CN112301014B - 一种热稳定性提高的酯酶突变体及其应用 - Google Patents

一种热稳定性提高的酯酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性提升的Escherichia coli酯酶(EstWY酶)突变体，属于酶工程技术领域。本发明通过对源自Escherichia coli菌株的EstWY酶基因进行突变及密码子优化，获得热稳定性显著提高的突变酶。与野生型半衰期相比，突变体在45℃半衰期大约是野生型的5倍，这表明突变体相比于野生型，同时构建的高效表达的基因工程菌，具有其培养周期短、培养条件简单、目的蛋白产量高、纯化简单的优点。

Description

一种热稳定性提高的酯酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的酯酶突变体及其应用。
背景技术
酯酶(Esterase)是催化酯类化合物水解的酶系，其作用是水解脂肪族酯和芳香族酯。在水分子的参与下，经过水解作用，将酯类水解为酸类及醇类。反应式如下：R-COOR/(酯)+H2O(水)＝＝＝＝RCOOH(脂酸)+R/OH(醇)。它广泛存在于动物、植物和微生物中。其中，动物胰脏酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要来源。由于微生物资源丰富，同时利用微生物发酵产酶具有便于工业化生产等优点，使得酯酶广泛应用于农业、食品酿造、医药化学、污水处理和生物修复等领域，又由于酯酶的酶促反应具有较高的底物专一性、区域选择性/对映选择性，它是合成手性化合物的高效生物催化剂。然而，由于天然酶都是在体内比较温和的环境中发挥作用的，而工业应用过程要求酶在比较严苛的环境(如高温、极端酸碱度、有机溶剂、非天然底物、产物抑制等)中发挥作用，因此天然酶在应用中往往遇到稳定性差等问题。为此必须选择稳定性良好的酶来满足工业生产的要求。通过蛋白质工程手段，提升EstWY酶的热稳定性，是解决这一问题的关键。
常用的蛋白质工程方法有理性设计(rational design)和非理性设计(irrational design)，分别基于结构功能--关系和高通量筛选。理性设计存在准确性的缺陷，主要在于蛋白质结构--功能关系过于庞杂，现今仍缺乏充足的认识。为了有效优化蛋白质的热稳定性，Markus Wyss等人于2001年提出共识理论(Consensus Concept)。和理性设计基于蛋白质精确结构-功能关系不同的是，Consensus Concept理论是基于同源蛋白的氨基酸序列信息，从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息。
使用原始菌种(如Fervidobacterium nodosum)发酵，存在培养条件苛刻、产酶水平低的问题，获得目标酶较为困难。同时，原始菌种酶系复杂，不能直接使用，而且纯化步骤繁琐，纯化得到的酶也不能直接使用，存在稳定性差的问题。
自然进化限制了原始EstWY酶的功能，往往不能以最佳的状态应用在工业途径中。使用蛋白质工程的方法，可以对原始基因进行分子改造，打破自然进化的限制，获得适合工业用途，性质优良的新酶基因。所以现阶段EstWY酶的高效表达、纯化及应用端的需求问题一直是本领域技术人员研究的重点和难点。
发明内容
本发明以共识理论(Consensus Concept)为指导思想，对酯酶家族序列进行整合分析，并结合生物信息学及晶体学方法辅助，获得具高稳定性的新型酯酶突变体。
为了解决上述技术问题，本发明利用共识设计方法获得了热稳定性提高的的EstWY酶突变体、本发明采用基于传统的共识方法改进的无***发育偏见的共识方法筛选得到5个氨基酸突变位点并对其进行定点突变，获得了热稳定显著提升的突变酶，解决了现有的EstWY酶热稳定性差，不能满足应用于试剂的需求的缺陷，为拓宽EstWY酶酶的工业应用奠定了基础。
本发明第一个目的是提供一种EstWY酶，EstWY酶是来源于Escherichia coli的EstWY酶，命名为ENND-TOP蛋白，编码ENND-TOP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EstWY酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，EstWY酶是SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的衍生蛋白。
进一步地，EstWY酶是通过一个或多个氨基酸残基取代SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中的一个或多个位置上的氨基酸残基而获得的EstWY酶突变体。
进一步地，EstWY酶是通过一个或多个氨基酸残基取代取代SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中表现出至少90％同源性的氨基酸序列的EstWY酶的氨基酸序列的一个或多个位置上的氨基酸残基而获得的EstWY酶突变体。
进一步地，SEQ ID NO.2表示的胺脱氢酶氨基酸序列的的突变取代位点包括以下至少一个：第276、279、289、322、358位或它们的相应位置。
进一步地，EstWY酶突变体包括在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列上S276V，L279F，T289R，R322G，N358D中任一单点突变位点的单点突变体。
