JP2864996B2 - 免疫学的疾患治療用医薬組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は免疫学的疾患治療用医薬
組成物に関する。 【０００２】 【従来の技術】以前にはＴ−細胞成長因子といわれたヒ
トインターロイキン−２（II−２）は、レクチンまたは
抗原で活性化されたＴ−細胞より生成されそして淋巴球
の活性を調節し、そして長期、インビトローの、抗原特
異的エフェクターＴ淋巴球の培養を促進しうる可溶性蛋
白質である。ＩＬ−２はまた、胸腺細胞の有糸***を促
進し、そして、細胞毒性を有するＴ−淋巴球の反応性を
促進することも知られている。 【０００３】それでこの淋巴球調節物質は液性および細
胞性免疫性反応を強化し免疫の欠如する状態を正常の液
性および細胞性免疫状態に戻すのに有用である。ＩＬ−
２のこれらの同定された免疫学的活性は、悪性新生物
病、細菌またはウイルス感染、免疫欠失病、自己免疫病
等を含めた免疫性不調に対する医学的免疫的治療に有用
である（ペーパーマスター（Ｐａｐｅｒｍａｓｔｅｒ，
Ｂ．）等、アデュ イミュノファーマコロジー（Ａｄ
ｕ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ，５０７〔１９８０〕）。
最近、ザ ジャーナル オブ ザ アメリカン メディ
カル アソシエーション（ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｉｏｎ），Ｖｏｌ．２４９、Ｎｏ．２、１
６６−１７１頁（１９８３年１月１４日）における総説
は、特にヒトＩＬ−２を含めた種々のリンホカインの臨
床的応用を論じている。 【０００４】誘導されたヒト悪性腫瘍細胞に由来するヒ
トＩＬ−２が、多段階高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）を用いて均質に精製された。生ずる均質ヒトＩ
Ｌ−２は、約１．４×１０⁹ 単位／mgの比活性を示した
（たとえばヨーロッパ特許願Ｎｏ．８３．１０９２０
２．８、公告Ｎｏ．１０６ １７９）。タニグチ（Ｔａ
ｎｉｇｕｃｈｉ）等は、第３回組換えＤＮＡ年会（ｔｈ
ｅ Ｔｈｉｒｄ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｏｍｂｉｎａｎｔ
ＤＮＡ Ｃｏｒｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌ
ｐｈｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、１９８３年２
月（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０２、３０５−３
１０〔１９８３〕において、ＩＬ−２遺伝子のクローン
化および配列決定および発現について報告している。 【０００５】ＩＬ−２蛋白質のアミノ酸配列の由来する
ｃＤＮＡは、Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａで誘導され
たＪｕｒｋａｔ細胞により得られたｍＲＮＡより調製さ
れた。ｃＤＮＡクローンの全長は８００塩基対長で１５
３個のアミノ酸の蛋白質をコードする。ヨーロッパ特許
出願公告Ｎｏ．９１５３９をみよ。 【０００６】他のグループの研究者はまたＩＬ−２遺伝
子のクローン化および配列決定について報告した。ドフ
エ（Ｄｏｖｅｓ）等、“（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ
−２ ｃＤＮＡ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ）、ヒトインターロイキン−
２ ｃＤＮＡの分子的クローン化およびＥ． ｃｏｌｉ
における発現”（核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１１、４３０７−４３２３
（１９８３）。ヨーロッパ特許願、公告Ｎｏ．１１８
９７７をみよ。 【０００７】これらの文献は、形質転換された宿主細
胞、特にＥ． ｃｏｌｉにおけるＩＬ−２の発現を記載
しているが、専門家が成熟した組換えヒトＩＬ−２を均
質、または実質的に純粋な形状にうることを可能とする
精製操作は記載していない。 【０００８】 【発明の開示】本発明は、組換えＩＬ−２、特に組換え
成熟ヒトＩＬ−２を精製する方法に関する。本発明はま
た、従来の精製方法の限界を克服する成熟組換えヒトＩ
Ｌ−２を精製する方法に関する。 【０００９】この方法はつぎの段階を包含する。 （ａ） 成熟ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）を
コードするＤＮＡ配列で形質転換した生物を培養する； （ｂ） 段階（ａ）の形質転換生物の培養物にＩＬ−２
を発現させそして蓄積させる； （ｃ） 段階（ｂ）の形質転換生物を溶解させ細胞溶解
物を形成させる； （ｄ） 段階（ｃ）の細胞溶解物より細胞膜成分を分離
する； （ｅ） 分離した細胞膜成分を抽出溶液で洗いＩＬ−２
を含有する洗浄溶液とする；そして （ｆ） 段階（ｅ）の洗浄溶液をクロマトグラフィーで
精製して実質的に純粋かまたは均質の組換えＩＬ−２と
する。 【００１０】本発明の操作は、微生物により発現される
ＩＬ−２蛋白質が、宿主微生物の膜分画、主に微生物の
内膜（膜は、しばしば疎水性蛋白質をあわせた脂質２重
層である）にずい伴する傾向を示すという驚くべき発見
にもとづいている。それで、形質転換され微生物よりＩ
Ｌ−２を分離する操作のあいだに膜を分けることは、全
精製プロセスの終了時におけるＩＬ−２レベルの高収量
および高純度を保証する。 【００１１】本発明においては種々の既知の細胞溶解法
たとえば酵素的または化学的溶解を用いうるが、音波処
