む。ＤＡＦを含有するリ
ポソームは、ＤＥ３，２１８，１２１Ａ　；エプスタイ
ンら（Ｅｐｓｔｅｉｎ）、１９８５、”プロシーディン
ゲス・オプザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ
ンスイズ、ＵＳＡ”　８２　：３６８８〜３６９２：ハ
ンら（Ｈａｎｇ）　１９８０”プロシーディンゲス・オ
ブ。
ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンスイズ、
ＵＳＡ”７７　：４０３０〜４０３４、ＥＰ５２３２２
Ａ、ＥＰ３６６７６Ａ、ＥＰ８８０４６Ａ、ＥＰ１４３
９４９Ａ。
ＥＰ１４２６４１Ａ、　日本特許出願８３−１１８００
８米国特許４，４８５，０４５および４，５４４，５４
５、並び≦こＥＰ１０２，３２４Ａ等に記載の自体既知
の方法で製造される。通常リポソームは、小さい（約２
００〜８００オングストローム）単層形であって、脂質
含量は約３０モル％コレステロール以上であり、ＤＡＦ
の漏出速度を適切にすべく調節された比率のものが選択
される。
徐放性ＤＡＦ製剤は、関節炎を起こしている関節や炎症
を起こしている腸組織等、炎症の部位または治療部位の
近くに埋め込むか、注射される。
ＤＡＦに対して惹起されたウサギまたは不ズーミのポリ
クローナル抗血清に関するメドフら（１９８４、前掲）
の記載がある。抗血清はＤＡＦのイムノアフイニテイ精
製およびＤＡＦのためのＥＬＩＳＡ分析に用いられる。
免疫原性のｓＤＡＦコンジユゲート（例えば、本明紹書
に示した様に、組換え細見培養で作られた免疫原性融合
物）に対して動物を免疫した後、ｍ　Ｄ　Ａ　Ｆを固定
化したカラムに抗血清を通してｍ　Ｄ　Ｆエピトープ；
こ対する抗体を吸着させ、吸着しなかった抗血清を１２
５　ｌ−ｓＤＡＦ（メドフら、１９８４、前掲の方法に
よす、　　Ｉ−ｍＤＡＦと実質上、同様の方法で調製）
の存在下でインキュベートして特異的なｓＤＡＦエピト
ープに吸着されなかった抗血清中の抗ｓＤＡＦ抗体を結
合させ、非結合１２５１−ｓＤＡＦ量を測定（例えば、
プロティンＡセファロースへの吸着）することにより抗
−ｓＤＡＦ力価の序在をスクリーニングし、ｓＤＡＦの
持異なＣ末端）こ対して特異的な抗体を調製する。
この様な抗血清中のｓＤＡＦ特異抗体は、固定化ｍＤＡ
Ｆに吸着させ、非吸着フラクションを回収して固定化ｓ
ＤＡＦに吸着させ、ｐＨ４−６のバッファーで溶離して
実質上ｍ　Ｄ　Ａ　Ｆ抗体を含まないｓＤＡＦ特異抗体
を回収すること蚤こより調製される。別法として、抗−
ｓＤＡＦ中和力価を示す免疫された動物から得た肺細胞
を回収し、骨髄腫細胞と融合させるか既知の方法シこよ
りＥＢウィルスで形質転換し、ｓＤＡＦ特異性のモノク
ローナル−ナル抗体を調製する。
ＤＡＦに対する中和抗体は免疫原としての免疫原曲ポリ
ペプチドとコンジュゲートさせ、ＤＡＦ活性を有する抗
−イディオタイプ抗体を惹起させるのに有用である。そ
の様な抗イデイオタイプ抗体は、ＤＡＦを同様の診断目
的および治療目的に用い得る。
実施例の記載を簡車にするため、［緊≦こ用いられる方
法を短い熟語に略して示す。
プラスミドは小文字のｐを先頭２こし、そして、／また
は大文字および／または数字を続けることによって表わ
される。本発明の出発物質であるプラスミドは市販され
ているか、または非制限的な施設から一般に入手可能で
あり、あるいはこの様にして入手し得るプラスミドから
、公知の方法３こ従って組立てることができる。更に、
その他の同等なプラスミドも当業者には知られており、