进一步地，EstWY酶突变体包括在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列上的组合突变体：L279F/T289R、L279F/R322G、L279F/N358D、T289R/R322G、T289R/N358D、R322G/N358D、L279F/T289R/R322G、L279F/T289R/N358D、L279F/R322G/N358D、T289R/R322G/N358D、L279F/T289R/R322G/N358D。
本发明第二方面，公开了一种编码EstWY酶突变体的基因。
本发明第三方面，公开了一种含有EstWY酶突变体的基因的重组质粒。
本发明第四方面，公开了一种表达EstWY酶突变体的可溶性蛋白、固定化酶或工程菌。
进一步地，工程菌为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母和真菌。
进一步地，工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。
本发明第五方面，公开了一种EstWY酶突变体的构建方法，包括以下步骤：
A1、通过在Pfam数据库及NCBI数据库中搜索ENND-TOP氨基酸序列，去除重复出现的相同序列后选取与目标蛋白序列一致性大于40％的蛋白质序列，然后通过Clustalx1.83软件进行多序列比对，生成fasta.文件，将fasta.文件上传到Consensus Maker v2.0.0服务器，修改设置参数，通过Clustalx1.83软件生成可以后期编辑的共识序列，将目的蛋白ENND-TOP的氨基酸序列与该家族共识序列以及各位点氨基酸丰度图进行对照比较；
A2、通过在线软件Swiss-model获得了ENND-TOP的结构模型；
A3、用PyMOL观测晶体结构，根据结构信息复查待选突变位点及突变形式，设置筛条件，筛选出ENND-TOP热稳定性的突变体；
A4、根据ENND-TOP结构模型，分析A3中获得的突变体，根据判断准则筛选出提高ENND-TOP蛋白热稳定性的突变体S276V，L279F，T289R，R322G，N358D；
进一步地，步骤A4中判断准则为：①突变应消除原有的不利于热稳定的作用力形式，如静电排斥作用、电荷聚集；②突变不应破坏现有的利于热稳定的作用力形式和稳定的蛋白结构；③突变应引入新的利于热稳定的作用力形式，如氢键、盐桥、疏水相互作用。
进一步地，步骤A3中的设置筛选条件包括：
B1、判断某一位点为待选位点的标准为：①该家族大多数蛋白在该位点处氨基酸丰度总体高度较高；②该位点氨基酸保守；③该位点出现频率较高的氨基酸与ENND-TOP该位点处的氨基酸有较大的理化性质差异，如电荷差异、极性强弱、空间位阻大小等；
B2、除去活性中心附近，即距离催化残基
Figure BDA0002760400770000031
范围内的氨基酸残基，除去处于包埋或半包埋状态的氨基酸残基。
本发明第六方面，公开了一种EstWY酶突变体在于水解脂肪族酯和芳香族酯中的应用，经过水解作用，将酯类水解为酸或醇。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.以共识理论为指导思想，建立了数据库检索、多序列筛选及比对，效率高。。
2.获得了热稳定性提高的EstWY酶突变体，在45℃下半衰期可达野生型的5倍。
3.构建的高效表达的基因工程菌，具有其培养周期短、培养条件简单、目的蛋白产量高、纯化简单的优点，有利于EstWY酶突变体在水解脂肪族酯和芳香族酯的应用。
附图说明
图1，ENND-TOP蛋白晶体结构示意图及突变位点示意图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。
本发明所述的生物材料的来源的一般性说明：
1、引物合成：本发明中所使用的引物均由上海生物工程有限公司合成制备。
2、实验中所使用KOD高保真酶购自东洋纺公司；限制性内切酶均购自于NEB公司；T4 DNA连接酶、DNA胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒均购自于Takara公司。
实施例1野生EstWY酶ENND-TOP基因的克隆
野生型EstWY酶基因以大肠杆菌为宿主进行密码子优化，并由苏州金唯智公司合成，通过上游引物5’-ACTGCTCATATG ACCGATCCGACCTTTGATGCA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶NdeI识别位点)和下游引物5’-TCAGCTCTCGAG TTAATGGCCCAGTGCTTTA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点)扩增目的基因，PCR扩增使用东洋纺的KOD高保真聚合酶，扩增条件为：95℃2min，然后55℃20sec，72℃100sec，共30个循环，最后72℃10min。
反应结束后，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，得到1.0kb的条带，长度符合预期结果。按照试剂盒标准操作，回收、纯化该目的片段，使用限制性核酸内切酶XhoI和NdeI对回收片段、pET28a质粒进行双酶切，T4 DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB平板上，提取阳性克隆质粒，进行测序，结果显示克隆的EstWY酶ENND-TOP基因序列正确，正确接入pET28a质粒，命名重组质粒为pET28a-ENND-TOP。
实施例2 ENND-TOP的表达、纯化及活力测定
将甘油管中的工程菌按体积比1％接种到含100ug/mL Kan的5mL LB培养基试管中，37℃220rpm培养12h。将该5mL菌液转接至含50ug/mL Kan的1L LB培养基摇瓶中，37℃220rpm培养约2h，使OD600达到0.8左右，加入0.1mM IPTG诱导剂，25℃220rpm诱导培养12-18h。将发酵后收获的大肠杆菌菌体悬液超声破碎，再经过一步Ni-NTA亲和层析处理后就能得到95％以上纯度的目的蛋白。