理溶解が有利な方法である。ついで内部および外部の膜
を他の細胞成分より、既知の方法、たとえば遠心により
分ける。 【００１２】溶解混合物より細胞膜を分けたら、抽出溶
液なるべくは塩および洗浄剤溶液で洗い、少なくとも約
５０％のＩＬ−２を含有する溶液をうる。有利な具体的
として、細胞膜を、塩および洗浄剤の溶液を用い、４つ
の別々の段階として洗う。第１の段階はなるべくは塩溶
液、なるべくは１Ｍ ＮａＣｌで細胞膜を洗うことを包
含する。 【００１３】第２の段階では、細胞膜分画を洗浄剤溶
液、なるべくは１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で洗う。
第３の段階では細胞膜分画を別の塩溶液、なるべくは
１．７５Ｍから２Ｍのグアニジン溶液で洗う。最後にや
はり塩溶液、なるべくは約４Ｍから７Ｍのグアニジン−
ＨＣｌで洗う。第４および最後の洗浄で得られた洗浄液
は少なくとも約５０％のＩＬ−２を含有する。 【００１４】最終ＩＬ−２洗浄溶液は、クロマトグラフ
ィー、なるべくは高速液クロ（ＨＰＬＣ）でさらに精製
する。ＨＰＬＣは実質的に１００％純度または均質な形
状の活性ＩＬ−２を与える。ＩＬ−２に対するポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体を用いる抗体アフィニ
ティクロマトグラフィーをＨＰＬＣに代えて用いうるこ
とはもちろんである。他のクロマトグラフィー操作、た
とえば染料−アフィニティカラム（たとえばヨーロッパ
特許出願Ｎｏ．８３１０３５８２．９、１９８３年１０
月２６日Ｎｏ．９２１６３として公告に記載のようなＰ
ｒｏｃｉｏｎレッドアガロース）またはｓｅｐｈａｃｒ
ｙｌ Ｓ２００カラムも用いうる。本発明の別の有利な
具体的として、多段階クロマトグラフィーを行なう。た
とえば、ＨＰＬＣにつづいて染料アフィニティクロマト
グラフィーを行なう。 【００１５】本発明によると、上記精製のＩＬ−２は他
の免疫調節化合物と同様に用いうる。たとえば免疫抑制
状態の治療に用いうる。薬剤に許容される投与形態、経
口、注射または局所の組成または方式で投与しうる。投
与量および投与の割合は、既知の免疫調節剤化合物の臨
床的応用に用いられると同様にする。代表的には、約１
−２００×１０⁶ 単位／日とする。 【００１６】本発明のＩＬ−２は治療のための投与量の
範囲で有害な毒性もしくは副作用は実質的に認められな
かった。これらの本発明の医薬組成物は、混和可能の薬
剤として許容されうる担体材料とあわせて該ＩＬ−２を
含有する。従来から使用の担体材料はいずれも用いう
る。 【００１７】担体材料は、経口、経皮または注射投与に
適当な有機または無機不活性担体材料でありうる。適当
な担体には水、ゲラチン、アラビヤゴム、乳糖、殿粉、
ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアル
キレングリコール、特にポリエチレングリコール、石油
ジエリーおよび類似のものがある。さらに本発明の医薬
組成物は、他の医薬活性剤を含有しうる。風味剤、保存
剤、安定剤、乳化剤、緩衝液および類似のものも、薬剤
調合に許容される実施法により加えうる。 【００１８】本発明の医薬組成物は任意の従来法による
形状でありうる。それには、ａ）錠剤、カプセル、ピ
ル、粉末、カ粒および類似の経口投与用の固体；ｂ）溶
液、シロップ、懸濁液、エリキシールおよび類似の経口
投与用の液体；ｃ）無菌溶液、懸濁液またはエマルジョ
ンような注射投与用の調製物；ｄ）溶液、懸濁液、軟
膏、クリーム、ゲル、微細化粉末、エアゾルおよび類似
の局所投与用製剤が包含される。これらの医薬組成物は
無菌としてそして（または）助剤たとえば保存剤、安定
剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変えるための塩および
（または）緩衝液を含有しうる。 【００１９】注射用投与形態の製剤は、静脈または筋肉
内に注射されうる注入または注射溶液でありうる。これ
らの製剤はまた他の薬として活性のある物質を含有しう
る。追加の添加物、たとえば保存剤、安定剤、乳化剤、
緩衝剤および類似のものを、薬剤調製に許容された実施
方法により添加しうる。 【００２０】ＩＬ−２発現ベクターおよびＩＬ−２を発
現しうる形質転換物の構築をより詳しく下記する。成熟
ＩＬ−２蛋白質のアミノ酸配列は図１に示す。遺伝子開
始コドンがＡＴＧならば、蛋白質のアミノ末端にメチオ
ニンを有する成熟形として蛋白質は発現されうる。メチ
オニンは、発現後、宿主細胞により除去されうるかまた
は除去されえない。 【００２１】本発明に係り使用される発現ベクターは、
バクテリオファージラムダＤＮＡより分離されたＰ_L プ
ロモーターを含有する、ｐＢＲ３２２の誘導物である。
Ｐ_Lは、ラムダｃＩレプレッサーにより効率的にそして
具合よくコントロールされうる非常に強いプロモーター
なのでの、有利なプロモーターである。 【００２２】それに対する遺伝子は微生物の染色体上に
存在し得、Ｐ_L プロモーターを含有するベクターと共存
しうるかまたは同じベクターである。レプレッサーをコ
ードする遺伝子は変異ｃＩｔｓを有し、これはレプレッ
サーを温度感受性とする。本発明に係り使用されうる、
そしてｃＩ変異を含有するベクターはｐＲＫ２４８ｃＩ
ｔｓで、これは、この方面の技術で知られ、カーン（Ｋ
ａｈｎ）等、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６８、２６８（１９７９）に記
載されている。 【００２３】３０℃でレプレッサーは正常に働らきそし
て約３７℃から約４２℃において不活化される。それ
で、Ｐ_L プロモーターは３０℃でレプレスされ（ターン
−オフ）そして４２℃で除レプレスされる（ターン−オ
ン）。Ｐ_L プロモーターをコントロールする能力は、遺