通常の技術者にとって自明であろう。
ＤＮＡの゛消化”とは、ＤＮＡを、該ＤＮＡのある位置
に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂することを指
す。その様な酵素を制限酵素と称し、該酵素にとって特
異的な部位を制限部位（サイト）と称する。本発明にお
いて用いる様々な制限酵素は市販されており、その反応
条件、コファクター、およびその他必要なものは、酵素
の供給業者の指示に従って使用した。制限酵素類は通常
、各制限酵素が最初；こ得られた微生物を表示する大文
字１次いで他の文字、更に、特定の酵素を表わす数字か
らなる略号で表わされる。一般；こ、約１μｇのプラス
ミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０μｇの緩衝液
中の約２単位の酵素と共に使用する。特定の制限酵素に
ついて適当な緩衝液および基質の量は、製造業者によっ
て明示されている。通常、インキュベーション時間は３
７℃で１時間とするが、供給者の指示に従って変えても
よい。インキュベーションした後、フェノールおよびク
ロロホルムでタンパク質を抽出して除き、水性フラクシ
ョンからエタノール沈殿によって消化された核酸を回収
する。時たま、制限酵素シこよる消化の後、ＤＮＡフラ
グメントの２つの制限的開裂末端が“閉環（サーキュラ
イディング）”したり、閉じたループを形成することに
より、該制限部位に他のＤＮＡフラグメントが挿入され
にくくなるのを防止するために、５′末端のホスフェー
トを細菌性アルカリホスファターゼで加水分解すること
がある。明示しない限り、プラスミドの消化には、５′
末端の脱りん酸反応は伴なわないものとする。脱りん酸
の方法および試薬は常法に従う［Ｔ、マニアテイス（Ｔ
、　Ｍａｎ　ｉａ　ｔ　ｉｓ　）ら、１９８２、モレキ
ュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ　）　ｐｐ、　１３３−１３４１゜°充填（フィ
リング）”または°平滑末端化（プランティング）”と
は、制限酵素で開裂した核酸の粘着末端の一本鎖末端を
二本鎖に変換する工程を指す。このことにより、粘着末
端が消滅して平滑末端が形成される。この工程は、１個
またはほんの少数の他の制限酵素によって作られた末端
とのみ結合し得る制限的な切断末端を、あらゆる、平滑
に切断する制限エンドヌクレアーゼで形成された末端末
端または他の充填後の粘着末端に適合し得る末端に変え
る上で多方面に利用可能な手段である。一般蟇こ、平滑
末端化は、目的とするＤＮＡ２〜１５μｇを、ＤＮＡポ
リメラーゼＩのフレノウフラグメント８単位と４種類の
デオキシヌクレオチドトリホスフェート各２５０μＭの
存在下、１０　ｍＭＭｇ　Ｃｌ　２．１　ｍＭジチオト
レイトール、５０ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭ）リス（ｐＨ
７，５）バッファーの混液中、３７℃でインキュベート
スルことにより行われる。通常、３０分後にフェノール
およびクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿に付すこ
とによりインキュベーションを終了する。
制限消化物からの特定のＤＮＡフラグメントの°回収”
または”単離”とは、この消化物をポリアクリルアミド
ゲルまたはアガロースゲル電気泳動にかけて分離し、フ
ラグメントの移動度を分子量既知のマーカーＤＮＡフラ