EstWY酶测定方法为：以浓度为20mM的对硝基苯丁酸酯作为反应底物，缓冲体系为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH9.0)，实时测定酶活。在30-60℃范围内，每隔5℃测酶活，在接近最适温度处加大温度密度测酶活，分析酯酶的最适反应温度。将纯化后的酶液分别保温在10、20、30、40、50和60℃条件下15min保温后测定酶活，分析酶的热稳定性。
实施例3 ENND-TOP同源蛋白的多序列比对及Consensus分析
具体操作如下：
1.进入Pfam数据库主页(http://pfam.xfam.org/)，在SEQUENCE SEARCH工具中输入FPOX-E的氨基酸序列进行搜索。服务器直接反馈该蛋白整个家族的氨基酸序列比对结果，并将各个位点的各类氨基酸丰度以柱状图形式显示。该网站也可以自动生成该蛋白家族的consensus sequence。
2.在NCBI protein数据库或Pfam数据库中输入ENND-TOP的氨基酸序列，利用Blast工具，找出所有与目标蛋白序列一致性(identity)大于40％的蛋白质序列。删除其中的重复出现的相同序列，将剩余序列整理成fasta.格式，输入Clustalx1.83软件进行多序列比对。比对结果以aln.、dnd.和fasta.格式输出。其中dnd.文件为构建进化树文件，aln.和fasta.文件为不同形式的序列文件。将上述fasta.文件上传到Weblogo 3(http://weblogo.threeplusone.com/)服务器，根据需要修改设置参数后，该在线软件将以柱状图的形式展示多序列比对结果中蛋白质序列各个位点氨基酸丰度。将上述fasta.文件上传到Consensus Maker v2.0.0(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html)服务器，根据需要修改设置参数后，该在线软件将生成可以后期编辑的consensus sequence。
3.将目的蛋白ENND-TOP的氨基酸序列与该家族consensus sequence以及各位点氨基酸丰度图进行对照比较。
实施例4同源建模及突变位点的选择
1.我们使用在线软件Swiss-model获得了ENND-TOP的结构模型。
2.用PyMOL观测晶体结构，根据结构信息复查上述待选突变位点及突变形式，筛选出最有可能提高ENND-TOP热稳定性的突变体，筛选条件如下：
(1)判断某一位点为待选位点的标准为：①该家族大多数蛋白在该位点处氨基酸丰度总体高度较高；②该位点氨基酸保守；③该位点出现频率较高的氨基酸与ENND-TOP该位点处的氨基酸有较大的理化性质差异，如电荷差异、极性强弱、空间位阻大小等。
(2)除去活性中心附近，即距离催化残基
Figure BDA0002760400770000051
范围内的氨基酸残基，除去处于包埋或半包埋状态的氨基酸残基。
经过两步筛选，此时共剩余28个差异位点，大多数位于蛋白分子的表面。
(3)根据ENND-TOP结构模型，逐个详细分析上述28种突变形式，筛选出可能提高ENND-TOP热稳定性的突变体。
主要判断准则为：①突变应消除原有的不利于热稳定的作用力形式，如静电排斥作用、电荷聚集等；②突变不应破坏现有的利于热稳定的作用力形式和稳定的蛋白结构；③突变应引入新的利于热稳定的作用力形式，如氢键、盐桥、疏水相互作用等。
共设计单点突变体5个：S276V，L279F，T289R，R322G，N358D。
实施例5突变体的构建、表达、纯化及性质表征
5.1ENND-TOP定点突变体的构建
以重组质粒pET28a-ENND-TOP为模板，以带有突变位点的一对互补的寡核苷酸为引物，用KOD高保真酶(TakaRa公司)进行全质粒PCR扩增，获得具有特定突变位点的重组质粒。引物序列如表1所示：
表1、引物序列表
Figure BDA0002760400770000061
PCR扩增使用东洋纺的KOD高保真聚合酶，扩增条件为：95℃2min，然后55℃20sec，72℃100sec，共30个循环，最后72℃10min。胶回收PCR产物，用DpnI酶(Fermentas公司)在37℃条件下消化胶回收产物2h，降解初始模板。消化产物转化至BL21(DE3)，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，测序验证。得到EstWY酶突变体的重组菌。
5.2突变体的性质表征
按照实施例2的方法得到EstWY酶定点突变突变体的纯酶液，并表征这5个单点突变体。结果如表2所示，这5个单点突变体中，4个突变体的热稳定性得到明显改善，分别为L279F，T289R，R322G，N358D。表2总结了热稳定性得到提高的突变体的酶学性质。
将稳定性提高的突变体进行累加组合：使用与单点突变体相似的构建方法，成功构建11个组合突变体：L279F/T289R，L279F/R322G，L279F/N358D，T289R/R322G，T289R/N358D，R322G/N358D，L279F/T289R/R322G，L279F/T289R/N358D，L279F/R322G/N358D，T289R/R322G/N358D，L279F/T289R/R322G/N358D，并逐一表达、纯化、表征。这些组合突变体的表达量及可溶蛋白量较野生型ENND-TOP有显著提高。所有组合突变体与单点突变体相比均表现出热稳定化的叠加效果。表一详细总结了ENND-TOP野生型酶、热稳定突变体酶学性质，稳定性最高突变体的45℃半衰期大约是野生型的5倍。
表2、ENND-TOP野生型及单点突变体的酶学性质表征