伝子生成物を発現しないで培養物を発育させることを約
３０℃から約３６℃で可能とし、至適の時点において、
約３０℃から約４２℃に温度を移すことにより、望む成
熟ヒトＩＬ−２生成物を生成させうる。 【００２４】本発明に係り使用されるのに有利なベクタ
ーは、さらに、ＳＤ配列により末端の方に（３′方向に
向けて下流）ＥｃｏＲＩ制限サイトを含有する、以下の
記載で有利なベクターｐＲＣ２３の調製および、それへ
のＩＬ−２遺伝子の導入を説明する。しかし、他のベク
ターも用いうる。 【００２５】図２および図３に概要を示す操作に従う
と、２０マイクログラムのｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩで
消化し、ついで２つの異なる反応に用いた。ひとつは
１）Ｓｌヌクレアーゼ処理による５′オーバハングの除
去、そして２）ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラ
グメントによる処理による末端の充填である。両反応
共、フェノール抽出、それに続くエタノール沈殿で停止
させた。 【００２６】各反応よりのＤＮＡは合成Ｂｇｌ II リン
カーにリゲーションさせ、ＢｇｌIIおよびＰｓｔＩで消
化し、１％アガロース中ゲル電気泳動に処した。両方の
反応よりの３６００ｂｐ（塩基対）および７６０ｂｐの
フラグメントをゲルより採取した。ｐＲＣ２の構築のた
めには、Ｋｌｅｎｏｗ反応よりの３６００ｂｐフラグメ
ントをＳ１反応よりの７６０ｂｐフラグメントにリゲー
ションさせた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１をリゲーション混
合物で形質転換し、５０μｇ／mlのアンピシリンを含有
する、培地上で形質転換物を選んだ。 【００２７】予期されるプラスミド構築、つまり、Ｅｃ
ｏＲＩ制限サイトの近傍にＢｇｌII制限サイトを含有す
るプラスミドを、分離されたプラスミドＤＮＡの制限サ
イト分析で同定した。“コンセンサス”またはコンピュ
ーターで得られたリボゾーム−結合サイト（ＲＢＳ）を
含有する合成オリゴヌクレオチド〔シェラー（Ｓｈｅｒ
ｅｒ）等、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ）、８、３８９５（１９８０）〕を含有
する合成オリゴヌクレオチドをラムダーＰ_Lプロモータ
ーを含有する２５０ｂｐ Ｂｇｌ II −Ｈａｅ IIIフラ
グメントにリゲートさせ、そして、リゲーション生成物
をｐＲＣ２に挿入することによりｐＲＣ２３を構築し
た。 【００２８】ラムダーＰ_L プロモーターを含有する２５
０ｂｐ ＤＮＡを分離するためには、４５０ｂｐ Ｂｇ
ｌ II −Ｈｐａ I ＤＮＡフラグメント（ラムダーファ
ージＤＮＡ配列のｂｐ Ｎｏ ３５２６０より３５７１
０まで）をＨａｅ IIIで消化し、生成物を５％ポリアク
リルアミド中調製用ゲル電気泳動で分離した。シェラー
（Ｓｃｈｅｒｅｒ）等記載のコンピューター分析で生成
された“コンセンサス”ＲＢＳ配列の大部分を含有す
る。 【００２９】図３に示す合成オリゴヌクレオチドの各６
０ｐｍｏｌｅに約２００ｎｇの２５０ｂｐ Ｂｇｌ II
−Ｈａｅ IIIフラグメントをリゲートさせた。リゲート
された分子はＢｇｌ II およびＥｃｏＲＩで消化して
（オリゴマーを除き）そしてゲル電気泳動で精製した。
リゲートされた生成物は、ついで、やはりＢｅｌ II お
よびＥｃｏＲＩで消化したｐＲＣ２中に挿入した。Ｅ．
ｃｏｌｉ株ＲＲ１（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ）の形質転
換は標準法を用いて行ない、形質転換物は、３０℃でア
ンピシリンを含有する培地上で選択した。５０形質転換
物を得た。これらのうちの８個よりＤＮＡを分離しＨｉ
ｎｃ II で消化して分析した。８個のうち６個が予期さ
れた制限パターンを示し、これらのうちのひとつをＭａ
ｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔヌクレオチド配列分析してみる
と予期された構築（ｐＲＣ２３と称する）を示した。 【００３０】成熟ヒトＩＬ−２をコードするＤＮＡを含
有するプラスミド性発現ベクターの構築 （１）ヒトＩＬ−２をコードするｍＲＮＡの分離 ＪｕｒｋａｔセルラインＦＨＣＲＣのクローンであるＨ
３３ＨＪ−ＪＡＬ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−８１
６３、１９８２年８月２６日寄託）より、ＰＨＡおよび
ＰＭＡで誘導したあとｍＲＮＡを分離した。１２，００
０mlのＨ３３ＨＪ−ＪＡＩクローン細胞培養物（１０⁶
細胞／ml）を、１０％牛胎児血清、５０μ／mlペニシリ
ン、５０μｇ／mlストレプトマイシン、５０μｇ／mlゲ
ンタマイシンおよび３００μｇ／mlの新しいＬ−グルタ
ミンを加えたＲＰＭＩ１６４０組織培養培地中に発育さ
せた。 【００３１】これらの細胞は遠心して集め、上記に示し
た培地より血清を除き、さらに１％ＰＨＡおよび１０ｎ
ｇ／mlＰＭＡを加えた培地の６リットルに再懸濁させ
た。細胞は無菌ガラスローラーびん中に６リットル宛分
け、ローラーミル上に置いた（１０ｒｐｍ３７℃）。 【００３２】８時間してから細胞を遠心して集め、標準
フェノールクロロホルム抽出操作でｍＲＮＡを抽出し
た。フェノールクロロホルム抽出のあと、エタノール沈
殿ＲＮＡを高速遠心でペレットとし、０．５Ｍ塩溶液中
に再懸濁させた。全ＲＮＡ群に含まれるポリＡ−テイル
付きｍＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）セルローズカラムに通し
て集めた。エタノール沈殿ｍＲＮＡは水に再懸濁させ５
００μｇ／mlの濃度とした。ＲＮＡの３０ｎｇをアフリ