グメントのそれと比較して所望の７ラグメントを同定し
、所望のフラグメントを含むゲルの部分を取り除き、該
ゲルからＤＮＡを分離することを意味する。この方法は
一般的蚤こ知られている。例、Ｒ，ローン（Ｒ、Ｌａｗ
ｎ）ら、１９８１、′ヌクレイツク・アシッズ・リサー
チ″９　：　６１０３−６１１４およびり、ゲラデル（
Ｄ、　Ｇｏｅｄｄｅｌ　）ら、１ヌクレイツク・アシッ
ズ・リサーチ″８：４０５７参照。
゛ノーザン”プロッティングとは、細胞性ｍＲＮＡの存
在を、既知の標識したオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ
フラグメントとハイブリダイゼーションさせることによ
って６［する方法である。
本発明の目的から、本明細書では特に明記しない限り、
ノーザン分析は、ｍ　ＲＮ　Ａを変性剤（〜７％ホルム
アルデヒド）の存在下、１％アガロース電気泳動によっ
て分離し、Ｔ、マニアティスら　（前掲、ｐ、２０２）
の方法に従ってニトロセルロース上に移して標識フラグ
メントとハイブリダイズさせる方法を指すものとする。
°形質転換”とは、ＤＮＡを生物内に導入することを意
味し、その結果ＤＮＡが染色体外成分として、あるいは
染色体内に組込まれて複製されることを意味する。特に
明示しない張り、本発明における大腸菌の形質転換法は
マンデル（Ｍａｎｄｅ＋）らのＣａＣｌ２法（１９７０
、”ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ”
５３：１５４）を採用する。
°ライゲーション（結合）＠とは、２個の二本鎖核酸７
ラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する工程
を言う（Ｔ、　　マニアティスラ、＠掲ｐ１４６）。特
に明示しない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と条
件を使用し、略等モル量のライゲートすべきＤＮＡフラ
グメント０．５μｇ当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ（１リガ
ーセ”）１０単位を用いて行う。
形質転換体からＤＮＡを°調製する”とは、プラスミド
ＤＮＡを微生物培養物中から単離することを意味する。
明示しない限り、マニアテ不スらのアルカリ性／ＳＤＳ
法（同上ｐ・９０）を採用する。
“オリゴヌクレオチド”とは、短かい一本鎖または二本
鎖ポリデオキシヌクレオチドであって、既知の方法によ
って化学的に合成され、次いでポリアクリルアミドゲル
上で精製されたものである。
以下に示す実施例は、本発明を実施する上で現在分って
いる最良の方法の単なる例示にすぎず、本発明を限定す
るものではない。
本明細書中で引用した文献は全て参照例として用いられ
た。
実施例Ｉ　　ＤＡＦをコードしているｃＤＮＡクローン
の同定、ヒトＤＡＦのクローニングヒトＤＡＦを等質（
ホモジニティ）なまで精製し、Ｎ末端の２３−アミノ酸
配列を決定した。この内５個はアンビギュアスであった
。
このアミノ酸配列に基づいて６９マー（量体）オリゴヌ
クレオチドプローブをインビトロ合成した。３２ｐでラ
ベμした（キナーゼ処理された）プローブは式： で示されるヌクレオチド配列を有している。
この６９マーを用い、低いストリンジエンシイ条件下、
Ｈｅ１ａ細胞λｃＤＮＡ　　ライブラリィ（約１×１０
６　組換え体）をスクリーニングした。１個のＤＡＦク