Figure BDA0002760400770000071
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 上海绅道生物科技有限公司
<120> 一种热稳定性提高的酯酶突变体及其应用
<130> 2020
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catatgaccg atccgacctt tgatgcactg catagcgcaa tgcgtgcaca ggttgatcag 60
cagtttctgc ctggtgttac caccgcactg ctgcgtggtc gtaaagttgt tgatcgtttt 120
tgttatggtc atgcagatcg tgaagcaggt attgcactgc gtgaagatca cctgtttcgt 180
atgtttagca gcaccaaact gattaccagc tgtgcagtta tgctgctggt tgaagaaggt 240
cgcgttcgtc tgagcgatcc ggttgatgca tatattccgg aactggcaaa tcgtcaggtt 300
ctgcgtgcag atgcaaaaac cctggcagat accgaaccgg cacgtagccc gattacactg 360
cagcatctga tgacccatac cagcggtctg agctatggtg tttttgatcc gggtagcctg 420
ctgtatcgtg catataatga agccggtgtt ctgaatccgc tgcaggatct ggcaggtatg 480
acccgtgttc tggcaaccct gccgctggca tttcatccgg gtacacagtg ggaatatagc 540
gttgcaaccg atgttctggg tcgtgttgtt gaagttgcaa gcggtgaaac ctttggtaat 600
tttctggcac gtcgtatttt tggtccgctg gaaatggttg ataccgattt ttgggttccg 660
cctgcaaaac aggatcgtct gtgtgcactg tatgttggtg ttgatctgct ggatccgacc 720
aaaccgggtc tgttacgtgc agataataaa ccgtttccgg gtgcatatcg tagtaaattt 780
gcacgtgaaa gcggtggtgg tggtctggtt agcaccctgg atgatagcat tcgtctgatt 840
cagagcctga ttcctggtgg tccgacactg ctgaaaccgg caacactgga acacatgttt 900
gcaaatcatc tgcctgcagg tatgcatgtt cgttttccga atgttccggc acagcctggt 960
tggcgttttg gtctgggtag ctcagttcgt gaaagtgcag gtctgggtga accgagcgaa 1020
gttgttggtg aagcaagctg gggtggcctg gcaggcaccc tgtggtggat caatccgcgt 1080
ctgggtattg cagcagttct gctgacccag cgttattttg gttttggtaa tccgtatgcc 1140
gtgcacttta aaaaccatgc atataaagca ctgggccatt aa 1182
<210> 2
<211> 393
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
His Met Thr Asp Pro Thr Phe Asp Ala Leu His Ser Ala Met Arg Ala
1 5 10 15
Gln Val Asp Gln Gln Phe Leu Pro Gly Val Thr Thr Ala Leu Leu Arg
20 25 30
Gly Arg Lys Val Val Asp Arg Phe Cys Tyr Gly His Ala Asp Arg Glu
35 40 45
Ala Gly Ile Ala Leu Arg Glu Asp His Leu Phe Arg Met Phe Ser Ser
50 55 60
Thr Lys Leu Ile Thr Ser Cys Ala Val Met Leu Leu Val Glu Glu Gly
65 70 75 80
Arg Val Arg Leu Ser Asp Pro Val Asp Ala Tyr Ile Pro Glu Leu Ala
85 90 95
Asn Arg Gln Val Leu Arg Ala Asp Ala Lys Thr Leu Ala Asp Thr Glu
100 105 110
Pro Ala Arg Ser Pro Ile Thr Leu Gln His Leu Met Thr His Thr Ser
115 120 125
Gly Leu Ser Tyr Gly Val Phe Asp Pro Gly Ser Leu Leu Tyr Arg Ala
130 135 140
Tyr Asn Glu Ala Gly Val Leu Asn Pro Leu Gln Asp Leu Ala Gly Met
145 150 155 160
Thr Arg Val Leu Ala Thr Leu Pro Leu Ala Phe His Pro Gly Thr Gln
165 170 175
Trp Glu Tyr Ser Val Ala Thr Asp Val Leu Gly Arg Val Val Glu Val