カツメガエル卵母細胞に微量注入した。 【００３３】無菌Ｂａｒｔｈ溶液中で２４時間インキュ
ベーションしてから、４個の卵を無菌の１．５mlＥｐｐ
ｅｎｄｏｒｆ遠心チューブに移し新しい無菌Ｂａｒｔｈ
溶液の５００〜１５００μｌを加えた。４８時間してか
ら卵コンディンションされた培地の２００μｌを採取し
標準ＣＴＬＬ細胞 ³Ｈ−Ｔｄｒ取り込み分析（ジルス
（Ｇｉｌｌｓ）等、ジェー イミュノロジー（Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．）１２０、２０２７〔１９７８〕）を用い
てＩＬ−２を分析した。卵母細胞で翻訳されるとｍＲＮ
Ａは著しいＩＬ−２活性の上昇を与えた。これらをプー
ルし、標準スクロース密度勾配遠心法により大きさに分
けエタノール沈殿させてｃＤＮＡライブラリーの構成に
あてた。 【００３４】（２）ｃＤＨＡ合成 つぎの方法（ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）およびホフマン
（Ｈｏｆｆｍａｎ），遺伝子（Ｇｅｎｅ）２５、２６３
−２６９〔１９８３〕）により精製ｍＲＮＡ（スクロー
ス勾配上約１０Ｓ）の３．５μｇを用いて２本鎖相補的
ＤＮＡ（ｄｓｃＤＮＡ）を合成した。 【００３５】（ａ）第１鎖ｃＤＮＡの合成 ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、 pＨ８．３、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭＤＴＴ、４ｍＭ Ｎａ−ピロホス
フェート、１．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、１．２５ｍＭ ｄ
ＧＴＰ、１．２５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴ
Ｐ、１００μ／mlオリゴ（ｄＴ）_12-18 および１０Ｃｉ
³²Ｐ−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ３０００Ｃｉ／ｍ
Ｍｏｌｅ）を含有する１７．５ml中にｍＲＮＡを懸濁さ
せた。４３℃で５分インキュベートしてから、３０００
単位のＡＭＶ逆転写酵素／ml（ライフサイエンス（Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社）を加え、混合物は４３℃
で３０分インキュベートした。ＥＤＴＡを２０ｍＭまで
加えて反応を止め、フェノール−クレゾール抽出し、エ
タノール沈殿で濃縮した。ＴＣＡ−不溶放射活性でアッ
セイして第１鎖合成の収量は５８．６ｎｇ（１．７％）
と計算された。 【００３６】（ｂ）第２鎖合成 ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリドを５．８μｌのＨ₂ Ｏに
再懸濁させた。この溶液に第２鎖合成ミックス７．７μ
ｌを加えて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pＨ７．
５、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭ（ＮＨ₄ ）₂ Ｓ
Ｏ₄ 、１００ｍＭＫＣｌ、０．１５ｍＭべーターＮＡ
Ｄ、５０μｇ／ml ＢＳＡ、４０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、
８．５単位／mlのＥ． ｃｏｌｉ ＲＮＡａｓｅＨ（ベ
セスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ
ｓ））、２３０単位／ml ＤＮＡポリメラーゼＩ（ベー
リンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ））、１０単位／ml Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡリガー
ゼ（ニューイングランド ボイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））含有溶液とした。 【００３７】この混合物は１２℃で６０分インキュベー
トし、ついで２２℃で６０分インキュベートした。ＥＤ
ＴＡを２０ｍＭまで加えて反応を止めた。フェノール−
クレゾール抽出した。１０ｍＭ ＴＥＡＢ中Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−５０微細カラムを通し、遊離ヌクレオチド
よりｃＤＮＡを分けた。この反応よりの収量は１０７ｎ
ｇのｄｓｃＤＮＡ（９１％）であった。 【００３８】（ｃ）アニーリングおよび形質転換 標準方法により６４ｎｇのｄｓｃＤＮＡにｄＧＴＰを加
えて、テイルを付けた。ｐＢＲ３２２ＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｖ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化
しｄＣＴＰのテイルを付したベクターを調製した。テイ
ルを付したＢＲ３２２ＤＮＡの１００ｎｇとテイルを付
したｃＤＮＡ挿入物の１．２５ｎｇ（比率＝８０：１）
とを、２５０μの０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ、 pＨ７．５、
１ｍＭＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌで９０分５８℃
でアニーリングし、コンピテントＥ． ｃｏｌｉ ＲＲ
Ｉ細胞を形質転換した。形質転換された細胞は１００μ
ｇ／mlアンピリシン（ブリストル（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｌ
ａｂｓ））を含有するＬＢプレート上に塗抹した。３７
℃で１２時間インキュベートした。３２００コロニーを
ＩＬ−２ｃＤＮＡライブラリーにあてた。 【００３９】（３）ＩＬ−２遺伝子配列に関してのｃＤ
ＮＡライブラリーのスクリーニング ＩＬ−２遺伝子の完全長ｃＤＮＡコピーを検出するため
にＴａｎｉｇｕｃｈｉ等発表のヒトＩＬ−２ ｃＤＮＡ
配列のヌクレオチド４５−６５に相当する合成デオキシ
−オリゴヌクレオチドプローブ（ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）３０２、３０５−３１０〔１９８３〕）を用い
た。このプローブ〔ＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣ
ＡＡＣＴＣ〕は、固体相ホスホジエステル法で合成し、
ＨＰＬＣで精製しそして³²Ｐ−ＡＴＰ（ＩＣＮ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．７０００Ｃｉ／ｍＭ）およ
びポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてラベルした。 【００４０】ｃＤＮＡライブラリーからのコロニーは、
グルンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）およびホグネス
（Ｈｏｇｎｅｓｓ）の方法（酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６８、３７９〔１９
７９〕）でニトロセルロースフィルターに移した。３０
℃で１６時間ハイブリダイゼーションさせたあと、フィ
ルターは、４×ＳＳＣ中４５℃で４５分洗い、乾燥し、
オートラジオグラフした。ひとつの陽性コロニーを検出
し、全ＩＬ−２コード配列を含有することを知った。ｐ
ＩＬ２−２Ｂと称するこのコロニーを用いてヌクレオチ
ド配列分析およびＥ． ｃｏｌｉ中発現のためのＤＮＡ
を調製した。ヌクレオチド配列分析で、それは２つを除
いてタニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）等の発表の配列と
同じであった。その２つは、ｐＩＬ２−２Ｂは、タニグ
チ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）の順序でヌクレオチド１７に
始まる挿入物を含有し、そして位置５０３において、Ｇ
がおきかえられている。 【００４１】（４）Ｓｅｒ−ＩＬ−２をコードするＤＮ
Ａを含有するＥ． ｃｏｌｉプラスミドベクターの構築 ３個のセグメント（図４）つまり（１）ラムダＰ_L プロ
モーターを有するベクターｐＲＣ２３、（２）合成アダ
プター分子および（３）ＩＬ−２ｃＤＮＡより分離され
たＨｇｉＡ Ｉ−Ａｈａ IIIフラグメントよりＥ． ｃ
ｏｌｉ発現ベクターを構築した。ベクターＤＮＡを調製
するには、５０ｎｇのｐＲＣ２３ ＤＮＡをＥｃｏＲＩ
およびＥｃｏＲＶで消化しついでフェノール抽出しそし
てエタノール沈殿させた。 【００４２】合成アダプター分子は、２つの相補的合成
デオキシ−オリゴヌクレオチド配列 【化１】 （Ａ）５′ＡＡＴＴＣＡＡＴＴＡＴＧＡＧＴＧＣＡ３′ （Ｂ）３′ ＧＴＴＡＡＴＡＣＴＣ ５′ をアニーリングさせて得た。この２本鎖アダプターはＥ
ｃｏＲＩサイトに５′末端においてそしてＨｇｉＡＩサ
イトに３′末端にアニールしえた。ｃＤＮＡ挿入物は、
ｐＩＬ２−２Ｂ ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ１（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）で消化して
調製した。 【００４３】このものは、このクローンより１キロベー
スＩＬ−２挿入物を放出させる。ＢａｍＨ１フラグメン
トはゲル精製しさらにＨｇｉＡＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏｌａｂｓ）およびＡｈａ III（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）でさらに消化した。つい
でフェノール抽出およびエタノール沈殿させた。 【００４４】ＨｇｉＡＩは、成熟ＩＬ−２をコードする
配列の始まりのところで、アラニンおよびプロリンコド
ンのあいだを切断する。発現のためのにクローニング戦
略は、ｐＲＣ２３中のＰ_L プロモーターに隣 ²ＥｃｏＲ
Ｉサイトを用いる。この合成アダプタは、ベクター中の
このＥｃｏＲＩサイトを、ｃＤＮＡ ＩＬ−２配列の始
まりの部分でのＨｇｉＡＩサイトに結合しうる。このア
ダプターは翻訳開始のためのメチオニンコドンを創出す
ようにデザインされた。 【００４５】セリンおよび成熟ＩＬ−２の第１のアミノ
酸アラニンのコドンは、ＨｇｉＡＩサイトにおいてアダ
プターおよびＣＤＮＡをリゲートさす時に創出される。
ＡｈａIII サイトのベクターＤＮＡ中のＥｃｏＲＶサイ
トへの平滑末端リゲーションにより、ｃＤＮＡをｐＲＣ
２３に結合させる。３個のセグメントのリゲーション
は、ベクター、合成アダプターおよびｃＤＮＡの各０．
０５ｐＭ、６５ｍＭ Ｔｒｉｓ、 pＨ７．６、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、０．５ｍＭ ＡＴＰおよび１５ｍＭベー
ターメルカプトエタノール含有１０μｌ中で３個のセグ
メントのリゲーションを行なった。 【００４６】リゲーション混合物は６５℃に５分加熱
し、４℃に冷却してから２００単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加
え、ついで、４℃で１６時間インキュベートした。つい
で５分間６５℃に加熱してＴ４ＤＮＡリガーゼを不活化
した。ついでリゲートされたＤＮＡｓはＥｃｏＲＶで消