ローン（λ２１）のみが同定され、虚偽の陽性を示した
６個のクローンも一緒に同定された〔これらは配列決定
に際し、プローブと限定的なホモロジイ（相同性）を示
したが、全体的に異なったアミノ酸配列を有していた〕
。入２１　　は式： ％式％ で示される配列をコードする挿入体を含有していた。上
記の式中、下線を施した残基はアミノ末端配列決定で同
定された残基と異なっている。
最初；こ碍たＤＡＦクローン（λ２１）は長さ１３９５
ｂｐ　であり、ポリＡテイル（尾部）を含有しているが
イニシエーターのメチオニンを含有していなかった。
ＤＡＦｍＲＮＡのサイズを決定するためにＨｅ１ａ細胞
ポリＡ＋ＲＮＡを含有するノーザンプロットを３２９で
ラベルしたＤＡＦλ２１でスクリーニングした。このプ
ローブは約１５００ｂｐと２，０００ｂｐの両サイプの
メツセージ（ｍ　ＲＮ　Ａ　）とノλイブリダイズした
。これら２個の強度は略等しかった。
５′または３′末端から延長する、より長いＤＡＦクロ
ーンを同定するために、λ２１の５′および３′　末端
から以下に示す２つの小さい制限フラグメントを単離し
た。
Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　　　　　　　Ｐｓｅ　Ｉ　Ｎｃｏｌ
（リンカ−）　　　　　　　　　　　　　　　　　　（
リンカ−）約２００ｂｐ　　　　　１１５ｂｐ ５′プローブ　　　　　　　　３・プ。−ブ５′プロー
ブ：　ＥｃｏｒＩ−Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ約２１５ｂｐ３
′プローブ：　Ｐｓｔｌ−ＮｃｏＩ　　　　　約１１５
ｂｐこれらのプローブを３２Ｐでラベルし、これを用い
てＤＡＦをコードするクローンに関してＨｅ１ａｃＤＮ
Ａ　ライブラリィをスクリーニングした。こうして、さ
らに２個のクローン、ＤＡＦλ４１　とＤＡＦλ４７と
が同定された。これらは両プローブとハイブリダイズし
、そのサイズは約２，０００ｂｐおよび２，２００ｂｐ
と、それぞれ、ＤＡＦλ２１挿入体より長かった。これ
らのクローンは、いずれもポリＡテイルの上流に約７８
０ｂｐの余分な３′非翻訳配列を有していた。ＤＡＦ遺
伝子の３′非翻訳または多数のポリアデニル化シグナル
（ＡＡＴＡＡＡ）を含有しており、上流または下流のシ
グナルが用いられて、約１ｓｏｏｂｐまたは約２０００
ｂｐのｍＲＮＡが生成されると考えられる。
クローンＤＡＦλ４１はＤＡＦλ２１よりも５′末端に
おいて５ｓｂｐ長く、翻訳開始のためのＡＴＧを含有し
ている。クローンＤＡＦλ４７は、ＤＡＦλ２１　より
も５′末端において９３ｂｐ短かい。
クローンＤＡＦλ３３も同定されたが、これは、５′　
プローブとのみハイブリダイズした。このクローンは、
５′末端においてＤＡＦλ２１よりも７１ｂｐ長く、従
って、５′　方向に最も長く伸長するものであった。
ＤＡＦλ２１とＤＡＦλ４１のタンパク質の暗号領域は
完全に重なり合って（オーバーラツプして）おり、４４
０アミノ酸のタンパク質をコードしている。ＤＡＦ人４
７とＤＡＦλ３３とは、ＤＡＦ人２１およびＤＡＦλ４
１＋こ関する１　１８　ｂｐの暗号領域が”欠失”され
ているように思えた。より綿層に調べたところ、ＤＡＦ
λ２１とＤＡＦ＾４１とは１１８ｂｐのスプライシング
されていない（除去されていない）イントロンを含んで
いることが分った。
次いで２つのクローン、ＤＡＦλ３５とＤＡＦλ３７と
が同定され、これらの内１方はこの同じイントロンを含
有し、他方は含有していなかった。