180 185 190
Ala Ser Gly Glu Thr Phe Gly Asn Phe Leu Ala Arg Arg Ile Phe Gly
195 200 205
Pro Leu Glu Met Val Asp Thr Asp Phe Trp Val Pro Pro Ala Lys Gln
210 215 220
Asp Arg Leu Cys Ala Leu Tyr Val Gly Val Asp Leu Leu Asp Pro Thr
225 230 235 240
Lys Pro Gly Leu Leu Arg Ala Asp Asn Lys Pro Phe Pro Gly Ala Tyr
245 250 255
Arg Ser Lys Phe Ala Arg Glu Ser Gly Gly Gly Gly Leu Val Ser Thr
260 265 270
Leu Asp Asp Ser Ile Arg Leu Ile Gln Ser Leu Ile Pro Gly Gly Pro
275 280 285
Thr Leu Leu Lys Pro Ala Thr Leu Glu His Met Phe Ala Asn His Leu
290 295 300
Pro Ala Gly Met His Val Arg Phe Pro Asn Val Pro Ala Gln Pro Gly
305 310 315 320
Trp Arg Phe Gly Leu Gly Ser Ser Val Arg Glu Ser Ala Gly Leu Gly
325 330 335
Glu Pro Ser Glu Val Val Gly Glu Ala Ser Trp Gly Gly Leu Ala Gly
340 345 350
Thr Leu Trp Trp Ile Asn Pro Arg Leu Gly Ile Ala Ala Val Leu Leu
355 360 365
Thr Gln Arg Tyr Phe Gly Phe Gly Asn Pro Tyr Ala Val His Phe Lys
370 375 380
Asn His Ala Tyr Lys Ala Leu Gly His
385 390
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggatgatta tattcgtctg attcagagc 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agacgaatat aatcatccag ggtgctaac 29
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcattcgttt tattcagagc ctgattcct 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctctgaataa aacgaatgct atcatccag 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtggtccgcg tctgctgaaa ccggcaaca 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttcagcagag ccggaccacc aggaatcag 29
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctggttgggg ttttggtctg ggtagctca 29
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agaccaaaac cccaaccagg ctgtgccgg 29
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggtggatcga tccgcgtctg ggtattgca 29
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agacgcggat cgatccacca cagggtgcc 29

Claims (5)

1.一种EstWY酶突变体，其特征在于，所述EstWY酶突变体来源于Escherichia coli的野生型EstWY酶，所述野生型EstWY酶命名为ENND-TOP蛋白，所述ENND-TOP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述EstWY酶突变体为在
SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列上的下列突变体之一：L279F、T289R、R322G、N358D、L279F/T289R、L279F/R322G、L279F/N358D、T289R/R322G、T289R/N358D、R322G/N358D、L279F/T289R/R322G、L279F/T289R/N358D、L279F/R322G/N358D、T289R/R322G/N358D、L279F/T289R/R322G/N358D。
2.一种编码如权利要求1所述的EstWY酶突变体的基因。
3.一种包含如权利要求2所述的基因的重组质粒。
4.一种包含如权利要求1所述的EstWY酶突变体的可溶性蛋白、固定化酶或工程菌。
5.一种如权利要求1所述的EstWY酶突变体在水解脂肪族酯和芳香族酯中的应用，经过水解作用，将酯类水解为酸或醇。
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