化し、未消化ベクターＤＮＡがあればそれを除去した。
この混合物はＥ． ｃｏｌｉ株ＲＲ１（ｐＲＫ２４８ｃ
Ｉｔｓ）の形質転換に用い、細胞は３０℃で１５時間発
育させた。 【００４７】コロニーは前記のようにニトロセルロース
フィルターに移し、ベーキングし、 ³²Ｐラベル合成アダ
プター分子Ａの放射活性プローブとハイブリダイゼーシ
ョンさせた。ｐＲＣ２３／ＩＬ−２ Ｎｏ．４−１と称
するひとつの陽性コロニーを選び分析した。このクロー
ンは、Ｐ_L プロモーターを４２℃で発現さすように誘導
した時に、２００，０００単位／mlより多くのＩＬ−２
を合成することが分った。ＩＬ−２活性は、ＩＬ−２の
インディケーターセルラインであるＣＴＬＬ細胞（ジル
（Ｇｉｌｌ）等、ジェー イミュノロジー（Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．）１２０、２０２７〔１９７８〕）上のバイ
オアッセイで検出した。 【００４８】（５）成熟ＩＬ−２（アミノ末端での第１
のアミノ酸としてアラニンを有する）生成のためのＥ．
ｃｏｌｉ発現ベクターの構築Ｅ． ｃｏｌｉに成熟ＩＬ−２を発現さすために、つぎ
の戦略（図５）を用いた。ＨｇｉＡＩ制限エンドヌクレ
アーゼサイトはセリン−アラニンの接続部に存在する。
これはＩＬ−２のシグナルペプチド除去のための切断サ
イトである（ロッブ（Ｒｏｂｂ）等、ＰＮＳＡ、８０、
５９９０−５９９４〔１９８３〕）。ＨｇｉＡＩで消化
したあと、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平
滑末端とした。 【００４９】生ずる分子は、ファージラムダーＤＮＡよ
り分離した１０８ｂｐ Ｂｇｌ II−Ｈａｅ IIIフラグ
メントに平滑末端でリゲーションさせた。Ｂｇｌ II お
よびＸｂａ Iで消化し、ベクターｐＲＣ２３／ＩＬ−２
Ｎｏ．４−１中のＢｇｌIII とＸｂａＩサイトのあい
だに挿入した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理が予期した
ようにおきたことを確かめるために、この中間クローン
化の段階を含めた。このことは、平滑末端化ＨｇＩＡＩ
末端にＨｅａ III末端を結合することで新しいＳｔｕＩ
サイトが創出されることで確かめられた。 【００５０】ＳｔｕＩで再消化すると、都合よく、この
サイトに、ＣＣＴプロリンコドンで始まる平滑末端を生
ずる。中間的に構築されたプラスミドはｐＲＣ２０１／
ＩＬ−２と称された。ＡＴＧ翻訳開始コドンを有し、ア
ラニンコドンを恢復しそしてＥｃｏＲＩ末端を創出する
２つの合成デオキシオリゴヌクレオチドをデザインし
た。 【００５１】これらのオリゴマーは発現ベクターｐＲＣ
２３のＥｃｏＲＩ末端にリゲーションさせ、ＰｓｔＩで
消化し、生ずる１０２５ｂｐフラグメントをゲル精製し
た。１０２５ｂｐ（ＰｓｔＩから平滑末端）フラグメン
トを、ＰｓｔＩサイトと新しく創出されたＳｔｕＩサイ
トとのあいだで、ｐＲＣ２０１／ＩＬ−２に挿入した。
予期される構築を含有する形質転換物は、分離されたプ
ラスミドＤＮＡの制限分析で同定した。確かめられたプ
ラスミド構築物はｐＲＣ２３３／ＩＬ−２（図６）と称
した。 【００５２】本発明に関連するＩＬ−２の遺伝子を含有
するベクターによる形質転換のための有利な宿主生物に
は、Ｅ． ｃｏｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓおよび類似のＢａｃｉｌｌａｃｅａｅがある。
酵母は形質転換のための有利な微生物である。 【００５３】形質転換操作に受け入れ体として用いられ
る具体的に有利な微生物は、１９７８年１０月２８日に
アメリカンタイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ），ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．３
１４４６として寄託されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏ
ｌｉ Ｋ−１２ ２９４株（英国特許公報Ｎｏ．２０５
５３８２Ａに記載）である。しかし、他のＥ． ｃｏｌ
ｉ株、たとえばＥ． ｃｏｌｉ ＲＲＩ ＡＴＣＣ Ａ
ｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．３１３４３、または、他の、
アメリカンタイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ）のような、認められている微生物寄託機関に
寄託されそして入手しうる多くの微生物も用いうる。 【００５４】本発明に係る上記方法の実施に際しては、
形質転換されたＥ． ｃｏｌｉの１夜培養物を３０℃で
１夜ＬＢブロス中に発育させる。１夜培養物の１リット
ルを、カサミノ酸を含有するミニマルＭ−９培地で１０
リットルに希釈するのがよい。対数増殖期において培養
物を３２℃から４２℃に移してＩＬ−２生成を誘導す
る。４２℃で２−３時間インキュベーションしてから細
菌を遠心して集める。発酵および操作はすべて、ザ ナ
ショナル インスティチュート オブ ヘルス（ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅ
ａｌｔｈ）の組換えＤＮＡガイドラインにより実施し
た。精製段階はつぎの例で詳細に記載する。 【００５５】 【実施例】 例 １ ＩＬ−２（ＮＨ₂ 末端にセリン残基を有する）を生成す
る形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の１グラムを、３０
ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、 pＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド中に