ライブラリィ中に非スプライシング型が仔在する頻度（
３／６クローン）は、スプライシングされていないクロ
ーンが、不適切なスプライシングのメツセージを表わす
ものでないことを示唆している。むしろ、このことは、
２つの型のＤＡＦタンパク質のｑ在を示すと思われる。
これらの２つのタンパク質はアミノ酸１〜３２７位にお
いて同一であるが、Ｃ末端の配列が異なっている。非ス
プライシング形は付加的な７９アミノ酸を有し、スプラ
イシング形は付加的な２０アミノ酸を有する。スプライ
シングによってリーディングフレームに変化が生じるの
で、２つのタンパク質はＣ末端シこおいて同質（ホモロ
ジイ）でない。
２個のＤＡＦタンパク質のヒトロバシイ・プロットから
、並びに、充分に特性化された”ｒｈｙ−ｉ膜結合糖タ
ンパク質との比較からスプライシングされたＤＡＦｃＤ
ＮＡは、膜結合形ＤＡＦの合成を指令し、他方非スプラ
イシング形の変異体は溶解性の形をコードしていると結
論される。
実施例２　組換え粗泡培養中でのＤＡＦの発現実施例１
で得たクローン、ＤＡＦ＾３３、λ４１およびλ４７の
各々を、ＥｃｏＲＩで消化し、その各々からＤＡＦ挿入
体を回収し、他方ｐＵｃ１９　　をＥｃ　ｏＲＩで消化
し、開裂されたＩ）ＵＣ１９に挿入体をライゲートし、
各ライゲーション混合物を用いて大腸菌２９４を形質転
換することにより、各人クローンを入手容易な大腸菌用
のクローニングベクターであるｐＵｃ１９にサブクロー
ンした。アンピシリン耐性コロニーからｐ　ＵＣ１９３
３、ｐＵｃ１９４１およびｐＵｃ１９４７が回収された
。
ｐ　ＵＣ１９３３、ｐＵｃ１９４１およびｐＵｃ１９４
７の各々をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｒＩＩで消化し、
それぞれ、ＤＡＦ遺１云子の５′末端、並びにｓＤＡＦ
およびｍＤＡＦ遺伝子の３′末端を含有するフラグメン
ト（それぞれ、フラグメントＩ、■および■）を回収し
た。ＥｃｏＲＩで消ｒヒしたｐＵｃ１９をフラグメント
Ｉおよび■と３方ライゲーシヨンに付し、アンピシリン
耐性大腸菌コロニーからｐＵｃ１９ｓＤＡＦを回収した
。これは第２ａ〜第２ｃ図記載の完全なｓＤＡＦ遺伝子
のサブクローンであった。フラグメント■でなく７ラグ
メント■を用いる外はｐＵｃ１９ｓＤＡＦと同様の方法
に従い、ｐＵｃ１９ｍＤＡＦを組立てた。
ｐＥ３４８ＨＢＶＥ４００Ｄ２２（また、　ｐＥ３４２
ＨＢＶＥ４００Ｄ２２゜Ｅｐ　１１７，０５８Ａ）をＨ
ｉｎｄｎｌで消化し、ＤＨＦＲ含有フラグメントを回収
する。
Ｈｉｎｄｕ粘着末端を充填し、該フラグメントをＣ１ａ
Ｉで消化し、下記のフラグメントを単離するまた、ｐＥ
３４８　ＭＢＶ　Ｅ４００Ｄ２２を、　ＣＩａＩおよび
５ｏｃｔｌで消化し、ＳＶ４０複製起源とＨｖｓＡｇポ
リＡ配列とを含有する９９０ｂｐ　　のフラグメント（
フラグメントｂ）を回収する。
ｐＵＣｓＤＡＦとｐＵＣｍＤＡＦをＥｃｏＲＩで消化し
、それぞれＤＡＦをコードしているフラグメントを単層
する（フラグメントＣ口およびＣＩＩＩ）。
フラグメントＣ■、ａおよびｂを三方ライゲーションに
付して大腸菌２９４をトランスフェクションする。アン
ピシリン耐性コロニーからｐＥ３４８ｓＤＡＦを回収ス
ル。こｈは５Ｖ４０ｓＤＡＦ初期プロモーターの３′側
５こ、適切な方向性でｓ　ＤＡＦ遺伝子を含有している
。このｓＤＡＦ遺云子は、哺乳頌宿主細胞を形質転換し
、メトトレキセート選択性を与え、増幅させるのｆこ適
した発現ベクター内（７）ＳＶ４（１Ｍプロモーターの