懸濁させ音波処理で溶解させた。この溶解混合物は１
４，０００×ｇで１５分遠心した。遠心溶解物の膜部分
を除き溶解の他の成分より分けた。膜成分は次表１に示
す４回の洗浄またはＩＬ−２抽出段階に処した。各洗浄
溶液は少なくとも５ml／グラム細胞量用いた。 【００５６】表１に詳記するようにＩＬ−２活性の全体
は最終洗浄により抽出された。ＩＬ−２活性の全体を含
有しＳＤＳ−ＰＡＧＥで判断して少なくとも約５０％純
度の最終洗浄溶液は逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−Ｃ８）に処し
た。実質的に１００％純粋（ＮＨ₂ 末端にセリン）を４
０から６０％収率で採取した。ＩＬ−２活性は少なくと
も１×１０⁸ ｕ／mgであった。 【００５７】 【表１】 表 １ Ｅ． ｃｏｌｉ膜よりのＩＬ−２の抽出 全蛋白質 全ＩＬ−２活性 比活性 抽 出 （mg） （単位） （ｕ／mg） １ＭＮａＣｌ洗浄 ０．４mg ０．０３×10⁶ ０．１×10⁶ １％Ｔｒｉｔｏｎ洗浄 ２mg ０．７５×10⁶ ０．４×10⁶ １．７５グアニジン− １mg １．５ ×10⁶ １．５×10⁶ ＨＣｌ洗浄 ７Ｍグアニジニン− ４．７mg ２５０ ×10⁶ ５３×10⁶ ＨＣｌ洗浄 （９９％） ───────── ２５２．３×１０⁶ 【００５８】例 ２ この例は、ＩＬ−２が、形質転換されたＥ． ｃｏｌｉ
宿主細胞の膜成分にずい伴することの傾向を示す。この
ことを証明するために、セリン−ＮＨ₂ 末端ＩＬ−２生
成性形質転換されたＥ． ｃｏｌｉ細胞１ｇを、１０ml
の２０％スクロース３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 pＨ
８．０に懸濁させライソザイム−ＥＤＴＡを用いて溶解
し、ペリプラスム空間に存在する蛋白質を分けた。溶解
混合物の残りは音波処理した。膜部分（内および外膜）
はスクロースグラジエント遠心で他の細胞成分より分け
た。これにより内膜と外膜も分れた。表２はＩＬ−２活
性の大部分が内細胞膜中に存在することを示す。 【００５９】 【表２】 表 ２ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞中のＩＬ−２の存在 全蛋白質 全ＩＬ−２活性 ＩＬ−２の収率 分 画 （mg） （単位） （％） 可溶分画 ３７mg ２×１０⁶ ０．３ ペリプラズム分画 ２mg １０×１０⁶ １．５ 外膜 ６mg ８×１０⁶ １．２ 内膜 １５mg ６．６×１０⁸ ９７ 【００６０】例 ３ 成熟ＩＬ−２生成形質転換Ｅ． ｃｏｌｉ細胞１ｇを３
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 pＨ８、５ｍ ＥＤＴＡ、
１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド中に懸濁
させ、音波で溶解させた。溶解混合物は１４，０００×
ｇで１５分遠心した。遠心溶解物の膜部分を他の成分よ
り分けた。膜部分は、表３に示す４回の洗浄またはＩＬ
−２抽出段階に処した。 【００６１】各洗浄溶液は細胞１グラムについて少なく
とも５mlの割合で用いた。ＩＬ−２活性の全体は、最後
に、表３に詳記する最終洗浄で抽出した。ＩＬ−２活性
を含み、ＳＤＳ−ＰＡＧＥより判断して少なくとも５０
％純度の最終洗浄溶液は、逆相高速液体クロマトグラフ
ィー（ＲＰ−Ｃ８）に処した。実質的に１００％純度の
成熟ＩＬ−２の収率は約６０％であった。ＩＬ−２活性
は約４×１０⁸ ｕ／mgであった。 【００６２】 【表３】 表 ３ Ｅ． ｃｏｌｉ膜よりの成熟ＩＬ−２の抽出 全蛋白質 全ＩＬ−２活性 比活性 抽 出 （mg） （単位） ｕ／mg １ＭＮａＣｌ洗浄 ０．５ ０．３×１０⁶ ０．６×１０⁶ １％Ｔｒｉｔｏｎ洗浄 ３．３ ５．５×１０⁶ １．７×１０⁶ １．７５Ｍグアニジン− ２．５ １０．０×１０⁶ ４．０×１０⁶ ＨＣｌ洗浄 ７Ｍグアニジン− １０．１ ７７９×１０⁶ ７７．１×１０⁶ ＨＣｌ洗浄 （９８％） ───────── ７９４．８×１０⁶ 【００６３】例 ４ つぎの例は、ＨＰＬＣに加えてプロシンレッドアガロー
ス（Ｐｒｏｃｉｎ Ｒｅｄ Ａｇａｒｏｓｅ）クロマト
グラフィー精製段階を用いる、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉよ
りの成熟ＩＬ−２の精製を説明する。 細胞の膜抽出 凍結Ｅ． ｃｏｌｉ細胞（ヒトＩＬ−２のためのプラス
ミド含有）を解凍し、その１ｇを５mlのＢｕｆｆｅｒＡ
（０．０３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 pＨ８．０、０．０
０５Ｍ ＥＤＴＡ）に加える。１０分混合してから、Ｓ
ｏｒｖａｌ ＳＳ−３４ローター中で遠心（１０，００
０ｒｐｍ、１０分）して細胞を分ける。 【００６４】上清を除き、細胞は５mlのＢｕｆｆｅｒＡ
に再懸濁させる。懸濁細胞はＢｒａｎｓｏｎ Ｃｅｌｌ
Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ３５０（音波発生器）で破壊し
た（６×３０秒）、破壊細胞は遠心し（１０，０００ｒ
ｐｍ、１０分）、可溶蛋白質を含有する上清をすてる。
残留物は５mlのＢｕｆｆｅｒＡで１度洗い遠心する（１
０，０００ｒｐｍ、１０分）。膜分画を含有する残留物
は、ＷｈｅａｔｏｎＤｏｕｎｃｅ組織ホモジナイザーを
用いてＢｕｆｆｅｒＢ（１Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 pＨ８．０、０．００５Ｍ ＥＤＴ
Ａ）中に懸濁させる。 【００６５】１０分混合してから、膜部分を、Ｓｏｒｖ
ａｌ ＳＳ−３４ローター中で遠心して分けた（１５，
０００ｒｐｍ、１０分）。残留物を５mlのＢｕｆｆｅｒ
Ｃ（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０３Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、 pＨ８．０）に懸濁させ、ホモジナイ
ズし、混合し遠心する（１５，０００ｒｐｍ、１０
分）。遠心残留物は５mlの１．７５Ｍグアニジニン−Ｈ
Ｃｌに懸濁させ、ホモジナイズし、混合し、遠心する
（１５，０００ｒｐｍ １０分）。残留物は５mlのＢｕ
ｆｆｅｒＡで１度洗い遠心する。膜分画（残留物）を５
mlの７Ｍグアニジン−ＨＣｌで抽出する。遠心後抽出物
（ＩＬ−２含有）を保留し、残留物は２度目の５mlの７
Ｍグアニジン−ＨＣｌ洗浄に処する。この抽出物も保留
しておく。 【００６６】Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｒｅｄ Ａｇａｒｏｓｅ
上のクロマトグラフィー カラムを室温におき、第１回の使用前に２倍容量の７Ｍ
グアニジンＨＣｌで洗う。カラムは平衡用緩衝液（０．
０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 pＨ７．９、０．０３５Ｍ
ＮａＣｌ）で４℃で緩衝させる。予期されるＩＬ−２
の各１００μｇについて少なくとも１mlのＰｒｏｃｉｏ
ｎ ｒｅｄ ａｇａｒｏｓｅを用いるべきである。流速
は毎時２床容量とする。ＩＬ−２を含有する７Ｍグアニ
ジン−ＨＣｌ抽出物を平衡緩衝液で４０倍に希釈し、沈
殿を遠心する。 【００６７】上清はカラム上におく。カラムは２倍容量
の平衡緩衝液で洗う。１．５−２容量の溶出緩衝液
（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 pＨ７．９、１．０
３５ＭＮａＣｌ）につづくピーク中にＩＬ−２を溶出す
る。ＩＬ−２を除いたあと、６Ｍグアニジン−ＨＣｌで
洗い、余分の物をカラムより除く。 【００６８】ＲＰ−Ｐ（Ｃ−１８）上のクロマトグラフ
ィー Ｐｒｏｃｉｏｎ ｒｅｄ溶出物の pＨを１．０Ｍ酢酸を
ゆっくり加えて７に調節する。 pＨ調製の前後に、０．
１mlを取りアッセイに供する。中性溶出物（６０ml）を
１ｍ／分に、０．３１×２５cmＲＰ−１８カラムに送
る。このものは５％ＨＰＬＣ Ｂｕｆｆｅｒ II および
９５％ＨＰＬＣ−Ｂｕｆｆｅｒ Iよりなり立つ平衡緩衝
液混合物で平衡させておく。カラムよりの流出物を集
め、蛋白質含量およびＩＬ−２生物活性を測定する。 【００６９】カラムは、室温で表４のプロフィールで溶
出する。流出物は２２０ｎｍで記録し、１．５ml分画を
集め蛋白質含量およびＩＬ−２活性を分析する。最高Ｉ
Ｌ−２活性のピークは、約７４％ＨＰＬＣ−Ｂｕｆｆｅ
ｒ II （５９％アセトニトリル）で流出する。４から８
℃で分画を保存し比活性に応じプールする。 【００７０】 【表４】 表 ４ ＲＰ−１８カラム上代表的Ｐｒｏｃｉｏｎ−ｒｅｄ溶出物のクロマトグラフ条件 添加試料の量：６０ml カラムの大きさ：０．４１×２５cm 流速：１ml／分 ＨＰＬＣ ＢｕｆｆｅｒＩ：０．０１Ｍリン酸、０．０５Ｍ塩化リチウム ＨＰＬＣ ＢｕｆｆｅｒII：０．０１Ｍリン酸、０．０５Ｍ塩化リチウム、 ８０％アセトニトリル ％ＨＰＬＣ−ＢｕｆｆｅｒII 時間（分） 平衡化 ５ ２０ 添加試料 − ６０ 洗浄 ５ １５ 段階１、勾配 ５から３５ １５ 段階２、勾配 ３５から８５ ５０ 段階３、一定 ８５ ５ 段階４、一定 ５ ５ クロマトグラフ段階はすべて室温で実施した。

【図面の簡単な説明】 【図１】ｐＩＬ２−２ＢのＤＮＡヌクレオチド配列およ
び成熟インターロイキン−２の対応するアミノ酸配列
（矢印は成熟ＩＬ−２蛋白質のアミノ末端を表わす）。 【図２】ｐＢＲ３２２よりｐＲＣ２の構築を示す模式
図。 【図３】Ｐ_L プロモーターを含有するｐＲＣ２３の構築
を示す模式図。 【図４】Ｓｅｒ−ＩＬ−２の発現のための構造遺伝子の
構築を示す模式図。 【図５】プロモーターシステムのない成熟ＩＬ−２発現
ベクター（ｐＲＣ２０１／ＩＬ−２）の構築を示す模式
図。 【図６】Ｐ_L プロモーターシステムを含有する成熟ＩＬ
−２発現ベクター（ｐＲＣ２３３／ＩＬ−２）の構築を
示す模式図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シゲコ ヤマザキ アメリカ合衆国ニユージヤージー州クリ フトン，ジヨンソン ストリート 58 (56)参考文献 特開 昭58−159420（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．活性成分として、 （ａ）成熟ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）をコ
   ードするＤＮＡ配列で形質転換した微生物を培養し； （ｂ）この形質転換微生物に成熟ヒトＩＬ−２を発現さ
   せ、そして蓄積させ； （ｃ）この形質転換微生物を溶解し、細胞溶解物を形成
   させ； （ｄ）この細胞溶解物中に存在する細胞膜成分を分離
   し； （ｅ）分離した細胞膜成分から約４〜７Ｍグアニジン−
   ＨＣｌを含有する洗浄溶液を用いてＩＬ−２を抽出し； （ｆ）この洗浄溶液からＩＬ−２をクロマトグラフィー
   により精製することを特徴とする実質的に均質な成熟組
   換えヒトインターロイキン−２の製造方法により得るこ
   とができ、標準ＣＴＬＬ細胞 ³Ｈ−Ｔｄｒとりこみ分析
   法により測定して、少なくとも５３×１０⁶ Ｕ／mgの比
   活性を有する均質成熟組換えヒトインターロイキン−２
   （ＩＬ−２）および生理学的に許容されうる担体物質を
   含有する免疫学的疾患治療用医薬組成物。