コントロール下にある。
ｐＥ３４８ｍＤＡＦは、フラグメントｃｍを用いる外は
同様にして組立てられた。
別の発現ベクターは、ｐ３４２Ｅ（クロウレイら（Ｃｒ
ｏｗｌ　ｅｙ　）、１９８３．”モアＬ／　・セル・バ
イオ口（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）”３：４
４〜５５］をＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩで消化し、ベク
ター７ラグメントを回収することにより組立てられた。
ｐＵｃ１９ｍＤＡＦまたはｐＵｃ１９ｓＤＡＦをＡｃｃ
Ｉ（ｍＤＡＦ用）または平滑Ｘｈｏ口（ｓ　Ｄ　Ａ、ｇ
Ｍ　）で消化し、充填し。
ＥｃｏＲＩで消化し、ＤＡＦをコードしているフラグメ
ントを回収した。ＤＡＦフラグメントをベクターフラグ
メントにライゲートし、発現ベクターを回収した。この
ベクターはＤＨＦＲ遺云子遺伝有していないが、ｐＦＤ
ｌｌ（シモンセンら（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ）１９８３°Ｐ
、Ｎ、Ａ、Ｓ、−ＵＳＡ　−８０：２４９５−９９〕と
同時形質転換すると満足すべき結果が得られるであろう
。
ｐＥ３４８ｍＤＡＦまたはｐＥ３４８ｓＤＡＦを通常の
方法でＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞≦こコトランスフェクショ
ンし、ＨＡ　Ｔ　＠地に接種し、ＤＨＦＲとＤＡＦ遺云
遺伝増幅するためにメトトレキセート濃度を連続的に増
加させた培地中で培徨することにより形質転換体を選択
する。ＤＡＦを安定的に発現し、培養培地中に分泌する
形質ｍＡ体クローンを回収する。ｓＤＡＦに対するウサ
ギポリクローナル抗体を固定したプロティンＡセファロ
ースを含有するイムノアフイニテイ力ラムに吸着させ、
グリシンバッファー（ｐＨ５）　　で溶離することによ
りｓＤＡＦを回収する。
ｐＥ３４８ｍＤＡＦを用い、同様の方法でＤＨＦＲＣＨ
Ｏ細胞を形質転換し、増幅させる。実質上、従来の赤血
球細胞ストローマからの回収法と同様の方法で、宿主細
胞の細胞膜の界面活性剤によるリゼイトからｍ　Ｄ　Ａ
　Ｆを単離、回収する。
【図面の簡単な説明】
第１図（ａ〜ｃ）はＤＡＦクローン類、λ３３および＾
４７のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す模式図、第２
図（ａ〜Ｃ）はヒトｓＤＡＦクローン類、λ３３および
λ４１のｃＤＮＡ　のヌクレオチド配列を示す模式図で
ある。 特許出４人　　ジエネンテク、インコーポレイテッド代
理人　弁理士　青　山　葆（外１名）」 ハエＡＡしし’ｕ°ハ゛工°　１”°工゛’ｉ’Ａ’ｉ
”工゛ＴＡＣＧＴＴＴＴＴ’↓゛１°゛１゛′上１　工
“１上上よｔｉｌｓｂｅｒｉｌｅ　　’ｉ°ｙｒにｙＳ
’ｉ’ｎｒＶ　　ａｉＡｓｎＡＳｎＡｓ≦９す １’（，１ＴＡＬ：Ａ’Ｊ”１”ｉ”ｌ’　　（ｊ’ｌ
”ｌ’シ’ｌ”Ｊ”１”１’（、；ＡＴＡＧＧＧＴＡＡ
ＡＡ　　ＡＡＣヒ八“へ゛ｌ”ｌ’“工“’ｌ”１“ｉ
”ｌ”Ｌ”ｉ上上上上上　上↓゛１′ ２、発明の名称 新規なりＡＦ組成物の製造のための核酸、並びに該Ｄ　
Ａ　Ｆ　４！１成物の製造方法 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国カリフォルニア９４０８０、サウ
ス・サン・フランンスコ、ポイント・サン・プルーノ・
ブールバード４６０番 名ゼト　ノエネンテク、インコーポレイテッド４代理人 住所　〒５４０　大阪府大阪市東区域見２丁目１番６１
号６　補正の対象　図　面

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、天然の成熟ＤＡＦアミノ酸配列またはプレＤＡＦア
    ミノ酸配列のアミノ酸残基またはポリペプチドに、予め
    定められたアミノ酸残基またはポリペプチドの挿入、欠
    失、あるいは置換がなされていることを特徴とするＤＡ
    Ｆアミノ酸配列変異体。 ２、予め定められたアミノ酸残基またはポリペプチドが
    成熟ＤＡＦアミノ酸配列に挿入されている第１項記載の
    変異体。 ３、成熟ＤＡＦがそのアミノ末端で、ＤＡＦにヘテロロ
    ーガスな分泌シグナル配列のカルボキシ末端と融合して
    いる第２項記載の変異体。 ４、シグナル配列がウィルス性ポリペプチドのシグナル
    配列である第３項記載の変異体。 ５、ウィルス性ポリペプチドが単純ヘルペスｇＤタンパ
    ク質のシグナル配列である第４項記載の変異体。 ６、ｍｅｔ−成熟ＤＡＦである第２項記載の変異体。 ７、成熟ＤＡＦがそのアミノ末端またはカルボキシ末端
    で免疫原性ポリペプチドと融合している第２項記載の変
    異体。 ８、免疫原性ポリペプチドが微生物性ポリペプチドであ
    る第７項記載の変異体。 ９、成熟ＤＡＦがそのカルボキシ末端で、細胞表面のタ
    ンパク質と結合し得るポリペプチドと融合している第２
    項記載の変異体。 １０、ポリペプチドが抗体、またはタンパク質結合性の
    そのフラグメントである第９項記載の変異体。 １１、抗体がＨＬＡ抗原に対するものである第１０項記
    載の変異体。 １２、予め定められたアミノ酸残基またはポリペプチド
    が成熟ＤＡＦアミノ酸配列から欠失されている第１項記
    載の変異体。 １３、予め定められたアミノ酸残基またはポリペプチド
    がｍＤＡＦのＣ末端に存在している第１２項記載の変異
    体。 １４、リジニル残基またはアルギニル残基が欠失または
    置換されている第１項記載の変異体。 １５、予め定められたアミノ酸残基またはポリペプチド
    で成熟ＤＡＦアミノ酸配列のアミノ酸残基またはポリペ
    プチドが置換されている第１項記載の変異体。 １６、単一の残基で成熟ＤＡＦアミノ酸配列の１個のア
    ミノ酸残基が置換されている第１５項記載の変異体。 １７、ＤＡＦに挿入された置換残基が疎水性側鎖を含有
    している第１６項記載の変異体。 １８、残基がバリル、イソロイシル、ロイシル、フエニ
    ルアラニルまたはアラニル残基である第１７項記載の変
    異体。 １９、ＤＡＦに挿入された置換残基が電気的に陰性の側
    鎖を含有している第１６項記載の変異体。 ２０、残基がグルタミルまたはアスパルチル残基である
    第１９項記載の変異体。 ２１、ＤＡＦに挿入された置換残基が電気的に陽性の側
    鎖を含有している第１６項記載の変異体。 ２２、残基がリシル、アルギニルまたはヒスチジル残基
    である第２１項記載の変異体。 ２３、残基がトリプトフアニル、プロリル、チロシル、
    メチオニル、セリルまたはスレオニルである第１６項記
    載の変異体。 ２４、残基がプロリル、システイニルまたはグリシルで
    ある第１６項記載の変異体。 ２５、リシルまたはアルギニル残基を含有している二塩
    基性のＤＡＦジペプチドのリシルまたはアルギニル残基
    がグルタミルまたはヒスチジル残基で置換されている第
    １項記載の変異体。 ２６、ＤＡＦがｍＤＡＦである第１項記載の変異体。 ２７、ＤＡＦがｓＤＡＦである第１項記載の変異体。 ２８、ホモローガスな細胞を含まず、少なくとも１種の
    ホモローガスな血漿成分を含まないｓＤＡＦ。 ２９、イントロンを含有していない、ＤＡＦをコードし
    ているＤＮＡ。 ３０、両側に接するゲノムＤＮＡを含有していない、Ｄ
    ＡＦをコードしているＤＮＡ。 ３１、ＤＡＦをコードしている、細胞不含の核酸。 ３２、ＤＡＦをコードする核酸の供給源にとつてホモロ
    ーガスな他のタンパク質をコードする核酸を含有してい
    ない、ＤＡＦをコードしている核酸。 ３３、ＤＡＦをコードしている核酸とハイブリダイズし
    得る核酸であつて、ＤＡＦをコードする天然ｍＲＮＡま
    たはゲノムＤＮＡ以外の核酸。 ３４、ＤＡＦをコードする核酸を含有している複製可能
    なベクター。 ３５、ＤＡＦがｓＤＡＦである第３４項記載のベクター
    。 ３６、第３４項記載のベクターで形質転換された宿主細
    胞からなる組成物。 ３７、細胞が哺乳類の細胞である第３６項記載の組成物
    。 ３８、（ａ）プロモーターと機能的に結合しているＤＡ
    Ｆをコードする核酸を含有しているベクターで宿主細胞
    を形質転換し、 （ｂ）宿主細胞をＤＡＦの発現のための条件下で培養す
    ることからによるＤＡＦの製造方法。 ３９、宿主細胞が哺乳類細胞である第３８項記載の方法
    。 ４０、宿主細胞の培養培地からＤＡＦを回収する第３９
    項記載の方法。 ４１、ＤＡＦがｓＤＡＦである第４０項記載の方法。 ４２、天然のグリコシル化を伴なわないＤＡＦ。 ４３、グリコシル化されていない第４２項記載のＤＡＦ
    。 ４４、第３８項記載の方法で製造された、天然のグリコ
    シル化を伴なつていないＤＡＦ。 ４５、治療有効量のＤＡＦを動物に投与することからな
    る、活性化された補体の溶解活性を阻害する方法。 ４６、同種移植に対する抗体媒介性の拒否反応を阻止す
    る方法、あるいは、標的組織に対する自己免疫応答を回
    復する方法であつて、同種移植組織または標的組織と特
    異的に結合し得る物質をＤＡＦに結合させて免疫調節コ
    ンジユゲートを調製し、このコンジユゲートと生理学上
    無害な賦形剤とを治療上有効な投与剤形に製剤化し、得
    られた製剤を自己免疫応答を示す動物または同種移植拒
    否反応のおそれのある動物に投与することからなる方法
    。 ４７、ＤＡＦがｍＤＡＦである第４６項記載の方法。 ４８、物質移植植片受容者によつて発現されない、同種
    移植片中に存在するＨＬＡ抗原と結合し得る抗体または
    そのフラグメントである第４６項記載の方法。 ４９、抗体またはそのフラグメントが共有結合によつて
    結合している第４６項記載の方法。 ５０、抗体またはそのフラグメントが、組換え宿主−ベ
    クター系の発現産物として、ｓＤＡＦのＣ末端に融合し
    ている第４６項記載の方法。 ５１、実質上、ｍＤＡＦと結合し得る抗体を含有してい
    ない、ｓＤＡＦと結合し得る抗体を含有する組成物。 ５２、抗−ｓＤＡＦ抗体がモノクローナル抗体である第
    ５１項記載の組成物。
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